ES2310033T3 - Genes de aceite de limnanthes. - Google Patents

Abstract

Fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa que comprende un elemento seleccionado del grupo que consiste en (a) y (b) en el que (a) es un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) es un fragmento de ácido nucleico aislado que es similar en al menos un 80% a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 usando el método Clustal de alineación y los parámetros por defecto K-TUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5; o un fragmento de ácido nucleico aislado que es complementario a (a) o (b).

Description

Genes de aceite de Limnanthes.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud estadounidense provisional número 60/078.736 presentada el 20 de marzo de 1998.

Campo de la invención

Esta invención está en el campo de la biología molecular vegetal. Más específicamente, esta invención se refiere a fragmentos de ácido nucleico que codifican para enzimas implicadas en la biosíntesis de lípidos en plantas y semillas.

Antecedentes de la invención

Los medios mejorados para manipular composiciones de ácidos grasos, a partir de fuentes vegetales naturales o biosintéticas, son de primordial importancia. Por ejemplo, se desean fuentes de aceites comestibles que contengan las mínimas cantidades posibles de ácidos grasos saturados por razones dietéticas y se necesitan alternativas a las fuentes actuales de productos de aceites altamente saturados, tales como los aceites tropicales.

Los ácidos grasos se usan en las membranas vegetales y en lípidos neutros que se forman para la reserva de energía en los tejidos de semillas en desarrollo. La composición de los ácidos grasos (polaridad, longitud de cadena y grado de instauración) de una membrana determina sus propiedades físicas. Los ácidos grasos más comunes contienen 16 ó 18 carbonos (C16 o C18) con uno o más dobles enlaces. Los ácidos grasos con cadenas de carbono más largas (C20 o C22) o más cortas (C12 o C14) son inusuales tal como lo son los ácidos grasos hidroxilados y ácidos grasos con diferentes posiciones de los dobles enlaces (delta-5 o delta-6). Las plantas superiores parecen sintetizar ácidos grasos comunes a través de una ruta metabólica en los orgánulos plastídicos vegetales (es decir, cloroplastos, proplástidos u otros orgánulos relacionados) con productos intermedios unidos a proteínas que portan acilo como parte del complejo de síntesis de ácidos grasos (FAS). Las rutas implicadas en la síntesis de ácidos grasos comunes en semillas oleaginosas en desarrollo se entienden bien actualmente y son relativamente fáciles de manipular. En la biosíntesis de ácidos grasos, delta-9 acil-lípido desaturasa/delta-9 acil-CoA desaturasa introduce lo más comúnmente un doble enlace en la posición 9-delta de un ácido graso saturado C18 (es decir, la desaturación de estearoil-ACP (C18:0-ACP) para dar oleoil-ACP (C18:1-ACP)) para producir ácidos grasos monoinsaturados. Se conocen varias otras enzimas ácido graso desaturasas en plantas superiores tales como delta-6 y delta-5 desaturasas que desaturan adicionalmente ácidos grasos monoinsaturados para producir ácidos grasos poliinsaturados. Existen varios ácidos grasos monoinsaturados que se producen de forma natural con dobles enlaces en posiciones distintas del noveno carbono del grupo carboxilo de ácido graso. Por ejemplo, todos los triacilgliceroles de Limnanthes alba y varios de otros gimnospermas contienen ácidos grasos monoinsaturados con un doble enlace en la posición delta-5. Esta actividad puede catalizarse por una delta-5 desaturasa que, a diferencia de la delta-9 desaturasa que usa 18:1-CoA como sustrato para la reacción de desaturación, puede usar en cambio 20:0-CoA (Pollard, M.R. y Stumpf, P.K. (1980) Plant Physiol 66:649-655; Moreau, R.A. et al. (1981) Arch Biochem Biophys 209:376-384).

En el documento WO98/46764, se usan constructos y secuencias de ácido nucleico que codifican para ácido graso desaturasas, incluyendo delta-5 desaturasas, delta-6 desaturasas y delta-12 desaturasas, para generar plantas transgénicas, partes de plantas y células que contienen y expresan uno o más transgenes que codifican para una o más desaturasas. Los ejemplos incluyen una referencia a la expresión simultánea de delta-5 y delta-6 desaturasas de M. Alpina en Brassica napus.

Fukuchi-Mizutani et al. (número de registro de la base de datos EMBL D49385) se refiere a la expresión inducida por senescencia de un homólogo de delta-9 desaturasa en pétalos de rosa.

La hierba de la pradera "meadowfoam" (Limnanthes alba) es una planta nativa de las altitudes más altas del norte de California y el sur de Oregón. La fracción de triacilglicerol de la semilla madura está compuesta principalmente por ácidos grasos que contienen 20 ó 22 carbonos y uno o dos dobles enlaces (20:1, 22:1 y 22:2). Este doble enlace no es habitual porque está en una posición que no se encuentra normalmente en los ácidos grasos de aceites vegetales comunes: la posición delta-5. La elongasa de Limnanthes parece preferir palmitoil-CoA (16:0-CoA) como su sustrato en lugar de oleoil-CoA (18:1-delta-9-CoA), el sustrato común para las ácido graso elongasas conocidas vegetales. En Limnanthes, la 16:0-CoA se alarga para dar la 20:0-CoA y se desatura para dar 20:1-delta-5. Esto es al contrario de la formación de 20:1-delta-11 tal como en Arabidopsis o Canola en las que 18:1-delta-9 se alarga para dar 20:1-delta-11 (Pollard, M.R. y Stumpf, P.K. (1980) Plant Physiol 66:649-655). Los genes que codifican para la delta-5 desaturasa de Limnanthes y las funciones de acido graso acil elongasa no se han aislado hasta la fecha y son el objeto de la presente solicitud.

Aunque la mayoría de las plantas contienen al menos cantidades traza de ácidos grasos de cadena muy larga, la FAS no está implicada en la producción de novo de estos ácidos grasos de cadena muy larga. En su lugar los productos de la FAS se exportan desde el plástido y se convierten en derivados de acil-CoA que sirven entonces como los sustratos para el sistema de elongación de ácidos grasos (FAE). El gen implicado en la FAE de Arabidopsis se ha localizado en el locus FAE1. El aceite de jojoba consiste principalmente en ceras que son ésteres de alcoholes y ácidos grasos monoinsaturados la mayoría de los cuales contienen cadenas de ácido graso con más de 18 carbonos. La elongación para formar ácidos grasos de cadena muy larga en Arabidopsis, jojoba y semilla de colza usa malonil-CoA y acil-CoA como sustratos (Lassner, M.W. et al. (1996) Plant Cell 8:281-292). En Limnanthes, la biosíntesis de ácidos grasos 20:0 se produce predominantemente mediante una elongación de cadena de palmitato como sustrato inicial; por tanto, la enzima que cataliza esta reacción debe ser similar pero también distinta de la enzima implicada en la producción de ácidos grasos de cadena muy larga a través de la elongación de malonil-CoA.

La capacidad para manipular las rutas biosintéticas de ácidos grasos mediante ingeniería genética permitirá que se realicen cambios en la composición de ácidos grasos de aceites vegetales y/o introducir rutas completamente nuevas en semillas oleaginosas con el fin de producir biopolímeros novedosos a partir de acetil-CoA. Los aceites y ácidos grasos de Limnanthes tienen un posible uso como agentes industriales. Los estólidos son ácidos grasos oligoméricos que contienen un enlace éster secundario en la estructura principal de alquilo de los ácidos grasos. Los ácidos grasos 20:1 delta-5 presentes en el aceite de Limnanthes son útiles para la producción de poliestólidos en los que el enlace delta-5 único estabiliza el compuesto (Isbell, T. A. y Kleiman, R. (1996) J Am Oil Chem Soc 73: 1097-1107). La biodegradación de poliestólidos derivados de los ácidos grasos monoinsaturados de Limnanthes parece ser más lenta que la biodegradación de poliestólidos derivados de los aceites de soja o aceites oleicos pero la biodegradación continua con el tiempo de modo que todos los estólidos se degradan probablemente en última instancia en la naturaleza (Ehran, S. M. y Kleiman, R. (1997) J Am Oil Chem Soc 74: 605-606). Esta resistencia frente a la degradación bacteriana sugiere que los poliestólidos derivados de ácidos grasos 20:1 delta-5 producirán lubricantes, grasas, plásticos, tintas, cosméticos y tensioactivos con una larga vida en almacenamiento.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a fragmentos de ácido nucleico aislados que codifican para enzimas biosintéticas de aceites de Limnanthes. Específicamente, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa que comprende un elemento seleccionado del grupo que consiste en (a) y (b) en el que:

(a)

es un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; y

(b)

es un fragmento de ácido nucleico aislado que es similar en al menos un 80% a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 usando el método Clustal de alineación y los parámetros por defecto K-TUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5;

o un fragmento de ácido nucleico aislado que es complementario a (a) o (b). También se da a conocer la extensión de 16:0-CoA para dar 20:0 mediante la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes. También se muestra que la delta-5 desaturasa, en ausencia de 20:0-CoA, insertará un doble enlace en la posición delta-5 de 16:0 y 18:0-CoA.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a polipéptido de delta-5 acil-CoA desaturasa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

En otra realización, la presente invención se refiere a un gen quimérico que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa de la invención, o a un gen quimérico que comprende un fragmento de ácido nucleico que es complementario a un fragmento de ácido nucleico que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa de la invención, operativamente unido a secuencias reguladoras adecuadas, en el que la expresión del gen quimérico da como resultado la producción de la proteína codificada en una célula huésped transformada.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a una célula huésped transformada que comprende en su genoma un gen quimérico de la invención. La expresión del gen quimérico da como resultado la producción de la proteína codificada en la célula huésped transformada. La célula huésped transformada puede ser de origen eucariota o procariota, e incluir células derivadas de microorganismos y plantas superiores.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para alterar el nivel de una delta-5 acil-CoA desaturasa en una célula huésped transformada que comprende: a) transformar una célula huésped con un gen quimérico de la invención; y b) hacer crecer la célula huésped transformada en condiciones que son adecuadas para la expresión del gen quimérico en las que la expresión del gen quimérico da como resultado la producción de niveles alterados de una delta-5 acil-CoA desaturasa en la célula huésped transformada.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un ácido graso desaturado que comprende un doble enlace en la posición delta-5 en una célula huésped, y métodos para producir aceites de semilla en los que las semillas y los aceites comprenden un ácido graso desaturado en los que el ácido graso comprende un doble enlace en la posición delta-5.

Breve descripción de los dibujos y descripciones de las secuencias

La invención puede entenderse más completamente a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos y lista de secuencias que forman una parte de esta solicitud.

La figura 1 muestra las rutas para la formación de ácidos grasos de cadena larga encontrados en semillas de Limnanthes. La biosíntesis de palmitato (16:0), estearato (18:0) y oleato (18:1) se produce en el plástido, mientras que la elongación de palmitato para dar araquidonato y desaturación en delta-5 se produce en el retículo endoplasmático (adaptado de Pollard, M. R. y Stumpf, P. K. (1980) Plant Physiol 66: 649-655).

La figura 2 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de la delta-9 desaturasa de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3) y la presente delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes (lde.pk0008.b9; SEQ ID NO: 2). Los aminoácidos que son idénticos entre ambas secuencias se indican con un asterisco (*) encima de la alineación. El programa usa guiones para maximizar la alineación de las secuencias.

La figura 3 muestra perfiles de cromatogramas de gases obtenidos para los aceites de embriones de soja de tipo natural (figura 3(A)) y de embriones de soja que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes (figura 3(B)), lo que demuestra la producción de ácidos grasos C20 en los embriones de soja transformados. Están indicados los ácidos grasos correspondientes a los diversos picos del cromatograma.

La figura 4 muestra la disminución en la acumulación de ácidos grasos 16:0 concomitante con el aumento en ácidos grasos 20:0 en embriones de soja transgénicos individuales que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes.

La figura 5 muestra perfiles de cromatogramas de gases obtenidos para los aceites de embriones de soja de tipo natural (figura 5(A)) y de embriones de soja que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes (figura 5(B)). Los ácidos grasos relevantes están indicados mediante sus tiempos de retención: 2,209 es 16:0; 2,271 es 16:1 \Delta5; 3,477 es 18:0; 3,530 es 18:1 \Delta5 y 3,567 es 18:1 \Delta9.

La figura 6 muestra el análisis de CG-EM de ésteres metílicos de ácidos grasos preparados a partir de embriones de soja que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes lo que demuestra la formación de ácidos grasos 16:1 delta-5 y 18:1 delta-5. La figura 6(A) presenta el cromatograma de gases en el que se identificaron los derivados de DMDS del ácido metil-hexadecenoico usando un barrido iónico seleccionado para 362 m/z. La figura 6(B) es el espectro de masas del mayor de los dos picos que se observan en la figura 6(A). La figura 6(C) presenta el cromatograma de gases en el que se identificaron los derivados de DMDS del ácido metil-octadecenoico usando un barrido iónico seleccionado para 390 m/z. La figura 6(D) es el espectro de masas para el hombro frontal del pico más grande que se observa en la figura 6(C).

Las siguientes descripciones de secuencias y lista de secuencias adjunta al presente documento cumplen con las normas que rigen las descripciones de secuencias de nucleótido y/o aminoácidos en las solicitudes de patentes tal como se expone en la norma 37 C.F.R. artículos 1.821-1.825.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc entero en el clon lde.pk0008.b9 que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos deducida de una delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes entera derivada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de una delta-9 desaturasa de Arabidopsis thaliana que tiene un número identificador general de NCBI: 2970034.

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos que comprende el cóntigo ensamblado del inserto de ADNc en clones lde.pk0008.d5 e lde.pk0015.d10 que codifica para una ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes entera.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos deducida de una ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes entera derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos que comprende una parte del inserto de ADNc en lde.pk0010.e4 que codifica para una parte de una ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos deducida de una parte de una ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.

La lista de secuencias contiene el código de una letra para los caracteres de secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos tal como se define según las normas de la IUPAC-IUBMB descritas en Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (Nº 2): 345-373 (1984). Los símbolos y el formato usados para los datos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las normas expuestas en la norma 37 C.F.R. artículo 1.822.

Descripción detallada de la invención

En el contexto de esta descripción, van a utilizarse varios términos. Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o ADN que es mono o bicatenario, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. Tal como se usa en el presente documento, "cóntigo" se refiere a un ensamblaje de secuencias de ácido nucleico solapantes para formar una secuencia de nucleótidos contigua. Por ejemplo, pueden compararse varias secuencias de ADN y alinearse para identificar regiones comunes o solapantes. Las secuencias individuales pueden entonces ensamblarse en una única secuencia de nucleótidos contigua.

Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente similar" se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que cambios en una o más bases de nucleótidos dan como resultado la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no afectan a las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. "Sustancialmente similar" también se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que cambios en una o más bases de nucleótido no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar en la alteración de la expresión génica mediante tecnología antisentido o de cosupresión. "Sustancialmente similar" también se refiere a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tales como la deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales del transcrito resultante en relación con la capacidad para mediar en la alteración de la expresión génica mediante tecnología antisentido o de cosupresión o alteración de las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. Se entiende por tanto que la invención abarca más de las secuencias a modo de ejemplo específicas.

Por ejemplo, en la técnica se conoce bien que puede lograrse la supresión antisentido y cosupresión de la expresión génica usando fragmentos de ácido nucleico que representan menos de la región codificante entera de un gen, y mediante fragmentos de ácido nucleico que no comparten el 100% de identidad de secuencia con el gen que va a suprimirse. Además, se conocen bien en la técnica alteraciones en un gen que dan como resultado la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado, pero no afectan a las propiedades funcionales de la proteína codificada. Por tanto, puede sustituirse un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, por un codón que codifica para otro residuo menos hidrófobo, tal como glicina, o para un residuo más hidrófobo, tal como valina, leucina o isoleucina. De manera similar, también puede esperarse que cambios que pueden dar como resultado la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, produzcan un producto funcionalmente equivalente. Además no se esperaría que cambios de nucleótidos que dan como resultado la alteración de las partes N-terminal y C-terminal de la molécula de proteína alteraran la actividad de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas está bien dentro de la experiencia habitual en la técnica, tal como lo está la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. Además, también pueden caracterizarse fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares mediante su capacidad para hibridarse, en condiciones rigurosas (0,1X SSC, SDS al 0,1%, 65ºC), con los fragmentos de ácido nucleico descritos en el presente documento.

También pueden caracterizarse fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares mediante la similitud en porcentaje de las secuencias de aminoácidos para las que codifican con respecto a las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, tal como se determina mediante algoritmos empleados comúnmente por los expertos en la técnica. Se prefieren aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de nucleótidos codifican para secuencias de aminoácidos que son similares en un 80% a las secuencias de aminoácidos notificadas en el presente documento. Fragmentos de ácido nucleico más preferidos codifican para secuencias de aminoácidos que son similares en un 90% con respecto a las secuencias de aminoácidos notificadas en el presente documento. Los más preferidos son fragmentos de ácido nucleico que codifican para secuencias de aminoácidos que son similares en un 95% con respecto a las secuencias de aminoácidos notificadas en el presente documento. Se realizaron las alineaciones de secuencia y los cálculos de similitud en porcentaje usando el programa Megalign de la serie de cálculo de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Se realizó la alineación múltiple de las secuencias usando el método Clustal de alineación (Higgins, D. G. y Sharp, P. M. (1989) CABIOS. 5: 151-153) con los parámetros por defecto (PENALIZACIÓN POR HUECOS = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 10). Los parámetros por defecto para alineaciones por parejas usando el método Clustal eran K-TUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5.

Una "parte sustancial" de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para proporcionar la supuesta identificación de ese polipéptido o gen, o bien mediante evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica, o mediante comparación de secuencias automatizada por ordenador e identificación usando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; véase también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, es necesaria una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos con el fin de identificar supuestamente una secuencia de polipéptido o ácido nucleico como homóloga a una proteína o gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, pueden usarse sondas oligonucleotídicas específicas de gen que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos en métodos dependientes de la secuencia de identificación génica (por ejemplo, hibridación de tipo Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófago). Además, pueden usarse oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR con el fin de obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprende los cebadores. En consecuencia, una "parte sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia para proporcionar la identificación específica y/o el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente memoria descriptiva enseña secuencias parciales o completas de aminoácidos o nucleótidos que codifican para una o más proteínas vegetales particulares. El experto, teniendo el beneficio de las secuencias notificadas en el presente documento, puede ahora usar la totalidad o una parte sustancial de las secuencias descritas para fines conocidos por los expertos en esta técnica.

"Degeneración de codones" se refiere a la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. En consecuencia, la presente invención se refiere a cualquier fragmento de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos que codifica para la proteína de delta-5 acil-CoA desaturasa tal como se expone en la SEQ ID NO: 2. El experto es muy consciente del "sesgo de codones" mostrado por una célula huésped específica utilizando codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por tanto, cuando se sintetiza un gen para la expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el gen de modo que su frecuencia de utilización de codón se aproxime a la frecuencia de utilización de codón preferida de la célula huésped.

"Genes sintéticos" pueden ensamblarse a partir de bloques de formación de oligonucleótidos que se sintetizan químicamente usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos bloques de formación se ligan e hibridan para formar segmentos génicos que entonces se ensamblan enzimáticamente para construir el gen entero. "Sintetizado químicamente", tal como se refiere a una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos componentes se ensamblaron in vitro. Puede lograrse la síntesis química manual de ADN usando procedimientos bien establecidos, o puede realizarse la síntesis química automatizada usando una de varias máquinas comercialmente disponibles. En consecuencia, los genes pueden adaptarse para la expresión génica óptima basándose en la optimización de secuencia de nucleótidos para reflejar el sesgo de codones de la célula huésped. El experto aprecia la probabilidad de expresión génica satisfactoria si la utilización del codón está sesgada hacia los codones favorecidos por el huésped. La determinación de codones preferidos puede basarse en una medición de los genes derivados de la célula huésped en la que la información de secuencia está disponible.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes en el sentido de 5') y que siguen (secuencias no codificantes en el sentido de 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias codificantes y reguladoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "foráneo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, sino que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia génica. Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

"Secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas en el sentido de 5' (secuencias no codificantes en el sentido de 5'), dentro, o en el sentido de 3' (secuencias no codificantes en el sentido de 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, procesado o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ADN que puede controlar la expresión de una secuencia codificantes o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se ubica en 3' con respecto a una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste en elementos proximales y más distales en el sentido de 5', denominándose los últimos elementos a menudo como potenciadores. En consecuencia, un "potenciador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel de especificidad tisular de un promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes fases de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares casi en todo momento se denominan como "promotores constitutivos". Constantemente se están descubriendo nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales; pueden encontrarse numerosos ejemplos en la recopilación de Okamuro y Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. También se reconoce que, debido a que en la mayoría de los casos no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica.

La "secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia de ADN ubicada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm procesado completamente en el sentido de 5' de la secuencia de iniciación de la traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar al procesamiento del transcrito primario para dar ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líder de traducción (Turner, R. y Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3: 225).

Las "secuencias no codificantes en el sentido de 3'" se refieren a secuencias de ADN ubicadas en el sentido de 3' de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de la poliadenilación y otras secuencias que codifican para señales reguladoras que pueden afectar al procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente efectuando la adición de extensiones de poli(ácido adenílico) al extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificantes en el sentido de 3' se muestra a modo de ejemplo por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1: 671-680.

"Transcrito de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Si el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina transcrito primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento tras la transcripción del transcrito primario y se denomina ARN maduro. "ARN mensajero (ARNm)" se refiere al ARN que está sin intrones y que puede traducirse para dar proteína por la célula. "ADNc" se refiere a un ADN bicatenario que es complementario a, y derivado de, ARNm. ARN "sentido" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y por tanto puede traducirse para dar proteína por la célula. "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a la totalidad a parte de un transcrito primario o ARNm diana y que bloquea la expresión de un gen diana (patente estadounidense número 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito de gen específico, es decir, en la secuencia no codificante en el sentido de 5', secuencia no codificante en el sentido de 3', intrones, o la secuencia codificante. "ARN funcional" se refiere a ARN sentido, ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que puede no traducirse pero que todavía tiene un efecto sobre procesos celulares.

El término "operativamente unido" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una se ve afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido con una secuencia codificante si puede afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control de la transcripción del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.

El término "expresión", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión puede referirse también a la traducción de ARNm para dar un polipéptido. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido que pueden suprimir la expresión de la proteína diana. "Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto génico en organismos transgénicos que supera los niveles de producción en organismos normales o no transformados. "Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN sentido que pueden suprimir la expresión de genes endógenos o foráneos idénticos o sustancialmente similares (patente estadounidense número 5.231.020).

"Niveles alterados" se refiere a la producción de producto(s) génico(s) en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las de organismos normales o no transformados.

Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado de manera postraduccional; es decir, uno del que se ha eliminado cualquier pre o propéptido en el producto de traducción primario. Proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción del ARNm; es decir, con pre y propéptidos todavía presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales de localización intracelular.

Un "péptido de tránsito al cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y que dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la que se produce la proteína. "Secuencia de tránsito al cloroplasto" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de tránsito al cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y que dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels, J. J., (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21-53). Si la proteína ha de dirigirse a una vacuola, puede añadirse adicionalmente una señal dirigida a vacuolas (citado anteriormente), o si ha de dirigirse al retículo endoplasmático, puede añadirse una señal de retención del retículo endoplasmático (citado anteriormente). Si la proteína ha de dirigirse al núcleo, debe eliminarse cualquier péptido señal presente e incluirse en su lugar una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100: 1627-1632).

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un organismo huésped, dando como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos". Los ejemplos de métodos de transformación de plantas incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. EnzymoL 143: 277) y tecnología de transformación acelerada por partículas o "pistola génica" (Klein TM et al. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73; patente estadounidense número 4.945.050).

Las técnicas convencionales de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en el presente documento se conocen bien en la técnica y se describen con más detalle en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a continuación en el presente documento "Maniatis").

Se han aislado fragmentos de ácido nucleico que codifican para al menos una parte de dos enzimas implicadas en la biosíntesis de lípidos y se han identificado mediante la comparación de secuencias de ADNc vegetal aleatorias con bases de datos públicas que contienen secuencias de nucleótidos y proteína usando los algoritmos BLAST bien conocidos por los expertos en la técnica. Se ha confirmado la identidad de estas enzimas mediante un análisis funcional tal como se expone en el ejemplo 6. La tabla 1 enumera las proteínas que se describen en el presente documento, y la designación de los clones de ADNc que comprenden los fragmentos de ácido nucleico que codifican para estas proteínas.

TABLA 1 Enzimas biosintéticas de aceite de Limnanthes

1

Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden usarse para aislar ADNc y genes que codifican para proteínas homólogas a partir de la misma u otras especies vegetales. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos dependientes de secuencias se conoce bien en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencias incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ADN y ARN tal como se muestra a modo de ejemplo mediante diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa).

Por ejemplo, los genes que codifica para otros homólogos de delta-5 acil-CoA desaturasa, o bien ADNc o ADN genómicos, podrían aislarse directamente usando la totalidad o una parte de los presentes fragmentos de ácido nucleico como sondas de hibridación de ADN para explorar bibliotecas de cualquier planta deseada empleando metodología bien conocida por los expertos en la técnica. Pueden diseñarse sondas de oligonucleótidos específicos basadas en las presentes secuencias de ácido nucleico y sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica (Meniatis). Además, pueden usarse las secuencias enteras directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por el experto tal como el marcaje de ADN cebador aleatorio, traducción por corte, o técnicas de marcado de extremos, o sondas de ARN que usan sistemas de transcripción in vitro disponibles. Además, pueden diseñarse cebadores específicos y usarse para amplificar una parte o la totalidad de las presentes secuencias. Los productos de amplificación resultantes pueden marcarse directamente durante las reacciones de amplificación o marcarse tras las reacciones de amplificación, y usarse como sondas para aislar fragmentos genómicos o de ADNc de longitud completa en condiciones de rigurosidad adecuada.

Además, pueden usarse dos segmentos cortos de los presentes fragmentos de ácido nucleico en protocolos de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican para genes homólogos a partir de ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también puede realizarse en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonado en los que la secuencia de un cebador se deriva de los presentes fragmentos de ácido nucleico, y la secuencia del otro cebador se aprovecha de la presencia de extensiones de poli(ácido adenílico) hacia el extremo 3' del precursor de ARNm que codifica para genes vegetales. Alternativamente, la secuencia del segundo cebador puede basarse en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el experto puede seguir el protocolo RACE (Frohman et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998) para generar ADNc usando PCR para amplificar copias de la región entre un único punto en el transcrito y el extremo 3' o 5'. Pueden diseñarse cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' a partir de las presentes secuencias. Usando sistemas RACE en el sentido de 3' o RACE en el sentido de 5' comercialmente disponibles (BRL), pueden aislarse fragmentos de ADNc en el sentido de 3' o 5' específicos (Ohara et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673; Loh et al., (1989) Science 243: 217). Pueden combinarse los productos generados mediante los procedimientos RACE en el sentido de 3' y 5' para generar ADNc de longitud completa (Frohman, M. A. y Martin, G. R., (1989) Techniques 1: 165).

La disponibilidad del presente nucleótido y las secuencias de aminoácidos deducidas facilita la selección inmunológica de bibliotecas de expresión de ADNc. Pueden sintetizarse péptidos sintéticos que representan partes de las presentes secuencias de aminoácidos. Pueden usarse estos péptidos para inmunizar animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad para péptidos o proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos. Entonces estos anticuerpos pueden usarse para explorar bibliotecas de expresión de ADNc para aislar clones de ADNc de longitud completa de interés (Lerner, R. A. (1984) Adv. Immunol. 36: 1; Maniatis).

Se ha estudiado bastante bien la biosíntesis de aceite en plantas (véase Harwood (1989) en Critical Reviews in Plant Sciences, Vol. 8: 1-43). Tal como se usa en el presente documento "cosechas de semillas oleaginosas" se refiere a especies vegetales que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, principalmente en las semillas. En particular, para los fines de esta descripción, "cosechas de semillas oleaginosas" se refiere a soja, maíz, girasol, cacahuete, cártamo, sésamo, níger, algodón, cacao, linaza (lino), lino de bajo contenido en ácido linoleico, ricino, palma de aceite, coco, canola y otras especies de semillas oleaginosas de Brassica tales como B. napus, B. campestris, B. oleracea, B. carinata, B. juncea, B. nigra, B. adressa, B. tournefortii, B. fruticulosas.

Pueden usarse los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención para crear plantas transgénicas en las que la delta-5 acil-CoA desaturasa descrita está presente a niveles superiores o inferiores a lo normal o en tipos celulares o fases del desarrollo en las que no se encuentran normalmente. Esto tendría el efecto de alterar la longitud de cadena y el nivel de saturación de los ácidos grasos en aquellas células. Tal como se demuestra en el ejemplo 6 a continuación, la sobreexpresión de la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes en una cosecha cultivo de semillas oleaginosas da como resultado la elongación del ácido palmítico (16:0) para dar ácido araquidónico (20:0). La sobreexpresión de la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes en una cosecha de semillas oleaginosas da como resultado la introducción de un doble enlace en la posición delta-5 de una cadena de ácido graso, dando como resultado la producción de ácidos grasos 16:1 y 18:1 delta-5. La sobreexpresión de estos dos genes en una cosecha de semillas oleaginosas permitirá la producción de ácidos grasos 20:1 delta-5. Existen al menos dos efectos positivos procedentes de esto: la reducción de los ácidos grasos saturados (especialmente 16:0) en aceites alimentarios y la producción de ácidos grasos (20:1 delta-5) con un millar de usos industriales.

La sobreexpresión de la proteína de delta-5 acil-CoA desaturasa de la presente invención puede conseguirse construyendo en primer lugar un gen quimérico en el que la región codificante está operativamente unida a un promotor que puede dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en la fase deseada del desarrollo. Por motivos de conveniencia, el gen quimérico puede comprender secuencias promotoras y secuencias líder de traducción derivadas de los mismos genes. También pueden proporcionarse señales de terminación de la transcripción que codifican para secuencias no codificantes en el sentido de 3'. El presente gen quimérico también puede comprender uno o más intrones con el fin de facilitar la expresión génica.

Entonces pueden construirse vectores de plásmidos que comprenden el presente gen quimérico. La elección del vector de plásmido depende del método que se usará para transformar las plantas huésped. El experto es muy consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector de plásmido con el fin de transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente células huésped que contienen el gen quimérico. El experto también reconocerá que diferentes acontecimientos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al., (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86), y por tanto que deben explorarse múltiples acontecimientos con el fin de obtener líneas que muestren el patrón y el nivel de expresión deseados. Tal exploración puede conseguirse mediante el análisis de tipo Southern de ADN, análisis de tipo Northern de la expresión de ARNm, análisis de tipo Western de la expresión de proteína, o análisis fenotípicos.

Para algunas aplicaciones puede ser útil dirigir la presente enzima implicada en la biosíntesis de lípidos hacia diferentes compartimentos celulares, o para facilitar su secreción a partir de la célula. Por tanto se prevé que el gen quimérico descrito anteriormente pueda complementarse adicionalmente alterando la secuencia codificante para codificar para delta-5 acil-CoA desaturasa o ácido graso acil-CoA elongasa añadiendo secuencias de selección como diana intracelulares apropiadas tales como las secuencias de tránsito (Keegstra, K. (1989) Cell 56: 247-253), secuencias señal o secuencias que codifican para la localización del retículo endoplasmático (Chrispeels, J. J., (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21-53), o señales de localización nuclear (Raikhel, N. (1992) Plant Phys. 100: 1627-1632) y/o eliminando secuencias de selección como diana que ya están presentes. Aunque las referencias citadas dan ejemplos de cada una de éstas, la lista no es exhaustiva y en el futuro pueden descubrirse más señales de selección como diana de utilidad.

La presente delta-5 acil-CoA desaturasa (o partes de la misma) puede producirse en células huésped heterólogas, particularmente en células de huéspedes microbianos, y puede usarse para preparar anticuerpos frente a estas proteínas mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar delta-5 acil-CoA desaturasa in situ en células o in vitro en extractos celulares. Células huésped heterólogas preferidas para la producción de la presente delta-5 acil-CoA desaturasa son huéspedes microbianos. Los expertos en la técnica conocen bien los sistemas de expresión microbianos y vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas foráneas. Puede usarse cualquiera de éstos para construir un gen quimérico para la producción de la presente delta-5 acil-CoA desaturasa. Este gen quimérico puede introducirse entonces en microorganismos apropiados mediante transformación para proporcionar una expresión de alto nivel de la enzima codificada implicada en la biosíntesis de lípidos. Se proporciona un ejemplo de un vector para la expresión de alto nivel de la presente delta-5 acil-CoA desaturasa (ejemplo 7).

También puede usarse la totalidad o una parte sustancial de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención como sondas para el mapeo genético y físico de los genes de los que forman parte, y como marcadores para rasgos unidos a aquellos genes. Tal información puede ser útil en fitogenética con el fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Por ejemplo, pueden usarse los presentes fragmentos de ácido nucleico como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Pueden examinarse con sonda transferencias de tipo Southern (Maniatis) del ADN genómico vegetal digerido con enzimas de restricción con los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención. Los patrones de bandeo resultantes pueden someterse entonces a análisis genéticos usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander et al., (1987) Genomics 1: 174-181) con el fin de construir un mapa genético. Además, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden usarse para examinar con sonda transferencias de tipo Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representan el progenitor y la progenie de un cruzamiento genético definido. Se observa segregación de los polimorfismos del ADN y se usa para calcular la posición de la presente secuencia de ácido nucleico en el mapa genético obtenido previamente usando esta población (Botstein, D. et al., (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes vegetales para su uso en el mapeo genético se describe en R. Bernatzky, R. y Tanksley, S. D. (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 46 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos usando la metodología resumida anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, pueden usarse para el mapeo poblaciones de entrecruzamiento F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas al azar, líneas casi isogénicas y otros conjuntos de individuos. Los expertos en la técnica conocen bien tales metodologías.

También pueden usarse sondas de ácido nucleico derivadas de las presentes secuencias de ácido nucleico para el mapeo físico (es decir, situar las secuencias en mapas físicos, véase Hoheisel, J. D., et al., En: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas 319-346, y referencias citadas en el mismo).

En otra realización pueden usarse sondas de ácido nucleico derivadas de las presentes secuencias de ácido nucleico en el mapeo directo mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH) (Trask, B. J. (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo mediante FISH favorecen el uso de clones grandes (de varios a varios cientos de KB; véase Laan, M. et al. (1995) Genome Research 5: 13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo mediante FISH usando sondas más cortas.

Puede llevarse a cabo una variedad de métodos de mapeo genético y físico basados en la amplificación de ácidos nucleicos usando las presentes secuencias de ácido nucleico. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelo (Kazazian, H. H. (1989) J Lab. Clin. Med 114 (2): 95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield, V. C. et al. (1993) Genomics 16: 325-332), ligamiento específico de alelo (Landegren, U. et al. (1988) Science 241: 1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov, B. P. (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), mapeo híbrido por radiación (Walter, M. A. et al. (1997) Nature Genetics 7:22-28) y mapeo de tipo "Happy" (Dear, P. H. y Cook, P. R. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Para estos métodos, se usa la secuencia un fragmento de ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. Los expertos en la técnica conocen bien el diseño de tales cebadores. En los métodos que emplean el mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en la secuencia de ADN entre los progenitores del cruzamiento del mapeo en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Sin embargo, generalmente esto no es necesario para los métodos de mapeo.

Ejemplos

La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos, en los que todas las partes y porcentajes son en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se facilitan sólo a modo de ilustración.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Composición de bibliotecas de ADNc: Aislamiento y secuenciación de clones de ADNc

Se prepararon bibliotecas de ADNc que representaban los ARNm de tejidos embrionarios de Limnanthes douglasii en vectores pcDNAII según el protocolo del fabricante (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Se amplificaron insertos de ADNc de colonias bacterianas elegidas al azar que contenían plásmidos pcDNAII recombinantes mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos para secuencias de vector que flanquean la secuencias de ADNc insertadas o se preparó ADN de plásmido a partir de células bacterianas cultivadas. Se secuenciaron los ADN de plásmido o los ADN de inserto amplificados en reacciones de secuenciación con colorante-cebador para generar secuencias de ADNc parcial (etiquetas de secuencia expresada o "EST"; véase Adams, M. D. et al., (1991) Science 252: 1651). Se analizaron las EST resultantes usando un secuenciador de fluorescencia modelo 377 de Perkin Elmer.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Identificación de clones de ADNc

Se identificaron EST que codificaban para enzimas implicadas en la biosíntesis de lípidos llevando a cabo búsquedas con BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; véase también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para detectar la similitud con respecto a secuencias contenidas en la base de datos "nr" de BLAST (que comprende traducciones de todas las CDS no redundantes de GenBank, secuencias derivadas del banco de datos de proteínas de Brookhaven de estructura tridimensional, la última publicación principal de la base de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT, bases de datos DDBJ y EMBL). Se analizaron las secuencias de ADNc obtenidas en el ejemplo 1 para detectar la similitud con respecto a todas las secuencias de ADN públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Se tradujeron las secuencias de ADN en todos los marcos de lectura y se compararon para detectar la similitud con respecto a todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish, W. y States, D. J. (1993) Nature Genetics 3: 266-272) proporcionado por el NCBI. Por conveniencia, el valor P (probabilidad) de observar una coincidencia de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos investigadas simplemente por casualidad tal como se calcula mediante BLAST se recogen en el presente documento como valores "pLog", que representan el negativo del logaritmo del valor P notificado. En consecuencia, cuanto mayor es el valor de pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el "resultado positivo" de BLAST representen proteínas homólogas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Caracterización de clones de ADNc que codifican para homólogos de delta-5 acil-CoA desaturasa

La búsqueda con BLASTX usando las secuencias EST de clones lde.pk0004.c10, lde.pk0012.e5 e lde.pk0012.g11, y el inserto de ADNc entero del clon lde.pk0010.a8 reveló similitud de las proteínas codificadas por los ADNc con respecto a delta-9 acil-lípido desaturasa/delta-9 acil-CoA desaturasa de Rosa hybrida (número de registro de GenBank S80863; número identificador general de NCBI 1911477). La búsqueda con BLASTX usando la secuencia EST del clon lde.pk0008.b9 reveló similitud de la proteína codificada par el ADNc con respecto a una ácido graso desaturasa de Rosa hybrida (número de registro de GenBank D49383; número identificador general NCBI 2580425). En la tabla 2 se muestran los resultados de BLAST para cada una de estas secuencias:

TABLA 2 Resultados de BLAST para clones que codifican para polipéptidos homólogos a desaturasas

2

Se determinó la secuencia del inserto de ADNc entero en el clon lde.pk0008.b9 y se muestra en la SEQ ID NO: 1; la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEQ ID NO: 2. Las secuencias EST para los clones lde.pk0004.c10, lde.pk0012.e5, lde. pk0012.g11 e lde.pk0010.a8 están englobadas por la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. Se evaluó la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 mediante BLASTP, produciendo un valor de pLog > 250 frente a la secuencia de delta-9 desaturasa de Arabidopsis thaliana (número identificador general de NCBI 2970034). La figura 1 representa una alineación de las secuencias de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de delta-9 desaturasa de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3). La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 similar en un 47,9% a la secuencia de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3). Se realizaron las alineaciones de secuencia y los cálculos de identidad en porcentaje usando el programa Megalign de la serie de cálculo de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Se realizaron la alineación por parejas de las secuencias de aminoácidos y los cálculos de la similitud en porcentaje usando el método Clustal de alineación (Higgins, D. G. y Sharp, P. M. (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros por defecto (PENALIZACIÓN POR HUECOS = 5, K-TUPLE = 1, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5).

Las alineaciones de secuencia, las puntuaciones de BLAST y las probabilidades sugerían que el presente fragmento de ácido nucleico codifica para una delta-9 acil-CoA desaturasa de Limnanthes entera. Sin embargo, el aceite derivado de Limnanthes está compuesto principalmente por ácidos grasos de cadena muy larga con un doble enlace cis en delta-5, lo que sugiere que el presente fragmento de ácido nucleico puede de hecho codificar para una delta-5 acil-CoA desaturasa en lugar de una delta-9 desaturasa. Tal como se muestra en el ejemplo 6, la expresión de la desaturasa de Limnanthes en embriones de soja da como resultado la formación de aceites que contienen ácidos grasos 16:1 y 18:1 delta-5. En consecuencia, los presentes fragmentos de ácido nucleico comprenden las primeras secuencias de Limnanthes douglasii que codifican para una delta-5 acil-CoA desaturasa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Caracterización de clones de ADNc que codifican para homólogos de la ácido graso acil-CoA elongasa

La búsqueda con BLASTX usando las secuencias EST de clones lde.pk0008.d5 y lde.pk0010.e4 reveló similitud de las proteínas codificadas por los ADNc con respecto a la beta-cetoacil-CoA sintasa de Arabidopsis thaliana (número de registro de GenBank AC003105; número identificador general de NCBI 2760830). En la tabla 3 se muestran los resultados de BLAST para estas EST:

TABLA 3 Resultados de BLAST para un clon que codifica para un polipéptido homólogo a la beta-cetoacil-CoA sintasa

3

Búsquedas adicionales en la base de datos privada indicaron que el clon lde.pk0015.d10 también revelaba similitud con la beta-cetoacil-CoA sintasa. Se determinó la secuencia del inserto de ADNc entero en el clon lde.pk0008.d5 y se ensambló un cóntigo con esta secuencia y la secuencia de una parte del inserto de ADNc del clon lde.pk0015.d10. La secuencia de nucleótidos de este cóntigo se muestra en la SEQ ID NO: 4; la secuencia de aminoácidos deducida de este cóntigo se muestra en la SEQ ID NO: 5. Una búsqueda con BLASTX usando la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 dio como resultado un valor de pLog > 254 frente a la secuencia de beta-cetoacil-CoA sintasa de Arabidopsis thaliana. La secuencia del inserto de ADNc casi entero del clon lde.pk0010.e4 se muestra en la SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEQ ID NO: 7. Una búsqueda con BLASTX usando las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 6 dio como resultado un valor de pLog de 132 frente a la secuencia de Arabidopsis thaliana. La secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 es similar en un 74,5% a la secuencia de Arabidopsis thaliana y la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7 es similar en un 80,3% a la secuencia de Arabidopsis thaliana. Las dos secuencias de Limnanthes son similares en un 88,0% entre sí, lo que sugiere que ambas secuencias de Limnanthes codifican para proteínas de función similar.

Las puntuaciones y probabilidades de BLAST indicaron que los presentes fragmentos de ácido nucleico codificaban para una parte de un homólogo de beta-cetoacil-CoA sintasa de Limnanthes douglasii y un homólogo de la beta-cetoacil-CoA sintasa de Limnanthes douglasii entero. Sin embargo, el aceite en Limnanthes está compuesto principalmente por ácidos grasos de cadena muy larga con doble enlace cis en delta-5, lo que sugiere que los presentes fragmentos de ácido nucleico pueden codificar de hecho para ácido graso acil-CoA elongasas en vez de para beta-cetoacil-CoA sintasas. Esto se confirma en el ejemplo 6 en el que la expresión de la elongasa de Limnanthes en embriones de soja da como resultado un enriquecimiento en ácidos grasos 20:0. Por tanto, estas secuencias representan las primeras secuencias de Limnanthes douglasii que codifican para ácido graso acil-CoA elongasas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Expresión de genes quiméricos en células de monocotiledóneas

Puede construirse un gen quimérico que comprende un ADNc que codifica para una enzima implicada en la biosíntesis de lípidos en orientación sentido con respecto al promotor de ceína de 27 kD del maíz que está ubicado en el sentido de 5' con respecto al fragmento de ADNc, y el extremo 3' de ceína de 10 kD que está ubicado en el sentido de 3' con respecto al fragmento de ADNc. Puede generarse el fragmento de ADNc de este gen mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del clon de ADNc usando cebadores oligonucleotídicos apropiados. Pueden incorporarse sitios de clonación (NcoI o SmaI) en los oligonucleótidos para proporcionar la orientación apropiada del fragmento de ADN cuando se inserta en del vector digerido pML103 tal como se describe a continuación. Entonces se realiza la amplificación en una PCR convencional. Entonces se digiere el ADN amplificado con enzimas de restricción NcoI y SmaI y se fracciona sobre un gel de agarosa. Puede aislarse la banda apropiada del gel y combinarse con un fragmento de NcoI-SmaI de 4,9 kb del plásmido pML103. El plásmido pML103 se ha depositado según los términos del tratado de Budapest en la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209), y lleva el número de registro ATCC 97366. El segmento de ADN de pML103 contiene un fragmento de promotor de SalI-NcoI de 1,05 kb del gen de la ceína de 27 kD del maíz y un fragmento de SmaI-SalI de 0,96 kD del extremo 3' del gen de la ceína de 10 kD del maíz en el vector pGem9Zf(+) (Promega). Pueden ligarse el vector y el ADN de inserto a 15ºC durante la noche, esencialmente tal como se describe (Maniatis). Entonces puede usarse el ADN ligado para transformar E. coli XL1-Blue (Epicurian ColiXL-1 Blue^{TM}; Stratagene). Pueden seleccionarse transformantes bacterianos mediante digestión con enzimas de restricción de ADN de plásmido y análisis de secuencia de nucleótidos limitado usando el método de terminación de la cadena de didesoxilo (kit de secuenciación de ADN Sequenase^{TM}; U.S. Biochemical). El constructo de plásmido resultante comprenderá un gen quimérico que codifica, en la dirección de 5' a 3', para el promotor de la ceína de 27 kD del maíz, un fragmento de ADNc que codifica para una enzima implicada en la biosíntesis de lípidos, y la región en 3' de la ceína de 10 kD.

El gen quimérico descrito anteriormente puede introducirse entonces en células de maíz mediante el siguiente procedimiento. Pueden disecarse embriones de maíz inmaduros a partir de cariópsides en desarrollo derivados de cruzamientos de líneas endogámicas de maíz H99 y LH132. Se aíslan los embriones de 10 a 11 días tras la polinización cuando tienen de 1,0 a 1,5 mm de longitud. Entonces se colocan los embriones con el lado del eje hacia abajo y en contacto con medio N6 solidificado con agarosa (Chu et al., (1975) Sci. Sin. Peking 18: 659-668). Se mantienen los embriones en la oscuridad a 27ºC. Callos embriogénicos friables que consisten en masas no diferenciadas de células con proembrioides somáticos y embrioides llevados sobre estructuras de suspensión proliferan a partir del escutelo de estos embriones inmaduros. Los callos embriogénicos aislados del explante primario pueden cultivarse en medio N6 y subcultivarse en este medio cada de 2 a 3 semanas.

El plásmido, p35S/Ac (obtenido del Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) puede usarse en experimentos de transformación con el fin de proporcionar un marcador seleccionable. Este plásmido contiene el gen Pat (véase la publicación de patente europea 0 242 236) que codifica para fosfinotricina acetil transferasa (PAT). La enzima PAT confiere resistencia frente a inhibidores herbicidas de la glutamina sintetasa tales como fosfinotricina. El gen pat en p35S/Ac está bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812) y la región en 3' del gen de la nopalina sintasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

Puede usarse el método de bombardeo de partículas (Klein TM et al. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73) para transferir genes a los callos de células en cultivo. Según este método, se recubren partículas de oro (de 1 \mum de diámetro) con ADN usando la siguiente técnica. Se añaden diez \mug de ADN de plásmido a 50 \mul de una suspensión de partículas de oro (60 mg por ml). Se añaden cloruro de calcio (50 \mul de una disolución 2,5 M) y base libre de espermidina (20 \mul de una disolución 1,0 M) a las partículas. Se agita con vórtex la suspensión durante la adición de estas disoluciones. Tras 10 minutos, se centrifugan brevemente los tubos (5 segundos a 15.000 rpm) y se elimina el sobrenadante. Vuelven a suspenderse las partículas en 200 \mul de etanol absoluto, vuelven a centrifugarse y a eliminarse el sobrenadante. Vuelve a realizarse el aclarado con etanol y vuelven a suspenderse las partículas en un volumen final de 30 \mul de etanol. Puede colocarse una alícuota (5 \mul) de las partículas de oro recubiertas con ADN en el centro de un disco de suspensión Kapton^{TM} (Bio-Rad Labs). Entonces se aceleran las partículas dentro del tejido de maíz con un instrumento Biolistic^{TM} PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA), usando una presión de helio de 1000 psi, una distancia de hueco de 0,5 cm y una distancia de vuelo de 1,0 cm.

Para el bombardeo, se coloca el tejido embriogénico sobre papel de filtro sobre medio N6 solidificado con agarosa. Se dispone el tejido como césped fino y se cubre una zona circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La placa petri que contiene el tejido puede colocarse en la cámara del instrumento PDS-1000/He aproximadamente a 8 cm del tamiz de detención. Entonces se evacua el aire en la cámara hasta un vacío de 28 pulgadas de Hg. Se acelera el macroportador con una onda de choque de helio usando una membrana de ruptura que estalla cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 1000 psi.

Siete días tras el bombardeo puede transferirse el tejido a medio N6 que contiene glufosinato (2 mg por litro) y carece de caseína y prolina. El tejido sigue creciendo lentamente en este medio. Tras 2 semanas adicionales puede transferirse el tejido a medio N6 fresco que contiene glufosinato. Tras 6 semanas, pueden identificarse zonas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos que crecen activamente sobre algunas de las placas que contienen el medio
complementado con glufosinato. Estos callos pueden seguir creciendo cuando se subcultivan en el medio selectivo.

Pueden regenerarse plantas a partir del callo transgénico transfiriendo en primer lugar agrupaciones de tejido a medio N6 complementado con 0,2 mg por litro de 2,4-D. Tras dos semanas puede transferirse el tejido a medio de regeneración (Fromm et al., (1990) Bio/Technology 8:833-839).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Expresión de genes quiméricos en células de dicotiledóneas

Puede usarse un casete de expresión específico para semillas compuesto por el promotor y terminador de la transcripción del gen que codifica para la subunidad \beta de la proteína de reserva de las semillas faseolina a partir de la judía Phaseolus vulgaris (Doyle, J. J. et al. (1986) J.Biol. Chem. 261: 9228-9238) para la expresión de las presentes enzimas implicadas en la biosíntesis de lípidos en dicotiledóneas transformadas. El casete de faseolina incluye aproximadamente 500 nucleótidos en el sentido de 5' desde el codón de iniciación de la traducción y aproximadamente 1650 nucleótidos en el sentido de 3' desde el codón de terminación de la traducción de faseolina. Entre las regiones en 5' y 3' están los sitios de endonucleasa restricción únicos Nco I (que incluye el codón de iniciación de la traducción ATG), SmaI, Kpn I y Xba I. El casete entero está flanqueado por sitios Hind III.

El fragmento de ADNc de este gen puede generarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del clon de ADNc usando cebadores oligonucleotídicos apropiados. Pueden incorporarse sitios de clonación en los oligonucleótidos para proporcionar la orientación apropiada del fragmento de ADN cuando se inserta en el vector de expresión. Entonces se realiza la amplificación tal como se describió anteriormente, y se inserta el fragmento aislado en un vector pUC18 que lleva el casete de expresión de semillas.

Entonces pueden transformarse embriones de dicotiledóneas con el vector de expresión que comprende secuencias que codifican para enzimas implicadas en la biosíntesis de lípidos. Para inducir embriones somáticos, pueden cultivarse cotiledóneas, de 3-5 mm de longitud disecadas a partir de semillas inmaduras, de superficie esterilizada de la dicotiledónea elegida, con luz u oscuridad a 26ºC en un medio agar apropiado durante 6-10 semanas. Entonces se escinden embriones somáticos que producen embriones secundarios y se colocan en un medio líquido apropiado. Tras la selección repetida de agrupamientos de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones tempranos, en fase globular, las suspensiones se mantienen tal como se describe a continuación.

Pueden mantenerse cultivos de suspensión embriogénica de dicotiledóneas en 35 ml de medio líquido en un agitador rotativo, 150 rpm, a 26ºC con luces fluorescentes con un programa de día/noche de 16:8 horas. Se subcultivan los cultivos cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido.

Entonces pueden transformarse los cultivos de suspensión embriogénica de dicotiledóneas mediante el método de bombardeo con pistola genética (Klein T. M. et al. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73, patente estadounidense número 4.945.050). Puede usarse un instrumento DuPont Biolistic^{TM} PDS1000/HE (ajuste con helio) para estas transformaciones.

Un gen marcador seleccionable que puede usarse para facilitar la transformación de plantas es un gen quimérico compuesto por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (a partir de E. coli; Gritz L et al. (1983) Gene 25: 179-188) y la región en 3' del gen de la nopalina sintasa a partir del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El casete de expresión de semillas que comprende la región en 5' de faseolina, el fragmento que codifica para la enzima implicada en la biosíntesis de lípidos y la región en 3' de faseolina pueden aislarse como fragmento de restricción. Entonces puede insertarse este fragmento en un sitio de restricción único del vector que lleva el gen marcador.

A 50 \mul de una suspensión de partículas de oro de 1 \mum a 60 mg/ml se le añaden (en orden): 5 \mul de ADN (1 \mug/\mul), 20 \mul de espermidina (0,1 M) y 50 \mul CaC1_{2} (2,5 M). Entonces se agita la preparación de partículas durante tres minutos, se centrifuga en una microcentrífuga durante 10 segundos y se elimina el sobrenadante. Entonces se lavan las partículas recubiertas con ADN una vez en 400 \mul de etanol al 70% y vuelven a suspenderse en 40 \mul de etanol anhidro. Puede sonicarse la suspensión de ADN/partículas tres veces durante un segundo cada vez. Entonces se cargan cinco \mul de las partículas de oro recubiertas con ADN en cada macrodisco portador.

Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas en una placa petri de 60 x 15 mm vacía y se elimina el líquido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, normalmente se bombardean aproximadamente 5-10 placas de tejido. Se fija la presión de ruptura de membrana a 1100 psi y se evacua la cámara hasta un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca a aproximadamente 3,5 pulgadas del tamiz de retención y se bombardea tres veces. Tras el bombardeo, puede dividirse el tejido por la mitad y volver a colocarse en líquido y cultivarse tal como se describió anteriormente.

De cinco a siete días tras el bombardeo, puede cambiarse el medio líquido por medio fresco, y de once a doce días tras el bombardeo sustituirse por medio fresco que contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo puede renovarse semanalmente. De siete a ocho semanas tras el bombardeo, puede observarse tejido verde, transformado que crece a partir de agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. Se retira el tejido verde aislado y se inocula en frascos individuales para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénica transformada, propagada por clones. Cada nueva línea puede tratarse como un acontecimiento de transformación independiente. Entonces pueden subcultivarse estas suspensiones y mantenerse como agrupaciones de embriones inmaduros o regenerarse para dar plantas completas mediante maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Expresión de delta-5 acil-CoA desaturasa y ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes en embriones de soja

Para confirmar la identidad y actividad de los fragmentos de ácido nucleico expuestos en la SEQ ID NO: 1 (que codifica para una delta-5 acil-CoA lípido desaturasa de Limnanthes) y SEQ ID NO: 4 (que codifica para una ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes), se clonaron individualmente estos ácidos nucleicos en un vector de expresión in vivo. Los insertos de ADNc en el vector de clonación pcDNAII de biblioteca están flanqueados por sitios Not I lo que permite eliminar el inserto de ADNc entero mediante digestión con Not I. Se digirieron los plásmidos que codifican para delta-5 acil-CoA desaturasa y ácido graso acil-CoA elongasa con Not I, se aisló el fragmento de ADNc, se purificó y se ligó en el vector pKS67 (descrito a continuación) siguiendo técnicas de biología molecular convencionales.

Se construyó un plásmido, pZBL100, que contenía genes quiméricos para permitir la expresión de higromicina B fosfotransferasa en ciertas bacterias y en células vegetales a partir de los siguientes elementos genéticos: a) promotor de T7 + Shine-Delgarno/higromicina B fosfotransferasa (HPT)/secuencia de terminación de T7, b) promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV)/higromicina B fosfotransferasa (HPT)/nopalina sintasa (NOS3' a partir de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens), y c) vector de plásmido pSP72 (Promega) con la región que codifica para b-lactamasa (gen de resistencia a la ampicilina) eliminada.

Se amplificó el gen de HPT mediante PCR a partir de la cepa W677 de E. coli, que contenía un plásmido pJR225 derivado de Klebsiella. Partiendo con el vector pSP72 se ensamblaron los elementos en un único plásmido usando métodos de clonación convencionales (Maniatis).

Por tanto, el plásmido pZBL100 contiene el casete de promotor de T7/HPT/terminador de T7 para la expresión de la enzima HPT en ciertas cepas de E. coli, tales como NovaBlue (DE3) (Novagen), que son lisogénicas para lambda DE3 (que lleva el gen de la ARN polimerasa de T7 bajo el control de lacUV5). El plásmido pZBL100 también contiene el casete 35S/HPT/NOS para la expresión constitutiva de la enzima HPT en plantas, tales como la soja. Estos dos sistemas de expresión permiten usar la selección para el crecimiento en presencia de higromicina como medio de identificación de células que contienen el plásmido tanto en sistemas bacterianos como vegetales. pZBL100 también contiene tres sitios de endonucleasa de restricción únicos para clonar otros genes quiméricos en este vector.

El plásmido pCW109 se derivó del plásmido pUC18 comercialmente disponible (Gibco-BRL) insertando dentro del sitio Hind III del vector de clonación pUC18 una región no codificante en 5' de 555 pb (que contiene la región del promotor) del gen de b-conglicinina seguido por la secuencia de clonación múltiple que contiene los sitios de endonucleasa de restricción para Nco I, Sma I, Kpn I y XbaI, y después 1174 pb de la región no traducida en 3' de la faseolina de la judía común en el sitio Hind III. La región del promotor de b-conglicinina usada es un alelo del gen de b-conglicinina publicado (Doyle et al. (1986) J Biol. Chem. 261: 9228-923 8) debido a diferencias en 27 posiciones de nucleótidos. Se introdujo un sitio Not I único dentro de la región de clonación entre el promotor de la conglicinina y el extremo 3' en de faseolina en pCW109 mediante digestión con Nco I y Xba I seguido por la eliminación de los extremos de ADN monocatenario con exonucleasa de la judía mungo. Se ligaron ligadores de Not I (New England Biochemical número de catálogo NEB 1125) en el plásmido linealizado para producir el plásmido pAW35.

El plásmido pML18 consiste en el promotor (35S) no específico de tejido y constitutivo del virus del mosaico de la coliflor (Odell, J. T. et al. (1985) Nature 313: 810-812; Hull et al. (1987) Virology 86: 482-493), que conduce la expresión del gen de la neomicina fosfotransferasa descrito en (Beck, E. et al. (1982) Gene 19: 327-336) seguido por el extremo 3' del gen de la nopalina sintasa incluyendo los nucleótidos 848 a 1550 descrito por (Depicker et al. (1982) J. Appl. Genet. 1: 561-574). Se insertó esta unidad de transcripción en el vector de clonación comercial pGEM9Z (Gibco-BRL) y está flanqueada en el extremo 5' del promotor 35S por los sitios de restricción Sal I, Xba I, Bam HI y Sma I en ese orden. Hay un sitio Sal I adicional presente en el extremo 3' de la secuencia NOS3' y los sitios Xba I, Bam HI y Sal I son únicos. Se destruyó el único sitio Not I en pML18 mediante digestión con Not I, llenando los extremos monocatenarios con dNTP y fragmento de Klenow mediante nuevo ligamiento del plásmido linealizado. Entonces se digirió el pML18 modificado con Hind III y se trató con fosfatasa intestinal de ternero. Se eliminó el casete de expresión de b-conglicinina:Not I:faseolina en pAW35 mediante digestión con Hind III y se aisló el fragmento de 1,8 kB mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligó dentro del la construcción de pML18 linealizado y modificado descrita anteriormente. Se identificó un clon con la orientación deseada mediante digestión con Not I y Xba I para liberar un fragmento de 1,08 kB indicando que la orientación de la unidad de transcripción de la conglicinina era la misma que la unidad de transcripción del marcador seleccionable. Al plásmido resultante se le dio el nombre pBS19.

Se preparó el vector pKS67 aislando el fragmento que contenía b-conglicinina a partir de pBS19 mediante digestión con Hind III, aislamiento mediante electroforesis en gel y ligamiento en el pZBL100 digerido con Hind III, que se había tratado con fosfatasa alcalina de ternero.

Se transformaron cultivos en suspensión embriogénica de soja con los vectores de expresión mediante el método de bombardeo con pistola génica (Klein, T. M. et al. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73, patente estadounidense número 4.945.050). Se realizó el mantenimiento de embriones transgénicos, preparación de aceites y medición del contenido en ácidos grasos mediante cromatografía de gases tal como se indica en la publicación PCT W093/11245.

\vskip1.000000\baselineskip

Demostración de la actividad elongasa

El porcentaje de acumulación de ácidos grasos 16:0 disminuye en embriones de soja que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa mientras que los niveles de ácidos grasos 20:0 aumentan drásticamente. La figura 3 presenta un análisis cromatográfico de aceites derivados de embriones de soja no transgénicos, de tipo natural (figura 3(A)) y de embriones de soja transgénicos que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes (figura 3 (B)). Se indican los picos correspondientes a los diferentes ácidos grasos presentes en los aceites. La cantidad de ácidos grasos 16:0 y 18:2 disminuye en los aceites de los embriones de soja que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa en comparación con aceite derivado de embriones de soja no transgénicos, de tipo natural. Además, la cantidad de ácidos grasos 20:0 está enormemente enriquecida en los aceites de los embriones transgénicos. La distribución cuantificada de ácidos grasos 16:0 y 20:0 en embriones de soja de tipo natural y embriones de soja que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes se muestra en la tabla 4. Los niveles de ácidos grasos 20:0 en embriones de tipo natural oscilan desde el 0,2 hasta el 0,6% mientras que en embriones que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa, el porcentaje de ácidos grasos 20:0 oscila desde el 7,7% hasta el 11,0%.

TABLA 4 Distribución de ácidos grasos en porcentaje en embriones de soja transgénicos que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes

4

\vskip1.000000\baselineskip

La figura 4 representa la relación lineal entre la reducción en el contenido en ácidos grasos 16:0 y el aumento en el contenido en ácidos grasos 20:0 en embriones de soja transgénicos que expresan la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes.

\vskip1.000000\baselineskip

Demostración de la actividad delta-5 desaturasa

Embriones de soja transgénicos que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes producen ácidos grasos 16:1 no observados en embriones de tipo natural. La distribución de ácidos grasos en embriones de soja que expresan la delta-5 desaturasa se ilustra en la figura 5 que muestra los cromatogramas correspondientes a aceites derivados de embriones de soja de tipo natural (figura 5(A)) y embriones de soja que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes (figura 5(B)). La tabla 5 muestra la distribución en porcentaje cuantificado de 16:0, 16:1 delta-5, 18:0 y 18:1 delta-5 en embriones de tipo natural y embriones transgénicos que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Distribución de ácidos grasos en porcentaje en embriones de soja transgénicos que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes

5

6

Para confirmar la ubicación del doble enlace catalizado por la desaturasa, se establecieron posiciones de dobles enlaces de ácidos grasos monoinsaturados mediante análisis de CG-EM de derivados de disulfuro de ésteres metílicos de ácidos grasos tal como se describe por Yamamoto, K. et al. (1991) Chem Phys Lipid 60: 39-50 y se ilustra en la figura 6.

Se hicieron reaccionar ésteres metílicos de ácidos grasos preparados a partir de embriones de soja que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes con disulfuro de dimetilo tal como se describió anteriormente (Yamamoto, K. et al. (1991) Chem. Phys. Lipids 60: 39-50). Esta reacción convierte los dobles enlaces de ésteres metílicos de ácidos grasos insaturados en aductos de disulfuro de dimetilo (DMDS). Cuando se analizan mediante CG-EM, estos derivados proporcionan iones que son diagnósticos para las posiciones de dobles enlaces en ácidos grasos. Se analizaron los derivados de DMDS de ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de embriones mediante CG-EM. Se resolvieron estos derivados usando una columna HP-INNOWax de 0,25 mm (diámetro interior) x 30 m (Hewlett Packard) con la temperatura de horno de una temperatura de cromatógrafo de gases HP6890 programada desde 185ºC (5 min. de mantenimiento) hasta 237ºC (25 min. de mantenimiento) a una velocidad de 7,5ºC/min. Se obtuvo el espectro de masas de los derivados de DMDS resueltos usando un detector selectivo de masas HP5973 que se puso en contacto con el cromatógrafo de gases. Se identificaron derivados de DMDS del ácido metilhexadecenoico (16:1) usando un barrido iónico seleccionado para 362 m/z, que corresponde al ión molecular de los derivados de DMDS de metil 16:1. Esto dio como resultado la identificación de dos picos con tiempos de retención entre 18,5 y 19,5 minutos (figura 6(A)). El espectro de masas del mayor de estos picos contenía abundantes iones con m/z de 161 y 201 (figura 6(B)). Las masas de estos iones concuerdan con la presencia del doble enlace en el átomo de carbono delta-5. El ión de 161 m/z (fragmento Y) es la masa esperada para la parte de carboxilo del derivado de DMDS de metil 16:1 \Delta5 y el ión de 201 m/z (fragmento X) es la masa esperada para el extremo metilo del derivado de DMDS de 16:1 \Delta5. También de manera coherente con la identificación de este pico como derivado de DMDS de 16:1 \Delta5 está el ión de 129 m/z que se genera mediante transposición de fragmento Y con la pérdida de 32 m/z. En general, el ión Y-32 se considera un ión de diagnóstico para derivados de DMDS de ésteres metílicos de ácidos grasos monoinsaturados (Francis, G. W. (1981) Chem. Phys. Lipids 29: 369-374). Debe observarse que el segundo pico más pequeño en la figura 6(A) se identificó como el derivado de DMDS de metil 16:1 \Delta9 (resultados no mostrados). Este ácido graso, al contrario que 16:1 \Delta5, puede detectarse en pequeñas cantidades en prácticamente todos los tejidos vegetales.

Inicialmente se identificaron derivados de DMDS de ácido metiloctadecenoico (18:1) usando un barrido iónico seleccionado para 390 m/z (figura 6(C)), que corresponde a la masa del ión molecular de estos aductos. Tal como se muestra en la figura 6(D), se esperaría que la fragmentación del derivado de DMDS de metil 18:1 \Delta5 genere iones de 161 m/z, 229 m/z y 129 m/z que corresponden a los fragmentos Y, X e Y-32, respectivamente. Estos iones se detectaron en un hombro en la parte frontal del pico correspondiente al derivado de metil 18:1 \Delta9, el ácido graso monoinsaturado principal de embriones de soja.

Los resultados presentados en el presente documento establecen la aparición de 16:1 \Delta5 y 18:1 \Delta5 en ésteres metílicos de ácidos grasos derivados de embriones de soja transgénicos que expresan la delta-5 acil-CoA desaturasade Limnanthes. Ninguno de los ácidos grasos fue detectable en derivados preparados a partir de embriones de soja de tipo natural.

Estos experimentos muestran que cuando se expresa en embriones de soja, la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes (SEQ ID NO: 5) cataliza la producción de araquidonato (20:0) a partir de palmitato (16:0). Estos experimentos también muestran que la acil-CoA desaturasade Limnanthes (SEQ ID NO: 2) codifica para una delta-5 desaturasa que produce ácidos grasos 16:1 delta-5 y 18:1 delta-5 cuando se expresa en embriones de soja transgénicos. Estos experimentos son la primera demostración de la actividad de la ácido graso acil-CoA elongasa y la delta-5 acil-CoA desaturasa de Limnanthes douglasii cuyas secuencias se exponen en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7.

La expresión de la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes en otras cosechas productoras de aceite aumentará las cantidades de C20:0 desde aproximadamente menos del 1% hasta más de aproximadamente el 15%. La expresión de la delta-5 acil-CoA desaturasa y la ácido graso acil-CoA elongasa de Limnanthes en otras cosechas de semillas oleaginosas tendrá el resultado de producir aceites 20:1 delta-5 que entonces pueden usarse en la producción de compuestos industrialmente útiles.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Expresión de genes quiméricos en células microbianas

Los ADNc que codifican para la presente enzima implicada en la biosíntesis de lípidos pueden insertarse en el vector de expresión pBT430 de E. coli de T7. Este vector es un derivado de pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125-135) que emplea el sistema bacteriófago de ARN polimerasa de T7/promotor de T7. Se construyó el plásmido pBT430 destruyendo en primer lugar los sitios EcoR I y Hind III en pET-3a en sus posiciones originales. Se insertó un adaptador oligonucleotídico que contenía sitios EcoR I y Hind III en el sitio BamH I de pET-3a. Esto creó pET-3aM con sitios de clonación únicos adicionales para la inserción de genes en el vector de expresión. Después, se convirtió el sitio Nde I en la posición de iniciación de la traducción en un sitio Nco I usando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Se convirtió la secuencia de ADN de pET-3aM en esta región, 5'-CATATGG, en 5'-CCCATGG en pBT430.

El ADN de plásmido que contiene un ADNc puede digerirse apropiadamente para liberar un fragmento de ácido nucleico que codifica para la proteína. Entonces puede purificarse este fragmento en un gel de agarosa de bajo punto de fusión NuSieve GTG^{TM} al 1% (FMC). El tampón y la agarosa contienen 10 \mug/ml de bromuro de etidio para la visualización del fragmento de ADN. Entonces puede purificarse el fragmento a partir del gel de agarosa mediante digestión con GELase^{TM} (Epicentre Technologies) según las instrucciones del fabricante, precipitarse en etanol, secarse y volver a suspenderse en 20 \mul de agua. Pueden ligarse adaptadores oligonucleotídicos apropiados al fragmento usando ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Puede purificarse el fragmento que contiene los adaptadores ligados a partir de los adaptadores en exceso usando agarosa de bajo punto de fusión tal como se describió anteriormente. Se digiere el vector pBT430, se desfosforila con fosfatasa alcalina (NEB) y se desproteiniza con fenol/cloroformo tal como se describió anteriormente. Entonces pueden ligarse el vector preparado pBT430 y el fragmento a 16ºC durante 15 horas seguido por una transformación en células electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL). Pueden seleccionarse transformantes sobre placas de agar que contienen medio LB y ampicilina 100 \mug/ml. Entonces se exploran transformantes que contienen el gen que codifica para la enzima implicada en la biosíntesis de lípidos para seleccionar la orientación correcta con respecto al promotor de T7 mediante análisis con enzimas de restricción.

Para la expresión de alto nivel, puede transformarse un clon de plásmido con el inserto de ADNc en la orientación correcta con respecto al promotor de T7 en la cepa BL21 de E. coli (DE3) (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130). Se hacen crecer los cultivos en medio LB que contiene ampicilina (100 mg/l) a 25ºC. A una densidad óptica de 600 nm de aproximadamente 1, puede añadirse IPTG (isopropiltio-\beta-galactósido, el inductor) hasta una concentración final de 0,4 mM y puede continuarse la incubación durante 3 h a 25ºC. Entonces se recogen las células mediante centrifugación y vuelven a suspenderse en 50 \mul de Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 que contiene DTT 0,1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM. Puede añadirse una pequeña cantidad de perlas de vidrio de 1 mm y sonicarse la mezcla tres veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonicador de microsonda. Se centrifuga la mezcla y se determina la concentración de proteínas del sobrenadante. Puede separarse un \mug de proteína de la fracción soluble del cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Pueden observarse los geles para determinar bandas de proteínas que migran en el peso molecular esperado.

<110> E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

\vskip0.400000\baselineskip

<120> GENES DE ACEITE DE LIMNANTHES

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BB-1117

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/078.736

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 20-03-1998

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<170> MICROSOFT WORD VERSIÓN 7.0A

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1355

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limnanthes douglasii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limnanthes douglasii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limnanthes douglasii

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (302)..(303)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (312)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (315)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (421)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1727)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 505

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limnanthes douglasii

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (74)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (77)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no es seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 844

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limnanthes douglasii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limnanthes douglasii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

16

17

Claims (12)

1. Fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa que comprende un elemento seleccionado del grupo que consiste en (a) y (b) en el que

(a)

es un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2;

(b)

es un fragmento de ácido nucleico aislado que es similar en al menos un 80% a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 usando el método Clustal de alineación y los parámetros por defecto K-TUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5; o un fragmento de ácido nucleico aislado que es complementario a (a) o (b).

2. Fragmento de ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos del fragmento comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.

3. Gen quimérico que comprende el fragmento de ácido nucleico según la reivindicación 1 operativamente unido a secuencias reguladoras adecuadas.

4. Célula huésped transformada que comprende el gen quimérico según la reivindicación 3.

5. Polipéptido de delta-5 acil-CoA desaturasa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

6. Método para alterar el nivel de expresión de una delta-5 acil-CoA desaturasa en una célula huésped que comprende

(a)

transformar una célula huésped con el gen quimérico según la reivindicación 3; y

(b)

hacer crecer la célula huésped transformada producida en la etapa (a) en condiciones que son adecuadas para la expresión del gen quimérico.

7. Método para producir un ácido graso desaturado que comprende un doble enlace en la posición delta-5 en una célula huésped, comprendiendo el método:

(a)

transformar una célula huésped con el gen quimérico según la reivindicación 3; y

(b)

hacer crecer la célula huésped transformada producida en la etapa (a) en condiciones que son adecuadas para la expresión del gen quimérico.

8. Método para producir aceite de semillas que comprende un ácido graso desaturado en el que el ácido graso comprende un doble enlace en la posición delta-5, comprendiendo el método:

(a)

transformar una célula vegetal con el gen quimérico según la reivindicación 3;

(b)

hacer crecer una planta fértil a partir de la célula vegetal transformada de la etapa (a);

(c)

obtener una semilla a partir de la planta de la etapa (b); y

(d)

procesar la semilla de la etapa (c) para obtener aceite

en el que el aceite comprende un ácido graso desaturado en el que el ácido graso comprende un doble enlace en la posición delta-5.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la célula vegetal se deriva de una cosecha de semillas oleaginosas.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la cosecha de semillas oleaginosas es soja.

11. Método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica para una delta-5 acil-CoA desaturasa que comprende:

(a)

examinar con sonda una biblioteca genómica o de ADNc con el fragmento de ácido nucleico según la reivindicación 1;

(b)

identificar un clon de ADN que se hibrida con el fragmento de ácido nucleico según la reivindicación 1 en condiciones rigurosas (0,1X SSC, SDS al 0,1%, 65ºC);

(c)

aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y

(d)

secuenciar el fragmento genómico o de ADNc que comprende el clon aislado en la etapa (c).

12. Método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica para una delta-5 acil CoA desaturasa que comprende:

(a)

sintetizar un cebador oligonucleotídico que comprende una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1; y

(b)

amplificar un inserto de ADNc presente en un vector de clonación usando el cebador oligonucleotídico de la etapa (a) y un cebador que representa secuencias del vector de clonación.