ES2305767T3 - Glucosa deshidrogenasa y su preparacion. - Google Patents
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Abstract
Pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa soluble de secuencia como se representa en la figura 1, caracterizada porque están intercambiados los siguientes aminoácidos frente a LMD 79.41 de Acinetobacter de tipo natural: la posición 21 tiene como aminoácido una N y 41 una S y 47 una L y 121 una V o una A y 149 una A y 213 una S y 244 una I y 320 una G y 391 una S y 452 una S y 474 una R y 480 una Q.
Description
Glucosa deshidrogenasa y su preparación.
La invención se refiere a nuevas glucosa
deshidrogenasas solubles dependientes de pirroloquinolinquinona
(PQQ) (sPQQGDH) de Acinetobacter así como a un procedimiento
para su preparación mediante sobreexpresión en sistemas de
expresión microbianos adecuados.
A los pacientes que sufren de diabetes se les
debe medir regularmente su azúcar en sangre. Así mismo la medida de
glucosa juega un importante papel en procesos de fermentación.
Muchas veces se realiza la determinación de glucosa
enzimáticamente. Para ello se usan glucosa oxidasas o en raros casos
también glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa. Los procedimientos que se basan en glucosa oxidasa
tienen la desventaja de que el enzima transfiere los electrones
también al oxígeno presente y no exclusivamente a los mediadores
añadidos. Por tanto el resultado de la media depende de la presión
parcial del oxígeno. Desde hace mucho tiempo se hacen esfuerzos por
reemplazar enzimas presentes por glucosa deshidrogenasas
dependientes del sPQQ. PQQ representa pirroloquinolinquinona. PQQ
es el grupo prostético de la glucosa deshidrogenasa (GDH). Este
porta equivalentes redox. La ventaja de estos enzimas se basa en
que el valor de medida de la presión parcial del oxígeno es
independiente y es posible una medida más exacta. Además es posible
con el uso de estos enzimas realizar la medida en volúmenes de
muestra más
pequeños.
pequeños.
En la bibliografía se encuentran dos PQQGDH
distintas. La que es una forma unida a la membrana (mPQQGDH) y que
es inadecuada para el uso en sensores de glucosa. La forma que es
soluble (sPQQGDH) y que se ha encontrado de forma diferenciada en
cepas del género Acinetobacter (Biosci. Biotech. Biochem. 59
(8), páginas 1548 a 1555, 1995). El enzima es un homodímero y posee
un peso molecular de 50 kDa. Las PQQGDH soluble y la unida a la
membrana no poseen homología de secuencia y son diferentes
inmunológicamente y en lo que respecta a su cinética
(Cleton-Jansen y col., 172 (11), páginas 6308 a
6315, J. Bacteriol. 1990) (Matsushita y col., Biochemistry 28 (15),
páginas 6276 a 6280, 1989).
La sPQQGDH de Acinetobacter es conocida
desde hace tiempo. Todos los autores trabajan con las cepas LMD
79.41 (Kojima y col., Biotechnology Letters, 22, páginas 1343 a
1347, 2000), NCIMB 11517 o JCM 6841 (ambos: documento US
2001021523).
Las secuencias de ADN de sPQQGDH de esta cepa
están registradas en el banco de genes con los números de entrada
X15871 (LMD 79.41), E28183 (JCM 6841) y E28182 (NCIMB 11517).
Se ha experimentado mucho para cambiar las
propiedades de esta sPQQGDH mediante modificación de las secuencias
génicas (documentos EP 1167519 A1, EP 1176202 A1, Sode y Kojima,
Biotechn. Letters, volumen 19, (11) páginas 1073 a 1077, 1997). A
este respecto el fin era mejorar la especificidad por el sustrato y
la estabilidad térmica del enzima. El documento EP 1167519 A1
describe el intercambio de determinados aminoácidos de la sPQQGDH de
LMD 79.41 de Acinetobacter, para obtener una estabilidad
térmica elevada. Se efectuaron cambios en los aminoácidos 209, 210,
231, 420 y 421. El documento WO 02/072839 A1 describe otros cambios
en la secuencia de aminoácidos para conseguir elevadas
estabilidades térmicas y mejoras en la solubilidad en agua. Se
intercambiaron las posiciones 167, 231, 340, 415 y 418. La forma de
proceder se basa en ambos casos en las usadas en el documento EP
1167519. En comparaciones del enzima de LMD 79.41 de
Acinetobacter con las sPQQGDH nuevas de acuerdo con la
invención así como de la JCM 6841 de Acinetobacter se debe
tener en cuenta que los dos enzimas recién citados son dos
aminoácidos más largos que el de LMD 79.41. Se considera a este
respecto el enzima maduro y el péptido
señal.
señal.
El documento WO 02/34919 A1 describe el
intercambio de aminoácidos discretos con el fin de reducir la
afinidad del enzima por la maltosa. La estabilidad térmica del
enzima no se ve influenciada.
Para la preparación de enzimas se expresan estos
heterólogamente normalmente en E. coli. En la expresión de
sPQQGDH aparece el problema de que E. coli puede sintetizar
en concreto el enzima pero no el cofactor PQQ. Concretamente según
Sode y col. (J. Biotechnology, 49, 239 a 243, 1996) en el caso de
glucosa deshidrogenasa unida a membrana da buen resultado la
expresión del apoenzima mPQQGDH, sin embargo este no es estable y se
descompone de nuevo durante el cultivo celular. Matsushita y col.
(Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1548 a 1555, 1995) postulan un
cambio de conformación del enzima que tiene lugar en la unión del
cofactor y protege el holoenzima frente a la digestión
tríptica.
Por tanto todos los grupos de trabajo y
fabricantes se han preocupado de preparar enzima activo y estable,
de modo que bien se añade PQQ durante el cultivo celular o bien
realiza la expresión en cepas que puede formar por sí mismos PQQ.
Sode y col. (J. Biotechnology, 49, 239 a 243, 1996) consiguieron la
coexpresión de mPQQGDH junto con los genes para la síntesis de PQQ
en E. coli y alcanzaron con una OD de 4 aproximadamente 1.500
U/l. Si se añade la PQQ durante el cultivo celular se consigue
1.100 U/l. Sin embargo el sistema tiene el problema de que las
células no alcanzan densidades ópticas elevadas y fallecen durante
la producción de enzima (Kojima y col., Biotechnology Letters, 22,
1343 a 1347, 2000). Los autores describen en la publicación citada
previamente la síntesis de sPQQGDH activa en Klebsiella
pneumoniae. Este organismo se puede obtener genéticamente y
posee la capacidad de sintetizar PQQ. Por tanto se consiguen a este
respecto actividades de aproximadamente 14.000 U/l, sin embargo
tiene que incorporar PQQ adicional. Yoshida y col. (Enzym. Microb.
Technol. 30, páginas 312 a 318, 2002) han expresado heterólogamente
el sPQQGDH soluble en Pichia pastoris y consiguieron con
ello rendimientos de enzima útil de hasta 200.000 U/l. No obstante
se deben alcanzar para ello densidades celulares muy elevadas. Al
mismo tiempo el enzima está glicosilado y además se debe purificar
mediante una precipitación y dos intercambiadores de iones. De
forma particular la purificación costosa y la glicosilación
dificultan una preparación
económica.
económica.
La compañía Toyobo Co. Ltd., Japón describe en
el documento JP 09140378 la preparación de sPQQGDH con
Acinetobacter calcoaceticus. Después de tres etapas de
purificación se consiguen 60 U/l. Para aumentar la productividad
del sistema se expresó el enzima a continuación heterólogamente en
Pseudomonas putida, ya que esta cepa puede sintetizar
PQQ.
Olsthoorn y Duine (Arch. Biochem. Biophys. 336
(1), 42 a 48, 1996) describen el cultivo en lotes de un clon de
E. coli, que expresa una sPQQGDH, en el fermento
100-1. Después del cultivo se purifica el enzima
mediante tres etapas en columna. El clon no forma PQQ alguna, el
cofactor se añade ya en el ensayo del enzima. Los rendimientos son
de 10 mg de proteína pura por 1 cultivo en desarrollo. Sin embargo
la baja densidad celular del cultivo, el procedimiento de
purificación costoso y el rendimiento hacen que el procedimiento se
muestre no económico.
\vskip1.000000\baselineskip
En el marco de una selección se encontraron 12
cepas del tipo Acinetobacter calcoaceticus que forman una
sPQQGDH. Una tipificación de las nuevas cepas con la Colección
Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DMSZ) dio un 99,8%
de homología de la secuencia de ADNr 16S parcial con la cepa tipo
Acinetobacter calcoaceticus. Sin embargo no es habitual el
uso observado de L-malato y la incapacidad para
descomponer L-fenilacetato para la cepa tipo. La
totalidad de las 12 cepas encontradas muestran esta propiedad.
Las sPQQGDH formadas por estas cepas se
diferencian de los enzimas conocidos hasta ahora en propiedades
esenciales. Por una parte poseen una estabilidad térmica mejorada
frente al enzima de la cepa tipo (véase el ejemplo 3). Se
diferencian igualmente las secuencias de nucleótidos y la secuencia
de aminoácidos.
Las secuencias de nucleótidos de los 12 genes
que codifican para la sPQQGDH nueva, dio los siguientes resultados
(véase la figura 1):
- Las secuencias de nucleótido de la totalidad de las sPQQGDH recién encontradas se diferencian claramente de las de enzimas de LMD 79.41 de Acinetobacter y JCM 6841 así como de NCIMB 11517 de Acinetobacter.
- Las secuencias de aminoácidos, que se pueden derivar de las secuencias de nucleótidos respectivas, se diferencian igualmente de las secuencias conocidas hasta ahora. La sPQQGDH de LMD 79.41 de Acinetobacter tiene, incluyendo el péptido señal, 478 aminoácidos, las de las otras dos cepas conocidas JCM 6841 de Acinetobacter y NCIMB 11517 de Acinetobacter así como los de las secuencias encontradas aquí tienen cada una, incluyendo el péptido señal, 480 aminoácidos.
- Las secuencias de aminoácidos de la sPQQGDH recién encontrada se diferencian en múltiples posiciones de las conocidas hasta ahora. De forma sorprendente se encontró en 12 posiciones en la totalidad de nuevos genes descritos aquí un aminoácido diferente que en todos los enzimas descritos previamente. Adicionalmente al menos el 75% de los nuevos genes descritos aquí portan en cuatro posiciones un aminoácido diferente que en genes descritos previamente. Adicionalmente hay en los enzimas nuevos descritos aquí otros intercambios que provienen únicamente o en parte del enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma particular están intercambiados los
siguientes aminoácidos de la nueva sPQQGDH encontrada de acuerdo
con la invención. El recuento de aminoácidos se orienta al recuento
en el enzima de la cepa JCM 6841 de Acinetobacter, que
comprende, además del péptido señal, 480 aminoácidos (véase la
figura 1):
- Son acordes con la invención todas las pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa solubles (sPQQGDH), que tienen como aminoácido en las posiciones 21 una N y 41 una S y 47 una L y 121 una V o una A y 149 una A y 213 una S y 244 una I y 320 una G y 391 una S y 452 una S y 474 una R y 480 una Q.
\vskip1.000000\baselineskip
Además son sPQQGDH acordes con la invención
todas aquellas en las que adicionalmente a los intercambios
descritos anteriormente se pueden realizar los siguientes
intercambios:
- En las posiciones 16 puede estar una H, en 18 una L, en 20 una F, en 40 una G, en 48 una I, en 61 una A, en 111 una T, en 154 una D, en 190 una D, en 293 una A, en 311 una S, en 314 una A, en 324 una L, en 333 una M, en 339 una S, en, 355 una G, en 366 una D, en 417 una N y en 418 una A.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha encontrado ahora de forma sorprendente que
los nuevos enzimas encontrados son todos más estables térmicamente
que el enzima de tipo natural. La estabilidad térmica es un criterio
esencial para el uso con éxito de sPQQGDH como sensor de glucosa.
De este modo se encontraron en una incubación de una hora a 60ºC y
70ºC por lo general mayores reactividades que en el enzima de LMD
79.41 de Acinetobacter. A 60ºC se encontraron en las sPQQGDH
de acuerdo con la invención reactividad entre 51,1% y 12,5%. El tipo
natural mostró en un uso idéntico sólo 1,8% de su actividad
original. A 70ºC se observaron entre 26,7% y 8,8% de la actividad de
partida, el enzima del tipo natural poseía por el contrario sólo
6,4% de la actividad original.
En el pasado se ha experimentado de diversa
forma aumentar la estabilidad térmica de sPQQGDH mediante
intercambio intencionado y aleatorio de aminoácidos.
El documento EP 1167519 A1 reivindica sin
embargo el intercambio de aminoácidos en posiciones que se
diferencian claramente de aquellas en las sPQQGDH de acuerdo con la
invención. Esto es igualmente válido para los intercambios que se
dan a conocer en el documento WO 02/072839. Igualmente esto es
cierto para los intercambios que se describen en el documento WO
02/34919 A1. La elevada estabilidad térmica de sPQQGDH de acuerdo
con la invención se correlaciona por tanto con el intercambio de un
grupo completo de aminoácidos, cuya influencia sobre esta propiedad
no se conocía hasta ahora.
Para la preparación de enzimas de acuerdo con la
invención se puede cultivar la cepa en cuestión en un medio
adecuado. A tal fin se pueden usar los medios descritos en la
bibliografía como caldo nutriente (Difco 0003). Después del lavado
de las células estas se cosechan y se rompen. La purificación del
enzima se realiza como se describe anteriormente.
Se prefieren clonar las sPQQGDH de tipo natural
en un huésped adecuado. Estos pueden ser los procariontes que se
puede obtener fácilmente genéticamente habituales como los
pertenecientes al género Bacillus, Klebsiella,
Pseudomonas así como E. coli. Además se pueden
expresar los enzimas también en eucariontes como los pertenecientes
a los géneros Pichia, Saccharomyces, Hansenula,
Aspergillus o Kluyveromyces. Los enzimas se pueden
expresar también en plantas o líneas celulares animales.
Para la clonación se pueden usar procedimientos
convencionales como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con
cebadores degenerados o hibridación de bibliotecas genómicas con
sondas adecuadas. Se prefiere llevar a cabo la expresión en E.
coli. La expresión se lleva a cabo normalmente en las cepas
BL21, DH5, HB101, JM101, RV308, TOPP, TOP10, XL-1
así como sus derivados. Se prefieren usar las cepas W3110 y DH5. A
tal fin se pueden usar los vectores de expresión comunes. Los
vectores contienen de forma típica un origen de replicación, una
resistencia contra un antibiótico y una secuencia promotora. Se
pueden usar los siguientes vectores, por ejemplo, pUC18/19,
pBluescript, pTZ, pGEX, pPROEx, pcDNA3.1, YEp24, pBAC, pPICZ. Se
prefieren los vectores de las series pMAL, pET, pTrx, pCAL, pQE y
pPROTet. Se prefieren usar especialmente los vectores de expresión
de la serie pASK-IBA 2 a pASK-IBA 7.
Antibióticos habituales, seleccionados por su resistencia, son por
ejemplo ampicilina, canamicina, tetraciclina y cloroanfenicol.
Se pueden usar también sistemas de expresión que
conducen a que se elimine la proteína al medio.
Los vectores se pueden transferir con los
procedimientos habituales a las células huésped. A tal fin se usan,
por ejemplo: electroporación, fusión de protoplastos, transformación
química.
La síntesis de sPQQGDH clonada se induce
mediante adición de un inductor. Para ello se usan los inductores
adecuados para el sistema de expresión elegido como, por ejemplo,
IPTG, triptófano, glucosa y lactosa. Se prefiere usar especialmente
el inductor anhidrotetraciclina.
Las líneas celulares recombinantes se recogen en
medios adecuados para ellas. Para tal fin son adecuados los
procedimientos comunes para el cultivo de pro- y eucariontes. El
cultivo se puede llevar a cabo en fermentadores adecuados. Se
prefiere cultivar los organismos de modo que se alcancen densidades
celulares muy altas. A tal fin se requiere que se realice con una
estrategia regulada adecuada la alimentación de una fuente de C y de
una fuente de N de modo que no se generen productos de metabolismo
tóxicos (para la revisión: Schügerl y col. (autores) en:
Bioreaction Engineering, páginas 374 a 390, editorial Springer,
Berlín, 2000; Yee y Blanch, Bio/Technology, 10 (2), páginas 1550 a
1556, 1992).
Un procedimiento adecuado en el sentido de esta
invención es, por ejemplo, el descrito por Riesenberg y col., Appl.
Microbiol. Biotechnol, 34, páginas 77 a 82, 1990.
Mientras que el cultivo de las células se
realiza de forma ideal de 28 a 37ºC, para la expresión de proteínas
se reduce a 10-28ºC. Preferiblemente esta se
encuentra de 15 a 25ºC y con especial preferencia de 20 a 22ºC.
De forma sorprendente se ha encontrado que con
uso del procedimiento de acuerdo con la invención se consiguen
rendimientos claramente mayores en enzima activo que como se
describe hasta ahora en la bibliografía. Con un cultivo de un clon
de E. coli en cultivo en lotes se pueden obtener hasta 48 mg
de proteína pura a partir de un litro de sobrenadante de cultivo
(véanse ejemplos 5 y 6). Yoshida y col. (Enzym. Microbiol. Technol.,
30, páginas 312 a 318, 2002) consiguen 43 mg/l. Sin embargo se debe
purificar el enzima de forma costosa y se glicosila. Olsthoorne y
Duine (Arch. Biochem. Biophys. 336 (1), páginas 42 a 48, 1996
informaron de un rendimiento de
10 mg/l.
10 mg/l.
Si se recogen las células con los enzimas de
acuerdo con la invención en una fermentación de alta densidad
celular se pueden conseguir incluso más de 220 mg de enzima pura por
l de líquido de cultivo (ejemplo 8).
Después del cultivo de las células estas se
cosechan y se rompen con procedimientos adecuados como, por ejemplo,
prensa francesa, adición de detergentes o ultrasonidos. La solución
de proteína se tampona y se lleva a un valor de pH ligeramente
alcalino. Se ajusta el tampón a un valor del pH entre 7 y 9,
preferiblemente este se encuentra entre 7,8 y 8,2.
Como sustancias tampón se pueden usar tampones
habituales en bioquímica como tampón Tris, MOPS o PIPES, tampón de
fosfato de potasio, debiendo encontrarse la concentración en 5 a 100
mM, preferiblemente se encuentra en un intervalo de 20 a 70 mM y
con especial preferencia en 50 mM.
Se puede purificar la sPQQGDH muy fácilmente en
la solución de proteína. Para ello se purifica la solución de
proteína bien mediante una cromatografía de intercambio de iones
convencional o bien se añade directamente el material de
intercambio de iones a la solución de proteína y a continuación se
separa mediante un embudo del resto de líquido. Como intercambiador
de iones se tienen en cuenta intercambiadores de cationes como, por
ejemplo, resinas Lewatit, CM-, S-, SM-Sepharose,
CM-, SP-Sephadex, Amberlyst 15, Amberlite
CG-50, Amberlite IR-120,
carboximetil-, sulfoxietil-, oxicelulosa, fosfato de celulosa y
CM-Toyopearl. Se prefiere usar CM-
Toyopearl.
Toyopearl.
La proteína se eluye a continuación con los
procedimientos habituales del material de intercambio de iones.
Para ello se usa un gradiente de NaCl creciente, se usa el tampón
que se usó también previamente en la unión de la proteína al
material de intercambio de iones. Normalmente se eluye el enzima a
una concentración de aproximadamente 200 mM de NaCl.
El enzima se puede purificar luego
adicionalmente, así mismo se puede reducir el contenido en sal
mediante los procedimientos habituales como diálisis y
ultracentrifugación.
La preparación y purificación de la sPQQGDH de
acuerdo con la invención se realiza preferiblemente como apoenzima,
el cofactor PQQ se añade ya cuando el enzima se haya purificado por
completo. De forma ideal se realiza la adición del PQQ de acuerdo
con el cambio de tampón del enzima tras la purificación con el
intercambiador de
iones.
iones.
Se puede añadir el PQQ antes del cambio de
tampón o después. Se prefiere añadir antes del mismo. La cantidad
se rige por el contenido de la solución de proteína. Por mol de
enzima activo se puede añadir de 0,1 a 5 mol de PQQ. De forma ideal
se añaden de 0,5 a 2 moles, con especial preferencia 2 moles de PQQ
por mol de proteína activa. Pero también es posible preparar y
purificar el enzima como holoenzima. A tal fin se puede añadir PQQ
durante el cultivo celular, en la ruptura de las células o antes de
la purificación. Además se pueden preparar las sPQQGDH de acuerdo
con la invención también como holoenzimas, expresándolas
heterólogamente en organismos que pueden sintetizar PQQ. Estos
pueden ser, por ejemplo, organismos del género Kiebsiella o
Pseudomonas.
Se usan las sPQQGDH nuevas de acuerdo con la
invención para la medida de glucosa. Se usan con especial
preferencia en equipos con los que se puede medir la glucosa en
sangre. Además de esto es también posible usar los enzimas para la
medida de glucosa, por ejemplo, en procesos de fermentación.
Si se usan las sPQQGDH de acuerdo con la
invención para fines de diagnóstico, un kit de ensayo de este tipo
comprende de forma típica un tampón, un mediador y algunas unidades
de actividad enzimática. De forma típica se usan de 0,5 a 10 U y
preferiblemente de 1 a 5 U. El enzima se puede formular de forma
diferenciada para tal fin. Se puede formular, por ejemplo, secado
por congelación o secado por pulverización así como solución.
Pueden ser electrodos adecuados electrodos de carbón, oro o platino.
Normalmente se inmoviliza el enzima sobre el electrodo. Normalmente
se usan a tal fin agentes reticulantes, pero el enzima puede estar
también encapsulado. Además se pueden inmovilizar mediante una
membrana de diálisis, con polímeros
foto-reticulantes, conductores eléctricos o redox.
También son posibles combinaciones de los procedimientos
anteriormente citados.
Se prefiere aplicar los enzimas como
holoenzimas, pero estos se pueden usar también como apoenzimas en
donde se alimenta el PQQ requerido mediante una segunda capa. Se
inmovilizan preferiblemente las sPQQGDH nuevas sobre un electrodo
de carbono con glutaraldehído y a continuación se trata con un
reactivo que contiene una amina, con ello reacciona el
glutaraldehído en exceso.
\newpage
Ejemplo
1
Se suspendieron muestras de suelo en solución
salina (NaCl al 0,9%) y se extendieron alícuotas sobre placas de
agar, que contenían un fondo nutritivo con gluconato como fuente de
carbono única. El medio estaba compuesto como sigue:
Se incubaron las placas a 30ºC durante 24 a 48
horas.
De forma alternativa se usaron también
Pseudomonas-agar de Oxoid. Las condiciones de incubación
fueron idénticas.
Se aislaron colonias cultivadas seleccionadas
sobre glucosa-eosina-azul de
metileno-agar. Este estaba compuesto como
sigue:
Se incubaron las placas a 30ºC durante 24 horas.
Se puede reconocer ahí clones positivos que son rojo oscuro y/o
poseen un brillo verde. Estas colonias se extendieron de nuevo sobre
nutriente agar (Oxoid) para comprobar la pureza. Este estaba
compuesto como sigue:
Se incubaron las placas durante 48 horas a 30ºC
y se aislaron de nuevo. Se recogieron a continuación las cepas
purificadas durante 20 horas a 30ºC en 100 ml de caldo nutriente
líquido (Oxoid), el medio tenía la siguiente composición:
Después del cultivo se cosecharon los cultivos
(4.500 x g, 40 minutos, 4ºC) y se lavaron con solución salina (NaCl
al 0,9%). Se resuspendieron los agregados en 5 ml de tampón KP 50 mM
pH 7,2, y se rompieron con ultrasonidos. Se centrifugó de nuevo el
extracto durante 30 minutos a 4ºC a 10.000 x g, se midió en el
sobrenadante libre de células la actividad de GDH. Sobre el medio
de selección se pudieron aislar con gluconato como fuente de
carbono única 26 cepas con actividad de GDH. Se pudieron aislar
cuatro cepas tras cultivo sobre el medio Pseudomonas.
Ejemplo
2
Se recogieron las cepas, cuya sPQQGDH se debería
investigar, en 8 l de medio NB (oxoide), que contenía 0,1% de
glucosa durante 20 horas a 30ºC. Se lavaron las células de nuevo
(4500 x g, 40 minutos, 4ºC) con 0,9% de solución salina y se
recogieron con 150 a 200 ml de MOPS 10 mM pH 8,0. La ruptura de las
células se realizó con ultrasonidos. Se recogió el extracto libre
de células sobre 300 ml de TSKgel CM-Toyopearl 650M
(Tosoh Corp.) y se lavó con 3 a 4 volúmenes de columna de MOPS 10
mM pH 8,0. Se realizó la elución con un gradiente de 0 a 0,3 M de
NaCl con un volumen de la columna de 3 a 4 veces. Se reunieron las
fracciones activas, se transfirieron a un tubo de diálisis y se
concentraron mediante adición de carboximetilcelulosa de alta
viscosidad como absorbedor de agua. Se resuspendió la muestra
concentrada con 3,5 volúmenes de K-MOPS 10 mM pH 6,8
y se purificó de nuevo sobre columna de
CM-Toyopearl. Se realizó el equilibrado de la
columna y el lavado con K-MOPS 10 mM pH 6,8, se
llevó a cabo la elución con un gradiente de NaCl de 0 a 0,3 M. Se
reunió las fracciones activas y se concentraron como se describe
anteriormente. Estas sirvieron como material de partida para la
determinación de la estabilidad térmica.
Ejemplo
3
Se incubaron los enzimas purificados para la
determinación de la estabilidad térmica durante 60 minutos a 50, 60
y 70ºC. La incubación se realizó en Pipes 50 mM a pH 6,5 en
presencia de CaCl_{2} 1 mM, 0,1% de Triton X-100,
0,1% de BSA y 5 \muM de PQQ. Después de la incubación se enfriaron
las muestras sobre hielo y se determinó la reactividad. Esta se
expresó en porcentaje de la actividad original.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para la clonación de los genes de sPQQGDH de las
cepas nuevas aquí descritas se experimentó amplificar en primer
lugar la secuencia de codificación completa en una PCR sobre ADN
genómico con oligonucleótidos sintéticos. El cebador usado a tal
fin derivado de la secuencia de sPQQGDH publicada (X15871; LMD
79.41) no condujo sin embargo a productos de PCR, ya que las
secuencias de las sPQQGDH de acuerdo con la invención se diferencian
en el intervalo del péptido señal y especialmente del tipo natural
cerca del codón de parada. Por tanto se usaron distintos cebadores
de ambas hebras de la secuencia de tipo natural que debieron
conducir con uso en una PCR a la amplificación de segmentos de la
secuencia de codificación. Con algunas de estas combinaciones de
cebador se pudieron aislar tales segmentos en las cepas descritas en
el ejemplo 3. Para reacciones de PCR se usaron por lo general kits
comerciales, normalmente el kit PCR-Master de la
compañía Roche, según las indicaciones del fabricante. Con los
cebadores GDH-fwd P1 (5'-CCA GAT AAT
CAA ATT TGG TTA AC-3') y GDH-rev P7
(5'-CAT CAC GAT AAC GGT TYT TGC-3')
se pudieron aislar fragmentos de aproximadamente 1200 bp de tamaño.
A continuación se secuenciaron los segmentos de ADN obtenidos. Para
obtener la secuencia completa de los genes individuales, se llevó a
cabo una PCR inversa (Sambrook y Russell: Molecluar Cloning - A
Laboratory Manual. CSHL Press (2001), página 8.81). En el presente
caso se usaron a tal fin cebadores que estaban posicionados
respectivamente en el borde del segmento de modo que se sintetiza
en una PCR adicional de la parte no conocida del gen de GDH. Se
realizó una reacción PCR de este tipo sobre ADN genómico de la
respectiva cepa, que se recorta con las endonucleasas de
restricción EcoR1 o BgIII y luego se recircularizó con
T4-ligasa. Como cebadores se usaron
GDH-3Mid
(5'-GGGATATGACCTACATTTGCTGGC-3') y
GDH-5Mid
(5'-TGTCCATCAGCRTCATTTACAAYCTCAG-3'),
que inicia la síntesis de ADN dirigida en dirección al extremo 3'
(GDH-3Mid) o extremo 5' (GDH-5Mid)
del gen de GDH. Los amplificados así obtenidos contenían también
las proporciones error de la secuencia de codificación, como se
desprendió mediante clonación en el vector pCR2.1 y a continuación
secuenciación. Con las secuencias de ADN presentes por completo
finalmente se desarrollaron de nuevo cebadores, que hacen posible
una clonación directa de la secuencia de codificación desde el
codón de inicio hasta el codón de parada. Los cebadores se
seleccionaron a este respecto de modo que es posible una clonación
en el vector pASK-IBA3 según las indicaciones de la
compañía IBA. A tal fin se posiciona un punto de corte Bsal
inmediatamente antes de la secuencia de codificación (en el cebador
que se une a 5') y uno inmediatamente después (en el cebador que se
une a 3'), de modo que es posible una ligadura dirigida del
producto de PCR recortado con Basl en el vector
pASK-IBA3 abierto con Bsal. Como cebador 5' se usó
GDH-U3
(5'-TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGCTAAAATTAC-3'),
como cebadores 3' se usaron GDH-L3
(5'-ATGGTAGGTCTCAGCGCTCTGAGCTTTATATGTAAACCTAATCAAAG-3';
para la GDH del clon PT15) y GDH-L4
(5'-ATGGTAGGTCTCAGCGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATCAGAG-3';
para todos los clones habituales). Los plásmidos que se generan se
designaron pAI3-X. En lugar de "X" se usa la
designación de cepa del clon del cual se aisló el ADN genómico. Para
fines comparativos se clonó de igual forma el gen de sPQQGDH a
partir de la cepa de tipo natural LMD79.41. A tal fin se usaron sin
embargo cebadores que se habían derivado de la secuencia publicada.
Este plásmido se designó pAI3-wt.
Los plásmidos descritos se transfirieron
mediante transformación química a la cepa DH5\alpha de E.
coli (compañía Invitrogen). Las cepas de bacterias así
obtenidas se designaron DH5\alpha::pAI3-X. De
forma similar se transfirieron los plásmidos a una cepa de E.
coli adicional, W3110 (ATCC 27325). Estas cepas se designaron
luego W3110::pAI3-X.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se preparó como sigue el
pre-cultivo. Se adicionaron a 2 ml de medio LB (50
\mug/ml de ampicilina) 0,1 ml de una solución madre de glicerina
de células DH5\alpha::pAI3-KOZ65 y se agitaron
durante la noche a 37º C y 225 rpm. Para el cultivo principal se
inocularon 1 l de medio TB (50 \mug/ml de ampicilina) en el
pre-cultivo. Se agitó el cultivo a 37ºC y 225 rpm,
hasta que se obtuvo una OD de aproximadamente 1. Luego se realizó la
incubación del cultivo principal con una solución madre de
anhidrotetraciclina (AHT). A tal fin se disolvió el inductor en
DMF. La concentración final del AHT en el cultivo fue de 0,2
\mug/ml, la incubación se realizó durante 24 horas a 27ºC y 225
rpm. La OD del cultivo principal fue de 4,2.
La cosecha de las células se realizó mediante
centrifugación del cultivo principal a 3220 x g durante 15 minutos
a 4ºC. Se resuspendieron los agregados celulares en 40 ml (= 1/25
del volumen total) en Tris-HCl 75 mM pH 8,0 y se
rompieron mediante prensa francesa. A tal fin se trata la suspensión
de células completa dos veces con la prensa francesa. El lisado
eventualmente enturbiado con inclusión de cuerpos y detritus
celulares se centrifugó a 48.745 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se
ensayaron el contenido en proteínas y la actividad del
sobrenadante. El contenido en proteínas fue de 9,25 mg/ml, la
actividad fue de 1,4 kU/ml. Referido al cultivo original se
obtuvieron 56 kU por l de cultivo.
\newpage
Ejemplo
6
Se separó cromatográficamente 11,2 ml del
sobrenadante del ejemplo 5 mediante un intercambiador de cationes
(Toyopearl CM-650M, compañía TOSOH BIOSEP GmbH) a
4ºC. Para ello se usa una columna XK 50/20 (compañía Amersham
Pharmacia Biotech) con aproximadamente 130 ml de lecho de columna;
el caudal fue de 8 ml/min. Se equilibró la columna con 10 volúmenes
de columna de K-MOPS 10 mM pH 8,0 + CaCl_{2} 1 mM,
luego se realizó la aplicación de la muestra. Se lavó la columna
con 4 volúmenes de columna de K-MOPS 10 mM pH 8,0 +
CaCl_{2} 1 mM, se eluyó a continuación mediante un gradiente de
sal lineal de NaCl de 0 a 0,4 N en K-MOPS 10 mM pH
8,0 (incluyendo respectivamente CaCl_{2} 1 mM), el eluído se
recogió en fracciones. La regeneración de la columna se realiza con
3 volúmenes de columna de NaCl 1 N + CaCl_{2} 1 mM.
Se ensayó la actividad de las fracciones de
eluído en placas de microtítulos de 96 pocillos de fondo plano para
encontrar las fracciones activas. La solución colorante estaba
compuesta como sigue:
PMS 0,2 mM (metosulfato de fenazina en
H_{2}O)
+ NTB 0,22 mM (azul de nitrotetrazolio en
H_{2}O)
+ 3 \mum de sal de PQQ-Na (en
DMSO)
en Tris/HCl 20 mM pH 7,5, con glucosa al 2%
Se llevó a cabo el ensayo como sigue: se
dispusieron 90 \mul de muestra cada vez en una placa de
microtítulos y se añadieron a cada una 110 \mul de solución
colorante, ya se puede observar la reacción de color en la mayoría
de los casos después de un minuto. En base a los resultados en el
cromatograma de UV en línea y en el ensayo de actividad se reúnen
las fracciones activas y dado el caso se concentra el reunido
mediante ultrafiltración (30.000 MWCO). Se realiza una
determinación de proteína así como un ensayo de actividad
cuantitativa (véase ejemplo 9).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el gel SDS y en el gel nativo se detectó sólo
una banda activa. La proteína estaba también más limpia. Referido
al cultivo original se obtuvieron 48,2 mg de proteína pura por l de
cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para una comparación de la estabilidad térmica
de sPQQGDH recombinante de LMD79.41 (plásmido
pAI3-wt) y de sPQQGDH de KOZ65 (plásmido
pAI3-KOZ65) se recogieron las cepas
W3110::pAl3-wt y W3110::pAl3-KOZ65
en 200 ml de medio TB con 100 \mug/ml de ampicilina. Una vez
hubiesen alcanzado los cultivos una OD_{600} de 3, se
centrifugaron las bacterias a 4.600 rpm durante 10' y se recogieron
los agregados en 25 ml cada uno de medio TB fresco con 100
\mug/ml de ampicilina. Para la inducción se añadió AHT hasta 2
\mug/ml y se agitaron las células a 22ºC durante 6 horas. Luego
se agregaron de nuevo las células y se conservaron los agregados
hasta el posterior procesamiento a -80ºC. Se resuspendieron las
células congeladas en 25 ml de tampón MOPS cada vez (MOPS 10 mM pH
8, CaCl_{2} 2,5 mM, 0,05% de Triton X-100) y se
rompieron mediante tratamiento con ultrasonidos, hasta que la
suspensión se volvió más clara. Se separaron los restos celulares a
20.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC y se purificó el sobrenadante
mediante una columna Toyopearl CM-650M (volumen del
lecho 20 ml). Para ello se lavó la columna tras la aplicación de
muestra con 50 ml de tampón MOPS (véase anteriormente) y a
continuación se eluyó proteína unida con un gradiente de NaCl de 0 a
0,6 mM en tampón MOPS. Se reunieron las fracciones con actividad de
GDH y se determinó la actividad de los reunidos (véase ejemplo
9).
Para la determinación de la estabilidad térmica
de ambas preparaciones de enzima se ajustó mediante dilución con
Pipes 50 mM, pH 6,5 con CaCl_{2} 1 mM, 0,1% de Triton
X-100, 0,1% de BSA y PQQ 5 \muM una solución de
20 U/ml. Se incubaron de esta solución alícuotas paralelamente
durante 60 minutos a 4ºC, 50ºC, 57ºC y 64ºC. Luego se determinaron
las siguientes actividades residuales, relativas al valor 100% a 4ºC
(por triplicado; véase el
ejemplo 9):
ejemplo 9):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se llevó a cabo la fermentación en un
fermentador de radiación de 10 litros (BIOSTAT C) de la compañía
Braun.
Se usaron para ello 5 litros de medio Riesenberg
(modificado).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Solución de oligoelementos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ajustó el pH a 6,80 tras adición de todos los
componentes del medio con NaOH 5 N.
La solución nutritiva se inoculó con 100 ml de
un pre-cultivo lavado durante la noche a 37ºC (medio
LB con 100 mg/l de ampicilina).
La OD tras la inoculación fue de 0,066. La tasa
de ventilación fue de 2 l/min, el número de revoluciones del
agitador de 500 rpm y la temperatura de 37ºC. Se ajustó el valor del
pH con NH_{3} 5 N a pH 7,25 y se mantuvo constante durante toda
la fermentación.
El valor de pO_{2} se redujo después de 12
horas de crecimiento por debajo del 10% y se consumió la glucosa en
su mayor parte. Después de 15 segundos de crecimiento la OD_{600}
fue de 14,2 y la masa seca de 6,2 g/l. En este momento se inició la
alimentación. La solución de alimentación se componía de:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtró la solución en condiciones de
esterilidad. Esta se alimentó mediante una bomba de manguera al
fermentador. El rendimiento de la bomba se reguló mediante el valor
teórico de pO_{2}, que se ajustó a 20%. Se realizó la regulación
de modo que se conectó la bomba a un valor de pO_{2} > 20% y se
alimentó glucosa fresca. El consumo de oxígeno empleado puede
reducir aún más el pO_{2}. Si se reduce el valor de pO_{2} por
debajo del 20% se desconecta la bomba. No se modificaron el número
de revoluciones ni la tasa de ventilación. Después de 64 horas de
crecimiento la OD_{600} alcanzó 50,2. Finalmente se alimentaron al
fermentador 5 l de medio TB doblemente concentrado, se redujo la
temperatura hasta 22ºC y se reguló la tasa de ventilación a 4
l/min.
Se aumentó el número de revoluciones del
agitador hasta 700 rpm. Luego se indujo el cultivo con 10 ml de
solución de anhidrotetraciclina (2 mg/ml en DMF) durante 6 horas. A
continuación se extrajo una muestra para la determinación de la
actividad. El ensayo de actividad dio un valor de 223 U/ml de
líquido de cultivo. Se obtuvieron sobre 220 mg de enzima puro por
ml de cultivo.
\newpage
Ejemplo
9
Se llevaron a cabo las medidas en un fotómetro
"Ultraspec 2000". Para ello se usaron las siguientes
soluciones:
\vskip1.000000\baselineskip
El reactivo de trabajo se compone de los
siguientes componentes:
- 25,5 ml de PIPES incluyendo 2,2% de Triton X-100
- 0,9 ml de glucosa
- 2,0 ml de PMS
- 1,0 ml de NTB
El EDB y el reactivo de trabajo se deberían
añadir lo más frescos posible.
\vskip1.000000\baselineskip
Realización de la determinación de la
actividad:
Se disponen 20 \mul de la dilución de muestra
elegida en microcubetas (como valor nulo se añaden 20 \mul de EDB
en lugar de la solución de muestra),
se añaden 600 \mul de reactivo de trabajo y se
inicia inmediatamente la medida a 570 nm durante 3 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo de la actividad:
Se determina el cambio de absorción como cambio
de extinción/minuto; una unidad de GDH produce 0,5 \mumol de
formazan por minuto. Es válida la siguiente fórmula:
U/ml = cambio de extinción/min x 1,54 x factor
de dilución \varepsilon = 40.200 M^{-1}cm^{-1}
<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Glucosa deshidrogenasa nueva y su
preparación
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LeA36627
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
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<211> 480
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<212> PRT
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<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Acinetobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Acinetobacter sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
Claims (8)
1. Pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa
soluble de secuencia como se representa en la figura 1,
caracterizada porque están intercambiados los siguientes
aminoácidos frente a LMD 79.41 de Acinetobacter de tipo
natural:
- la posición 21 tiene como aminoácido una N y 41 una S y 47 una L y 121 una V o una A y 149 una A y 213 una S y 244 una I y 320 una G y 391 una S y 452 una S y 474 una R y 480 una Q.
2. Pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa
soluble de secuencias de la reivindicación 1, caracterizada
porque pueden estar intercambiadas adicionalmente los siguientes
aminoácidos frente a LMD 79.41 de Acinetobacter de tipo
natural (numeración según figura 1):
- en las posiciones 16 puede estar una H, en 18 una L, en 20 una F, en 40 una G, en 48 una I, en 61 una A, en 111 una T, en 154 una D, en 190 una D, en 293 una A, en 311 una S, en 314 una A, en 324 una L, en 333 una M, en 339 una S, en, 355 una G, en 366 una D, en 417 una N y en 418 una A.
3. Pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa
soluble de secuencias correspondientes a la ID SEC 5 hasta la ID
SEC 28.
4. Pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa
soluble de secuencias según la reivindicación 1 a 3,
caracterizada porque están clonadas en el vector
pASK-IBA3 y se expresan heterólogamente en una cepa
del género Escherichia.
5. Procedimiento para la preparación de la
pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa soluble de
Acinetobacter según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque se cultiva un microorganismo que expresa
la pirroloquinolinquinona glucosa deshidrogenasa soluble y a
continuación se aísla la pirroloquinolinquinona glucosa
deshidrogenasa soluble.
6. Reactivo para la detección de glucosa que
contiene uno o varios enzimas pirroloquinolinquinona glucosa
deshidrogenasa soluble según las reivindicaciones 1 a 3.
7. Sensor para la detección de glucosa que
contiene uno o varios enzimas pirroloquinolinquinona glucosa
deshidrogenasa soluble según las reivindicaciones 1 a 3.
8. Uso de varios enzimas pirroloquinolinquinona
glucosa deshidrogenasa soluble según las reivindicaciones 1 a 3
para la detección de glucosa.
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