ES2306478T3

ES2306478T3 - Secuencias nucleidas de polipeptidos exportados de micobacterias, vectores que los comprenden y aplicaciones para el diagnostico y para la tuberculosis.

Info

Publication number: ES2306478T3
Application number: ES98942748T
Authority: ES
Inventors: Brigitte Gicquel; Denis Portnoi; Eng-Mong Lim; Vladimir Pelicic; Agnes Guigueno; Yves Goguet De La Salmoniere
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: FR2767337A1; DK1003888T3; US20050158714A9; US7244613B2; EP1003888A2; JP2002534956A; EP1003888B1; WO1999009186A2; NZ529503A; FR2767337B1; EP1950221A3; WO1999009186A3; NZ519053A; NZ503316A; EP1950221A2; US20070015173A1; DE69839426D1; PT1003888E; ATE393828T1; DE69839426T2

Abstract

Vector recombinante de cribado, de clonación y/o de expresión, caracterizado porque se replica en unas micobacterias y porque contiene: 1) un replicón funcional en las micobacterias; 2) un marcador de selección; 3) un casete indicador que comprende: a) un sitio de clonación múltiple (polylinker), b) eventualmente, un terminador de transcripción activo en las micobacterias, en dirección corriente arriba del polylinker, c) una primera secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de exportación y/o de secreción de proteína, estando dicha secuencia nucleotídica desprovista de su codón de iniciación y de sus secuencias de regulación, y d) en dirección corriente abajo, una segunda secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado, estando dicha secuencia nucleotídica desprovista de su codón de iniciación.

Description

Secuencias nucleicas de polipéptidos exportados de micobacterias, vectores que los comprenden y aplicaciones para el diagnóstico y para la prevención de la tuberculosis.

La presente invención tiene por objeto nuevos vectores recombinantes de cribado, de clonación y/o de expresión que se replican en las micobacterias. La misma tiene asimismo por objeto un procedimiento de cribado de secuencias que codifican para unos polipéptidos exportados y/o secretados, inducidos o reprimidos durante la ingestión de las micobacterias por lo macrófagos que usa un vector de la invención. Por último, la invención se refiere a unas micobacterias recombinantes transformadas por un vector según la invención.

El género Mycobacterium, que comprende por lo menos 56 especies diferentes, incluye unos agentes patógenos humanos mayores tales como M. leprae y M. tuberculosis, los agentes responsables de la lepra y de la tuberculosis, que siguen siendo unos problemas graves de salud pública en el mundo entero.

La tuberculosis sigue siendo un problema de salud pública en el mundo. Hoy en día, esta enfermedad es la causa de 2 a 3 millones de muertes en el mundo, y aproximadamente 8 millones de nuevos casos se observan cada año (Bouvet, 1994). En los países desarrollados M. tuberculosis es la causa más común de las infecciones micobacterianas. En Francia, aparecen aproximadamente 10.000 nuevos casos por año, y entre las enfermedades de declaración obligatoria es la tuberculosis la que comprende el mayor número de casos. La vacunación mediante BCG (Bacillo de Calmette y Guérin), una cepa avirulenta derivada de M. bovis y que se usa mucho como vacuna contra la tuberculosis, está lejos de ser eficaz en todas las poblaciones. Esta eficacia varía aproximadamente de 80% en los países occidentales como Inglaterra, a 0% en India (resultados del último ensayo de vacunación a Chingleput, publicado en 1972 en Indian J. Med. Res.). Además, la aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a los antituberculosos y el riesgo aumentado en los pacientes inmunodeprimidos, pacientes que padecen SIDA, en desarrollar una tuberculosis, hacen necesaria la realización de métodos rápidos, específicos y fiables para el diagnóstico de la tuberculosis, y la realización de nuevas vacunas. Por ejemplo, un estudio epidemiológico realizado en Florida, y cuyos resultados han sido publicados en 1993 en AIDS terapias, ha mostrado que el 10% de los enfermos que padecen SIDA padecen también de tuberculosis en el momento del diagnóstico del SIDA o 18 meses antes de éste. En estos enfermos, la tuberculosis aparece en el 60% de los casos en forma diseminada, y por lo tanto no detectable mediante los criterios de diagnóstico habituales como la radiografía pulmonar o el análisis de esputos.

Actualmente, una certeza del diagnóstico aportado por la demostración de bacilos cultivables en una extracción que procede del enfermo se obtiene solamente para menos de la mitad de los casos de tuberculosis, incluso en los casos de tuberculosis pulmonar. El diagnóstico de la tuberculosis y de las otras micobacterias emparentadas es, por lo tanto, difícil de realizar, y ello por diferentes razones: la micobacterias están frecuentemente presentes en baja cantidad, su tiempo de generación es muy largo (24 horas para M. tuberculosis) y su cultivo es difícil (Bates et al., 1986).

Se pueden usar otras técnicas en la clínica, para identificar una infección micobacteriana:

a): la identificación directa de los microorganismos con el microscopio; esta técnica es rápida, pero no permite la identificación de la especie micobacteriana observada y le falta sensibilidad (Bates, 1979).

Los cultivos, cuando son positivos, tienen una especificidad que se acerca al 100% y permiten la identificación de la especie micobacteriana aislada; sin embargo, como se ha precisado anteriormente, el crecimiento de las micobacterias in vitro es larga (se puede realizar solamente en 3 a 6 semanas de cultivos repetidos (Bates, 1979; Bates et al., 1986)) y costosa.

b): las técnicas serológicas pueden resultar útiles en ciertas condiciones, pero su uso está a veces limitado por su sensibilidad y/o su especificidad baja (Daniel et al., 1987).

c): la presencia de micobacterias en el seno de una muestra biológica también se puede determinar mediante hibridación molecular con ADN o ARN usando unas sondas de oligonucleótidos específicas de las secuencias buscadas (Kiehn et al., 1987; Roberts et al., 1987; Drake et al., 1987). Varios estudios han mostrado el interés de esta técnica para el diagnóstico de las infecciones con micobacterias. Las sondas usadas están constituidas por ADN, por ARN ribosómico o por fragmentos de ADN micobacterianos que proceden de un banco de genes. El principio de estas técnicas se basa en el polimorfismo de las secuencias nucleotídicas de los fragmentos usados, o en el polimorfismo de las regiones cercanas. En todos los casos, necesitan el uso de cultivos y no son aplicables directamente sobre las muestras biológicas.

La baja cantidad de micobacterias presentes en el seno de una muestra biológica y por consiguiente la cantidad baja de ADN diana a detectar en esta muestra puede necesitar recurrir a una amplificación específica in vitro del ADN diana antes de su detección con la ayuda de la sonda nucleotídica y usando unas técnicas de amplificación in vitro tales como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). La amplificación específica del ADN mediante la técnica de PCR puede constituir la primera etapa de un procedimiento de detección de la presencia de un ADN micobacteriano en una muestra biológica, efectuándose la detección propiamente dicha del ADN amplificado en un segundo tiempo con la ayuda de una sonda oligonucleotídica capaz de hibridarse específicamente al ADN amplificado.

Se ha descrito un ensayo de detección de micobacterias que pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis, mediante hibridación sándwich (ensayo que usa una sonda de captura y una sonda de detección) por Chevrier et al., en 1993. El complejo de Mycobacterium tuberculosis es un grupo de micobacterias que comprende M. bovis-BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. africanum y M. microti.

Se ha realizado un procedimiento de detección de bajas cantidades de micobacterias, que pertenecen al complejo tuberculosis, mediante amplificación génica e hibridación directamente sobre unas muestras biológicas. Dicho procedimiento usa la secuencia de inserción IS6110 (patente europea EP 0 490 951 B1). Thierry et al. han descrito en 1990 una secuencia específica del complejo Mycobacterium tuberculosis y denominada IS6110. Ciertos autores han propuesto amplificar específicamente el ADN que procede de Mycobacterium usando unos cebadores nucleicos en un método de amplificación, tal como la reacción de polimerasa en cadena (PCR). Patel et al. han descrito en 1990 el uso de varios cebadores nucleicos seleccionados a partir de una secuencia conocida como sonda en la identificación de M. tuberculosis. Sin embargo, la longitud de los fragmentos obtenidos usando estos cebadores era diferente de la longitud teórica esperada, y se obtuvieron varios fragmentos de tamaño variable. Además, los autores han observado la ausencia de hibridación de los productos amplificados con el plásmido que sirvió para determinar los cebadores. Estos resultados indican que estos cebadores no serían apropiados en la detección de la presencia de M. tuberculosis en una muestra biológica, y confirman la naturaleza crítica de la elección de los cebadores. El mismo año, J.L. Guesdon y D. Thierry han descrito un método de detección de M. tuberculosis, de gran sensibilidad, mediante amplificación de un fragmento de ADN de M. tuberculosis localizado en el seno de la secuencia IS6110 (patente europea EP 461 045) con la ayuda de cebadores que generan unos fragmentos de ADN amplificado de longitud constante, incluso cuando la elección de los cebadores conducía a la amplificación de fragmentos largos (del orden de 1.000 a 1.500 bases) en la que el riesgo de interrupción de la polimerización es elevado debido a los efectos de la estructura secundaria de la secuencia. En la patente europea EP 0 490 951 se describen otros cebadores específicos de la secuencia IS6110.

Los inventores han demostrado (resultados no publicados) que ciertos aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis estaban exentos de la secuencia de inserción IS6110 y, por lo tanto, no podían ser detectados con la ayuda de los oligonucleótidos específicos de esta secuencia, pudiendo conducir así a unos resultados de diagnóstico falsamente negativo. Estos resultados confirman una observación similar realizada por Yuen et al. en 1993. La imposibilidad de detectar estas cepas patógenas potencialmente presentes en una muestra biológica extraída de un paciente es así susceptible de conducir a dificultades incluso errores de diagnóstico. La disponibilidad de varias secuencias específicas del bacilo de la tuberculosis, en el interior de las cuales se seleccionarán unos cebadores apropiados para la amplificación, es importante. Se podrá usar la secuencia DP428 descrita en la presente memoria.

M. bovis y m. tuberculosis, los agentes causantes de la tuberculosis, son unas bacterias facultativas intracelulares.

Estos agentes han desarrollado unos mecanismos para asegurar su supervivencia y su replicación en el interior del macrófago, uno de los tipos celulares que se supone que erradica la invasión mediante unos microorganismos. Estos agentes son capaces de modular la evolución normal de su fagosoma y de impedir que se diferencien en un compartimiento ácido rico en hidrolasa (Clemens, 1979; Clemens et al., 1996; Sturgill-Koszycki et al., 1994 y Xu et al., 1994). Sin embargo, esta modulación es posible sólo si la bacteria está viva en el seno del fagosoma, sugiriendo que unos compuestos sintetizados de manera activa y/o secretados en el interior de la célula forman parte de este mecanismo. A pesar de los problemas mayores de salud relacionados con estos organismos patógenos, se saben pocas cosas sobre sus proteínas exportadas y/o secretadas. Unos análisis en SDS-PAGE de filtrado de cultivo de M. tuberculosis muestran por lo menos 30 proteínas secretadas (Altschul et al., 1990; Nagal et al., 1991 y Young et al., 1992). Ciertas de ellas se han caracterizado, se han clonado y secuenciado sus genes (Borremans et al., 1989 ; Wiker et al., 1992 y Yamaguchi et al., 1989). Otros, aunque se trata de antígenos inmunodominantes de mayor importancia para inducir una inmunidad protectora (Anderson et al.,1991 y Orme et al., 1993), no están totalmente identificados. Además, es probable que numerosas proteínas exportadas sigan fijadas sobre la membrana celular y, por consiguiente, no estén presentes en los sobrenadantes de cultivo. Se ha demostrado que las proteínas localizadas en la superficie externa de diversas bacterias patógenas, tales como la invasina de 103 kDa de Yersina Pseudotuberculosis (Isberg et al., 1987) o la internalina de 80 kDa de Listeria monocytogenes (Gaillard et al., 1991 y Dramsi et al., 1997) desempeñan un papel importante en las interacciones con las células hospedantes y, por consiguiente, en la patogenicidad como en la inducción de respuestas protectoras. Así, una proteína enlazada a la membrana podría ser importante para la infección con M. tuberculosis como para la inducción de una respuesta protectora contra esta infección. Estas proteínas podrían revestir un interés real para la preparación de vacunas.

Recientemente, se ha descrito la adaptación a las micobacterias de una metodología genética para la identificación y la selección fenotípica de proteínas exportadas (Lim et al., 1995). Este método usa la fosfatasa alcalina (PhoA) periplásmica de E. coli. Se ha construido un vector plasmídico permitiendo la fusión de genes entre un gen PhoA truncado y unos genes que codifican para unas proteínas exportadas (Manoil et al., 1990).

Mediante este método, se ha podido identificar un gen de M. tuberculosis (erp (Berthet et al., 1995)) que presenta unas homologías con una proteína exportada de 28 kDa de M. leprae, que es una diana frecuente de las respuestas humorales de la forma lepromatosa de la lepra. Asimismo, se ha caracterizado una proteína que presenta unos motivos de aminoácidos característicos de la desaturasa de planta (des) mediante la técnica de fusión con PhoA.

Sin embargo, este método genético de identificación de proteínas exportadas no permite evaluar fácilmente la expresión intracelular de los genes correspondientes. Dicha evaluación es de primordial importancia al mismo tiempo para la selección de buenos candidatos a vacunas y para la comprensión de las interacciones entre las bacterias y sus células hospedantes. Se ha descrito la inducción de la expresión de factor de virulencia mediante el contacto de célula diana patógena. Es el caso, por ejemplo, para los factores de virulencia Yops (Petersson et al., 1996) de Yersinia pseudotuberculosis. Shigella mediante el contacto con las células dianas libera las proteínas Ipa en el medio de cultivo, y Salmonella sintetiza nuevas estructuras de superficie.

Asimismo, se puede citar el documento Ronal et al. (Gene, 90 (1990) 145-148) que describe la construcción de vectores plasmídicos que comprenden la combinación de dos secuencias de genes sin promotor que codifican para unas enzimas, y su uso para la detección de actividad del promotor.

Teniendo en cuenta lo anterior, existe hoy en día una gran necesidad de desarrollar nuevas vacunas contra las micobacterias patógenas, así como nuevos ensayos de diagnóstico específicos, fiables y rápidos. Estos desarrollos necesitan la implementación de herramientas específicas con más prestaciones todavía que permiten, por una parte, aislar u obtener unas secuencias de nuevos polipéptidos específicos, en particular inmunógenos, y, por otra parte, entender mejor el mecanismo de las interacciones entre las bacterias y sus células hospedantes como en particular la inducción de la expresión de factor de virulencia. Éste es precisamente el objeto de la presente invención.

Los inventores han definido y realizado con ese objetivo unos nuevos vectores que permiten el cribado, la clonación y/o la expresión de secuencias de ADN de micobacterias a fin de identificar entre estas secuencias unos ácidos nucleicos que codifican para unas proteínas de interés, preferentemente unas proteínas exportadas, que se pueden localizar sobre la membrana bacteriana y/o secretadas, y de identificar entre estas secuencias las que estén inducidas o reprimidas durante la infección (crecimiento intracelular).

Descripción

La presente invención describe el uso del gen identificador phoA en las micobacterias. Permite identificar unos sistemas de expresión y de exportación en un contexto micobacteriano. Muchos genes se expresan sólo en dicho contexto, lo que demuestra la ventaja de la presente invención. Durante la clonación de segmentos de ADN de cepas del complejo M. Tuberculosis en fusión con phoA en otra micobacteria como M. smegmatis, el inicio del gen, sus regiones reguladoras y su regulador se clonarán, lo que permitirá observar una regulación. Si esta regulación es positiva, la clonación del regulador constituirá una ventaja para observar la expresión y la exportación.

En el contexto de la invención, se entiende por micobacteria cualquier micobacteria que pertenece a las diversas especies enumeradas por Wayne L.G. y Kubica G.P. (1980). Family Mycobacteriaceae in Bergey's manual of systematic bacteriology, Ed. J. P. Butler (Baltimore USA: Williams y Wilkins P. 1436-1457).

En ciertos casos, los genes clonados se someten, en su hospedante de origen, a una regulación negativa haciendo la observación de la expresión y de la exportación difícil en el hospedante de origen. En este caso, la clonación del gen en ausencia de su regulador negativo, en un hospedante que no lo contiene, constituirá una ventaja.

La invención describe asimismo nuevos polipéptidos y nuevos polinucleótidos de micobacterias que se han podido aislar mediante los vectores anteriores, y susceptibles de entrar en la realización de composiciones para la detección de una infección mediante unas micobacterias, o para la protección contra una infección debida a unas micobacterias, o para la búsqueda de inhibidores como se ha descrito anteriormente para DP428.

Por lo tanto, la invención tiene por objeto un vector recombinante de cribado, de clonación y/o de expresión, caracterizado porque se replica en unas micobacterias y porque contiene:

1) un replicón funcional en las micobacterias;

2) un marcador de selección;

3) un casete indicador que comprende:

a): un sitio de clonación múltiple (Polylinker),

b): eventualmente un terminador de transcripción activo en las micobacterias, en dirección corriente arriba del polylinker,

c): una primera secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de exportación u/o de secreción de proteína, estando dicha secuencia nucleotídica desprovista de su codón de iniciación y de sus secuencias de regulación, y

d): en dirección corriente abajo una segunda secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado, estando dicha secuencia nucleotídica provista de su codón de iniciación. Eventualmente, le vector recombinante contiene igualmente un replicón funcional en E. coli.

Preferentemente, el marcador de exportación y/o de secreción se dispone en la misma orientación que el marcador de actividad de promotores.

Preferentemente, el vector recombinante de cribado según la invención comprenderá, además, un terminador de transcripción dispuesto en dirección corriente abajo del marcador de actividad de promotores, lo que está encaminado a permitir la obtención de transcritos cortos que resultan más estables y que, por consiguiente, permiten un nivel de expresión más alto de los productos de traducción.

El marcador de exportación y/o de secreción es una secuencia de nucleótidos cuya expresión seguida de la exportación y/o de la secreción depende de los elementos de regulación que controlan su expresión.

Mediante la expresión "secuencias o elementos de regulación de la expresión de la producción de polipéptidos y de su localización" se entiende una secuencia promotora de la transcripción, una secuencia que comprende el sitio de unión al ribosoma (RBS), las secuencias responsables de la exportación y/o de la secreción tal como la secuencia denominada secuencia señal.

Un primer marcador interesante de exportación y/o de secreción es una secuencia codificante que procede del gen phoA. Cuando sea apropiado, se trunca de tal manera que la actividad fosfatasa alcalina este sin embargo susceptible de ser restaurada cuando la secuencia codificante truncada está dispuesta bajo el control de un promotor y de elementos de regulación apropiados.

Se pueden usar otros marcadores de exportación y/o de secreción. Se citará a título de ejemplos una secuencia del gen \beta-agarasa, de la nucleasa de un estafilococo o de una \beta-lactamasa.

Entre los marcadores interesantes de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado, se prefiere una secuencia codificante que procede del gen luc de luciferasa de luciola provista de su codón de iniciación.

Se pueden usar otros marcadores de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado. Se citará a título de ejemplos una secuencia del gen de la GFP (Green Fluorescent Protein).

El terminador de transcripción debe ser funcional en las micobacterias. Un terminador ventajoso para ello es el terminador del colifago T4 (tT4). Se pueden aislar otros terminadores apropiados para la realización de la invención usando la técnica presentada en los ejemplos, por ejemplo mediante un casete "omega" (Prentki et al., 1984).

Un vector particularmente preferido para la realización de la invención es un plásmido seleccionado de entre los siguientes plásmidos depositados en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia):

a): pJVED_{a} depositado en la CNCM con el nº I-1797, el 12/12 de 1996,

b): pJVED_{b} depositado en la CNCM con el nº I-1906, el 25 de julio de 1997,

c): pJVED_{c} depositado en la CNCM con el nº I-1799, el 12/12 de 1996.

Para la selección, o la identificación de secuencias de ácidos nucleicos de micobacterias que codifican para unos polipéptidos susceptibles de ser incorporados en unas composiciones inmunógenas, o antigénicas para la detección de una infección, o susceptibles de inducir o reprimir un factor de virulencia de micobacterias, el vector de la invención comprenderá, en uno de los sitios de clonación múltiple del polylinker, una secuencia de nucleótidos de una micobacteria en la que se detecta la presencia de secuencias que corresponden a unos polipéptidos exportados y/o secretados que se pueden inducir o reprimir durante la infección, o también expresar o producir de manera constitutiva, sus secuencias promotoras y/o reguladoras asociadas susceptibles de permitir o de favorecer la exportación y/o la secreción de dichos polipéptidos de interés, o la totalidad o parte de genes de interés que codifican para dichos polipéptidos.

Preferentemente, esta secuencia se obtiene mediante fragmentación física o mediante digestión enzimática del ADN genómico o del ADN complementario de un ARN de una micobacteria, preferentemente M. tuberculosis o seleccionada de entre M. africanum, M. avium o M. leprae.

En efecto, los vectores de la invención se pueden usar asimismo para determinar la presencia de secuencias de interés, que corresponden preferentemente a unas proteínas exportadas y/o secretadas, y/o capaces de ser inducidas o reprimidas o producidas de manera constitutiva durante la infección, en particular durante la fagocitosis mediante los macrófagos, y según lo que se ha expuesto anteriormente, en las micobacterias tales como M. africanum, M. bovis, M. avium o M. leprae de los cuales se habrá tratado el ADN o el ADNc mediante fragmentación física o con unas enzimas determinadas.

Según un primer modo de realización de la invención, la digestión enzimática del ADN genómico o del ADN complementario se efectúa a partir de M. tuberculosis.

Preferentemente, este ADN es digerido con una enzima tal como sau3A, BclI, BglII.

De forma natural, se pueden usar otras enzimas de digestión tales como ScaI, ApaI, SacII, CPU o también unas nucleasas o unas polimerasas, por cuanto que permiten la obtención de fragmentos cuyos extremos se pueden insertar en uno de los sitios de clonación del polylinker del vector de la invención.

Cuando sea apropiado, se efectuarán simultáneamente unas digestiones con diferentes enzimas.

Unos vectores recombinantes preferidos para la realización de la invención se seleccionan de entre los vectores recombinantes siguientes depositados en la CNCM:

a): p6D7 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1814,

b): p5A3 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1815,

c): p5F6 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1816,

d): p2A29 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1817,

e): pDp428 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1818,

f): p5B5 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1819,

g): p1C7 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1820,

h): p2D7 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1821,

i): p1B7 depositado el 31 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1843,

j): pJVED/M. tuberculosis depositado el 25 de julio de 1997 en la CNCM con el nº I-1907,

k): pM1C25 depositado el 4 de agosto de 1998 en la CNCM con el nº I-2062.

La invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de cribado de secuencias de nucleótidos que proceden de micobacterias para determinar la presencia de secuencias que corresponden a unos polipéptidos exportados y/o secretados que pueden ser inducidos o reprimidos durante la infección, sus secuencias promotoras y/o reguladores asociadas susceptibles en particular de permitir o de favorecer la exportación y/o la secreción de dichos polipéptidos de interés, o la totalidad o parte de genes de interés que codifican para dichos polipéptidos, caracterizado porque usa un vector recombinante según la invención.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de cribado, según la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): la fragmentación física de las secuencias de ADN de micobacterias o su digestión mediante por lo menos una enzima determinada, y la recuperación de los fragmentos obtenidos;

b): la inserción de los fragmentos obtenidos en la etapa a) en un sitio de clonación, llegado el caso compatible con la enzima de la etapa a), del polylinker de un vector según la invención;

c): si es necesario, la amplificación de dichos fragmentos contenidos en el vector, por ejemplo mediante replicación de este último después de la inserción del vector así modificado en una célula determinada, preferentemente E. coli;

d): la transformación de las células hospedantes mediante el vector amplificado en la etapa c), o en ausencia de amplificación, mediante el vector de la etapa b);

e): el cultivo de las células hospedantes transformadas en un medio que permite la demostración del marcador de exportación y/o de secreción, y/o del marcador de actividad de promotores contenido en el vector;

f): la detección de las células hospedantes positivas (colonias positivas) para la expresión del marcador de exportación y/o de secreción, y/o del marcador de actividad de promotores;

g): el aislamiento del ADN de las colonias positivas y la inserción de este ADN en una célula idéntica a la de la etapa c);

h): la selección de las inserciones contenidas en el vector, que permiten la obtención de clones positivos para el marcador de exportación y/o de secreción, y/o para el marcador de actividad de promotores;

i): el aislamiento y la caracterización de los fragmentos de ADN de micobacterias contenidas en estos insertos.

En uno de los modos de realización preferidos del procedimiento de cribado según la invención, las células hospedantes positivas, detectadas en la etapa f), para el marcador de exportación y/o de secreción se ensayan eventualmente en un segundo tiempo para la capacidad del inserto nucleotídico seleccionado de estimular la expresión del marcador de actividad de promotores cuando dichas células hospedantes están fagocitadas mediante unas células de tipo macrofágicas.

De manera más específica, se compara la estimulación de la expresión del marcador de actividad de promotores en unas células hospedantes dispuestas en cultivo axénico (células hospedantes solas en cultivo) con la estimulación de la expresión del marcador de actividad de promotores en unas células hospedantes cultivadas en presencia de macrófagos y fagocitadas así por éstos.

La selección de células hospedantes para el marcador de actividad de promotores se puede realizar desde la etapa e) del procedimiento de cribado descrito anteriormente, o también después de cualquiera de las etapas f), g), h) o i), es decir una vez que las células hospedantes han sido seleccionadas positivamente para el marcador de exportación y/o de selección.

La realización de este procedimiento permite la construcción de bancos de ADN que comprenden unas secuencias que corresponden a unos polipéptidos susceptibles de ser exportados y/o secretados, y/o susceptibles de ser inducidos o reprimidos durante la infección cuando se producen en el seno de micobacterias recombinantes. La etapa i) del procedimiento puede comprender una etapa de secuenciación de las inserciones seleccionadas.

Preferentemente, en el procedimiento según la invención, el vector usado se selecciona de entre los plásmidos pJVED_{a} (CNCM, nº I-1797), pJVED_{b} (CNCM, nº I-1906), pJVED_{c} (CNCM, nº I-1799) o pJVED/M. tuberculosis (CNCM, nº I-1907), y la digestión de las secuencias de ADN de micobacterias se efectúa mediante la enzima Sau3A.

Según un modo de realización preferido de la invención, el procedimiento de cribado se caracteriza porque las secuencias de micobacterias proceden de una micobacteria patógena, por ejemplo de M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. africanum o M. leprae.

En la presente invención, se entiende designar mediante la expresión "secuencias nucleicas" o "secuencias de aminoácidos" SEC ID nº X a SEC ID nº Y, en las que X e Y pueden representar independientemente un número o un carácter alfanumérico, respectivamente el conjunto de las secuencias nucleicas o el conjunto de las secuencias de aminoácidos representadas por las figuras X a Y, incluyendo los extremos.

Por ejemplo, las secuencias nucleicas o las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 1 a SEC ID nº 4N son, respectivamente, las secuencias nucleicas o las secuencias de aminoácidos representadas por las figuras 1 a 4N, es decir respectivamente las secuencias nucleicas o las secuencias de aminoácido SEC ID nº 1, SEC ID nº 1A', SEC ID nº 1B', SEC ID nº 1C', SEC ID nº 1D, SEC ID nº 1F, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3A, SEC ID nº 3B, SEC ID nº 3C, SEC ID nº 4A, SEC ID nº 4B, SEC ID nº 4C, SEC ID nº 4A', SEC ID nº 4B', SEC ID nº 4C', SEC ID nº 4F, SEC ID nº 4J, SEC ID nº 4K, SEC ID nº 4L, SEC ID nº 4M y SEC ID nº 4N.

La presente invención permite determinar un fragmento de gen que codifica para un polipéptido exportado. La comparación con la secuencia del genoma publicada por Cole et al. (Cole et al., 1998, Nature, 393, 537-544) permite determinar el gen completo que porta la secuencia identificada según la presente invención.

Cuando la secuencia que codifica para el gen marcador de exportación y/o de secreción es una secuencia que procede del gen phoA, la exportación y/o la secreción del producto del gen phoA, cuando sea apropiado truncado, se obtiene sólo cuando esta secuencia está insertada en fase con la secuencia o elemento de regulación de la expresión de la producción de polinucleótidos, y su localización está dispuesta en dirección corriente arriba, que contiene los elementos que controlan la expresión, la exportación y/o la secreción procedentes de secuencia de micobacterias.

Los vectores recombinantes de la invención pueden comprender evidentemente unos sitios de clonación múltiples desplazados uno o dos nucleótidos con relación a un vector según la invención, permitiendo así expresar el polipéptido que corresponde al fragmento de ADN de micobacteria insertado y susceptible de ser traducido según uno de los tres marcos de lectura posibles.

Por ejemplo, los vectores preferidos pJVED_{b} y pJVED_{c} de la invención se distinguen del vector preferido pJVED_{a} por un desplazamiento respectivo de uno y de dos nucleótidos a nivel del sitio de clonación múltiple.

Así, los vectores de la invención son capaces de expresar cada uno de los polipéptidos susceptibles de ser codificados por un fragmento de ADN de micobacteria insertado.

La invención tiene asimismo por objeto unas micobacterias recombinantes que contienen un vector recombinante según la invención descrito anteriormente. Una micobacteria preferida es una micobacteria de tipo M. smegmatis.

M. smegmatis permite ventajosamente ensayar la eficacia de secuencias de micobacterias, para el control de la expresión, de la exportación y/o de la secreción, y/o de la actividad de promotores de una secuencia dada, por ejemplo una secuencia que codifica para un marcador tal como la fosfatasa alcalina y/o la luciferasa.

Otra micobacteria preferida es una micobacteria de tipo M. bovis, por ejemplo la cepa BCG usada actualmente para la vacunación contra la tuberculosis.

Otra micobacteria preferida es una cepa de M. tuberculosis, M. bovis o M. africanum que presentan potencialmente todos los sistemas de regulación apropiados.

Los inventores han caracterizado así en particular un polinucleótido constituido por una secuencia de nucleótidos presente en todas las cepas ensayadas de micobacterias que pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis. Este polinucleótido, denominado DP428 contiene un marco abierto de lectura (ORF) que codifica para un polipéptido de aproximadamente 12 kD. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica para el polipéptido DP428 se extiende desde el nucleótido en posición nt 941 hasta el nucleótido en posición nt 1351 de la secuencia SEC ID nº 2, teniendo el polipéptido DP428 la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 28 siguiente:

1

Este peso molecular (PM) corresponde al PM teórico de la proteína madura obtenida después de la escisión de la secuencia señal, siendo el PM de la proteína o polipéptido DP428 de aproximadamente 10 kD después del anclaje potencial al peptidoglicano y corte potencial entre S y G del motivo LPISG.

Este polinucleótido incluye, por una parte, un marco abierto de lectura que corresponde a un gen de estructura y, por otra parte, las señales de regulación de la expresión de la secuencia codificante en dirección corriente arriba y en dirección corriente abajo de esta última. El polipéptido DP428 está compuesto por un péptido señal, por una región central hidrófila y por una región C-terminal hidrófoba. Esta última se termina por dos restos argininas (R), señal de retención, y está precedida por un motivo LPISG que recuerda el motivo LPXTG de anclaje al peptidoglicano (Schneewind et al., 1995).

Mediante la expresión "gen de estructura" para los fines de la presente invención, se entiende un polinucleótido que codifica para una proteína, un polipéptido o también un fragmento de estos últimos, comprendiendo solamente dicho polinucleótido la secuencia que corresponde al marco abierto de lectura (ORF), lo que excluye las secuencias del lado 5' del marco abierto de lectura (ORF) que dirigen la iniciación de la transcripción.

Mediante la expresión "secuencia nucleotídica, polinucleótido o ácido nucleico", según la presente invención, se entiende tanto un ADN bicatenario, un ADN monocatenario como unos productos de transcripción de dichos ADN.

Mediante la expresión "porcentaje de identidad" en el sentido de la presente invención, se entiende un porcentaje de identidad entre las bases de dos polinucleótidos, siendo este porcentaje puramente estadístico y siendo las diferencias entre los dos polinucleótidos repartidas al azar y sobre toda su longitud.

Una hibridación en unas condiciones de fuerte astringencia significa que las condiciones de temperatura y de fuerza iónica se seleccionan de tal manera que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementarios.

A título ilustrativo, unas condiciones de fuerte astringencia de la etapa de hibridación con fines de definir los fragmentos polinucleotídicos descritos a continuación, son ventajosamente las siguientes:

La hibridación se realiza a una temperatura preferida de 65ºC, en presencia de tampón comercializado con el nombre de rapid-hyb buffer por Amersham (RPN 1636) y 100 \mug/ml de ADN de E. coli.

Las etapas de lavado pueden ser, por ejemplo, las siguientes:

-: dos lavados de 10 minutos, preferentemente a 65ºC, en un tampón 2 x SSC y 0,1% de SDS;

-: dos lavados de 10 minutos, preferentemente a 65ºC, en un tampón 1 x SSC y 0,1% de SDS;

-: un lavado de 10 minutos, preferentemente a 65ºC, en un tampón de 0,1 x SSC y 0,1% de SDS.

1 x SSC corresponde a 0,15 M de NaCl y 0,5 M de citrato de Na, y una disolución de 1 x Denhardt corresponde a 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona y 0,02% de suero de albúmina bovina.

Ventajosamente, un fragmento nucleotídico que responde a la definición anterior tendrá por lo menos 8 nucleótidos, preferentemente por lo menos 12 nucleótidos, y todavía más preferentemente por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de la que procede. Las condiciones de hibridación de fuerte astringencia descritas anteriormente para un polinucleótido de un tamaño de aproximadamente 200 bases, serán adaptadas por el experto en la materia para unos oligonucleótidos de tamaño más grande o más pequeño, según la enseñanza de Sambrook et al., 1989.

Para las condiciones de realización de las enzimas de restricción con el objetivo de obtener unos fragmentos nucleótidicos de los polinucleótidos según la invención, se hará referencia ventajosamente al trabajo de Sambrook et al., 1989.

Mediante la expresión "polipéptido homólogo" se entenderá designar los polipéptidos que presentan, con relación al polipéptido natural tal como el polipéptido DP428, ciertas modificaciones como en particular una deleción, una adición o una sustitución de la menos un aminoácido, un truncado, un alargamiento, una fusión quimérica y/o una mutación. Entre los polipéptidos homólogos, se prefieren aquéllos cuya secuencia de aminoácidos presenta por lo menos 30%, preferentemente 50%, de homología con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos naturales. En el caso de una sustitución, uno o varios aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se sustituyen por unos aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido "equivalente" quiere designar en la presente memoria cualquier aminoácido susceptible de ser sustituido por uno de los aminoácidos de la estructura de base sin modificar sin embargo esencialmente las propiedades inmunógenas de los péptidos correspondientes. En otras palabras, los aminoácidos equivalentes serán los que permiten la obtención de un polipéptido de secuencia modificada que permite la inducción in vivo de anticuerpos o de células capaces de reconocer el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos está comprendida en la secuencia de aminoácidos de polipéptido natural, tal como las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 1 a SEC ID nº 2, o un polipéptido de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 28 (polipéptido DP428) o uno de sus fragmentos definidos anteriormente.

Estos aminoacilos equivalentes se pueden determinar apoyándose sobre su homología se estructura con los aminoacilos a los que sustituyen, o bien sobre los resultados de los ensayos de inmunogenicidad cruzada a los que los diferentes péptidos son susceptibles de dar lugar.

A título de ejemplo, se mencionarán las posibilidades de sustituciones susceptibles de ser efectuadas sin que de ello resulte ninguna modificación profunda de la inmunogenicidad de los péptidos modificados correspondientes, las sustituciones, por ejemplo, de la leucina por la valina o la isoleucina, del ácido aspártico por el ácido glutámico, de la glutamina por la asparagina, de la arginina por la lisina, etc., siendo las sustituciones inversas naturalmente factibles en las mismas condiciones.

Mediante la expresión "fragmento biológicamente activo" se entenderá designar en particular un fragmento de secuencia de aminoácidos de polipéptido que presenta por lo menos una de las características de los polipéptidos descritos en la presente invención, en particular porque es:

-: capaz de ser exportado y/o secretado mediante una micobacteria y/o de ser inducido o reprimido durante la infección mediante la micobacteria; y/o

-: capaz de inducir, de reprimir o de modular, directa o indirectamente, un factor de virulencia de micobacteria; y/o

-: capaz de inducir una reacción de inmunogenicidad dirigida contra las micobacterias; y/o

-: capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico de micobacteria.

Mediante la expresión "fragmento de polipéptido" se entiende designar un polipéptido que comprende por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente 10 aminoácidos y 15 aminoácidos.

Un polipéptido o uno de sus fragmentos, tales como se han definido anteriormente, es susceptible de ser reconocido específicamente por los anticuerpos presentes en el suero de pacientes infectados por unas micobacterias y, preferentemente, unas bacterias que pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis o mediante unas células del hospedante infectado.

Se ha realizado un análisis de la hidrofilicidad del polipéptido DP428 con la ayuda del programa DNA Strider^{TM} (comercializado por CEA Saclay), en base a un cálculo del carácter hidrófilo de la región que codifica para el DP428 de la SEC ID nº 28. Los resultados de este análisis se representan en la figura 54, en la que se detallan, para cada uno de los aminoácidos (AA) de posición definida en la SEC ID nº 28, el índice de hidrofilicidad. Cuanto más elevado es el índice de hidrofilicidad, más susceptible es el aminoácido considerado de ser expuesto al disolvente en la molécula nativa, y es, por consiguiente, susceptible de presentar un grado de antigenicidad elevado. Así, una cadena de por lo menos siete aminoácidos que presentan un índice elevado de hidrofilicidad (>0,3) puede constituir la base de la estructura de un péptido candidato inmunógeno.

Las respuestas inmunitarias celulares del hospedante con un polipéptido se pueden demostrar según las técnicas descritas por Colignon et al., 1996.

Según los datos del mapa de hidrofilicidad presentada en la Figura 54, los inventores han podido definir unas regiones del polipéptido DP428 expuestas preferentemente al disolvente, más particularmente la región localizada entre los aminoácidos 55 y 72 de la secuencia SEC ID nº 28 y la región localizada entre los aminoácidos 99 y 107 de la SEC ID nº 28.

Las regiones peptídicas del polipéptido DP428 definidas anteriormente se pueden realizar de manera ventajosa para la realización de una composición inmunógena o de una composición vacunal.

La invención describe además el uso de una secuencia de ácido nucleico de polinucleótidos como sonda o cebador, para la detección y/o la amplificación de una secuencia de ácido nucleico. Entre estas secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar como sonda o cebador, se describen particularmente las secuencias de ácido nucleico, o su secuencia complementaria, comprendidas entre el nucleótido en posición nt 964 y el nucleótido en posición nt 1234, incluyendo los extremos, de la secuencia SEC ID nº 1.

Entre los polinucleótidos que se pueden utilizar como cebadores nucleotídicos, se describen particularmente los polinucleótidos de secuencia SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26.

Los polinucleótidos descritos en la invención se pueden usar así para seleccionar unos cebadores nucleotídicos, en particular para la técnica de PCR (Erlich, 1989; Innis et al., 1990, y Rolfs et al., 1991).

Los resultados presentados en la figura 51 muestran que la secuencia que codifica para el polipéptido DP428 (SEC ID nº 28) no se encuentra en los ADN de M. fortuitum, M. simiae, M. avium, M. chelonae, M. flavescens, M. gordonae, M. marinum y M. kansasii.

La invención describe asimismo las células hospedantes transformadas mediante un vector, en unas condiciones que permiten en particular la expresión de un polipéptido recombinante.

Se describe particularmente una cepa E. coli transformada por el plásmido pDP428 depositado el 28 de enero de 1997 en la CNCM con el nº I-1818, o transformada por el plásmido pM1C25 depositado el 4 de agosto de 1998 en la CNCM con el nº I-2062, o una micobacteria que pertenece a una cepa de M. tuberculosis, M. bovis o M. africanum que presenta potencialmente todos los sistemas de regulación apropiados.

Los polipéptidos descritos identificados por los vectores o procedimientos según la invención se pueden usar ventajosamente en un procedimiento para la detección in vitro de anticuerpos dirigidos contra dichos polipéptidos, en particular el polipéptido DP428, y así de anticuerpos dirigidos contra una bacteria del complejo Mycobacterium tuberculosis, en una muestra biológica (tejido o fluido biológico) susceptible de contenerlos, comprendiendo este procedimiento la puesta en contacto de esta muestra biológica con dicho polipéptido en unas condiciones que permiten una reacción inmunológica in vitro entre dicho polipéptido y los anticuerpos eventualmente presentes en la muestra biológica, y la demostración in vitro de los complejos antígeno-anticuerpo eventualmente formados.

Estos polipéptidos se pueden usar asimismo y ventajosamente en un procedimiento para la detección de una infección mediante una bacteria del complejo Mycobacterium tuberculosis en un mamífero basado en la detección in vitro de una reacción celular que indica una sensibilización previa del mamífero a dicho polipéptido, como por ejemplo la proliferación celular, la síntesis de proteínas tales como el interferón gamma.

La invención describe asimismo un neceser o kit para el diagnóstico in vitro de una infección mediante una micobacteria que pertenece al complejo Mycobacterium tuberculosis, que comprende en particular dicho polipéptido.

La invención describe asimismo unos anticuerpos mono o policlonales o sus fragmentos, o anticuerpos quiméricos, capaces de reconocer específicamente dicho polipéptido.

Estos anticuerpos podrán asimismo ser marcados, tal como un marcado de tipo enzimático, fluorescente o radioactivo.

La invención describe además un procedimiento para la detección específica de la presencia de un antígeno de una micobacteria, tal como una bacteria del complejo Mycobacterium tuberculosis, en una muestra biológica, que usa en particular dicho anticuerpo mono o policlonal.

En el ámbito de la invención, se describe asimismo un neceser o kit para el diagnóstico in vitro sobre una muestra biológica, de la presencia de cepas de micobacterias, tales como las bacterias que pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis, como M. tuberculosis, caracterizado porque comprende en particular dicho anticuerpo policlonal o monoclonal marcado si es necesario.

La presente invención describe asimismo un procedimiento de detección y de identificación rápida de las micobacterias, y preferentemente de las bacterias de M. tuberculosis en una muestra biológica, caracterizado porque usa unos cebadores, unas sondas o unos polipéptidos.

La invención describe asimismo un neceser o kit para la realización del procedimiento descrito anteriormente, destinado a la detección de la presencia de las micobacterias y preferentemente de las bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis en una muestra biológica, caracterizado porque comprende en particular dichos cebadores y/o sondas.

\newpage

La presente invención describe asimismo una composición inmunógena que comprende dicho polipéptido o polinucleótido identificado mediante la presente invención.

Se describe que la composición inmunógena definida anteriormente puede ser constitutiva de una vacuna, cuando se presenta en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente uno o varios adyuvantes de la inmunidad tales como el alun o un representante de la familia de los péptidos de muramilo o también el adyuvante incompleto de Freund.

Hoy en día, diversos tipos de vacunas están disponibles para proteger el ser humano de las enfermedades infecciosas: microorganismos vivos atenuados (M. bovis - BCG para la tuberculosis), microorganismos desactivados (virus de la gripe), extractos acelulares (Bordetella pertussis para la tos ferina), proteínas recombinadas (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B), poliósidos (neumococos). Vacunas preparadas a partir de péptidos de síntesis o de microorganismos genéticamente modificados que expresan unos antígenos heterólogos están pendientes de experimentación. Más recientemente todavía, se han propuesto unos ADN plasmídicos recombinados que portan unos genes que codifican para unos antígenos protectores como estrategia vacunal alternativa. Este tipo de vacunación se realiza con un plásmido particular que deriva de un plásmido de E. coli que no se replica in vivo y que codifica únicamente para la proteína vacunante. Los principales componentes funcionales de este plásmido son: un promotor fuerte que permite la expresión en las células eucariotas (por ejemplo el del CMV), un sitio de clonación apropiado para insertar el gen de interés, una secuencia de terminación-poliadenilación, un origen de replicación procariota para producir el plásmido recombinado in vitro y un marcador de selección (por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina) para facilitar la selección de las bacterias que contienen el plásmido. Se han inmunizado unos animales inyectando simplemente el ADN plasmídico desnudo en el músculo. Esta técnica conduce a la expresión de la proteína vacunal in situ y a una respuesta inmunitaria en particular de tipo celular (CTL) y de tipo humoral (anticuerpos). Esta doble inducción de la respuesta inmunitaria es una de las principales ventajas de la técnica de vacunación con el ADN desnudo. Huygen et al. (1996) y Tascon et al. (1996) han logrado obtener una cierta protección contra M. tuberculosis inyectando unos plásmidos recombinados que contienen unos genes de M. leprae (hsp65, 36kDa pra) como insertos. M. leprae es el agente responsable de la lepra. El uso de un inserto específico de M. tuberculosis como, por ejemplo, la totalidad o parte del gen DP428, llevaría probablemente a una mejor protección contra la tuberculosis. La totalidad o parte del gen DP428, o cualquier polinucleótido identificado mediante la presente invención se puede insertar fácilmente en los plásmidos vectores V1J (Montgomery et al, 1993), pcDNA3 (Invitrogen, R & D Systems) o pcDNA1/Neo (Invitrogen) que presentan las características necesarias para un uso vacunal.

Asimismo, se describe un método de cribado de moléculas capaces de inhibir el crecimiento de micobacterias o el mantenimiento de micobacterias en un hospedante, caracterizado porque dichas moléculas bloquean la síntesis o la función de los polipéptidos codificados por una secuencia nucleotídica identificada mediante la presente invención, o por un polinucleótido tal como se ha descrito anteriormente.

En dicho método de cribado, las moléculas pueden ser anti-mensajeros o pueden inducir la síntesis de anti-mensajeros.

Otras características y ventajas de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos y las figuras siguientes:

Figuras

La serie de Figuras 1:

La serie de Figuras 1 ilustra la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 1 que corresponden al inserto del vector pDP428 (depositado en la CNCM con el nº I-1818) y la serie de secuencias de aminoácidos SEC ID nº 1 de los péptidos codificados por la serie de las secuencias nucleotídicas SEC ID nº 1.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 2:

Ilustra la secuencia nucleotídica SEC ID nº 2 que corresponde a la región que incluye el gen que codifica para el polipéptido DP428 (región subrayada). Se ha tenido en cuenta en esta figura al mismo tiempo los codones ATG y GTG de iniciación de la traducción. La figura muestra que el polipéptido DP428 probablemente forma parte de un operón que comprende por lo menos tres genes. La región doblemente enmarcada incluye probablemente las regiones promotoras.

La región simplemente enmarcada corresponde al motivo LPISG que recuerda el motivo LPXTG descrito en las bacterias Gram positivas como que permiten el anclaje a los petidoglicanos.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 3:

La serie de Figuras 3 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 3 que corresponde al inserto del vector p6D7 (depositada en la CNCM con el nº I-1814).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 4:

La serie de Figuras 4 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 4 que corresponde al inserto del vector p5A3 (depositado en la CNCM con el nº I-1815).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 5:

La serie de Figuras 5 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 5 que corresponde al inserto del vector p5F6 (depositado en la CNCM con el nº I-1816).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 6:

La serie de Figuras 6 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 6 que corresponde al inserto del vector p2A29 (depositado en la CNCM con el nº I-1817).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 7:

La serie de Figuras 7 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 7 que corresponde al inserto del vector p5B5 (depositado en la CNCM con el nº I-1819).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 8:

La serie de Figuras 8 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 8 que corresponde al inserto del vector p1C7 (depositado en la CNCM con el nº I-1820).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 9:

La serie de Figuras 9 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 9 que corresponde al inserto del vector p2D7 (depositado en la CNCM con el nº I-1821).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 10:

La serie de Figuras 10 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 10 que corresponde al inserto del vector p1B7 (depositado en la CNCM con el nº I-1843).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 11:

La serie de Figuras 11 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 11.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 12:

La serie de Figuras 12 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 12.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 13:

La serie de Figuras 13 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 13.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 14:

La serie de Figuras 14 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 14 que corresponde al inserto del vector p5B5 (depositado en la CNCM con el nº I-1819).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 15:

La serie de Figuras 15 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 15.

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip0.950000\baselineskip

La serie de Figuras 16:

La serie de Figuras 16 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 16.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 17:

La serie de Figuras 17 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 17.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 18:

La serie de Figuras 18 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 18.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 19:

La serie de Figuras 19 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 19.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 20:

La serie de Figuras 20 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 20 que corresponde al inserto del vector p2A29 (depositado en la CNCM con el nº I-1817).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 21:

La serie de Figuras 21 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 21.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 22:

La serie de Figuras 22 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 22.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 23:

La serie de Figuras 23 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 23.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 24:

La serie de Figuras 24 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 24.

\vskip1.000000\baselineskip

Figuras 25 y 26:

Las Figuras 25 y 26 ilustran respectivamente las secuencias SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26, que representan un par de cebadores usados para amplificar específicamente mediante PCR la región que corresponde a los nucleótidos 964 a 1234 incluidos en la secuencia SEC ID n º1.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 27:

La serie de Figuras 27 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 27 que corresponde al inserto del vector p5A3.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 28:

La secuencia de aminoácidos tal como se define en la figura 28 representa la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 28 que corresponde al polipéptido DP428.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 29:

La Figura 29 representa la secuencia nucleotídica SEC ID nº 29 del gen completo que codifica para la proteína M1C25.

\global\parskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 30:

La Figura 30 representa la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 30 de la proteína M1C25.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 31:

La serie de Figuras 31 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 31.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 32:

La serie de Figuras 32 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 32.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 33:

La serie de Figuras 33 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 33.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 34:

La serie de Figuras 34 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 34.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 35:

La serie de Figuras 35 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 35.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 36:

La serie de Figuras 36 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 36.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 37:

La serie de Figuras 37 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 37.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 38:

La serie de Figuras 38 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 38.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 39:

La serie de Figuras 39 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 39.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 40:

La serie de Figuras 40 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 40.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 41:

La serie de Figuras 41 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 41 que corresponde al inserto del vector p2D7 (depositado en la CNCM con el nº I-1821).

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 42:

La serie de Figuras 42 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 42.

\newpage

\global\parskip0.950000\baselineskip

La serie de Figuras 43:

La serie de Figuras 43 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 43.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 44:

La serie de Figuras 44 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 44.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 45:

La serie de Figuras 45 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 45.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 46:

La serie de Figuras 46 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 46.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 47:

La serie de Figuras 47 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 47.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 48:

La serie de Figuras 48 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 48.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 49:

La serie de Figuras 49 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 49.

\vskip1.000000\baselineskip

La serie de Figuras 50:

La serie de Figuras 50 representa la serie de secuencias nucleotídicas SEC ID nº 50.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 51:

A. la construcción pJVED: Plásmido lanzadera (que puede multiplicarse en las micobacterias así como en E. coli), con un gen de resistencia a la kanamicina (procedente de Tn903) como marcador de selección. El Gen phoA truncado (\Delta phoA) y el gen luc forman un operón sintético.

B. Secuencia de la unión entre phoA y luc.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 52:

Hibridación genómica (transferencia de Southern) del ADN genómico de diferentes especies micobacterianas con la ayuda de una sonda oligonucleotídica cuya secuencia es la secuencia comprendida entre el nucleótido en la posición nt 964 (extremo 5' de la sonda) y el nucleótido en la posición nt 1234 (extremo 3' de la sonda), extremos incluidos, de la secuencia SEC ID nº 1.

\vskip1.000000\baselineskip

Figuras 53 y 54

Actividad Luc y PhoA de M. smegmatis recombinante que contiene el pJVED con diferentes fragmentos nucleotídicos como se describen en los ejemplos. Las figuras 52 y 53 representan los resultados obtenidos para dos experimentos distintos realizados en las mismas condiciones.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 55:

Representación de la hidrofobicidad (Kyte y Doolitle) de la secuencia codificante del polipéptido DP428 con su representación esquemática. El motivo LPISG precede inmediatamente la región C-terminal hidrófoba. La secuencia se termina por dos argininas.

\global\parskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 56:

Representación de la hidrofobicidad (Kyte y Doolitle) de la secuencia del polipéptido M1C25 de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 30.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 57:

A- Gel de acrilamida (12%) en condición desnaturalizante de un extracto bacteriano obtenido mediante sonicación de bacterias E. coli M15 que contienen el plásmido pM1C25 sin inducción y después de 4 horas de inducción mediante el IPTG, coloreado en azul de Coomassie.

Línea 1: Marcador de masa molar (Prestained SDS-PAGE Standards High Range BIO-RAD@).

Línea 2: Extracto bacteriano obtenido mediante sonicación de bacterias E. coli M15 que contienen el plásmido pM1C25 sin inducción mediante el IPTG.

Línea 3: Extracto bacteriano obtenido mediante sonicación de bacterias E. coli M15 que contienen el plásmido pM1C25 después de 4 horas de inducción mediante el IPTG.

Línea 4: Marcador de masa molar (Prestained SDS-PAGE Standards Low Range BIO-RAD@)

B- Transferencia Western de un gel parecido (acrilamida 12%) revelado gracias al anticuerpo penta-His comercializado por la compañía Qiagen.

Línea 1: representación del marcador de masa molar (Prestained SDS-PAGE Standards High Range BIO-RAD@)

Línea 4: Representación del marcador de masa molar (Prestained SDS-PAGE Standards Low Range BIO-RAD@).

La banda presente muy mayoritariamente en las líneas que corresponden a las bacterias inducidas por el IPTG con relación a las no inducidas por el IPTG, comprendida entre 34200 y 28400 daltons, corresponde a la expresión del inserto M1C25 clonado en el vector pQE-60 (Qiagen@).

A propósito de las leyendas de las demás figuras numeradas mediante un carácter alfanumérico, cada una de estas otras figuras representa la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID cuya numeración es idéntica al carácter alfanumérico de cada unas de dichas figuras.

Las numeraciones alfanuméricas de las figuras que representan las SEC ID que comprenden un número seguido de una letra tienen los siguientes significados:

-: las numeraciones alfanuméricas que presentan el mismo número se refieren a una misma familia de secuencia relacionada con la secuencia de referencia SEC ID cuya numeración presenta este mismo número y la letra A;

-: las letras A, B y C para una misma familia de secuencias distinguen las tres fases de lecturas posibles de la secuencia nucleotídica SEC ID de referencia (A);

-: las letras indexadas mediante una prima (') significan que la secuencia corresponde a un fragmento de la secuencia SEC ID de referencia (A);

-: la letra D significa que la secuencia corresponde a la secuencia del gen predicho por Cole et al., 1998;

-: la letra F significa que la secuencia corresponde a la fase abierta de lectura (ORF por "Open Reading Frame") que contiene la secuencia "D" correspondiente según Cole et al., 1998.

-: la letra G significa que la secuencia es una secuencia predicha por Cole et al., 1998, y que presenta una homología de más de 70% con la secuencia SEC ID de referencia (A);

-: la letra H significa que la secuencia corresponde a la fase abierta de lectura que contiene la secuencia "G" correspondiente según Cole et al., 1998;

\newpage

-: la letra R significa que la secuencia corresponde a una secuencia predicha por Cole et al., 1998 en dirección corriente arriba de la secuencia "D" correspondiente, y que puede estar en fase con la secuencia "D" debido a posibles errores de secuenciación;

-: la letra P significa que la secuencia corresponde a la fase abierta de lectura que contiene la secuencia "R" correspondiente;

-: la letra Q significa que la secuencia corresponde a una secuencia que contiene las secuencias "F" y "P" correspondientes.

A propósito de la familia de secuencias SEC ID nº 4, el inserto que precede phoA contiene dos fragmentos no contiguos sobre el genoma, SEC ID 4J y SEC ID 4A y, por lo tanto, procedentes de una clonación múltiple que permite la expresión y la exportación de phoA. Estos dos fragmentos no son contiguos, los genes y las fases abiertas de lectura que los contienen según Cole et al., 1998, son importantes para la exportación de un polipéptido antígeno.

-: las letras J, K y L distinguen las tres fases de lectura posibles de la secuencia nucleotídica "J" correspondiente;

-: la letra M significa que la secuencia corresponde a la secuencia predicha por Cole et al., 1998, y que contiene la secuencia SEC ID nº 4J;

-: la letra N significa que la secuencia corresponde a la fase abierta de lectura que contiene la secuencia SEC ID nº 4M.

A propósito de la familia de secuencias SEC ID nº 45, la letra Z significa que la secuencia corresponde a la secuencia de un fragmento clonado fusionado con phoA.

Por último, a propósito de la familia de secuencia SEC ID nº 41, la letra S significa que la secuencia corresponde a una secuencia predicha por Cole et al., 1998, y que puede estar en la misma fase de lectura que la secuencia "D" correspondiente, significando la letra T que la secuencia correspondiente contiene las secuencias "F" y "S" correspondientes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Material y métodos Cultivos bacterianos, plásmidos y medios de cultivos

Se ha cultivado E. coli en un medio líquido o sólido de Luria-Bertani (LB). Se ha cultivado M. smegmatis en un medio líquido de Middlebrook 7H9 (Difco) adicionado con dextrosa albúmina (ADC), 0,2% de glicerol y 0,05% de Tween, o en un medio sólido de L. Si es necesario, se ha añadido el antibiótico kanamicina con una concentración de 20 \mug/ml^{-1}. Se han detectado los clones bacterianos que presentan una actividad PhoA sobre el agar LB que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolilo de fosfato (X-P, a 40 \mug/ml^{-1}).

\vskip1.000000\baselineskip

Manipulación de ADN y secuenciación

Se han efectuado las manipulaciones de ADN y los análisis mediante transferencia de Southern usando las técnicas estándares (Sambrook et al., 1989). Se han determinado las secuencias de ADN bicatenario con un kit de secuenciación Taq Dye Deoxy Terminator Cycle (Applied Biosystems), en un System 9600 GeneAmp PCR (Perkin - Elmer), y después con la migración en un sistema de análisis ADN modelo 373 (Applied Biosystems).

\vskip1.000000\baselineskip

Construcciones de los plásmidos

Se ha construido el plásmido pJVED_{a} a partir de pLA71, plásmido de transferencia que comprende el gen phoA truncado y dispuesto en fase con BlaF. Se ha cortado pLA71 con las enzimas de restricción KpnI y NotI, retirando así phoA sin tocar el promotor de BlaF. Se ha amplificado el gen luc que codifica para la luciferasa de luciola a partir de pGEM-luc y se ha añadido un sitio de unión del ribosoma. Se ha amplificado phoA a partir de pJEM11. Se han cortado los fragmentos amplificados con PstI y se han enlazado juntos. Los oligodesoxinucleótidos usados son los siguientes:

2

El fragmento así obtenido se ha reamplificado usando los oligonucleótidos complementarios de sus extremos, cortado con KpnI y NotI, e integrado en pLA71 cortado con las mismas enzimas. Se ha realizado una electroporación de la construcción resultante en E. coli DH5\alpha y M. smegmatis mc^{2} 155. Se ha seleccionado un clon M. smegmatis que emite una luz y que presenta una actividad phoA y se ha denominado pJVED/blaF. El inserto se ha quitado usando BamHI, y se ha vuelto a cerrar la construcción sobre sí misma, reconstruyendo así el pJVED_{a}. Con el fin de obtener el pJVED_{b,c}, se ha cortado el multisitio de clonación con ScaI y KpnI, y se ha vuelto a cerrar quitando un (pJVED_{b}) o dos (pJVED_{c}) nucleótidos del sitio SnaBI. Después de la fusión, se ha podido obtener así seis cuadros de lectura. El inserto de pJVED/hsp18 se ha obtenido mediante amplificación en cadena por polimerasa (ACP) de pPM1745 (Servant et al., 1995) usando unos oligonucleótidos de la secuencia:

3

Se ha cortado el producto con KpnI y ScaI, y enlazado a pJVED_{a}, cortado con las mismas enzimas, quitando así pJVED/hsp18.

El pJVED/P19kDa y el pJVED/erp se han construido cortando con BamHI el inserto de pExp410 y pExp53 respectivamente, e insertándolos en el sitio BamHI del multisitio de clonación de pJVED_{a}.

\vskip1.000000\baselineskip

Medición de la actividad de fosfatasa alcalina

La presencia de actividad se detecta mediante el color azul de las colonias que crecen en un medio de cultivo que contiene el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolilo de fosfato (XP), y después se puede medir la actividad cuantitativamente de manera más precisa de la siguiente manera:

Se han cultivado M. smegmatis en un medio LB adicionado con 0,05% de Tween 80 (Aldrich) y con kanamicina (20 \mug/ml^{-1}) a 37ºC durante 24 horas. Se ha medido la actividad de la fosfatasa alcalina mediante el método de Brockman y Heppel (Brockman et al., 1968) en un extracto sonicado, con p-nitrofenilfosfato como sustrato de la reacción. La cantidad de proteínas se ha medido mediante el ensayo Bio-Rad. La actividad de fosfatasa alcalina se expresa en unidad arbitraria (densidad óptica a 420 nm x \mug de proteínas ^{-1} x minutos ^{-1}).

\vskip1.000000\baselineskip

Medición de la actividad luciferasa

Se ha cultivado M. smegmatis en un medio LB adicionado con 0,05% de Tween 80 (Aldrich) y con kanamicina (20 \mug/ml^{-1}) a 37ºC durante 24 horas, y se ha usado en pleno crecimiento exponencial (DO a 600 nm comprendida entre 0,3 y 0,8). Las alícuotas de suspensiones bacterianas se han sonicado brevemente y se ha usado el extracto celular para medir la actividad de la luciferasa. Se han mezclado 25 \mul del extracto sonicado con 100 \mul de sustrato (sistema de ensayo de luciferasa Promega) automáticamente en un luminómetro, y la luz emitida se expresa en ULR o RLU (Unidades Luminosas Relativas). Se han contado las bacterias mediante diluciones seriales de la suspensión de origen en un medio agar LB kanamicina, y se expresa la actividad de la luciferasa en ULR/\mug de proteínas bacterianas o en ULR/10^{3} bacterias.

\vskip1.000000\baselineskip

Construcción de bancos genómicos de M. tuberculosis y de M. bovis-BCG

Los bancos se han obtenido usando esencialmente pJVED_{a,b,c}, descritos anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de macrófagos que proceden de la médula ósea e infección mediante M. smegmatis recombinantes

Los macrófagos que proceden de la médula ósea se ha preparado como se describe por Lang et al., 1991. En resumen, se han extraído las células de la médula ósea del fémur de ratón C57BL/6 de 6 a 12 semanas (Iffa-Credo, Francia). Se han lavado las células en suspensión y se ha resuspendido en un DMEM enriquecido con 10% de suero fetal de ternera, 10% de medio L-cell acondicionado y 2 mM de glutamina, sin antibióticos. Se han inoculado 10^{6} células sobre unas placas de 24 pocillos Costar con fondo plano en 1 ml. Después de cuatro días a 37ºC en una atmósfera húmeda al 10% de contenido en CO2, los macrófagos se han aclarado y se han vuelto a incubar durante dos a cuatro días suplementarios. Las células de un pocillo de control se han lisado con Triton x 100 al 0,1% en agua y se han enumerado los núcleos. Se han contado aproximadamente 5 x 10^{5} células adherentes. Para la infección, se ha cultivado M. smegmatis que porta los diferentes plásmidos en plena fase exponencial (DO_{600 \ nm} entre 0,4 y 0,8) y se ha diluido hasta una DO de 0,1, y después 10 veces en un medio para macrófago. Se ha añadido 1 ml en cada pocillo y se han centrifugado e incubado las placas durante cuatro horas a 37ºC. Después de tres lavados, las células se han incubado en un medio que contiene amikacina durante dos horas. Después de tres nuevos lavados, las células infectadas adherentes se han incubado en un medio macrófago durante una noche. Después, las células se han lisado en 0,5 ml de tampón de lisis (Promega). Se han sonicado 100 \mul y se ha medido la luz emitida sobre 25 \mum. Simultáneamente, se han numerado las bacterias mediante esparcimiento sobre L-agar-kanamicina (20 \mug/ml^{.-1}). La luz emitida se expresa en ULR/10^{3} bacterias.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de los bancos de datos

Las secuencias nucleotídicas se han comparado con EMBL y Genbank, usando el algoritmo FASTA y las secuencias proteicas se han analizado mediante similitud gracias a los bancos de datos PIR y Swiss Prot, usando el algoritmo BLAST.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Los vectores pJVED

Los vectores pJVED (Figura 51) son unos plásmidos que portan un gen phoA truncado de E. coli desprovisto de codón de iniciación, de secuencia señal y de secuencia reguladora. El sitio múltiple de clonación (SMC) permite la inserción de fragmentos de los genes que codifican para unas eventuales proteínas exportadas así como sus secuencias de regulación. Por lo tanto, se puede producir la proteína de fusión y puede presentar una actividad fosfatasa alcalina si se exporta. Sólo las fusiones en fase podrán ser productivas. Así, se ha modificado el SMC de manera que las fusiones se puedan obtener en seis fases de lectura. En dirección corriente abajo de phoA, se ha insertado el gen luc de la luciferasa de luciola. El gen completo con el codón de iniciación, pero sin que se haya usado ningún promotor, debería así expresarse con phoA como en un operón sintético. Se ha insertado un nuevo sitio de unión de los ribosomas ocho nucleótidos en dirección corriente arriba del codón de iniciación de luc. Dos terminadores de transcripción están presentes en los vectores pJVED, uno en dirección corriente arriba del SMC y un segundo en dirección corriente abajo de luc. Estos vectores son unos plásmidos de transferencia E. coli-micobacterium con un gen de resistencia a la kanamicina como marcador de selección.

phoA y luc funcionan como en un operón, pero la exportación es necesaria para la actividad phoA.

Se han construido cuatro plásmidos mediante inserción en el SMC de fragmentos de ADN de diversos orígenes:

En la primera construcción denominada pJVED/blaF, el fragmento de 1,4 kb procede del plásmido ya descrito pLA71 (Lim et al., 1995). Este fragmento que procede del gen \beta-lactamasa (blaF) de M. fortuitum D216 (Timm et al., 1994) incluye el promotor mutado hiperactivo, el segmento que codifica para 32 aminoácidos de la secuencial señal y los 5 primeros aminoácidos de la proteína madura. Así, esta construcción incluye el promotor más fuerte conocido en Microbacterium y los elementos necesarios para la exportación de la proteína de la fusión phoA. Por consiguiente, se puede esperar de esta construcción una fuerte emisión de luz y una buena actividad phoA (véanse las figuras 53 y 54).

En una segunda construcción denominada pJVED/hsp18, se ha clonado un fragmento de 1,5 kb a partir del plásmido ya descrito pPM1745 (Servant et al., 1995). Este fragmento incluye los nucleótidos que codifican para los diez primeros aminoácidos de la proteína de choque térmico de 18 kb que procede de Streptomyces albus (heat shock protein 18, HSP 18), el sitio de unión del ribosoma, el promotor y, en dirección corriente arriba, unos sitios reguladores que controlan su expresión. Esta proteína pertenece a la familia de alfa-cristalina de HSP con bajo peso molecular (Verbon et al., 1992). Su homólogo que procede de M. leprae, el antígeno de 18 kDa, ya se conoce por ser inducido durante la fagocitosis mediante un macrófago murino de la línea celular J-774 (Dellagostin et al., 1995). En condiciones de cultivo estándar, el pJVED/hsp18 muestra una baja actividad luc y ninguna actividad phoA (véanse las figuras 53 y 54).

En una tercera construcción, denominada pJVED/P19kDa, el inserto que procede de pExp410 (Lim et al., 1995) ha sido cortado y clonado en el SMC de pJVED_{a}. Este fragmento incluye los nucleótidos que codifican para los 134 primeros aminoácidos de la proteína conocida de M. tuberculosis 19 kDa y de sus secuencias reguladoras. Como se ha podido demostrar, esta proteína es una lipoproteína glucosilada (Garbe et al., 1993; Herrmann et al., 1996). En las figuras 53 y 54 se observa, para esta construcción, una buena actividad luc que corresponde a un promotor fuerte, pero la actividad phoA es la más fuerte de las cuatro construcciones. La actividad phoA elevada de esta proteína de fusión con una lipoproteína se explica porque sigue atada a la pared celular por su extremo N-terminal.

En una cuarta y última construcción denominada pJVED/erp, el inserto procede de pExp53 (Lim et al., 1995) y ha sido clonado en el SMC de pJVED_{a}. El pExp53 es el plásmido inicial seleccionado por su actividad phoA y que contiene una parte del gen erp de M. tuberculosis que codifica para un antígeno de 28 kDa. Este último incluye la secuencia señal, una parte de la proteína madura y, en dirección corriente arriba del codón de iniciación, el sitio de unión de ribosoma. Se ha cartografiado el promotor. Una caja de hierro (iron box) putativo de tipo fur está presente en esta región y enmarca la región -35 del promotor (Berthet et al., 1995). Tal como estaba previsto (figuras 53 y 54) esta construcción presenta una buena emisión luminosa y una buena actividad phoA. El hecho de que esta proteína de fusión, contrariamente a la fusión con la lipoproteína de 19 kDa, no parece atada a la pared celular no excluye que la proteína nativa esté asociada a la misma. Además, el extremo C-terminal de erp está ausente de la proteína de fusión.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Ejemplo 2 Construcción de un banco de ADN genómico de M. tuberculosis en los vectores pJVED_{s} e identificación de uno de los miembros de estos bancos, (DP428), inducido durante la fagocitosis por los macrófagos murinos derivados de la médula ósea

Las diferentes construcciones se ensayan para su capacidad en evaluar la expresión intracelular de los genes identificados por la expresión de phoA. Con este objetivo, la actividad luc se expresa en URL para 10^{3} bacterias en cultivo axénico y/o en unas condiciones intracelulares. La inducción o la represión que sigue a la fagocitosis mediante los macrófagos murinos derivados de la médula ósea se puede evaluar convenientemente mediante la medición de las actividades específicas. Los resultados de dos experimentos distintos se representan en la tabla 2.

Se ha usado el plásmido pJVED/hsp18 como control positivo para la inducción durante la fase de crecimiento intracelular. Aunque la inducción del promotor mediante el calentamiento de la bacteria hasta 42ºC no haya sido concluyente, la fagocitosis de la bacteria conduce claramente a un aumento de la actividad del promotor. En todos los experimentos, la actividad luc intracelular ha sido fuertemente inducida, aumentando de 20 a 100 veces la actividad basal inicialmente baja (Servant, 1995).

Se ha usado el plásmido pJVED blaF como control de la modulación no específica durante la fagocitosis. Se han podido demostrar unas bajas variaciones, probablemente debidas a unos cambios de condiciones de cultivos. De cualquier forma, estas bajas variaciones no son comparables con la inducción observada con el plásmido pJVED/hsp18.

Se han ensayado todos los miembros del banco de ADN mediante medición de la actividad del promotor durante el crecimiento intracelular. Entre éstos, el DP428 está fuertemente inducido durante la fagocitosis (tablas 1 y 2).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

5

\vskip1.000000\baselineskip

El fragmento nucleotídico que codifica para la región N-terminal del polipéptido DP428 de secuencia SEC ID nº 28 está contenido en el plásmido depositado en la CNCM con el nº I-1818.

La totalidad de la secuencia que codifica para el polipéptido DP428 se ha obtenido como se detalla a continuación.

Se ha obtenido una sonda mediante PCR con la ayuda de los oligonucleótidos de secuencia SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26. Se ha marcado esta sonda mediante extensión aleatoria en presencia de ^{32}P dCTP. Se ha realizado una hibridación del ADN genómico de M. tuberculosis cepa Mt103 previamente digerido por la endonucleasa Scal con la ayuda de dicha sonda. Los resultados de la hibridación han demostrado que un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb estaba marcado. Debido a que existe un sitio Scal que se extiende desde el nucleótido nt 984 hasta el nucleótido nt 989 de la secuencia SEC ID nº 1, es decir del lado 5' de la secuencia usada como sonda, el final de la secuencia codificante está necesariamente presente en el fragmento detectado mediante hibridación.

El ADN genómico de la cepa Mt 103 de M. tuberculosis, después de la digestión por Scal, ha sufrido una migración sobre un gel de agarosa. Se han clonado los fragmentos de tamaños comprendidos entre 1,6 y 1,8 kb en el vector pSL1180 (Pharmacia) previamente escindido por Scal y desfosforilado. Después de la transformación de E. coli con los vectores recombinantes resultantes, las colonias obtenidas han sido cribadas con la ayuda de la sonda. El cribado ha permitido aislar seis colonias que se hibridan con esta sonda.

Se han secuenciado los insertos contenidos en los plásmidos de los clones recombinantes previamente seleccionados, y después se han alineado las secuencias de manera que se determina la totalidad de la secuencia que codifica para DP428, más específicamente la SEC ID nº 2.

Se ha sintetizado un par de cebadores a fin de amplificar, a partir del ADN genómico de M. tuberculosis cepa Mt 103, la totalidad de la secuencia que codifica para el polipéptido DP428. Se ha clonado el amplicón obtenido en un vector de expresión.

Unos pares de cebadores apropiados para la amplificación y la clonación de la secuencia que codifica para el polipéptido DP428 pueden ser fácilmente realizados por el experto en la materia, en base a las secuencias nucleotídicas SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.

Un par de cebadores particular según la invención es el par de cebadores siguientes, capaz de amplificar el ADN que codifica para el polipéptido DP428 desprovisto de su secuencia señal:

-: Cebador de ida (SEC ID nº 29), que comprende la secuencia de ida que va desde el nucleótido en posición nt 1021 al nucleótido nt 1044 de la secuencia SEC ID nº 2:

: 5'-AGTGCATGCTGCTGGCCGAACCATCAGCGAC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

-: Cebador de vuelta (SEC ID nº 30), que comprende la secuencia complementaria de la secuencia que va des-de el nucleótido en posición nt 1345 hasta el nucleótido en posición nt 1325 de la secuencia SEC ID nº 2:

: 5'-CAGCCAGATCTGCGGGCGCCCTGCACCGCCTG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

en las que la parte subrayadas representa las secuencias que se hibridan específicamente con la secuencia SEC ID nº 2, y los extremos 5' corresponden a unos sitios de restricción con vistas a la clonación del amplicón resultante en un vector de clonación y/o de expresión.

Un vector particular usado para la expresión del polipéptido DP428 es el vector pQE70 comercializado por la compañía Qiagen.

Ejemplo 3 La secuencia completa del gen DP428 y de sus regiones flanqueantes

Se ha obtenido una sonda de la región codificante de DP428 mediante ACP, y se ha usado para hibridar el ADN genómico de diferentes especies de micobacterias. Según los resultados de la figura 3, el gen está presente únicamente en las micobacterias del complejo de M. tuberculosis.

El análisis de la secuencia sugiere que DP428 podría formar parte de un operón. La secuencia codificante y las regiones flanqueantes no presentan ninguna homología con unas secuencias conocidas depositadas en los bancos de datos.

Según la secuencia codificante, este gen codifica para una proteína de 10 kDa con un péptido señal, un extremo C-terminal hidrófobo terminado por dos argininas y precedido por un motivo LPISG parecido al motivo conocido LPXTG. Estas dos argininas podrían corresponder a una señal de retención, y la proteína DP428 podría estar enlazada mediante este motivo a unos peptidoglicanos como ya se ha descrito en otras bacterias Gram (Navarre et al., 1994 y 1996).

El mecanismo de supervivencia y de crecimiento intracelular de las micobacterias es complejo y las relaciones íntimas entre la bacteria y la célula hospedante siguen sin explicarse. Independientemente del mecanismo, el crecimiento y la supervivencia intracelular de las micobacterias depende de factores producidos por la bacteria y capaces de modular la respuesta del hospedante. Estos factores pueden ser unas moléculas expuestas en la superficie celular tal como LAM o unas proteínas asociadas con la superficie celular, o unas moléculas activamente secretadas.

Por otra parte, intracelularmente, las mismas bacterias deben hacer frente a un entorno hostil. Parece que responden mediante unos medios próximos a los usados en las condiciones de estrés, mediante la inducción de proteínas de choque térmico (Dellagostin et al., 1995), pero también mediante la inducción o la represión de diferentes proteínas (Lee et al., 1995). Usando una metodología derivada de la PCR, Plum y Clark-curtiss (Plum et al., 1994) han demostrado que un gen de M. avium incluido en un fragmento de ADN de 3 kb, está inducido después de la fagocitosis mediante unos macrófagos humanos. Este gen codifica para una proteína exportada que comprende una secuencia líder, pero que no presenta ninguna homología significativa con las secuencias propuestas por los bancos de datos. Asimismo, se ha demostrado (Dellagostin et al., 1995) la inducción, durante la fase de crecimiento intracelular, de una proteína de choque térmico de bajo peso molecular que procede de M. leprae. En otro estudio, las proteínas bacterianas de M. tuberculosis se han marcado metabólicamente durante la fase de crecimiento intracelular o bien en unas condiciones de estrés, y se han separado mediante electroforesis sobre gel en dos dimensiones: 16 proteínas de M. tuberculosis han sido inducidas y 28 reprimidas. Las mismas proteínas entran en juego durante un estrés provocado por un pH bajo, un choque térmico, H_{2}O_{2}, o durante la fagocitosis mediante unos monolitos humanos de la línea THP1. Sea lo que sea, el comportamiento de las proteínas inducidas y reprimidas era único en cada condición (Lee et al., 1995). Considerados en conjunto, estos resultados indican que un diálogo molecular sutil se establece entre las bacterias y sus hospedantes celulares. De este diálogo depende probablemente el futuro del organismo intracelular.

En este contexto, la inducción de la expresión de DP428 podría ser de mayor importancia, indicando un papel importante de esta proteína en la supervivencia y el crecimiento intracelular.

El método usado en estos experimentos para evaluar la expresión intracelular de los genes (véase Jacobs et al., 1993, para el método de determinación de la expresión de la luciferasa de luciola, y Lim et al., 1995, para el método de determinación de la expresión del gen PhoA) presenta la ventaja de ser simple en comparación con las demás técnicas como la técnica descrita por Mahan et al. (Mahan et al., 1993) adaptada a las micobacterias y propuesta por Bange et al. (Bange et al., 1996), o el método sustractivo basado en el ACP descrito por Plum y Clark-curtiss (Plum et al., 1994). Existe indiscutiblemente una variabilidad como lo muestra la comparación de los diferentes experimentos. Aunque sea suficiente provocar la inducción o la represión, es posible a partir de ahora evaluarla, suministrando así una herra-
mienta suplementaria de estudios fisiológicos de las proteínas exportadas identificadas mediante la fusión con phoA.

Ejemplo 4 Búsqueda de una modulación de la actividad de los promotores durante las fases intramacrofágicas

Se preparan unos macrófagos de médula ósea de ratón como se describe por Lang y Antoine (Lang et al., 1991). Las bacterias de M. segmentis recombinantes, de las cuales se ha determinado la actividad luciferasa mediante 10^{3} bacterias como anteriormente, se incuban a 37ºC en atmósfera humidificada y enriquecida con CO_{2} al 5%, durante 4 horas en presencia de estos macrófagos, de tal manera que estén fagocitadas. Después del aclarado para eliminar las bacterias extracelulares restantes, se añade al medio de cultivo amikacina (100 \mug/ml) durante dos horas. Después de un nuevo aclarado, el medio se sustituye por un medio de cultivo (DMEM enriquecido con 10% de suero de ternera y 2 mM de glutamina) sin antibióticos. Después de una noche de incubación como anteriormente, los macrófagos se lisan en frío (4ºC) con la ayuda de un tampón de lisis (cee lysis buffer, Promega), y se determina la actividad luciferasa mediante 10^{3}
bacterias. La relación de las actividades en la puesta en cultivo y después de una noche da el coeficiente de inducción.

Ejemplo 5 Aislamiento de una serie de secuencias mediante secuenciación directamente a partir de las colonias

Se ha aislado una serie de secuencias que permiten la expresión y la exportación de phoA a partir del ADN de M. tuberculosis o de M. Bovis BCG. Entre este grupo de secuencias, dos de ellas se han estudiado más, se han clonado los genes completos que corresponden a los insertos, se han secuenciado, y unos anticuerpos contra el producto de estos genes han servido para demostrar en un microscopio electrónico que estos genes codificaban para unos antígenos encontrados en la superficie de los bacilos de la tuberculosis. Según la secuencia, uno de estos genes erp que codifica para una secuencia señal de exportación consenso, el otro des no poseía ninguna característica de gen que codifica para una proteína exportada. Se ha secuenciado otro gen DP428 antes de que la secuencia del genoma de M. Tuberculosis esté disponible. Contiene una secuencia parecida a la secuencia consenso de enlace al peptidoglicano, lo que sugiere que se trata también de un antígeno probablemente encontrado en la superficie de los bacilos de la tuberculosis. El estudio de los tres genes erp, des, y el que codifica para DP428 muestra que el sistema phoA que los inventores han desarrollado en las micobacterias permite localizar unos genes que codifican para unas proteínas exportadas sin determinante localizable mediante unos estudios in silico. Esto es particularmente real para los polipéptidos que no presentan ninguna secuen-
cia señal consenso (des) o que no tienen ninguna similitud con unas proteínas de función conocida (erp y DP428).

Se han identificado y secuenciado un cierto número de insertos antes del conocimiento del genoma de M. Tuberculosis, y otros se han identificado y secuenciado después. Estas secuencias se pueden considerar como unos cebadores que permiten buscar unos genes que codifican para unas proteínas exportadas. Hoy en día, se han secuenciado una serie de cebadores, y los genes completos correspondientes se han secuenciado o bien identificado según la secuencia publicada del genoma. Para tener en cuenta de los errores de secuenciación siempre posibles, se han considerado las regiones en dirección corriente arriba o en dirección corriente abajo de ciertos cebadores como que forman parte de secuencias que codifican para unas proteínas exportadas. En ciertos casos, se han detectado unas similitudes con unos genes que codifican para unas proteínas exportadas o unas secuencias características de señales de exportación o unas características topológicas de proteínas membranarias.

Unas secuencias cebadores parecen corresponder a unos genes que pertenecen a unas familias de genes que presentan más del 50% de similitud. Así, se puede indicar que los otros genes detectados por similitud con un cebador codifican para unas proteínas exportadas. Es el caso de las secuencias SEC ID nº 8G y SEC ID nº 8H que presentan más del 77% de similitud con SEC ID nº 8A'.

Las secuencias que pueden codificar para unas proteínas exportadas son las siguientes: SEC ID nº 1, 8, 9, 8G, 8H, 13, 3, 10, 19, 20, 6, 16, 22, 23, 24, 39, 44, 46 y 50.

Unos genes identificados según los cebadores a partir de la secuencia del genoma no tienen ninguna característica (según la secuencia) de proteínas exportadas. Se trata de las siguientes secuencias: SEC ID nº 4, 27, 11, 12, 14, 7, 15, 17, 18, 21, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 45, 47, 48, y 49.

Según la secuencia de otros organismos como E. coli, se puede buscar en la secuencia del genoma de M. tuberculosis unos genes que presentan unas similitudes con unas proteínas conocidas por ser exportadas en otros organismos aunque no presentan ninguna secuencia señal de exportación. En este caso, una fusión con phoA es un protocolo ventajoso para determinar si estas secuencias de M. tuberculosis codifican para unas proteínas exportadas aunque no presenten ninguna secuencia señal consenso. En efecto, fue posible clonar SEC ID nº 49, una secuencia similar a un gen de E. coli de la familia htrA. Una fusión de SEC ID nº 49 con phoA conduce a la expresión y a la exportación de phoA. Unas colonias M. smegmatis que albergan una fusión SEC ID nº 49 phoA sobre un plásmido pJVED son azules.

Por lo tanto, la SEC ID nº 49 está considerada como una proteína exportada.

El método phoA es, por lo tanto, útil para detectar según la secuencia de M. Tuberculosis unos genes que codifican para unas proteínas exportadas sin que codifiquen para unas secuencias características de las proteínas exportadas.

Incluso si una secuencia presenta unos determinantes de proteínas exportadas, eso no demuestra una exportación funcional. El sistema phoA permite demostrar que el gen en cuestión codifica realmente para una proteína exportada. Así, se ha verificado que la secuencia SEC ID nº 50 poseía realmente unas señales de exportación.

\global\parskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

6

TABLA 3 (Continuación)

7

Ejemplo 6 Características y obtención de la proteína M1C25

Se ha detectado que el extremo N-terminal de la proteína M1C25 mediante el sistema phoA permite la exportación de la proteína de fusión, necesaria para la obtención de su actividad fosfatasa.

La secuencia de ADN que codifica para el extremo N-terminal de la proteína M1C25 está contenida en la secuencia SEC ID nº 20 de la presente solicitud de patente.

A partir de esta secuencia cebador, se ha buscado el gen completo que codifica para la proteína M1C25 en el genoma de M. tuberculosis (Fundación Welcome Trust, site Sanger).

El centro Sanger ha atribuido a M1C25 los nombres:

Rv3576,

MTCY06G11.23,

pknM

Secuencia SEC ID nº 29 del gen completo M1C25 (714 bases):

Véase la Figura 29

Este gen codifica para una proteína de 237 AA, de 25 kDa de masa molar. Esta proteína está designada en los bancos con las denominaciones:

PID: e306716

SPTREMBL: P96858

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia SEC ID nº 30 de la proteína M1C25 (237 aminoácidos): véase la Figura 30

M1C25 contiene un sitio de fijación en la parte lipídica de las lipoproteínas de membrana de los procariotas (PS00013 Prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site:

CTGGTCGGTG CGTGCATGCT CGCAGCCGGA TGC).

\vskip1.000000\baselineskip

La función de M1C25 no es segura pero presenta muy probablemente una actividad "serina/treonina-Proteína quinasa". Se pueden observar unos parecidos con la mitad C-terminal de K08G_MYCTU Q11053 Rv1266c (MTCY50.16). También se encuentran unas similitudes con KY28_MYCTU.

En dirección 5' del gen que codifica M1C25 se encuentra un gen que codifica potencialmente para una proteína reguladora (PID:e306715, SPTREMBL:P96857, Rv3575c, (MTCY06G11.22c)).

El perfil de hidrofobicidad (Kyte y Doolitle) de M1C25 se representa en la figura 56.

Se predice un sitio de escisión de la secuencia señal (SignalP V1.1; World Wide Web Prediction Server, Center for Biological Sequence Analysis) entre los aminoácidos 31 y 32: AVA-AD. Este sitio de escisión está detrás de un motivo "AXA" habitual. Esta predicción es compatible con el perfil de hidrofobicidad. En esta secuencia señal potencial se observa la repetición tres veces de la secuencia de los tres aminoácidos LAA.

Clonación del gen M1C25 con vistas a la producción de la proteína que codifica:

Se ha sintetizado un par de cebadores a fin de amplificar, a partir del ADN genómico de M. tuberculosis, cepa H37Rv, la totalidad de la secuencia que codifica para el polipéptido M1C25. Se ha clonado el amplicón obtenido en un vector de expresión.

Se han sintetizado unos pares de cebadores apropiados para la amplificación y la clonación de la secuencia que codifica para M1C25:

-: cebador de ida:

: 5'-ATAATACCATGGGCAAGCAGCTAGCCGCGC-3'

-: cebador de vuelta:

: 5'-ATTTATAGATCTCTGCTTAGCAACCTTGGCCGCG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

La parte subrayada representa las secuencias que se hibridan específicamente con la secuencia M1C25, y los extremos 5' corresponden a unos sitios de restricción con vistas a la clonación del amplicón resultante en un vector de clonación y/o de expresión.

Un vector particular usado para la expresión del polipéptido M1C25 es el vector pQE60 comercializado por la compañía Qiagen, siguiendo el protocolo y las recomendaciones propuestos por esta marca.

Las células usadas para la clonación son unas bacterias: E. coli XL1-Blue (resistentes a la tetraciclina).

Las células usadas para la expresión son unas bacterias: E. coli M15 (resistentes a la kanamicina) que contienen el plásmido pRep4 (M15 pRep4).

La producción de la proteína MC25 se ilustra mediante las figuras 57A y B (extractos bacterianos de la cepa E. coli M15 que contienen el plásmido pM1C25). Los cultivos bacterianos y los extractos se preparan según Sambrook et al., (1989). El análisis de los extractos bacterianos se efectúa según las instrucciones de Qiagen (1997).

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias bibliográficas

AIDS therapies, 1993, en Mycobacterial infections, ISBN 0-9631698-1-5, p. 1-11.

Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410.

Andersen, P. et al., 1991, Infect. Immun., 59:1905-1910.

Andersen, P. et al., 1995, J. Immunol., 154, 3359-3372.

Bange, F.C., A.M. Brown, y W.R. Jacobs JR., 1996, Leucine auxotrophy restricts growth of Mycobacterium bovis BCG in macrophages. Infect. Immun., 64: 1794-1799.

Barany, F., 1911, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193.

Bates, J. et al., 1986, Am. Rev. Respir. Dis., 134:415-417.

Bates, J. 1979. Chest. 76 (Suppl.):757-763.

Bates, J. et al. 1986. Am. Rev. Respir. Dis. 134:415-417.

Berthet, F.X., J. Rauzier, E.M. Lim, W. Philipp, B. Gicquel, y D. Portnoï, 1995, Characterization of the M. tuberculosis erp gene encoding a potential cell surface protein with repetitive structures. Microbiology. In press

Borremans, M. et al., 1989, Biochemistry, 7: 3123-3130.

Bouvet, E. 1994. Rev. Fr. Lab. 273:53-56.

Brockman, R.W. y Heppel L.A., 1968, On the localization of alkaline phosphatase and cyclic phosphodiesterase in Escherichia coli, Biochemistry, 7: 2554-2561.

Burg, J.L. et al., 1996, Mol. and Cell. Probes, 10:257-271.

Chevrier, D. et al., 1993, Mol. and Cell. Probes, 7:187-197.

Clemens, D.L., 1996, Characterization of the Mycobacterium tuberculosis phagosome, Trends Microbiol., 4: 113-118.

Chu, B.C.F. et al., 1986, Nucleic Acids Res., 14:5591-5603.

Clemens, D.L. y Horwitz M.A., 1995, Characterization of the Mycobacterium tuberculosis phagosome and evidence that phagosomal maturation is inhibited, J. Exp. Med., 181:257-270.

Colignon J.E., 1996. Immumologic studies in humans. Measurement of proliferative responses of culturered lymphocytes. Current Protocols in Immunology, NIH, 2, Sección II.

Daniel, T.M. et al. 1987. Am. Rev. Respir. Dis., 135:1137-1151).

Dellagostin, O.A., Esposito G., Eales L.-J., Dale J.W. y McFadden J.J., 1995, Activity of mycobacterial promoters during intracellular and extracellular growth. Microbiol., 141: 2123-2130.

Drake, T.A. et al. 1987. J. Clin. Mocrobiol. 25:1442-1445.

Dramsi et al., 1997, Infection and Immunity, 65, 5: 1615-1625.

Duck, P. et al., 1990, Biotechniques, 9:142-147.

Erlich, H.A. 1989. En PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. Nueva York: Stockton Press.

Feigner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413.

Fraley et al., 1980, J. Biol. Chem., 255:10431.

Gaillard, J.L., Berche P., Frehel C., Gouin E. y Cossart P., 1991, Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from Gram-positive cocci, Cell., 65: 1127-1141.

Garbe, T., Harris D., Vordermeir M., Lathigra R., Ivanyi J. y Young D., 1993, Expression of the Mycobacterium tuberculosis 19-kilodalton antigen in Mycobacterium srnegmatis: immunological analysis and evidence of glycosylation, Infect. Immun., 61: 260-267.

Guateli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878.

Harboe et al., 1996, Infect. Immun., 64, 16-22.

Herrmann, J.L., O'Gaora P., Gallagher A., Thole J.E.R. y Young D.B., 1996, Bacterial glycoproteins: a link between glycosylation and proteolytic cleavage of a 19 kDa antigen from Mycobacterium tuberculosis, EMBO J. 15: 3547-3554.

Houbenweyl, 1974, en Meuthode der Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volumen 15-I y 15-II, Thieme, Stuttgart.

Huygen, K. et al., 1996, Nature Medicine, 2(8):893-898.

Innis, M.A. et al. 1990. en PCR Protocols. A guide to Methods and Apllications. San Diego: Academic Press. Isberg, R.R., Voorhis D.L. y Falkow S., 1987, Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells, Cell, 50:769-778.

Jacobs, W.R. et al., 1991. Construction of mycobacterial genomic libraries in shuttle cosmids. Genetic Systems for Mycobacteria, Methods in Enzymology, 204: 537-555.

Jacobs, W.R. et al., 1993, Science, 260:819-822.

Kaneda, et al., 1989, Science, 243:375

Kiehn, T.E., et al. 1987. J. Clin. Microbiol. 25:1551-1552.

Kievitis, T. et al., 1991, J. Virol. Methods, 35:273-286.

Kohler, G. et al., 1975, Nature, 256(5517):495-497.

Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177.

Landegren, U. et al., 1988, Science, 241:1077-1080.

Lang, T. y Antoine J.-C., 1991, Localization of MHC classll molecules in murine bone marrow-derived macrophages. Immunology, 72: 199-205.

Lee, H.Y. y Horwitz M.A., 1995, Identification of macrophage and stress-induced proteins of Mycobacterium tuberculosis, J. Clin. Invest., 96: 245-249.

Lim, E.M., Rauzier J., Timm J., Torrea G., Murray A., Gicquel B. y Portnoï D., 1995, Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA sequences encoding exported proteins, using phoA gene fusions, J. Bacteriol., 177:
59-65.

Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/technology, 6:1197-1202.

Mahan, M.J. et al., 1993. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues, Science, 259: 686-688.

Manoil L., Mekolanos J.J. y Beckwith J., J. Bacterial., 1990, 172, 515-518.

Matthews, J.A. et al., 1988, Anal. Biochem., 169:1-25.

Merrifield, R.D., 1966, J. Am. Chem. Soc., 88(21):5051-5052.

Midoux, 1993, Nucleic Acids Research, 21:871-878.

Miele, E.A. et al., 1983, J. Mol. Biol., 171:281-295.

Minton, N.P., 1984, Gene, 31, 269-273.

Montgomery et al., 1993, DNA Cell Biol., 12:777-783.

Navarre, W.W. et al., 1994, Molecular Microbiologie, 14(1):115-121.

Navarre, W.W. et al., 1996, J. of Bacteriology, 178, 2:441-446.

Pagano et al., 1967, J. Virol., 1:891

Pastore, 1994, Circulation, 90:I-517.

Patel, et al. 1990. J. Clin. Microbiol. :513-518.

Prentki, B. y Krish H.M., 1984, Gene, 29: 303-313.

Pettersson R., Nordfelth J., Dubinina E., Bergman T., Gustafeson M., Magnusson R.E. y Wolf-Watz H., 1996, Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science., 273: 1231-1233.

Plum, G. y Clark-Curtiss J.E., 1994, Induction of Mycobacterium avium gene expression following phagocytosis by human macrophages. Infect. Immun., 62: 476-483.

Roberts, M.C., et al. 1987. J. Clin. Microbiol. 25:1239-1243.

Rolfs, A. y al. 1991. In PCR Topics. Usage of Polymerase Chain reaction in Genetic and Infectious Disease. Berlin: Springer-Verlag.

Sambrook, J. et al. 1989. In Molecular cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sanchez-Pescador, R., 1988, J. Clin. Microbiol., 26(10):1934-1938.

Schneewind, O. et al., 1995, Science, 268: 103-106.

Segev D., 1992, en a Non-radioactive Labeling and Detection of Biomolecules v. Kessler C. Springer Verlag, Berlin, Nueva York, 197-205.

Servant, P. y Mazodier P., 1995, Characterization of Streptomyces albus 18-kilodalton heat shock-responsive protein. J. Bacteriol., 177: 2998-3003.

Shiver, J.W.; 1995, en Vaccines 1995, ed. Chanock, R.M. Brown, F. Ginsberg, H.S. & Norrby, E.), p. 95-98, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

Sorensen et al., 1995, Infect. Immun., 63, 1710-1717.

Stone, B.B. et al., 1996, Mol. and Cell. Probes, 10 :359-370.

Stover, C.K., Bansal G.P., Hanson M.S., Burlein S.R., Palaszynski S.R., Young J.F., Koenig S., Young D.H., Sadziene A. y Barbour A.G., 1993, Protective immunity elecited by recombinant Bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme disease vaccine. J. Exp. Med., 178:
197-209.

\newpage

Sturgill-Koszycki, S., Schlesinger P.H., Chakroborty P., Haddix P.L., Collins H.L., Fok A.K., Allen R.D., Gluck S.L., Heuser J. y Russell D.G., 1994, Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science., 263: 678-681.

Tascon, R.E et al., 1996, Nature Medicine, 2(8):888-892.

Technique assemblage oligonucléotides, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:7461-7465.

Technnique des béta-cyanethylphosphoramidites, 1986, Bioorganic Chem., 4:274-325.

Thierry, D. et al., 1990, Nucl. Acid Res., 18:188.

Timm, J., Perilli M.G., Duez C., Trias J., Orefici G., Fattorini L., Amicosante G., Oratore A., Boris B., Frere J.M., Pugsley A.P. y Gicquel B., 1994, Transcription and expression analysis, using lacZ and phoA gene fusions, of Mycobacterium fortuitum B-lactamase genes cloned from a natural isolate and a high-level B-lactamase producer. Mol. Microbiol., 12: 491-504.

Tuberculosis Prevention Trial, 1980, Mendis, a "Trial of BCG vaccines in South India for Tuberculosis Infection", Indian Journal of Medical research, 1972 (Supl.):1-74.

Urdea, M.S. et al., 1991, Nucleic Acids Symp. Ser., 24:197-200.

Urdea, M.S., 1988, Nucleic Acids Research, 11: 4937-4957.

Verbon, A., Hartskeerl R.A., Schuitema A., Kolk A.H., Young D.B. y Lathigra R., 1992, The 14,000-molecular-weight antigen of Mycobacterium tuberculosis is related to the alpha-crystallin family of low-molecular-weight heat shock proteins. J Bacteriol., 174: 1352-1359.

Walker, G.T. et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:1691-1696.

Walker, G.T. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:392-396.

Wiker, H.G. et al., 1992, Microbiol. Rev., 56:648-661.

Yamaguchi, R. et al., 1989, Infect. Immun., 57:283-288;

Xu, S., Cooper A., Sturgill-Koezycki S., van Heyningen T., Chatterjee D., Orme I., Allen P. y Russel D.G., 1994, Intracellular trafficking in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-infected macrophages, J. Immuno., 153: 2568-2578.

Young, D.B. et al., 1992, Mol. Microbiol., 6:133-145.

Yuen, L.R.W. et al., 1993, J. Clin. Microbial., 31: 1615-1618.

Claims

1. Vector recombinante de cribado, de clonación y/o de expresión, caracterizado porque se replica en unas micobacterias y porque contiene:

1) un replicón funcional en las micobacterias;

2) un marcador de selección;

3) un casete indicador que comprende:

a): un sitio de clonación múltiple (polylinker),

b): eventualmente, un terminador de transcripción activo en las micobacterias, en dirección corriente arriba del polylinker,

c): una primera secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de exportación y/o de secreción de proteína, estando dicha secuencia nucleotídica desprovista de su codón de iniciación y de sus secuencias de regulación, y

d): en dirección corriente abajo, una segunda secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado, estando dicha secuencia nucleotídica desprovista de su codón de iniciación.

2. Vector recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de exportación y/o de secreción de proteína es una secuencia codificante que procede del gen phoA de la fosfatasa alcalina.

3. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de exportación y/o de secreción de proteína es una secuencia codificante del gen de la \beta-agarasa, de la nucleasa de un estafilococo o de la \beta-lactamasa de una micobacteria.

4. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado es una secuencia codificante que procede del gen luc de la luciferasa de luciola.

5. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica para un marcador de actividad de promotores contenidos en el fragmento clonado es una secuencia codificante que procede del gen GFP de la Green Fluorescent Protein.

6. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el terminador de transcripción activo en las micobacterias es el terminador del colifago T4 (tT4).

7. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es un plásmido seleccionado de entre los plásmidos siguientes depositados en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Paris, Francia):

a): pJVED_{a} depositado en la CNCM con el nº I-1797, el 12/12/1996,

c): pJVED_{c} depositado en la CNCM con el nº I-1799, el 12/12/1996.

8. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende en uno de los sitios de clonación del polylinker una secuencia de ácido nucleico de micobacteria en la que se detecta la presencia de una secuencia nucleica que codifica para un polipéptido susceptible de ser exportado y/o secretado, y/o de ser inducido o reprimido durante la infección mediante dicha micobacteria, o también expresado o producido de manera constitutiva, así como las secuencias promotoras y/o reguladoras asociadas susceptibles de permitir o de favorecer la exportación y/o la secreción de dicho polipéptido, o la totalidad o parte de gen que codifica para dicho polipéptido.

9. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de micobacteria que contiene se obtiene mediante fragmentación física o mediante digestión enzimática del ADN genómico o del ADN complementario de un ARN de una micobacteria.

10. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha micobacteria es M. tuberculosis.

11. Vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha micobacteria se selecciona de entre M. africanum, M. bovis, M. avium o M. leprae.

12. Procedimiento de cribado de secuencias de nucleótidos procedentes de micobacterias para determinar la presencia de secuencias que corresponden a unos polipéptidos exportados y/o secretados que pueden ser inducidos o reprimidos durante la infección, sus secuencias promotoras y/o reguladores asociadas susceptibles en particular de permitir o de favorecer la exportación y/o la secreción de dichos polipéptidos de interés, o la totalidad o parte de unos genes de interés que codifican para dichos polipéptidos, caracterizado porque utiliza un vector según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Procedimiento de cribado según la reivindicación 12, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

b): la inserción de los fragmentos obtenidos en la etapa a) en un sitio de clonación, llegado el caso compatible con la enzima de la etapa a), del polylinker de un vector según una de las reivindicaciones 1 a 11;

d): la transformación de células hospedantes mediante el vector amplificado en la etapa c), o en ausencia de amplificación, mediante el vector de la etapa b);

h): la selección de las inserciones contenidas en el vector, permitiendo la obtención de clones positivos para el marcador de exportación y/o de secreción, y/o para el marcador de actividad de promotores;

i): el aislamiento y la caracterización de los fragmentos de ADN de micobacterias contenidas en estos insertos y, pudiendo la etapa i) del procedimiento comprender además una etapa de secuenciación de las inserciones seleccionadas.

14. Micobacteria recombinante, caracterizada porque se transforma mediante un vector recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 11.