JP2000350588A

JP2000350588A - グルコース脱水素酵素

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Publication number: JP2000350588A
Application number: JP2000009152A
Authority: JP
Inventors: Koji Hayade; 広司早出
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2000-12-19
Also published as: US7067295B1; CN1350579A; EP1167519A4; IL145805A0; WO2000061730A1; CN1576365A; EP1167519A1; TW585917B; CN1288242C; US20060099698A1; CA2364565A1; KR20010109347A

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、改良されたグルコースに対する親
和性を有する改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供すること
を目的とする。【解決手段】ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
溶性グルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨの第２２７残基から２４４残基、第１８６残
基から２２１残基または第４１２残基から４２１残基に
相当する領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基
が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする
改変型グルコース脱水素酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノ
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されている改変型ＰＱＱＧＤＨに関する。本発明の改変
型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるグルコース
の定量に有用である。

【０００２】

【従来の技術】ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。

【０００３】ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性
酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨ
は、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であ
り、種々のグラム陰性菌において広く見いだされてい
る。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株に
おいてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９
（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクロ
ーニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３
０−４３６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水
溶性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのホモダイマ
ーである。他のＰＱＱ酵素とは蛋白質一次構造上でのホ
モロジーがほとんどなく、その機能と構造の相関に関す
る研究はすすんでいないため、酵素安定化の指針となり
うる知見はこれまでに得られていない。

【０００４】最近、オランダの研究者グループにより水
溶性PQQGDHのＸ線結晶構造解析がおこなわれ、同酵素の
高次構造が明かとなった（J.Mol.Biol., 289, 319-333
(1999), The crystal structure of the apo form of t
he soluble quinoprotein glucose dehydrogenase from
Acinetobacter calcoaceticus reveals a novel inter
nal conserved sequence repeat; A.Oubrie et al., Th
e EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999), Structure
and mechanism of soluble quinoprotein glucose deh
ydrogenase, A. Oubrie et al., PNAS, 96(21), 11787-
11791 (1999), Active-site structure of the soluble
quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with
methylhydrazine: A covalent cofactor-inhibitor co
mplex, A.Oubrie et al.）。これらの論文によれば、水
溶性ＰＱＱＧＤＨは６つのＷ−モチーフから構成される
βプロペラ蛋白質である。

【０００５】血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマ
ーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。ま
た、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の
定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっ
ている。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ
６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しか
し、ＧＯＤを用いる方法ではグルコース酸化反応にとも
ない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼある
いはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要があ
った。またＧＯＤを用いるバイオセンサーの開発も進め
られてきたが、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存す
ることから高濃度のグルコース試料には適さないこと、
あるいは溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じる可
能性があった。一方、Ｇ６ＰＤＨは分光学的手法に基づ
くグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素
であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならないという煩
雑性があった。そこで、これまでのグルコース酵素定量
方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素としてＰ
ＱＱＧＤＨの応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨはグ
ルコースに対して高い酸化活性を有していること、およ
びＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受
容体として酸素を必要としないことから、グルコースセ
ンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応
用が期待されている。しかしながら、ＰＱＱＧＤＨはＧ
ＯＤと比較して熱安定性が低いという問題点があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、改良された熱安定性を有する改変型水溶性ＰＱＱＧ
ＤＨを提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は従来の水溶性
ＰＱＱＧＤＨを改良してその熱安定性を高め、臨床検査
や食品分析などに応用できる改変型ＰＱＱＧＤＨを開発
すべく鋭意研究を行なった結果、水溶性ＰＱＱＧＤＨの
特定の領域においてアミノ酸変異を導入することによ
り、安定性がきわめて高い酵素を得ることに成功した。
すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノンを補酵素と
するグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨ（本明細書においては、野生型ＰＱＱＧＤＨ
とも称される）の２３１番目のセリン残基に相当するア
ミノ酸残基、または２０９番目のグルタミン残基、また
は２１０番目のグルタミン酸残基、または４２０番目の
アスパラギン酸残基、または４２１番目のアラニン残基
に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換され
ている改変型グルコース脱水素酵素を提供する。なお、
本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチオニ
ンを１として番号付けする。本発明はまた、ピロロキノ
リンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素におい
て、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、第４８残基
から５３残基、第６０残基から６２残基、第６９残基か
ら７１残基、第７９残基から８２残基、第９１残基から
１０１残基、第１１０残基から１１５残基、第１２７残
基から１３５残基、第１４７残基から１５０残基、第１
６１残基から１６９残基、第１７７から１７９残基、第
１８６残基から２２１残基、第２２７残基から２４４残
基、第２５０残基から２５５残基、第２６１残基から２
６３残基、第２７１残基から２７５残基、第２８２残基
から３４３残基、第３４９残基から３７７残基、第３８
２残基から３９３残基、第４００から４０３残基、第４
１２残基から４２１残基、第４２７残基から４３２残
基、第４３８残基から４４１残基および第４４９残基か
ら４６８残基の領域からなる群より選択される１または
それ以上の領域において、１またはそれ以上のアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基で置換されており、Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水
溶性ＰＱＱＧＤＨより高い熱安定性を有することを特徴
とする改変型グルコース脱水素酵素を提供する。好まし
くは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、５０℃で１０分
間熱処理した後の活性の残存率が天然型ＰＱＱＧＤＨの
活性の残存率より１０％以上高く、より好ましくは２０
％以上高く、さらに好ましくは３０％以上高い。また好
ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、５５℃にお
ける熱失活半減期が天然型ＰＱＱＧＤＨの熱失活半減期
より５分以上長く、より好ましくは１５分以上長い。本
発明の特に好ましい改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１
で表されるアミノ酸配列の第２２７残基から２４４残
基、第１８６残基から２２１残基または第４１２残基か
ら４２１残基の領域において、１またはそれ以上のアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。さらに
好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号
１で表されるアミノ酸配列の２３１番目のセリン残基
が、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジ
ン、メチオニン、ロイシンおよびシステインからなる群
より選択されるアミノ酸残基で置換されているか、また
は２０９番目のグルタミン残基がリジン残基で、または
２１０番目のグルタミン酸残基がリジン残基で、または
４２０番目のアスパラギン酸残基がリジン残基で、また
は４２１番目のアラニン残基がアスパラギン酸残基で置
換されている。

【０００８】また別の観点においては、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨは、配列：Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile P
ro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser ［式中、Xaa231はSer以外の天然アミノ酸残基である］
または配列：Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Ty
r Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala GlnHis Thr Pro Thr G
ln Xaa209 Xaa210 Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr T
yr Met Gly ［式中、Xaa209およびXaa210は任意の天然アミノ酸残基
である、ただし、Xaa209がGlnであるとき、Xaa210はGlu
ではない］または配列：Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr
Asp Xaa420 Xaa421 ［式中、Xaa420およびXaa421任意の天然アミノ酸残基で
ある、ただし、Xaa420がAspであるとき、Xaa421はAlaで
はない］を含む。

【０００９】本発明はまた、上述の改変型グルコース脱
水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター
および該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキ
ットおよびグルコースセンサーを提供する。

【００１０】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの酵素蛋白質
は高い熱安定性を有し、かつグルコースに対して高い酸
化活性を有していることから、グルコースの高感度かつ
高選択的な測定に応用できる。

【００１１】

【発明の実施の形態】改変型ＰＱＱＧＤＨの構造本発明者は、水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の
コーディング領域中にエラープローンＰＣＲ法によりラ
ンダムに変異を導入し、アミノ酸残基の変異が導入され
た水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブラリーを構築した。これ
を大腸菌に形質転換し、熱処理後のＰＱＱＧＤＨの残存
活性についてスクリーニングして、熱安定性の向上した
ＰＱＱＧＤＨを発現する多数のクローンを得た。

【００１２】これらのクローンの一つについて遺伝子配
列を解析したところ、第２３１番目のＳｅｒがＣｙｓに
置換されていることが判明した。さらにこの残基を種々
の別のアミノ酸残基に置換したところ、いずれの残基に
置換しても野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性に
優れた変異酵素が得られた。

【００１３】水溶性ＰＱＱＧＤＨは６つのＷ−モチーフ
から構成されるβプロペラ蛋白質の構造を有している。
本発明においては、ループ領域の１つである第２２７残
基から２４４残基の領域中の第２３１番目のＳｅｒを他
のアミノ酸に置換することにより、熱安定性が向上する
ことが見いだされた。次に、他のループ領域に関して部
位特異的に変異を導入し、その熱安定性の向上を試み
た。第１８６残基から２２１残基のループに存在する２
０９番目のＧｌｎをＬｙｓに、同２１０番目のＧｌｕを
Ｌｙｓに、第４１２残基から４２１残基のループに存在
する４２０番目のＡｓｐをＬｙｓに、同４２１番目のＡ
ｌａをＡｓｐに置換したところ、変異型酵素の熱安定性
が向上した。

【００１４】すなわち、本発明により、ループ領域中に
適切な変異を導入することにより、熱安定性が向上した
水溶性ＰＱＱＧＤＨを構築しうることが立証された。こ
れは、水溶性ＰＱＱＧＤＨにおいては、Ｗ−モチーフ間
のループ領域の間の相互作用がβプロペラ蛋白質の構造
の安定化に寄与しているためであると考えられる。上記
に示したＳｅｒ２３1、Ｇｌｎ２０９、Ｇｌｕ２１０、
Ａｓｐ４２０、Ａｌａ４２１残基は単なる例であり、本
発明を限定するものではない。本発明は、ループ領域の
構造遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりＰ
ＱＱＧＤＨの熱安定性を改良できることを当該技術分野
において初めて明らかにしたものであり、ＰＱＱＧＤＨ
の熱安定性を改良する方法論がここで提供される。

【００１５】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号
１で表される野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列中の特
定の領域中にアミノ酸残基の変異を含むことを特徴とす
る。すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノンを補酵
素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で
表されるアミノ酸配列の、第４８残基から５３残基、第
６０残基から６２残基、第６９残基から７１残基、第７
９残基から８２残基、第９１残基から１０１残基、第１
１０残基から１１５残基、第１２７残基から１３５残
基、第１４７残基から１５０残基、第１６１残基から１
６９残基、第１７７から１７９残基、第１８６残基から
２２１残基、第２２７残基から２４４残基、第２５０残
基から２５５残基、第２６１残基から２６３残基、第２
７１残基から２７５残基、第２８２残基から３４３残
基、第３４９残基から３７７残基、第３８２残基から３
９３残基、第４００から４０３残基、第４１２残基から
４２１残基、第４２７残基から４３２残基、第４３８残
基から４４１残基および第４４９残基から４６８残基の
領域からなる群より選択される１またはそれ以上の領域
において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミ
ノ酸残基で置換されている構造を有する、改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを提供する。

【００１６】本発明の好ましい改変型ＰＱＱＧＤＨは、
配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２２７残基から
２４４残基、第１８６残基から２２１残基または第４１
２残基から４２１残基の領域において、１またはそれ以
上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されてい
る。さらに、本発明の特に好ましい改変型ＰＱＱＧＤＨ
は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２３１番目の
セリン残基が、リジン、アスパラギン、アスパラギン
酸、ヒスチジン、メチオニン、ロイシンおよびシステイ
ンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されて
いるか、またはまたは２０９番目のグルタミン残基がリ
ジン残基で、または２１０番目のグルタミン酸残基がリ
ジン残基で、または４２０番目のアスパラギン酸残基が
リジン残基で、または４２１番目のアラニン残基がアス
パラギン酸残基で置換されている。

【００１７】また別の観点においては、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨは、配列：Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile P
ro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser ［式中、Xaa231はSer以外の天然アミノ酸残基である］または配列：Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Ty
r Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala GlnHis Thr Pro Thr G
ln Xaa209 Xaa210 Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr T
yr Met Gly ［式中、Xaa209およびXaa210は任意の天然アミノ酸残基
である、ただし、Xaa209がGlnであるとき、Xaa210はGlu
ではない］または配列：Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa420
Xaa421［式中、Xaa420およびXaa421任意の天然アミノ
酸残基である、ただし、Xaa420がAspであるとき、Xaa42
1はAlaではない］を含む。

【００１８】本発明の改変型グルコース脱水素酵素にお
いては、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限
り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換さ
れていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されてい
てもよい。さらに、当業者は、他の細菌に由来する水溶
性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にしたがって
ループ構造を有する領域を予測し、この領域内でアミノ
酸残基を置換することにより、熱安定性の向上した改変
型グルコース脱水素酵素を得ることができる。特に、蛋
白質の一次構造を並列して比較することにより、Ａｃｉ
ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由
来の水溶性ＰＱＱＧＤＨの２３１番目のセリン残基、２
０９番目のグルタミン残基、２１０番目のグルタミン酸
残基、４２０番目のアスパラギン酸残基、または４２１
番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基を容易に認
識することができ、本発明にしたがって、かかる残基を
他のアミノ酸残基で置換して改変型グルコース脱水素酵
素を得ることができる。これらの改変型グルコース脱水
素酵素も本発明の範囲内である。改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子の配列は配列番号２で規定される。

【００１９】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする
遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子において、上述のループ領域中に存在するアミノ酸残
基をコードする塩基配列を、変異すべきアミノ酸残基を
コードする塩基配列に置換することにより構築すること
ができる。このような部位特異的塩基配列置換のための
種々の方法が、当該技術分野において知られている。こ
のようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター
（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例
えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させ
るための多くのベクター・宿主系が当該技術分野におい
て知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培
養細胞などの種々のものを用いることができる。

【００２０】ランダム変異を導入する場合には、標的と
するループ領域においてエラープローンＰＣＲ法により
ランダムに変異を導入し、ループ領域に変異が導入され
た変異水溶性ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーを構築す
る。これを大腸菌に形質転換し、ＰＱＱＧＤＨの熱安定
性について各クローンをスクリーニングする。水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨは大腸菌において発現させたときにペリプラ
ズム空間に分泌されるため、菌体そのものを用いて容易
に酵素活性の検定を行うことができる。このライブラリ
ーを６０−７０℃で約３０分処理した後に、グルコース
および色素としてＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、残存するＰ
ＱＱＧＤＨの活性を目視により判定して、熱処理によっ
ても残存活性を示すクローンを選択し、遺伝子配列を解
析してその変異を確認する。

【００２１】上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心
分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスな
どで破砕するか、またはオスモティックショックにより
ペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心
分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることがで
きる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることに
より、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させるこ
ともできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、Ｈ
ＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨを調製する。酵素活性の測定方法本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グル
コースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触
媒する作用を有する。

【００２２】酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグ
ルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸
化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈
色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ンなどを用いることができる。熱安定性本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの熱安定性は、酵素を高温
（例えば５５℃）でインキュベートし、一定時間ごとに
アリコートを取り出して酵素活性を測定し、時間経過に
ともなう酵素活性の低下をモニターすることにより評価
することができる。典型的には、酵素の熱安定性は、酵
素活性が５０％に減少するまでに要する時間（ｔ_1/2）
を指標として表される。

【００２３】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型Ｐ
ＱＱＧＤＨと比較して高い熱安定性を有することを特徴
とする。このため、酵素生産において調製／精製時の失
活が少なく収率が高い、溶液中での安定性が高く酵素の
保存が容易である、本酵素を用いてアッセイキットある
いは酵素センサーを作成する過程において失活が少な
く、本酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは
酵素センサーの熱安定性が高いことから、保存性に優れ
るなどの利点を有する。グルコースアッセイキット本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含む
グルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグル
コースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧ
ＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典
型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加
えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャ
リブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試
薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供す
ることができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で
提供し、使用時にホロ化することもできる。グルコースセンサー本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カ
ーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上
に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架
橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する
方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電
性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフ
ェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエ
ーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着
固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよ
い。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化し
た形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定
化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供するこ
ともできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化
した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアル
デヒドをブロッキングする。

【００２４】グルコース濃度の測定は、以下のようにし
て行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱ
およびＣａＣｌ₂、およびメディエーターを加えて一定
温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用い
ることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電
極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用
いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定
常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコー
ス濃度を計算することができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。実施例１変異ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリの構築およびスクリ
ーニングプラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファ
ルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Acinetob
acter calcoaceticus由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構
造遺伝子を挿入したものである（図１）。このプラスミ
ドをテンプレートとして、エラープローンＰＣＲ法によ
りコーディング領域中にランダムに変異を導入した。Ｐ
ＣＲ反応は、表１に示す組成の溶液中で、９４℃３分
間、次に、９４℃３分間、５０℃２分間、および７２℃
２分間を３０サイクル、最後に７２℃で１０分間の条件
で行った。

【００２６】

【表１】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）０．５μｌテンプレートＤＮＡ１．０μｌフォワードプライマーＡＢＦ４．０μｌリバースプライマーＡＢＲ４．０μｌ１０× Ｔａｑポリメラーゼバッファー１０．０μｌ１Ｍ β−メルカプトエタノール１．０μｌＤＭＳＯ１０．０μｌ５ｍＭＭｎＣｌ₂ １０．０μｌ１０ｍＭｄＧＴＰ２．０μｌ２ｍＭｄＡＴＰ２．０μｌ１０ｍＭｄＣＴＰ２．０μｌ１０ｍＭｄＴＴＰ２．０μｌＨ₂Ｏ５１．５μｌ１００．０μｌ得られた変異水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブラリーを大腸
菌に形質転換し、形成された各コロニーをマイクロタイ
タープレートに移した。プレートを６０℃で約３０分熱
処理した後に、グルコースおよびＰＭＳ−ＤＣＩＰを加
え、残存するＰＱＱＧＤＨの活性を目視で判定した。熱
処理後においてもＰＱＱＧＤＨの活性を示すクローンが
多数得られた。

【００２７】このうち１つのクローンを任意に選び、遺
伝子配列を解析したところ、第２３１番目のセリンがシ
ステインに変異していたことがわかった。実施例２改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由
来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、常法に従って部
位特異的変異法により２３１番目のセリン残基、２０９
番目のグルタミン残基、２１０番目のグルタミン酸残
基、４２０番目のアスパラギン酸残基、または４２１番
目のアラニン残基をコードする塩基配列を所定のアミノ
酸残基をコードする塩基配列に置換した。部位特異的変
異はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図２に示す方法によ
り行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲ
ットプライマーの配列を表２に示す。表２においては、
例えば「Ｓ２３１Ｄ」は、２３１番目のセリンがアスパ
ラギン酸に置換されていることを表す。

【００２８】

【表２】 S231D 5'-C CTT TGG AAT ATC TCC ATC AAG ATT TAA GC-3' S231H 5'-C CTT TGG AAT ATG TCC ATC AAG ATT TAA GC-3' S231K 5'-C CTT TGG AAT TTT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3' S231L 5'-C CTT TGG AAT CAT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3' S231M 5'-C CTT TGG AAT AGT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3' S231N 5'-C CTT TGG AAT ATT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3' I278F 5'-C AAT GAG GTT GAA TTC ATC GTC AGA G-3' Q209K 5'-G ACC ATT CAG TTC TTT TTG AGT TGG C-3' E210K 5'-G ACC ATT CAG TTT TTG TTG AGT TGG C-3' D420K 5'-A CAT CGG TAC AGC TTT ATC ATA AGT AG-3' A421D 5'-A CAT CGG TAC ATC GTC ATC ATA AGT AG-3' ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造（株））にAc
inetobacter calcoaceticus由来ＰＱＱＧＤＨをコード
する遺伝子の一部を含むKpn I-Hind III断片を組み込
み、これをテンプレートとした。このテンプレート５０
fmolと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｅｘｐ
ｒｅｓｓＫｍキットに付属のセレクションプライマー
５pmol、リン酸化したターゲットプライマー５０pmolを
全体（２０μｌ）の１／１０量の同キットのアニーリン
グバッファーとともに混合し、１００℃、３分間の熱処
理でプラスミドを変性させ、１本鎖にした。セレクショ
ンプライマーはｐＫＦ１８ｋのカナマイシン耐性遺伝子
上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのもので
ある。これを５分間氷上に置き、プライマーをアニーリ
ングさせた。これに３μｌの同キットエクステンション
バッファー、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１μｌの
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌの滅菌水を加え
て相補鎖を合成した。

【００２９】これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株で
あるE.coli ＢＭＨ７１−１８mutSに形質転換し、一晩
振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。次に、こ
こから抽出したプラスミドをE.coli ＭＶ１１８４に形
質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そ
してこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、
目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラス
ミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子のKpn I-Hind III断片と入れ替え、改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈの遺伝子を構築した。実施例３改変型酵素の調製野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子
を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿
入し、構築されたプラスミドをE.coli ＤＨ５α株に形
質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ
含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養
し、１ｍＭＣａＣｌ₂、５００μＭＰＱＱを含む７１の
Ｌ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピル
チオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加
し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離
（5000×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、この菌体
を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。集菌した菌
体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（10000×ｇ、
１５分、４℃）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠
心分離（160500×ｇ（40000r.p.m.)、９０分、４℃）
し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以
下の実施例において用いた。

【００３０】さらに、こうして得た水溶性画分を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で一晩透析した。透析したサ
ンプルを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇ
ｅｌＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株
式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２
ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を
用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行っ
た。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭＭＯ
ＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。
このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ
蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例
において用いた。実施例４酵素活性の測定酵素活性の測定は１０ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光
度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少
速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μ
ｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットと
した。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係
数は１６．３ｍＭ^-1とした。実施例５粗精製酵素標品の熱安定性の評価実施例３で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨ
の粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣ
ａＣｌ₂存在下で１時間以上ホロ化した後、５５℃でイ
ンキュベートした。一定時間ごとにアリコートを取り出
し、氷上で急冷した。これらのサンプルの酵素活性を実
施例４の方法に従って測定し、活性が５０％に低下する
のに要する時間（ｔ_1/2）として表した。

【００３１】結果を表３に示す。

【００３２】

【表３】ｔ_1/2（分）野生型１０Ｓ２３１Ｋ９５Ｓ２３１Ｌ１６Ｓ２３１Ｄ２５Ｓ２３１Ｃ５０Ｓ２３１Ｍ１４Ｓ２３１Ｈ１５Ｓ２３１Ｎ５０Ｉ２７８Ｆ２５Ｑ２０９Ｋ４０Ｅ２１０Ｋ４０Ｄ４２０Ｋ２０Ａ４２１Ｄ８０本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの５５℃における熱失活の
半減期はいずれも野生型ＰＱＱＧＤＨの５５℃における
熱失活の半減期より長く、野生型ＰＱＱＧＤＨと比較し
て高い熱安定性を有することがわかる。実施例６精製酵素標品の熱安定性の評価実施例３で得られた野生型酵素およびＳ２３１Ｋ改変型
酵素の精製酵素標品を用いて、実施例５と同様に５５℃
における熱失活の半減期を測定した。野生型の精製酵素
の熱失活の半減期は５分であり、Ｓ２３１Ｋ改変型酵素
の熱失活の半減期は４１分であった。

【００３３】次に、実施例３で得られた野生型酵素およ
びＳ２３１Ｋ改変型酵素の精製酵素標品をそれぞれ１μ
ＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ₂存在下で１時間以上ホロ
化した。次に、１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ₂、１
０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、指示され
た温度で１０分間インキュベートした後、氷上で急冷し
た。これらの試料の酵素活性を実施例４の方法に従って
測定し、熱処理前の活性に対する残存活性として表し
た。

【００３４】結果を図３に示す。Ｓ２３１Ｋ改変型酵素
は、４０℃から６２．５℃までの各温度において、野生
型酵素と比較して高い活性を有していた。実施例７酵素活性の評価実施例３で得られたＳ２３１Ｋ改変型酵素の粗精製酵素
標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ₂存在
下で１時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注
し、３μｌの活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４８μｌ，６０
０ｍＭＰＭＳ８μｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０
１６μｌ）および各濃度のＤ−グルコース溶液１０μ
ｌを加え、実施例４に示す方法により室温で酵素活性を
測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、Ｋｍお
よびＶｍａｘを求めた。Ｓ２３１Ｋのグルコースに対す
るＫｍ値は約２０ｍＭであり、Ｖｍａｘ値は３３００Ｕ
／ｍｇであった。これまで報告されている野生型ＰＱＱ
ＧＤＨのグルコースに対するＫｍ値は約２０ｍＭであ
り、Ｖｍａｘ値は測定上件により２５００−７０００Ｕ
／ｍｇである。この結果から、Ｓ２３１Ｋ改変型ＰＱＱ
ＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨに匹敵する高い活性を有
する酵素であることがわかる。実施例８基質特異性の評価各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調
べた。基質として、それぞれ２０ｍＭのグルコース、お
よび２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノース、アロ
ース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトー
ス、キシロース、ラクトースおよびマルトースを用い、
１μＭＰＱＱおよび１ｍＭＣａＣｌ₂の存在下で３
０分間インキュベートして、実施例７と同様に酵素活性
を測定した。値はグルコースを基質としたときの活性に
対する相対活性で表した。図４に示されるように、本発
明の改変型酵素はいずれも野生型酵素と同様の基質特異
性を示した。実施例９グルコースのアッセイ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いてグルコースをアッセイし
た。Ｓ２３１Ｋ改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ
ＣａＣｌ₂存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグ
ルコースおよび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭＣａＣｌ₂存
在下で酵素活性を測定した。方法は実施例４に記載の酵
素活性の測定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度
の変化を指標とした。図５に示されるように、Ｓ２３１
Ｋ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて、５ｍＭ−５０ｍＭの範
囲でグルコースの定量を行うことができる。実施例１０酵素センサーの作製および評価５ＵのＳ２３１Ｋ改変型酵素にカーボンペースト２０ｍ
ｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既
にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペ
ースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。こ
の電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭＭ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理し
た後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭＭ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡
化させた。電極は４℃で保存した。

【００３５】作製した酵素センサーを用いてグルコース
濃度の測定を行った。得られたキャリブレーションカー
ブを図６に示す。すなわち、本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈを固定化した酵素センサーを用いて、１ｍＭ−１２ｍ
Ｍの範囲でグルコースの定量を行うことができた。

【００３６】

【発明の効果】改変型ＰＱＱＧＤＨは熱安定性に優れて
いることから、酵素生産において調製／精製時の失活が
少なく収率が高い、溶液中での安定性が高く酵素の保存
が容易である、本酵素を用いてアッセイキットあるいは
酵素センサーを作成する過程において失活が少なく、本
酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素セ
ンサーの熱安定性が高いことから、保存性に優れるとい
った利点が期待される。

【００３７】

【配列表】 Sequence Listing <110> Sode, Koji <120> Glucose Dehydrogenase <130> 000029 <150> JP 11-101143 <151> 1999-4-8 <160> 16 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 1 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60 cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120 ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180 tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240 atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300 aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360 aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420 accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480 tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540 agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600 tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660 aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720 taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780 actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840 aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900 acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960 aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020 gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080 caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140 gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200 cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260 gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320 ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380 agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440 ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500 cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560 cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 4 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 3 Asn Leu Asp Gly Xaa Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val 1 5 10 15 Val Ser <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 24 <223> Xaa is any amino acid residue <222> 25 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 4 Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln 1 5 10 15 Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Xaa Xaa Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His 20 25 30 Thr Tyr Met Gly 35 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 9 <223> Xaa is any amino acid residue <222> 10 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 5 Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 6 cctttggaat atctccatca agatttaagc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 7 cctttggaat atgtccatca agatttaagc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 8 cctttggaat ttttccatca agatttaagc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 9 cctttggaat cattccatca agatttaagc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 10 cctttggaat agttccatca agatttaagc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 11 cctttggaat atttccatca agatttaagc 30 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 12 caatgaggtt gaattcatcg tcagag 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 13 gaccattcag ttctttttga gttggc 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 14 gaccattcag tttttgttga gttggc 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 15 acatcggtac agctttatca taagtag 27 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 16 acatcggtac atcgtcatca taagtag 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明において用いたプラスミドｐ
ＧＢ２の構造を示す。

【図２】図２は、本発明の改変型酵素をコードする突
然変異遺伝子を作成する方法を示す。

【図３】図３は、本発明の改変型酵素の熱安定性を示
す。

【図４】図４は、本発明の改変型酵素の基質特異性を
示す。

【図５】図５は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースのアッセイを示す。

【図６】図６は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
る酵素センサーのキャリブレーションカーブを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｑ 1/54 Ｃ１２Ｑ 1/54 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧ
ＤＨの２３１番目のセリン残基に相当するアミノ酸残基
が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース
脱水素酵素。
【請求項２】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧ
ＤＨの２０９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコ
ース脱水素酵素。
【請求項３】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧ
ＤＨの２１０番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ
酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グル
コース脱水素酵素。
【請求項４】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧ
ＤＨの４２０番目のアスパラギン酸残基に相当するアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グ
ルコース脱水素酵素。
【請求項５】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧ
ＤＨの４２１番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残
基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコー
ス脱水素酵素。
【請求項６】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列の、第４８残基から５３残基、第６０残基か
ら６２残基、第６９残基から７１残基、第７９残基から
８２残基、第９１残基から１０１残基、第１１０残基か
ら１１５残基、第１２７残基から１３５残基、第１４７
残基から１５０残基、第１６１残基から１６９残基、第
１７７から１７９残基、第１８６残基から２２１残基、
第２２７残基から２４４残基、第２５０残基から２５５
残基、第２６１残基から２６３残基、第２７１残基から
２７５残基、第２８２残基から３４３残基、第３４９残
基から３７７残基、第３８２残基から３９３残基、第４
００から４０３残基、第４１２残基から４２１残基、第
４２７残基から４３２残基、第４３８残基から４４１残
基および第４４９残基から４６８残基の領域からなる群
より選択される１またはそれ以上の領域において、１ま
たはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されており、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｅｒｃａｌｃ
ｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性グルコース脱水素酵素と
比較して高い熱安定性を有することを特徴とする改変型
グルコース脱水素酵素。
【請求項７】配列番号１で表されるアミノ酸配列の第
２２７残基から２４４残基の領域において、１またはそ
れ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されて
いる、請求項３に記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項８】配列番号１で表されるアミノ酸配列の２
３１番目のセリン残基が、他のアミノ酸残基で置換され
ている、請求項７記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項９】配列番号１で表されるアミノ酸配列の第
１８６残基から２２１残基の領域において、１またはそ
れ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されて
いる、請求項３に記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１０】配列番号１で表されるアミノ酸配列の
２０９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基で置換されている、請求項９記載の改
変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１１】配列番号１で表されるアミノ酸配列の
２１０番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基
が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項９記載の
改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１２】配列番号１で表されるアミノ酸配列の
第４１２残基から４２１残基の領域において、１または
それ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換され
ている、請求項３に記載の改変型グルコース脱水素酵
素。
【請求項１３】配列番号１で表されるアミノ酸配列の
４２０番目のアスパラギン酸残基に相当するアミノ酸残
基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１２記
載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１４】配列番号１で表されるアミノ酸配列の
４２１番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が他
のアミノ酸残基で置換されている、請求項１２記載の改
変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１５】配列：Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile P
ro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser ［式中、Xaa231はSer以外の天然アミノ酸残基である］
を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコー
ス脱水素酵素。
【請求項１６】配列：Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln
Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala GlnHis Thr
Pro Thr Gln Xaa209 Xaa210 Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
His Thr Tyr Met Gly ［式中、Xaa209およびXaa210は任意の天然アミノ酸残基
である、ただし、Xaa209がGlnであるとき、Xaa210はGlu
ではない］を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とす
るグルコース脱水素酵素。
【請求項１７】配列：Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr
Asp Xaa420 Xaa421 ［式中、Xaa420およびXaa421任意の天然アミノ酸残基で
ある、ただし、Xaa420がAspであるとき、Xaa421はAlaで
はない］を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とする
グルコース脱水素酵素。
【請求項１８】請求項１−１７のいずれかに記載の改
変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
【請求項１９】請求項１８に記載の遺伝子を含むベク
ター。
【請求項２０】請求項１８に記載の遺伝子を含む形質
転換体。
【請求項２１】遺伝子が主染色体に組み込まれてい
る、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２２】請求項１−１７のいずれかに記載の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキ
ット。
【請求項２３】請求項１−１７のいずれかに記載の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。