ES2310527T3 - Enzimas humanas de la familia de las metaloproteasas. - Google Patents

Enzimas humanas de la familia de las metaloproteasas. Download PDF

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Rico Wiegers
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Abstract

Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 6; y (b) la secuencia de nucleótidos de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 y Nº ID SEC: 5, o una secuencia de nucleótidos complementaria de dicho polinucleótido.

Description

Enzimas humanas de la familia de las metaloproteasas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a polipéptidos recientemente identificados y a polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, a su uso en terapia y para identificar compuestos que pueden ser estimuladores y/o inhibidores que son potencialmente útiles en terapia y a la producción de tales polipéptidos y polinucleótidos. Más particularmente, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención están relacionados con enzimas que son miembros de la familia de metaloproteasas de polipéptidos o de familias particulares de polipéptidos estructuralmente y funcionalmente relacionados. Estas enzimas se denominan posteriormente en la presente memoria IGS5. La invención también se refiere a inhibir o estimular/activar la acción de tales polipéptidos y polinucleótidos, a un vector que contiene dichos polinucleótidos y a una célula huésped que contiene tal vector. La invención se refiere además a un método para rastrear compuestos capaces de actuar como un estimulador o inhibidor de dichas enzimas
IGS5.
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Antecedentes de la invención
El proceso de descubrimiento de fármacos está sufriendo actualmente una revolución fundamental ya que abarca la "genómica funcional", esto es, la biología basada en genomas o genes de alto rendimiento. Este sistema, como un medio para identificar genes y productos génicos como dianas terapéuticas, está superando rápidamente a sistemas previos basados en la "clonación posicional". Se identificaría un fenotipo, es decir una función biológica o enfermedad genética, y a continuación se seguiría de nuevo hasta el gen responsable, basándose en su posición en el mapa
genético.
La genómica funcional se basa principalmente en tecnologías de secuenciación de DNA de alto rendimiento y las diversas herramientas de bioinformática para identificar secuencias génicas de interés potencial a partir de las muchas bases de datos de biología molecular disponibles actualmente. Todavía existe una necesidad de identificar y caracterizar genes adicionales y sus polipéptidos/proteínas relacionados, como dianas para el descubrimiento de fármacos.
Entre los polipéptidos de interés en el descubrimiento de fármacos, existen metaloproteasas y familias particulares de enzimas estructuralmente y funcionalmente relacionadas. Se han identificado varias enfermedades en las que las metaloproteasas representan un papel crítico en la patología de la enfermedad. Por ejemplo, un número de metaloproteasas de zinc de familias particulares de enzimas estructuralmente y funcionalmente relacionadas se ha identificado y caracterizado en el estado de la especialidad, y se ha hecho evidente que la participación de estas enzimas, por ejemplo metaloproteasas de zinc, representa un papel en una serie diversa de funciones biológicas que abarcan situaciones tanto normales como patológicas. Las metaloproteasas de zinc son un subgrupo de tales enzimas cuyas funciones catalíticas dependen críticamente del ion zinc en el sitio activo. Por ejemplo, se describe que este grupo de enzimas, que comprende diversas familias clasificadas sobre la base de la información tanto de secuencia como estructural, está íntimamente implicado en procesos tales como, por ejemplo, el desarrollo embrionario, la formación de cartílagos y huesos, el procesamiento de hormonas peptídicas, la reproducción, las enfermedades cardiovasculares, la artritis y el cáncer. Inhibidores dirigidos al sitio ya activos de algunas de las metaloproteasas de zinc están siendo usados terapéuticamente como, por ejemplo, antihipertensivos.
Partiendo de la base de la información de secuencia y estructural alrededor del sitio de unión a zinc de las metaloproteasas de zinc, estas enzimas pueden clasificarse en varias familias que pueden clasificarse además en superfamilias tales como las "metzincinas" (astacina, serratia, reprolisina, matrixina), las "gluzincinas" (termolisina, neprilisina, enzima convertidora de angiotensina, aminopeptidasa) o las "zincinas" que comprenden las superfamilias de metzincinas y gluzincinas. Tal agrupamiento no solo ayuda a la elucidación de mecanismos de procesamiento catalíticos y biosintéticos comunes, sino que también es inestimable para elucidar la función o las funciones de proteínas recientemente identificadas que poseen motivos de unión a zinc similares. Algunos ejemplos individuales de metaloproteasas, por ejemplo enzimas de zinc, ya identificadas en el estado de la especialidad comprenden neprilisina, enzima convertidora de endotelina, enzima convertidora de angiotensina, termolisina, aminopeptidasa, astacina, serratia, reprolisina, matrixina, insulinasa, carboxipeptidasa y DD-carboxipeptidasa.
A partir de la evidencia anterior basada en el estado de la especialidad, es evidente que las metaloproteasas y las enzimas estructuralmente y funcionalmente relacionadas particulares representan papeles clave en la salud y la enfermedad. Así, todavía existe una necesidad de descubrir adicionalmente funciones importantes y aplicaciones terapéuticas potenciales para este grupo de enzimas y de proporcionar nuevas metaloproteasas con el desarrollo subsiguiente de nuevos estimuladores (activadores) o inhibidores sintéticos que puedan ayudar a proporcionar nuevos tratamientos para una variedad de enfermedades de importancia socioeconómica.
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Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención se refiere a IGS5, en particular a polipéptidos de IGS5 y polinucleótidos de IGS5, preferiblemente los relacionados con la especie humana, a materiales recombinantes y a métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para usar tales polipéptidos, polinucleótidos y materiales recombinantes, incluyendo el tratamiento de enfermedades en las que polipéptidos como metaloproteasas o familias particulares de enzimas estructuralmente y funcionalmente relacionadas representan un papel crítico en la patología de las disfunciones, los trastornos o las enfermedades que han de tratarse, generalmente denominados posteriormente en la presente memoria "las enfermedades". Ejemplos de enfermedades, en el contexto de las cuales se cree que es útil el uso de los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención, incluyen entre otras: trastornos del SNC, incluyendo esquizofrenia, ansiedad paroxística episódica (EPA, por sus siglas en inglés), trastornos tales como trastorno obsesivo-compulsivo (OCD, por sus siglas en inglés), trastorno de estrés postraumático (PTSD, por sus siglas en inglés), fobia y pánico, trastorno depresivo principal, trastorno bipolar, enfermedad de Parkinson, trastorno de ansiedad general, autismo, delirio, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer/demencia y otras enfermedades neurodegenerativas, retardo mental severo y disquinesias, tales como enfermedad de Huntington o síndrome de Gilles de la Touret, anorexia, bulimia, apoplejía, adicción/dependencia/síndrome de abstinencia, trastorno del sueño, epilepsia, migraña; trastorno de déficit de atención/hiperactividad (ADHD, por sus siglas en inglés); enfermedades cardiovasculares incluyendo fallo cardíaco, angina de pecho, arritmias, infarto de miocardio, hipertrofia cardíaca, hipotensión, hipertensión - por ejemplo hipertensión esencial, hipertensión renal o hipertensión pulmonar, trombosis, arteriosclerosis, vasoespasmo cerebral, hemorragia subaracnoide, isquemia cerebral, infarto cerebral, enfermedad vascular periférica, enfermedad de Raynaud, enfermedad renal - por ejemplo fallo renal; dislipidemias; obesidad; vómitos; trastornos gastrointestinales incluyendo síndrome del intestino irritable (IBS, por sus siglas en inglés), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD, por sus siglas en inglés), enfermedad del reflujo gastroesofágico (GERD, por sus siglas en inglés), trastornos de movilidad y estados de vaciado gástrico retardado, tales como gastroparesis posoperatoria o diabética, y diabetes, úlceras - por ejemplo úlcera gástrica; diarrea; otras enfermedades incluyendo osteoporosis; inflamaciones; infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias y virales, particularmente infecciones provocadas por HIV-1 o HIV-2; dolor; cánceres; lesión inducida por quimioterapia; invasión tumoral; trastornos inmunitarios; retención urinaria; asma; alergias; artritis; hipertrofia prostática benigna; choque endotóxico; sepsis; una complicación de la diabetes mellitus. En un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos para identificar agonistas y antagonistas o inhibidores usando los materiales proporcionados por la invención. Condiciones asociadas con el desequilibrio de IGS5 pueden tratarse con los compuestos identificados. En un aspecto adicional más, la presente solicitud describe ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles inapropiados de
IGS5.
Los polipéptidos de la presente invención son de particular interés en el contexto de las enfermedades cardiovasculares.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 DNA de IGS5 ("DNAIGS5") del Nº ID SEC: 1
1
2 
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TABLA 2 Proteína de IGS5 (PROT"IGS5") del Nº ID SEC: 2
3 
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TABLA 3 DNA-1 de IGS5 ("DNA1IGS5") del Nº ID SEC: 3
4
5
TABLA 4 Proteína 1 de IGS5 (PROT1"IGS5") del Nº ID SEC: 4
6
TABLA 5 DNA-2 de IGS5 ("DNA2IGS5") del Nº ID SEC: 5
7
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TABLA 6 Proteína-2 de IGS5 (PROT2"IGS5") del Nº ID SEC: 6
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Descripción detallada de la invención Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados frecuentemente en la presente memoria.
"IGS5" se refiere, entre otras cosas, a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en uno de los ID SEC Nº: 2, ID SEC Nº: 4 y Nº ID SEC: 6.
Así, "IGS5" incluye particularmente PROTIGS5, PROT1IGS5 y PROT2IGS5.
"Actividad Enzimática" o "Actividad Biológica" se refiere a la función metabólica o fisiológica de dicha IGS5 incluyendo actividades similares o actividades mejoradas o estas actividades con efectos secundarios no deseables disminuidos. También se incluyen actividades antigénicas e inmunogénicas de dicha IGS5.
"Gen de IGS5" se refiere a un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en uno cualquiera de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 y Nº ID SEC: 5 y/o sus complementos.
"Anticuerpos", según se usa en la presente memoria, incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos Fab, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de Fab u otra inmunoglobulina.
"Aislado" significa alterado por el hombre con respecto al estado natural y/o separado del ambiente natural. Así, si una composición o sustancia "aislada" que está presente en la naturaleza se ha "aislado", se ha cambiado o retirado de su ambiente natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente naturalmente en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", según se emplea el término en la presente memoria.
"Polinucleótido" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, DNA de una sola hebra y de doble hebra, DNA que es una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra, RNA de una sola hebra y de doble hebra y RNA que es una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que pueden ser de una sola hebra o, más típicamente, de doble hebra o una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de triple hebra que comprenden RNA o DNA o tanto RNA como DNA. El término "polinucleótido" también incluye DNAs o RNAs que contienen una o más bases modificadas y DNAs o RNAs con cadenas principales modificadas con respecto a la estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen, por ejemplo bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Puede efectuarse una variedad de modificaciones en el DNA y el RNA; así, "polinucleótido" abarca formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos como los encontrados típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de DNA y RNA características de virus y células. "Polinucleótido" también abarca polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleótidos.
"Polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos ligados entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados; es decir, isoésteres peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipéptidos" incluyen secuencias de aminoácidos modificadas bien por procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, como por técnicas de modificación químicas que son bien conocidas en la especialidad. Tales modificaciones se describen a fondo en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino y carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en grados iguales o variables en varios sitios de un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos postraduccionales naturales o pueden elaborarse mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, biotinilación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto de heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol; reticulación, ciclación, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por RNA de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación, y ubiquitinación (véanse, por ejemplo, "Proteins-Structure and Molecular Properties", 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993; Wold, F., "Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", pp. 1-12 en "Post-translational Covalent Modification of Proteins", B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter y otros, "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646; y Rattan y otros, "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663: 48-62).
"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente, pero retiene las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios en los nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, según se analiza posteriormente. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones y deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una presente en la naturaleza tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que esté presente en la naturaleza. Las variantes no presentes en la naturaleza de polinucleótidos y polipéptidos pueden elaborarse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
"Identidad", según se conoce como una medida de la identidad en la especialidad, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, que se determina comparando las secuencias. En la especialidad, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, según se determina mediante el emparejamiento entre series de tales secuencias, por ejemplo, generalmente, mediante el alineamiento de las secuencias de modo que se obtenga el emparejamiento de orden más alto. Así, "Identidad" y/o la palabra alternativa "Similitud" tiene un significado conocido en la especialidad y puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero no limitados a, los descritos en "Computational Molecular Biology", Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; "Biocomputing: Informatics and Genome Projects", Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; "Computer Analysis of Sequence Data", Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; "Sequence Analysis in Molecular Biology", von Heinje, G., Academic Press, 1987; "Sequence Analysis Primer", Gribskov, M. y Devereux, J., Eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad se diseñan para dar el mayor emparejamiento entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Métodos informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J. y otros, Nucleic Acids Research 12 (1) : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul, S. F. y otros, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa BLAST X está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y otros, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también puede usarse para determinar la identidad. Un programa públicamente disponible útil para determinar la identidad o la similitud de secuencias polipeptídicas o secuencias polinucleotídicas, respectivamente, se conoce como el programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI, que se arranca habitualmente con los parámetros por defecto para las comparaciones (junto con ausencia de penalización para los huecos extremos). Los parámetros preferidos (es decir, por defecto) para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes: Un algoritmo como el descrito por Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); la Matriz de Comparación BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. de A. 89: 10915-10919 (1992); Penalización por Hueco: 12; Penalización por Longitud del Hueco: 14. Los parámetros preferidos (es decir, por defecto) para la comparación de secuencias polinucleotídicas incluyen los siguientes: Un algoritmo como el descrito por Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970); Matriz de Comparación: emparejamientos = +10, desemparejamientos = 0; Penalización por Hueco: 50; Penalización por Longitud del Hueco: 3. La palabra homología puede sustituir a la palabra identidad.
Como una ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de identidad con una secuencia de nucleótidos de referencia, por ejemplo con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 y Nº ID SEC: 5, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia respectiva. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a un secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede someterse a deleción o sustituirse por otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia, o en un número de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede haber una combinación de deleción, inserción y sustitución. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5'- o 3'-terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre nucleótidos dentro de la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
De forma similar, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, por ejemplo con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 y Nº ID SEC: 6, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia puede someterse a deleción o sustituirse por otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta 5% de los residuos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
"Homólogo" es un término genérico usado en la especialidad para indicar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica que posee un alto grado de relación de secuencia con una secuencia en cuestión. Tal relación puede cuantificarse determinando el grado de identidad y/o similitud entre las secuencias que se comparan según se describe en la presente memoria. Incluyéndose dentro de este término están los términos "ortólogo", que significa un polinucleótido o polipéptido que es el equivalente funcional de un polinucleótido o polipéptido en otra especie, y "parálogo", que significa una secuencia funcionalmente similar cuando se considera dentro de la misma especie. De ahí que, en seres humanos, por ejemplo, dentro de la familia de enzimas convertidoras de endotelina, ECE-1 es un parálogo de otros miembros, por ejemplo de ECE-2.
"Proteína de fusión" se refiere a una proteína codificada por dos genes o fragmentos de los mismos, a menudo no relacionados, fusionados. Este término puede ilustrarse, por ejemplo, por proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, emplear una región Fc de inmunoglobulina como una parte de una proteína de fusión es ventajoso para el uso en terapia y diagnóstico dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (véase, por ejemplo, el documento EP-A 0232262). Por otra parte, para algunos usos, sería deseable poder someter a deleción a la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado.
Polipéptidos de la Invención
La presente invención se refiere a polipéptidos de IGS5 (o enzimas IGS5, por ejemplo a PROTIGS5, PROT1IGS5 o PROT2IGS5, respectivamente), en particular a polipéptidos de IGS5 humanos (o enzimas IGS5 humanas).
Polipéptidos adicionales de la presente invención incluyen polipéptidos de IGS5 aislados que comprenden la secuencia contenida en uno de los Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 y Nº ID SEC 6, y que en particular son polipéptidos de la especie humana.
Los polipéptidos de la presente invención son miembros de la familia de metaloproteasas de polipéptidos. Son de interés debido a que se han identificado disfunciones, trastornos o enfermedades diversos en los que las metaloproteasas representan un papel crítico en la patología de la enfermedad. Ejemplos de las enfermedades, en el contexto de las cuales se cree que es útil el uso de los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención, incluyen entre otras: trastornos de SNC, incluyendo esquizofrenia, ansiedad paroxística episódica (EPA), trastornos tales como trastorno obsesivo-compulsivo (OCD), trastorno de estrés postraumático (PTSD), fobia y pánico, trastorno depresivo principal, trastorno bipolar, enfermedad de Parkinson, trastorno de ansiedad general, autismo, delirio, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer/demencia y otras enfermedades neurodegenerativas, retardo mental severo y disquinesias, tales como enfermedad de Huntington o síndrome de Gilles de la Touret, anorexia, bulimia, apoplejía, adicción/dependencia/síndrome de abstinencia, trastorno del sueño, epilepsia, migraña; trastorno de déficit de atención/hiperactividad (ADHD); enfermedades cardiovasculares incluyendo fallo cardíaco, angina de pecho, arritmias, infarto de miocardio, hipertrofia cardíaca, hipotensión, hipertensión - por ejemplo hipertensión esencial, hipertensión renal o hipertensión pulmonar, trombosis, arteriosclerosis, vasoespasmo cerebral, hemorragia subaracnoide, isquemia cerebral, infarto cerebral, enfermedad vascular periférica, enfermedad de Raynaud, enfermedad renal - por ejemplo fallo renal; dislipidemias; obesidad; vómitos; trastornos gastrointestinales incluyendo síndrome del intestino irritable (IBS), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad del reflujo gastroesofágico (GERD), trastornos de movilidad y estados de vaciado gástrico, tales como gastroparesis posoperatoria o diabética, y diabetes, úlceras, por ejemplo úlcera gástrica; diarrea; otras enfermedades incluyendo osteoporosis; inflamaciones; infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias y virales, particularmente infecciones provocadas por HIV-1 o HIV-2; dolor; cánceres; lesión inducida por quimioterapia; invasión tumoral; trastornos inmunitarios; retención urinaria; asma; alergias; artritis; hipertrofia prostática benigna; choque endotóxico; sepsis; una complicación de la diabetes mellitus. Los polipéptidos de la presente invención son de particular interés en el contexto de las enfermedades cardiovasculares. Por otra parte, los polipéptidos de IGS5 de la invención también son de interés para identificar estimuladores o inhibidores de estos polipéptidos, para proporcionar ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles de IGS5 inapropiados, y para tratar estados asociados con el desequilibrio de IGS5 con compuestos identificados como estimuladores o inhibidores. De ahí que los polipéptidos de IGS5 de la invención puedan usarse para diseñar o rastrear estimuladores o inhibidores selectivos, y así pueden conducir al desarrollo de nuevos fármacos. Las propiedades de los polipéptidos de IGS5, en particular de los polipéptidos de IGS5 de la especie humana, de la presente invención se denominan posteriormente en la presente memoria "actividad de IGS5" o "actividad del polipéptido de IGS5" o "actividad biológica de IGS5". Además, se incluyen entre estas actividades las actividades antigénicas e inmunogénicas de dichos polipéptidos de IGS5, en particular las actividades antigénicas e inmunogénicas de uno de los polipéptidos seleccionados del grupo de Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 y Nº ID SEC: 6. Preferiblemente, un polipéptido de la presente invención exhibe al menos una actividad biológica de IGS5, preferiblemente de IGS5 humana.
Los polipéptidos de IGS5 de la presente invención pueden estar en la forma de la proteína madura o pueden ser una parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líderes, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como múltiples residuos de histidina o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante.
La presente descripción trata además de fragmentos de los polipéptidos de IGS5, en particular de fragmentos de polipéptidos de IGS5 que comprenden una porción sustancial de todo el polipéptido de IGS5. Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es totalmente igual que parte, pero no la totalidad, de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de IGS5 mencionados anteriormente. Como con los polipéptidos de IGS5, los fragmentos pueden ser independientes o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido mayor del que forman una parte o región, lo más preferiblemente como una región continua individual.
Los fragmentos preferidos descritos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de IGS5, excepto por la deleción de una serie continua de residuos que incluye el extremo amino o una serie continua de residuos que incluye el extremo carboxilo o la deleción de dos series continuas de residuos, una que incluye el extremo amino y una que incluye el extremo carboxilo. Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos. Fragmentos biológicamente activos son los que median en la actividad enzimática, incluyendo aquellos con una actividad similar o una actividad mejorada, o con una actividad no deseable disminuida. También se incluyen los que son antigénicos o inmunogénicos en un animal, especialmente en un ser humano.
Con respecto a los polipéptidos de IGS5 de la presente invención, se encontró que estaban implicados en el metabolismo de péptidos biológicamente activos. En particular, se encontró que estos polipéptidos de IGS5 son enzimas de tipo metaloproteasa que pueden actuar sobre una variedad de péptidos vasoactivos. Péptidos vasoactivos conocidos en el estado de la especialidad son, por ejemplo, tales como el péptido natriurético auricular (ANP, por sus siglas en inglés), la bradiquinina, la endotelina grande (ET-1 Grande), la endotelina (ET-1), la sustancia P y la angiotensina-1. En el contexto de la presente invención, se encontró que el ectodominio de IGS5, que es una nueva metaloproteasa humana, hidroliza, por ejemplo, in vitro una variedad de dichos péptidos vasoactivos, incluyendo ET-1 Grande, ET-1, ANP y bradiquinina.
Por otra parte, la enzimas de tipo metaloproteasa de IGS5 de la presente invención pueden ser inhibidas por compuestos de referencia que se usan para determinar las propiedades de inhibición con respecto a enzimas que tienen características de ECE/NEP, por ejemplo inhibición por compuestos como fosforamidón. No se observa inhibición de IGS5 para compuestos de referencia que inhiben específicamente NEP, por ejemplo no hay inhibición de IGS5 por compuestos tales como tiorfano. Tampoco se observa inhibición de IGS5 para compuestos de referencia que inhiben específicamente ECE, por ejemplo no hay inhibición de IGS5 por compuestos tales como el inhibidor de ECE selectivo CGS-35066 (De Lombart y otros, J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43 (3): 488-504). Los datos de inhibición de estos compuestos de referencia con respecto a la inhibición de las enzimas de tipo metaloproteasa de IGS5 de la presente invención se describen adicionalmente en la parte experimental posterior, en particular en el Ejemplo 7.
Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier modo adecuado. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos presentes en la naturaleza aislados, polipéptidos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos métodos. Medios para preparar tales polipéptidos son bien conocidos en la especialidad.
Polinucleótidos de la Invención
En otro aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos de IGS5 (por ejemplo a DNAIGS5, DNA1IGS5 o DNA2IGS5, respectivamente), en particular polinucleótidos de IGS5 humanos, es decir, polinucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos contenida en uno de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 5, que codifican el polipéptido respectivo del Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 6.
La invención también proporciona polinucleótidos que son complementarios de todos los polinucleótidos descritos anteriormente.
La secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1 (denominada "DNAIGS5") es una secuencia de cDNA de origen humano (Homo sapiens) con una longitud de 2076 nucleótidos y comprende una secuencia codificante de polipéptido (desde el nucleótido Nº 1 al Nº 2073) que codifica un polipéptido de 691 aminoácidos, el polipéptido del Nº ID SEC: 2 (denominado "PROTIGS5"). La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Nº ID SEC: 2 puede ser idéntica a la secuencia codificante de polipéptido contenida en el Nº ID SEC: 1 o puede ser una secuencia distinta de la contenida en el Nº ID SEC: 1, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de Nº ID SEC: 2.
La secuencia de nucleótidos de Nº ID SEC: 3 (denominada "DNA1IGS5") es una secuencia de cDNA de origen humano (Homo sapiens) con una longitud de 2340 nucleótidos (incluyendo el codón de terminación tag) y comprende un secuencia codificante de polipéptido (desde el nucleótido Nº 1 al Nº 2337) que codifica un polipéptido de 779 aminoácidos, el polipéptido del Nº ID SEC: 4 (denominado "PROT1IGS5"). La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Nº ID SEC: 4 puede ser idéntica a la secuencia codificante de polipéptido contenida en el Nº ID SEC: 3 o puede ser una secuencia distinta de la contenida en el Nº ID SEC: 3, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de Nº ID SEC: 4.
La secuencia de nucleótidos de Nº ID SEC: 5 (denominada "DNA2IGS5") es una secuencia de cDNA de origen humano (Homo sapiens) con una longitud de 2262 nucleótidos (incluyendo el codón de terminación tag) y comprende un secuencia codificante de polipéptido (desde el nucleótido Nº 1 al Nº 2259) que codifica un polipéptido de 753 aminoácidos, el polipéptido del Nº ID SEC: 6 (denominado "PROT2IGS5"). La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Nº ID SEC: 6 puede ser idéntica a la secuencia codificante de polipéptido contenida en el Nº ID SEC: 5 o puede ser una secuencia distinta de la contenida en el Nº ID SEC: 5, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de Nº ID SEC: 6.
Las características del tipo de polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención se describen con más detalle posteriormente.
Rasgos Biológicos y Farmacológicos de las Metaloproteasas
Los polipéptidos de la presente invención y, en particular, los que son polipéptidos de la especie humana, están estructuralmente y funcionalmente relacionados con otras proteínas de la familia de las metaloproteasas, por ejemplo mostrando homología y/o similitud estructural con metaloproteasas o enzimas relacionadas, tales como, por ejemplo, MMPs, ACE, ECE o NEP, respectivamente. Así, por ejemplo, el polipéptido del Nº ID SEC: 2 está estructuralmente y funcionalmente relacionado con otras proteínas de la familia de las metaloproteasas, teniendo homología y/o similitud estructural con enzimas tales como NEP o ECE (por ejemplo ECE-1), y en particular con NEP. Así, se espera que los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención tengan, entre otras cosas, funciones/propiedades biológicas similares a sus polipéptidos y polinucleótidos homólogos. Por otra parte, los polipéptidos y polinucleótidos preferidos de la presente invención tienen al menos una actividad de IGS5.
Los rasgos generales de las metaloproteasas y sus actividades, en particular con respecto a la presente invención, ya se han descrito anteriormente. Para una comprensión más detallada de la naturaleza y las características de los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención, en particular la función de estos polipéptidos y polinucleótidos, algunos rasgos más específicos de cada una de enzimas tales como MMPs, ACE, ECE o NEP, respectivamente, se resumen como sigue.
Las metaloproteasas de matriz (MMPs), también denominadas matrixinas, son una familia de metaloproteasas de zinc que funcionan en la renovación de componentes de la matriz extracelular. Hasta la fecha, se han identificado en seres humanos varios miembros de la familia de matrixinas. Las MMPs son sintetizadas y secretadas desde un número de tipos de células tales como fibroblastos, células epiteliales, fagocitos, linfocitos y células cancerosas. Las MMPs son sintetizadas como pre-pro-enzimas que están destinadas a ser secretadas como proenzimas desde todas las células productoras excepto los neutrófilos. Bajo condiciones fisiológicas estas enzimas representan papeles fundamentales en la morfogénesis, la remodelación tisular y la reabsorción. En exceso, participan en la destrucción de la matriz extracelular asociada con muchas enfermedades del tejido conectivo tal como en la artritis, la periodontitis, la glomerulonefritis y con invasión y metástasis de células cancerosas. Así, las MMPs representan un papel fundamental, por ejemplo, en la génesis embrionaria y la remodelación tisular normales y en muchas enfermedades tales como artritis, cáncer, periodontitis, glomerulonefritis, encefalomielitis, aterosclerosis y ulceración tisular. Se ha puesto énfasis en la importancia de las matrixinas en el catabolismo tanto fisiológico como patológico de la matriz de tejido conectivo, debido a que puede detectarse poca actividad de MMPs en tejidos estacionarios normales, pero la síntesis de muchas MMPs está regulada por transcripción por citoquinas inflamatorias, hormonas, factores de crecimiento y durante la transformación celular. Las actividades biológicas de las MMPs son controladas adicionalmente de forma extracelular durante las etapas en su activación desde precursores inactivos (proMMPs), así como a través de interacción con el sustrato extracelular e inhibidores endógenos. Las MMPs son una clase importante de metaloproteasas dependientes de zinc implicadas en la degradación y la remodelación de la matriz extracelular. Los inhibidores de estas enzimas tienen potencial terapéutico en, por ejemplo, el cáncer, la artritis, la osteoporosis y la enfermedad de Alzheimer, y varios de estos inhibidores están bajo evaluación clínica.
La enzima convertidora de angiotensina I (ACE; peptidil dipeptidasa A; EC 3.4.15.1) es un miembro de la familia de enzimas convertidoras de angiotensina de metaloproteasas de zinc. La ACE se expresa principalmente en la superficie de células endoteliales, epiteliales y neuroepiteliales (ACE somática) como una ectoenzima, lo que significa que está anclada a la membrana plasmática con la carga de su masa, incluyendo su sitio o sitios catalíticos, estando expuesta al medio extracelular. La ACE se encuentra en la membrana plasmática de células endoteliales vasculares, con altos niveles encontrados en la superficie endotelial vascular del pulmón, de modo que los sitios activos de la ACE están situados para metabolizar sustratos en circulación. Además de la localización endotelial de la ACE, la enzima también se expresa en los bordes en cepillo de epitelios absorbentes del intestino delgado y el túbulo contorneado proximal del riñón. La ACE también se encuentra en células mononucleares, tales como monocitos después de la diferenciación de macrófagos, y linfocitos T, y en fibroblastos. La autorradiografía in vitro, que emplea inhibidores de ACE específicos radiomarcados, y los estudios inmunohistoquímicos han mapeado las localizaciones principales de la ACE en el cerebro. La ACE se encontró principalmente en el plexo coroidal, que puede ser la fuente de ACE en el fluido cerebroespinal, el ependimo, el órgano subfornical, los ganglios basales (caudado-putamen y globus pallidus), la substantia nigra y la pituitaria. Una forma soluble de ACE se ha detectado en muchos fluidos biológicos tales como el suero, el fluido seminal, el fluido amniótico y el fluido cerebroespinal. La forma soluble de ACE parece derivarse de la forma unida a membrana de la enzima en células endoteliales. Una actividad fisiológica importante de la ACE es que segmenta el dipéptido C-terminal de la angiotensina I para producir el potente péptido vasopresor angiotensina II e inactiva el péptido vasodilatador bradiquinina mediante la retirada secuencial de dos dipéptidos C-terminales. Como consecuencia de la implicación de la ACE en el metabolismo de estos dos péptidos vasoactivos angiotensina II y bradiquinina, la ACE se ha convertido en una diana molecular crucial en el tratamiento de la hipertensión y el fallo cardíaco congestivo. Esto ha conducido al desarrollo de inhibidores de ACE altamente potentes y específicos que se han hecho clínicamente importantes y extendidos como fármacos oralmente activos para controlar estos estados de hipertensión y fallo cardíaco congestivo. Aunque el metabolismo de los péptidos vasoactivos sigue siendo la función fisiológica mejor conocida de la ACE, la enzima también se ha relacionado con una gama de otros procesos fisiológicos no relacionados con la regulación de la presión sanguínea tales como la inmunidad, la reproducción y el metabolismo neuropeptídico debido a la localización de la ACE y/o la segmentación in vitro de una gama de péptidos biológicamente activos.
La endopeptidasa neutra (NEP, neprilisina, EC 3.4.24.11) es una metaloproteasa de zinc y está clasificada como un miembro de la familia de las neprilisinas. La NEP se aisló en primer lugar de las membranas con borde en cepillo de riñón de conejo. Más tarde, se identificó en cerebro de rata que una enzima similar a NEP estaba implicada en la degradación de los péptidos opiodes encefalinas. La clonación de la ectoenzima NEP y los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio subsiguientes han mostrado que, además de tener una especificidad similar a la termilisina, también tiene una organización de sitios activos similar. La NEP también muestra una especificidad similar a la termolisina para segmentar péptidos en el extremo N-terminal de residuos hidrófobos. Con respecto a la distribución general de NEP, se ha determinado en el cerebro y la médula espinal, y la lesión y los estudios microscópicos electrónicos apoyan generalmente una localización predominantemente neuronal de la NEP, aunque la enzima podría estar presente en oligodendrocitos que rodean las fibras de las rutas estriado-palidal y estriado-nigral y en células de Schwann en el sistema nervioso periférico. La NEP no parece estar concentrada en interfaces de membranas específicas tales como la sinapsis, pero está bastante uniformemente distribuida en la superficie de cuerpos celulares y dendritas neuronales. En la periferia, la NEP es particularmente abundante en las membranas con bordes en cepillo del riñón y el intestino, los nódulos linfáticos y la placenta, y se encuentra en concentraciones inferiores en muchos otros tejidos incluyendo la pared vascular de la aorta. Al encontrar que el antígeno de la leucemia linfoblástica aguda común era la NEP, también se observó en el estado de la especialidad que la enzima está presente transitoriamente en la superficie de células linfohematopoyéticas y se encuentran niveles elevados en linfocitos maduros en ciertos estados de enfermedad. El interés clínico en la NEP, en particular el interés en inhibidores de NEP como agentes clínicos potenciales, deriva de las acciones de la NEP, junto con otra metaloproteasa de zinc, la aminopeptidasa N (APN, alanil aminopeptidasa de membrana, EC 3.4.11.2), en la degradación de las encefalinas y también de su papel en la degradación del péptido natriurético auricular (ANP). Por ejemplo, se sabe que los inhibidores dobles de NEP y enzima convertidora de angiotensina (ACE) son potentes antihipertensivos, como resultado de incrementar simultáneamente los niveles en circulación de péptido natriurético auricular, debido a la inhibición de NEP, y disminuir los niveles en circulación de angiotensina II, debido a la inhibición de ACE. Un interés adicional en el potencial clínico de los inhibidores de NEP se produjo cuando se observó que la enzima periférica degradaba el péptido natriurético y diurético en circulación, el péptido natriurético auricular. Por lo tanto, los inhibidores de NEP se investigaron con respecto a sus propiedades antihipertensivas. A partir de un ejemplo adicional, se sabe que la inhibición del metabolismo de las encefalinas por el inhibidor de NEP sintético tiorfano daba respuestas antinociceptivas reversibles con naloxona en ratones. Esto abrió la posibilidad de que, al incrementar los niveles de opioides endógenos en las regiones de sus receptores diana, pudiera obtenerse una analgesia relativamente libre de los efectos secundarios de la morfina u otros fármacos opiáceos clásicos. Se apreció que, para alcanzar cualquier efecto significativo, también tenían que inhibirse otras enzimas metabolizadoras de encefalinas, en particular la aminopeptidasa N (APN). Tales inhibidores dobles de NEP/APN bloquean completamente el metabolismo de encefalinas y tienen fuertes propiedades antinociceptivas.
La enzima convertidora de angiotensina (ECE) cataliza la etapa final en la biosíntesis del potente péptido vasoconstrictor endotelina (ET). Esto implica la segmentación del enlace Trp-Val en el producto intermedio inactivo, endotelina grande. La ECE-1 es una metaloproteasa de zinc que es homóloga a la endopeptidasa neutra (NEP; neprilisina; EC 3.4.24.11, véase anteriormente). Como la NEP, la ECE-1 es inhibida por el compuesto fosforamidón y es una proteína de membrana integral tipo II. Sin embargo, a diferencia de la NEP, la ECE-1 existe como un dímero conectado por disulfuro y no es inhibida por otros inhibidores de NEP tales como tiorfano. Los estudios inmunocitoquímicos indican una localización predominante en la superficie celular para ECE-1, donde existe como una ectoenzima. La ECE-1 está localizada en células endoteliales y algunas células secretoras, por ejemplo células \beta del páncreas, y en células del músculo liso. Inhibidores potentes y selectivos de ECE, o inhibidores dobles de ECE y NEP, pueden tener aplicaciones terapéuticas en medicina cardiovascular y renal. La endotelina (ET), que es un péptido bicíclico de 21 aminoácidos que contiene dos enlaces disulfuro intramoleculares, es uno de los péptidos vasoconstrictores más potentes identificados hasta la fecha y la administración a animales da como resultado un incremento sostenido en la presión sanguínea que pone énfasis en su papel potencial en la regulación cardiovascular. La producción endógena de ET-1 en seres humanos contribuye al mantenimiento del tono vascular basal. El sistema de endotelina y enzimas relacionadas como ECE representa por lo tanto un aspirante probable para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Así, el interés clínico en la ECE, en particular el interés en inhibidores de ECE como agentes cínicos potenciales, deriva de las acciones de la ECE, en particular en el contexto de la biosíntesis de ET. Por consiguiente, los compuestos que muestran una actividad inhibidora de enzima convertidora de angiotensina significativa son útiles para tratar y prevenir diversas enfermedades que están inducidas o se sospecha que están inducidas por ET, tales como, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares incluyendo fallo cardíaco, angina de pecho, arritmias, infarto de miocardio, hipertrofia cardíaca, hipotensión, hipertensión - por ejemplo hipertensión esencial, hipertensión renal o hipertensión pulmonar, trombosis, arteriosclerosis, vasoespasmo cerebral, hemorragia subaracnoide, isquemia cerebral, infarto cerebral, enfermedad vascular periférica, enfermedad de Raynaud, enfermedad renal - por ejemplo fallo renal; asma; apoplejía, enfermedad de Alzheimer; una complicación de la diabetes mellitus; úlcera tal como úlcera gástrica; cáncer tal como cáncer de pulmón; choque endotóxico; sepsis; y similares.
Los polipéptidos de la presente invención son de particular interés en el contexto de las enfermedades cardiovasculares.
Procedimientos para Obtener Polinucleótidos de la Presente Invención
Los polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse usando técnicas de clonación y rastreo estándar, a partir de una biblioteca de cDNA derivada de mRNA en células de tejido testicular humano, usando el análisis de etiquetas de secuencias expresadas (EST) (Adams, M.D. y otros, Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, M.D. y otros, Nature, (1992) 355: 632-634; Adams, M.D. y otros, Nature (1995) 377 Supl: 3-174). Los polinucleótidos de la invención también pueden obtenerse a partir de fuentes naturales tales como bibliotecas de DNA genómico o pueden sintetizarse usando técnicas bien conocidas y disponibles comercialmente (por ejemplo, F.M. Ausubel y otros, 2000, Current Protocols in Molecular Biology).
Cuando los polinucleótidos de la presente invención se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificante para el polipéptido maduro, por sí mismo; o la secuencia codificante para el polipéptido maduro en el marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, una pre- o pro- o prepro-secuencia de proteína u otras porciones de péptidos de fusión. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexahistidínico, según se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y otros, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 821-824, o es una etiqueta de HA. El polinucleótido también puede contener secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como secuencias no traducidas transcritas, señales corte y empalme y poliadenilación, sitios de unión al ribosoma y secuencias que estabilizan mRNA.
Polinucleótidos que son idénticos o suficientemente idénticos a una secuencia de nucleótidos contenida en uno de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 5 pueden usarse como sondas de hibridación para cDNA y DNA genómico o como cebadores para una reacción de amplificación de ácidos nucleicos (PCR), para aislar cDNAs de longitud completa y clones genómicos que codifican polipéptidos de la presente invención y para aislar cDNA y clones genómicos de otros genes (incluyendo genes que codifican parálogos procedentes de fuentes humanas y ortólogos y parálogos procedentes de especies distintas al ser humano) que tienen una alta similitud de secuencia con uno de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 5. Típicamente, estas secuencias de nucleótidos son al menos 70% idénticas, preferiblemente al menos 80% y en particular al menos 85% idénticas, más preferiblemente al menos 90% idénticas, lo más preferiblemente al menos 95% idénticas, a las del referente. Las sondas o los cebadores comprenderán generalmente al menos 15 nucleótidos, preferiblemente al menos 30 nucleótidos, y pueden tener al menos 50 nucleótidos. Sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 y 50 nucleótidos. Cebadores particularmente preferidos tendrán entre 20 y 25 nucleótidos.
Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de rastrear una biblioteca adecuada bajo condiciones de hibridación restrictivas con una sonda marcada que tiene la secuencia de uno de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 5, o uno de sus fragmentos; y aislar cDNA de longitud completa y clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica. Tales técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto. Condiciones de hibridación restrictivas preferidas incluyen incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano (p/v) y 20 microgramos/ml de DNA de esperma de salmón cortado desnaturalizado; seguido por lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC.
El experto apreciará que, en muchos casos, una secuencia de cDNA aislada estará incompleta, ya que la región que codifica para el polipéptido se corta cerca del extremo 5' del cDNA. Esto es una consecuencia de la transcriptasa inversa, una enzima con "procesividad" (una medida de la capacidad de la enzima para permanecer ligada a la plantilla durante la reacción de polimerización) inherentemente baja, no completando una copia de DNA de la plantilla de mRNA durante la síntesis de DNA de la 1ª hebra.
Existen varios métodos disponibles y bien conocidos por los expertos en la especialidad para obtener cDNAs de longitud completa, o cDNAs cortos extendidos, por ejemplo los basados en el método de amplificación rápida de extremos de cDNA (RACE, por sus siglas en inglés) (véase, por ejemplo, Frohman y otros, PNAS USA 85, 8998-9002,1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de cDNAs más largos. En la tecnología Marathon^{TM}, se han preparado cDNAs a partir de mRNA extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada a cada extremo. Se lleva a cabo a continuación amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "perdido" del cDNA usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen y específicos para el adaptador. La reacción de PCR se repite a continuación usando cebadores "inclusivos", es decir, cebadores diseñados para reasociarse dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico para el adaptador que se reasocia más 3' en la secuencia del adaptador y un cebador específico para el gen que se reasocia más 5' en la secuencia génica conocida). Los productos de esta reacción pueden analizarse a continuación mediante secuenciación de DNA y construirse un cDNA de longitud completa bien empalmando el producto directamente al cDNA existente para dar una secuencia completa o bien llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.
Vectores, Células Huésped, Expresión
Pueden prepararse polipéptidos recombinantes de la presente invención mediante procedimientos bien conocidos en la especialidad a partir de células huésped sometidas a ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. De acuerdo con esto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que se someten a ingeniería genética con tales sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando RNAs derivados de los constructos de DNA de la presente invención.
Para la producción recombinante, las células huésped pueden someterse a ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos para polinucleótidos de la presente invención. La introducción de polinucleótidos en células huésped puede efectuarse mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y otros, Basic Methods in Molecular Biology (1986), y Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Tales métodos preferidos incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística o infección.
Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas tales como células de estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y de melanoma de Bowes; y células vegetales.
Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo sistemas cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, de un bacteriófago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vacunales, adenovirus, poxvirus aviares, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan y también engendran la expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector que sea capaz de mantener, propagar o expresar un polinucleótido para producir un polipéptido en un huésped. La secuencia de nucleótidos apropiada puede insertarse en un sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y habituales, tales como, por ejemplo, las indicadas en Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (anteriormente). Señales de secreción apropiadas pueden incorporarse en el polipéptido deseado para permitir la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, el espacio periplásmico o el ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas, es decir, derivadas de una especie diferente.
Si un polipéptido de la presente invención ha de expresarse para el uso en ensayos de rastreo, generalmente es posible que el polipéptido se produzca en la superficie de la célula o alternativamente en una forma de proteína soluble. Si el polipéptido se secreta al medio, el medio puede recuperarse para recuperar y purificar el polipéptido. Si se produce intracelularmente, las células deben someterse a lisis en primer lugar antes de que el polipéptido se recupere. Si el polipéptido está unido a la superficie de la célula (polipéptido unido a membrana), habitualmente se preparan fracciones de membrana para acumular el polipéptido unido a membrana.
Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatito y cromatografía en lectina. Lo más preferiblemente, se emplea para la purificación cromatografía líquida de alta resolución. Técnicas bien conocidas para replegar proteínas pueden emplearse para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación.
Ensayos Diagnósticos
Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos diagnósticos. La deleción de una forma mutada del gen caracterizado por uno de los polinucleótidos seleccionados del grupo de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 y Nº ID SEC: 5, que está asociada con una disfunción, proporcionará una herramienta diagnóstica que se añadirá a, o definirá, un diagnóstico de una enfermedad, o la propensión a una enfermedad, que resulta de la subexpresión, la sobreexpresión o la expresión espacial o temporal alterada del gen. Los individuos que tienen mutaciones en el gen pueden detectarse al nivel del DNA mediante una variedad de técnicas.
Los ácidos nucleicos para diagnóstico pueden obtenerse a partir de las células de un sujeto, tal como a partir de sangre, orina, saliva, biopsia tisular o material de autopsia. El DNA genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR u otras técnicas de amplificación antes del análisis. También pueden usarse RNA o cDNA de modo similar. Las deleciones e inserciones pueden detectarse mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden identificarse hibridando DNA amplificado a secuencias de nucleótidos de IGS5 marcadas. Secuencias perfectamente emparejadas pueden distinguirse de dúplex desacoplados mediante digestión con RNasa o mediante diferencias en las temperaturas de fusión. Las diferencias en las secuencias de DNA también pueden detectarse mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o mediante secuenciación directa de DNA (véase, por ejemplo, Myers y otros, Science (1985) 230: 1242). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también pueden revelarse mediante ensayos de protección frente a nucleasas, tales como protección frente a RNasa y S1, o mediante el método de segmentación (véase Cotton y otros, Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401). En otra realización, puede construirse una serie de sondas oligonucleotídicas que comprenden la secuencia de nucleótidos de IGS5 o fragmentos de la misma para efectuar un rastreo eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas. Los métodos de tecnología serial son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y pueden usarse para tratar una variedad de cuestiones en la genética molecular, incluyendo la expresión génica, la conexión genética y la variabilidad genética (véase, por ejemplo: P. Chee y otros, Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)).
Los ensayos diagnósticos ofrecen un procedimiento para diagnosticar o determinar una propensión a las enfermedades a través de la detección de una mutación en el gen de IGS5 mediante los métodos descritos. Además, tales enfermedades pueden diagnosticarse mediante métodos que comprenden determinar a partir de una muestra derivada de un sujeto un nivel anormalmente disminuido o incrementado de polipéptido o mRNA. La expresión disminuida o incrementada puede medirse al nivel del RNA usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la especialidad para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección frente a RNasa, transferencia Northern y otros métodos de hibridación. Técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de una proteína, tal como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped son bien conocidas por los expertos en la especialidad. Tales métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western y ensayos ELISA.
Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un estuche (kit) diagnóstico que comprende:
(a)
un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de uno de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 5, o uno de sus fragmentos;
(b)
una secuencia de nucleótidos complementaria de la de (a);
(c)
un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de uno de los Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 6, o uno de sus fragmentos; o
(d)
un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferiblemente para uno de los polipéptidos de Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 6.
Se apreciará que, en cualquiera de tales estuches, el componente (a), (b), (c) o (d) puede constituir un componente sustancial de dicho estuche diagnóstico. Tal estuche puede ser de utilidad para diagnosticar una enfermedad o la propensión a una enfermedad, particularmente, entre otras, una enfermedad como la indicada anteriormente en el contexto de los polipéptidos de la presente invención.
Ensayos Cromosómicos
Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también son valiosas para la localización de cromosomas. La secuencia se dirige específicamente a, y puede hibridarse con, una localización particular en un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes para cromosomas de acuerdo con la presente invención es una primera etapa importante al correlacionar esas secuencias con la enfermedad asociada al gen. Una vez que una secuencia se ha mapeado hasta una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedades que se han mapeado hasta la misma región cromosómica se identifica a continuación a través de análisis de conexión (coherencia de genes físicamente adyacentes).
También pueden determinarse las diferencias en la secuencia de cDNA o genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en alguno o todos los individuos afectados pero no en individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causal de la enfermedad.
Localización Tisular
Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también son valiosas para la localización tisular. Tales técnicas permiten la determinación de patrones de expresión de los polipéptidos de IGS5 en tejidos mediante la detección de los mRNAs que los codifican. Estas técnicas incluyen técnicas de hibridación in situ y técnicas de amplificación de nucleótidos, por ejemplo PCR. Tales técnicas son bien conocidas en la especialidad. Los resultados de estos estudios proporcionan una indicación de las funciones normales de los polipéptidos en el organismo. Además, estudios comparativos del patrón de expresión normal de mRNAs de IGS5 con el de mRNAs codificados por un gen de IGS5 proporcionan percepciones valiosas del papel de polipéptidos de IGS5 mutantes, o el de la expresión inapropiada de polipéptidos de IGS5 normales, en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de naturaleza temporal, espacial o simplemente cuantitativa.
Los polipéptidos de la invención o sus fragmentos o análogos, o las células que los expresan, también pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos de la presente invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen una afinidad sustancialmente mayor para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la especialidad anterior.
Anticuerpos
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de la presente invención pueden obtenerse administrando los polipéptidos o fragmentos que tienen epítopos, análogos o células a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos habituales. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Ejemplos incluyen la técnica de los hibridomas (Kohler, G. y Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), la técnica de los triomas, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y otros, Immunology Today (1983) 4: 72) y la técnica del hibridoma del EBV (Cole y otros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). Técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios, tales como las descritas en la Patente de EE.UU. Nº 4.946.778, también pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios para polipéptidos de esta invención. Además, ratones, u otros organismos, incluyendo otros mamíferos, transgénicos pueden usarse para expresar anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o para identificar clones que expresan el polipéptido o para purificar los polipéptidos mediante cromatografía de afinidad.
Anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención también pueden emplearse para tratar las enfermedades que se indican anteriormente, entre otras.
Proteínas de Fusión
En un aspecto adicional, la presente invención puede estar en la forma de una proteína de fusión soluble sometida a ingeniería genética que comprende dicho polipéptido y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG, particularmente IgG1, humana, donde la fusión tiene lugar en la región de bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede retirarse simplemente mediante la incorporación de una secuencia de segmentación que puede segmentarse con factor de coagulación de la sangre Xa. Por otra parte, esta solicitud describe procedimientos para la preparación de proteínas de fusión mediante ingeniería genética y su uso para el rastreo de fármacos, el diagnóstico y la terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Ejemplos de tecnología para proteínas de fusión pueden encontrarse en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.
Vacunas
El polipéptido de la invención puede usarse para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero, que comprende administrar (por ejemplo mediante inoculación) al mamífero un polipéptido de la presente invención, adecuado para producir respuesta inmunitaria de anticuerpos y/o células T para proteger a dicho animal de las enfermedades mencionadas anteriormente en la presente memoria, entre otras. La respuesta inmunológica también puede inducirse en un mamífero aportando un polipéptido de la presente invención a través de un vector que dirige la expresión del polinucleótido y que codifica para el polipéptido in vivo para inducir tal respuesta inmunológica para producir anticuerpo para proteger a dicho animal de enfermedades.
La presente solicitud describe una formulación (composición) inmunológica/vacunal que, cuando se introduce en un huésped mamífero, induce una respuesta inmunológica en ese mamífero a un polipéptido de la presente invención, en donde la composición comprende un polipéptido o polinucleótido de la presente invención. Tales formulaciones (composiciones) inmunológicas/vacunales pueden ser bien formulaciones inmunológicas/vacunales terapéuticas o bien formulaciones inmunológicas/vacunales profilácticas. La formulación vacunal puede comprender además un portador adecuado. Puesto que un polipéptido puede desintegrarse en el estómago, preferiblemente se administra parenteralmente (por ejemplo inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que pueden hacer a la formulación isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de una sola dosis o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado liofilizado que solo requiere la adición del portador líquido estéril inmediatamente antes del uso. La formulación vacunal también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación, tales como sistemas de aceite en agua y otros sistemas conocidos en la especialidad. La dosificación dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente mediante experimentación habitual.
Ensayos de Rastreo
Los polipéptidos de la presente invención son responsables de una o más funciones biológicas, incluyendo uno o más estados de enfermedad, en particular las enfermedades mencionadas anteriormente en la presente memoria. Por lo tanto, es deseable idear métodos de rastreo para identificar compuestos que estimulen o que inhiban la función del polipéptido. De acuerdo con esto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para rastrear compuestos para identificar los que estimulan o que inhiben la función del polipéptido. Pueden identificarse compuestos procedentes de una variedad de fuentes, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Tales estimuladores o inhibidores así identificados pueden ser sustratos, ligandos, receptores, enzimas, etc., naturales o modificados, según sea el caso, del polipéptido; o pueden ser miméticos estructurales o funcionales del mismo (véase Coligan y otros, Current Protocols in Immunology 1 (2): Capítulo 5 (1991)).
El método de rastreo puede medir simplemente la influencia de un compuesto aspirante sobre la actividad del polipéptido o sobre células o membranas que tienen el polipéptido. Alternativamente, el método de rastreo puede implicar la competición con un competidor. Además, estos métodos de rastreo pueden probar si el compuesto aspirante da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para la actividad del polipéptido o para las células o las membranas que tienen el polipéptido. La inhibición de la actividad del polipéptido se ensaya generalmente en presencia de un sustrato conocido y el efecto del compuesto aspirante se observa por la actividad alterada, por ejemplo probando si el compuesto aspirante da como resultado inhibición o estimulación del polipéptido. Por ejemplo, los métodos de rastreo pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto aspirante con una solución que contiene un polipéptido de la presente invención y un sustrato adecuado para formar una mezcla, medir la actividad de IGS5 en la mezcla y comparar la actividad de IGS5 de la mezcla con un patrón sin compuesto aspirante.
Los polinucleótidos, los polipéptidos y los anticuerpos para el polipéptido de la presente invención también pueden usarse para configurar métodos de rastreo para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de mRNA y polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir niveles secretados o asociados a células de polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante métodos estándar conocidos en la especialidad. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido desde células o tejidos adecuadamente manipulados.
Ejemplos de inhibidores de polipéptidos potenciales incluyen anticuerpos o, en algunos casos, oligonucleótidos o proteínas que están estrechamente relacionados con los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc., según sea el caso del polipéptido, por ejemplo, un fragmento de los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc.; o pequeñas moléculas que se unen al polipéptido de la presente invención pero no provocan una respuesta, de modo que se evita la actividad del polipéptido.
Así, en otro aspecto, la presente solicitud describe un estuche de rastreo para identificar en particular inhibidores, estimuladores, ligandos, receptores, sustratos, enzimas, etc. para polipéptidos de la presente invención; o compuestos que disminuyen o potencian la producción de tales polipéptidos, que comprende:
(a)
un polipéptido de la presente invención;
(b)
una célula recombinante que expresa un polipéptido de la presente invención;
(c)
una membrana celular que expresa un polipéptido de la presente invención; o
(d)
un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención; polipéptido que es preferiblemente uno de los de Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 6.
Se apreciará que, en cualquiera de tales estuches, el componente (a), (b), (c) o (d) puede constituir una parte sustancial de dicho estuche.
Será apreciado fácilmente por el experto que un polipéptido de la presente invención también puede usarse en un método para el diseño basado en la estructura de un estimulador o inhibidor del polipéptido, al:
(a)
determinar en primer lugar la estructura tridimensional del polipéptido;
(b)
deducir la estructura tridimensional para el sitio o los sitios probablemente reactivos o de unión de un estimulador o inhibidor;
(c)
sintetizar compuestos aspirantes que se predice que se unen a o reaccionan con el sitio de unión o reactivo deducido; y
(d)
probar si los compuestos aspirantes son en efectos estimuladores o inhibidores.
Se apreciará además que este será normalmente un procedimiento iterativo.
Métodos Profilácticos y Terapéuticos
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para tratar estados anormales tales como, por ejemplo, aquellas disfunciones, trastornos o enfermedades que han de tratarse, denominados generalmente anteriormente en la presente memoria "las enfermedades" en el contexto de los polipéptidos de la presente invención, relacionados bien con un exceso de o bien con una subexpresión de la actividad de polipéptidos de IGS5.
Si la actividad del polipéptido está en exceso, están disponibles varios sistemas. Un sistema comprende administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto inhibidor como el descrito anteriormente en la presente memoria, opcionalmente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para inhibir la función del polipéptido, tal como, por ejemplo, bloqueando la unión de sustratos, enzimas, etc., y de ese modo aliviando el estado anormal. En otro sistema, pueden administrarse formas solubles de los polipéptidos todavía capaces de unirse al sustrato, las enzimas, etc. en competición con polipéptido endógeno. Ejemplos típicos de tales competidores incluyen fragmentos del polipéptido de IGS5.
En otro sistema más, la expresión del gen que codifica polipéptido de IGS5 endógeno puede inhibirse usando técnicas de bloqueo de la expresión. Tales técnicas conocidas implican el uso de secuencias antisentido, bien generadas internamente o bien administradas separadamente (véase, por ejemplo, O'Connor, J. Neurochem. (1991) 56: 560 en Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Alternativamente, pueden suministrarse oligonucleótidos que forman triples hélices ("tríplex") con el gen (véanse, por ejemplo, Lee y otros, Nucleic Acids Res (1979) 6: 3073; Cooney y otros, Science (1988) 241: 456; Dervan y otros, Science (1991) 251: 1360). Estos oligómeros pueden administrarse por sí mismos o los oligómeros pertinentes pueden expresarse in vivo. Los oligonucleótidos antisentido o tríplex sintéticos pueden comprender bases modificadas o cadenas principales modificadas. Ejemplos de las últimas incluyen cadenas principales de fosfonato de metilo, fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos. Tales cadenas principales se incorporan en el oligonucleótido antisentido o tríplex para proporcionar protección de la degradación por nucleasas y son bien conocidos en la especialidad. Las moléculas antisentido y tríplex sintetizadas con estas y otras cadenas principales modificadas también forman parte de la presente invención.
Además, la expresión del polipéptido de IGS5 puede evitarse usando ribozimas específicas para la secuencia de mRNA de IGS5. Las ribozimas son RNAs catalíticamente activos que pueden ser naturales o sintéticos (véase, por ejemplo, Usman, N, y otros, Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6 (4), 527-33.) Pueden diseñarse ribozimas sintéticas para segmentar específicamente mRNAs de IGS5 en posiciones seleccionadas, evitando de ese modo la traducción de los mRNAs de IGS5 en polipéptido funcional. Pueden sintetizarse ribozimas con una cadena principal natural de fosfato de ribosa y bases naturales, como se encuentra normalmente en moléculas de RNA. Alternativamente, las ribozimas pueden sintetizarse con cadenas principales no naturales para proporcionar protección de la degradación por ribonucleasas, por ejemplo, 2'-O-metil-RNA, y pueden contener bases modificadas.
Para tratar estados anormales relacionados con la subexpresión de IGS5 y su actividad, también están disponibles varios sistemas. Un sistema comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que estimula a un polipéptido de la presente invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, para aliviar de ese modo el estado anormal. Alternativamente, puede emplearse terapia génica para efectuar la producción endógena de IGS5 por las células pertinentes en el sujeto. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede someterse a ingeniería para la expresión en un vector retroviral deficiente para la replicación, según se analiza anteriormente. El constructo de expresión retroviral puede entonces aislarse e introducirse en una célula de empaquetamiento transducida con un vector plasmídico retroviral que contiene RNA que codifica un polipéptido de la presente invención, de modo que la célula de empaquetamiento produzca ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden administrarse a un sujeto para someter a ingeniería a células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo. Para una visión general de la terapia génica, véase el Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (y las referencia citadas allí) en Human Molecular Genetics, T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996). Otro sistema es administrar una cantidad terapéutica de un polipéptido de la presente invención en combinación con un portador farmacéutico adecuado.
Formulación y Administración
En un aspecto adicional, la presente solicitud describe composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, tal como la forma soluble de un polipéptido de la presente invención, que estimula o inhibe un péptido o un compuesto de moléculas pequeñas, en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La presente solicitud describe además paquetes y estuches farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones mencionadas anteriormente. Los polipéptidos y otros compuestos de la presente invención pueden emplearse solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.
La composición estará adaptada a la ruta de administración, por ejemplo mediante una ruta sistémica o una oral. Formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Pueden usarse otras rutas de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen administración transmucosal y transdérmica usando agentes penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también es posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en la forma de ungüentos, pastas, geles y similares.
El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido u otros compuestos de la presente invención, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza del estado del sujeto y el juicio del médico asistente. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de sujeto. Sin embargo, han de esperarse amplias variaciones en la dosificación deseada en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de las diversas rutas de administración. Por ejemplo, se esperará que la administración oral requiera dosificaciones superiores que la administración mediante inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para la optimización, como se sabe bien en la especialidad.
Los polipéptidos usados en un tratamiento también pueden generarse endógenamente en el sujeto, en modalidades de tratamiento a menudo denominadas "terapia génica" según se describe anteriormente. Así, por ejemplo, las células de un sujeto pueden tratarse mediante ingeniería con un polinucleótido, tal como DNA o RNA, para codificar un polipéptido ex vivo, y, por ejemplo, mediante el uso de un vector plasmídico retroviral. Las células se introducen a continuación en el sujeto.
Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas forman una fuente de información valiosa con la que es posible identificar otras secuencias de homología similar. Esto se facilita lo más sencillamente almacenando la secuencia en un medio legible informáticamente y a continuación usando los datos almacenados para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como las de los paquetes de software GCC y Lasergene. De acuerdo con esto, en un aspecto adicional, la presente solicitud describe un medio legible informáticamente que tiene almacenado en el mismo un polinucleótido que comprende las secuencias de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 5 y/o una secuencia polipeptídica codificada por el mismo.
Todas las publicaciones, incluyendo, pero no limitadas a, patentes y solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente memoria mediante referencia como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación individual estuviera incorporada mediante referencia en la presente memoria como si estuviera totalmente indicada.
Los siguientes Ejemplos solo están destinados a ilustrar adicionalmente la invención, con más detalle, y por lo tanto no se considera que estos ejemplos restrinjan de ningún modo el alcance de la invención.
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Ejemplo 1
La clonación de cDNA que codifica un nuevo miembro de la familia de metaloproteasas NEP/ECE
Ejemplo 1a
Clonación por PCR de homología de un fragmento de cDNA de un nuevo miembro de la familia de metaloproteasas NEP/ECE
En el banco de datos de DNA de etiquetas de secuencia expresadas (ESTs) se detectaron 4 secuencias de EST solapadas (nº de registro AA524283, AI088893, AI217369 y AI380811) que contenían un marco de lectura abierto pequeño que codifica una extensión de proteína que mostraba similitud con la parte C-terminal de miembros de la familia de metaloproteasas de endopeptidasa neutra 24.11/enzima convertidora de endotelina (NEP/ECE) (Turner A. J. y otros Faseb J. [1997] 11: 355-364). El marco de lectura abierto pequeño similar a NEP/ECE en estas ESTs se terminaba mediante un codón de terminación (en el caso de AA524283) y estaba precedido en las 4 ESTs por una secuencia que contenía codones de terminación en lo 3 marcos de lectura. Esta secuencia precedente no parecía estar en absoluto relacionada con miembros de la familia de metaloproteasas NEP/ECE. Aunque la polaridad del marco de lectura abierto pequeño era opuesta a la orientación 5'\rightarrow3' del mRNA del que se han derivado estas ESTs, se decidió usar estas secuencias como la base para un sistema de clonación por homología de RT-PCR. En paralelo, se observó que secuencias de EST adicionales, que mostraban la misma estructura que las 4 ESTs mencionadas anteriormente, aparecían en los bancos de datos de dominio público, por ejemplo nº de registro: AI825876, AI888306, AI422224, AI422225, AI469281, AA975272, AA494534, AW006103, AI827701, AI650385, AI827898, AI934499 y AA422157. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo usando un cebador inverso (IP11689; Nº ID SEC: 7) diseñado sobre el aglomerado de EST (dentro del área que muestra similitud con la familia de NEP/ECE) y un cebador directo degenerado (IP11685; Nº ID SEC: 8), centrado en un motivo peptídico conservado [VNA(F,Y)Y] de la familia de NEP/ECE.
Para la síntesis de cDNA, 2 \mug de RNA total de pulmón humano (Clontech #64023-1), 1 \mul de oligo(dT) 12-18 (500, \mug/ml) y 9 \mul de H_{2}O se combinaron [volumen final = 12 \mul], se calentaron hasta 70ºC durante 10 minutos y a continuación se enfriaron sobre hielo. Se añadieron 4 \mul de 5 x tampón para la primera hebra [Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl_{2} 15 mM], 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de mezcla de dNTP 10 mM y 1 \mul (200 U) de transcriptasa inversa Superscript^{TM} II (Life Technologies). La mezcla se incubó a 42ºC durante 50 minutos y la reacción se inactivó calentando a 70ºC durante 15 minutos.
La reacción de PCR se realizó en un volumen de 50 \mul que contenía 1 \mul de la reacción de síntesis de cDNA, 5 \mul de 10 x tampón de PCR GeneAmp^{TM} (KCl 500 mM, Tris 100 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, 0,01% (p/v) de gelatina; Perkin Elmer), 2 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores directo e inverso y 5 unidades de polimerasa AmpliTaq^{TM} (Perkin Elmer). Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min., las reacciones de PCR se realizaron cíclicamente 40 x como sigue: 1 min de desnaturalización a 94ºC, 1 min de reasociación a 60ºC y 1 min de extensión a 72ºC. Los productos de reacción de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La reacción de RT-PCR de IP11685/lP11689 producía un amplicón de \pm 600 pares de bases (pb). El fragmento se purificó del gel usando el estuche de purificación Qiaex-II^{TM} (Qiagen) y se ligó en el plásmido pGEM-T Easy de acuerdo con el procedimiento recomendado por el suministrador (sistema pGEM-T Easy, Promega). Los plásmidos recombinantes se usaron a continuación para transformar bacterias E. coli competentes SURE^{TM} 2 (Stratagene). Las células transformadas se cultivaron en placa sobre placas de agar LB que contenían ampicilina (100 \mug/l), IPTG (0,5 mM) y X-gal (50 \mug/ml). El DNA plasmídico se purificó de minicultivos de colonias individuales usando el sistema de purificación de ácidos nucleicos BioRobot^{TM} 9600 (Qiagen). Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación de DNA sobre el DNA plasmídico purificado con el estuche ABI Prism^{TM} BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE-ABI), usando cebadores de flanqueo de insertos o internos. Los insertos plasmídicos se sometieron a secuenciación completamente en ambas hebras. Los productos de la reacción de secuenciación cíclica se purificaron a través de precipitación con EtOH/NaOAc y se analizaron en un secuenciador automatizado ABI 373. La secuencia de DNA de los insertos de los clones recombinantes YCE14, YCE15 y YCE16 (derivados del amplicón IP11685/lP11689) extendía el marco de lectura abierto del aglomerado de EST original en la dirección del extremo N y confirmaba adicionalmente que este marco de lectura abierto se derivaba de un nuevo miembro de la familia de proteínas de metaloproteasas (véase la Fig. 1). Esta secuencia aguas arriba se desviaba así completamente de la secuencia aguas arriba presente en las secuencias de EST. Esta nueva secuencia se denomina dentro del contexto de la presente invención generalmente "IGS5".
Ejemplo 1b
Clonación de cDNA que contiene el ectodominio putativo de IGS5
Para obtener una secuencia de cDNAIGS5, se llevó a cabo otra ronda de reacciones de RT-PCR sobre RNA de pulmón humano bajo las condiciones descritas anteriormente usando el cebador inverso específico de IGS5 IP12190 (Nº ID SEC: 9) y un cebador directo degenerado (IP12433; Nº ID SEC: 10), centrado en un motivo peptídico conservado [LXXLXWMD] de la familia NEP/ECE. La reacción de RT-PCR de IP12190/12433 producía un amplicón de \pm 600 pb que se clonaba en el vector pGEM-T Easy dando los clones YCE19, YCE22 e YCE23. Todos los clones se sometieron a secuenciación completamente y se dejó que extendieran el marco de lectura abierto de IGS5 más aguas arriba (véase la Fig. 1).
Para obtener clones de cDNA que cubrirían el extremo 5' del transcrito de IGS5, se realizaron reacciones de PCR RACE 5' semiinclusivas sobre cDNA Marathon-Ready^{TM} de corazón humano usando el cebador adaptador 1 (AP1: Nº ID SEC: 11) proporcionado con el estuche de amplificación de cDNA Marathon^{TM} (Clontech K1802-1) en combinación con los cebadores específicos para IGS5 IP12189 Nº ID SEC: 12) y IP12585 (Nº ID SEC: 13). Se realizaron reacciones de PCR RACE de acuerdo con las instrucciones del manual de usuario del cDNA Marathon-Ready^{TM} proporcionado por Clontech. Los productos de RACE se separaron sobre gel de agarosa, se visualizaron con bromuro de etidio y se transfirieron sobre membranas Hybond N+. Las transferencias se prehibridaron a 65ºC durante 2 h en tampón de Church modificado (fosfato 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 10 mM) y a continuación se hibridaron durante la noche a 65ºC en el mismo tampón que contenía 2 x 10^{6} cpm/ml del inserto marcado con ^{32}P del clon YCE23. El inserto YCE23 se radiomarcó a través de la incorporación cebada aleatoria de [\alpha-^{32}P]dCTP hasta una actividad específica de >10^{9} cpm/\mug usando el estuche Prime-It II^{TM} (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el suministrador. Las transferencias hibridadas se lavaron con restricción alta (2 x 30 min a temperatura ambiente en 2 x SSC/SDS al 0,1% seguido por 2 lavados de 40 min a 65ºC en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%) y se autorradiografiaron durante la noche. Los fragmentos que se hibridan se purificaron de gel, se clonaron en el vector pGEM-T Easy (dando los clones YCE 59, YCE 64 e YCE 65) y se sometieron a secuenciación como se describe anteriormente.
Las secuencias de DNA de todos los clones aislados podían montarse en un solo cóntigo (CONSIGS5; véase la Fig. 1) que extendía el marco de lectura abierto de IGS5 más aguas arriba pero sin embargo no se encontraba un inicio ATG del codón de traducción. El cebador IP11689 se ha diseñado en EST AI380811 y no contenía los 4 últimos nucleótidos antes del codón de terminación presente en las secuencias de EST alineadas. Para generar un marco de lectura abierto que terminara en el codón de terminación, los 22 nucleótidos últimos (consenso) de las secuencias de EST alineadas se incluían en el montaje global de CONSIGS5.
Las búsquedas de homología mostraban que la proteína codificada (parcial) era la más similar a la endopeptidasa neutra (NEP; véase el Ejemplo 2). Sin embargo, los 20 aminoácidos iniciales del marco de lectura abierto de
CONSIGS5 no mostraban ninguna similitud con NEP. Esto podría deberse posiblemente al hecho de que se derivaban de un intrón. En efecto, el exón 4 de NEP humana empieza en una posición que corresponde aproximadamente a la posición aguas abajo de estos 20 aminoácidos (D'Adamio L. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [1989] 86: 7103-7107). El análisis de hidropatía (Kyte J. y otros [1982] J. Mol. Biol. 157: 105-132; Klein P. y otros Biochim. Biophys. Acta 815: 468-476) no indicaba la presencia de un dominio de transmembrana dentro de la secuencia de aminoácidos de CONSIGS5 predicha, aunque se esperaría que tal dominio de transmembrana se presentara (o al menos solapara con) dentro de los 20 aminoácidos iniciales. Por estas razones, se prefería excluir la parte de secuencia inicial del cóntigo de IGS5 (Fig. 1). La secuencia de DNA resultante (DNAIGS5; Nº ID SEC: 1) tiene 2076 nucleótidos de largo (incluyendo el codón de terminación) y codifica una proteína de 691 residuos (PROTIGS5, Nº ID SEC: 2). El alineamiento de PROTIGS5 con la secuencia proteínica de NEP humana mostraba que la secuencia de PROTIGS5 corresponde a la secuencia de ectodominio completa de NEP. Puede esperarse así que PROTIGS5 tenga la actividad enzimática completa de la enzima IGS5 putativa, como se demostraba para el ectodominio de NEP (Fossiez F. y otros Biochem. J. [1992] 284,53-59).
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TABLA 7 Visión general de los oligocebadores usados en el Ejemplo 1
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Ejemplo 2
Alineamiento de IGS5 con secuencias proteínicas de miembros de la familia de metaloproteasas NEP/ECE
Para la secuencia de IGS5 clonada en el ejemplo 1a, se ejecutaron búsquedas de homología de bancos de datos de proteínas actualizados y bancos de datos de DNA traducido usando el algoritmo BLAST (Altschul S.F. y otros, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Estas búsquedas mostraban que la proteína de IGS5 era la más similar (identidades de 54-55% sobre \pm 700 residuos alineados) a endopeptidasa neutra de ratón, rata y ser humano (SW:NEP_MOUSE, nº de registro Q61391; SW:NEP_RAT, nº de registro P07861 y SW: NEP_HUMAN, nº de registro P08473).
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Así, este alineamiento de la secuencia proteínica de IGS5 casi completa con los otros miembros de la familia NEP/ECE muestra la relación de IGS5 con las metaloproteasas en general, y en particular con las familias de metaloproteasas NEP y/o ECE. A partir de este alineamiento estructural, se concluye que la IGS5 tiene la funcionalidad de las metaloproteasas, que a su vez son de interés en el contexto de varias disfunciones, trastornos o enfermedades en animales y seres humanos.
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Ejemplo 3
La clonación de cDNA que codifica un nuevo miembro de la familia de metaloproteasas NEP/ECE
Ejemplo 3a
Clonación por PCR de homología de un fragmento de cDNA de un nuevo miembro de la familia de metaloproteasas NEP/ECE
En el banco de datos de DNA de etiquetas de secuencia expresadas (ESTs) se detectaron 4 secuencias de EST solapadas (nº de registro AA524283, AI088893, AI217369 y AI380811) que contenían un marco de lectura abierto pequeño que codifica una extensión de proteína que mostraba similitud con la parte C-terminal de miembros de la familia de proteínas de metaloproteasas de endopeptidasa neutra 24.11/enzima convertidora de endotelina (NEP/ECE) (Turner A. J. y otros [1997] 11: 355-364). El marco de lectura abierto pequeño similar a NEP/ECE en estas ESTs se terminaba mediante un codón de terminación (en el caso de AA524283) y estaba precedido en las 4 ESTs por una secuencia que contenía codones de terminación en los 3 marcos de lectura. Esta secuencia precedente parecía no tener relación en absoluto con miembros de la familia de metaloproteasas NEP/ECE. Aunque la polaridad del marco de lectura abierto pequeño era opuesta a la orientación 5'\rightarrow3' del mRNA del que se han derivado estas ESTs, se decidió usar estas secuencias como la base para un sistema de clonación por homología de RT-PCR. En paralelo, se observó que secuencias de EST adicionales, que mostraban la misma estructura que las 4 ESTs mencionadas anteriormente, aparecían en los bancos de datos de dominio público, por ejemplo nº de registro: A1825876, AI888306, A1422224, A1422225, A1469281, AA975272, AA494534, AW006103, AI827701, A1650385, A1827898, AI934499 y AA422157. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo usando un cebador inverso (IP11689; Nº ID SEC: 7) diseñado sobre el aglomerado de EST (dentro del área que muestra similitud con la familia de NEP/ECE) y un cebador directo degenerado (IP11685; Nº ID SEC: 8), centrado en un motivo peptídico conservado [VNA(F,Y)Y] de la familia de NEP/ECE.
Para la síntesis de cDNA, 2 \mug de RNA total de pulmón humano (Clontech #64023-1), 1 \mul de oligo(dT) 12-18 (500, \mug/ml) y 9 \mul de H_{2}O se combinaron (volumen final = 12 \mul), se calentaron hasta 70ºC durante 10 minutos y a continuación se enfriaron sobre hielo. Se añadieron 4 \mul de 5 x tampón para la primera hebra (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl_{2} 15 mM), 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de mezcla de dNTP 10 mM y 1 \mul (200 U) de transcriptasa inversa Superscript^{TM} II (Life Technologies). La mezcla se incubó a 42ºC durante 50 minutos y la reacción se inactivó calentando a 70ºC durante 15 minutos.
La reacción de PCR se realizó en un volumen de 50 \mul que contenía 1 \mul de la reacción de síntesis de cDNA, 5 \mul de 10 x tampón de PCR GeneAmp^{TM} (KCl 500 mM, Tris 100 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,01% (p/v); PE Biosystems), 2 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores directo e inverso y 5 unidades de polimerasa AmpliTaq^{TM} (PE Biosystems). Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min., los tubos de la reacción de PCR se sometieron a ciclos 40 x como sigue: 1 min de desnaturalización a 94ºC, 1 min de reasociación a 60ºC y 1 min de extensión a 72ºC. Los productos de reacción de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La reacción de RT-PCR de IP11685/lP11689 producía un amplicón de \pm 600 pares de bases (pb). El fragmento se purificó del gel usando el estuche de purificación Qiaex-II^{TM} (Qiagen) y se ligó en el plásmido pGEM^{TM}-T Easy de acuerdo con el procedimiento recomendado por el suministrador (sistema pGEM^{TM}-T Easy, Promega). Los plásmidos recombinantes se usaron a continuación para transformar bacterias E. coli competentes SURE^{TM} 2 (Stratagene).
Las células transformadas se cultivaron en placa sobre placas de agar LB que contienen ampicilina (100 \mug/ml), IPTG (0,5 mM) y X-gal (50 \mug/ml). El DNA plasmídico se purificó de minicultivos de colonias individuales usando el sistema de purificación de ácidos nucleicos BioRobot^{TM} 9600 (Qiagen).Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación de DNA sobre el DNA plasmídico purificado con el estuche ABI Prism^{TM} BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE-Biosystems), usando cebadores de flanqueo de insertos o internos. Los insertos plasmídicos se sometieron a secuenciación completamente en ambas hebras. Los productos de la reacción de secuenciación cíclica se purificaron a través de precipitación con EtOH/NaOAc y se analizaron en un secuenciador automatizado ABI 377. La secuencia de DNA de los insertos de los clones recombinantes YCE14, YCE15 e YCE16 (derivados del amplicón IP11685/lP11689) extendía el marco de lectura abierto del aglomerado de EST original en la dirección del extremo N y confirmaba adicionalmente que este marco de lectura abierto se derivaba de un nuevo miembro de la familia de proteínas de metaloproteasas (véase la Fig. 2). Esta secuencia aguas arriba se desviaba así completamente de la secuencia aguas arriba presente en las secuencias de EST. Esta nueva secuencia se denomina dentro del contexto de la presente invención generalmente "IGS5".
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Ejemplo 3b
Clonación de fragmentos de cDNA que contienen la secuencia codificante de longitud completa de IGS5
Para obtener secuencia de cDNA de IGS5 adicional, se llevó a cabo otra ronda de reacciones de RT-PCR sobre RNA de pulmón humano bajo las condiciones descritas anteriormente usando el cebador inverso específico para IGS5 IP12190 (Nº ID SEC: 9) y un cebador directo degenerado (IP12433; Nº ID SEC: 10), centrado en un motivo peptídico conservado [LXXLXWMD] de la familia de proteínas NEP/ECE. La reacción de RT-PCR de IP12190/12433 producía un amplicón de \pm 600 pb que se clonaba en el vector pGEM^{TM}-T Easy dando los clones YCE19, YCE22 e YCE23. Todos los clones se sometieron a secuenciación completamente y se dejó que extendieran el marco de lectura abierto de IGS5 más aguas arriba (véase la Fig. 2).
Para obtener clones de cDNA que cubrirían el extremo 5' del transcrito de IGS5, se realizaron reacciones de PCR RACE 5' semiinclusivas sobre cDNA Marathon-Ready^{TM} de corazón humano usando el cebador adaptador 1 (AP1: Nº ID SEC: 11) proporcionado con el estuche de amplificación de cDNA Marathon^{TM} (Clontech K1802-1) en combinación con los cebadores específicos para IGS5 IP12189 (Nº ID SEC: 12) e IP12585 (Nº ID SEC: 13). Se realizaron reacciones de PCR RACE de acuerdo con las instrucciones del manual de usuario del cDNA Marathon-Ready^{TM} proporcionado por Clontech. Los productos de RACE se separaron sobre gel de agarosa, se visualizaron con bromuro de etidio y se transfirieron sobre membranas Hybond^{TM}-N+ (Amersham). Las transferencias se prehibridaron a 65ºC durante 2 h en tampón de Church modificado (fosfato 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 10 mM) y a continuación se hibridaron durante la noche a 65ºC en el mismo tampón que contenía 2 x 10^{6} cpm/ml del inserto marcado con ^{32}P del clon YCE23. El inserto YCE23 se radiomarcó a través de la incorporación cebada aleatoria de [\alpha-^{32}P]dCTP hasta una actividad específica de >10^{9} cpm/\mug usando el estuche Prime-It II^{TM} (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el suministrador. Las transferencias hibridadas se lavaron con restricción alta (2 x 30 min a temperatura ambiente en 2 x SSC/SDS al 0,1% seguido por 2 lavados de 40 min a 65ºC en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%) y se autorradiografiaron durante la noche. Los fragmentos que se hibridan se purificaron de gel, se clonaron en el vector pGEM-T Easy (dando los clones YCE 59, YCE 64 e YCE 65) y se sometieron a secuenciación como se describe anteriormente.
Las secuencias de DNA de todos los clones aislados podrían montarse en un solo cóntigo que extendía el marco de lectura abierto de IGS5 más aguas arriba aunque sin embargo no se encontró el inicio del codón de traducción. El cebador IP11689 se ha diseñado en EST AI380811 y no incorporaba los 4 últimos nucleótidos antes del codón de terminación presente en las secuencias de EST alineadas. Para generar un marco de lectura abierto que terminaba en este codón de terminación, los 22 nucleótidos últimos (consenso) de las secuencias de EST alineadas se incluyeron en el cóntigo.
Fallaron varios intentos de clonar la parte aminoterminal todavía perdida de la secuencia codificante de IGS5 a través de la extensión por PCR RACE 5' o a través de rastreo de bibliotecas de cDNA. Por lo tanto, se trató de obtener información sobre la secuencia genómica en el área alrededor y aguas arriba del extremo 5' del cóntigo de IGS5 preliminar. Aproximadamente 550.000 calvas de una biblioteca de DNA genómico humano, construida en el vector fágico lambda EMBL3 (Clontech HL1067j), se transfirieron sobre membranas Hybond^{TM}-N^{+}. Las transferencias de membrana ("membrane lifts") se prehibridaron a 65ºC durante 2 h en tampón de Church modificado y a continuación se hibridaron durante la noche a 65ºC en el mismo tampón que contenía 2 x 10^{6} cpm/ml de un fragmento EcoRI/EcoRII de \pm 150 pb marcado con ^{32}P, situado en el extremo 5' del clon YCE59. La sonda de cDNA se radiomarcó a través de la incorporación cebada aleatoria de [\alpha-^{32}P]dCTP hasta una actividad específica de >109 cpm/\mug usando el estuche Prime-It II^{TM} (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el suministrador. Las membranas hibridadas se lavaron con restricción alta (2 x 30 min a temperatura ambiente en 2 x SSC/SDS al 0,1% seguido por 1 lavado de 40 min a 65ºC en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%) y se autorradiografiaron. Las calvas que se hibridan se sometieron a una segunda ronda de rastreo y se obtuvieron calvas simples puras. DNA fágico recombinante se purificó de cultivos líquidos infectados usando el estuche Qiagen^{TM} Lambda Midi (Qiagen) y se sometió a secuenciación como se describe anteriormente usando cebadores del vector EMBL3 de flanqueo y cebadores internos de IGS5. A partir del inserto del clon IGS5/S1, se sometieron a secuenciación aproximadamente 5.000 nucleótidos aguas arriba del extremo 5' del cóntigo de IGS5 preliminar. Las búsquedas de homología de bancos de datos de DNA traducido mostraban que este fragmento de 5.000 pb contenía una extensión de 78 pb que codificaba un péptido que era el más similar (15 residuos idénticos sobre 25 alineados) a un fragmento de 69 pb alternativamente sometido a corte y empalme en la secuencia de SEP de ratón (nº de registro del GenBank AF157105), que es un nuevo miembro recientemente descrito de la familia de NEP/ECE (Ikeda y otros [1999] JBC 274: 32469-32477). Este fragmento humano de 78 pb estaba precedido por y seguido por sitios aceptores y donantes de corte y empalme putativos, respectivamente, pero no contenía un inicio "ATG" del codón de traducción.
Para obtener clones de cDNA que contienen la parte aminoterminal de la secuencia codificante de IGS5, se llevaron a cabo reacciones de PCR RACE 5' semiinclusivas sobre cDNA Marathon-Ready^{TM} de testículo humano (Clontech 7414-1) usando el cebador adaptador 1 (AP1: Nº ID SEC: 11) proporcionado con el estuche de amplificación de cDNA Marathon^{TM} (Clontech K1802-1) en combinación con los cebadores antisentido específicos para IGS5 IP14241 (Nº ID SEC: 14) e IP14242 (Nº ID SEC: 15) que se diseñaron dentro del fragmento genómico de 78 pb descrito anteriormente. Las reacciones de PCR RACE se realizaron de acuerdo con las instrucciones del manual de usuario del cDNA Marathon Ready^{TM} proporcionado por Clontech (volumen de reacción = 25 \mul). Los productos de RACE se separaron sobre gel de agarosa, se visualizaron con bromuro de etidio y se analizaron a través de transferencia Southern.
Para generar una sonda de hibridación específica para los productos de RACE transferidos, se llevó a cabo una reacción de PCR de semihomología sobre los productos de RACE inclusivos usando el cebador oligonucleotídico inverso IP14241 (Nº ID SEC: 14) y un cebador directo degenerado (IP13798; Nº ID SEC: 16) que estaba centrado en un motivo peptídico [GLMVLLLL] dentro del dominio de transmembrana de la proteína SEP de ratón. La reacción de PCR se realizó en un volumen de 25 \mul que contenía 1 \mul del producto de reacción de PCR RACE 5' semiinclusivo, 2,5 \mul de 10 x tampón de PCR GeneAmp^{TM} (KCl 500 mM, Tris 100 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,01% (p/v); PE Biosystems), 1 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores directo e inverso y 2,5 unidades de polimerasa AmpliTaq-Gold^{TM} (PE Biosystems). Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 min., los tubos de la reacción de PCR se sometieron a ciclos 35x como sigue: 1 min de desnaturalización a 95ºC, 30 segundos de reasociación a 50ºC y 30 segundos de extensión a 72ºC. Los productos de reacción de PCR se analizaron a través de electroforesis en gel de agarosa. La reacción de PCR de semihomología producía un amplicón de \pm 110 pares de bases. El fragmento se purificó del gel usando el estuche de purificación Qiaex-II^{TM} (Qiagen) y se ligó en el plásmido pGEM^{TM}-T de acuerdo con el procedimiento recomendado por el suministrador (sistema pGEM^{TM}-T, Promega). Los plásmidos recombinantes se usaron a continuación para transformar bacterias E. coli competentes SURE^{TM} 2 (Stratagene). Las células transformadas se cultivaron en placa sobre placas de agar LB que contenían ampicilina (100 \mug/l), IPTG (0,5 mM) y X-gal (50 \mug/ml). El DNA plasmídico se purificó de minicultivos en colonias individuales usando el sistema de purificación de ácidos nucleicos BioRobot^{TM} 9600 (Qiagen) y se sometió a secuenciación como se describe anteriormente. La secuencia de DNA de los insertos de los clones recombinantes YCE207, YCE212, YCE216, YCE217, YCE218 e YCE219 podía montarse con el fragmento genómico de 78 pb descrito anteriormente en un solo cóntigo (véase la Fig. 2).
Transferencias Southern de los productos de reacción de PCR RACE 5' semiinclusivos se prehibridaron a 65ºC durante 1 h en tampón de Church modificado y a continuación se hibridaron durante la noche a 65ºC en el mismo tampón que contenía 2 x 10^{6} cpm/ml del inserto marcado con ^{32}P del clon YCE207. Las transferencia hibridadas se lavaron con alta restricción y se autorradiografiaron. Los fragmentos que se hibridaban se purificaron del gel, se clonaron en el vector pGEM^{TM}-T (dando los clones YCE223, YCE224 e YCE226) y se sometieron a secuenciación como se describe anteriormente. Las secuencias de DNA de estos clones podrían montarse con el fragmento genómico de 78 pb y con los clones YCE207, YCE212, YCE216, YCE217, YCE218 e YCE219 en un solo cóntigo (Fig. 2). El cóntigo resultante contenía un marco de lectura abierto que empezaba en el codón de iniciación ATG y codificaba una proteína que mostraba mucha similitud con la secuencia N-terminal de la proteína SEP de ratón.
Para obtener clones de cDNA que cubran la parte aminoterminal de la secuencia codificante de IGS5 y que se solapen con el clon YCE59, se establecieron reacciones de PCR sobre cDNA Marathon-Ready^{TM} de testículo humano (Clontech 7414-1) usando un cebador directo específico (IP14535; Nº ID SEC: 17) basado en la secuencia de UTR 5' de IGS5 y un cebador inverso específico (IP14537; Nº ID SEC: 18) situado dentro de YCE59. La reacción de PCR se realizó en un volumen de 25 \mul que contenía 2,5 \mul de cDNA Marathon-Ready^{TM} de testículo humano, 2,5 \mul de 10 x tampón de PCR GeneAmp^{TM} (KCl 500 mM, Tris 100 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,01% (p/v); PE Biosystems), 1 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores directo e inverso y 2,5 unidades de polimerasa AmpliTaq-Gold^{TM} (PE Biosystems). Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 min., los tubos de la reacción de PCR se sometieron a ciclos 41x como sigue: 1 min de desnaturalización a 95ºC, 1 min de reasociación a 53ºC y 1 min de extensión a 72ºC. Los productos de reacción de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La reacción de PCR producía dos amplicones de \pm 300 y 380 pares de bases, respectivamente. Los fragmentos de 300 pb y 380 pb se purificaron del gel, se clonaron en el vector pGEM^{TM}-T y se sometieron a secuenciación como se describe anteriormente. Esto da los clones YCE231, YCE233 e YCE235 (fragmento de 300 pb) e YCE229 (fragmento de 380 pb).
El montaje de las secuencias de DNA de todos los clones aislados mostraba la presencia de dos tipos de secuencias de cDNA, que diferían por la presencia o ausencia del segmento de 78 pb, inicialmente identificado dentro del clon genómico IGS5/S1. Estas dos secuencias se originan probablemente a partir de moléculas de RNA alternativamente sometidas a corte y empalme. El transcrito más largo contiene un marco de lectura abierto de 2337 nucleótidos (que codifica una proteína de 779 residuos) mientras que el transcrito más corto contiene un marco de lectura abierto de 2259 nucleótidos (que codifica una proteína de 753 residuos). Se hace referencia a la secuencia codificante y la secuencia proteínica de la forma larga como DNA1IGS5 (mostrada en el Nº ID SEC: 3, 2340 pb incluyendo el codón de terminación tag) y PROT1IGS5 (Nº ID SEC: 4), respectivamente, mientras que la secuencia codificante y la secuencia proteínica de la forma más corta se denominan DNA2IGS5 (mostrada en el Nº ID SEC: 5, 2262 pb incluyendo el codón de terminación tag) y PROT2IGS5 (Nº ID SEC: 6), respectivamente. Aguas abajo del codón de iniciación de metionina postulado dentro de DNA1IGS5 y DNA2IGS5 un codón de metionina "en el marco" adicional está presente en la posición codónica 10. Aunque se ha optado por el primer codón de metionina como el codón de iniciación, no puede excluirse alguna iniciación (o incluso exclusiva) de la traducción en la posición codónica 10, ya que ambas metioninas parecen estar dentro de un contexto de iniciación de la traducción de Kozak igualmente favorable (Kozak M., Gene [1999]: 234: 187-208). El análisis de hidropatía (Kyte J. y otros, J. Mol. Biol. [1982] 157: 105-132; Klein P. y otros, Biochim. Biophys. Acta [1985] 815: 468- 476) de las secuencias de PROT1iGS5 y PROT2IGS5 mostraba la presencia de un solo dominio de transmembrana entre los residuos 22 y 50. Esto indica que PROT1IGS5 e PROT2IGS5 son proteínas de membrana integrales tipo II y así tienen una topología de membrana similar a otros miembros de la familia de proteínas NEP/ECE.
TABLA 8 Visión general de los cebadores oligonucleotídicos que se usaban en el Ejemplo 3
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Ejemplo 4
Alineamiento de IGS5 con secuencias proteínicas de miembros de la familia de metaloproteasas NEP/ECE
Para la secuencia de IGS5 clonada en el Ejemplo 3, se ejecutaron búsquedas de homología de bancos de datos de proteínas actualizados y bancos de datos de DNA traducido, usando el algoritmo BLAST (Altschul S.F. y otros, Nucleic Acids Res. [1997] 25: 3389-3402). Estas búsquedas mostraban que PROT1IGS5 era la más similar (76% de identidades sobre 778 residuos alineados) a SEP de ratón (nº de registro del GenBank AF157105) y también mostraban 54-55% de identidades sobre 696 residuos alineados con endopeptidasas neutras de ratón, rata y ser humano (SW: NEP_MOUSE, nº de registro Q61391; SW:NEP_RAT, nº de registro P07861; SW:NEP_HUMAN, nº de registro P08473). Las búsquedas de homología de PROT2IGS5 mostraban que esta secuencia era la más similar (78% de identidades sobre 752 residuos alineados) a SEP de ratón (nº de registro del GenBank AF157106). Análogamente a la SEP de ratón y las proteínas SEP, ha de esperarse que PROT1IGS5 y PROT2IGS5 representen las formas unida a membrana y soluble de la proteína de IGS5, respectivamente. Esto se corrobora por la presencia de residuos dibásicos (KRK) codificados en el extremo 3' del exón de 78 pb alternativamente sometido a corte y empalme.
Así, este alineamiento de la secuencia proteínica de IGS5 completa con los otros miembros de la familia NEP/ECE muestra la relación de IGS5 con las metaloproteasas NEP/ECE en general, y en particular con los miembros de las familias SEP y NEP. A partir de este alineamiento estructural, se concluye que la proteína de IGS5 tiene la funcionalidad de las metaloproteasas, que a su vez son de interés en el contexto de varias disfunciones, trastornos o enfermedades en animales y seres humanos.
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Ejemplo 5
Análisis de la expresión de RNA de IGS5
Análisis de la expresión de IGS5 sobre RNA humano Master Blot^{TM}. Una solución de Express-Hyb^{TM} (Clontech #8015-1) y DNA de testículo de salmón cortado se preparó como sigue: 15 ml de Express-Hyb se precalentaron a 50-60ºC. 1,5 mg de DNA de testículo de salmón cortado se calentaron a 95ºC durante 5 minutos y a continuación se enfriaron rápidamente sobre hielo. El DNA de testículo de salmón cortado desnaturalizado térmicamente se mezcló con el Express-Hyb^{TM} precalentado. El RNA humano Master Blot (Clontech #7770-1) se prehibridó en 10 ml de la solución preparada anteriormente durante 30 minutos con agitación continua a 65ºC. La sonda YCE15 marcada con ^{32}P (marcada con el estuche Prime-it Il^{TM}, Stratagene) se desnaturalizó térmicamente y se añadió a los 5 ml restantes de la solución de Express-Hyb^{TM}. La hibridación se realizó durante la noche a 65ºC. Los lavados se realizaron en 2 x SSC/SDS al 1% durante 100 minutos (5 x 20 min.) a 65ºC. Se realizaron dos lavados de 20 minutos adicionales en 200 ml de 0,1 x SSC/SDS al 0,5% a 55ºC. Finalmente, el Master Blot se autorradiografió usando película de rayos X.
La hibridación de la sonda de IGS5 sobre el Master Blot^{TM} mostraba expresión en una amplia gama de tejidos, y en particular expresión en testículo, intestino delgado, próstata y estómago (Fig. 3).
Análisis de la Expresión de IGS5 sobre Transferencias Northern de Tejido Múltiple Cerebral Humano II y IV (#7755-1 y #7769-1, respectivamente). Una solución de Express-Hyb^{TM} (Clontech #8015-1) se precalentó a 68ºC. La transferencia se prehibridó a 68ºC durante 1 hora. 100 \mug de DNA de testículo de salmón cortado se añadieron a la sonda YCE15 marcada con ^{32}P (marcada con el estuche Prime-it II^{TM}, Stratagene) y se desnaturalizaron térmicamente a 95ºC durante 10 minutos. La sonda se añadió a los 5 ml restantes de la solución de Express-Hyb^{TM} y la hibridación se realizó durante 2 horas a 68ºC. Los lavados se realizaron en 2 x SSC/SDS al 0,05% durante 40 minutos (2 x 20 min.) a TA. Se realizaron dos lavados de 20 minutos adicionales en 200 ml de 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 55ºC. La transferencia se autorradiografió usando película de rayos X.
Este análisis por transferencia Northern mostraba una banda de hibridación principal de 3 kb y una banda secundaria de 5,5-6 kb en todos los tejidos investigados.
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Ejemplo 6
Expresión y purificación del ectodominio etiquetado con HIS de IGS5 humana
El objetivo del experimento era producir proteína de IGS5 soluble usando el sistema de expresión baculoviral. Se construyó un baculovirus recombinante que expresaba el ectodominio de IGS5 etiquetado con His_{6} durante la infección de la línea celular Sf9. La proteína de IGS5 soluble se purificó a continuación del sobrenadante de cultivo en un procedimiento en dos etapas que implicaba lectina de lenteja y cromatografía de Zn-IMAC.
Se fusionó el péptido de señal del precursor de proopiomelanocortina (POMC) a la parte extracelular etiquetada con His de la secuencia codificante de IGS5. Como el sitio enzimáticamente activo (metaloproteasa) de la proteína está situado en el extremo C-terminal, se prefiere añadir la etiqueta de purificación de His en el extremo N de la proteína. Por otra parte, un conector de Gly-Ser se insertó entre el péptido de señal de POMC y el ectodominio de IGS5. La proteína de IGS5 expresada empezaba en el residuo 60 de PROT2IGS5 (SEVC...) y así comprendía el ectodominio de IGDS5 casi completo. La estrategia de clonación implicaba una combinación de montaje de oligonucleótidos sintéticos, PCR de solapamiento y ligación de 3 puntos. Esto daba como resultado la expresión de una proteína que consistía en la señal de POMC (segmentada durante la secreción), un conector de Gly-Ser, un péptido de His6 y el dominio extracelular de IGS5.
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Ejemplo 6a
Construcción del vector de transferencia de baculovirus pAcSG2SOLhuIGS5His6
Para la construcción del vector de transferencia de vaculovirus pAcSG2SOLhuIGS5, se generaron los siguientes fragmentos de DNA:
1.
El vector pAcSG2 (BD PharMingen) se digirió con StuI/NotI. El fragmento de 5527 pb se extrajo de gel de agarosa usando el estuche de extracción QiaExil (Westburg) y se disolvió en 30 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5.
2.
El clon de pGEMT YCE174 se montó a partir de los clones YCE15, YCE22, YCE64 y YCE65 a través de una combinación de PCR y digestión/ligación por restricción. El cebador IP13541, que, en contraste con IP11689, no contenía los 4 últimos nucleótidos de la secuencia codificante de IGS5 ni el codón de terminación, se usó en este procedimiento (Tabla 9). Por lo tanto, YCE174 contenía la región codificante casi completa del dominio extracelular de hulGS5 hasta (e incluyendo) el codón de terminación (Fig. 2). YCE174 se digirió con XhoI/NotI, dando como resultado un fragmento de 3025 pb, uno de 1723 pb y uno de 448 pb, según se muestra mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de 1723 pb, que contiene la región codificante para el ectodominio de huIGS5, se extrajo de gel (QiaexII, Qiagen) y se disolvió en 20 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5.
3.
Un fragmento de ácido nucleico sintético (180 pb) que contiene un sitio de reconocimiento de StuI en el extremo 5', seguido por la secuencia de señal de POMC, un conector Gly-Ser, una etiqueta de His6 y 65 pb del extremo 5' de la secuencia codificante del ectodominio de IGS5, se montó combinando los oligonucleótidos IP14165, IP14114, IP14115, IP14116, IP14117, IP14118, IP14119 e IP14120, seguido por PCR de solapamiento con los cebadores IP14166 e IP14110 (Tabla 9; véase además la Fig. 4). El sitio StuI presente en la secuencia codificante del péptido de señal de POMC natural se retiró introduciendo una mutación silenciosa (IP14115, nucleótido 30 G -> A) en la posición del pb 57.
TABLA 9 Visión general de los cebadores oligonucleotídicos que se usaban en el Ejemplo 6
13
Un segundo fragmento de PCR (495 pb) se amplificó a partir de la plantilla del clon YCE174 usando los cebadores IP14111 e IP14112. Los productos de PCR primero y segundo comparten una región solapada de 65 pb de largo. Usando una mezcla de ambos productos de PCR como una plantilla, se realizó una PCR de solapamiento con los cebadores IP14166 e IP14112, generando un fragmento final de PCR de 610 pb. Este fragmento se purificó en una columna giratoria QiaQuick (Qiagen), se digirió con StuI/XhoI y el fragmento de 496 pb resultante se extrajo de gel de agarosa (QiaexII).
Los tres fragmentos de DNA (5527, 1723 y 496 pb) que se generaban como se describe anteriormente se combinaron en una reacción de ligación. La mezcla de ligación se incubó durante la noche a 16ºC y se usó para transformar células DH5alphaF competentes. Las bacterias transformadas se cultivaron en placa sobre placas de agar de LB/ampicilina (100 \mug/ml de ampicilina). Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. 30 colonias aleatorias se cultivaron en 5 ml de medio LB complementado con 100 \mug/ml de ampicilina. Se preparó DNA plasmídico usando el sistema de purificación de ácidos nucleicos Biorobot^{TM} 9600 (Qiagen) y se rastreó a través de digestión con BamHI. 7 clones que presentaban el patrón de restricción correcto se analizaron adicionalmente mediante digestión con XhoI, StuI, AlwNI, HindIII y HincII y análisis de secuencia del inserto. Un clon con el patrón de restricción correcto y la secuencia de inserto esperada finalmente se seleccionó y se depositó en la colección de cultivos (lista de cepas) como ICCG4502. (Este clon contiene una mutación 
\hbox{silenciosa similar en la posición del pb 878 (G -> A)
del vector de transferencia).}
Una preparación de DNA Qiagen Midi (Westburg) estéril se elaboró a partir del clon depositado, que daba 110 \mug de DNA. El análisis de restricción mediante digestión con XhoI, AlwNI, StuI, HindIII y HincII revelaba el patrón de restricción correcto según se muestra mediante electroforesis en gel de agarosa. El análisis de secuencia confirmaba la secuencia esperada. El mapa del vector de transferencia de vaculovirus pAcSG2SOLhulGS5His6 se muestra en la Fig. 5.
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Ejemplo 6b
Generación de un baculovirus recombinante para la expresión de hulGS5His6 soluble
Un baculovirus recombinante, que expresa el dominio extracelular (menos unos pocos AA) de la IGS5 humana etiquetada con His N-terminal se generó mediante la cotransfección (método de transfección con fosfato Ca) del DNA del vector de transferencia pAcSG2SOLhuIGS5His6 (ICCG 4502) en la célula de insecto huésped (células de Spodoptera frugiperda Sf9) con el DNA genómico linealizado de una versión modificada del genoma baculoviral silvestre (BaculoGold; nº de cat Pharmingen 21100 D) en las células huésped de insecto (células de Spodoptera frugiperda Sf9). El DNA BaculoGold contiene una deleción letal y no codifica para virus viable. La cotransfección del DNA BaculoGold con un vector de transferencia de baculovirus complementario rescata la deleción letal mediante recombinación homóloga. Usando este sistema, se purificaron por calvas 3 recombinantes aspirantes individuales. Todos los recombinantes aspirantes se amplificaron.
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Ejemplo 6c
Expresión eucariótica
Análisis cinético de la expresión. Células Sf9 (IGCL 83.0), que crecían exponencialmente en suspensión en matraces giratorios a 27ºC en medio TC100 (nº de Cat de JRH Biosciences 56941), complementadas con suero de ternero fetal (nº de Cat de Gibco BRL 10 084 168) inactivado al 10%, se recogieron mediante centrifugación a baja velocidad y se sembraron a 5.10^{5} células/matraz (25 cm^{2}) en medio TC100 libre de suero. Los clones virales recombinantes aspirantes se añadieron a una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de 3 pfu/célula y los cultivos de células/virus se incubaron subsiguientemente a 27ºC. El medio acondicionado (CM, por sus siglas en inglés) se recogió a las 24, 48 y 72 h después de la infección mediante 2 centrifugaciones a baja velocidad consecutivas. Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel SDS PAGE y transferencia Western.
La transferencia Western revelaba una banda transparente a aproximadamente 81 kDa en el CM de todos los clones aspirantes, correspondiente al Mr teórico de la proteína madura (81,2 kDa) (no mostrado). Los niveles de expresión de los 3 clones alcanzaban máximos a las 48-72 h después de la infección. El clon 2 se seleccionó para una amplificación adicional y se depositó como IGBV73. El tiempo de recogida óptimo se fijó a las 72 h después de la infección.
Estudio de desglicosilación. La secuencia proteínica de IGS5 humana soluble contiene 8 sitios de N-glicosilación potenciales (Fig. 6). Puesto que el protocolo de purificación implica la unión de los residuos sacáricos en una columna de lectina de lenteja, muestras de CM de todos los clones virales recombinantes aspirantes, recogidos 72 h después de la infección, se usaron para un estudio de desglicosilación con N-glicosidasa F, para comprobar si la proteína de His61GS5 soluble recombinante en efecto es expresada como una proteína glicosilada.
Las muestras se complementaron con SDS hasta una concentración final de 1% y se incubaron a 95ºC durante 5 minutos. Después de la adición de 1 volumen del tampón de incubación (tampón de fosfato 250 mM, EDTA 50 mM, N-octilglicósido al 5%, 2-mercaptoetanol al 1%) 2 x y un tiempo de incubación adicional de 5 minutos a 95ºC, la muestra se enfrió hasta 37ºC. Se añadió 1 U de N-glicosidasa F (Boehringer Mannheim, nº cat 1 365 177) y, después de la incubación durante la noche a 37ºC, la muestra se redujo con DTT 100 mM (concentración final).
El análisis por transferencia Western de muestras de CM tratadas con N-glicosidasa F y controles no tratados muestra un cambio en el Mr cuando las muestras están desglicosadas (Fig. 7), demostrando que la IGS5 etiquetada con His soluble se expresa como una proteína glicosilada.
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Ejemplo 6d
Purificación
Producción preparativa y pretratamiento de muestras. Células Sf9 (IGCL 83-2) que crecían exponencialmente en suspensión en matraces giratorios a 27ºC en medio TC100 (JRH Biosciences, nº cat 56941) complementadas con suero de ternero fetal (Gibco BRL, nº cat 10 084 168) inactivado al 10% se recogieron mediante centrifugación a baja velocidad y se resuspendieron a una densidad de 2.10^{6} células/ml en medio TC100, complementado con 0,013 TIU de aprotinina/ml (Pentex). El virus recombinante IGBV73 se añadió a las células a una multiplicidad de infección (MOI) de 2,25 pfu/célula. La suspensión de células/virus se incubó subsiguientemente a 27ºC en botellas rotatorias de vidrio (3 x 500 ml/1260 cm^{2}) durante 72 h. El CM (1,5 l) se clarificó a continuación de células y residuo celular mediante dos centrifugaciones a baja velocidad consecutivas. 1 tableta de EDTA free complete (EFC; Roche biochemicals, nº cat 1873580) se añadió a 300 ml de CM de baculovirus clarificado. HEPES, glicerol y Tween 20 se añadieron hasta una concentración final, respectivamente, de 20 mM, 5% (v/v) y 0,005% (p/v). El pH del CM se ajustó hasta 7,4 y la muestra se filtró (Durapore Membrane Filters 0,2 \mu GV). Todas las etapas de purificación se realizaron a 4ºC.
Cromatografía con Lectina de Lenteja. La muestra de baculovirus se cargó durante la noche a 0,3 ml/min en una resina Sepharose de lectina de lenteja de 5 ml en una columna C10/10 (Pharmacia), que se había equilibrado en tampón A (Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, glicerol al 5%, Tween 20 al 0,005%) complementado con 1 tableta de EFC/500 ml. La columna se lavó con tampón de equilibración hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzaba el nivel de la línea de base y las proteínas unidas se eluyeron a 1 ml/min aplicando tampón A que contenía alfa-metilpiranósido 0,5 M. La columna se regeneró aplicando acetato 100 mM, NaCl 500 mM, pH 5,0. Los líquidos de elución y regeneración se recogieron manualmente y las fracciones reunidas se analizaron mediante SDS-PAGE sobre geles Phast al 12,5% (Pharmacia) y tinción con plata. Se incluyeron marcadores preteñidos (Gibco) como patrón del peso molecular relativo (Mr).
La mayor cantidad de proteínas se recuperó en flujo pasante y se observó una banda de aspirante de IGS5 con un Mr de aproximadamente 85.000 en las fracciones reunidas de elución 1-3 (Fig. 8). Los análisis de transferencia Western de la cromatografía con lectina de lenteja con el mapa de la etiqueta anti-His mostraba que la proteína de htGS5 soluble (Mr-85.000) está unida cuantitativamente a la resina de lectina de lenteja y que la proteína etiquetada con his se recupera a lo largo de todo el pico de elución, pero principalmente en las fracciones reunidas 1 y 2 (Fig 9). Las fracciones reunidas de elución en lectina de lenteja 1 y 2 se procesaron adicionalmente en la columna Zinc-IMAC (experimentos A y B).
Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) y diálisis. 1 ml de Chelating HiTrap (Pharmacia) se cargó con iones zinc como se describe por el fabricante y se equilibró con tampón B (Hepes 20 mM, NaCl 100 mM, glicerol al 5%, Tween 20 al 0,005% (p/v), pH 7,2). Las fracciones reunidas 1 y 2 de la elución en lectina de lenteja se cargaron separadamente a 0,5 ml/min sobre la columna HiTrap (experimento de IMAC A y experimento de IMAC B). Se incluyó un experimento en blanco para comparar el perfil de absorbancia cromatográfica. La columna se lavó con tampón B hasta el nivel de la línea de base y las proteínas unidas se eluyeron al aplicar un gradiente escalonado de imidazol (20, 50, 100 y 200 mM) en tampón B. Las fracciones se recogieron manualmente. La columna de IMAC se regeneró al aplicar Hepes 20 mM, EDTA 50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,2. Las fracciones reunidas de elución y regeneración se analizaron mediante SDS-PAGE (geles Phast al 12,5%, Pharmacia) y tinción con plata. La fracción reunida de imidazol 200 mM se transfirió a un casete Slide-a-Lyzer (PMCO 10.000, Pierce) y se dializó durante la noche contra tampón B (exceso de 130 veces, sin reposición de tampón). La cantidad de IGS5 soluble en la fracción reunida dializada se determino con el método micro-BCA (Pierce). Se incluyó BSA como referencia. La IGS5 de baculovirus dializada se caracterizó bioquímicamente por (1) SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras y (2) transferencia Western con un mAb anti-etiqueta de His (21E1B4, Innogenetics), seguido por incubación con anti-(Ig de ratón) de conejo marcada con fosfatasa alcalina (Dako) y detección con tinción con NBT/BCIP. El estado de glicosilación de la IGS5 soluble se verificó mediante tratamiento con PGNasa F (Biorad).
El análisis por SDS-PAGE y la tinción con plata mostraban que el grueso de proteínas contaminantes se eluía aplicando la etapa de imidazol 20 mM y 50 mM (Fig. 10). La proteína de hIGS5 se recuperó en las etapas de elución con imidazol 100 mM y 200 mM. La banda de 85 kDa en la fracción reunida de imidazol 200 mM es una sola banda en la SDS-PAGE, que reacciona con el mAb anti-etiqueta de his (Fig. 9). La tinción con plata no revelaba ninguna diferencia en la pureza entre el material de hIGS5 obtenido a partir del experimento A y el experimento B de IMAC. Partiendo de 300 ml de CM de baculovirus, se obtuvieron 340 \mug ectodominio de IGS5 etiquetado con his de más de 95% de pureza mediante el procedimiento de 
\hbox{purificación en 2 etapas (es  decir, un rendimiento de
aproximadamente 1 mg/l).}
La fracción reunida de Zn-IMAC de imidazol 20 mM se transfirió después de SDS-PAGE sobre membranas de PVDF y las proteínas se visualizaron mediante tinción con negro amido. Las bandas de PVDF se lavaron sucesivamente con acetonitrilo al 20% y metanol al 20% y se secaron. Se realizó secuenciación aminoterminal mediante degradación de Edman usando un Procise^{TM} 492A (Applied biosystems) de acuerdo con la descripción del fabricante. La secuenciación aminoterminal confirmaba que la IGS5 de baculovirus se recupera en la banda proteínica de 85 kDa.
Ejemplo 7
Ensayo de inhibición de enzimas
La actividad enzimática de los polipéptidos de IGS5 de la invención se probó con respecto al metabolismo de péptidos biológicamente activos. En particular, se probó si estos polipéptidos de IGS5 pueden actuar sobre una variedad de péptidos vasoactivos conocidos en el estado de la especialidad, por ejemplo, tales como el péptido natriurético auricular (ANP), la bradiquinina, la endotelina grande (ET-1 Grande), la endotelina (ET-1), la sustancia P y la angiotensina-1. En el contexto de la presente invención, en particular, se probó si el ectodominio de IGS5, que es una nueva metaloproteasa humana, hidroliza dichos péptidos vasoactivos. Para comparación, también se realizó el ensayo para un miembro conocido de la familia de las metaloproteasas que fue descrito previamente como endopeptidasa secretada soluble (SEP) por Emoto y otros (J. Biol. Chem., Vol. 274 (1999): pp. 32469-32477). Por otra parte, se probó si la actividad de IGS5 para convertir un análogo de ET-1 Grande (la llamada ET-1 grande de 17 aa) puede ser inhibida por compuestos de referencia que se usan para determinar las propiedades de inhibición con respecto a enzimas que tienen características de ECE y/o NEP. Los compuestos usados para probar la inhibición de la actividad de IGS5 sobre el análogo de ET-1 Grande eran el compuesto fosforamidón, que inhibe endopeptidasas como NEP y ECE, el compuesto tiorfano, que inhibe específicamente NEP, y el compuesto CGS-35066, que es un inhibidor selectivo de ECE.
Ejemplo 7a
Materiales
Enzima:
IGS-5 (sol hu) (his) 6; o ectodominio de IGS etiquetado con His6;
\quad
\underbar{solución de reserva}: 53 mg/ml en HEPES 20 mM, pH 7,2, glicerol al 5%, Tween 20 al 0,005%, NaCl 100 mM, pureza >99%; almacenamiento a 4ºC.
\quad
\underbar{solución de trabajo}: solución de reserva diluida con tampón de ensayo hasta 10 mg/ml.
Sustrato:
Mca-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH;
\quad
Análogo de ET-1 Grande con fluorescencia extinguida;
\quad
Mca = (7-Metoxicumarin-4-ilo);
\quad
Dpa = (3- [2, 4-Dinitrofenil]-L-2, 3-diaminopropionilo;
\quad
\underbar{solución de reserva}: 100 \muM en tampón de ensayo; almacenamiento a -20ºC.
\quad
(disponible comercialmente del suministrador: Polypeptide Laboratories, Wolfenbuttel, Alemania)
Tampón de ensayo:
Tris 100 mM, pH 7,0, NaCl 250 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO a 10 mM y se diluyeron adicionalmente con tampón de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7b
Procedimiento de Ensayo
Una cantidad de 70 \mul del tampón de ensayo, de 10 \mul solución de trabajo de enzima y de 10 \mul de solución de compuesto de prueba se mezclaron en un vial de Eppendorf y se preincubaron a 37ºC durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 10 \mul de solución de reserva de sustrato y la mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 60 minutos para permitir la hidrólisis enzimática. Subsiguientemente, la reacción enzimática se terminó calentando a 95ºC durante 5 minutos. Después de la centrifugación (Heraeus Biofuge B, 3 min), el sobrenadante se sometió a análisis de HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7c
Procedimiento de HPLC
Para separar el sustrato restante de los productos de segmentación, se usó la técnica de HPLC en fase inversa con una columna CC 125/4 Nucleosil 300/5 C18 RP y una precolumna CC 8/4 Nucleosil 100/5 C18 (disponibles comercialmente de Macherey-Nagel, Duren, Alemania). Así, 60 \mul de las muestras de reacción obtenidas en el Ejemplo 7b se inyectaron en la HPLC y la columna se eluyó a un caudal de 1 ml/min aplicando el gradiente y las soluciones siguientes:
Solución A:
H_{2}O al 100% + H_{3}PO_{4} 0,5 M, pH = 2,0
Solución B:
acetonitrilo al 100% + H_{3}PO_{4} 0,5 M
\vskip1.000000\baselineskip
0-2 min 20% B
2-6 min 20-60% B
6-8 min 60% B
8-10 min 60-90% B
10-13 min 90% B
13-15 min 90-100% B
Los péptidos se detectaron mediante absorbancia a 214 nm y mediante fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 328 nm y una longitud de onda de emisión de 393 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7d
Cálculos
La señal de fluorescencia creciente del pico de HPLC del péptido con el fluoróforo de Mca no extinguido se tomó como la base para cualquier cálculo.
\newpage
Esta señal se comparó para las muestras con y sin inhibidor y el % de inhibición se calculó sobre la base de las áreas de los picos respectivos.
%\ inhib = 100* (1-A_{inhib}/A_{control})
Todas las muestras se experimentaron por duplicado y se usaron los valores medios.
Un inhibidor estándar (fosforamidón 10 nM y 100 nM) y un control de disolvente (0,1%) se añadieron a cada experimento del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7e
Resultados
Con respecto a los polipéptidos de IGS5 de la presente invención, los resultados del Ejemplo 7 muestran que estos polipéptidos de metaloproteasa de IGS5 hidrolizan in vitro una variedad de péptidos vasoactivos conocidos en el estado de la especialidad, en particular tales como ET-1 Grande, ET-1, ANP y bradiquinina. Los resultados del ensayo de hidrólisis en comparación con la actividad de SEP se muestran en la Tabla 10. A partir de estos resultados, se concluye que la IGS5 puede estar implicada particularmente en el metabolismo de dichos péptidos biológicamente
activos.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 Hidrólisis de péptidos vasoactivos mediante polipéptidos de IGS5 en comparación con SEP (endopeptidasa soluble secretada)
14
* \hskip0,35cm 500 \mug de polipéptido de IGS5
** \hskip0,15cm 10 \mug de polipéptido de IGS5
*** se detectó actividad, pero no podía cuantificarse debido a problemas con la detección por HPLC.
Por otra parte, los resultados de los experimentos con compuestos de referencia para la inhibición de la actividad de ECE y/o NEP muestran que la actividad de polipéptidos de metaloproteasa de IGS5 de la presente invención para convertir el análogo de ET-1 Grande ET-Grande de 17 aa es inhibida por fosforamidón, un compuesto de referencia para la inhibición de ECE/NEP, pero la IGS no es inhibida eficazmente por el inhibidor de NEP tiorfano. Estos resultados se muestran en la Tabla 11. Los polipéptidos de IGS5 tampoco son inhibidos por el inhibidor de ECE selectivo CGS-35066, un inhibidor no peptídico potente y selectivo de enzima convertidora de endotelina 1 con duración de acción sostenida. (De Lombart y otros, J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43 (3): 488-504).
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TABLA 11 Inhibición de la actividad de polipéptidos de IGS5 para convertir el análogo de ET-1 Grande ET Grande de 17 aa
15 
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de las figuras
Fig. 1 Representación esquemática de las posiciones relativas de los diferentes clones de cDNA que se aislaban y se sometían a secuenciación completamente para generar la secuencia de cDNA de consenso de IGS5 parcial. Los cebadores de PCR que se usaban para RACE 5' y clonación por PCR de semihomología están indicados y se han descrito en este documento (indicados por el Nº IP respectivo). CONSIGS5 indica el cóntigo de consenso que se obtenía después de fusionar todas las secuencias obtenidas. El marco de lectura abierto de 691 aminoácidos de largo presente en el cóntigo de IGS5, que se postula que contiene el ectodominio de la enzima IGS5 (DNAIGS5, PROTIGS5), está indicado por cajas abiertas ("\Box\Box"). La parte de las secuencias de EST alineadas (nº de registro AA524283, AI088893, AI217369 y AI380811) que tiene homología con miembros de la familia de NEP/ECE está indicada con "+==+" (ESTIGS5). "pb" = pares de bases.
Fig. 2 Representación esquemática de las posiciones relativas de los diferentes clones de cDNA que se aislaban y se sometían a secuenciación completamente para generar las secuencias de cDNA de DNA1IGS5 y DNA2IGS5. Los cebadores de PCR que se usaban para RACE 5' y clonación por PCR de semihomología están indicados y se han descrito en este documento (indicados por el Nº IP respectivo). CONS1IGS5 y CONS2IGS5 indican los 2 cóntigos de consenso diferentes que se obtenían después de fusionar todas las secuencias obtenidas. IGS5DNA1 y IGS5DNA2 indican los marcos de lectura abiertos presentes en CONS1IGS5 y CONS2IGS5, respectivamente ("**"). La parte de las secuencias de EST alineadas (nº de registro AA524283, AI088893, AI217369 y AI 380811) que tiene homología con miembros de la familia de NEP/ECE está indicada con "+==+" (ESTIGS5). "pb" = pares de bases. El fragmento de 78 pb identificado dentro del clon genómico IGS5/S1 se indica como "IGS5/S1/78pb". La ausencia de la secuencia exónica alternada de 78 pb dentro de los clones YCE231, YCE233 e YCE235 y dentro de los clones CONS2IGS5 y DNA2IGS5 está indicada por un hueco.
Fig. 3 Análisis por RNA Master Blot del gen de IGS5.
Fig. 4 Secuencia del fragmento de 180 pb, que codifica la secuencia de señal de POMC, el conector Gly-Ser, la etiqueta de His6 y el comienzo de la secuencia del ectodominio de IGS5, montada mediante PCR de solapamiento usando diferentes oligonucleótidos. (*mutación silenciosa (pb 57 de la secuencia de señal de pomc)).
Fig. 5 Mapa plasmídico del vector pAcSG2SOLhuIGS5His6.
Fig. 6 Secuencia proteínica predicha de la IGS5 humana etiquetada con His soluble recombinante madura, según se expresa en células Sf9 durante la infección con baculovirus recombinante IGBV73 (después de segmentación de la secuencia de señal de POMC de 26 AA de largo). Los sitios de N-glicosilación potenciales están subrayados.
Fig. 7 Estudio de desglicosilación - análisis por transferencia Western. La recolección de CM de 72 h de la infección con los 3 clones de His61GS5 solubles recombinantes (clon 1: carriles 1 a 3, clon 2: carriles 4 a 6, clon 3: carriles 7 a 9) se trató como se describe con y sin la adición de N-glicosidasa F. Se cargaron 10 \mul de equivalente de CM sobre gel frente a 20 \mul del CM no tratado como un control.
La detección se realizó con anticuerpo anti-His (21E1B4EPR300, Innogenetics, concentración final de 1 \mug/ml). El segundo anticuerpo estaba conjugado a anti-(fosfatasa alcalina de ratón) de conejo (Sigma A-1902). El revelado de las bandas se realizó con NBT-BCIP. El marcador de Mr es el marcador del PM de intervalo amplio de Biolabs (nº cat 7707S).
Fig. 8 Análisis por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (+DTT) gel PHAST al 12,5% (Pharmacia; 4 \mul/ranura) de las etapas de cromatografía con lectina de lenteja. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con plata.
Fig. 9 Análisis por transferencia Western de IGS5 en diferentes fases del procedimiento de purificación. Las muestras se separaron sobre un Minigel (Biorad MINI-Protean II) al 7,5% y se analizaron a través de transferencia Western usando el mab primario anti-His6 21 E1 B4, seguido por una anti-(Ig de ratón) de conejo conjugada a fosfatasa alcalina como un anticuerpo secundario y detección mediante NBT/BCIP.
+, - DTT, respectivamente: las proteínas eran reducidas o no con DTT.
Fig. 10 Análisis por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (+DTT) sobre gel PHAST al 12,5% (Pharmacia, ranuras de 4 \mul) de diferentes fracciones reunidas de elución de imidazol de la cromatografía con Zn-iMAC de la fracción reunida 1 procedente del eluato de la cromatografía con lectina de lenteja. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con plata.
<110> SOLVAY PHARMACEUTICALS B.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas Enzimas Humanas de la Familia de las Metaloproteasas
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<130> SPW 99.09/H 99.26-WO
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<140>
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<141>
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<160> 31
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 2076
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(2073)
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<400> 1
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16
17
18
19 
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<210> 2
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<211> 691
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
20
21
22 
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<210> 3
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<211> 2340
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(2337)
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<400> 3
23
24
25
26 
\newpage
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<210> 4
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<211> 779
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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27
28
29 
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<210> 5
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<211> 2262
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(2259)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
30
31
32
33 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 753
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
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<400> 6
34
36
37 
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<210> 7
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Inverso
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<400> 7
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38 
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<210> 8
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Degenerada Cebador Directo
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<400> 8
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39 
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<210> 9
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Inverso
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<400> 9
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40 
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Degenerada Cebador Directo
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Adaptador
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42 
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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43 
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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44 
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Específica Cebador Antisentido/Cebador Oligonucleotídico Inverso
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<400> 14
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45 
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Específica Cebador Antisentido
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<400> 15
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46 
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Degenerada Cebador Directo
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47 
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Específica Cebador Directo
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Específica Cebador Inverso
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 19
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50 
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 20
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51 
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<210> 21
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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52 
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<210> 22
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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53 
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<210> 23
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 23
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54 
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<210> 24
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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55 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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56 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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57 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<211> 38
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 31
62

Claims (11)

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 6; y
(b)
la secuencia de nucleótidos de los Nº ID SEC: 1, Nº ID SEC: 3 y Nº ID SEC: 5,
o una secuencia de nucleótidos complementaria de dicho polinucleótido.
2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que es DNA o RNA.
3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que es un polinucleótido humano.
4. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, que es un polipéptido humano.
6. Un sistema de expresión que comprende un polinucleótido capaz de producir un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, cuando dicho sistema de expresión está presente en una célula huésped compatible.
7. Una célula huésped que comprende el sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 o una membrana de la misma que expresa el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
8. Un procedimiento para producir un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7 bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.
9. Un método de rastreo para identificar compuestos que influyen en la actividad del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, que comprende:
(a)
poner en contacto células o membranas de acuerdo con la reivindicación 7 que tienen un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 con un compuesto aspirante; y
(b)
determinar si dicho compuesto aspirante da como resultado una estimulación o una inhibición de la actividad de dicho polipéptido.
10. Un método de rastreo para identificar compuestos que estimulan o que inhiben la función del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, que comprende un método seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
medir la influencia de un compuesto aspirante sobre la actividad del polipéptido, o sobre las células o membranas que tienen el polipéptido, o una proteína de fusión del mismo en presencia de un sustrato adecuado para dicho polipéptido;
(b)
medir la influencia de un compuesto aspirante sobre la actividad del polipéptido, o sobre las células o membranas que tienen el polipéptido, o una proteína de fusión del mismo en presencia de un competidor de dicho polipéptido;
(c)
probar si el compuesto aspirante da como resultado una señal generada mediante activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para la actividad del polipéptido o para las células o membranas que tienen el polipéptido;
(d)
mezclar un compuesto aspirante con una solución que contiene un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 y un sustrato adecuado, para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido en la mezcla y comparar la actividad de la mezcla con un patrón sin compuesto aspirante; o
(e)
detectar el efecto de un compuesto aspirante sobre la producción de mRNA que codifica dicho polipéptido y/o dicho polipéptido en células, usando, por ejemplo, un ensayo de ELISA.
11. Un compuesto para usar en terapia, que se selecciona del grupo de:
(a)
un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o
(b)
una secuencia antisentido o una ribozima que inhibe la expresión del gen que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020086405A1 (en) * 2000-09-25 2002-07-04 Inmaculada Silos-Santiago 56638, a novel human neprilysin protease and uses thereof
DE60040089D1 (de) 1999-11-19 2008-10-09 Solvay Pharm Bv Menschliches homolog aus der familie der metalloproteasen
US6991916B2 (en) * 2000-07-14 2006-01-31 Pfizer Inc. Compounds for the treatment of sexual dysfunction
WO2003102544A2 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Cognosci, Inc. Assays for measuring matrix metalloproteinase activities
US20040014131A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-22 Pfizer Inc. Assay methods
US7452875B2 (en) 2003-09-26 2008-11-18 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7262184B2 (en) 2003-09-26 2007-08-28 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7427611B2 (en) 2003-09-26 2008-09-23 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl)-cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US8883144B2 (en) * 2010-09-02 2014-11-11 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Treatment of pulmonary vascular remodeling with neprilysin
AU2011343564B2 (en) 2010-12-16 2016-09-29 Scion NeuroStim, Inc. Systems, devices and methods for bilateral caloric vestibular stimulation
WO2019035916A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Northwestern University DESIGN OF PROTEIN GLYCOSYLATION SITES BY RAPID EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF N-GLYCOSYLTRANSFERASES
WO2019204346A1 (en) 2018-04-16 2019-10-24 Northwestern University METHODS FOR CO-ACTIVATING IN VITRO NON-STANDARD AMINO ACID (nsAA) INCORPORATION AND GLYCOSYLATION IN CRUDE CELLLYSATES
EP3931341A4 (en) 2019-02-25 2023-03-29 Northwestern University Cell-free protein synthesis platforms derived from clostridia

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4960700A (en) * 1986-12-24 1990-10-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the synthesis and assay of a mammalian enkephalinase
IL88535A0 (en) * 1987-12-04 1989-06-30 Dana Farber Cancer Inst Inc Common acute lymphoblastic leukemia antigen
ATE158816T1 (de) * 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
CA2100355A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-05 Lynne H. Parker Botehlo Endothelin converting enzyme
EP0928237B1 (de) * 1996-07-22 2002-04-17 Wifa Werkzeuge GmbH Bolzenschneider
DE19638020A1 (de) * 1996-09-18 1998-03-19 Solvay Pharm Gmbh Die gastrointestinale Durchblutung fördernde Arzneimittel
FR2777291B1 (fr) * 1998-04-08 2000-07-07 Inst Nat Sante Rech Med Nouvelle metalloprotease membranaire nep ii et son utilisation pour le criblage d'inhibiteurs utiles en therapie
US20020086405A1 (en) 2000-09-25 2002-07-04 Inmaculada Silos-Santiago 56638, a novel human neprilysin protease and uses thereof
CA2260376A1 (en) * 1999-02-11 2000-08-11 Universite De Montreal New metalloproteases of the neprilysin family
DE19906310A1 (de) * 1999-02-16 2000-08-17 Solvay Pharm Gmbh Arzneimittel zur Behandlung von Bluthochdruck
AUPP948299A0 (en) * 1999-03-29 1999-04-22 Taylor, Stephen Dennis Adjustable mounting literature display system
EP1069188A1 (en) * 1999-07-15 2001-01-17 Sanofi-Synthelabo Three neprilysin-like membrane metallopeptidases
DE60040089D1 (de) 1999-11-19 2008-10-09 Solvay Pharm Bv Menschliches homolog aus der familie der metalloproteasen
JP2001275687A (ja) * 2000-04-04 2001-10-09 Masafumi Matsuo 膜結合型メタロプロテアーゼ及びその可溶性分泌型
AU2001259473A1 (en) 2000-05-04 2001-11-12 Sugen, Inc. Novel proteases
GB0017387D0 (en) 2000-07-14 2000-08-30 Pfizer Ltd Novel enzyme
US6991916B2 (en) 2000-07-14 2006-01-31 Pfizer Inc. Compounds for the treatment of sexual dysfunction
CA2416691A1 (en) 2000-07-21 2002-01-31 Incyte Genomics, Inc. Proteases
EP1347750A1 (en) 2000-12-15 2003-10-01 Pfizer Limited Treatment of male sexual dysfunction
US20030119714A1 (en) 2000-12-15 2003-06-26 Naylor Alasdair Mark Treatment of male sexual dysfunction
JP2004536063A (ja) 2001-05-18 2004-12-02 ゾルファイ　ファーマスーティカルズ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング 医薬の製造における組み合わせたｎｅｐ／ｍｐ−抑制活性を有する化合物の使用
EP1308459A3 (en) 2001-11-05 2003-07-09 Research Association for Biotechnology Full-length cDNA sequences
WO2003040393A2 (en) 2001-11-06 2003-05-15 Decode Genetics Ehf. Nucleic acids encoding proteases
GB0130219D0 (en) 2001-12-18 2002-02-06 Pfizer Ltd Compounds for the treatment of sexual dysfunction
US7427611B2 (en) * 2003-09-26 2008-09-23 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl)-cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7262184B2 (en) * 2003-09-26 2007-08-28 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JP4824573B2 (ja) * 2003-11-18 2011-11-30 ゾルファイ ファーマスーティカルズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 腎不全、腎疾患または腎障害、特に糖尿病患者におけるこれらの治療のための医薬組成物

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