ES2307618T3 - Proteinas subunidades de receptores de cotocinas de mamiferos, reactivos y metodos relacionados. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante, que comprende al menos diez aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2.

Description

Proteínas subunidades de receptores de citocinas de mamíferos, reactivos y métodos relacionados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para influir en la fisiología de los mamíferos, incluyendo la función del sistema inmunitario. En particular, proporciona métodos para regular el desarrollo y/o el sistema inmunitario. Se describen también los usos de estos materiales para el diagnóstico y la terapéutica.

Antecedentes de la invención

La tecnología del DNA recombinante se refiere en general a técnicas de integración de información genética a partir de una fuente donante hacia vectores para el procesado posterior, tal como a través de la introducción en un hospedante, con lo que la información genética transferida se copia y/o se expresa en el nuevo entorno. Comúnmente, la información genética existe en la forma de DNA complementario (cDNA) derivado del RNA mensajero (mRNA) que codifica un producto proteínico deseado. El vehículo es frecuentemente un plásmido que tiene la capacidad de incorporar el cDNA para posterior replicación en un hospedante y, en algunos casos, en realidad la capacidad de controlar la expresión del cDNA y con ello dirigir la síntesis del producto codificado en el hospedante. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY.

Durante algún tiempo, se ha sabido que la respuesta inmunitaria de los mamíferos se basa en una serie de interacciones celulares complejas, llamada la "red inmunitaria". Investigaciones recientes han proporcionado nuevas revelaciones sobre el funcionamiento interno de esta red. Aunque sigue estando claro que muchas de las respuestas inmunitarias giran, de hecho, en torno a las interacciones tipo red de los linfocitos, macrófagos, granulocitos y otras células, los inmunólogos en general, mantienen ahora la opinión, de que las proteínas solubles, conocidas como linfocinas, citocinas o monocinas, desempeñan papeles críticos en el control de estas interacciones celulares. Por tanto, existe un considerable interés en el aislamiento, caracterización y mecanismos de acción de los factores moduladores celulares, cuya comprensión debería llevar a avances significativos en el diagnóstico y en la terapia de numerosas anomalías médicas, por ejemplo, los trastornos del sistema inmunitario.

Las linfocinas, al parecer, median en las actividades celulares en una diversidad de formas. Véase, por ejemplo, Paul (ed. 1996) Fundamental Immunology 3d ed., Raven Press, New York; y Thomson (ed. 1994) The Cytokine Handbook 2d ed., Academic Press, San Diego. Se ha demostrado que apoyan la proliferación, crecimiento y/o diferenciación de las células madres hematopoyéticas pluripotenciales para producir gran número de progenitores, que comprenden diversas líneas celulares que forman un sistema inmunitario complejo. Para una respuesta inmunitaria saludable son necesarias interacciones apropiadas y equilibradas entre los componentes celulares. Las diferentes líneas celulares responden a menudo de diferente manera cuando se administran las linfocinas conjuntamente con otros agentes.

Las líneas celulares especialmente importantes para la respuesta inmunitaria incluyen dos clases de linfocitos: las células B, que pueden producir y segregar inmunoglobulinas (proteínas con la capacidad de reconocer y unirse a las sustancias extrañas para efectuar su separación), y las células T de varios subconjuntos que segregan linfocinas e inducen o deprimen las células B y otras variedades de células (incluyendo otras células T), construyendo la red inmunitaria. Estos linfocitos interactúan con otros muchos tipos de células.

La investigación para conocer y tratar mejor diferentes trastornos inmunitarios se ha visto dificultada por la incapacidad general de mantener las células del sistema inmunitario in vitro. Los inmunólogos han descubierto que el cultivo de muchas de estas células se puede conseguir mediante el uso de sobrenadantes de células T y de otras células, que contienen diferentes factores de crecimiento, incluyendo muchas de las linfocinas.

Existen diferentes factores de crecimiento y reguladores que modulan el desarrollo morfogenético. Se conocen muchos receptores de las citocinas. A menudo, hay al menos dos subunidades críticas en el receptor funcional. Véase, por ejemplo, Heinrich, et al. (1998) Biochem. J. 334:297-314; Gonda and D'Andrea (1997) Blood 89:355-369; Presky, et al. (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:14002-14007; Drachman and Kaushansky (1995) Curr. Opin. Hematol. 2:22-28; Theze (1994) Eur. Cytokine Netw. 5:353-368; y Lemmon and Schlessinger (1994) Trends Biochem. Sci. 19:459-463.

A la vista de lo anterior, está claro que el descubrimiento y desarrollo de nuevas proteínas solubles y sus receptores, incluyendo las similares a las linfocinas, debería contribuir a nuevas terapias para un amplio grupo de enfermedades degenerativas o anormales que implican directa o indirectamente el desarrollo, diferenciación, o función, por ejemplo, del sistema inmunitario y/o de las células hematopoyéticas. En particular, debería ser muy ventajoso el descubrimiento y conocimiento de nuevos receptores para moléculas similares a las linfocinas que mejoran o potencian las actividades beneficiosas de otras linfocinas. La presente invención proporciona nuevos receptores para ligandos que presentan similitud con las composiciones tipo citocinas y compuestos relacionados, y métodos para su uso.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a nuevos receptores relacionados con los receptores de la citocina, por ejemplo, estructuras moleculares tipo receptores de citocinas de los primates, denominadas subunidades del receptor de la citocina DNAX (DCRS), y sus actividades biológicas. En particular, proporciona la descripción de una subunidad, denominada DCRS5. Incluye ácidos nucleicos que codifican los propios polipéptidos y métodos para su producción y uso. Los ácidos nucleicos de la invención se caracterizan, en parte, por su homología con las secuencias del DNA complementario (cDNA) clonado incluidas aquí. Adicionalmente, la invención proporciona la comparación del ligando p40/IL-B30 con las subunidades del receptor DCRS5 y IL-12R\beta1, cuyo emparejamiento proporciona percepciones sobre las indicaciones para el uso de los agonistas y antagonistas basadas en los reactivos dirigidos al mismo.

La presente invención proporciona un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende al menos diez aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el polipéptido: comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2; es recombinante, comprendiendo la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2; comprende además al menos diez aminoácidos contiguos de la porción no intracelular de la SEQ ID NO: 2; comprende al menos 25 aminoácidos de la porción extracelular de la SEQ ID NO: 2; comprende la SEQ ID NO: 2 madura; o es un polipéptido natural sustancialmente puro. En otras realizaciones, el polipéptido recombinante: consiste en la secuencia madura de la Tabla 1; es un polipéptido no glucosilado; procede de un ser humano; comprende al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; presenta al menos tres segmentos no solapados de al menos quince aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; es una variante polimórfica natural de la SEQ ID NO: 2; tiene una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; presenta al menos dos epítopos no solapados que son específicos para un DCRS5 de primate; tiene un peso molecular de al menos 30 kD con glucosilación natural; es un polipéptido sintético; está en una forma estéril; está en una solución acuosa o tamponada; está unido a un sustrato sólido; está conjugado con otro resto químico; o está físicamente asociado con un polipéptido IL-12R\beta1.

Otras realizaciones de la invención proporcionan: un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende al menos dos segmentos definidos no solapados de al menos seis aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2; un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende al menos doce aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2; o un polipéptido de la secuencia natural sustancialmente puro que comprende la SEQ ID NO: 2 madura. En las formas particulares, estará el polipéptido que comprende al menos dos segmentos definidos no solapados de al menos seis aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2, en el que: los segmentos definidos no están solapados: incluyen uno de al menos doce aminoácidos; incluyen uno de al menos siete aminoácidos y un segundo de al menos nueve aminoácidos; incluyen un tercer segmento definido de al menos seis aminoácidos; o comprenden uno de R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587, o N592-606; o el polipéptido comprende además al menos dos segmentos definidos no solapados de al menos seis aminoácidos contiguos de la porción extracelular de la SEQ ID NO: 2. Alternativamente, el polipéptido que comprende al menos doce aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2 será aquel en que: el segmento de al menos doce aminoácidos contiguos comprende uno de R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587, o N592-606; o el polipéptido comprende además al menos dos segmentos definidos no solapados de al menos seis aminoácidos contiguos de la porción extracelular de la SEQ ID NO: 2, o el polipéptido de secuencia natural puro que comprende la SEQ ID NO: 2 madura, puede comprender además un epítopo de purificación o detección. Tales polipéptidos pueden: consistir en la secuencia madura de la Tabla 1; ser un polipéptido no glucosilado; proceder de un ser humano; comprender al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; presentar al menos tres segmentos no solapados de al menos quince aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; ser una variante polimórfica natural de la SEQ ID NO: 2; tener una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; presentar al menos dos epítopos no solapados que son específicos para un DCRS5 de primate; tener un peso molecular de al menos 30 kD con glucosilación natural; ser un polipéptido sintético; estar en una forma estéril; estar en una solución acuosa o tamponada; estar unido a un sustrato sólido; estar conjugado con otro resto químico; o estar físicamente asociado con un polipéptido IL-12R\beta1.

Se proporcionan otras composiciones diferentes, por ejemplo, que comprenden: un polipéptido sustancialmente puro combinado con la proteína IL-12R\beta1; o dicho polipéptido en un vehículo, donde el vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o solución tampón; y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral.

Se proporcionan kits que comprenden tal polipéptido y: un compartimento que comprende el polipéptido; un compartimento que comprende un polipéptido IL-12R\beta1; un compartimento que comprende un polipéptido p40, IL-B30, o p40/IL-B30; o instrucciones para el uso o para la eliminación de los reactivos del kit.

Se proporcionan anticuerpos y otros compuestos de unión que comprenden por ejemplo, un sitio de unión a un antígeno a partir de un anticuerpo, que se une específicamente a la porción intracelular del DCRS5, en el que: el compuesto de unión está en un envase; el polipéptido procede de un ser humano; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; el compuesto de unión está conjugado con otro resto químico; o el anticuerpo: se produce frente a una secuencia peptídica de un polipéptido maduro de la Tabla 1; se produce frente a un DCRS5 maduro; se produce para un DCRS5 humano purificado; se inmunoselecciona; es un anticuerpo policlonal; se une a un DCRS5 desnaturalizado; presenta una Kd para el antígeno de al menos 30 \mum; está unido a un sustrato sólido, incluyendo una perla o una membrana plástica; está en una composición estéril; o está marcado de forma detectable, incluyendo una marca radiactiva o fluorescente. También se proporcionan Kits que comprenden el compuesto de unión y: un compartimento que comprende el compuesto de unión; un compartimento que comprende: un polipéptido p40; un polipéptido IL-B30; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12R\beta1; un compartimento que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a: un polipéptido p40; un polipéptido IL-B30; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12R\beta1; o instrucciones para el uso o para la eliminación de los reactivos del kit.

También se proporcionan métodos, por ejemplo, para producir un complejo antígeno:anticuerpo, que comprende poner en contacto en condiciones apropiadas un polipéptido DCRS5 de primate con un anticuerpo, permitiendo así que se forme el complejo. Un método de este tipo puede ser aquel en que: el complejo se purifica de otros receptores de citocina; el complejo se purifica de otro anticuerpo; el contacto se realiza con una muestra que comprende un interferón; el contacto permite la detección cuantitativa del antígeno; el contacto se realiza con una muestra que comprende el anticuerpo; o el contacto permite la detección cuantitativa del anticuerpo. Se proporcionan otras composiciones, por ejemplo, una composición que comprende: un compuesto de unión estéril, o el compuesto de unión y un vehículo, donde el vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o solución tampón; y/o composiciones formuladas para administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral.

La invención proporciona también un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica el polipéptido DCRS5, en el que: el DCRS5 procede de un ser humano; o el ácido nucleico: codifica una secuencia peptídica antigénica de la Tabla 1; codifica una pluralidad de secuencias peptídicas antigénicas de la Tabla 1; presenta identidad a lo largo de al menos trece nucleótidos con un cDNA natural que codifica el segmento; es un vector de expresión; comprende además un origen de replicación; procede de una fuente natural; comprende una marca detectable; comprende secuencias nucleotídicas sintéticas; tiene menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb; procede de un primate; comprende una secuencia codificadora natural de longitud completa; es una sonda de hibridación para un gen que codifica el DCRS5; o es un cebador de la PCR, un producto de la PCR, o un cebador de la mutagénesis. Se proporcionan células que comprenden el ácido nucleico recombinante, incluyendo aquellas en las que la célula es: una célula procariota; una célula eucariota; una célula bacteriana; una célula de levaduras; una célula de insectos; una célula de mamíferos; una célula de ratón; una célula de primate; o una célula humana.

Las realizaciones de kits incluyen aquellas que comprenden el ácido nucleico y: un compartimento que comprende el ácido nucleico; un compartimento que comprende un ácido nucleico que codifica: un polipéptido p40; un polipéptido IL-B30; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12R\beta1; un compartimento que comprende: un polipéptido p40; un polipéptido IL-B30; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12R\beta1; un compartimento que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a: un polipéptido p40; un polipéptido IL-B30; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12R\beta1; o instrucciones para el uso o para la eliminación de los reactivos del kit.

Otras realizaciones de ácidos nucleicos incluyen aquellas que: se hibridan en condiciones de lavado de 30 minutos a 30ºC y concentración de sal inferior a 2 M con la porción de la SEQ ID NO: 1 que codifica la porción intracelular; o presentan identidad a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos con la porción intracelular de un DCRS5 de primate. Preferiblemente, dicho ácido nucleico será aquel en que: las condiciones de lavado son 45ºC y/o sal 500 mM; o 55ºC y/o sal 150 mM; o el tramo es al menos de 55 o 75 nucleótidos.

Los usos terapéuticos incluyen métodos para modular la fisiología o el desarrollo de una célula que comprenden poner en contacto la célula con: un antagonista de p40/IL-B30 que es un complejo que comprende: la porción extracelular de un DCRS5 de primate y/o la porción extracelular de un IL-12R\beta1 de primate; un antagonista de p40/IL-B30 que es un anticuerpo que se une a un complejo que comprende: DCRS5 de primate y/o IL-12R\beta1 de primate; un antagonista de p40/IL-B30 que es un anticuerpo que se une a DCRS5; un antagonista de p40/IL-B30 que es un anticuerpo para IL-12R\beta1; un antagonista de p40/IL-B30 que es un ácido nucleico antisentido para DCRS5 o IL-12R\beta1; o un agonista de p40/IL-B30 que es un anticuerpo que se une a un complejo que comprende DCRS5 de primate y/o IL-12R\beta1 de primate. En un tipo de método, el contacto se realiza con un antagonista, y el contacto se hace en combinación con un antagonista de IL-12, IL-18, TNF, y/o IFN\gamma; o la célula procede de un hospedante que: presenta signos o síntomas de una enfermedad crónica mediada por TH1; presenta síntomas o signos de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes, psoriasis, o sepsis; o recibe un transplante alogénico. Inversamente, el método puede ser poner en contacto con un agonista, y: el contacto se hace en combinación con IL-12, IL-18, TNF, o IFN\gamma; o la célula procede de un hospedante que: presenta signos o síntomas de una respuesta crónica mediada por Th2; padece un crecimiento tumoral, vírico, o fúngico; recibe una vacuna; o padece una respuesta alérgica.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas Sumario

I.

Generalidades

II.

Actividades

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III.

Ácidos nucleicos

A.

fragmentos codificadores, secuencias, sondas.

B.

mutaciones, quimeras, fusiones

C.

preparación de ácidos nucleicos

D.

vectores, células que los comprenden

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IV.

Proteínas, péptidos

A.

fragmentos, secuencias, inmunógenos, antígenos

B.

muteínas

C.

agonistas/antagonistas, equivalentes funcionales

D.

preparación de proteínas

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V.

Preparación de ácidos nucleicos, proteínas

A.

sintética

B.

recombinante

C.

fuentes naturales

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VI.

Anticuerpos

A.

policlonales

B.

monoclonales

C.

fragmentos; Kd

D.

anticuerpos anti-idiotípicos

E.

líneas celulares del hibridoma

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VII.

Kits, diagnosis, y cuantificación

A.

ELISA

B.

ensayo de codificación de mRNA

C.

cualitativo/cuantitativo

D.

kits

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VIII.

Composiciones terapéuticas, métodos

A.

composiciones de combinación

B.

dosis unitaria

C.

administración

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IX.

Cribado

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I. Generalidades

La presente invención proporciona la secuencia de aminoácidos y la secuencia de DNA de las moléculas de la subunidad tipo receptor de citocina, de mamíferos, aquí de primates, denominada ésta subunidad 5 del receptor de citocina DNAX (DCRS5) que tiene propiedades particulares definidas, tanto estructurales como biológicas. Varias de estas moléculas que codifican los cDNA se obtuvieron de primates, por ejemplo, de genotecas de secuencias de cDNA humano. También serían deseables homólogos de otros primates o de otros mamíferos.

Adicionalmente, la invención proporciona la comparación del ligando p40/IL-B30 con las subunidades DCRS5 y IL-12R\beta1 del receptor, cuyo emparejamiento proporciona percepciones sobre las indicaciones para el uso de los agonistas y antagonistas basadas en los reactivos dirigidos al mismo.

Algunos de los métodos estándar aplicables están descritos o referenciados, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1 3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York.

La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de un segmento que codifica el DCRS5 de un primate, por ejemplo, de un ser humano, se muestra en la Tabla 1. Se indica la secuencia señal predicha, pero puede depender del tipo de célula, o puede tener algunos restos en cualquier dirección. Los sitios potenciales de N-glucosilación están en los restos de asparragina 6, 24, 58, 118, 157, 209, y 250. Los enlaces disulfuro se encuentran probablemente entre los restos de cisteína en las posiciones 29 y 78; y en las posiciones 110/121/123 se encuentra un motivo C_CXW conservado. Son destacables el triptófano en 219; y el motivo WxxWS de 281-285. El segmento de aproximadamente 1-101 es un dominio Ig; de aproximadamente 102-195 es un dominio 1 de unión a citocina; de aproximadamente 196-297 es un dominio 2 de unión a citocina; de aproximadamente 298-330 es un enlace; de aproximadamente 329-354 es un segmento transmembranal; y de aproximadamente 356-606 es un dominio intracelular. Las características intracelulares incluyen sitios putativos de unión a SH2 en Y374-I377, Y461-Q464, y Y588-Q591; y restos de tirosina potencialmente importantes en 406, 427, 440, y 453. Son destacables estos sitios y límites.

La ORF contiene una secuencia señal putativa de la que se predice que será escindida en...CHG/GIT... como se muestra anteriormente. Un dominio extracelular predicho de 328 aminoácidos va seguido por un segmento transmembranal putativo, y finalmente por un dominio citoplásmico de aproximadamente 252 aminoácidos. Se predice que las funciones de unión al ligando residen en el dominio extracelular.

La traducción inversa de la secuencia de ácido nucleico se proporciona en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Secuencias de nucleótidos y de polipéptidos de la subunidad del receptor de citocina DNAX como realizaciones (DCRS5). Realización en primates, por ejemplo, en seres humanos (véanse SEQ ID NO: 1 y 2). Está indicada la secuencia señal predicha, pero puede variar en algunas posiciones dependiendo del tipo de célula. Están identificadas las posiciones de variación en los nucleótidos 127 y 563; que están emparejados con G y G (traduciendo a la combinación de Q y G) o T y A (traduciendo a H y R)

1

2

3

4

TABLA 2 Traducción inversa de DCRS5 de primates, por ejemplo, de seres humanos (SEQ ID NO: 3)

5

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TABLA 3 Alineamiento de varias subunidades de receptores de citocinas. La proteína gp 130 del receptor de IL-6 humano es la SEQ ID NO: 4 (GenBank M57230); la subunidad beta2 del receptor de IL-12 humano es la SEQ ID NO: 5 (GenBank U64198)

6

7

8

Los relacionados más próximos del dominio extracelular de "IL-30R" son los transductores de la señal de IL-6 gp130 y IL-12R\beta2. Algo menos estrechamente relacionados son el receptor GCSF, receptor de leptina, receptor del factor inhibidor de la leucemia, y receptor CNTF. Por tanto "IL-30R" es un miembro de la rama de la clase I de la superfamilia de receptores de citocina y está estrechamente relacionado con la familia IL-6R/IL-12R.

La Tabla 3 presenta la comparación de las secuencias disponibles de las subunidades del receptor de primates con el DCRS5 (IL-30R) de primates, por ejemplo, de los seres humanos. El DCRS5 presenta similitud con la subunidad del receptor de IL-6 gp130 (por ejemplo, la subunidad IL-6R) y la subunidad IL-12R\beta2. El DCRS5 presenta características estructurales de una subunidad beta, pero la secuencia real de las interacciones proteínicas y de señalización permanece sin resolver.

Como se utiliza en esta memoria, el término DCRS5 debe ser usado para describir una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1. En muchos casos, uno de sus fragmentos sustanciales será funcional o estructuralmente equivalente, incluyendo, por ejemplo, los segmentos extracelulares adicionales. La invención incluye también una variación proteínica del alelo DCRS5 respectivo cuya secuencia proporciona, por ejemplo, una muteína u otra construcción. Típicamente, tales variantes presentarán menos de aproximadamente el 10 % de diferencias en la secuencia con la región objetivo, y por lo tanto a menudo tendrán sustituciones entre 1 y 11 veces, por ejemplo, 2, 3, 5, 7 veces, y otras. También engloba variantes alélicas y otras variantes, por ejemplo, polimorfismos naturales, de la proteína descrita. Típicamente, se unirá con su correspondiente ligando biológico, probablemente en un estado dimerizado con una subunidad del receptor alfa, con alta afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 nM, usualmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor que aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente mejor que aproximadamente 3 nM. El término se utilizará también aquí para referirse a las formas relacionadas que se presentan en la naturaleza, por ejemplo, alelos, variantes polimórficas, y variantes metabólicas de la proteína del mamífero. Las formas preferidas de los complejos del receptor se unirán al ligando apropiado con una afinidad y selectividad apropiadas para una interacción ligando-receptor.

Esta invención engloba también combinaciones de proteínas o péptidos que tienen una identidad sustancial de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Tabla 1. Incluirán las variantes de secuencias con relativamente pocas sustituciones, por ejemplo, preferiblemente menos de aproximadamente 3-5.

Un "fragmento", o "segmento" sustancial de polipéptido es un tramo de restos de aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente de al menos 10 aminoácidos, más generalmente de al menos 12 aminoácidos, a menudo de al menos 14 aminoácidos, más a menudo de al menos 16 aminoácidos, típicamente de al menos 18 aminoácidos, más típicamente de al menos 20 aminoácidos, usualmente de al menos 22 aminoácidos, más usualmente de al menos 24 aminoácidos, preferiblemente de al menos 26 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 28 aminoácidos, y, en realizaciones especialmente preferidas, de al menos aproximadamente 30 aminoácidos o más. Las secuencias de segmentos de diferentes proteínas se pueden comparar una con otra a lo largo de tramos de longitud apropiada. En muchas situaciones, los fragmentos pueden presentar propiedades funcionales de las subunidades intactas, por ejemplo, el dominio extracelular del receptor transmembranal puede retener las características de unión al ligando, y puede ser usado para preparar un complejo soluble tipo receptor.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o la identidad de la secuencia, se determina optimizando los emparejamientos de los restos. En algunas comparaciones, se pueden introducir espacios, si fuera requerido. Véase, por ejemplo, Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al., (1983) chapter one in Time Warps, String Edits, y Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de programas informáticos de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y la University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservadoras como emparejamientos. Las sustituciones conservadoras incluyen, de forma típica, sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparragina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias con aminoácidos homólogos se pretende que incluyan las variaciones alélicas naturales y las variaciones interespecies en la secuencia de la citocina. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una homología desde 50 100% (si se pueden introducir espacios), hasta una homología de 60 100% (si se incluyen sustituciones conservadoras) con un segmento de la secuencia de aminoácidos de la Tabla 1. Las medidas de la homología serán al menos aproximadamente 70%, generalmente al menos 76%, más generalmente al menos 81%, a menudo al menos 85%, más a menudo al menos 88%, típicamente al menos 90%, más típicamente al menos 92%, usualmente al menos 94%, más usualmente al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, y más preferiblemente al menos 97%, y en las realizaciones especialmente preferidas, al menos 98% o más. El grado de homología variará con la longitud de los segmentos comparados. Las proteínas o péptidos homólogos, tales como las variantes alélicas, compartirán la mayor parte de las actividades biológicas con las realizaciones descritas en la Tabla 1, particularmente la porción intracelular.

Como se utiliza en esta memoria, el término "actividad biológica" se usa para describir, sin limitación, los efectos producidos sobre la señalización, respuestas inflamatorias, inmunidad innata, y/o desarrollo morfogénico, por los ligandos tipo citocina. Por ejemplo, estos receptores deberían mediar en las actividades de la fosfatasa o fosforilasa, actividades que se miden fácilmente por procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738. Los receptores, o porciones de los mismos, pueden ser útiles como enzimas marcadoras de fosfato para marcar sustratos generales o específicos. Las subunidades pueden ser también inmunógenos funcionales para producir anticuerpos que las reconocen, o antígenos capaces de unirse a los anticuerpos.

Los términos ligando, agonista, antagonista, y análogo, por ejemplo, de un DCRS5 requieren características de interacciones ligando-receptor, por ejemplo, en las que el receptor es un receptor natural o un anticuerpo. Las respuestas celulares probablemente están mediadas típicamente a través de las rutas de tirosina-cinasa del receptor.

También, un ligando es una molécula que sirve o como un ligando natural al que se une dicho receptor, o uno de sus análogos, o como una molécula que es un análogo funcional del ligando natural. El análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula totalmente no relacionada que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes apropiados de unión al ligando. Los ligandos pueden servir como agonistas o antagonistas del receptor, véase, por ejemplo, Goodman, et al. (eds.1990) The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York.

Un diseño de fármacos lógico se puede basar también en estudios estructurales de las formas moleculares de un receptor o anticuerpo y de otros efectores o ligandos. Véase, por ejemplo, Herz, et al. (1997) J. Recept. Signal Transduct. Res. 17:671-776; y Chaiken, et al. (1996) Trends Biotechnol. 14:369-375. Los efectores pueden ser otras proteínas que median en otras funciones en respuesta a la unión al ligando, u otras proteínas que normalmente interaccionan con el receptor. Un medio para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es la determinación de la estructura física, por ejemplo, mediante técnicas de cristalografía de rayos X o de NMR bidimensional. Éstas proporcionarán una guía sobre cuáles son los restos de aminoácidos que forman las regiones de contacto moleculares. Para una descripción detallada de la determinación estructural de las proteínas, véase, por ejemplo, Blundell and Johnson (1976), Protein Crystallography, Academic Press, New York.

II. Actividades

Las proteínas tipo receptor de citocina tendrán una serie de diferentes actividades biológicas, por ejemplo, señalización intracelular, por ejemplo, a través de STAT4, modulación de la proliferación celular, o en el metabolismo del fosfato, siendo añadidas o separadas de sustratos específicos, típicamente proteínas. Esto dará como resultado generalmente la modulación de una función inflamatoria, otra respuesta inmunitaria innata, o un efecto morfológico. La subunidad tendrá probablemente una afinidad específica baja de unión al ligando.

El DCRS5 tiene los motivos característicos de una señalización del receptor a través de la ruta JAK. Véase, por ejemplo, Ihle, et al. (1997) Stem Cells15(suppl. 1):105-111; Silvennoinen, et al. (1997) APMIS 105:497-509; Levy (1997) Cytokine Growth Factor Review 8:81-90; Winston and Hunter (1996) Current Biol. 6:668-671; Barrett (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol. 10:1-15; y Briscoe, et al. (1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351:167-171. Son de particular interés los motivos de unión de SH2 descritos anteriormente.

Las actividades biológicas de las subunidades del receptor de citocina estarán relacionadas con la adición o separación de restos de fosfato a los sustratos, típicamente de una manera específica, pero ocasionalmente de una manera no específica. Se pueden identificar los sustratos, o se pueden analizar las condiciones para la actividad enzimática por métodos estándar, por ejemplo, como se describe en Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738.

Las subunidades de receptor se pueden combinar para formar complejos funcionales, por ejemplo, que pueden ser útiles para unirse a un ligando o para preparar anticuerpos. Estos tendrán sustanciales usos de diagnóstico, incluyendo detección o cuantificación. El enlace funcional del receptor con el ligando p40/IL-B30 proporciona importantes percepciones sobre las indicaciones clínicas para las que podrá ser útil el receptor. Por lo tanto, los antagonistas y agonistas tendrán los efectos funcionales predichos.

III. Ácidos nucleicos

Esta invención contempla el uso de ácido nucleico aislado o fragmentos, por ejemplo, que codifican estas proteínas u otras estrechamente relacionadas, o sus fragmentos, por ejemplo, para codificar un polipéptido correspondiente, preferiblemente uno que sea biológicamente activo. En adición, esta invención cubre los DNA aislados o recombinantes que codifican combinaciones de tales proteínas o polipéptidos que tienen secuencias características, por ejemplo, de los DCRS5 solos o en combinación con otros tales como una subunidad IL-12R\beta1 (véase Showe, et al. (1996)) Ann. N.Y. Acad. Sci. 795:413-425; Gately, et al. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495-521; GenBank U03187, NM_005535). Típicamente, el ácido nucleico es capaz de hibridarse, en condiciones apropiadas, con un segmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Tabla 1, pero preferiblemente no con un segmento correspondiente de otros receptores descritos en la Tabla 3. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una proteína de longitud completa, o un fragmento, y tendrá típicamente un segmento de una secuencia de aminoácidos altamente homólogo, por ejemplo, que presenta tramos significativos de identidad, con el mostrado en la Tabla 1. Además, esta invención cubre el uso de ácido nucleico aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, que codifica proteínas que tienen fragmentos que son equivalentes a las proteínas DCRS5, por ejemplo, porciones intracelulares. Los ácidos nucleicos aislados pueden tener las respectivas secuencias reguladoras en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotoras, potenciadoras, señales de adición de poli-A, y otras procedentes del gen natural. Las combinaciones, como se han descrito, se proporcionan también, por ejemplo, combinando el DCRS5 con el IL-12R\beta1, o sus porciones extracelulares de unión al ligando como antagonistas del ligando. Los servicios de diagnóstico, por ejemplo, de las variantes polimórficas u otras variantes, son también claramente importantes.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un RNA, un DNA, o un polímero mixto, que es sustancialmente puro, por ejemplo, separado de otros componentes que en la naturaleza acompañan a una secuencia nativa, tales como ribosomas, polimerasas, y secuencias genómicas flanqueantes de la especie origen. El término incluye una secuencia de ácido nucleico que ha sido retirada de su entorno natural, e incluye aislados de DNA recombinante o clonado, que se pueden distinguir por tanto de las composiciones que se presentan en la naturaleza, y análogos sintetizados químicamente, o análogos sintetizados biológicamente mediante sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula, completa o sustancialmente puras.

Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones, contendrá heterogeneidad, preferiblemente menor. Esta heterogeneidad se encuentra, de forma típica, en los extremos del polímero o porciones que no son críticas para una función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico "recombinante" se define típicamente o por su método de producción o por su estructura. Con referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto fabricado mediante un procedimiento, el procedimiento es el uso de las técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos. Típicamente esta intervención incluye la manipulación in vitro, aunque bajo ciertas circunstancias puede incluir técnicas de reproducción animal más clásicas. Como alternativa, puede ser un ácido nucleico preparado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no están contiguos uno de otro de forma natural, pero pretende excluir los productos de la naturaleza, por ejemplo, los mutantes que aparecen en la naturaleza, como se encuentran en su estado natural. Así, por ejemplo, se incluyen los productos preparados transformando células con cualquier vector que no aparece en la naturaleza, como son los ácidos nucleicos que comprenden secuencias derivadas utilizando cualquier procedimiento sintético de oligonucleótidos. Dicho procedimiento se realiza a menudo para reemplazar, por ejemplo, un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservador, mientras que típicamente se introduce o se elimina un sitio de reconocimiento en la secuencia para una enzima de restricción, o para el análisis de alguna estructura-función. Alternativamente, el procedimiento se realiza para unir juntos los segmentos de ácido nucleico de las funciones deseadas para generar una única entidad genética que comprende una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales comúnmente disponibles, por ejemplo, que codifica una proteína de fusión. Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción son, a menudo, las dianas para estas manipulaciones artificiales, pero se pueden incorporar mediante diseño otras dianas específicas de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de DNA, secuencias reguladoras, secuencias control u otras características útiles. Se pretende un concepto similar para un polipéptido recombinante, por ejemplo, un polipéptido de fusión. Éste incluirá una repetición dimérica o fusión del DCRS5 con la subunidad IL-12R\beta1. Se incluyen específicamente ácidos nucleicos sintéticos, que por redundancia del código genético, codifican polipéptidos equivalentes a los fragmentos de DCRS5 y fusiones de secuencias de varias moléculas relacionadas diferentes, por ejemplo, otros miembros de la familia de receptores de citocina.

Un "fragmento" en el contexto de un ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de al menos 21 nucleótidos, más generalmente de al menos 25 nucleótidos, ordinariamente de al menos 30 nucleótidos, más ordinariamente de al menos 35 nucleótidos, a menudo de al menos 39 nucleótidos, más a menudo de al menos 45 nucleótidos, típicamente de al menos 50 nucleótidos, más típicamente de al menos 55 nucleótidos, usualmente de al menos 60 nucleótidos, más usualmente de al menos 66 nucleótidos, preferiblemente de al menos 72 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 79 nucleótidos, y en las realizaciones particularmente preferidas será de al menos 85 o más nucleótidos, incluyendo 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, etc. Típicamente, se pueden comparar fragmentos de diferentes secuencias genéticas uno con otro a lo largo de tramos de longitud apropiada, particularmente segmentos definidos tales como los dominios descritos a continuación.

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Un ácido nucleico que codifica DCRS5 será particularmente útil para identificar genes, especies de mRNA, y cDNA que codifican el mismo o proteínas estrechamente relacionadas, así como los DNA que codifican variantes polimórficas, alélicas, u otras variantes genéticas, por ejemplo, de diferentes individuos o especies relacionadas. Las sondas preferidas para tales cribados son aquellas regiones del receptor que se conservan entre diferentes variantes polimórficas o que contienen nucleótidos que carecen de especificidad, y serán preferiblemente de longitud completa o casi completa. En otras situaciones, las secuencias específicas de la variante polimórfica será más útil. También se pueden determinar las combinaciones de variantes polimórficas de DCRS5 con variantes de IL-12R\beta1.

Esta invención cubre además las moléculas y fragmentos de ácido nucleico recombinante que tienen una secuencia de ácido nucleico idéntica o altamente homóloga con el DNA aislado indicado aquí. En particular, las secuencias estarán a menudo operativamente ligadas a segmentos de DNA que controlan la transcripción, traducción, y replicación del DNA. Estos segmentos adicionales ayudan típicamente en la expresión del segmento deseado de ácido nucleico.

Las secuencias de ácido nucleico homólogas, o con alta identidad, cuando se comparan una con otra, por ejemplo, las secuencias de DCRS5, presentan una similitud significativa. Los patrones de homología en ácido nucleicos son medidas de la homología utilizadas en general en la técnica mediante comparación de las secuencias o basadas en las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación comparativas se describen con más detalle a continuación.

Una identidad sustancial en el contexto de la comparación de secuencias de ácido nucleico, significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando se alinean de forma óptima, con las inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos, en al menos aproximadamente 60% de los nucleótidos, generalmente al menos 66%, ordinariamente al menos 71%, a menudo al menos 76%, más a menudo al menos 80%, usualmente al menos 84%, más usualmente al menos 88%, típicamente al menos 91%, más típicamente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 a 98% o más, y en realizaciones particulares, tanto como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos, incluyendo, por ejemplo, segmentos que codifican dominios estructurales u otros segmentos descritos. Como alternativa, existe una identidad sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas con una hebra, o su complemento, de forma típica utilizando una secuencia derivada de la Tabla 1. Típicamente, la hibridación selectiva tendrá lugar cuando haya una homología de al menos aproximadamente 55% a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, más típicamente de al menos aproximadamente 65%, preferiblemente de al menos aproximadamente 75%, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 90%. Véase, Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de la homología, como se describe, puede ser sobre tramos más largos y, en ciertas realizaciones, será sobre un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, usualmente de al menos aproximadamente 24 nucleótidos, más usualmente de al menos aproximadamente 28 nucleótidos, de forma típica de al menos aproximadamente 32 nucleótidos, de forma más típica de al menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 75 a 100 nucleótidos o más. Esto incluye, por ejemplo, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, etc., y otras longitudes.

Unas condiciones rigurosas, con referencia a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, típicamente controlados en las reacciones de hibridación. Unas condiciones rigurosas de temperatura normalmente incluirán temperaturas superiores a aproximadamente 30ºC, más usualmente superiores a aproximadamente 37ºC, de forma típica superiores a aproximadamente 45ºC, de forma más típica superiores a aproximadamente 55ºC, preferiblemente superiores a aproximadamente 65ºC, y más preferiblemente superiores a aproximadamente 70ºC. Unas condiciones rigurosas de sales normalmente serán menores que aproximadamente 500 mM, habitualmente menores que aproximadamente 400 mM, más habitualmente menores que aproximadamente 300 mM, de forma típica menores que aproximadamente 200 mM, preferiblemente menores que aproximadamente 100 mM, y más preferiblemente menores que aproximadamente 80 mM, o incluso llegando hasta menores que aproximadamente 50 o 20 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370.

El DNA aislado se puede modificar con facilidad mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de DNA que codifican esta proteína o sus derivados. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir proteínas mutantes (muteínas) o para mejorar la expresión de especies variantes. Un aumento de la expresión puede implicar la amplificación de genes, aumento de la transcripción, aumento de la traducción y otros mecanismos. Tal DCRS5 mutante es el principio del DCRS5 como se ha indicado antes, pero teniendo una secuencia de aminoácidos que difiere de la de otras proteínas tipo receptor de citocina que se encuentran en la naturaleza, ya sea a modo de deleción, sustitución, o inserción. En particular, "sitio específico de DCRS5 mutante" engloba una proteína que tiene una identidad de secuencia sustancial con una proteína de la Tabla 1, y comparte típicamente la mayor parte de las actividades biológicas o efectos de las formas descritas aquí. También se identifican varias secuencias de variantes polimórficas naturales.

Aunque los sitios de la mutación específica de sitio están predeterminados, no es necesario que los mutantes sean específicos de sitio. Se puede alcanzar la mutagénesis del DCRS5 de mamífero preparando inserciones o deleciones de aminoácidos en el gen, acopladas con la expresión. Se pueden generar sustituciones, deleciones, inserciones, o muchas combinaciones para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones en amino- o carboxi terminal. Se puede realizar una mutagénesis aleatoria en un codón objetivo y los mutantes DCRS5 de mamífero expresados pueden ser cribados entonces en cuanto a la actividad deseada, proporcionando algún aspecto de una relación estructura-actividad. Los métodos para preparar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del DNA que tienen una secuencia conocida, son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante mutagénesis con cebador M13. Véase también Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y periodic Supplements). Serán construcciones particularmente útiles las porciones extracelulares del DCRS5 asociadas con los segmentos IL-12R\beta1.

Las mutaciones en el DNA normalmente no deberían colocar secuencias codificadoras fuera de los marcos de lectura, y preferiblemente no crearán regiones complementarias que se puedan hibridar para producir una estructura secundaria de mRNA, tales como bucles u horquillas.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de DNA sintéticos adecuados. Se obtendrá a menudo un fragmento de doble hebra bien sintetizando la hebra complementaria e hibridando las hebras juntas en condiciones apropiadas o bien añadiendo la hebra complementaria utilizando la DNA-polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden aplicar a menudo en la mutagénesis. Alternativamente, los cebadores de la mutagénesis son métodos comúnmente usados para generar mutaciones definidas en sitios predeterminados. Véase, por ejemplo, Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; y Dieffenbach and Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.

Ciertas realizaciones de la invención se dirigen a composiciones de combinación que comprenden las secuencias del receptor descritas. En otras realizaciones, las porciones funcionales de las secuencias se pueden unir para codificar proteínas de fusión. En otras formas, las variantes de las secuencias descritas pueden ser sustituidas.

IV. Proteínas, péptidos

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención engloba DCRS5 de primates, cuyas secuencias, por ejemplo, están expuestas en la Tabla 1, y se han descrito anteriormente. Se contemplan también las variantes alélicas y otras variantes, incluyendo, por ejemplo, las proteínas de fusión que combinan porciones de dichas secuencias con otras, incluyendo, por ejemplo, IL-12R\beta1, marcas de epítopos, y dominios funcionales.

La presente invención proporciona también proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas utilizando segmentos de estas proteínas de primates o de roedores. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que normalmente no están fusionadas de la misma manera en la naturaleza. Por lo tanto, el producto de fusión de un DCRS5 con otro receptor de citocina es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, preparado típicamente como un único producto de la traducción y que presenta propiedades, por ejemplo, secuencia o antígenicidad, derivadas de cada péptido fuente. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas. Se proporcionan también combinaciones de varias proteínas diseñadas en complejos.

En adición, se pueden hacer nuevas construcciones a partir de la combinación de dominios similares funcionales o estructurales procedentes de otras proteínas relacionadas, por ejemplo, receptores de citocina o receptores tipo Toll, incluyendo variantes de especies. Por ejemplo, los segmentos de unión al ligando u otros segmentos pueden ser "intercambiados" entre diferentes nuevos polipéptidos de fusión o fragmentos. Véase, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989), Science, 243:1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. Por tanto, se generarán nuevos polipéptidos quiméricos que muestran nuevas combinaciones de especificidades a partir del enlace funcional de especificidades de unión al receptor. Por ejemplo, los dominios de unión al ligando de otras moléculas de receptor relacionadas se pueden añadir o reemplazar a otros dominios de estas proteínas o relacionadas. La proteína resultante tendrá a menudo una función y propiedades híbridas. Por ejemplo, una proteína de fusión puede incluir un dominio diana que puede servir para proporcionar el secuestro de la proteína de fusión hasta una organela subcelular
particular.

Se pueden seleccionar candidatos de compañeros de fusión y secuencias a partir de diferentes bases de datos de secuencias, por ejemplo, GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA; y BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI. En particular, son especialmente preferidas las combinaciones de secuencias de polipéptidos proporcionadas en las Tablas 1 y 3. Formas variantes de las proteínas pueden estar sustituidas en las combinaciones descritas.

La presente invención proporciona particularmente muteinas que se unen a los ligandos tipo citocina, y/o que son afectadas en la transducción de señales. El alineamiento estructural de DCRS5 humano con otros miembros de la familia de los receptores de citocina muestra características/restos conservados. Véase la Tabla 3. El alineamiento de la secuencia de DCRS5 humano con otros miembros de la familia de los receptores de citocina indica diferentes características estructural y funcionalmente compartidas. Véase también, Bazan, et al. (1996) Nature 379:591; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269.

Son particularmente preferidas las sustituciones con secuencias de ratón o con secuencias humanas. Inversamente, las sustituciones conservadoras lejos de las regiones de interacción de unión al ligando conservarán probablemente la mayor parte de las actividades de señalización; y las sustituciones conservadoras lejos de los dominios intracelulares conservarán probablemente la mayor parte de las propiedades de unión al ligando.

Los "derivados" del DCRS5 de primates incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de glucosilación, derivados metabólicos y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes se pueden preparar mediante el enlace de funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácidos de CDRS5 o en el N-terminal, por ejemplo, por medios que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, amidas o ésteres alifáticos del carboxilo terminal o de restos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados de O-acilo de restos que contienen grupos hidroxilo, y derivados de N-acilo del aminoácido amino-terminal o de restos que contienen grupos amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo, incluyendo alquilo normal C3 a C18, formando, con ello, especies de alcanoíl-aroílo.

En particular, se incluyen las alteraciones por glucosilación, por ejemplo, preparadas modificando los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en posteriores etapas del procesamiento. Los medios particularmente preferidos para lograr esto son mediante la exposición del polipéptido a enzimas glucosilantes derivadas de células que normalmente proporcionan este procesamiento, por ejemplo, enzimas de glucosilación de mamífero. También se contemplan enzimas de desglucosilación. También se incluyen versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos que tiene otras modificaciones menores, incluyendo restos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina.

Un grupo principal de derivados son los conjugados covalentes de los receptores o sus fragmentos con otras proteínas de polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en cultivo recombinante, tal como fusiones en N-terminal, o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad para entrecruzar proteínas a través de sus grupos laterales reactivos. Los sitios de derivatización preferidos con agentes de entrecruzamiento son los grupos amino libres, los restos de carbohidratos, y los restos de cisteína.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre los receptores y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre diferentes receptores, que dan como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que presenta especificidad de unión para múltiples ligandos de citocina diferentes, o un receptor que puede tener especificidad ampliada o debilitada de efecto en el sustrato. De forma similar, se pueden construir fusiones heterólogas que pueden presentar una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de un receptor, por ejemplo, un segmento de unión al ligando, de forma que la presencia o localización de un ligando deseado se puede determinar con facilidad. Véase, por ejemplo, Dull, et al., patente de EEUU nº 4.859.609. Otros compañeros de fusión génica incluyen glutatión-S-transferasa, \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, \beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol-deshidrogenasa, y factor de apareamiento alfa de levaduras. Véase, por ejemplo, Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816. Las proteínas marcadas serán sustituidas a menudo en las combinaciones descritas de proteínas. Las asociaciones del DCRS5 con el IL-12R\beta1 son particularmente importantes, como se ha descrito.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage and Carruthers (1981) Tetra, Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de DNA sintéticos, adecuados. Se obtendrá a menudo un fragmento de doble hebra bien sintetizando la hebra complementaria e hibridando las hebras juntas en condiciones apropiadas o bien añadiendo la hebra complementaria utilizando la DNA-polimerasa con una secuencia apropiada de cebador.

Estos polipéptidos pueden tener también restos de aminoácidos que se han modificado químicamente por fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o eliminación de otros restos, en particular aquellos que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos útiles para marcar, o pueden actuar como dianas de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad.

Las proteínas de fusión se prepararán típicamente o por métodos de ácido nucleico recombinante o por métodos de polipéptido sintético. Las técnicas para la manipulación y expresión del ácido nucleico están descritas en general, por ejemplo, en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Vols. 1 3, Cold Spring Harbor Laboratory, y Ausubel, et al. (eds. 1987 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos están descritas, por ejemplo, en Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; y Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Véase también Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779 sobre métodos para preparar polipéptidos más grandes.

Esta invención contempla también el uso de derivados de un DCRS5 distintos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o la glucosilación. Estos derivados pueden implicar la asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos derivados generalmente pertenecen a tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de cadenas laterales y restos terminales, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares. Estos derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación, tales como purificación por afinidad de un receptor o de otras moléculas de unión, por ejemplo, un anticuerpo. Por ejemplo, un ligando de citocina se puede inmovilizar mediante enlace covalente a un soporte sólido, tal como Sepharose activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos muy conocidos en la técnica, o se puede adsorber sobre superficies de poliolefina, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para su uso en el ensayo o purificación de anticuerpos de un receptor de citocina o de otras moléculas similares. El ligando se puede marcar también con un grupo detectable, por ejemplo, puede radioyodarse por el procedimiento de la cloramina T, unirse covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugarse con otro resto fluorescente para su uso en ensayos de diagnóstico.

Se puede utilizar una combinación, por ejemplo, que incluye un DCRS5, de esta invención como un inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos, por ejemplo, capaces de distinguir entre otros miembros de la familia de receptores de citocina, para las combinaciones descritas. Los complejos se pueden utilizar para el cribado de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno preparados por inmunización con diferentes formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos" engloba también los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos naturales, por ejemplo, Fab, Fab2, Fv, etc. El DCRS5 purificado se puede utilizar también como un reactivo para detectar los anticuerpos generados en respuesta a la presencia de elevados niveles de expresión, o trastornos inmunológicos que llevan a la producción de anticuerpos frente al receptor endógeno. Adicionalmente, los fragmentos de DCRS5 pueden servir también como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente invención, como se describe inmediatamente a continuación. Por ejemplo, esta invención contempla los anticuerpos que tienen afinidad de unión o que se producen frente a las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla 1, fragmentos de los mismos, o varios péptidos homólogos. En particular, esta invención contempla los anticuerpos que tienen afinidad de unión o que se producen frente a fragmentos específicos de los que se predice que serán o que realmente son, expuestos a la superficie exterior proteínica del DCRS5 nativo. Los complejos de combinaciones de proteínas serán útiles también, y se pueden preparar preparaciones de anticuerpos en los mismos.

En otras ciertas realizaciones, las construcciones solubles, por ejemplo, de los segmentos extracelulares de unión al ligando del DCRS5 con el IL-12R\beta1 pueden ser composiciones de unión para el ligando y pueden ser útiles como antagonistas del ligando, o como antígenos para bloquear la señalización mediada por el ligando. Esto puede ser útil o para diagnóstico, por ejemplo, para marcado histológico del ligando, o terapéuticamente, por ejemplo, como antagonistas del ligando.

El bloqueo de la respuesta fisiológica a los ligandos del receptor puede ser el resultado de la inhibición de la unión del ligando al receptor, probablemente, mediante una inhibición competitiva. Por tanto, los ensayos in vitro de la presente invención utilizarán a menudo anticuerpos o segmentos de estos anticuerpos de unión al antígeno, construcciones solubles del receptor, o fragmentos unidos a los sustratos de fase sólida. Estos ensayos permitirán también la determinación diagnóstica de los efectos o bien de las mutaciones y modificaciones de la región de unión al ligando, o bien de otras mutaciones y modificaciones, por ejemplo, que afectan a la función de señalización o función enzimática.

Esta invención contempla también el uso de ensayos competitivos de cribado de fármacos, por ejemplo, en los que los anticuerpos neutralizantes frente a los complejos o fragmentos del receptor compiten con un compuesto de ensayo por la unión a un ligando o a otro anticuerpo. De esta manera, los anticuerpos o fragmentos neutralizantes, se pueden utilizar para detectar la presencia de un polipéptido que comparte uno o más sitios de unión a un receptor, y se pueden utilizar también para ocupar sitios de unión sobre un receptor que, de otra forma, podría unirse a un ligando. Las construcciones de receptor solubles que combinan los dominios extracelulares, o de unión al ligando, dominios del DCRS5 con el IL-12R\beta1, pueden ser útiles antagonistas para la unión competitiva del ligando p40/IL-B30.

V. Preparación de ácidos nucleicos y proteínas

Se puede obtener DNA que codifica la proteína, o fragmentos de la misma, mediante síntesis química, cribado de bancos de cDNA, o cribado de genotecas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejidos. Las secuencias naturales se pueden aislar utilizando métodos estándar y las secuencias proporcionadas aquí, por ejemplo, en la Tabla 1. Otras especies equivalentes se pueden identificar por técnicas de hibridación, o por diferentes técnicas de la PCR, combinadas con la búsqueda en las bases de datos de secuencias, por ejemplo, GenBank, o mediante esta búsqueda.

Este DNA se puede expresar en una amplia variedad de células hospedantes para la síntesis de un receptor de longitud completa, o de fragmentos, que, a su vez, por ejemplo, se pueden utilizar para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de los dominios de unión al ligando modificados o los dominios de cinasa/fosfatasa; y para estudios de estructura/función. Las variantes o fragmentos se pueden expresar en células hospedantes que se transforman o transfectan con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden estar sustancialmente libres de contaminantes celulares o proteicos, distintos de los derivados del hospedante recombinante y, por tanto, son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. La proteína, o sus porciones, se pueden expresar como fusiones con otras proteínas. Son particularmente interesantes las combinaciones de las proteínas descritas, o de los ácidos nucleicos que las codifican.

Los vectores de expresión son, de forma típica, construcciones de DNA o RNA autorreplicantes que contienen el gen del receptor deseado, sus fragmentos, o genes de combinación, usualmente unidos operativamente con los elementos de control genético apropiados que son reconocidos en una célula hospedante adecuada. Estos elementos de control son capaces de efectuar la expresión dentro de un hospedante adecuado. Se pueden expresar coordinadamente múltiples genes, y pueden estar en un mensaje policistrónico. El tipo específico de elementos de control necesarios para llevar a cabo la expresión dependerá de la célula hospedante concreta utilizada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariota o un sistema de control de expresión del promotor eucariota y, de forma típica, pueden incluir un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de la expresión del mRNA, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosomas adecuado, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción.. Los vectores de expresión contienen también normalmente un origen de la replicación que permite al vector replicarse independientemente de la célula hospedante.

Los vectores de esta invención incluyen aquellos que contienen DNA que codifica una combinación de proteínas, como se describe, o un polipéptido equivalente biológicamente activo. El DNA puede estar bajo el control de un promotor vírico y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla también el uso de estos vectores de expresión que son capaces de expresar los cDNA eucariotas que codifican tales proteínas en un hospedante procariota o eucariota, donde el vector es compatible con el hospedante y donde los cDNA eucariotas se insertan en el vector, de tal forma que con el crecimiento del hospedante que contiene el vector se expresa el cDNA en cuestión. Normalmente, los vectores de expresión se diseñan para la replicación estable en sus células hospedantes, o para la amplificación para aumentar en gran medida el número total de copias de los genes deseables por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula hospedante, por ejemplo, es posible efectuar una expresión transitoria de la proteína, o sus fragmentos, en diversos hospedantes utilizando vectores que no contengan un origen de la replicación que sea reconocido por la célula hospedante. Es posible también utilizar vectores que causan la integración de la proteína que codifica porciones en el DNA hospedante por recombinación.

Los vectores, tal como se utilizan aquí, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de DNA integrables, y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de DNA en el genoma del hospedante. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que llevan a cabo la expresión de genes unidos operativamente. Los plásmidos son la forma de vector más comúnmente usada, pero todas las demás formas de vectores que tienen una función equivalente y que son, o pueden llegar a ser, conocidas en la técnica son adecuadas para su utilización aquí. Véase, por ejemplo, Pouwels, et al. (1985 y suplementos), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., y Rodriguez, et al. (eds. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston.

Las células transformadas son células, preferiblemente de mamífero, que han sido transformadas o transfectadas con vectores construidos utilizando técnicas de DNA recombinante. Las células transformadas en el hospedante usualmente expresan las proteínas deseadas, pero para los fines de clonar, amplificar, y manipular su DNA, no necesitan expresar las proteínas susceptibles. Esta invención contempla además cultivar células transformadas en un medio nutriente, permitiendo así que las proteínas se acumulen. Se pueden recoger las proteínas, o desde el cultivo o, en ciertos casos, desde el medio de cultivo.

Para los fines de esta invención, las secuencias nucleicas están operativamente ligadas cuando están funcionalmente relacionadas una con otra. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o secuencia líder secretora está operativamente ligado a un polipéptido si este se expresa como una preproteína o participa en dirigir el polipéptido hacia la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificadora si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión a ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificadora si está en una posición que permite la translación. Usualmente, operativamente ligado significa contiguo y en marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como los genes represores no están ligados de forma contigua pero aún así se unen a las secuencias del operador que a su vez controlan la expresión.

Las células hospedantes adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Las procariotas incluyen organismos gram-negativos y gram-positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Las eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Las eucariotas superiores incluyen líneas celulares de cultivos de tejidos procedentes de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insecto y de aves, como de origen mamífero, por ejemplo, seres humanos, primates y roedores.

Los sistemas de vector en hospedante procariota incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Tal como se utiliza en esta memoria, E. coli y sus vectores se utilizan genéricamente para incluir vectores equivalentes utilizados en otras procariotas. Un vector representativo para amplificar el DNA es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden utilizar para expresar el receptor o sus fragmentos incluyen, pero sin limitarse a ellos, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos, tales como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda, and Ipp derived Promoters", en Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez and Denhardt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205 236.

Las eucariotas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, se pueden transformar con vectores que contienen secuencias de DCRS5. Para los fines de esta invención, el hospedante eucariota inferior más común es la levadura del panadero, Saccharomyces cerevisiae. Se utilizará para representar genéricamente a las eucariotas inferiores, aunque también está disponible una serie de otras cepas y especies. Los vectores de levadura consisten, de forma típica, en un origen de la replicación (a menos que sean del tipo integrante), un gen de selección, un promotor, DNA que codifica el receptor o sus fragmentos, y secuencias para la terminación de la traducción, la poliadenilación y la terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levaduras incluyen promotores constitutivos, tales como 3-fosfoglicerato-cinasa y otros diversos promotores de genes enzimáticos glucolíticos, o promotores inducibles, tales como el promotor de la alcohol-deshidrogenasa 2 o el promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: autorreplicantes de bajo número de copias (tales como la serie YRp), autorreplicantes con alto número de copias (tales como la serie YEp); tipos integrantes (tal como la serie YIp), o mini-cromosomas (tales como la serie YCp).

Las células de cultivos de tejidos de eucariotas superiores son normalmente las células hospedantes preferidas para la expresión de la interleucina o proteínas del receptor funcionalmente activas. En principio, son viables muchas líneas celulares de cultivo de tejidos de eucariotas superiores, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insecto, ya sean de origen invertebrado o vertebrado. Sin embargo, se prefieren las células de mamífero. La transformación o transfección y propagación de tales células ha llegado a ser un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñón de cría de rata (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para estas líneas celulares normalmente incluyen un origen de la replicación, un promotor, un sitio de inicio de la traducción, un sitio de ruptura del RNA (por ejemplo, si se emplea DNA genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también contienen usualmente un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que portan promotores derivados, por ejemplo, de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vacuna, o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136 1142; pMClneo poliA, véase Thomas, et al. (1987) Cell 51:503 512; y un vector de baculovirus, tal como pAC 373 o pAC 610.

Para las proteínas segregadas y algunas proteínas de la membrana, un marco de lectura abierto usualmente codifica un polipéptido que consiste en un producto maduro o segregado ligado covalentemente en su N-terminal a un péptido señal. El péptido señal se escinde antes de la secreción del polipéptido maduro, o activo. Se puede predecir el sitio de escisión con un alto grado de seguridad a partir de reglas empíricas, por ejemplo, von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:4683-4690 y Nielsen, et al. (1997) Protein Eng. 10:1-12, y la composición precisa de aminoácidos del péptido señal a menudo no parece que sea crítica para su función, por ejemplo, Randall, et al. (1989) Science 243:1156-1159; Kaiser et al. (1987) Science 235:312-317. Las proteínas maduras de la invención se pueden determinar fácilmente utilizando métodos estándar.

A menudo será deseable expresar estos polipéptidos en un sistema que proporciona un patrón específico o definido de glucosilación. En este caso, el patrón normal será aquel proporcionado naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón puede modificarse mediante la exposición del polipéptido, por ejemplo, una forma no glucosilada, a proteínas de glucosilación apropiadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen del receptor puede ser cotransformado con uno o más genes que codifican enzimas glucosilantes de mamífero o de otra clase. Usando este método, se podrán conseguir en células procariotas u otras células, ciertos patrones de glucosilación en mamíferos. La expresión en células procariotas llevará típicamente a formas no glucosiladas de proteína.

La fuente de DCRS5 puede ser un hospedante eucariótico o procariótico que expresa el DCRS5 recombinante, tal como se ha descrito anteriormente. La fuente puede ser también una línea celular, pero se contemplan también en esta invención otras líneas celulares de mamíferos, siendo la línea celular preferida la de la especie humana.

Ahora que se conocen las secuencias, se pueden preparar el DCRS5 de primate, sus fragmentos, o sus derivados por los procedimientos convencionales de la síntesis de péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los descritos en Stewart and Young (1984), Solid Phase Pentide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York. Por ejemplo, se pueden utilizar un procedimiento de azida, un procedimiento de cloruro de ácido, un procedimiento de anhídrido de ácido, un procedimiento de anhídrido mixto, un procedimiento de éster activo (por ejemplo, éster p-nitrofenílico, éster N-hidroxisuccinimídico, o éster cianometílico), un procedimiento de carbodiimidazol, un procedimiento de oxidación-reducción, o un procedimiento aditivo de diciclohexilcarbodiimida (DCCD). Las síntesis en fase sólida y en fase de solución son ambas aplicables a los anteriores procedimientos. Se pueden utilizar técnicas similares con secuencias parciales de DCRS5.

Las proteínas, fragmentos, o derivados de DCRS5 se preparan de modo adecuado de acuerdo con los procedimientos anteriores que se emplean típicamente en la síntesis de péptidos, generalmente o bien por un procedimiento llamado de etapas que comprende condensar un aminoácido con el aminoácido terminal, uno a uno en secuencia, o bien por el acoplamiento de fragmentos de péptido al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se usan en la reacción de acoplamiento se deben proteger típicamente para evitar el acoplamiento en una localización incorrecta.

Si se adopta la síntesis en fase sólida, el aminoácido del C-terminal se une a un vehículo o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo insoluble no está particularmente limitado siempre que tenga una capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de tales vehículos insolubles incluyen resinas de halometilo, tal como resina de clorometilo o resina de bromometilo, resinas de hidroximetilo, resinas de fenol, resinas terc-alquiloxicarbonilhidrazidadas, y similares.

Un aminoácido de grupo amino protegido está unido a la secuencia por medio de condensación de su grupo carboxilo activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena previamente formado, para sintetizar el péptido etapa a etapa. Después de sintetizar la secuencia completa, se separa el péptido del vehículo insoluble para producir el péptido. Este método de fase sólida está descrito en general por Merrifield, et al. (1963) en J. Am. Chem. Soc. 85:2149 2156.

La proteína preparada, y sus fragmentos, se puede aislar y purificar a partir de la mezcla de reacción por medios de separación de péptidos, por ejemplo, por extracción, precipitación, electroforesis, diversas formas de cromatografía, inmunoafinidad y similares. Los receptores de esta invención se pueden obtener con diversos grados de pureza dependiendo del uso deseado. Se puede lograr la purificación mediante el uso de técnicas de purificación de proteínas descritas aquí, véase más adelante, o mediante el uso de anticuerpos descritos aquí en los métodos de cromatografía de afinidad con inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad con inmunoabsorbente se realiza ligando en primer lugar los anticuerpos a un soporte sólido y poniendo después en contacto los anticuerpos ligados con lisados solubilizados de las células apropiadas, lisados de otras células que expresan el receptor, o lisados o sobrenadantes de células que producen la proteína como resultado de técnicas de DNA, véase a continuación.

Generalmente, la proteína purificada tendrá al menos aproximadamente 40% de pureza, ordinariamente al menos aproximadamente 50% de pureza, usualmente al menos aproximadamente 60% de pureza, típicamente al menos aproximadamente 70% de pureza, más típicamente al menos aproximadamente 80% de pureza, preferible al menos aproximadamente 90% de pureza y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de pureza, y en realizaciones particulares, 97%-99% o más. La pureza se expresa usualmente basándose en peso, pero también se puede expresar en base molar. Se aplicarán diferentes ensayos según sea apropiado. Las proteínas individuales se pueden purificar y después reunir.

VI. Anticuerpos

Se pueden producir anticuerpos para las diferentes proteínas de mamíferos, por ejemplo, proteínas DCRS5 de primates y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas nativas naturales como en sus formas recombinantes, siendo la diferencia que los anticuerpos para el receptor activo es más probable que reconozcan los epítopos que están presentes sólo en las conformaciones nativas. Se contemplan también los anticuerpos que reconocen los epítopos presentados por la combinación, por ejemplo, funcionalmente, del DCRS5 con el IL-12R\beta1. La detección del antígeno desnaturalizado también puede ser útil, por ejemplo, en el análisis de Western. Se contemplan también los anticuerpos anti-idiotípicos, que podrían ser útiles como agonistas o antagonistas de un receptor natural o de un anticuerpo.

Se pueden generar anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y las versiones monocatenarias, frente a fragmentos predeterminados de la proteína mediante una inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden seleccionar para la unión a proteínas normales o defectuosas, o se pueden seleccionar para su actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos monoclonales normalmente se unirán con una KD de al menos aproximadamente 1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente 300 \muM, de forma típica al menos aproximadamente 100 \muM, de forma más típica al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 \muM o mejor.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, de esta invención pueden tener un significativo valor de diagnóstico o terapéutico. Pueden ser potentes antagonistas que se unen al receptor e inhiben la unión al ligando o inhiben la capacidad del receptor para producir una respuesta biológica, por ejemplo, actúan sobre su sustrato. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden acoplar a las toxinas o radionúclidos para unirse a las células productoras, o células localizadas para la fuente de la interleucina. Además, estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, directa o indirectamente por medio de un enlace.

Los anticuerpos de esta invención pueden ser útiles también en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, se pueden unir al receptor sin inhibir la unión al ligando o sustrato. Como anticuerpos neutralizantes, pueden ser útiles en ensayos de unión competitivos. También serán útiles para detectar o cuantificar el ligando. Se pueden utilizar como reactivos para el análisis de transferencia Western, o para inmunoprecipitación o inmunopurificación de la proteína respectiva. Asimismo, los ácidos nucleicos y proteínas pueden ser inmovilizados en sustratos sólidos para métodos de purificación de afinidad o de detección. Los sustratos pueden ser, por ejemplo, perlas de resina sólida u hojas de plástico.

Los fragmentos de proteína se pueden unir a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para ser usados como inmunógenos. Los receptores de citocina de mamífero y los fragmentos pueden ser fusionados o ligados covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como la hemocianina de lapa bocallave, seroalbúmina bovina, toxoide tetánico, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; y Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York, para descripciones de métodos de preparación de antisueros policlonales. Un método típico implica la hiperinmunización de un animal con un antígeno. Se recoge entonces la sangre del animal rápidamente después de las inmunizaciones repetidas y se aísla la gammaglobulina.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diferentes mamíferos hospedantes, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Se pueden encontrar descripciones de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, en Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas allí; Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York; y particularmente en Kohler and Milstein (1975) en Nature 256: 495 497, que exponen un método para generar anticuerpos monoclonales. Resumido brevemente, este método implica inyectar un inmunógeno a un animal. Se sacrifica entonces el animal y se recogen células de su bazo, que se fusionan entonces con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se criba entonces para aislar los clones individuales, cada uno de los cuales segrega una única especie de anticuerpo contra el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas procedentes del animal inmune, generadas en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas incluyen la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a una selección de genotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; y Ward, et al. (1989), Nature, 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden emplear con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos se marcan uniendo, de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se indican con gran detalle tanto en la bibliografía científica como en la de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que indican el uso de estos marcadores incluyen las patentes de EEUU nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes o quiméricas, véase Cabilly, U.S. Patent No. 4,816,567; o se pueden preparar en ratones transgénicos, véase Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156.

Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar también para cromatografía de afinidad para aislar las proteínas o péptidos DCRS5. Se pueden preparar columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como agarosa, Sephadex, o similares, en las que un lisado celular se pueden hacer pasar a través de la columna, se lava la columna, seguido de concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, con lo que se libera la proteína purificada. Alternativamente, se puede utilizar la proteína para purificar el anticuerpo. Se pueden aplicar absorciones o depleciones cruzadas apropiadas.

Los anticuerpos se pueden utilizar también para cribar bancos de expresión para productos de expresión concretos. Normalmente, los anticuerpos utilizados en estos procedimientos serán marcados con un resto que permita una detección fácil de la presencia del antígeno por la unión del anticuerpo.

Los anticuerpos generados frente a un receptor de citocina se podrán utilizar también para generar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles para detectar o diagnosticar diferentes condiciones inmunológicas relacionadas con la expresión de la proteína o células que expresan la proteína. También serán útiles como agonistas o antagonistas del ligando, que pueden ser inhibidores competitivos del receptor o sustitutos para los ligandos que se presentan en la naturaleza. Ciertos anticuerpos frente a subunidades o combinaciones del receptor pueden servir como anticuerpos activadores, que pueden efectuar señales con lo que sirven, por ejemplo, como agonistas del ligando.

Una proteína del receptor de citocina que se una específicamente o que sea específicamente inmunorreactiva con un anticuerpo generado frente a un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, se determina típicamente en un inmunoensayo. El inmunoensayo utiliza típicamente un antisuero policlonal que ha sido producido, por ejemplo, para una proteína de la SEQ ID NO: 2. Este antisuero se selecciona para que tenga un reactividad cruzada baja frente a otros miembros de la familia de los receptores de citocina, por ejemplo, la subunidad del receptor IL-12R\beta2 o la subunidad gp130 del receptor de IL-6, preferiblemente procedente de la misma especie, y cualquier reactividad cruzada como la mencionada se elimina por inmunoabsorción antes del uso en el inmunoensayo.

Con el fin de producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, la proteína, por ejemplo, de la SEQ ID NO: 2, se aísla como se describe aquí. Por ejemplo, la proteína recombinante se puede producir en una línea celular de mamífero. Se inmuniza un hospedante apropiado, por ejemplo, una cepa endogámica de ratones tal como Balb/c, con la proteína seleccionada, utilizando típicamente un adyuvante estándar, tal como el adyuvante de Freund, y un protocolo estándar de inmunización de ratones (véase Harlow and Lane, cita anterior). Como alternativa, se puede utilizar como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias descritas aquí y conjugado con una proteína portadora. Los sueros policlonales se recogen y se valoran frente a la proteína del inmunógeno en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Se seleccionan los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor y se analizan en cuanto a su reactividad cruzada frente a otros miembros de la familia de receptores de citocina, por ejemplo, gp130 o IL-12R\beta1 utilizando un inmunoensayo de unión competitivo tal como el descrito en Harlow and Lane, cita anterior, en las páginas 570-573. Preferiblemente se utilizan en esta determinación al menos dos miembros de la familia de receptores de citocina. Estos miembros de la familia de receptores de citocina se pueden producir como proteínas recombinantes y se pueden aislar utilizando técnicas convencionales de biología molecular y de la química de las proteínas, como se describe aquí.

Se pueden emplear inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la determinación de la reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de la SEQ ID NO: 2 se puede inmovilizar con un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con las proteínas, por ejemplo, de gp130 o IL-12R\beta2. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores, utilizando cálculos estándar. Se seleccionan y se reúnen aquellos antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas listadas anteriormente. Los anticuerpos de reactividad cruzada se retiran entonces de los antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con las proteínas listadas anteriormente.

Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se utilizan entonces en un inmunoensayo de unión competitiva, como se ha descrito antes, para comparar una segunda proteína con la proteína del inmunógeno (por ejemplo, la proteína tipo DCRS5 de la SEQ ID NO: 2). Para realizar esta comparación, las dos proteínas se ensayan cada una en un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad requerida de cada proteína para inhibir el 50% de la unión del antisuero a la proteína inmovilizada. Si la cantidad requerida de la segunda proteína es menor que dos veces la cantidad de proteína que se requiere de la proteína o proteínas seleccionadas, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado frente al inmunógeno.

Se entiende que estas proteínas del receptor de citocina son miembros de una familia de proteínas homólogas que comprenden muchos genes identificados. Para un producto génico dado, tal como el DCRS5, el término no se refiere solamente a las secuencias de aminoácidos descritas aquí, sino también a otras proteínas que son variantes alélicas, no alélicas o variantes de especie. También se entiende que los términos incluyen mutaciones no naturales introducidas mediante una mutación deliberada utilizando la tecnología recombinante convencional, tal como mutación en un sitio único, o mediante escisión de secciones cortas de DNA que codifican las respectivas proteínas, o mediante sustitución de nuevos aminoácidos, o mediante la adición de nuevos aminoácidos. Estas alteraciones menores típicamente mantendrán sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Por lo tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína denominada DCRS5 que se presenta en la naturaleza. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas se pueden determinar expresando la proteína en una línea celular apropiada y midiendo el efecto apropiado, por ejemplo, en los linfocitos transfectados. Las modificaciones particulares de la proteína que se consideran menores incluyen la sustitución conservadora de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se ha descrito antes para la familia de receptores de citocina en su conjunto. Las composiciones de proteínas de la invención se pueden establecer mediante la alineación óptima de una proteína con la proteína de los receptores de citocina y mediante el uso de inmunoensayos convencionales descritos aquí para determinar la inmunoidentidad.

Además, los anticuerpos frente a las subunidades del receptor pueden servir para bloquear estéricamente la unión del ligando al receptor funcional. Se pueden producir tales anticuerpos frente a cualquier subunidad sola, o frente a la combinación de DCRS5 con IL-12R\beta1. Resultarían los antagonistas del anticuerpo.

VII. Kits, diagnosis, y cuantificación

Tanto las formas naturales como las recombinantes de las moléculas tipo receptor de citocina de esta invención son particularmente útiles en los kits y métodos de ensayo. Por ejemplo, estos métodos se deben aplicar también para el cribado según la actividad de unión, por ejemplo, de ligandos para estas proteínas. Se han desarrollado varios métodos de ensayos automáticos en los últimos años para permitir el cribado de decenas de miles de compuestos por año. Véase, por ejemplo, una terminal de trabajo automática BIOMEK, Beckman Instruments, Palo Alto, California, y Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773. El último describe medios para ensayar la unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados para seleccionar un ligando o proteínas homólogas agonistas/antagonistas se puede facilitar en gran medida por la disponibilidad de grandes cantidades de receptores de citocina solubles, purificados, en un estado activo tal como se proporcionan en esta invención.

El DCRS5 purificado puede ser extendido como una capa directamente sobre placas para su uso en las técnicas de cribado del ligando mencionadas anteriormente. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes para estas proteínas se pueden usar como anticuerpos de captura para inmovilizar el receptor respectivo sobre la fase sólida, útil, por ejemplo, en usos diagnósticos.

Esta invención contempla también el uso de DCRS5, sus fragmentos, péptidos y sus productos de fusión en una diversidad de kits de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de la proteína o su ligando. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden incorporar a los kits y a los métodos, anticuerpos frente a las moléculas. Típicamente el kit tendrá un compartimento que contiene o el péptido DCRS5 o un segmento de gen o un reactivo que reconoce a uno o al otro. Típicamente, los reactivos de reconocimiento, en el caso de péptido, debería ser un receptor o un anticuerpo, o en el caso de un segmento génico, debería ser usualmente una sonda de hibridación. Otros componentes del kit pueden incluir otras proteínas o reactivos relacionados con los polipéptidos p40, IL-B30, o IL-12R\beta1 del emparejamiento ligando/receptor.

Un kit preferido para determinar la concentración de DCRS5 en una muestra comprenderá, de forma típica, un compuesto marcado, por ejemplo, un ligando o anticuerpo, que tenga una afinidad de unión conocida para el DCRS5, una fuente de DCRS5 (que aparece en la naturaleza o recombinante) como control positivo, y un medio para separar el compuesto marcado unido del compuesto marcado libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar el DCRS5 en la muestra de ensayo. Normalmente se proporcionan compartimentos que contienen reactivos e instrucciones. Se proporcionan también kits apropiados que contienen ácido nucleico o proteína.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para el DCRS5 de mamíferos o un fragmento peptídico, o los fragmentos de receptor son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de ligando y/o sus fragmentos. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de anticuerpo-antígeno) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el inmunoensayo enzimático (EIA), la técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT), el inmunoensayo fluorescente de sustrato marcado (SLFIA), y similares. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos no marcados empleando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo frente a un receptor de citocina o frente a un fragmento particular del mismo. Estos ensayos también se han discutido extensamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., y Coligan (ed. 1991 y suplementos periódicos) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York.

Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener uso similar para servir como agonistas o antagonistas de los receptores de citocina. Estos deberían ser útiles como reactivos terapéuticos en circunstancias apropiadas.

Con frecuencia, los reactivos para ensayos de diagnóstico se suministran en kits, para optimizar de esta forma la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo y el marcador, se proporciona el anticuerpo marcado o no marcado, o el ligando marcado. Esto se realiza normalmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señales, tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el kit contendrá también instrucciones para su uso apropiado y para la eliminación de los contenidos después del uso. Típicamente el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil, y contendrá instrucciones para el uso apropiado y para la eliminación de los reactivos. De forma deseable, se proporcionan los reactivos como un polvo liofilizado seco, donde se pueden reconstituir los reactivos en un medio acuoso con las concentraciones apropiadas para realizar el ensayo.

Los constituyentes mencionados de los ensayos de diagnóstico se pueden utilizar sin modificación o se pueden modificar en una serie de formas. Por ejemplo, se puede conseguir la aplicación de una marca mediante la unión covalente o no covalente de un resto que proporciona, de forma directa o indirecta, una señal detectable. En muchos de estos ensayos, un compuesto de ensayo, el receptor de la citocina, o los anticuerpos contra éste se pueden marcar directa o indirectamente. Las posibilidades para marcar directamente incluyen los grupos de marcadores: radiomarcadores tales comoI, enzimas (patente de Estados Unidos No. 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de Estados Unidos No.3.940.475) capaces de monitorizar el cambio de la intensidad de fluorescencia, cambio de la longitud de onda, o polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para marcar indirectamente incluyen la biotinilación de un constituyente, seguida por la unión a avidina acoplada con uno de los anteriores grupos de marcadores.

También existen numerosos métodos para separar el ligando unido del ligando libre o, como alternativa, el compuesto de ensayo unido del compuesto de ensayo libre. El receptor de citocina se puede inmovilizar sobre diversas matrices, seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos, tales como una placa de ELISA, filtros, y perlas. Los métodos para inmovilizar el receptor sobre una matriz incluyen, sin limitación, la adhesión directa al plástico, el uso de un anticuerpo de captura, el acoplamiento químico, y la biotina-avidina. La última etapa en esta estrategia implica la precipitación del complejo de anticuerpo/antígeno mediante cualquiera de una serie de métodos, incluyendo los que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico, tal como polietilenglicol, o una sal, tal como sulfato de amonio. Otras técnicas adecuadas de separación incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables del anticuerpo con fluoresceína descrito en Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30(9):1457 1461, y la separación de partículas magnéticas del anticuerpo doble como se describe en la patente de Estados Unidos No. 4.659.678.

Los métodos para ligar las proteínas o fragmentos a diferentes marcas han sido descritos a fondo en la bibliografía y no requieren un análisis detallado en esta memoria. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados, mediante el uso de carbodiimida o de ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres por reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo, o una olefina activada, tal como maleimida, para el enlace, o similares. Las proteínas de fusión se pueden utilizar también en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas tomadas de la secuencia de un receptor de citocina. Estas secuencias se pueden usar como sondas para detectar los niveles del respectivo receptor de citocina en pacientes sospechosos de tener un trastorno inmunológico. La preparación de las secuencias de nucleótidos de ambos, RNA y DNA, el marcado de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y análisis en la bibliografía. Normalmente, una sonda oligonucleotídica debe tener al menos aproximadamente 14 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas polinucleotídicas pueden tener hasta varias kilobases. Se pueden emplear diversos marcadores, de forma más habitual radionúclidos, en particular ^{32}P. Sin embargo, se pueden emplear también otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina actúa entonces como el sitio de unión para la avidina o los anticuerpos, que pueden ser marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, fluoróforos, enzimas o similares. Como alternativa, se pueden emplear anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyen dúplex de DNA, dúplex de RNA, dúplex híbridos de DNA-RNA, o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos, a su vez, se pueden marcar y el ensayo se realiza cuando el dúplex está unido a una superficie, de forma que tras la formación del dúplex sobre la superficie se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas contra el nuevo RNA antisentido se puede llevar a cabo con técnicas convencionales, tales como la hibridación de ácidos nucleicos, el cribado de más y menos, la utilización de sondas de recombinación, la traducción permitida por hibridación (HRT), y la traducción impedida por hibridación (HART). Esto incluye también técnicas de amplificación, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se contemplan también los kits de diagnóstico que comprueban también la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. La diagnosis o la prognosis pueden depender de la combinación de múltiples indicaciones utilizadas como marcadores. Por tanto, los kits pueden comprobar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97. La detección de variaciones polimórficas, que pueden reflejar diferencias funcionales en la señalización del receptor, puede ser útil para determinar la estrategia terapéutica. Las variaciones que reflejan una mayor o menor respuesta al ligando pueden permitir la formación de subconjuntos de grupos de pacientes sensibles/no sensibles.

VIII. Utilidad terapéutica

Esta invención proporciona reactivos con importante valor terapéutico. Véase, por ejemplo, Levitzki (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8:239-244. Los receptores de citocina (naturales o recombinantes), los fragmentos de los mismos, receptores de muteína, y anticuerpos, junto con los compuestos identificados como poseedores de afinidad de unión a los receptores o anticuerpos, deben ser útiles en el tratamiento de enfermedades que presentan una expresión anormal de los receptores o sus ligandos. Dicha anormalidad se manifestará típicamente por trastornos inmunológicos. Véase el documento WO 01/18051. Adicionalmente, esta invención puede proporcionar valor terapéutico en diferentes enfermedades o trastornos asociados con la expresión anormal o el desencadenamiento anormal de una respuesta al ligando. Por ejemplo, se ha sugerido que el ligando p40/IL B30 está implicado en el desarrollo de la inmunidad mediada por las células, por ejemplo, actividad anti-tumoral, inmunidad humoral y celular creciente, y efectos antivirales. En particular, el ligando parece que activa las células NK y T. La terapia puede ser combinada con IL-18, IL-12, TNF, IFN\gamma, radiación/quimioterapia, adyuvantes, o compuestos antitumorales, antivirales, o antifúngicos.

Inversamente, los antagonistas, que se pueden combinar con antagonistas de TNF, IFN\gamma, IL-18, o IL-12, o con IL-10 o esteroides, pueden estar indicados en enfermedades crónicas mediadas por Th1, autoinmunidad, o situaciones de transplante y/o rechazo, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, osteoartritis, o enfermedades inflamatorias del intestino. Los antagonistas pueden tomar la forma de anticuerpos frente a las subunidades del receptor, construcciones solubles del receptor, o ácidos nucleicos antisentido para una o más de las del subunidades del receptor. La comparación del ligando p40/IL-B30 con las subunidades DCRS5 y IL-12R\beta1 del receptor proporciona una idea de las indicaciones para el uso de los agonistas y antagonistas.

Terapéuticamente, basados en las actividades de p40/IL-B30 descritas, los antagonistas de la citocina pueden ser activados, por ejemplo, mediante DCRS5 soluble, con o sin IL-12R\beta1 soluble, o mediante anticuerpos frente a cualquier subunidad del receptor. Los antagonistas pueden ser útiles como inhibidores de respuestas inmunitarias o infamatorias indeseables para dirigirse a las células T de memoria, o en combinación con los antagonistas de IL-12/IL-12R, u otros anti-inflamatorios o inmunodepresores. Las indicaciones clínicas pueden ser la inflamación crónica o las situaciones de transplante. Diferentes polimorfismos pueden aumentar o reducir la función del receptor, y si fueran dominantes, podrían ser útiles como compuestos terapéuticos. La identificación de tales variantes puede permitir la división en subconjuntos de grupos de pacientes sensibles o no sensibles. Los reactivos pueden ser útiles como reactivos detectores o marcadores o reactivos ablativos para las células T de memoria y/o para las células NK.

La terapia génica puede hacer que la respuesta deseada de las poblaciones de células frente al ligando p40/IL-B30, por ejemplo, como adyuvantes para la inmunoterapia tumoral, facilite la activación de los linfocitos, células T, o células NK que se infiltran en el tumor. Se pueden aplicar estrategias antisentido, por ejemplo, para evitar la receptividad del receptor.

Se conocen varias condiciones anormales en tipos de células que se ha demostrado que producen mRNA de ambos IL-12 p40 y/o IL-B30 mediante análisis de transferencia Northern. Véase Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; y Weatherall, et al. (eds.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Otras muchas condiciones médicas y enfermedades serán sensibles al tratamiento por uno de los agonistas o antagonistas proporcionados en esta memoria. Véase, por ejemplo, Stites and Terr (eds.; 1991) Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; y Samter, et al. (eds.) Immunological Diseases Little, Brown and Co. Otras indicaciones similares para tratamiento incluyen la reestructuración ósea, la disfunción sexual, prevención de enfermedades neurodegenerativas, demencia, estrés, y otras. Estos problemas deberían ser susceptibles de prevención o tratamiento usando las composiciones proporcionadas en esta memoria.

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Los receptores recombinantes de citocina, muteínas, anticuerpos agonistas o antagonistas de los mismos, o anticuerpos, se pueden purificar y después administrar a un paciente. Estos reactivos se pueden combinar para su uso terapéutico con ingredientes activos adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes convencionales farmacéuticamente aceptables, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser estériles, por ejemplo filtradas y puestas en formas farmacéuticas, tales como viales dosificados por liofilización, o ser conservadas en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión que no se unen al complemento.

Se puede realizar el cribado del ligando utilizando el receptor de citocina o sus fragmentos, para identificar las moléculas que tienen afinidad de unión a los receptores. Se pueden utilizar entonces posteriores ensayos biológicos para determinar si un ligando putativo puede proporcionar una unión competitiva, que pueda bloquear la actividad estimuladora intrínseca. Se pueden utilizar los fragmentos del receptor como bloqueantes o antagonistas porque bloquean la actividad del ligando. Asimismo, un compuesto que tiene actividad estimulante intrínseca puede activar el receptor y es por tanto un agonista porque estimula la actividad del ligando, por ejemplo, induciendo la señalización. Esta invención contempla también el uso terapéutico de anticuerpos frente a los receptores de citocina como antagonistas.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, la vida fisiológica del reactivo, la vida farmacológica, el estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. Por tanto, se deben valorar las dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. De forma típica, las dosis utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil para la cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo con animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos concretos proporcionará más indicaciones predictivas de la dosificación en seres humanos. Se describen varias consideraciones, por ejemplo, en Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para la administración se analizan en estos textos y más adelante, por ejemplo para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, la difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Debido a las cifras similares de unión de alta afinidad, o de renovación, entre un ligando putativo y sus receptores, se debe esperar inicialmente que sean eficaces dosis bajas de estos reactivos. Y la ruta de señalización da a entender que cantidades extremadamente bajas de ligando pueden tener efecto. Por lo tanto, se espera normalmente que los intervalos de dosificación estarán en unas cantidades menores que concentraciones 1 mM, de forma típica menores que concentraciones aproximadamente 10 \muM, normalmente menores que aproximadamente 100 nM, preferiblemente menores que aproximadamente 10 pM (picomolar), y lo más preferiblemente menores que aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo apropiado. A menudo se utilizarán formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, para la administración continua.

Los receptores de citocinas, sus fragmentos, y los anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, se pueden administrar directamente al hospedante que se va a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede resultar deseable conjugarlos con proteínas portadoras, tales como ovoalbúmina o seroalbúmina, antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en muchas formulaciones de dosificación convencionales. Cuando sea posible que el ingrediente activo se administre solo, resulta preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden al menos un ingrediente activo, como se ha definido anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo debe ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable, en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las que son adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en formas de dosificación unitarias y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Véase, por ejemplo, Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. La terapia de esta invención se puede combinar o usar en asociación con otros agentes terapéuticos, particularmente agonistas o antagonistas de otros miembros de la familia de receptores de citocina.

IX. Cribado

Se puede realizar el cribado de fármacos utilizando DCRS5 o sus fragmentos, para identificar los compuestos que tienen afinidad de unión para la subunidad del receptor, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Se pueden emplear entonces ensayos biológicos posteriores para determinar si el compuesto tiene actividad estimuladora intrínseca y es por tanto, un bloqueante o antagonista porque bloquea la actividad del ligando.

Además, el emparejamiento del ligando p40/IL-B30 con el receptor funcional de DCRS3 IL-12R\beta1, permite el cribado de los antagonistas y agonistas con un control positivo de la señalización. Se puede realizar el cribado de pequeñas moléculas o anticuerpos.

Un método de cribado de fármacos utiliza células hospedantes eucariotas o procariotas que están transformadas establemente con las moléculas de DNA recombinante que expresan el DCRS5 en combinación con otra subunidad del receptor de citocina, por ejemplo, IL-12R\beta1. Se cree que la señalización utiliza STAT4. Se pueden aislar células que expresan un receptor en aislamiento de otros receptores funcionales. Estas células, ya sea en forma viable o en forma fijada, se pueden utilizar para ensayos estándar de unión anticuerpo/antígeno o ligando/receptor. Véase, también, Parce, et al. (1989), Science, 246:243-247; y Owicki, et al. (1990)1, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar la respuesta celular. Los ensayos competitivos son particularmente útiles, donde las células se ponen en contacto y se incuban con un anticuerpo o receptor marcado que tenga una afinidad conocida de unión por el ligando, tal como un ^{125}I-anticuerpo, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión por la composición de unión se va a medir. Las composiciones de unión marcadas unidas y libres, se separan entonces para evaluar el grado de unión al ligando. La cantidad de compuesto de ensayo unido es inversamente proporcional a la cantidad de unión del receptor marcado con la fuente conocida. Se pueden utilizar muchas técnicas para separar el ligando unido del ligando libre para evaluar el grado de unión del ligando. Esta etapa de separación puede implicar, de forma típica, un procedimiento tal como la adhesión a filtros seguida de lavado, la adhesión a plástico seguida de lavado, o la centrifugación de las membranas celulares. También se pueden utilizar células viables para cribar los efectos de los fármacos sobre las funciones mediadas por las citocinas, por ejemplo, señalización por STAT4 y otras. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo, un sistema de detección sensible a la proximidad.

El amplio alcance de esta invención se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten la invención a las realizaciones específicas.

Ejemplos I. Métodos generales

Algunos de los métodos estándar están descritos o referenciados, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; o Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía en columna, la electroforesis, la centrifugación, la cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Coligan, et al. (ed. 1996) y suplementos periódicos, Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y la bibliografía de los fabricantes sobre el uso de productos de purificación de las proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión con segmentos apropiados, por ejemplo, con una secuencia FLAG o un equivalente que pueda ser fusionado, por ejemplo, a través de una secuencia escindible por las proteasas. Véase, por ejemplo, Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Se realiza un análisis de las secuencias por ordenador, por ejemplo, utilizando programas disponibles de software, incluyendo los procedentes de GCG (U. Wisconsin) y GenBank. Se utilizaron también las bases de datos de secuencias, públicas, por ejemplo, de GenBank y otros.

Muchas técnicas aplicables a los receptores de IL-10 se pueden aplicar al DCRS5, como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 5.789.192 (receptor de IL-10 ).

II. Clonación funcional

Se observó que el anticuerpo anti-hIL-12R\beta1 bloqueaba las respuestas de las células T humanas al p40/IL-B30, y al p40/IL-B30 unido a IL-12R\beta1. Esto dio a entender que IL-12R\beta1 era una subunidad del complejo del receptor para p40/IL-B30.

Se identificó una población de células T que respondían a p40/IL-B30 pero no a IL-12, y otra población que respondía a IL-12 pero no a p40/IL-B30. En adición, se observó que las células Ba/F3 que expresan mIL-12R\beta1 y mIL-12R\beta2 recombinantes respondían a IL-12, pero no a p40/IL-B30. Estos resultados indicaron de forma colectiva que el complejo del receptor para p40/IL-B30 contenía el IL-12R\beta1 y al menos otra subunidad que no era IL-12R\beta2. Por consiguiente se ideó una estrategia de clonación por expresión para aislar este segundo componente del receptor.

Se preparó una genoteca de cDNA a partir de mRNA aislado de las células Kit225, una línea de células T humanas dependientes de IL-2 que responde tanto a IL-12 como a p40/IL-B30. La genoteca de cDNA se preparó utilizando un vector de expresión retroviral, pMX. Se infectaron las células Ba/F3 que expresan hIL-12R\beta1 recombinante con esta genoteca de cDNA, se dejó que se recuperaran durante 3-4 días en IL-3, después se lavaron y se pusieron en placas a \sim15.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos en un medio que contiene 50 ng/ml de hiper-hp40/hIL-B30. Véase el documento WO 01/18051. Se suplementaron los cultivos cada \sim5 días con hiper-hp40/hIL-B30 adicional. Después de aproximadamente dos semanas, 5-10 % de los pocillos presentaron crecimiento celular. Se recuperaron las células de cada pocillo, se extendieron individualmente en cultivos más grandes en hiper-hp40/hIL-B30, y se ensayaron en cuanto a la dependencia del crecimiento de hiper-hp40/hIL-B30.

Las células que eran dependientes de p40/IL-B30 para el crecimiento se analizaron por PCR para insertos de cDNA retroviral. De los más de 40 aislados analizados, todos menos uno contenían los cDNA que codifican el nuevo receptor DCRS5. Se clonó este cDNA humano candidato en un vector de expresión y se transfectó a células Ba/F3 que expresan hIL-12R\beta1. Estas células se convirtieron en sensibles al p40/IL-B30; por tanto se llegó a la conclusión de que el nuevo cDNA codificaba el DCRS5 deseado, funcionalmente una subunidad del receptor IL-B30.

III. Características del DCRS5 de longitud completa; Localización cromosómica

El dominio citoplásmico de DCRS5 no está en general estrechamente relacionado con otros dominios citoplásmicos de los receptores de citocina, una observación común en esta familia de moléculas. El dominio citoplásmico contiene siete restos tyr, tres de los cuales al menos son parte de motivos de unión de SH2 reconocibles: YEDI, YKPQ, y YFPQ. El motivo YEDI es similar a los sitios de unión identificados para la tirosina-fosfatasa shp2. Los dos últimos motivos son muy similares a las secuencias que se sabe que se unen a Stat1/Stat3, o Stat3, respectivamente. El motivo YKPQ, junto con las secuencias flanqueantes cercanas, también se parece hasta cierto punto a los motivos de Stat4 e IL-12R\beta2 que se sabe que se unen a Stat1-3. Esto es consistente con los datos preliminares que sugieren que el p40/IL-B30, como la IL-12, activa Stat4.

Los cebadores de la PCR derivados de la secuencia de DCRS5 se utilizan para explorar una genoteca de cDNA humano. Las secuencias se pueden derivar, por ejemplo, de la Tabla 1, preferiblemente las adyacentes a los extremos de las secuencias. Los cDNA de longitud completa para DCRS5 de primates, roedores, o de otras especies son clonados, por ejemplo, mediante cribado de la hibridación de DNA del fago \lambdagt10. Las reacciones de la PCR se llevan a cabo utilizando DNA-polimerasa de T. aquaticus, Taqplus (Stratagene) en condiciones apropiadas.

Se preparan extensiones de cromosomas. Se realiza la hibridación in situ en preparaciones de cromosomas obtenidos de linfocitos humanos estimulados por fitohemaglutinina cultivados durante 72 h. Se añadió 5-bromodesoxiuridina durante las últimas siete horas de cultivo (60 \mug/ml de medio), para asegurar unas bandas de cromosomas post-hibridación de buena calidad.

Un fragmento de la PCR, amplificado con la ayuda de cebadores, es clonado en un vector apropiado. Se marca el vector mediante desplazamiento de mella (nick-translation) con ^{3}H. La sonda radiomarcada se hibrida con extensiones en metafase a una concentración final de 200 ng/ml de solución de hibridación como se describe en Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331.

Después de recubrimiento con emulsión de pista nuclear (KODAK NTB2), se exponen los portaobjetos. Para evitar cualquier deslizamiento de granos de plata durante el procedimiento de formación de bandas, las extensiones de cromosomas se tiñen en primer lugar con solución de Giemsa tamponada y se fotografían en metafase. Se forman entonces bandas R mediante el método de fluorocromo-fotolisis-Giemsa (FPG) y se fotografían de nuevo las metafases antes del análisis.

Se utilizan métodos similares apropiados para otras especies.

IV. Localización de mRNA de DCRS5

Se adquirieron de Clontech (Palo Alto, CA), tejido múltiple humano (Cat# 1, 2) y transferencias de líneas celulares cancerosas (Cat# 7757-1), que contienen aproximadamente 2 \mug de poli (A) ^{+}RNA por pista. Se radiomarcan las sondas con [\alpha-^{32}P] dATP, por ejemplo, utilizando el kit marcador de cebador aleatorio de Amersham Rediprime (RPN1633). Se realizan la prehibridación y las hibridaciones, por ejemplo, a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 0,5 M (pH 8,0). Se realizan lavados rigurosos, por ejemplo, a 65ºC con dos lavados iniciales de 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 40 min seguido por un lavado posterior de 0,1 x SSC, SDS al 0,1% durante 20 min. Se exponen entonces las membranas a -70ºC a una película de Rayos X (Kodak) en la presencia de pantallas de intensificación. Se realizan estudios más detallados mediante transferencias Southern de la genoteca de cDNA con clones apropiados seleccionados de DCRS5 humano para examinar su expresión en subconjuntos hemopoyéticos o de otras células.

Alternativamente, se seleccionan dos cebadores apropiados de la Tabla 1. Se utiliza la RT-PCR sobre una muestra apropiada de mRNA seleccionada por la presencia de mensaje para producir un cDNA, por ejemplo, una muestra que expresa el gen.

Se pueden aislar clones de longitud completa mediante hibridación de genotecas de cDNA a partir de tejidos apropiados preseleccionados por la señal de la PCR. Se pueden realizar transferencias Northern.

El mensaje de los genes que codifican DCRS5 será comprobado por tecnología apropiada, por ejemplo, PCR, inmunoensayo, hibridación, o de otra manera. Están disponibles preparaciones de cDNA de tejidos y órganos, por ejemplo, de Clontech, Mountain View, CA. La identificación de fuentes de expresión natural son útiles, como se ha descrito. Y la identificación del emparejamiento de la subunidad funcional del receptor permite la predicción de qué células expresan la combinación de las subunidades del receptor que darán como resultado una receptividad fisiológica para cada uno de los ligandos de citocina.

\newpage

Para la distribución en ratón, se puede realizar por ejemplo, análisis Southern: se digirió DNA (5 \mug) procedente de una genoteca primaria de cDNA amplificado con enzimas de restricción apropiadas para liberar los insertos, se hizo un recorrido sobre gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nilón (Schleicher and Schuell, Keene, NY).

Las muestras para aislamiento de mRNA de ratón pueden incluir: línea celular L fibroblástica de ratón en reposo (C200); células transfectadas con Braf:ER (fusión de Braf con el receptor de estrógenos), control (C201); células T, polarizadas a TH1 (Mell4 brillante, células CD4+ del bazo, polarizadas durante 7 días con IFN-\gamma y anti IL-4; T200); células T, polarizadas a TH2 (Mell4 brillante, células CD4+ del bazo, polarizadas durante 7 días con IL-4 y anti IFN-\gamma; T201); células T, altamente polarizadas a TH1 (véase Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 h y reunidas; T202); células T, altamente polarizadas a TH2 (véase Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 h y reunidas; T203); células pre T CD44-CD25+, separadas del timo (T204); clon D1.1 de la célula T TH1, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T205); clon D1.1 de la célula T TH1, estimulado con 10 \mug/ml de ConA durante 15 h (T206); clon CDC35 de la célula T TH2, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T207); clon CDC35 de la célula T TH2, estimulado con 10 \mug/ml de ConA durante 15 h (T208); células T Mell4+ nativas del bazo, en reposo (T209); células T Mell4+, polarizadas a Th1 con IFN-\gamma/IL-12/anti-IL-4 durante 6, 12, 24 h y reunidas (T210); células T Mell4+, polarizadas a Th2 con IL-4/anti-IFN-\gamma durante 6, 13, 24 h y reunidas (T211); línea celular A20 de la leucemia de células B maduras no estimuladas (B200); línea celular CH12 de células B no estimuladas (B201); células B grandes, no estimuladas, del bazo (B202); células B del bazo total, activadas con LPS (B203); células dendríticas enriquecidas con metrizamida procedentes del bazo, en reposo (D200); células dendríticas procedentes de la médula ósea, en reposo (D201); línea celular de monocitos RAW 264.7 activada con LPS durante 4 h (M200); macrófagos de la médula ósea derivados con GM y M-CSF (M201); línea celular de macrófagos J774, en reposo (M202); línea celular de macrófagos J774 + LPS + anti-IL-10 reunidas a las 0,5, 1, 3, 6, 12 h (M203); línea celular de macrófagos J774 + LPS + IL-10 reunidas a las 0,5, 1, 3, 5, 12 h (M204); tejido pulmonar de ratón expuesto a aerosol, cebadores Th2, exposición a OVA en aerosol reunidos a las 7, 14, 23 h (véase Garlisi, et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75:75-83; X206); tejido pulmonar infectado con nippostrongulus (véase Coffman, et al. (1989) Science 245:308-310; X200); pulmón total adulto, normal (0200); pulmón total, rag-1 (véase Schwarz, et al. (1993) Immunodeficiency 4:249-252; 0205); IL-10 K.O. de bazo (véase Kuhn, et al. (1991) Cell 75:263-274; X201); bazo total adulto, normal (0201); bazo total, rag-1 (0207); IL-10 K.O. parches de Peyer (0202); parches totales de Peyer, normales (0210); IL-10 K.O. nódulos linfáticos mesentéricos (X203); nódulos linfáticos mesentéricos totales, normales (O211); IL-10 K.O. colon (X203); colon total, normal (0212); páncreas de ratón NOD (véase Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205); timo total, rag-1 (0208); riñón total, rag-1 (0209); corazón total, rag-1 (0202); cerebro total, rag-1 (0203); testículos totales, rag-1 (0204); hígado total, rag-1 (0206); tejido articular de rata normal (0300); y tejido articular de rata artrítica (X300).

Las muestras para aislamiento de mRNA humano pueden incluir: células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T, células NK, granulocitos, células B), en reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 h y reunidas (T101); células T, clon Mot 72 de TH0, en reposo (T102); células T, clon Mot 72 de TH0, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h y reunidas (T103); células T, clon Mot 72 de TH0, anérgicas tratadas con péptido específico durante 2, 7, 12 h y reunidas (T104); células T, clon HY06 de TH1, en reposo (T107); células T, clon HY06 de TH1, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h y reunidas (T108); células T, clon HY06 de TH1, anérgicas tratadas con péptido específico durante 2, 6, 12 h y reunidas (T109); células T, clon HY935 de TH2, en reposo (T110); células T, clon HY935 de TH2, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 2, 7, 12 h y reunidas (T111); células T polarizadas a células CD4+CD45RO-T 27 días en anti-CD28, IL-4, y anti IFN-\gamma, polarizadas a TH2, activadas con anti-CD3 y anti-CD28 4 h (T116); líneas de células T tumorales Jurkat and Hut78, en reposo (T117); clones de células T, reunidos en AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, en reposo (T118); células T aleatorias \gamma clones de células T \delta, en reposo (T119); esplenocitos, en reposo (B100); esplenocitos, activados con anti-CD40 y IL-4 (B101); líneas de células B EBV reunidas en WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, en reposo (B102); línea celular B JY, activada con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunidas (B103); clones NK 20 reunidos, en reposo (K100); clones NK 20 reunidos, activados con PMA y ionomicina durante 6 h (K101); clon NKL, derivado de la sangre periférica de un paciente de leucemia LGL, tratado con IL-2 (K106); clon citotóxico NK 640-A30-1, en reposo (K107); línea precursora hematopoyética TF1, activada con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunida (C100); línea premonocítica U937, en reposo (M100); línea premonocítica U937, activada con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunida (M101); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h y reunidos (M102); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h y reunidos (M103); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 4, 16 h y reunidos (M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 4, 16 h y reunidos (M107); monocitos elutriados, activados con LPS durante 1 h (M108); monocitos elutriados, activados con LPS durante 6 h (M109); DC con 70 % de CD1a+, procedentes de CD34+ GM-CSF, 12 días con TNF\alpha, en reposo (D101); DC con 70 % de CD1a+, procedentes de CD34+ GM-CSF, 12 días con TNF\alpha, activadas con PMA y ionomicina durante 1 h (D102); DC con 70 % de CD1a+, de CD34+ GM-CSF, 12 días con TNF\alpha, activadas con PMA y ionomicina durante 6 h (D103); DC con 95 % de CD1a+, procedentes de CD34+ GM-CSF, 12 días con TNF\alpha separadas por FACS, activadas con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunidas (D104); DC con 95 % de CD14+, procedentes de CD34+ GM-CSF, 12 días con TNF\alpha separadas por FACS, activadas con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunidas (D105); DC con CD1a+ CD86+, procedentes de CD34+ GM-CSF, 12 días con TNF\alpha separadas por FAC, activadas con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunidas (K106); DC procedentes de los monocitos GM-CSF, 5 días con IL-4, en reposo (D107); DC procedentes de los monocitos GM-CSF, 5 días con IL-4, en reposo (D108); DC procedentes de los monocitos GM-CSF, 5 días con IL-4, activadas con LPS 4, 16 h y reunidas (D109); DC procedentes de los monocitos GM-CSF, 5 días con IL-4, activadas con TNF\alpha, monocitos supe durante 4, 16 h y reunidas (D110); tumor benigno leiomioma L11 (X101); miometrio normal M5 (0115); leiomiosarcoma maligno GS1 (X103); línea del sarcoma de fibroblastos de pulmón MRC5, activadas con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunidas (C101); línea celular del carcinoma epitelial de riñón CHA, activadas con PMA y ionomicina durante 1, 6 h y reunidas (C102); riñón fetal de macho de 28 semanas (O100); pulmón fetal de macho de 28 semanas (O101); hígado fetal de macho de 28 semanas (O102); corazón fetal de macho de 28 semanas (O103); cerebro fetal de macho de 28 semanas (O104); vesícula fetal de macho de 28 semanas (O106); intestino delgado fetal de macho de 28 semanas (O107); tejido adiposo fetal de macho de 28 semanas (O108); ovario fetal de hembra de 25 semanas (O109); útero fetal de hembra de 25 semanas (O110); testículo fetal de macho de 28 semanas (O111); bazo fetal de macho de 28 semanas (O112); placenta adulta de 28 semanas (O113); y amígdalas inflamadas, de 12 años de edad (X100).

Se pueden aislar muestras similares de otras especies para evaluación.

V. Clonación de especies homólogas de DCRS5

Se utilizan diferentes estrategias para obtener especies homólogas del DCRS5, preferiblemente de otros primates o roedores. Un método es mediante hibridación cruzada utilizando sondas de DNA de especies estrechamente relacionadas. Puede ser útil ir a especies evolucionalmente similares como etapas intermedias. Otro método es utilizar cebadores específicos de la PCR basados en la identificación de bloques de similitud o diferencias entre genes, por ejemplo, áreas de la secuencia de polipéptidos o nucleótidos altamente conservadas o no conservadas.

Las búsquedas en las bases de datos pueden identificar secuencias similares y permitir la producción de sondas apropiadas.

VI. Producción de la proteína DCRS5 de mamífero

Se prepara por ingeniería genética una construcción de fusión apropiada, por ejemplo, GST, para expresión, por ejemplo, en E. coli. Por ejemplo, se construye un plásmido pGex de IGIF de ratón y se transforma en E. coli. Se cultivan células recientemente transformadas, por ejemplo, en medio LB que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y se provocan con IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Después de inducción durante la noche, se recogen las bacterias y se aíslan los sedimentos que contienen la proteína DCRS5. Se homogenizan los sedimentos, por ejemplo, en 2 litros de solución tampón TE ( Tris-base 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM y pefabloc 2 mM ). Se pasa este material tres veces a través de un microfluidificador (Microfluidics, Newton, MA). El sobrenadante fluidificado se centrifuga en un rotor Sorvall GS-3 durante 1 h a 13.000 rpm. El sobrenadante resultante que contiene la proteína del receptor de citocina se filtra y se pasa sobre una columna de glutatión-SEPHAROSE equilibrada en Tris-base 50 mM a pH 8,0. Las fracciones que contienen la proteína de fusión DCRS5-GST se reúnen y se escinden, por ejemplo, con trombina (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). El conjunto escindido se pasa entonces sobre una columna de Q-SEPHAROSE equilibrada en Tris-base 50 mM. Las fracciones que contienen DCRS5 se reúnen y se diluyen en H_{2}O destilada fría, para bajar la conductividad, y se vuelven a pasar sobre una columna reciente de Q-Sepharose, sola o en sucesión con una columna de inmunoafinidad para anticuerpos. Las fracciones que contienen la proteína DCRS5 se reúnen, se dividen en alícuotas, y se conservan en el refrigerador a -70ºC.

La comparación del espectro CD con la proteína del receptor de citocina puede dar a entender que la proteína está correctamente plegada. Véase Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem. 264:1689-1693.

VII. Preparación de anticuerpos específicos para DCRS5

Se inmunizan ratones endogámicos Balb/c intraperitonealmente con formas recombinantes de la proteína, por ejemplo, DCRS5 purificado o células NIH-3T3 estables transfectadas. Los animales reciben dosis de refuerzo, en puntos apropiados de tiempo, de proteína, con o sin adyuvante adicional, para estimular adicionalmente la producción de anticuerpos. Se reúne el suero, o los hibridomas producidos con los bazos recogidos.

Alternativamente, los ratones Balb/c se inmunizan con células transformadas con el gen o sus fragmentos, bien células endógenas o exógenas, o bien con membranas aisladas enriquecidas para la expresión del antígeno. Se recoge el suero en el tiempo apropiado, típicamente después de numerosas administraciones adicionales. Pueden ser útiles varias técnicas de terapia génica, por ejemplo, para producir la proteína in situ, para generar una respuesta inmunitaria. Las preparaciones de suero o anticuerpo se pueden absorber de forma cruzada o se pueden inmunoseleccionar para preparar anticuerpos sustancialmente purificados de especificidad definida y de alta afinidad.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se fusionan los esplenocitos con un compañero de fusión apropiado y se seleccionan los hibridomas en un medio de crecimiento por procedimientos estándar. Los sobrenadantes de hibridoma se someten a cribado en cuanto a la presencia de anticuerpos que se unen al DCRS5, por ejemplo, por ELISA u otro ensayo. También se pueden seleccionar o preparar los anticuerpos que reconocen específicamente las realizaciones concretas de DCRS5.

En otro método, se presentan péptidos sintéticos o proteínas purificadas a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (ed. 1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow and Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. En situaciones apropiadas, el reactivo de unión o bien se marca como se ha descrito antes, por ejemplo, por fluorescencia o de otra manera, o bien se inmoviliza en un sustrato para métodos panning. Los ácidos nucleicos pueden ser introducidos también en células de un animal para producir el antígeno, que sirve para provocar una respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo, Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:4156-4160; Barry, et al. (1994) BioTechniques 16:616-619; y Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135.

VIII. Producción de proteínas de fusión con DCRS5

Se preparan diferentes construcciones de fusión con DCRS5, incluyendo realizaciones que combinan estas con la secuencia de IL-12R\beta1. Una porción del gen apropiado se fusiona a una marca (tag) del epítopo, por ejemplo, una marca FLAG, o a una construcción de un sistema de dos híbridos. Véase, por ejemplo, Fields and Song (1989) Nature 340:245-246.

Se puede utilizar la marca del epítopo en un procedimiento de clonación de expresión con detección con anticuerpos anti-FLAG para detectar un compañero de unión, por ejemplo, un ligando para el respectivo receptor de citocina. El sistema de dos híbridos se puede utilizar también para aislar proteínas que se unen específicamente a DCRS5.

IX. Relación entre estructura y actividad

Se determina la información sobre la presencia crítica de restos concretos utilizando procedimientos y análisis convencionales. Se realiza un análisis de mutagénesis convencional, por ejemplo, generando muchas variantes diferentes en posiciones determinadas, por ejemplo, en las posiciones identificadas anteriormente, y evaluando las actividades biológicas de las variantes. Esto se puede realizar hasta el punto de determinar las posiciones que modifican la actividad, o se puede enfocar sobre posiciones específicas para determinar los restos que pueden ser sustituidos para mantener, bloquear o modular una actividad biológica.

Como alternativa, el análisis de las variantes naturales puede indicar qué posiciones toleran las mutaciones naturales. Esto puede resultar del análisis poblacional de la variación entre individuos, o a través de razas o especies. Se analizan muestras procedentes de individuos seleccionados, por ejemplo, mediante análisis de PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de los polimorfismos poblacionales.

X. Coexpresión de DCRS5 y IL-12R\beta1

Un vector, o vectores, que codifican los respectivos genes pueden ser transfectados a una célula. Preferiblemente, tal vector tendrá marcadores de selección para identificar las células que han sido transformadas satisfactoriamente. La coexpresión de los dos genes permitirá que los productos génicos se asocien apropiadamente para formar complejos de receptor activos.

Alternativamente, está disponible el uso de métodos que producen la asociación de dímeros funcionales. Véase, por ejemplo, O'Shea, et al. (1989) Science 245:646-648; Kostelny, et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553; y Patel, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:30386-30391. La expresión de dominios extracelulares, y asociación física, por ejemplo, dirigida por afinidad de leucina zipper Fos/Jun, dará como resultado construcciones de unión al ligando que deberían actuar como compuestos de unión para usos de diagnóstico o terapéuticos.

Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin separarse de su espíritu y alcance, como debe ser evidente para los expertos en la técnica. Las realizaciones específicas descritas en esta memoria se ofrecen sólo a modo de ejemplo, y la invención tiene que ser limitada por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes autorizados por dichas reivindicaciones. y la invención no tiene que ser limitada por las realizaciones específicas que han sido presentadas aquí a modo de ejemplo.

<110> Schering Corporation

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<120> Proteínas de receptores de mamíferos; reactivos y métodos relacionados

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<130> DX01074

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<150> US 60/203,426

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<151> 10-05-2000

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<160> 5

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2859

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<212> DNA

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción de organismo desconocido: primate; Homo sapiens supuesto

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<220>

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<221> CDS

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<222> (119)..(2005)

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<220>

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<221> mat_péptido

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<222> (188)..(2005)

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<220>

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<221> característica_misc

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<222> (1)..(2859)

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<223> Las traducciones de Xaa dependen del código genético

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<400> 1

9

10

11

12

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<210> 2

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<211> 629

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<400> 2

14

15

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<210> 3

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<211> 1887

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<212> DNA

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<213> traducción inversa

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<220>

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<221> característica_misc

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<222> (1) .. (1887)

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<223> n puede ser a, c, g, o t

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<400> 3

16

17

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<210> 4

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<211> 918

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción de organismo desconocido: primate; Homo sapiens supuesto

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<400> 4

18

19

20

21

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<210> 5

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<211> 862

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción de organismo desconocido: primate; Homo sapiens supuesto

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<400> 5

22

23

24

Claims (36)

1. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante, que comprende al menos diez aminoácidos contiguos de la porción intracelular de la SEQ ID NO: 2.

2. Un polipéptido antigénico sustancialmente puro o recombinante, que comprende los restos de aminoácidos 1 a 606 de la SEQ ID NO: 2.

3. Un ácido nucleico aislado o recombinante, que codifica el polipéptido de la reivindicación 2.

4. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 3, que comprende los restos nucleotídicos 188-2005 de la SEQ ID NO: 1.

5. El polipéptido antigénico sustancialmente puro o recombinante de la reivindicación 2, que comprende los restos de aminoácidos 23 a 606 de la SEQ ID NO: 2.

6. Un ácido nucleico aislado o recombinante, que codifica el polipéptido de la reivindicación 5.

7. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 6, que comprende los restos nucleotídicos 119-2005 de la SEQ ID NO: 1.

8. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3.

9. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8.

10. La célula hospedante de la reivindicación 9, donde la célula hospedante es una célula de mamífero.

11. La célula hospedante de la reivindicación 9, donde la célula hospedante es una célula de insecto.

12. La célula hospedante de la reivindicación 9, donde la célula hospedante es una célula bacteriana.

13. La célula hospedante de la reivindicación 9, donde la célula hospedante es una célula de levaduras.

14. Un método para producir un polipéptido, que comprende:

a)

cultivar la célula hospedante de la reivindicación 9, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido; y

b)

aislar o purificar el polipéptido.

15. Un compuesto de unión que comprende un anticuerpo o el fragmento del mismo de unión al antígeno, que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

16. El compuesto de unión de la reivindicación 15, donde el compuesto de unión se une específicamente a un polipéptido que comprende los restos 1-606 de la SEQ ID NO: 2.

17. El compuesto de unión de la reivindicación 16, donde el compuesto de unión se une específicamente a un polipéptido que comprende los restos 356-606 de la SEQ ID NO: 2.

18. El compuesto de unión de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17, donde el compuesto de unión es un anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo que se une al antígeno.

19. El compuesto de unión de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17, donde el compuesto de unión es un fragmento Fab, Fab2, de Fv.

20. Un kit que comprende:

a)

el compuesto de unión de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17; y

b)

instrucciones para su uso.

21. Un método para producir un complejo antígeno:anticuerpo, que comprende poner en contacto el compuesto de unión de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17 con un polipéptido antigénico de la SEQ ID NO: 2 en condiciones adecuadas para la formación del complejo.

\newpage

22. Una composición heterodimérica que comprende:

a)

un polipéptido que comprende los restos de aminoácidos 1 a 606 de la SEQ ID NO: 2; y

b)

IL-12R\beta1.

23. La composición de la reivindicación 22, capaz de unirse a IL-B30/p40.

24. Un kit que comprende:

a)

un polipéptido que comprende los restos de aminoácidos 1 a 606 de la SEQ ID NO: 2; y

b)

instrucciones para su uso.

25. El kit de la reivindicación 24, que comprende además:

a)

el polipéptido IL-12R\beta1; y

b)

los polipéptidos p40 o IL-B30 o el complejo IL-B30/p40.

26. Una composición que comprende un anticuerpo antagonista o el fragmento del mismo de unión al antígeno, que se une a un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-328 de la SEQ ID NO: 2 para uso como un medicamento.

27. Una composición que comprende un anticuerpo antagonista o el fragmento del mismo de unión al antígeno, que se une a un complejo que comprende:

i)

un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-328 de la SEQ ID NO: 2; y

ii)

la porción extracelular de IL-12R\beta1

para uso como un medicamento.

28. Una composición que comprende un complejo de:

a)

un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-328 de la SEQ ID NO: 2; y

b)

la porción extracelular de IL-12R\beta1

para uso como un medicamento.

29. Una composición que comprende un ácido nucleico antisentido para un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 para uso como un medicamento.

30. Una composición que comprende un anticuerpo agonista o el fragmento del mismo de unión al antígeno, que se une a un complejo que comprende:

a)

un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-328 de la SEQ ID NO: 2; y

b)

la porción extracelular de IL-12R\beta1

para uso como un medicamento.

31. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 26-29, en combinación con un antagonista de:

a)

IL-12;

b)

IL-18;

c)

TNF; o

d)

IFN\gamma

para uso como un medicamento.

32. La composición de la reivindicación 30 en combinación con:

a)

IL-12;

b)

IL-18;

c)

TNF; o

d)

IFN\gamma

para uso como un medicamento.

33. El uso de la composición que se define en las reivindicaciones 26 o 31, en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que tiene:

a)

una enfermedad crónica mediada por Th1;

b)

esclerosis múltiple;

c)

artritis reumatoide:

d)

osteoartritis;

e)

enfermedad inflamatoria del intestino;

f)

diabetes;

g)

psoriasis;

h)

sepsis; o

i)

un transplante alogénico.

34. El uso de la composición que se define en las reivindicaciones 27, 28 o 29, en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que tiene:

a)

una enfermedad crónica mediada por Th1;

b)

esclerosis múltiple;

c)

artritis reumatoide;

d)

osteoartritis;

e)

enfermedad inflamatoria del intestino;

f)

diabetes;

g)

psoriasis;

h)

sepsis; o

i)

un transplante alogénico.

35. El uso de la composición que se define en las reivindicaciones 30 o 32, en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que tiene:

a)

una respuesta crónica a Th2;

b)

un tumor;

c)

una infección vírica;

d)

un crecimiento fúngico; o

e)

una respuesta alérgica.

36. El uso de la composición que se define en las reivindicaciones 30 o 32, en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que recibe una vacuna.