ES2306668T3

ES2306668T3 - Polipeptidos inmunogenicos derivados de moraxella catarrhalis y uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2306668T3
Application number: ES00956339T
Authority: ES
Inventors: Joelle GlaxoSmithKline Biologicals s.a. THONNARD
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: CA2380515A1; DE60039303D1; GB9918003D0; EP1204752B1; WO2001009332A3; DK1204752T3; ATE399205T1; JP2003506043A; HK1047954A1; US20100075378A1; WO2001009332A2; AU6832300A; CN1378597A; EP1204752A2; PT1204752E; US7632516B1; CY1108554T1

Abstract

Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o b) un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº 2 que comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en que la actividad inmunogénica de dicho fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Polipéptidos inmunogénicos derivados de Moraxella catarrhalis y uso de los mismos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (en este documento mencionados como "polinucleótido(s) BASB115", polipéptidos codificados por ellos (mencionados en este documento como "BASB115" o "polipéptido(s) BASB115"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. La invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram-negativa frecuentemente aislada del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías siendo las principales otitis media en bebés y niños, y neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante de la niñez tanto por la cantidad de casos como sus secuelas potenciales. Se registran más de 3,5 millones de casos cada año en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños ha experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 (Klein, JO (1994) Clin. lnf. Dis 19:823). Dejada sin tratar, o llegando a ser crónica, la enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el caso de acumulación de fluido en el oído medio) o permanentes (si el nervio auditivo está dañado). En bebés, dichas pérdidas de audición pueden ser responsables de un aprendizaje retardado del lenguaje.

Tres especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 al 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambas aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Otras bacterias podrían aislarse del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes etc.) pero a una frecuencia muy inferior (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un pre-requisito absoluto para el desarrollo de una otitis; otros, sin embargo, también se requieren para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J. Infect. Dis. 158: 205, Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Estos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias en el oído medio mediante los tubos de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la fecha. Se ha postulado que una anormalidad transitoria del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, podría causar una incapacidad de controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col. (1994) J. Infect Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente llegan a ser susceptibles al desarrollo de otitis media a causa de la presencia sostenida de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está mal caracterizada. El análisis de capas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés después de 0 a 2 años de edad, indica que obtienen y elimina frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que se monta una respuesta inmune eficaz contra estas bacterias por los niños colonizados (Faden, H Letal (1994) J. Infect Dis. 169:1312).

En la mayoría de los adultos ensayados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col. (1985) J. Infect Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad de resistir la actividad bactericida sérica: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que los de los que simplemente están colonizados (Hoi, C y col. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. SA): 28S). La resistencia sérica podría, por lo tanto, considerarse como un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños que se recuperan de otitis media.

Los antígenos a los que están dirigidas estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos no se han identificado, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que se reconoce por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect. lmmun. 63:1516), y de UspA y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. lmmun. 67:1310).

Se han caracterizado unas pocas proteínas de membrana diferentes presentes en la superficie de M. catarrhalis usando métodos bioquímicos, o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para una revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos producidos contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está altamente conservado entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado que es eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis se ha elevado drásticamente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a aparición de cepas resistentes a múltiples fármacos y una población creciente de gente con sistemas inmunes debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas de Moraxella catarrhalis que sean resistentes a algunos o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica insatisfecha y la demanda de nuevos agentes anti-microbianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y ensayos de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB115, en particular polipéptidos BASB115 y polinucleótidos BASB115, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. La invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. Se describen ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones asociadas con dichas infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB115.

Descripción

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº 2 que comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en que la actividad inmunogénica de dicho fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.

Los polipéptidos y polinucleótidos BASB115 se describen con mayor detalle a continuación. En particular, la invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos y polinucleótidos de BASB115 de Moraxella catarrhalis, que está relacionada por la homología de la secuencia de aminoácidos con una supuesta proteína periplásmica de E. coli. Se predice que es una lipoproteína porque tiene una secuencia señal característica de lipoproteína. La invención se refiere a BASB115 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en la Lista de Secuencias a continuación como "ADN" representan una ejemplificación de una secuencia de una realización de la invención, ya que los especialistas en la técnica reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse de forma útil en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

La invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos de Moraxella catarrhalis mencionados en este documento como "BASB115" y "polipéptidos BASB115" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos.

Las composiciones pueden comprender:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta, con el de la SEC ID Nº 2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta con la SEC ID Nº 1 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 1; o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

Los polipéptidos BASB115 proporcionados en la SEC ID Nº 2 son el polipéptido BASB115 de Moraxella catarrhalis cepa MC2931 (ATCC 43617).

La composición puede comprender un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB115, es decir, una parte contigua del polipéptido BASB115 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2; es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB115. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB115 que carece de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En una realización preferida el fragmento inmunogénico de BASB115 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99%, con el de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente igual que parte pero no toda de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de cualquier polipéptido útil en la invención. Como con polipéptidos BASB115, los fragmentos pueden ser "independientes" o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del que forman una parte o región, más preferiblemente en forma de una única región continua en un único polipéptido más grande.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una parte de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o de una variante de la misma, tal como una serie continua de restos que incluyen una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo-terminal. También se prefieren formas de degradación de los polipéptidos útiles en la invención producidas por o en una célula huésped. Se prefieren adicionalmente fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprende regiones de alfa-hélice y formadoras de alfa-hélice, regiones de lámina-beta y formadoras de lámina-beta, regiones de giros y formadoras de giros, regiones de espiral y formadoras de espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, región de unión a sustrato, y regiones de elevado índice antigénico.

Los fragmentos para su uso en la invención incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2. Se prefieren adicionalmente fragmentos que incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

Los fragmentos de los polipéptidos útiles en la invención pueden emplearse para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa por síntesis peptídica; por lo tanto, estos fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa útiles en la invención.

Son particularmente preferidas variantes en las que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos están sustituidos, delecionados, o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, útiles en la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína más grande tal como una proteína precursora o de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líder, pro-secuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como restos de múltiples histidinas, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de un polipéptido exógeno o cola lipídica o secuencias polinucleotídicas para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En una realización la invención se refieren proteínas de fusión solubles modificadas genéticamente que comprende un polipéptido útil en la presente invención, o un fragmento de las mismas, y diversas partes de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pasada de IgG humana, particularmente IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede retirarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor Xa de coagulación sanguínea.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para selección de fármacos, diagnóstico y terapia. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94122914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes que permiten que se produzcan niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con una proteína no fusionada. El compañero de fusión puede ayudar a proporcionar epítopes auxiliares T (compañero de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes auxiliares T reconocidos por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (potenciador de la expresión) a rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente el compañero de fusión será tanto un compañero de fusión inmunológica como compañero potenciador de la expresión.

Los compañeros de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructura del virus de la influenza virus, NS1 (hemaglutinina). Otro compañero de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la parte C terminal de la molécula. Lyta se obtiene de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272}) una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LytA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Es posible usar la parte repetida de la molécula LytA encontrada en el extremo C terminal que comienza en el resto 178, por ejemplo los restos 188 - 305.

La presente invención también puede comprender polipéptidos que son variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, que son polipéptidos que varían de los referentes por sustituciones aminoacídicas conservativas, por las que un resto se sustituye con otro con características similares. Dichas sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu y Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos Lys y Arg; o los restos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos útiles en la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética, o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar dichos polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Es más preferido que un polipéptido útil en la invención se obtenga de Moraxella catarrhalis,sin embargo, puede obtenerse preferiblemente de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido útil en la invención también puede obtenerse, por ejemplo, de organismos de la misma familia taxonómica u orden.

Polinucleótidos

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº 2 que comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en que la actividad inmunogénica de dicho fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB115 que comprende una secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1 que incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.

El polinucleótido BASB115 proporcionado en la SEC ID Nº 1 es el polinucleótido BASB115 de Moraxella catarrhalis cepa MC2931 (ATCC 43617).

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o que expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB115, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB115 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN de ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN B y Z. Realizaciones adicionales de la invención pueden incluir composiciones que comprenden polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos.

Los polinucleótidos aislados pueden incluir al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB115 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº 2 y polinucleótidos estrechamente relacionados con la misma y variantes de los mismos.

En otra realización particularmente preferida de la invención hay un polipéptido BASB115 de Moraxella catarrhalis que comprende o que consta de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o una variante del mismo.

Usando la información proporcionada en este documento, dicha secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 1, puede obtenerse un polinucleótido útil en la invención que codifica el polipéptido BASB115 usando procedimientos de clonación y exploración convencionales, tales como aquellos para la clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células Catlin de Moraxella catarrhalis como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica útil en la invención, tal como una secuencia polinucleotídica dada en la SEC ID Nº 1, típicamente se sonde una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Catlin de Moraxella catarrhalis en E. coli o algún otro huésped adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente un de 17 unidades o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que transportan ADN idéntico al de la sonta después pueden distinguirse usando condiciones de hibridación rigurosas. Secuenciando clones individuales por tanto identificados por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir del polipéptido original o la secuencia polinucleotídica después es posible extender la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para determinar una secuencia génica de longitud completa. Convenientemente, dicha secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de un clon plasmídico. Se describen técnicas adecuadas por Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL., 2a Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (Véase en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). También puede realizarse secuenciación directa del ADN genómico para obtener una secuencia génica de longitud completa. Es ilustrativo de un polinucleótido útil en la invención, el polinucleótido expuesto en la SEC ID Nº 1 que se descubrió en una biblioteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, la secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº 1 contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente la cantidad de restos aminoacídicos expuestos en la SEC ID Nº 2 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de peso molecular de los restos aminoacídicos bien conocidos para los especialistas en la técnica.

El polinucleótido de la SEC ID Nº 1, entre el codón Inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 598 de la SEC ID Nº 1, codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

El polinucleótido aislado puede comprender o constar de:

(a) una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta con la SEC ID Nº 1 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 1; o

(b) una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o 100% exacta, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido útil en la presente invención, que incluye homólogos y ortólogos de especies diferentes a Moraxella catarrhalis,puede obtenerse por un procedimiento que comprende las etapas de exploración de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS del 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que consta de o que comprende la secuencia de la SEC ID Nº o un fragmento de la misma; y aislamiento de un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica.

La secuencia polinucleotídica puede ser idéntica sobre su longitud completa a una secuencia codificante (fase de lectura abierta) en la SEC ID Nº 1. Además, la secuencia polinucleotídica puede ser una secuencia codificante de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo por sí mismos así como una secuencia codificante de un polipéptido maduro o un fragmento en fase de lectura con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia pre-, o pro- o prepro-proteica. El polinucleótido útil en la invención también puede contener al menos una secuencia no codificante, incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitación, al menos una secuencia 5' y 3' no codificante, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tal como señales de terminación rho-dependientes y rho-independientes), sitios de unión al ribosoma, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia polinucleotídica también puede comprender una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En una secuencia de ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad Sci., USA 86: 821-824 (1989), o un cola peptídico HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), que pueden ser útiles ambas para purificar la secuencia polipeptídica fusionada a los mismos. Los polinucleótidos útiles en la invención también incluyen, aunque sin limitación, polinucleótidos que comprende un gen estructural y sus secuencias asociadas de forma natural que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB115 de la SEC ID Nº 2 puede ser idéntica al polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 a 597 de la SEC ID Nº 1. Como alternativa, puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en este documento abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido útil en la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de BASB115 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o discontinua que codifica el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, un secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada, o debido al editado del ARN o la reorganización del ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

La invención se refiere adicionalmente a variantes de los polinucleótidos descritos en este documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº 2. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos útiles en la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa útiles en la invención.

Realizaciones particularmente preferidas adicionales pueden comprender polinucleótidos que codifican variantes de BASB115, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB115 de la SEC ID Nº 2 en que varios, unos pocos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, o ningún resto aminoacídico está sustituido, modificado, delecionado y/o añadido, en cualquier combinación. Son especialmente preferidos entre éstos sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB115.

Realizaciones preferidas adicionales de la invención pueden comprender polinucleótidos que son al menos un 85% idénticas sobre su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB115 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2, y polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Como alternativa, son muchos más preferidos polinucleótidos que comprenden una región que es al menos un 90% idéntica sobre su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB115 y polinucleótidos complementarios al mismo. A este respecto, son particularmente preferidos polinucleótidos al menos un 95% idénticos sobre su longitud completa al mismo. Además, aquellos con al menos el 97% son altamente preferidos entre aquellos con al menos el 95%, y entre aquellos con al menos el 98% y al menos el 99% son particularmente muy preferidos, siendo con al menos el 99% los más preferidos.

Realizaciones preferidas pueden comprender polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEC ID Nº 1.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de esta invención pueden proporcionarse polinucleótidos que hibridan, particularmente en condiciones rigurosas, con secuencias polinucleotídicas de BASB115, tales como los polinucleótidos de la SEC ID Nº 1.

La invención se refiere adicionalmente a polinucleótidos que hibridan con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en este documento. A este respecto, la invención especialmente se refiere a polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos en este documento. Como se usa en este documento, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significan hibridación que sucede solamente si hay al menos un 95% y preferiblemente al menos un 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado, desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente el Capítulo 11 en el mismo. La hibridación en solución también puede usarse con las secuencias polinucleotídicas útiles en la invención.

La invención también puede comprender un polinucleótido que consta de o que comprende una secuencia polinucleotídica obtenida por exploración de una biblioteca adecuada que contiene el gen completo para una secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 1 en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 1 o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores completamente descritos en otra parte en este documento.

Como se analiza en otra parte en este documento con respecto a ensayos polinucleotídicos, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, pueden usarse como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB115 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen elevada identidad, particularmente elevada identidad de secuencia, con el gen BASB115. Dichas sondas generalmente comprenderán al menos 15 restos nucleotídicos o pares de bases. Preferiblemente, dichas sondas tendrán al menos 30 restos nucleotídicos o pares de bases y pueden tener al menos 50 restos nucleotídicos o pares de bases.

Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 restos nucleotídicos o pares de bases y tendrán menos de 30 restos nucleotídicos o pares de bases.

Una región codificante de un gen BASB115 puede aislarse por exploración usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEC ID Nº 1 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Después se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención para explorar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar qué miembros de la biblioteca hibridan con la sonda.

Hay varios procedimientos disponibles y bien conocidos para los especialistas en la técnica para obtener ADN de longitud completa, o ADN de corta extensión, por ejemplo los basados en el procedimiento de Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon^{TM}, se han preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada en cada extremo. Después se realiza amplificación del ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "perdido" del ADN usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen y específicos de adaptador. La reacción de PCR después se repite usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridar dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico de adaptador que hibrida adicionalmente 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que hibrida adicionalmente 5' en la secuencia génica seleccionada). Los productos de esta reacción después pueden analizarse por secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o realizando una reacción de PCR de longitud completa diferente usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos útiles en la invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para el descubrimientos de tratamientos de y agentes de diagnóstico para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se analiza adicionalmente en este documento con relación a ensayos polinucleotídicos.

Los polinucleótidos útiles en la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEC ID Nº 1 pueden usarse en los procedimientos de este documento que como se describen, pero preferiblemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en este documento por completo o en parte se transcriben o no en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que dichas secuencias tendrán también utilidad en el diagnóstico de la fase de la infección y el tipo de infección que el patógeno ha obtenido.

La invención también puede comprender polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos amino o carboxilo-terminales adicionales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Dichas secuencias pueden desempeñar una tarea en el procesamiento de una proteína a partir del precursor en una forma madura, pueden permitir el transporte de proteínas, pueden alargar o acortar la semi-vida de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden retirarse por procesamiento de la proteína madura por enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos útiles en la invención se proporciona un polinucleótido complementario al mismo. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean completamente complementarios a cada polinucleótido con el que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se retiran las prosecuencias dichos precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias pueden retirarse antes de la activación. Generalmente, dichos precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones A, G, C, T/U convencionales para los nucleótidos, también se puede usar el término "N" para describir ciertos polinucleótidos útiles en la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatros nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en dicha posición indicada en la secuencia de ADN o ARN, excepto si se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma junto con posiciones nucleotídicas adyacentes, cuando se leen en la fase de lectura correcta, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematura en dicha fase de lectura.

En resumen, un polinucleótido útil en la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede mencionarse como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se retiran durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido del segundo aspecto de la presente invención en la preparación de un medicamento para su uso para generar una respuesta inmune en un animal.

Por tanto, de acuerdo con la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención en la preparación de un medicamento para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido en inmunización genética preferiblemente empleará un procedimiento de suministro adecuado tal como inyección directa de ADN plasmídico en músculos (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), suministro de ADN en complejo con vehículos proteicos específicos (Wu y col., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato cálcico (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo con partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81: 5849).

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para fabricar una composición de vacuna que comprende las etapas de preparar células huésped que comprende un polinucleótido recombinante del segundo aspecto de la presente invención, o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula huésped, que expresa un polipéptido recombinante a partir de dicho polinucleótido, y formular dicho polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Vectores, Células Huésped, Sistemas de Expresión

Se describen vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos útiles en la invención, células huésped que están modificadas genéricamente con vectores y la producción de polipéptidos útiles en la invención por técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir dichas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN útiles en la invención.

Los polipéptidos recombinantes útiles en la presente invención pueden prepararse por procedimientos bien conocidos para los especialistas en la técnica a partir de células huésped modificadas genéticamente que comprende sistemas de expresión. Por consiguiente, se describen sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos útiles en la presente invención, células huésped que están modificadas genéticamente con dichos sistemas de expresión, y la producción de polipéptidos útiles en la invención por técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos útiles en la invención, las células huésped se pueden modificar genéricamente para incorporar sistemas de expresión o partes de los mismos o polinucleótidos útiles en la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede realizarse por procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed., Cold Spring Harbor. Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tal como, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspados, introducción balística e infección.

Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilocos, enterococos, E. coli, streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomicete, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Puede usarse una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos útiles en la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela del pollo, virus de la pseudos-rabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como las derivadas de elementos genéticos plasmídicos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión por cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en la luz del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos útiles en la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía de afinidad a iones metálicos (IMAC) para la purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, aislamiento y o purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno y la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este propósito son, por ejemplo: poxvirus (por ejemplo; vaccinia, viruela del pollo, viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, Virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adeno-asociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus varicella zoster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o estar atenuados de diversos modos para obtener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas también pueden formar parte de la invención.

Ensayos de Diagnóstico, Pronóstico, Serotipado y Mutación

Se describe el uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB115 útiles en la invención para su uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB115 en eucariotas, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, la fase de una enfermedad o la respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Los eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente aquellos infectados o que se sospecha que están infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB115, puede detectarse a nivel de ácido nucleico o aminoácidos por una diversidad de técnicas bien conocidas así como por procedimientos proporcionados en este documento.

Los polipéptidos y polinucleótidos para el pronóstico, diagnóstico u otros análisis pueden obtenerse a partir de un material corporal de un individuo supuestamente infectado y/o infectado. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, pueden usarse directamente para la detección o pueden amplificarse enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. También puede usarse ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico de los mismos modos. Usando amplificación, puede hacerse la caracterización de la especie y cepa del organismo infeccioso o residente presente en un individuo, por un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo seleccionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Pueden identificarse mutaciones puntuales hibridando ADN amplificado a secuencias polinucleotídicas BASB115 marcadas. Pueden distinguirse secuencias perfecta o significativamente coincidentes a partir de dúplex imperfectamente o más significativamente desapareados por digestión con DNasa o RNasa, para ADN o ARN respectivamente, o detectando diferencias en las temperaturas de fusión o la cinética de renaturalización. También pueden detectarse diferencias en secuencias polinucleotídicas por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos polinucleotídicos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede realizarse con o sin agentes desnaturalizantes. También pueden detectarse diferencias polinucleotídicas por secuenciación directa de ADN o ARN. Véase, por ejemplo, Myers y col. Science, 230: 1242 (1985). También pueden revelarse cambios de secuencia en localizaciones específicas por ensayos de protección con nucleasa, tal como RNasa, ensayo de protección V1 y S 1 p un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad Sci., USA, 85: 4397-401 (1985).

Se describe una serie de sondas oligonucleotídicas que comprenden la secuencia de nucleótidos de BASB115 o fragmentos de la misma que puede construirse para realizar una selección eficaz de; por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología de series son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y pueden usarse para abordar una diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610(1996)).

Se describe un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido útil en la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1, o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido útil en la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de la misma; o

(d) un anticuerpo contra un polipéptido útil en la presente invención, preferiblemente contra el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

Se apreciará que en dicho kit cualquiera de (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Dicho kit será de uso para diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otras cosas.

Se describe el uso de polinucleótidos útiles en la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido útil en la invención, preferiblemente, la SEC ID Nº 1, que está asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede ayudar a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de un transcurso de enfermedad, una determinación de una fase de enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, que sea el resultado de la infra-expresión, sobre-expresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en dicho polinucleótido pueden detectarse a nivel de polinucleótido por una diversidad de técnicas, tales como las descritas en otra parte en este documento.

También pueden detectarse células de un organismo que lleva mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido útil en la invención a nivel de polinucleótido o polipéptido por una diversidad de técnicas, para permitir el serotipado, por ejemplo. Por ejemplo, puede usarse RT-PCR para detectar butacones en el ARN. Es particularmente preferido usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizados, tales como, por ejemplo, GeneS-can. También puede usarse ARN, ADNc o ADN genómico para el mismo propósito, PCR. Como un ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB115 para identificar y analizar mutaciones.

Se describen cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos retirados del extremo 5' y/o el 3'. Estos cebadores pueden usarse para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASB115 aislado de una muestra obtenida de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de modo que el polinucleótido después pueda someterse a diversas técnicas para dilucidar la secuencia polinucleotídica. De este modo, pueden detectarse mutaciones en la secuencia polinucleotídica y usarse para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o transcurso, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

Se describe un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de la SEC ID Nº 1. La expresión aumentada o disminuida de un polinucleótido BASB115 puede medirse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de RNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, se describe un ensayo de diagnóstico para detectar la sobre-expresión del polipéptido BASB115 en comparación con muestras de tejido de control normal que puede usarse para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un polipéptido BASB115, en una muestra obtenida de un huésped, tal como un material corporal, son bien conocidas para los especialistas en la técnica. Dichos procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos tipo sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos útiles en la invención también pueden usarse como componentes de series de polinucleótidos, preferiblemente series o rejillas de elevada densidad. Estas series de elevada densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, puede usarse una serie de aplicaciones puntuales que contienen cada una un gen diferente, y que comprenden adicionalmente un polinucleótido o polinucleótidos útiles en la invención, para sondear, tal como usando hibridación o amplificación de ácido nucleico, usando sondas obtenidas o derivadas de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia polinucleotídica particular o secuencia relacionada en un individuo. Dicha presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o un transcurso de enfermedad. Se prefiere una rejilla que comprende varias variantes de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº 1. También se prefiere una rejilla que comprende varias variantes de una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº 2.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos útiles en la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para dichos polipéptidos o polinucleótidos respectivamente. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen afinidad sustancialmente mayor por los polipéptidos útiles en la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior.

De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona una composición terapéutica útil para tratar seres humanos con enfermedad por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo directamente contra el polipéptido del primer aspecto de la presente invención y un vehículo farmacéutico adecuado.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB115.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos útiles en la invención pueden obtenerse administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos útiles en la invención, o fragmentos que albergan el epítope de cualquier o ambos, análogos de cualquier o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como aquellas en Kohler, G. y Milstein, C, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pág. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla contra polipéptidos o polinucleótidos útiles en esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos útiles en la invención.

Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de presentación de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido útil en la invención a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por poseer anti-BASB115 o de bibliotecas sin tratamiento previo (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también puede mejorarse,

\hbox{por ejemplo, por arrastre de cadena
(Clackson y  col., (1991) Nature 352: 628).}

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos útiles en la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos por, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Por tanto, entre otros, los anticuerpos contra el polipéptido BASB115 o polinucleótido BASB115 pueden emplearse para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes polipeptídicas incluyen variantes antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalentes que son útiles en esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo está modificado para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano el anticuerpo puede estar muy preferiblemente "humanizado", donde la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se ha traducido en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se describe en Jones y col. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y Agonistas - Ensayos y Moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos útiles en la invención también se pueden usar para evaluar la unión de sustratos y ligandos de molécula pequeña en, por ejemplo, células, preparaciones sin células, bibliotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1(2), Capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de exploración pueden simplemente medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que albergan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido mediante un marcador directamente o indirectamente asociado con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de exploración puede implicar la competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de exploración pueden ensayar si el compuesto candidato produce una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de la activación generalmente se ensayan en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista por la presencia del compuesto candidato. Puede usarse un polipéptido constitutivamente activo y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados para procedimientos de exploración para agonistas o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato provoca la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de exploración pueden simplemente comprender las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido útil en la presente invención, para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB115 en la mezcla, y comparar la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB115 de la mezcla con un patrón. También pueden usarse proteínas de fusión, tales como las preparadas a partir de la parte Fc y el polipéptido BASB115, como se ha descrito anteriormente en este documento, para ensayos de exploración de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido útil en la presente invención, así como de polipéptidos filogenética y y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471
(1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido útil en la presente invención también pueden usarse para configurar procedimientos de exploración para detectar el efecto de los compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir los niveles secretados y asociados a células de polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales por procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados.

También se describe un procedimiento para seleccionar compuestos para identificar aquellos que potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB115, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción mixta, un compartimiento celular, tal como una membrana, envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de ellos, que comprende polipéptido BASB115 y un sustrato o ligando marcado de dicho polipéptido en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB115. La capacidad de la molécula candidata de agonizar o antagonizar el polipéptido BASB115 se refleja en la unión disminuida del ligando marcado o la producción disminuida del producto a partir de dichos sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB115 tienen que ser muy probablemente buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, como puede ser el caso, aumentan la velocidad de la producción de producto a partir del sustrato, aumentan la transducción de señales, o aumentan la actividad de los canales químicos son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como puede ser el caso, la producción de producto a partir del sustrato, la transducción de señales, o la actividad de canales químicos puede potenciarse usando un sistema informador. Los sistemas informadores que pueden usarse a este respecto incluyen, aunque sin limitación, ensayos colorimétricos, sustrato marcado convertido en producto, un gen informador que sea sensible a cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB115, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de BASB115 es un ensayo competitivo que combina BASB115 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB115, moléculas de unión a BASB115 recombinante, sustratos o ligandos naturales, o miméticos de sustrato o ligando, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB115 puede marcarse, tal como por radiactividad o un compuesto colorimétrico, de modo que pueda determinarse la cantidad de moléculas BASB115 unidas a una molécula de unión o convertirse en producto de forma precisa para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido útil en la invención y de este modo inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína estrechamente relacionada o anticuerpo que se una a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB115, evitando de este modo la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB115 excluyendo polipéptidos y/o polinucleótidos BASB115 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se una a y ocupe el sitio de unión del polipéptido evitando de este modo la unión a moléculas de unión celulares, de modo que se evite la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, aunque sin limitación, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB115.

En una realización adicional, la invención emplea proteínas de fusión solubles modificadas genéticamente que comprenden un polipéptido útil en la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas partes de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede retirarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor Xa de coagulación sanguínea. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para selección de fármacos, diagnóstico y terapia. Una realización adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en este documento pueden usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, después de la expresión, puede usarse como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. Además, las secuencias polinucleotídicas que codifican las regiones amino terminales de la proteína codificada o la secuencia Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo pueden usarse para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, o describe un agonista o antagonista para impedir la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un huésped eucariota, preferiblemente mamífero, responsable de la secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de matriz extracelular de eucariotas, preferiblemente mamífero, en dispositivos intravasculares o a proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular de eucariotas, preferiblemente mamífero, y proteínas BASB115 bacterianas que median el daño tisular y/o; para bloquear el progreso normal de la patogénesis en infecciones iniciadas de forma diferente al implante de dispositivos intravasculares o por otras técnicas
quirúrgicas.

Se describe la provisión de agonistas y antagonistas de BASB115, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a mimótopos del polipéptido útil en la invención. Un mimótopo es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que es capaz de reconocerse por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de producir anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimótopos peptídicos pueden diseñarse para un propósito particular por adición, deleción o sustitución de aminoácidos elegidos. Por tanto, los péptidos pueden modificarse para los propósitos de facilidad de conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable para péptidos conjugados con un vehículo proteico que incluyan un extremo hidrófobo distal del extremo conjugado del péptido, de modo que el extremo no conjugado libre del péptido permanezca asociado con la superficie de la proteína vehículo. Presentando de este modo el péptido en una conformación que se parece lo más posible a la del péptido encontrado en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, puede realizarse la adición o sustitución de una forma de D-estereoisómero de uno o más se los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del
péptido.

Como alternativa, pueden identificarse mimótopos peptídicos usando anticuerpos que son capaces ellos mismos de unirse a los polipéptidos útiles en la presente invención usando técnicas tales como tecnología de presentación de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera una gran cantidad de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos anti-péptido nativo, pero puede que no necesariamente compartan por sí mismos homología de secuencia significativa con el polipéptido
nativo.

Vacunas

Otra realización de la invención se refiere al uso de un polinucleótido y/o polipéptido BASB115, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T para proteger a dicho individuo de infección, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, donde dicha inducción comprende inocular al individuo. Dicho uso puede ser de un polinucleótido y/o polipéptido BASB115, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T para proteger a dicho individuo de infección, particularmente infección bacteriana y más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan usos de un polinucleótido y/o polipéptido BASB115, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T para proteger a dicho individuo de infección, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunológica que ralentice la replicación bacteriana. Otra realización más de la invención se refiere al uso de un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para dirigir la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido BASB115, o un fragmento o una variante del mismo, para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB115, o un fragmento o una variante del mismo, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, donde dicha inducción comprende el suministro a dicho individuo in vivo para inducir una respuesta inmunológica, tal como, para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citoquinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de enfermedad, esté esa enfermedad ya establecida en el individuo o no. Un ejemplo de suministro es administrar el gen acelerándolo en las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otro modo. Dicho vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido ADN/ARN, un complejo ADN-proteína o un complejo ARN-proteína.

De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido del primer aspecto de la presente invención en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de haber inducido en el mismo una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en dicho individuo contra un polinucleótido y/o polipéptido BASB115 codificado por el mismo, donde la composición comprender un polinucleótido recombinante y/o polipéptido BASB115 codificado por el mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB115, polipéptido codificado por el mismo, u otro polipéptido útil en la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede adoptar la forma de inmunidad de anticuerpos y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células T CTL o CD4+.

Las composiciones de vacuna de acuerdo con la presente invención pueden comprender al menos un antígeno de Moraxella catarrhalis diferente.

Un polipéptido BASB115 o un fragmento del mismo puede fusionarse con una co-proteína o resto químico que por sí mismo puede o no producir anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. La proteína recombinante fusionada de este modo, preferiblemente comprende adicionalmente una co-proteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra co-proteína relativamente grande que solubilice la proteína y facilite la producción y purificación de la misma. Además, la co-proteína puede funcionar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La co-proteína puede estar unida a cualquiera del extremo amino o carboxi de la primera proteína.

En una composición de vacuna de acuerdo con la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB115, o un fragmento, o un mimótopo, o una variante del mismo puede estar presente en un vector, tal como los vectores recombinantes vivos descritos anteriormente, por ejemplo, vectores bacterianos vivos.

También son adecuados vectores no vivos para el polipéptido BASB115, por ejemplo, vesículas de membrana externa bacteriana o "ampollas".

De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona una vesícula de membrana externa bacteriana que se puede obtener de una célula huésped que comprende un vector de ácido nucleico que comprende un polinucleótido del segundo aspecto de la presente invención que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo, donde el polipéptido se expresa en la membrana externa.

De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende la vesícula de membrana externa bacteriana del séptimo aspecto de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las ampollas de ME se obtienen de la membrana externa de la membrana de dos capas de bacterias Gram-negativas y se han documento en muchas bacterias Gram-negativas (Zhou, L y col. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163:223-228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que se ha informado que producen ampollas también incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

Las ampollas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de membrana externa en su conformación nativa y son por tanto particularmente útiles para vacunas. Las ampollas también pueden mejorarse para uso en vacunas modificando la bacteria para modificar la expresión de una o más moléculas de la membrana externa. Por tanto, por ejemplo, la expresión de una proteína inmunogénica deseada en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB115, puede introducirse o regularse positivamente (por ejemplo, alterando el promotor). En lugar de o además de, la expresión de moléculas de membrana externa que no son relevantes (por ejemplo, antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o son nocivas (por ejemplo, moléculas tóxicas tales como LPS, o inductores potenciales de una respuesta autoinmune) pueden regularse negativamente. Estos enfoques se analizan con mayor detalle a
continuación.

Las regiones flanqueantes no codificantes del gen BASB115 contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como traduccional. La secuencia de estas regiones, cadena arriba o cadena abajo de la fase de lectura abierta del gen, puede obtenerse por secuenciación de ADN. Esta información de secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tales como los diferentes elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de secuencia inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia shine-dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicada en la regulación, así como otros tipos de motivos o secuencias reguladoras. La invención puede comprender esta secuencia.

Esta información de secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen BASB115. La regulación positiva de la expresión génica puede conseguirse alterando el promotor, la secuencia shine-dalgarno, elementos represores u operadores potenciales, o cualquier otro elemento implicado. Asimismo, la regulación negativa de la expresión puede conseguirse por tipos similares de modificación. Como alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen puede ponerse bajo el control de variación de fase, o puede desacoplarse de esta regulación, en otro enfoque, la expresión del gen puede ponerse bajo el control de uno o más elementos inducibles que permite la expresión regulada. Ejemplos de dicha regulación incluyen, aunque sin limitación, inducción por cambio de temperatura, adición de sustratos inductores como carbohidratos seleccionados o sus derivados, elementos traza, vitaminas, co-factores, iones metálicos, etc.

Dichas modificaciones que se han descrito anteriormente pueden introducirse por varios medios diferentes. La modificación de secuencias implicadas en la expresión génica puede realizarse in vivo por mutagénesis aleatoria seguida de selección del fenotipo deseado. Otro procedimiento consiste en aislar la región de interés y modificarla por mutagénesis aleatoria, o reemplazo dirigido al sitio, mutagénesis por inserción o deleción. La región modificada después puede reintroducirse en el genoma bacteriano por recombinación homóloga, y puede evaluarse el efecto de la expresión génica. En otro enfoque, el conocimiento de la secuencia de la región de interés puede usarse para remplazar o delecionar todo o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora diana se aísla y modifica para que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o para delecionar partes seleccionadas de las secuencias reguladoras de tipo silvestre. Estas secuencias modificadas después pueden reintroducirse en la bacteria mediante recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos que podrían usarse para la regulación positiva de la expresión génica incluye los promotores porA, porB, IbpB, tbpB, p110, 1st, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, IbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M. Catarrhalis, p1, p2, p4, p5, p6, IpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen puede modularse intercambiando su promotor con un promotor más fuerte (a través del aislamiento de la secuencia cadena arriba del gen, modificación in vitro de esta secuencia, y reintroducción en el genoma por recombinación homóloga). La expresión regulada positivamente puede obtenerse tanto en bacterias como en las vesículas de membrana externa desprendidas (o fabricadas) por la bacteria.

En otros ejemplos, los enfoques descritos pueden usarse para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacuna. Éstas pueden ser, aunque sin limitación, cepas atenuadas, cepas con expresión aumentada de antígenos seleccionados, cepas con knock-outs (o expresión disminuida) de genes interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con desprendimiento modulado de vesículas de membrana externa.

Por tanto, la invención puede incluir una región cadena arriba modificada del gen BASB115, conteniendo dicha región cadena arriba modificada un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína BASB115 localizada en la membrana externa. La región cadena arriba de acuerdo con esta realización de la invención incluye la secuencia cadena arriba del gen BASB115. La región cadena arriba comienza inmediatamente cadena arriba del gen BASB115 y continua habitualmente hasta una posición no más de aproximadamente 1000 pb cadena arriba del gen desde el codón de inicio ATG. En el caso de un gen localizado en una secuencia policistrónica (operón) la región cadena arriba puede comenzar inmediatamente precediendo el gen de interés, o precediendo el primer gen del operón. Preferiblemente, una región cadena arriba modificada de acuerdo con este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pb cadena arriba del ATG.

Por tanto, la invención proporciona un polipéptido BASB115, en una ampolla bacteriana modificada. Se describen células huésped modificadas capaces de producir los vectores de ampolla basados en membrana no vivos, y vectores de ácido nucleico que comprenden el gen BASB115 que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

Además, se describen procedimientos para preparar las células huésped y ampollas bacterianas de acuerdo con la invención.

Además, en esta invención se proporcionan composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. y col. Science 273: 352 (1996).

Además, se describen procedimientos para usar el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que han demostrado codificar regiones no variables de proteínas de superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótido usadas en dichos experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Dichos experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopes proteicos capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este procedimiento permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano necesario del animal que resiste exitosamente o elimina la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como los polipéptidos y polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que vuelven la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, de los individuos; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en un estado secado por congelación que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema adyuvante provoca preferentemente un tipo TH1 de respuesta.

Una respuesta inmune puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, que sin respuestas inmunes humorales o mediadas por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos de protección de anticuerpos y de efectores celulares respectivamente). Estas categorías de respuesta se han llamado respuestas tipo TH1 (respuesta mediada por células), y respuestas inmunes tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes tipo TH1 extremas pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos de haplotipo restringido específicos de antígeno, y respuestas de células asesinas naturales. En ratones las respuestas tipo TH1 a menudo se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, aunque en el ser humano estos corresponden a anticuerpos tipo IgG1. Las respuestas inmunes tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en ratones IgG1, IgA, e IgM.

Puede considerarse que la fuerza directriz detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citoquinas. Elevados niveles de citoquinas tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células contra el antígeno dado, mientras que elevados niveles de citoquinas tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales contra el antígeno.

La distinción de respuestas inmunes tipo TH 1 y TH2 no es absoluta. En realizada un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de lo descrito en clones de células T CD4 +va murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, RL (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo TH1 están asociadas con la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas a menudo directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunes tipo TH1 no se producen por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluyen la medición directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de reestimulación con antígeno, y/o la medición de la proporción IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpos específicas de antígeno.

Por tanto, un adyuvante tipo TH1 es un que estimula preferentemente poblaciones de células T aisladas para producir elevados niveles de citoquinas tipo TH1 cuando se re-estimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con el isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de una estimulación preferente de la respuesta de células TH1 se describen en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL) es uno de dichos adyuvantes. Se conoce del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado se describe en la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse a esterilidad a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Patente Europea número 0 689 454).

3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 g - 100 g preferiblemente 25 - 50 g por dosis donde el antígeno típicamente estará presente en un intervalo de 2 - 50 g por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21; una fracción no tóxica purificada por Hplc derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente éste puede estar en mezcla con monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Previamente se han descrito formulaciones adyuvantes no reactogénicas que contienen QS21 (documento WO 96/33739). Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser adyuvantes estimuladores de TH satisfactorios cuando se formulan junto con un antígeno.

Adyuvantes adicionales que son estimuladores preferentes de la respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se describe en el documento WO
96/02555.

También se contemplan combinaciones de diferentes adyuvantes estimuladores de TH1, tales como los mencionados anteriormente en este documento, ya que proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferente de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La proporción de QS21: 3D-MPL típicamente será del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para la sinergia óptima es 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferiblemente también está presente un vehículo en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos de la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión. Además la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para administración a seres humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 g - 200 g, tal como 10 - 100 g, preferiblemente 10 g - 50 g por dosis. Típicamente la emulsión de aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10% de alfa tocoferol y del 0,3 al 3% de tween 80. Preferiblemente la proporción de escualeno:alfa tocoferol es igual a o menos de 1 ya que ésta proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención tengan adicionalmente un estabilizador.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno, un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/172 10.

La presente invención también proporciona una composición polivalente de vacuna que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Dicha composición polivalente de vacuna puede incluir un adyuvante inductor de TH-1 como se ha descrito anteriormente en este documento.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB115 y/o un polipéptido BASB115 para administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido analizados en este documento o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo de medios o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente. Dichos vehículos pueden incluir, aunque sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. Se describen adicionalmente paquetes y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones mencionadas anteriormente de la invención.

Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier modo eficaz, conveniente incluyendo, por ejemplo, administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como un profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, en forma de una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido útil en la presente invención, péptido o compuesto de molécula pequeña agonista o antagonista, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, aunque sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La invención se refiere adicionalmente a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones mencionadas anteriormente de la invención. Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos solo o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo por una vía sistémica o una vía oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente por inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para administración sistémica incluyen administración a través de la mucosa y transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o una formulación encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de pomadas balsámicas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para administración a mamíferos, y particularmente seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo sea de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación real que será más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso promedio. Puede haber, pos supuesto, casos individuales donde se merecen intervalos de dosificación mayores o inferiores, y éstas están dentro del alcance de esta invención.

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El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la afección del paciente, y el juicio del médico que está atendiendo. Las dosificaciones adecuadas, sin embargo, están en el intervalo de 0,1 - 100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es 0,5 - 5 microgramos/kg de antígeno, y dicha dosis se administra preferiblemente 1 - 3 veces y con un intervalo de 1 - 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que descartaría su administración a individuos adecuados.

Deben esperarse amplias variaciones en la dosificación necesaria, sin embargo, en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiriera dosificaciones mayores que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas convencionales para optimización, como se entenderá bien en la técnica.

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Bases de Datos de Secuencias, Secuencias en un Medio Tangible, y Algoritmos

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas forman una fuente de información valiosa con la que determinar sus estructuras 2- y 3-dimensional así como para identificar adicionalmente secuencias de homología similar. Estos enfoques están más fácilmente facilitados por el almacenamiento de la secuencia en un medio legible por ordenador y después usando los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como el paquete de programas
GCG.

Se describen procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas características, particularmente secuencias genéticas o secuencias proteicas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencia, determinación de la fase de lectura abierta, lectura automática de los nucleótidos del ácido nucleico, análisis del uso de codones, recorte de las bases del ácido nucleico, y análisis de picos de cromatogramas de secuencia-
ción.

Se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar homología.

También se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporciona una primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en a medio legible por ordenador; y comparar dicho primera secuencia polipeptídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar la homología.

Todas las publicaciones y referencias, incluyendo, aunque sin limitación, patentes y solicitudes de patente, citados en esta memoria descriptiva se incorporan en este documento por referencia en su totalidad como si cada publicación individual o referencia estuviera específica e individualmente indicada incorporada por referencia en este documento como completamente expuesta. Cualquier solicitud de patente a la que esta solicitud reivindica prioridad también se incorpora por referencia en este documento en su totalidad del modo descrito anteriormente para publicaciones y referencias.

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Definiciones

"Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como puede ser el caso, que se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso, que se determina por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo, aunque sin limitación, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles para el público. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)). La familia de programas BLAST está disponible al público de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col.,NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también puede usarse para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalización por Hueco: 8

Penalización por Longitud de Hueco: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible al público como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con ausencia de penalización para huecos finales).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: apareamientos = +10, desapareamientos = 0

Penalización por Hueco: 50

Penalización por Longitud de Hueco: 3

Disponible como: El programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Estos son los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporciona en (1) y (2) a continuación.

(1) Las realizaciones de polinucleótidos adicionalmente incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad de al menos el 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% con la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 1, donde dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de nucleótidos, y donde dichas alteraciones pueden suceder en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en otra parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia, y donde dicha cantidad de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando la cantidad total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando el producto de dicha cantidad total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1, o:

n_{n}\ \leq\ x_{n} - (x_{n}\ \cdot\ y),

donde n_{n} es la cantidad de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es la cantidad total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea a la baja al número entero más cercano antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido incorrecto de desplazamiento de fase en esta secuencia codificante y de este modo alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones. A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 1, es decir puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta una cierta cantidad de número enteros de alteraciones de ácido nucleico en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad sea menor del 100% de identidad. Dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de ácido nucleico, y donde dichas alteraciones pueden suceder en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia polinucleotídica de referencia o en otra parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. La cantidad de alteraciones del ácido nucleico para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando la cantidad total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando el producto de dicha cantidad total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº 1, o:

n_{n}\ \leq\ x_{n} - (x_{n}\ \cdot\ y),

donde n_{n} es la cantidad de alteraciones del ácido nucleico, x_{n} es la cantidad total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº 1, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea a la baja al número entero más cercano antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen adicionalmente un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% con una secuencia polipeptídica de referencia de la SEC ID Nº 2, donde dicha secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y donde dichas alteraciones pueden suceder en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o cualquier otra parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia, y donde dicha cantidad de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando la cantidad total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando el producto de dicha cantidad total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2, o:

n_{a}\ \leq\ x_{a} - (x_{a}\ \cdot\ y),

donde n_{a} es la cantidad de alteraciones de aminoácidos, x_{a}, es la cantidad total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea a la baja al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 2, es decir, puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad sea menor del 100% de identidad. Dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y donde dichas alteraciones pueden suceder en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en otra parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. La cantidad de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando la cantidad total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicha cantidad total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2, o:

n_{a}\ \leq\ x_{a} - (x_{a}\ \cdot\ y),

donde n_{a} es la cantidad de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es la cantidad total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea a la baja al número entero más cercado antes de restarlo de x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se usa en este documento con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, aunque sin limitación, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir,si sucede en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en este documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si aún está presente en dicho organismo, pudiendo estar dicho organismo vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado incluyendo regiones monocatenarias y bicatenarias.

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"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero que retiene las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia.

Cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Cambios de nucleótidos pueden provocar sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un resto aminoacídico sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que se sabe que es de origen natural. Pueden hacerse variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos por técnica de mutagénesis o por síntesis directa.

"Enfermedad(s)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en bebés y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño del nervio auditivo, aprendizaje retardado del lenguaje, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se realizan usando técnicas convencionales, que son bien conocidas y rutinarias para los especialistas en la técnica, excepto cuando se describe de otro modo con detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplo 1

Secuenciación de ADN del gen BASB115 de Moraxella catarrhalis cepa ATCC 43617

La secuencia de ADN del gen BASB115 de Moraxella catarrhalis cepa ATCC 43617 (también mencionada como cepa MC2931) se muestra en la SEC ID Nº 1. La traducción de la secuencia polinucleotídica de BASB115 se muestra en la SEC ID Nº 2.

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Ejemplo 2

Construcción del Plásmido para Expresar BASB115 Recombinante A: Clonación de BASB115

Los sitios EcoRI y SalI diseñados en los cebadores de amplificación directo MC-Lip7-Fn/t-RI (5'- AGG CAG AGG GAA TTC ATG ATG AAA AAA TTA TTA ATC G -3') [SEC ID Nº 3] e inverso MC-Lip7RCh/t-Sal (5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG TGATTG GTATAACTT TCT AAC TCC-3') [SEC ID Nº 4], respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de PCR en el plásmido de expresión de E. coli pTLZ2 de modo que podía expresar una proteína BASB115 madura como una proteína de fusión que contenía una cola para cromatografía de afinidad (His)6 en el extremo C. El producto de PCR de BASB115 se purificó de la reacción de amplificación usando columnas de centrifugación basadas en gel de sílice (QiaGen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Para producir los extremos EcoRI y SalI requeridos necesarios para clonación, el producto de PCR purificado se digirió secuencialmente hasta completarse con las enzimas de restricción EcoRI y SalI como se recomienda por el fabricante (Life Technologies).

Después de la primera digestión de restricción, el producto de PCR se purificó mediante una columna de centrifugación como anteriormente para retirar las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. El fragmento de ADN digerido se purificó de nuevo usando columnas de centrifugación basadas en gel de sílice antes del ligamiento con el plásmido pTLZ2.

B: Producción de Vectores de Expresión

Para preparar el plásmido de expresión pTLZ2 para el ligamiento, se digirió de forma similar hasta completarse tanto con EcoRI como con SalI y después se trató con fosfatasa intestinal de ternera (CIP, \sim0,02 unidades/pmol del extremo 5', Life Technologies) como indica el fabricante para evitar el auto-ligamiento. Se usó un exceso molar de aproximadamente 5 veces del fragmento digerido al vector preparado para programar la reacción de ligamiento. Se realizó una reacción de ligamiento convencional de -20 \mul (\sim16ºC, \sim16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica, usando ADN ligasa T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una alícuota del ligamiento (\sim5 \mul) para transformar células JM 109 electro-competentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Después de un periodo de \sim2-3 horas de crecimiento a 37ºC en \sim1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 \mug/ml). Se incluyó antibiótico en la selección. Las placas se incubaron durante una noche a 37ºC durante \sim16 horas. Se cogieron colonias ApR individuales con palillos estériles y se usaron para inocular en "parches" placas LB ApR recientes así como un cultivo de caldo LB ApR de \sim1,0 ml. Tanto las placas de parches como el cultivo de caldo se incubaron durante una noche a 37ºC en una incubadora convencional (placas) o un baño de agua en agitación. Se empleó un análisis de PCR basado en células para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN de BASB115. Aquí, el cultivo de caldo LB Ap de \sim1,0 ml durante una noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (\sim3 min., temperatura ambiente, \sim12.000 X g). El sedimento celular se suspendió en \sim200 \mul de agua estéril y se usó una alícuota de \sim10 \mul para programar una reacción de PCR de \sim50 \mul de volumen final que contenía ambos cebadores de amplificación de BASB115 directo e inverso. Las concentraciones finales de los componentes de la reacción de PCR fueron esencialmente las mismas que las especificadas en el ejemplo 2 excepto que se usaron \sim5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de desnaturalización inicial a 95ºC se aumentó a 3 minutos para asegurar la alteración térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN plasmídico. Se usaron un ciclador térmico ABI Modelo 9700 y un perfil de amplificación térmica de tres etapas de 32 ciclos, es decir 95ºC, 45 seg.; 55-58ºC, 45 seg., 72ºC, 1 min., para amplificar el fragmento de BASB115 a partir de las muestras transformantes lisadas. Después de la amplificación térmica, se analizó una alícuota de \sim20 \mul de la reacción por electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0,8% en un tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron por iluminación UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un patrón de tamaño molecular de ADN (ladder de 1 kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que produjeron el producto de PCR de tamaño esperado se identificaron como cepas que contienen una construcción de expresión de BASB115. Las cepas que contienen el plásmido de expresión se analizaron después para la expresión inducible de BASB115 recombinante.

C: Análisis de Expresión de Transformantes PCR-Positivos

Para cada transformante PCR-positivo identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contenía ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa de parches y se cultivaron durante una noche a 37ºC con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota del cultivo de siembra de una noche (\sim1,0 ml) en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 de caldo LB Ap y se cultivó a 37ºC con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D.O. 600 de \sim0,5, es decir fase semi-log (habitualmente aproximadamente 1,5 - 2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de la proteína BASB115 recombinante por la adición de IPTG (solución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) a una concentración final de 1,0 mM. La incubación de los cultivos tanto inducidos con IPTG como no inducidos continuó durante \sim4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Se retiraron muestras (\sim1,0 ml) de cultivos tanto inducidos como no inducidos después del periodo de inducción y las células se recogieron por centrifugación en un microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se suspendieron en \sim50 \mul de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra Laemelli SDS-PAGE 2X que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua hirviendo durante \sim3 min. para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) de lisados celulares tanto inducidos con IPTG brutos como no inducidos en gel poliacrilamida Tris al 12%/glicina duplicado (Mini-geles de 1 mm de grosor, Novex). Las muestras lisadas inducidas y no inducidas se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de procesamiento convencional SDS/Tris/glicina (BioRad). Después de la electroforesis, un gel se tiñó con azul brillante de coomassie R250 (BioRad) y después se destiñó para visualizar nueva(s) proteína(s) BASB115 inducibles por IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF (0,45 micrómetros de tamaño de poro, Novex) durante \sim2 h a 4ºC usando un aparato de transferencia BioRad Mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol de Towbin (20%). El bloqueo de la membrana y las incubaciones con anticuerpo se realizaron de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpos monoclonal anti-RGS (His)3, seguido de un segundo anticuerpos de conejo anti-ratón conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión e identidad de la proteína BASB115 recombinante. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se consiguió usando sustrato insoluble ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia Amersham ECL.

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Ejemplo 3

Producción de BASB115 Recombinante Cepa Bacteriana

Se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli JM109 que contenía un plásmido (pTLZ2) que codifica BASB115 de M. catarrhalis para producir una masa celular para la purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó en placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") para asegurar que se mantenía pTLZ2. Para la crioconservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB que contenía la misma concentración de antibióticos y después se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante constaba de caldo YT 2X (Difco) que contenía 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína BASB115 recombinante, se añadió IPTG (Isopropil B-D-Tiogalactopiranósido) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación

Se inoculó un matraz de siembra erlenmeyer de 500 ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo, con 0,3 ml de cultivo congelado rápidamente calentado, o varias colonias de un cultivo en placa de agar selectiva, y se incubaron durante aproximadamente 12 horas a 37 \pm 1ºC en una plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra después se usó para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo que contenía caldo YT 2X y ambos antibióticos Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se hizo funcionar a 37 \pm 1ºC, chorro de aire 0,2 - 0,4 WM, 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controló ni en el cultivo de siembra de matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH varió de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (solución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó el semi-log de crecimiento (\sim0,7 unidades de D.O. 600). Las células se incubaron durante 2 - 4 horas, después se recogieron por centrifugación usando una centrífuga se superaceleración 28RS Heraeus (Sepatech) o RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20ºC hasta que se procesó.

Compuestos Químicos y Materiales

El imidazol, clorhidrato de guanidina, Tris (hidroximetilo), y EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) de calidad biotecnológica o mejor se obtuvieron todos de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. El Triton X-100 (t-Octilfenoxipolietoxi-etanol), Triton X-114, y fosfato sódico, monobásico eran de calidad reactiva o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey. El metanol se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. Pefabloc®SC (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo), los comprimidos de cóctel de inhibidor de proteasa completo, y PMSF (fluoruro de fenilmetil-sulfonilo) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. La bestatina, pepstatina A, e inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de Calbiochem LaJolla, California. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1x PBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Mariland. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10x PBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville, Mariland. El anticuerpo penta-His, sin BSA se obtuvo de QiaGen, Valencia, California. El anticuerpo de cabra AffiniPure anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. La solución sencilla AEC se obtuvo de Zymed, South San Francisco, California. Todos los demás compuestos químicos eran de calidad reactiva o mejor.

La resina Sepharose Fast Flow Ni-quelante se obtuvo de Pharmacia., Suecia, California. Los geles de Tris-Glicina poliacrilamida al 4-20% y 10-20% premoldeados, los tampones de procesamiento y soluciones, los patrones pre-teñidos SeeBlue, los patrones multicoloreados MultiMark y las membranas de transferencia de PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Los kits de tinción con plata para SDS-PAGE se obtuvieron de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La solución de tinción de Coomassie se obtuvo de BioRad Laboratories, Hercules, California. Los filtros de jeringa de 0,2 m Acrodisc® PF se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringa desechables de 25 mm GD/X se obtuvieron de Whatman Inc., Clifton, Nueva Jersey. Los tubos de diálisis 8.000 MWCO se obtuvieron de BioDesign Inc. Od Nueva York, Carmal Nueva York. Los reactivos de ensayo de proteínas BCA y los tubos de diálisis de piel de serpiente 3.500 MWCQ se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

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Ejemplo 4

Purificación de BASB115 recombinante de E. coli Extracción Purificación

La pasta celular se calentó a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Después de la alteración de la pasta celular, el extracto se repartió con PBS enfriado en hielo que contenía TritonX-114 al 1%.

Se retiraron los desechos celulares, el extracto se calentó a 37ºC y las fases se repartieron por centrifugación.

La fracción de interés después se pasó sobre una resina Sepharose fast flow quelante de níquel equilibrada en PBS (pH 7,5) que contenía glicerol al 10% y Triton X100 al 0,05%. La proteína se eluyó con el mismo tampón que contenía imidazol 200 mM. La fracción que contenía la proteína eluida se diluyó con cuatro volúmenes de tampón Tris 50 mM (pH 7,5) que contenía EDTA 2 mM, cloruro sódico 10 mM y Triton X100 0,05% y se procesó a través de una resina DEAE-Sepharose FF. Se recogió el flujo continuo y se concentró dos veces en una célula de agitación de punto de corte a 3 kD, después se dializó frente a PBS (pH 7,4) que contenía Triton X 100 al 0,1%.

Como se muestra en la figura 1-A, la proteína BASB115 purificada apareció en el análisis de SDS-PAGE como una banda principal que migraba a aproximadamente 22 kDa (masa molecular relativa estimada). La pureza se estimó a más del 90%. La proteína BASB115 era reactiva contra un anticuerpo monoclonal de ratón producido contra el motivo de 6-Histidina (figura 1-B). El análisis de la proteína demuestra una banda inmunorreactiva principal con un contaminante minoritario inmediatamente debajo de la banda inmunorreactiva.

Caracterizaciones Bioquímicas Análisis de SDS-PAGE y Transferencia de Western

La proteína BASB115 purificada recombinante se resolvió en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Las membranas de PVDF después se pretrataron con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía leche desnatada en polvo al 5%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o inmune o suero inmune anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF después se lavaron dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro sódico 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo o anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF después se lavaron 4 veces con tampón de lavado, y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea

\hbox{suministrado por Zymed (San Francisco,
CA) durante 10 minutos  cada una.}

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Ejemplo 5

Producción de Antisueros contra BASB115 Recombinante

Se generaron antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB115 vacunando dos conejos con la proteína BASB115 recombinante purificada. A cada animal se le dio un total de tres inmunizaciones de forma subcutánea de aproximadamente 10 \mug de proteína BASB115 por inyección a intervalos de aproximadamente 21 días. Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inmunización ("pre-extracción") y en los días 49 y 56.

Se midieron los títulos anti-proteína BASB115 por un ELISA usando proteína BASB115 recombinante purificada (4 \mug/pocillo). El título se define como los títulos de punto medio calculados por un modelo logístico de 4 parámetros usando el software soft max pro. Los títulos obtenidos después de la inmunización fueron 1:25000 para los sueros de conejo.

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Ejemplo 6

Caracterización inmunológica: Exposición superficial de BASB115

Los títulos anti-proteína BASB115 se determinaron por un ELISA usando células completas de Moraxella catarrhalis cepa 14 eliminadas con formalina (20 \mug/pocillo). El título se define como los títulos de punto medio por un modelo logístico de 4 parámetros usando el software SoftMax Pro. Los títulos observados con los sueros inmunes de conejo (1:2400) demuestran que la proteína BASB115 se detecta en la superficie de células de M. catarrhalis.

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Ejemplo 7

Caracterización inmunológica: Actividad Bactericida

Se examinó la actividad citotóxica mediada por el complemento de anticuerpos anti-BASB15 para determinar el potencial de vacuna de antisuero contra la proteína BASB115 preparado como se ha descrito anteriormente. Se examinaron las actividades del suero pre-inmune y el antisuero anti-BASB115 en la eliminación mediada por el complemento de M. catarrhalis.

Se cultivaron cepas de M. catarrhalis en placas Mueller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se añadieron varias colonias a 15 ml de HHI en el matraz de 125 ml. Los cultivos se cultivaron durante aproximadamente 4 horas a 200 rpm hasta A620 = 0,4. Después de una etapa de lavado, el sedimento se suspendió con HBSS y la cepa se diluyó para obtener 28500 CFU por mililitro. Se depositaron cincuenta (50) \mul de sueros preinmunes y los sueros anti-BASB115 (inactivados a 56ºC durante 30 min.) en el primer pocillo de una placa de 96 pocillos y se depositaron diluciones seriadas de factor dos en HBSS en los otros pocillos de la misma línea. Posteriormente se añadieron veinticinco (25) \mul de M. catarrhalis diluido vivo y la mezcla se incubó durante 15 min. a temperatura ambiente. Se añadió el complemento de cría de conejo (Pel freez, clinical systems, Brown Deer, WI, EEUU) en cada pocillos a una dilución de trabajo definida de antemano en un ensayo de toxicidad. Las microplacas se cubrieron y se incubaron durante 1 hora a 37ºC a 200 rpm. Cada ensayo incluye un control de complemento (pocillos sin suero que contiene fuente de complemento activo o inactivado), un control positivo (pocillos que contienen suero con un título conocido de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin suero y complemento) y un control de suero (pocillos sin complemento). El título bactericida de antisuero de conejo (eliminación del 50% de la cepa homóloga) fue < 1:28 (pre-inmune) y > 1:168 (inmune).

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Ejemplo 8

Eficacia de la vacuna de BASB115: potenciación de la eliminación pulmonar de M. catarrhalis en ratones

Este modelo de ratón se basa en el análisis de la invasión pulmonar por M. catarrhalis después de una exposición intranasal convencional a ratones vacunados.

Se inmunizan grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, 6 semanas de edad) de forma subcutánea con 100 \mul de vacuna correspondiente a una dosis de 10 \mug y se refuerzan 2 semanas después. Una semana después del refuerzo, los ratones se exponen por instilación de 50 \muI de suspensión bacteriana (5 10^{5} CFU/50 \mul) en la fosa nasal izquierda con anestesia (los ratones se anestesian con una combinación de los anestésicos quetamina y xilazina, 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8 mg de quetamina (Imalgene)/100 \mul). Los ratones se sacrifican 4 horas después de la exposición y los pulmones se retiran asépticamente y se homogenizan individualmente. Se determina la cantidad media ponderada en log10 de CFU/pulmón contando las colonias que han crecido en placas de agar Mueller-Hinton después de sembrar en placas 20 \mul de 5 diluciones seriadas del homogeneizado. Se calculan para cada grupo la media aritmética de la cantidad media ponderada en log 10 de CFU/pulmón y las desviaciones típicas.

Los resultados se analizan estadísticamente aplicando un ANOVA de una vía después de suponer igualdad de varianza (comprobada por ensayo de Brown y Forsythe) y normalidad (comprobada usando el ensayo de Shapiro-Wilk). Las diferencias entre grupos se analizaron usando el ensayo de Dunnet, el ensayo de rango estudentizado de Tukey (HSD) y el ensayo de Student-Newman-Keuls.

En este experimento los grupos de ratones se inmunizaron con BASB115 adsorbido en A1P04 (10 \mug de BASB115 sobre 100 \mug de AIPO4) o con una preparación de células completas muertas (kwc) de M. catarrhalis cepa ATCC 43617 adsorbida en AIPO4 (5 10^{8} células sobre 100 \mug de AIPO4) o con 100 \mug de AIPO4 sin antígeno. Los ratones se expusieron a 5 10^{5} CFU de bacterias vivas M. catarrhalis cepa ATCC 43617.

Se calcularon la cantidad media ponderada en log 10 de CFU/pulmón y la desviación típica 4 horas después de la exposición para cada grupo. Los ratones de inmunización simulada tenían 5,66 (+/-0,18) log 10 CFU/pulmón 4 horas después de la exposición.

La preparación kwc indujo eliminación pulmonar significativa en comparación con el grupo de control (diferencia de 1,76 log). La vacuna de BASB115 indujo una diferencia de 0,46 log en la eliminación pulmonar en comparación con el grupo de control, que fue significativamente diferente del control.

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contienen una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis en la American Type Culture Collection (en este documento "ATCC") el 21 de junio de 1997 y con el número de depósito asignado 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca de inserto de 1,5-2,9 kb secada por congelación construida a partir del aislado de M. catarrhalis obtenido de un aspirado a transtraqueal de un minero del carbón con bronquitis crónica.

\hbox{El depósito se describe en
Antimicrob. Agents  Chemother. 21: 506-508
(1982).}

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se menciona en este documento como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen de BASB115 de longitud completa.

Se ha depositado un depósito del vector pMC-ORF1/2 constituido por el ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y con el número de depósito asignado 207118.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la capa/clon depositado, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado por los mismos, se están controlando en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias de este documento.

El depósito de las cepas depositadas se ha hecho en los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimiento de Patente. Las cepas depositadas se harán públicas irrevocablemente y sin restricción o condición después de la emisión de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan simplemente por conveniencia para los especialistas en la técnica y no son una admisión de que se requiere un depósito para la habilitación, tal como se requiere según 35 U.S.C. \NAK112.

Información de secuencia Secuencias Polinucleotídicas y Polipeptídicas de BASB115

SEC ID Nº 1

Secuencia polinucleotídica de BASB115 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

1

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SEC ID Nº 2

Secuencia polipeptídica de BASB115 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº 1

2

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SEC ID Nº 3

\hskip0,1cm

100

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SEC ID Nº 4

101

<110> SmithKline Beecham Biologicals SA

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<120> Nuevos Compuestos

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<130> BM45406

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<160> 4

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 600

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

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3

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<210> 2

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<211> 199

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 2

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4

5

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<210> 3

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador

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<400> 3

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\hskip0,8cm

102

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<210>4

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 4

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\hskip0,8cm

6

Claims

1. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o b) un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº 2 que comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en que la actividad inmunogénica de dicho fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos consta de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que el fragmento inmunogénico está acoplado a un vehículo.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende una proteína de fusión que comprende dicho polipéptido o fragmento inmunogénico del mismo.

7. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o b) un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº 2 que comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en que la actividad inmunogénica de dicho fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 2.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85% con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº 2 sobre la región codificante completa.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la de la SEC ID Nº 1 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº 1.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en que la identidad es al menos del 95% con la SEC ID Nº 1.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el polinucleótido aislado codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2, o un fragmento inmunogénico del mismo en que la actividad inmunogénica de dicho fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el polinucleótido aislado comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº 1.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el polinucleótido aislado codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2, que se puede obtener por exploración de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 1 o un fragmento de la misma.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el fragmento inmunogénico está acoplado a un vehículo.

16. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que dicha composición comprende al menos un antígeno de Moraxella catarrhalis diferente.

17. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

18. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

19. Una composición terapéutica útil para tratar seres humanos con enfermedad por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéutico adecuado.

20. Una vesícula de membrana externa bacteriana que se puede obtener de una célula huésped que comprende un vector de ácido nucleico que comprende un polinucleótido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo, en la que el polipéptido se expresa en la membrana externa.

21. Una composición de vacuna que comprende la vesícula de membrana externa bacteriana de la reivindicación 20, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Un procedimiento para fabricar una composición de vacuna que comprende las etapas de preparar células huésped que comprenden un polinucleótido recombinante definido en una cualquiera de las reivindicaciones 7-15, o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula huésped, expresar un polipéptido recombinante a partir de dicho polinucleótido, y formular dicho polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.