ES2305245T5 - Locus de la cadena ligera lambda de ratón - Google Patents

Description

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normales mantenidos en las mismas condiciones libres de patógenos (Tabla 1). Los anticuerpos de suero en λ1-/-κ-/y λ1.3-/-κ-/-fueron también reducidos pero comparables con aquellos en ratones κ-/-(Zou, X. y otros, 1995, supra). Inesperadamente ratones λ1.3.2-/-κ-/-y λ1-2∆-/-κ-/-derivados de hembras heterocigóticas o madres adoptadas tuvieron títulos de anticuerpos significativos en el suero aún detectables por ELISA 6 semanas después del destete. Sin embargo, los análisis de suero de tales ratones después de 3 meses no mostraron anticuerpos remanentes (datos no mostrados). La pérdida de Ig de suero en ratones λ1.3.2-/-κ-/-confirmó que Cλ4 tiene que ser seudogen que los genes Vλ remanentes no pueden ser expresados usando un gen C todavía desconocido. La reducción del nivel de células B en la médula ósea y el bazo a cada etapa de silenciamiento sucesiva es mostrado en la Fig. 2 y la Tabla 1. En la médula ósea el desarrollo de las células pro y pre-B parece estar un poco afectado por la pérdida de la expresión de la cadena L y los niveles de c-kit+, las células B CD43+, y CD25+ son bastante similares en las cepas KO y comparadas con los ratones normales (Fig. 2a). Sin embargo, en la etapa cuando el reordenamiento de la cadena L debería haber sido completado el desarrollo normal es bloqueado y las células B inmaduras fallan para expresar la IgM de superficie. De manera interesante, es claramente visible una reducción en el número de células que expresan la IgM de superficie y, comparado al 12 % de IgM de linfocitos B220+ en la médula ósea de ratones normales, 4 % son encontrados en ratones κ-/-, 2 % en ratones λ1-/-κ-/-, 1 % en λ1.3-/-κ-/-y esencialmente ninguno en ratones λ1.3.2-/-κ-/-y λ1-2∆-/-κ-/-. En el bazo los niveles de células B Ig+ en ratones λ1-/-κ-/-y λ1.3-/-κ-/-son similares a aquellos en ratones κ-/-mientras que en ratones λ1.3.2-/-κ-/-y λ1-2∆-/-κ-/-solo una tinción de fondo es remanente (Fig. 2b). Para evaluar si las células B B220+ en la médula ósea acumulan cadena H µ en el citoplasma y si esas células migran a órganos linfoides secundarios se tiñó para el IsM citoplasmático. Como se muestra en la figura 3a las células B de la médula ósea CD25+ provenientes de ratones λ1-2∆-/-κ-/-ciertamente se tiñen para la cadena H µ citoplasmática pero no muestran teñimiento para la IgM de superficie. Ciertamente los niveles de células B CD25+ y su distribución de tamaños es muy similar en ratones normales y L KO (Fig. 3b). Sin embargo, la migración de estas células a, por ejemplo, el peritoneo no tiene lugar y la Fig 4 muestra que esencialmente ninguna célula B existe en los órganos linfoides secundarios. Hubo sorpresa porque la cadena H µ identificada en el citoplasma de las células B de los ratones λ1-2∆-/-κ-/-es del mismo tamaño o peso molecular que la cadena H µ convencional. La lisis celular usando digitonina y capturando las cadenas H µ enlazadas y no enlazadas, analizadas en geles de poliacrilamida (Fig.5), no mostró diferencias de tamaño de la cadena H µ producida en el citoplasma de ratones silenciada de cadena L o normal. Sin embrago, como se mostró también en la Fig. 5 la Ig de suero no es producida por esos ratones. Esto re-enfatiza que el desarrollo de las células B y la expresión de la cadena H µ hasta la etapa cuando las cadenas L son expresadas parece no ser ampliamente afectada en ratones KO de cadena L. Además, la pérdida de la cadena L evita la liberación de la cadena H µ desde la célula lo cual evita la secreción de Ig.

Bloqueo en el desarrollo en la etapa de células B inmaduras. El silenciamiento de los genes de la cadena L λ en el fondo de κ-/-mostró que no es producida Ig secretada ni de superficie y que el bloqueo resultante en el desarrollo de las células B está establecido en la fase de transición de preB II a inmadura. En esta etapa la expresión de CD25 es revocada, el pre BCR es reemplazado por el BCR, la cadena L no es expresada y el reordenamiento de la cadena L κ o λ es completado con la expresión exitosa que permite la asociación de la cadena H µ. Después de algunas divisiones las células pre B-II de CD25+ grandes se diferencian en células pre B-II que mantienen CD25+ pequeños las cuales están en el proceso de reordenamiento de sus genes de cadena L. Como puede ser observado en la Fig. 2a el número de células CD25+B220+ en la etapa inmediatamente antes del bloqueo desarrollado es muy similar. Como el reordenamiento exitoso de la cadena L es evitado o impedido en los ratones mutantes hubo sorpresa porque este bloqueo altera la relación de células CD25+ pequeñas y grandes. En la Fig.3b el número de células de la médula ósea CD25* de ratones κ-/-y λ1-2∆-/-κ-/-, normales de edad similar es trazado contra el tamaño celular. La comparación muestra ligeras variaciones como se esperaba pero no diferencias importantes en las poblaciones de células pre B-II grandes y pequeñas. Esto concluye que la falla para expresar cadenas L inicia un completo bloqueo en el desarrollo de la etapa de células B inmaduras cuando la IgM de superficie debería ser expresada. Además no se acumulan células B inmaduras antes del evento.

Este bloqueo en el desarrollo con recobrados no evidentes impide la expresión IgM de superficie y la subsecuente migración celular. Como se muestra en la Tabla 1 el número de células del bazo en ratones λ1.3.2-/-κ-/-y λ1-2∆-/-κ-/-es significativamente reducida. Una pérdida completa de las células B maduras es también encontrada en la cavidad del peritoneo con células no B 220+ y B 220+CD5+. (Fig.4). Esta pérdida de células B-1 y B-2 parece no tener efecto en los niveles de células T las cuales son mantenidos.

Discusión

Los experimentos mostraron que el desarrollo de las células B es abortado en los ratones con la deleción de la cadena L en la etapa de transición de células B pre BII a inmaduras cuando la expresión del receptor de superficie debería haber sido lograda. Este completo bloqueo en el desarrollo evita la maduración de las células B y el ratón es inmunodeficiente con respecto a las células B que expresan anticuerpos. La cadena L correspondiente codificada por VpreB y λ5 no sostiene el desarrollo de células B y con la falla para expresar polipéptidos de la cadena L la diferenciación de células B cesa exactamente en la etapa cuando el reordenamiento de la cadena L debería haber sido completado. Esto reenfatiza la importancia de la cadena L para el desarrollo inmune y que, al menos en el ratón, no hay gen o eventos de rescate que puedan compensar la deficiencia de la cadena L.

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