ES2310557T3

ES2310557T3 - Procedimiento para tratar enfermedades reumaticas usando una molecula de ctla4 soluble.

Info

Publication number: ES2310557T3
Application number: ES01952420T
Authority: ES
Inventors: Robert Cohen; Suzette Carr; David Hagerty; Robert J. Peach; Jean-Claude Becker
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2009-01-16
Anticipated expiration: 2021-07-02
Also published as: EE05378B1; BG66454B1; CA2413190A1; HRP20030071A2; LV12993B; CY1109786T1; IL153593A0; DK1372696T3; HK1058486A1; ZA200210058B; TR201807700T4; HUP0301727A3; BG66024B1; NO20026264D0; PT1935427T; RS50811B; MXPA02012603A; AU7317401A; EP2281568A2; BG107362A

Abstract

El uso de una molécula soluble de fusión de CTLA4, que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en la que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que terminan con ácido aspártico en la posición +124, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar un sujeto que tiene artritis reumatoide, en el que el sujeto ha presentado una respuesta insuficiente a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME).

Description

Procedimiento para tratar enfermedades reumáticas usando una molécula de CTLA4 soluble.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de las enfermedades reumáticas. En particular, la invención se refiere al uso de moléculas de CTLA4 solubles para tratar enfermedades reumáticas, tales como artritis reumatoide, y a composiciones que comprenden una cantidad eficaz de moléculas de CTLA4 solubles y un segundo agente.

Antecedentes de la invención

En la actualidad no existe cura para las enfermedades reumáticas. En su lugar, se usan agentes terapéuticos para tratar los síntomas. Normalmente, los agentes terapéuticos se administran durante periodos de tiempo prolongados y el valor terapéutico a menudo se ve disminuido por los efectos secundarios adversos.

Las enfermedades reumáticas abarcan un grupo de enfermedades que afectan a los tejidos musculoesqueléticos y conjuntivos del cuerpo. Estas enfermedades se caracterizan por inflamación crónica que suele conducir a daño tisular permanente, deformidad, atrofia y discapacidad. Las enfermedades reumáticas afectan a las articulaciones, huesos, tejidos blandos o médula espinal (Mathies, H. 1983 Rheuma (y se clasifican cono reumatismo inflamatorio, reumatismo degenerativo, reumatismo extraarticular o enfermedades del colágeno. Se sabe que algunas enfermedades reumáticas son enfermedades autoinmunitarias causadas por la respuesta inmunitaria alterada de un sujeto.

La artritis reumatoide es una enfermedad reumática progresiva que afecta a aproximadamente un 2% de la población adulta de países desarrollados (Uysinger, P. D., y col., 1985 Rheumatoide Arthritis, pág., 140). Esta enfermedad se caracteriza por sinovitis inflamatoria persistente que causa destrucción del cartílago y erosión ósea, que conduce a deformidades estructurales en las articulaciones periféricas. Los síntomas asociados con la artritis reumatoide incluyen tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y dolor, especialmente tras la flexión. Los sujetos en estadios avanzados de la artritis sufren daños estructurales, incluida destrucción articular con erosión ósea (en: "Principals of Internal Medicine", Harrison, 13 edición, páginas 1648-1655). Además, los pacientes pueden presentar otros síntomas clínicos de varias lesiones orgánicas, incluidas lesiones de la piel, riñones, corazón, pulmones, sistema nervioso central y ojos, debido a vasculitis relacionada con el proceso autoinmunitario.

Otros síntomas que se correlacionan con la artritis reumatoide incluyen tasas elevadas de sedimentación eritrocitaria y niveles elevados de proteína C reactiva en suero (CRP) y/o del receptor soluble de IL-2 (IL-2r). La tasa de sedimentación eritrocitaria aumenta en casi todos los pacientes con artritis reumatoide activa. El nivel de proteína C reactiva en suero también está elevado y se correlaciona con la actividad de la enfermedad y la probabilidad de daño articular progresivo. Además, el nivel de IL-2r soluble, un producto de células T activadas, está elevado en suero sanguíneo y líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide activa (véase: "Principals of Internal Medicine", Harrison, 13 edición, página 1650).

Se cree que la artritis reumatoide es una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T, que implica interacciones intercelulares no específicas de antígeno entre los linfocitos T y las células presentadoras de antígeno. En general, la magnitud de la respuesta de las células T se determina mediante la respuesta coestimuladora provocada por la interacción entre moléculas de superficie de las células T y sus ligandos (Mueller, y col., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7:445-480). Mediante la interacción entre receptores de superficie de las células T, CD28 y CTLA4, y sus ligandos, como las moléculas relacionadas con B7 CD80 (es decir, B7-1) y CD86 (es decir, B7-2) sobre las células presentadoras de antí-
geno (Linsley, P. y Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11:191-212) proporcionan señales coestimuladoras clave.

La activación de células T en ausencia de coestimulación tiene como resultado un respuesta alérgica de las células T (Schwartz, R. H., 1992 Cell 71:1065-1068)m en la que el sistema inmunitario no responde a la estimulación.

Dado que se piensa que la artritis reumatoide es una enfermedad del sistema inmunitario mediado por células T, una estrategia para desarrollar agentes nuevos para tratar la artritis reumatoide es identificar moléculas que bloquean las señales coestimuladoras entre los linfocitos T y las células presentadoras de antígeno, mediante el bloqueo de la interacción entre el CD28 y CTLA4 endógenos y B7. Entre las posibles moléculas se incluyen moléculas de CTLA4 solubles modificadas para unirse a B7 con una mayor avidez que el CTLA4 salvaje (cuya secuencia se muestra en la figura 19) o CD28, de modo que se bloquean las señales coestimuladoras.

Se han construido formas solubles de CD28 y CTLA4 mediante condensación de los dominios extracelulares variables de tipo (V) de CD28 y CTLA4 a los dominios constantes de la inmunoglobulina g (Ig), que tiene como resultado CD28Ig y CTLA4Ig. En la figura 20 se muestra una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de CTLA4Ig, en la que la proteína comienza con metionina en la posición +1 o alanina en la posición -1 y finaliza con lisina en la posición +357. CTLA4g se une a las células positivas para CD80 y positivas para CD86 con más fuerza que CD28Ig (Linsley, P., y col., 1994 Immunity 1:793-80). Se ha descubierto CTLA4g bloquea que muchas respuestas inmunitarias dependientes de células T tanto in vitro como in vivo. (Linsley, P., y col., 1991b, supra; Linsley, P., y col., 1992a Science 257:792-795; Linsley, P., y col., 1992b J. Exp. Med. 176: 1595-1604; Lenschow, D.J., y col. 1992 Science 257: 789-792; Tan, P., y col., 1992 J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L.A., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105).

Para alterar la afinidad de la unión a ligandos naturales, como el B7, las moléculas de fusión CTLA4Ig solubles se modificaron mediante mutación de aminoácidos en la porción CTLA4 de las moléculas. Las regiones de CTLA4 que, una vez mutadas, alteran la afinidad o avidez de la unión por los ligandos B7 incluyen la región determinante de complementariedad 1 (CDR-1, tal y como se describe en las patentes de EE.UU. 6.090.914, 5.773.253, 5.844.095; en la solicitud de patente de EE.UU. pendiente de tramitación con número de serie 60/214.065; y por Peach y col., 1994. J. Exp. Med., 180: 2049-2058) y la región determinante de la complementariedad 3 regiones tipo (CDR-3) (la CDR-3 es la región conservada del dominio extracelular CTLA4 tal y como se describe en las patentes de EE.UU. 6.090.914, 5.773.253 y 5.844.095; en la solicitud de patente de EE.UU. pendiente de tramitación con número de serie 60/214.065; y de Peach y col., 1994. J. Exp. Med., 180: 2049-2058. La región de tipo CDR-3 abarca la región CDR-3 y se extiende, mediante varios aminoácidos, hacia el extremo 3' y/o 5' del motivo de CDR-3). La región de tipo CDR-3 incluye un motivo hexapeptídico MYPP-PY que está altamente conservado en todos los miembros de la familia de CD28 y CTLA4. La mutagénesis de barrido de alanina en el motivo hexapeptídico en CTLA4, y en residuos seleccionados en CD28Ig, ha reducido o anulado la unión a CD80 (Peach, R. J., y col. J. Exp. Med., 1994 180:2049-2058).

Se realizaron posteriores modificaciones a las moléculas CTLA4Ig solubles mediante intercambio de regiones homólogas de CTLA4 y CD28. Estas moléculas mutantes homólogas quiméricas CTLA4/CD28 identificaron el motivo hexapeptídico MYPPPY común a CTLA4 y CD28, así como ciertos residuos de aminoácidos no conservados en las regiones de tipo CDR-1 y CDE-3 de CTLA4, como regiones responsables para incrementar la avidez de la unión de CTLA4 con CD80 (Peach, R. J., y col. 1994 J. Exp. Med. 180:2049-2058).

Las moléculas de CTLA4 solubles, tales como CTLA4Ig, moléculas mutantes de CTLA4 o mutantes homólogos quiméricos CTLA4/CD28 tal como se ha descrito en lo que antecede, introducen un nuevo grupo de fármacos terapéuticos para tratar enfermedades reumáticas.

Entre los tratamientos actuales para lasa enfermedades reumáticos, tales como la artritis reumatoide, se incluye administrar fármacos inmunosupresores citotóxicos inespecíficos, tales como metotrexato, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A y bloqueantes o antagonistas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha). Los fármacos inmunosupresores suprimen todo el sistema inmunitario del sujeto, y el uso prolongado incrementa el riesgo de infección. Además, estos fármacos sólo retrasan el progreso de la artritis reumatoide, que continua a un ritmo acelerado tras la interrupción del tratamiento. Además, el tratamiento prolongado con estos fármacos inespecíficos produce efectos secundarios tóxicos, incluida una tendencia hacia el desarrollo de ciertas neoplasias malignas, insuficiencia renal, supresión de médula ósea, fibrosis pulmonar, neoplasia maligna, diabetes y trastornos de la función hepática. Estos fármacos también dejan de ser eficaces gradualmente tras aproximadamente 2-5 años (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6ª Edición, páginas 1001-1022).

Como alternativa se ha usado agentes terapéuticos que son fármacos inmunosupresores no específicos y antiinflamatorios para obtener alivio sintomático. Estos fármacos dependen de la dosis y no protegen de la progresión de la enfermedad. Estos fármacos incluyen compuestos esteroideos, tales como prednisona y metilprednisolona. Los esteroides también producen significativos efectos tóxicos asociados con su uso prolongado (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6ª Edición, páginas 829-833).

Por tanto, los tratamientos actuales para la artritis reumatoide son de eficacia limitada, implican significativos efectos secundarios tóxicos y no se pueden usar continuamente durante periodos de tiempo prolongados.

En consecuencia, existe una necesidad de tratamientos eficaces y más potentes para tratar enfermedades reumáticas, tales como artritis reumatoide, y evita las desventajas de los procedimientos y agentes convencionales, que tengan como objetivo el mecanismo fisiopatológico de la autoinmunidad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de una molécula de fusión CTLA4 soluble, que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en el que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la Figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que finalizan con ácido aspártico en la posición 124, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar un sujeto con artritis reumatoide, en el que el sujeto ha presentado una respuesta insuficiente a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME).

De acuerdo con una forma de realización concreta, el FAME es metotrexato, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A o un bloqueante o antagonista del factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha).

El uso de la molécula de fusión CTLA4 soluble de acuerdo con la presente invención es especialmente para reducir un síntoma de artritis reumatoide, especialmente un síntoma seleccionado del grupo compuesto por tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y dolor.

La presente invención también se refiere al uso de una molécula de fusión CTLA4 soluble, que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en el que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la Figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que finalizan con ácido aspártico en la posición 124, en la fabricación de una composición farmacéutica para reducir o prevenir daño estructura, especialmente erosión ósea o articular, en un sujeto con una enfermedad reumática.

La presente invención además se refiere al uso de un primer agente y de un segundo agente, en el que

a): el primer agente es una molécula de fusión CTLA4 soluble, que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en el que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la Figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que finalizan con ácido aspártico en la posición 124, y

b): el segundo agente se selecciona de un grupo compuesto por corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, prednisona, azatioprina, metotrexato, bloqueantes o antagonistas de TNF\alpha (p. ej., infliximab o etanercept), hidroxicloroquina, sulfasalazina, sales de oro, anakinra, ciclofosfamida y leflunomida,

en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad reumática.

El uso de un primer agente y un segundo agente de acuerdo con la presente invención comprende la fabricación de una composición farmacéutica para la administración secuencial o concomitante de dicho primer agente y dicho segundo agente.

La presente invención además se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de un primer agente y un segundo agente, en la que

b): el segundo agente se selecciona de un grupo compuesto por corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, prednisona, azatioprina, metotrexato, bloqueantes o antagonistas de TNF\alpha (p. ej., infliximab o etanercept), hidroxicloroquina, sulfasalazina, sales de oro, anakinra, ciclofosfamida y leflunomida.

Las composiciones y usos de la presente invención se refieren a tratar enfermedades del sistema inmunitario mediante la administración a un sujeto moléculas de CTLA4 solubles, que se unen a las moléculas 87 sobre células positivas para 87, de modo que se inhibe la unión moléculas 87 endógenas a CTLA4 y/o CD28 sobre las células T. Las moléculas de CTLA4 solubles usadas de acuerdo con la invención incluyen CTLA4Ig.

Los usos de la presente invención también se refieren a la inhibición de la función de las células T, pero no a la depleción de células T en un ser humano mediante el contacto de las células positivas para B7 en el ser humano con una molécula CTLA4 soluble. Entre los ejemplos de moléculas de CTLA4 solubles se incluyen CTLAIg.

Los usos de la presente invención también se refieren a tratar (p. ej., reducir síntomas de) enfermedades reumáticas, tales como artritis reumatoide, mediante la administración a un sujeto con diagnóstico de artritis reumatoide de moléculas de CTLA4 solubles tales como CTLA4Ig.

Los usos de la presente invención también se refieren a reducir los cambios fisiopatológicos asociados con la enfermedad reumática, tal como daño estructural, mediante administración a un sujeto con diagnóstico de artritis reumatoide de moléculas de CTLA4 solubles. La presente invención también se refiere a una molécula de fusión CTLA4 soluble que comprende un dominio extracelular de una molécula CTLA4, en el que el dominio extracelular de la molécula CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que finalizan con ácido aspártico en la posición 124, para usar en el tratamiento de un sujeto con artritis reumatoide, en el que el sujeto no ha respondido a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME), o para usar en la reducción o la prevención del daño estructural en un sujeto con enfermedad reumática.

La presente invención también se refiere a un primer agente y un segundo agente, en la que

para usar en el tratamiento de una enfermedad reumática.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A: Datos demográficos de cohortes de pacientes. Los datos demográficos incluyen sexo, raza y duración de la enfermedad, tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 1B: Datos demográficos de cohortes de pacientes. Los datos demográficos incluyen sexo, edad, peso y actividad de la enfermedad evaluada por el paciente y por el médico, tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 1C: Datos demográficos de cohortes de pacientes tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante. Los datos demográficos incluyen actividad de la enfermedad, tasa de sedimentación eritrocitaria (VSG), función física (discapacidad evaluada mediante un cuestionario de salud) y proteína C reactiva (PCR).

Figura 1D: Datos demográficos de cohortes de pacientes tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante. Los datos demográficos incluyen tumefacción articular, sensibilidad articular, rigidez matutina y dolor.

Figura 1E: Datos demográficos de cohortes de pacientes tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante. Los datos demográficos incluyen tratamientos previos.

Figura 2: Resumen de las interrupciones el día 85 por razón, tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 3A: Respuestas ACR el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: Respuestas ACR-20, -50 y -70.

Figura 3B: Respuestas ACR -20 el día 85, incluida la respuesta al placebo, tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: Respuesta ACR-20 con límites de confianza del 95%.

Figura 3C: Respuestas ACR -20 el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: Diferencia en la respuesta ACR-20 con relación a los límites de confianza del 95%.

Figura 4A: Respuestas clónicas básicas (mejora del 20%) en el recuento de articulaciones tumefactas y sensibles en el porcentaje de pacientes el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: Respuesta clínica básica, ACR-20.

Figura 4B: Respuestas clínicas (en porcentaje de mejora) en el recuento de articulaciones tumefactas y sensibles en el porcentaje de pacientes el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: Cambio en la respuesta clínica en la mejora en porcentaje.

Figura 5A: Respuesta al dolor (mediante la escala de Likert por medio del cambio de una unidad con respecto al valor basal) en el porcentaje de pacientes el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambios en la puntuación del dolor con respecto a la situación basal.

Figura 5B: Cambios en la enfermedad global del paciente (mediante la escala de Likert por medio del cambio de una unidad con respecto al valor basal) en el porcentaje de pacientes el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambios en la actividad global de la enfermedad del paciente.

Figura 5C: Cambios en la enfermedad global observados por el médico (mediante la escala de Likert por medio del cambio de una unidad con respecto al valor basal) en el porcentaje de pacientes el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambios en la actividad global de la enfermedad observados por el médico.

Figura 5D: Dolor (mediante la escala de Likert por medio del cambio de una unidad con respecto al valor basal) en el porcentaje de pacientes el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambios en el dolor con respecto a la situación basal.

Figura 6A: Evaluación global del paciente del cambio de la actividad de la enfermedad con respecto a la situación basal en 2 unidades el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: mejora de la actividad de la enfermedad.

Figura 6B: Evaluación global realizada por el médico del cambio de la actividad de la enfermedad con respecto a la situación basal en 2 unidades el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: mejora de la actividad de la enfermedad.

Figura 7A: Porcentaje de reducción de los niveles de la proteína C reactiva (CRP) el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: porcentaje de reducción en los niveles de CRP con respecto a la situación basal.

Figura 7B: Diferencia en la reducción de los niveles de la proteína C reactiva (CRP) el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: diferencia en el porcentaje de reducción en los niveles de CRP con intervalos de confianza del 95%.

Figura 7C: Reducción media de los niveles de la proteína C reactiva (CRP) el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambio medio con respecto a la situación basal.

Figura 8: Reducción del cambio medio de los niveles de receptor soluble de IL-2 con respecto a la situación basal el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 9A: El efecto de CTLA4Ig sobre las articulaciones sensibles en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: mediana de la diferencia con respecto a la situación basal.

Figura 9B: El efecto de CTLA4Ig sobre las articulaciones sensibles en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: diferencia media con respecto a la situación basal.

Figura 10A: El efecto de CTLA4Ig sobre las articulaciones tumefactas en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: mediana de la diferencia con respecto a la situación basal.

Figura 10B: El efecto de CTLA4Ig sobre las articulaciones tumefactas en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: diferencia media con respecto a la situación basal.

Figura 11: El efecto de CTLA4Ig sobre la diferencia media en la evaluación de dolor con respecto a la situación basal en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 12A: El efecto de CTLA4Ig sobre la evaluación del paciente de la diferencia media en la actividad de la enfermedad con respecto a la situación basal en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 12B: El efecto de CTLA4Ig sobre la evaluación realizada por el médico de la diferencia media en la actividad de la enfermedad con respecto a la situación basal en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 13A: El efecto de L104EA29YIg sobre las articulaciones sensibles en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: diferencia media con respecto a la situación basal.

Figura 13B: El efecto de L104EA29YIg sobre las articulaciones sensibles en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambio medio con respecto a la situación basal.

Figura 14A: El efecto de L104EA29YIg sobre las articulaciones tumefactas en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: diferencia media con respecto a la situación basal.

Figura 14B: El efecto de L104EA29YIg sobre las articulaciones tumefactas en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambio medio con respecto a la situación basal.

Figura 15: El efecto de L104EA29YIg sobre la evaluación del dolor en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante: cambio medio con respecto a la situación basal en el tiempo.

Figura 16A: El efecto de L104EA29YIg sobre la evaluación realizada por el paciente de la diferencia media de la actividad de la enfermedad en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 16B: El efecto de L104EA29YIg sobre la evaluación realizada por el médico de la diferencia media de la actividad de la enfermedad con respecto a la situación basal en el tiempo tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 17: Porcentaje de mejora en la discapacidad del paciente evaluada mediante el cuestionario de Evaluación de la salud (HAQ) en comparación con la situación basal el día 85 con tratamiento con CTLA4Ig y L104EA29YIg tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 18: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de L104EA29YIg tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Figura 19: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos del receptor CTLA4.

Figura 20: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos del receptor CTLA4Ig.

Figura 21: Gel SDS (FIG. 21A) para CTLA4Ig (calle 1), L104EIg (calle 2) y L104EA29YIg (calle 3A); y cromatografías de exclusión por tamaño de CTLA4Ig (FIG. 21B) y L104EA29YIg (FIG. 21C).

Figuras 22A y B: Reducción del cambio medio de los niveles de ICAM-1 soluble y de E-selectiva soluble el día 85 tal y como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen los significados de uso frecuente en la técnica a menos que se especifique lo contrario. Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ligando" se refiere a una molécula que reconoce específicamente y se une a otra molécula, por ejemplo un ligando para CTLA4 es una molécula B7.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "CTLA4 salvaje" o "CTLA4 no mutado" tiene la secuencia de aminoácidos del CTLA4 natural de longitud completa como se muestra en la figura 19 (también como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.434.131, 5.844.095, 5.851.795) o cualquier porción o derivado de la misma, que reconoce o se une a B7 o interfiere con B7, de modo que bloquea la unión a CD28 y/o CTLA4 (p. ej., CD28 y/o CTLA4 endógenos). En formas de realización particulares, el dominio extracelular de CTLA4 salvaje comienza con metionina en la posición +1 y finaliza en ácido aspártico en la posición +124 o el dominio extracelular de CTLA4 salvaje comienza con alanina en la posición -1 y finaliza en ácido aspártico en la posición +124. El CTLA4 salvaje es una proteína de superficie celular, que tiene un dominio extracelular en el extremo N y un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático en el extremo C. El dominio extracelular se une a moléculas diana, tales como una molécula B7. En la célula, la proteína CTLA4 salvaje natural se traduce en un polipéptido inmaduro, que incluye un péptido señal en el extremo N. El polipéptido inmaduro sufre un procesamiento postraduccional, que incluye escisión y eliminación del péptido señal para generar un producto de escisión de CTLA4 que tiene un extremo en N terminal recién generado que difiere del extremo N terminal de la forma inmadura. Un experto en la técnica apreciará que se puede producir un procesamiento postraduccional adicional, que elimina uno o más de los aminoácidos del extremo N terminal recién generado del producto de escisión de CTLA4. Como alternativa, el péptido señal puede no eliminarse completamente, por lo que se generan moléculas que comienzan antes del aminoácido inicial habitual metionina. Por tanto, la proteína CTLA4 madura puede comenzar en metionina en la posición + 1 o alanina en la posición -1. La forma madura de la molécula CTLA4 incluye el dominio extracelular o cualquier porción del mismo,
que se une a B7.

"CTLA4Ig" es una proteína de fusión soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 salvaje unido a una cola de Ig, o una porción del mismo, que se une a B7. Una forma de realización particular comprende el dominio extracelular de CTLA4 salvaje (como se muestra en la Figura 19) que comienza en metionina en la posición +1 y finaliza en ácido aspártico en la posición +124; o que comienza en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; un residuo aminoacídico de unión glutamina en la posición +125; y una porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 a través de lisina en la posición +357 (el ADN que codifica CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 según las condiciones del tratado de Budapest, y con un número de registro ATCC acordado ATCC 68629; Linsley, P., y col., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresa CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991, con un número de identificación ATCC CRL-10762). Las moléculas de CTLA4Ig soluble usadas en los procedimientos y/o kit de la invención pueden incluir o no una secuencia peptídica señal (líder). Normalmente, en los procedimientos y/o kit de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia peptídica señal.

"L10EA29YIg" es una proteína de fusión que es una molécula mutante de CTLA4 que comprende un dominio extracelular de CTLA4 salvaje con cambios aminoacídicos A29Y (un residuo de aminoácido tirosina en sustitución de una alanina en la posición 29) y L104E (un residuo de aminoácido de ácido glutámico en sustitución de una leucina en la posición +104), o una porción del mismo que se una a una molécula B7, unido a una cola de Ig (incluida en la Figura 18; el ADN que codifica L104EA29YIg se depositó el 20 de junio de 2000 con número ATCC PTA-2104; pendiente de tramitación en los números de serie de solicitud de patente de EE.UU. 09/579.927, 60/287.576 y 60/214.065.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "soluble" se refiere a cualquier molécula, o fragmentos y derivados de la misma, no unida o fijada a una célula, es decir en circulación. Por ejemplo, CTLA4 , B7 o CD28 se pueden hacer solubles fijando una fracción de inmunoglobulina (Ig) al dominio extracelular de CTLA4, B7 o CD28, respectivamente. Como alternativa, una molécula como CTLA4 se puede convertir en soluble mediante la eliminación de su dominio transmembrana. Normalmente, las moléculas solubles usadas de acuerdo con al invención no incluyen una secuencia señal (o líder).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "moléculas de CTLA4 solubles" quiere decir moléculas de CTLA4 no unidos a la superficie celular (es decir, en circulación) o cualquier porción funcional de una molécula de CTLA4 que se une a B7, incluidas, entre otras: proteínas de fusión de CTLA4Ig (p. ej., ATCC 68629), en las que el dominio extracelular de CTLA4 está condensado a una fracción de inmunoglobulina (Ig) lo que convierte en soluble la molécula de fusión, o fragmentos y derivados de las mismas; proteínas con el dominio extracelular de CTLA4 condensado o unido a una porción de una proteína biológicamente activa o químicamente activa tal como el producto del gen E7 del papilomavirus (CTLA4-E7), el antígeno p97 asociado a melanoma (CTLA4-p97) o proteína env del VIH (env gp120 de CTLA4), o fragmentos y derivados de las mismas; moléculas de CTLA4 con el dominio transmembrana eliminado para hacer que la proteína sea soluble (Oaks, M. K., y col., 2000 Cellular Immunology 201:144-153), o fragmentos y derivadas de las mismas. Las moléculas de CTLA4 solubles usadas en los procedimientos de la invención pueden o no incluir una secuencia peptídica señal (líder). Normalmente, en los procedimientos de la invención las moléculas no incluyen una secuencia peptídica señal.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "el dominio extracelular de CTLA4" es la porción de CTLA4 que reconoce y se une a los ligandos de CTLA4, tal como moléculas B7. Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124 (Figura 19). Como alternativa, un dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124 Figura 19). El dominio extracelular incluye fragmentos o derivados de CTLA4 que se unen a una molécula B7.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "una secuencia de proteínas que no es de CTLA4" o "molécula que no es de CTLA4" quiere decir cualquier molécula de proteína que no se une a B7 y que no interfiere en la unión de CTLA4 a su diana. Un ejemplo incluye una región constante de la inmunoglobulina (Ig) o porción de la misma. Preferentemente, la región constante de Ig es una región constante de Ig humana o de mono, por ejemplo C(gamma)1 humana, incluida la bisagra, las regiones CH2 y CH3. La región constante de Ig puede mutarse para reducir sus funciones efectoras (patentes de EE.UU. 5.637.481, 5.844.095 y 5.434.131).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "fragmento" o "porción" es cualquier parte o segmento de una molécula CTLA4, preferentemente el dominio extracelular de CTLA4 o una parte o segmento del mismo, que reconoce o se une a su diana, por ejemplo una molécula B7.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "B7" se refiere a la familia B7 de moléculas, incluidas B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) y B7-3, que pueden reconocer y unirse a CTLA4 y/o CD28.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "células positivas para B7" son todas las células con uno o más tipos de moléculas B7 expresados en la superficie de la célula.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un "derivado" es una molécula que comparte homología de secuencia y actividad de su molécula parental. Por ejemplo, un derivado de CTLA4 incluye una molécula de CTLA4 soluble que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 70% similar al dominio extracelular del CTLA4 salvaje y que reconoce y se une a B7, por ejemplo CTLA4Ig.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "bloquear" o "inhibir" un receptor, señal o molécula quiere decir interferir en la activación del receptor, señal o molécula, tal y como se detecta mediante una prueba reconocida en la técnica. Por ejemplo, el bloqueo de una respuesta inmunitaria mediada por células se puede detectar determinando la reducción de los síntomas asociados con la enfermedad reumática. El bloqueo o inhibición puede ser parcial o
total.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "bloquear la interacción de B7" quiere decir interferir en la unión de B7 a sus ligandos, tales como CD28 y/o CTLA4, de modo que se obstruyen las interacciones entre células T y células positivas para B7. Entre los ejemplos de agentes que bloquean las interacciones de B7 se incluyen moléculas tales como un anticuerpo (o una porción o derivado del mismo) que reconoce y se une a cualquiera de las moléculas de CTLA4, CD28 o B7 (p. ej., B7-1, B7-2); una forma soluble (o una porción o derivado de la misma) de las moléculas, tales como CTLA4 soluble; un fragmento peptídico u otra molécula pequeña diseñada para interferir en la señal celular a través de la interacción mediada por CTLA4/CD28/B7. De acuerdo con la invención, el agente bloqueante es una molécula de CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig (ATCC 68629).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "enfermedad del sistema inmunitario" quiere decir cualquier enfermedad mediada por interacciones de células T con células positivas para B7, incluidas enfermedades autoinmunitarias, trastornos relacionados con injertos y enfermedades inmunoproliferativas. Ejemplos de enfermedades del sistema inmunitario incluyen la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH) (por ejemplo, las que pueden ser el resultado de un trasplante de médula ósea o en la inducción de tolerancia), trastornos inmunitarios asociados con el rechazo de trasplantes de injertos, rechazo crónico y alo o xenoinjertos tisulares o celulares, incluidos órganos sólidos, piel, islotes, músculos, hepatocitos, neuronas. Entre los ejemplos de enfermedades inmunoproliferativas se incluyen psoriasis, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma angiocéntrico testicular de células T, angitis linfocítica benigna, lupus (p. ej., lupus eritematoso, nefritis lúpica), tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, diabetes (p. ej., diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II), síndrome de Goodpasture, miastenia gravis, pénfigo, enfermedad de Crohn, oftalmia simpática, uveítis autoinmunitaria, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedades reumáticas (p. ej., artritis reumatoide), polimiositis, esclerodermia y enfermedad mixta del tejido conjuntivo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "enfermedades reumáticas" quiere decir cualquier enfermedad que afecta a las articulaciones, los huesos, los tejidos blandos o la médula espinal (Mathies H., 1983, Rheuma) y comprende reumatismo inflamatorio, reumatismo degenerativo, reumatismo extraarticular y enfermedades del colágeno. Además, entre las enfermedades reumáticas se incluyen poliartritis crónica, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide, panarteritis nodosa, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia sistémica progresiva, periartritis humeroescapular, artritis urática, condrocarcinosis, dermatomiositis, reumatismo muscular, miositis y miogelosis. Se sabe que algunas enfermedades reumáticas son enfermedades autoinmunitarias causadas por la respuesta inmunitaria alterada de un sujeto.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "tratamiento génico" es un procedimiento para tratar una enfermedad mediante manipulación genética de modo que se transfiere una secuencia de ácido nucleico a una célula, tras lo cual la célula expresa cualquier producto génico codificado por el ácido nucleico. Por ejemplo, como es bien conocido por los expertos en la técnica, la transferencia del ácido nucleico puede realizarse mediante la inserción in vivo o in vitro de un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de interés en células mediante diversos procedimientos, incluidos, por ejemplo, precipitación en fosfato cálcico, dextrano dietilaminoetílico, polietilenglicol (PEG), electroporación, inyección directa, lipofección o infección viral (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CoId Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, N.Y., 1993) y Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993). Como alternativa, las secuencias de ácido nucleico de interés pueden transferirse a una célula in vivo en diversos vectores y mediante diversos procedimientos, incluidos, por ejemplo, la administración directa del ácido nucleico en un sujeto (Williams y col, 1991 PNAS 88:2726-2730) o la inserción del ácido nucleico en un vector viral y la infección del sujeto con el virus (Battleman y col., 1993 J Neurosci 13:94-951; Carroll y col. 1993 J CelI Biochem 17E: 241; Lebkowski y col., patente de EE.UU. 5.354.678; Davison y Elliott, Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Otros procedimientos usados para la transferencia in vivo incluyen encapsulación del ácido nucleico en liposomas y transferencia directa de los liposomas, o liposomas combinados con un virus Sendai hemaglutinante, a un sujeto (patente de EE.UU. 5.824.655, incorporada por referencia en la presente memoria descriptiva). Las células transfeccionadas o infectadas expresan los productos proteicos codificados por el ácido nucleico con el fin de mejorar una enfermedad o los síntomas de una enfermedad.

Con el fin de que la invención descrita en la presente memoria descriptiva pueda entenderse más completamente, se expone la descripción siguiente.

Composiciones y usos de la invención

Las composiciones de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de un ligando que se une a B7, es decir moléculas solubles de CTLA4 (tal como CTLA4Ig). Una cantidad eficaz se define como la cantidad de moléculas solubles de CTLA4 que, cuando se unen a las moléculas B7 sobre células positivas para B7, inhiben la unión de las moléculas B7 a los ligandos endógenos tales como CTLA4 y CD28.

Los usos de la presente invención se refieren al tratamiento de un sujeto con una enfermedad reumática. Las enfermedades reumáticas son todas las enfermedades que se caracterizan por (i) inflamación o degeneración de estructuras musculoesqueléticas o del tejido conjuntivo del cuerpo, en particular las articulaciones, e incluidos músculos, tendones, cartílago y tejidos sinovial y fibroso, (ii) se acompañan de tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y/o dolor, o alteración de la locomoción o la función de dichas estructuras y, en algunos casos, (iii) a menudo se acompañan de pruebas serológicas de factor reumatoide y otros marcadores inflamatorios secundarios.

Entre las enfermedades reumáticas se incluye la artritis reumatoide. Los síntomas de artritis reumatoide incluyen tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y dolor, que producen discapacidad física. Los sujetos afectados por los estadios avanzados de artritis sufren síntomas de daño estructural y dolor debilitante. Otros órganos también pueden estar alterados a causa del mecanismo autoinmunitario.

Composiciones

La presente invención proporciona composiciones para usar en el tratamiento de enfermedades inmunitarias, tales como enfermedades reumáticas, que comprende moléculas de CTLA4 solubles. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un agente biológico que inhibe la función de las células T pero no depleción de células T en un ser humano, a través del contacto de célula positivas para B7 en el ser humano con una molécula de CTLA4 soluble. Entre los ejemplos de moléculas de CTLA4 solubles se incluyen CTLA4Ig.

Las moléculas de CTLA4, con secuencias salvajes, pueden convertirse en solubles mediante la deleción del segmento transmembrana de CTLA4 (Oaks, M. K., y col., 2000 Cellular Immunology 201:144-153).

Las moléculas de CTLA4 solubles de la presente invención con secuencias salvajes pueden ser proteínas de fusión, en las que las moléculas de CTLA4 están condensadas a residuos que no son de CTLA4 tal como moléculas de inmunoglobulina (Ig) que convierten a las moléculas de CTLA4 e solubles. Por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4 puede incluir el dominio extracelular de CTLA4 condensado con un dominio constante de inmunoglobulina, que tiene como resultado la molécula CTLA4Ig (Figura 20) (Linsley P. S., y col., 1994 Immunity 1:793-80).

Para los protocolos clínicos, se prefiere que la región de la inmunoglobulina no provoca una respuesta inmunitaria perjudicial en un sujeto. El resto preferido es la región constante de la inmunoglobulina, incluidas las regiones constantes de inmunoglobulina humana o de mono. Un ejemplo de una región de inmunoglobulina adecuada es C\gamma1, incluida la bisagra, las regiones CH2 y CH3 que pueden mediar las funciones efectoras tales como la unión a los receptores Fc, a través de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), o median la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). El resto de inmunoglobulina puede tener en su interior una o más mutaciones (p. ej., en el dominio CH2, para reducir las funciones efectoras tales como CDC o ADCC), donde la mutación modula la capacidad de unión de la inmunoglobulina a su ligando, mediante el incremento o la disminución de la capacidad de unión de la inmunoglobulina al receptor Fc. Por ejemplo, mutaciones en la inmunoglobulina pueden incluir cambios en cualquiera o todos sus residuos de cisteína dentro del dominio de bisagra, por ejemplo las cisteínas en las posiciones +130, +136 y +139 están sustituidas con serina (Figura 20). La molécula de inmunoglobulina puede también incluir la prolina en la posición +148 sustituida con una serina, como se muestra en la figura 20. Además, las mutaciones en el resto de la inmunoglobulina pueden incluir la sustitución de la leucina en la posición +144 por fenilalanina, sustitución de la leucina en la posición +145 por ácido glutámico o la sustitución de la glicina en la posición +147 por
alanina.

Restos que no son de CTLA4 adicionales para usar en las moléculas de CTLA4 solubles incluyen la molécula p97, la molécula env gp120, la molécula E7 y la molécula ova (Dash, B. y col. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):1389-97; Ikeda, T., y col. 1994 Gene 138(1-2):193-6; Falk, K., y col. 1993 CelI. Immunol. 150 (2): 447-52; Fujisaka, K. y col. 1994 Virology 204 (2): 789-93). También son posibles otras moléculas (Gerard, C. y col. 1994 Neuroscience 62 (3): 721; Byrn, R. y col. 1989 63 (10): 4370; Smith, D. y col. 1987 Science 238: 1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).

La molécula de CLTA4 soluble de la invención puede incluir una secuencia peptídica señal unida al extremo N terminal del dominio extracelular de la porción CTLA4 de la molécula. El péptido señal puede ser cualquier secuencia que permita la secreción de la molécula, incluido el péptido señal de oncostatina (Malik, y col., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), o CD5 (Jones, N. H. y col., (1986) Nature 323:346-349) o el péptido señal de cualquier proteína extracelular.

La molécula de CLTA4 soluble de la invención puede incluir el péptido señal de la oncostatina M unido al extremo N terminal del dominio extracelular de CTLA4 y la molécula de inmunoglobulina humana (p. ej., bisagra, CH2 y CH3) unida al extremo C terminal del dominio extracelular (salvaje o mutado) de CTLA4. Esta molécula incluye el péptido señal de la oncostatina M que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición -26 hasta la alanina en la posición -1, en la que la porción de CTLA4 abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un residuo aminoacídico de unión glutamina en la posición +125 y la porción de inmunoglobulina que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357.

Formas de realización preferidas de la invención son moléculas de CTLA4 solubles tales como CTLA4Ig (como se muestra en la figura 20, comenzando en metionina en la posición +1 y finalizando en lisina en la posición +357). La invención además proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes a las moléculas de CTLA4 solubles de la invención. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico es un ADN (p. ej., ADNc) o un híbrido del mismo. El ADN que codifica CTLA4Ig (Figura 24) se depositó el 31 de mayo de 1991 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 según las condiciones del tratado de Budapest, y con un número de registro ATCC acordado ATCC 68629. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico son ARN o un híbrido del mismo.

Además, la invención proporciona un vector que comprende las secuencias nucleotídicas de la invención. ejemplos de vectores de expresión para incluir vectores para células huésped de mamífero (p. ej., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSGS (Stratagene)), vectores retrovirales (p. ej., vectores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) o formas modificadas de los mismos, vectores adenovirales; vectores víricos adeno-asociados, vectores de baculovirus, vectores de levaduras (p. ej., vectores pESC (Stratagene)).

También se proporciona un sistema de vector huésped. El sistema de vector huésped comprende el vector de la invención en una célula huésped adecuada. Ejemplos de células huésped adecuadas incluyen células procarióticas y eucarióticas. De acuerdo con la práctica de la invención, las células eucarióticas también son células huésped adecuadas. Entre los ejemplos de células eucarióticas se incluyen cualquier célula animal, primaria o inmortalizada, levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris) y células vegetales. Células de mieloma, COS y CHO son ejemplos de células animales que se pueden usar como huéspedes. Células CHO concretas incluyen DG44 (Chasin, y col., 1986 Som. CelI. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-Kl (Nº ATCC CCL-61), línea celular CHO-Kl Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), clon 13 de CHO (GEIMG, Genova, IT), clon B de CHO (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire Reino Unido) y RR-CHOKI designado ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Entre los ejemplos de células vegetales se incluyen células de tabaco (plantas enteras, cultivos celulares o callos), maíz, soja y arroz. También son aceptables semillas de maíz, soja y arroz.

La invención incluye composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de enfermedades del sistema inmunitario, que comprende cantidades farmacéuticamente eficaces de moléculas de CTLA4 solubles. En ciertas formas de realización, las enfermedades del sistema inmunitario están medidas por interacciones de CD28/CTLA4/B7. Las moléculas de CTLA4 solubles son moléculas de CTLA4 solubles con secuencia salvaje. La composición farmacéutica puede incluir moléculas proteicas de CTLA4 solubles y/o moléculas de ácido nucleico, y/o vectores que codifican estas moléculas. En formas de realización preferidas, las moléculas de CTLA4 solubles tienen la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA4 como se muestra en la figura 20 (CTLA4Ig). Las composiciones pueden además incluir otros agentes terapéuticos, incluidas toxinas farmacológicas, enzimas, antibióticos o conjugados.

Como es práctica estándar en la técnica, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de la invención mezcladas con un portador o adyuvante aceptable conocido por los expertos en la técnica. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas incluyen portadores y adyuvantes adecuados que incluyen cualquier material que, cuando se combina con la molécula de la invención (p. ej., una molécula de CTLA4 soluble, tal como, CTLA4Ig), conserva la actividad de la molécula y no reacciona con el sistema inmunitario del sujeto. Estos portadores y adyuvantes incluyen intercambiadores de iones, alumbre, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicérido de ácidos grasos vegetales saturados, solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (p. ej., emulsión de aceite/agua), sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato de potasio, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa y polietilenglicol. Otros portadores pueden también incluir soluciones estériles; comprimidos, incluidos comprimidos recubiertos y cápsulas. Normalmente, dichos portadores contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar (p. ej., sacarosa, glucosa, maltosa), ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos portadores también pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos portadores se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos. Tales composiciones también pueden formularse en varias composiciones lipídicas, tales como, por ejemplo, liposomas así como en varias composiciones poliméricas, tales como microesferas poliméricas.

Usos

Los usos de la invención se refieren a la regulación de interacciones funcionales de células positivas para CTLA4 y CD28 con células positivas para B7. Esto comprende poner en contacto las células positivas para B7 con una molécula de CTLA4 soluble de la invención de modo que se forman complejos solubles de CTLA4/B7, los complejos interfieren en la reacción de una molécula endógena de CTLA4 y/o CD28 con una molécula B7.

Los usos de la presente invención también se refieren a la inhibición de la función de las células T pero no a la depleción de células T en un ser humano mediante el contacto de las células positivas para B7 en el ser humano con una molécula de CTLA4 soluble de la invención. Ejemplos de moléculas de CTLA4 solubles incluyen CTLA4Ig.

Las composiciones farmacéuticas tal y como se definen en las reivindicaciones 21 a 26 se pueden usar para tratar enfermedades del sistema inmunitario, tales como enfermedades reumáticas. Esto comprende administrar una composición terapéutica, que comprende moléculas de CTLA4 solubles de la invención, a un sujeto en una cantidad eficaz para aliviar al menos uno de los síntomas asociados con enfermedades del sistema inmunitario. Además, la invención puede proporcionar tratamiento prolongado para enfermedades del sistema inmunitario mediante el bloqueo de las interacciones células T/células positivas para B7, de modo que se bloquea la estimulación de las células T mediante señales coestimuladoras tales como la unión de B7 a CD28, lo que conduce a la inducción de anergia o tolerancia de las células T. Las enfermedades del sistema inmunitario incluyen, entre otras, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inmunoproliferativas y trastornos relacionados con injertos. Ejemplos de enfermedades relacionadas con injertos incluyen la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH) (p. ej., la que puede ser el resultado de un trasplante de médula ósea o en la inducción o tolerancia), trastornos inmunitarios asociados con el rechazo de trasplantes de injertos, rechazo crónico y alo o xenoinjertos tisulares o celulares, incluidos órganos sólidos, piel, islotes, músculos, hepatocitos, neuronas. Entre los ejemplos de enfermedades inmunoproliferativas se incluyen psoriasis, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma angiocéntrico testicular de células T, angitis linfocítica benigna, y enfermedades autoinmunitarias tales como lupus (p. ej., lupus eritematoso, nefritis lúpica), tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, diabetes (p. ej., diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II), síndrome de Goodpasture, miastenia gravis, pénfigo, enfermedad de Crohn, oftalmia simpática, uveítis autoinmunitaria, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedades reumáticas (p. ej., artritis reumatoide), polimiositis, esclerodermia y enfermedad mixta del tejido conjuntivo.

Las moléculas de CTLA4 solubles de la invención exhiben propiedades inhibidoras in vivo. En condiciones en las que se producen interacciones células T/células positivas para B7, por ejemplo interacciones células T/células B, como resultado del contacto entre células T y células positivas para B7, la unión de las moléculas de CTLA4 introducidas para reaccionar con las células positivas para B7, por ejemplo células B, pueden interferir, es decir inhibir, las interacciones células T/células positivas para B7 y tener como resultado la regulación de las respuestas inmunitarias.

Los usos de la presente invención se refieren al la regulación por disminución de las respuestas inmunitarias. La regulación por disminución de una respuesta inmunitaria por las moléculas de CTLA4 solubles de la invención puede ser un modo de inhibir o bloquear una respuesta inmunitaria ya en progreso o puede implicar la prevención de la inducción de una respuesta inmunitaria. Las moléculas de CTLA4 solubles de la invención pueden inhibir las funciones de las células T activadas, tales como la proliferación de los linfocitos T y la secreción de citocinas, mediante la supresión de las respuestas de las células T o mediante la inducción de tolerancia específica en las células T, o ambos. Además, las moléculas de CTLA4 solubles de esta invención, que interfieren en la vía de CTLA4/CD28/B7 pueden inhibir la proliferación de células T y/o la secreción de citosina, y, por tanto, tienen como resultado destrucción tisular reducida e inducción de la falta de respuesta o anergia de las células T.

Una forma de realización preferida incluye tratar una enfermedad reumática, tal como artritis reumatoide, mediante la administración de una cantidad eficaz de las composiciones terapéuticas, de modo que alivia al sujeto de al menos uno de los síntomas asociados con la enfermedad, incluida la reducción de: tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y dolor, y el daño estructural que, posteriormente, disminuye la discapacidad física. La invención también puede usarse para reducir al menos un síntoma asociado con la artritis reumatoide, incluida la reducción de las tasas de sedimentación eritrocitaria, los niveles séricos de proteína C reactiva, ICAM-1, E-selectiva soluble y/o IL-2r soluble.

La cantidad de alivio de síntomas proporcionado por la presente invención se puede medir usando cualquiera de los criterios aceptados establecidos para medir y documentar el alivio de síntomas en un contexto clínico. Criterios aceptables para medir el alivio de los síntomas pueden incluir puntuaciones basadas en los criterios establecidos por el Colegio Americano de Reumatología (p. ej., ACR 20), las cuatro medidas de alivio de síntomas (en: "CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA" 1988), y el Cuestionario de Evaluación de la salud (HAQ) (Fries, J. F., y col., 1982 J. of Rheumatology 9:789-793). Para una descripción general de estos criterios, véase "Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA)", Febrero 1999.

Los sujetos tratados por la presente invención incluyen sujetos mamíferos, incluidos seres humanos, monos, simios, perros, gatos, vacas, caballos, conejos, ratones y ratas.

La presente invención proporciona varios procedimientos, locales o sistémicos, para administrar la molécula de CTLA4 soluble. Los procedimientos incluyen procedimientos intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, oral, inhalación y subcutáneo, así como procedimientos con bomba implantable, infusión continua, terapia génica, liposomas, supositorios, contacto tópico, vesículas, cápsulas e inyección. El agente terapéutico, mezclado con un portador, normalmente se liofiliza para su almacenamiento y se reconstituye con agua o con una solución tamponada con un pH neutro (pH de aproximadamente 7-8, p. ej., pH 7,5) antes de la administración.

Como es práctica estándar en la técnica, las composiciones de la invención pueden administrarse al sujeto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la práctica de la invención, los usos comprende administrar a un sujeto las moléculas de CTLA4 solubles de la invención para regular las interacciones de células positivas pata CD28 y/o CTLA14 con células positivas para B7. Las células positivas para B7 se ponen en contacto con una cantidad eficaz de moléculas de CTLA4 solubles de la invención, o con fragmentos o derivados de las mismas, de modo que se formen complejos solubles de CTLA4B7. Los complejos interfieren con la interacción entre las moléculas endógenas de CTLA4 y CD28 con las moléculas de la familia B7.

Las moléculas de CTLA4 solubles se pueden administrar a un sujeto en una cantidad y durante un periodo de tiempo (p. ej., longitud de tiempo y/o múltiples veces) suficiente para bloquear la unión de las moléculas de B7 endógenas a sus ligandos respectivos, en el sujeto. De este modo, el bloqueo de la unión B7 endógeno/ligando inhibe las interacciones entre las células positivas para B7 con las células positivas para CD28 y/o CTLA4.

La dosis de un agente terapéutico depende de muchos factores, incluido el tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoinmunitaria que se está tratando, la gravedad de la enfermedad, la salud de un sujeto y la respuesta al tratamiento con los agentes. En consecuencia, las dosificaciones de los agentes pueden variar dependiendo de cada sujeto y del modo de administración. Las moléculas de CTLA4 solubles pueden administrarse en una cantidad entre 0,1 a 20,0 mg/kg en peso del paciente/día, preferentemente entre 0,5 a 10,0 mg/kg/día.

La invención también abarca el uso de acuerdo con la invención junto con otros agentes farmacéuticos para tratar enfermedades del sistema inmunitario, Por ejemplo, se pueden tratar enfermedades reumáticas con moléculas de la invención junto con inm8unosupresores tales como corticosteroides, ciclosporina (Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2):151-156), prednisona, azatioprina, metotrexato (R. Handschumacher, en: "Drugs Used for Immunosuppression" páginas 1264-1276), bloqueantes o antagonistas del TNF\alpha (New England Journal of Medicine, vol. 40:253-259, 1999; The Lancet vol. 354:1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130: 478-486), o cualquier otro agente biológico dirigido a cualquier citosina inflamatoria, fármacos antiinflamatorios no esteroideos/inhibidores de la Cox-2, hidroxicloroquina, sulfasalazoprina, sales de oro, etanercept, infliximab, rapamicina, micofenolato, mofetilo, azatioprina, tacrolimus, basiliximab, citoxabo, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrina clorhidrato, anakinra y/u otros productos biológicos.

Las moléculas de CTLA4 solubles también se pueden usar en combinación con uno o más de los siguientes agentes para regular una respuesta inmunitaria: gp39 soluble (también conocida como ligando de CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), CD29 soluble, CD40 soluble , CD80 soluble (p. ej., ATCC 68627), CD86 soluble, CD28 soluble (p. ej., 68628), CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1, soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos a gp39 (p, ej. ATCC HB- 10916, ATCC HB-12055 y ATCC HB 12056) anticuerpos reactivos a CD40 (p. ej., ATCC HB -9110), anticuerpos reactivos a B7 (p. ej., ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, etc.), anticuerpos reactivos a CD28 (p. ej., ATCC HB-11944 o Acmo 9.3 como describen Martin y col. (J. Clin. Immun. 4(1): 18-22, 1980), anticuerpos reactivos a LFA-1 (p. ej., ATVV HB-9579 y ATCC TIB-213), anticuerpos reactivos a LFA-2, anticuerpos reactivos a IL-2, anticuerpos reactivos a IL-2, anticuerpos reactivos a IFN-gamma, anticuerpos reactivos a CD2, anticuerpos reactivos a CD48, anticuerpos reactivos a ICAM (p. ej., ICAUI-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 e OCAM-3), anticuerpos reactivos a CTLA4 (p. ej., ATCC HB-304), anticuerpos reactivos a Thy-1, anticuerpos reactivos a CD56, anticuerpos reactivos a CD3, anticuerpos reactivos a CD29, anticuerpos reactivos a TCR, anticuerpos reactivos a VCAM-1, anticuerpos reactivos a LECAM-1, anticuerpos reactivos a ELAM-1, anticuerpos reactivos a CD44. En ciertas formas de realización se prefieren anticuerpos monoclonales. En otras formas de realización se prefieren fragmentos de anticuerpos. Como los expertos en la técnica entenderán con facilidad, la combinación puede incluir las moléculas de CTLA4 solubles de la invención y otro agente inmunosupresor, las moléculas de CTLA4 solubles con otros dos agentes inmunosupresores, las moléculas de CTLA4 solubles con otros tres agentes inmunosupresores, etc. La determinación de la combinación y dosificaciones óptimas se puede determinar y optimizar usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Las moléculas de CTLA4 solubles de la invención se pueden administrar como único ingrediente activo o junto con otros fármacos en regímenes de inmunomodulación u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo para el tratamiento o prevención del rechazo agudo o crónico de alo o xenoinjertos o trastornos inflamatorios o autoinmunitarios o para inducir tolerancia. Por ejemplo, puede usarse en combinación con un inhibidor de la calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK506; un macrólido inmunosupresor, por ejemplo rapamicina o un derivado del mismo; por ejemplo 40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina, un agente hospedador de linfocitos, por ejemplo FTY720 o un análogo del mismo; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida o un análogo de la misma; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetilo; 15-desoxispegualina o un análogo del mismo; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo anticuerpos monoclonales frente a receptores leucocitarios, por ejemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos; u otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo CTLA4/CD28-I-g, u otros inhibidores de moléculas de adhesión, por ejemplo AcMo o inhibidores de bajo peso molecular incluidos antagonistas de LFA-1, antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4. El compuesto es particularmente útil en combinación con un compuesto que interfiera con CD40 y su ligando, por ejemplo anticuerpos frente a CD40 y anticuerpos frente a
CD40-L.

Cuando las moléculas de CTLA4 solubles mutantes de la invención se administran junto con otros tratamientos inmunosupresores/inmunomoduladores o antiinflamatorios, por ejemplo los que se han especificado en lo que antecede, las dosificaciones del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio coadministrado variarán dependiendo del tipo de co-fármaco empleado, por ejemplo si es un esteroide o una ciclosporina, del fármaco empleado, de la afección que se esté tratando etc.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona en otro aspecto más usos tal y como se ha definido antes, que comprenden la coadministración, por ejemplo de forma concomitante o secuencial, de una cantidad terapéuticamente eficaz de moléculas de CTLA4 solubles de la invención, por ejemplo CTLA4Ig, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y una segunda sustancia farmacológica, en la que dicha segunda sustancia farmacológica es un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, como se ha indicado antes. Además se proporcionan combinaciones terapéuticas, por ejemplo un kit, por ejemplo para usar como se ha definido en lo que antecede, que comprende una molécula de CTLA4 soluble, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, para usar de forma concomitante o secuencial con al menos una composición farmacéutica que comprende un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio. El kit puede comprender instrucciones para su administración.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a un experto en la técnica al hacer y usar la misma. Los ejemplos no están destinados de ninguna manera a limitar de ningún modo el alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

A continuación se proporciona una descripción de los procedimientos usados para generar las secuencias nucleotídicas que codifican las moléculas de CTLA4 de la invención.

En primer ligar se construyó un plásmido que codificada CTLA4Ig y se demostró que expresaba moléculas de CTLA4Ig tal y como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.434.131, 5.885.579 y 5.851.795. A continuación, a partir de la secuencia codificadora de CTLA4Ig se generaron moléculas mutantes en un solo sitio (p. ej., L104EIg), se expresaron y se analizó la cinética de unión para varias moléculas B7. La secuencia nucleotídica de L104EIg se usó como molde para generar la secuencia mutante de CTLA4 de doble sitio de L104EA29YIg (como se incluye en la secuencia que se muestra en la figura 18), que se expresó en forma de proteína y cuya cinética de unión se analizó.

Construcción de Atla4ig

Se construyó un constructo genético codificador de CTLA4Ig que comprendía el dominio extracelular de CTLA4 y un dominio de la IgG gamma, tal y como se describe en las patentes de EE.UU. 5.434.131, 5.844.095 y 5.851.795. El dominio extracelular del gen CTLA4 se clonó mediante PCR usando oligonucleótidos sintéticos correspondientes a la secuencia publicada (Dariavach y col., J. Eur. Journ. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)).

Dado que en el gen de CTLA4 no se identificó un péptido señal para CTLA4, el extremo N de la secuencia predicha de CTLA4 se condensó con el péptido señal de la oncostatina M (Malik y col., Mol and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) en dos etapas, usando oligonucleótidos superpuestos. Para la primera etapa, el oligonucleótido, CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCA AGCATGGCGAGCATGGCAATGCA CGTGGCCCAGCC (que codificaba los 15 aminoácidos del extremo C del péptido señal de la oncostatina M condensados con los 7 aminoácidos del extremo N de CTLA4) se usó como cebador directo y TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (que codificaba los residuos de aminoácidos 119-125 de la secuencia de aminoácidos codificadora del receptor de CTLA4 y que contenía un sitio para la enzima de restricción BcI I) como cebador inverso. El molde para esta etapa fue ADNc sintetizado a partir de 1 microg del ARN total de células H38 (un línea celular de leucemia de células T de HTLV II proporcionada por los Drs. Salahudin y Gallo, NCI, Bethesda, MD). Una porción del producto de la PCR obtenido en la primera etapa se reamplificó usando un cebador directo de superposición, que codificaba la porción N terminal del péptido señal de la oncostatina M y que contenía un sitio para la endonucleasa de restricción Hind III, CTAGC
CACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGC TCAGTCTGGTCCTTGCACTC y el mismo cebador inverso. El producto de la reacción PCR se digirió con Hind III y BcI y se ligó junto con un fragmento de ADNc escindido BcI/Xba codificador de las secuencias de aminoácidos correspondientes a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la IGC(gamma) en el vector de expresión escindido con Hind III/Xba I, CDM8 o el vector de expresión escindido con Hind III/Xba I piLN (también conocido como \piLN).

El ADN codificador de la secuencia de aminoácidos correspondiente a CTLA4Ig se ha depositado con la ATCC según el Tratado de Budapest, el 31 de mayo de 1991 y se ha acordado el número de registro ATCC 68629.

Las secuencias nucleotídicas mutantes de doble sitio que codifican la molécula mutante de CTLA4 L104R129YIg se ha depositado el 19 de junio de 2000 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 y con un número de registro ATCC acordado PTA-2104.

Número de registro ATCC PAT-2104.

Las moléculas de CTLA4 solubles se expresaron a partir de las secuencias nucleotídicas y se usaron en los estudios clínicos de fase II descritos en el Ejemplo 2, más adelante.

Ejemplo 2

A continuación se proporciona una descripción de estudios clínicos de fase II de pacientes humanos a los que se ha administrado la molécula mutante de CTLA4 soluble L104EA29YIg (también conocida como LEA29Y o LEA) o CTLA4Ig, para aliviar al menos un síntoma asociado con la artritis reumatoide, incluido reducir: tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y dolor. La molécula de CTLA4Ig usada en la presente memoria descriptiva comienza con metionina en la posición +1 (o, como alternativa, con alanina en la posición -1) y termina con lisina en la posición +357, como se muestra en la figura 20. El ADN que codifica una forma de realización de la molécula de CTLA4Ig se ha depositado como ATCC 68629. La molécula de L104EA29YIg usada en la presente memoria comienza con metionina en la posición +1 (o, como alternativa, con alanina en la posición -1) y termina con lisina en la posición +357, como se muestra en la figura 18. El ADN que codifica una forma de realización de la molécula de L104EA29YIg se ha depositado como ATCC PTA 2104.

Además, a continuación se proporciona una descripción de pacientes humanos a los que se ha administrado L104EA29YIg o CTLA4Ig para aliviar al menos un marcador biológico secundario asociado con la artritis reumatoide, incluida la reducción de las tasas de sedimentación eritrocitaria y los niveles séricos de proteína C reactiva y/o del receptor de IL-2.

Cohortes de pacientes

En el estudio participó un total de 214 pacientes, incluidos 54 varones y 160 mujeres (Figuras 1A, 1B). En el momento basal, los pacientes presentaban una duración media de la enfermedad de 3,4 (\pm 2,0) años y no habían respondido a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME). Se permitió el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) o de esteroides a dosis estables (\leq 10 mg/día) y los FAME estaban prohibidos. Se aleatorizó a los pacientes a grupos de 25 a 32 pacientes por grupo de tratamiento. Treinta y dos pacientes recibieron placebo, 92 recibieron L104EA29YIg y 90 recibieron CTLA4Ig. Los pacientes que siguieron las directrices del protocolo y no abandonaron antes del día 57 recibieron un total de 4 infusiones intravenosas, una infusión cada uno de los días 1, 15, 29 y 57. Todos los pacientes se evaluaron los días 1, 15, 29, 43, 57, 71 y 85. Las dosis administradas incluyeron 0,5, 2,0 o 10,0 mg/kg de LA104EA29YIg (indicados como LEA.5, LEA2 y LEA10, respectivamente en las Figuras 1A-1E) o de CTLA4Ig (indicadas como CTLA.5, CTLA2 y GTLA10, respectivamente en las figuras
1A-1E).

Se monitorizó a todos los sujetos para determinar la existencia de acontecimientos adversos peri-infusión y la seguridad global mediante un cuestionario en el que se enumeran los posibles acontecimientos adversos. Se preguntó a los pacientes por los posibles acontecimientos adversos que pudieran haberse producid en las veinticuatro horas después de la infusión. Además, se alentó a los pacientes para que comunicaran de forma espontánea cualquier acontecimiento adverso que hubieran experimentado. Los médicos vigilaron periódicamente las muestras analíticas de los pacientes para detectar anomalías en la bioquímica en sangre y en la hematología, por ejemplo evaluaron los niveles de mediadores de respuesta inflamatoria tales como citocinas (TNF, IL-6), triptasa y complemento. El criterio de valoración principal fue la proporción de sujetos que cumplían los criterios de ACR 20 el día 85.

Almacenamiento del material de ensayo

CTLA4Ig y L194EA29YIg se suministraron en viales de vidrio de un solo uso que contenían 200 mg/vial de CTLA4Ig o 100 mg/vial de L104EA29YIg, respectivamente. Antes de la infusión, el CTLA4Ig t L104EA29YIg se diluyeron hasta una concentración final de 25 mg/ml con agua estéril para inyectables (AEPI).

Protocolo de administración

Todas las fusiones se administraron por vía intravenosa durante 1 hora (figuras 1 a 17). Todos los sujetos recibieron al menos una infusión de la medicación del estudio.

Grupo 1: 32 pacientes, CTLA4Ig o L104EA29YIg placebo equivalente.

Grupo 2: 26 pacientes; dosis 0,5 mg/kg de CTLA4Ig.

Grupo 3: 32 pacientes; dosis 2,0 mg/kg de CTLA4Ig.

Grupo 4: 32 pacientes; dosis 10,0 mg/kg de CTLA4Ig.

Grupo 5: 32 pacientes; dosis 0,5 mg/kg de L104EA29YIg.

Grupo 6: 29 pacientes; dosis 2,0 mg/kg de L104EA29YIg.

Grupo 7: 31 pacientes; dosis 10,0 mg/kg de L104EA29YIg.

Monitorización clínica

Se evaluó a los pacientes para determinar síntomas basales de actividad de la enfermedad antes de recibir alguna infusión. Estas evaluaciones basales incluyeron: tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina , la actividad de la enfermedad evaluada por el paciente y por el médico, así como la discapacidad evaluada mediante el Cuestionario de Evaluación de la salud (HAQ) (indicada como la puntuación de la función física en la figura 1C) y dolor (figuras 1A a 1D). Además, las evaluaciones basales incluyeron las tasas de sedimentación eritrocitaria (TSE) y los niveles séricos de proteína C reactiva (PCR) y del receptor soluble de IL-2 (IL-2r) (Figuras 1C y 1D).

Los estudios de la respuesta clínica se basaron en los criterios establecidos por el Colegio Americano de Reumatología (ACR). Un sujeto satisfacía el criterio ACR20 si se producía una mejora del 20 por ciento en los recuentos de articulaciones sensibles y tumefactas y una mejora del 20 por ciento en tres de los cinco síntomas restantes medidos, tales como los cambios globales en la enfermedad indicados por el paciente y por el médico, el dolor, la discapacidad y un reactante de fase aguda (Felson, D. T. y col., 1993 Arthritis and Rheumatism 36: 729-740; Felson, D. T., y col., 1995 Arthritis and Rheumatism 38: 1-9).

Marcadores biológicos

También se evaluaron posibles marcadores biológicos de la actividad de la enfermedad (factor reumatoide, PCR, TSE, IL-2R soluble, ICAM-1 soluble, E-selectiva y MMP-3). Para determinar la concentración sérica de IL-2sRa, sICAM-1, E-selectina y MMP-3 se usaron procedimientos validados de enzimoinmunoensayo (EIA). Se evaluaron los niveles de TNF\alpha e IL-6 antes de la infusión y 2 horas después, en caso necesario.

Los niveles de IL-2sR\alpha, sICAM-1, sE-selectina se midieron usando kit EIA colorimétricos disponibles comercialmente de R&D Sysmtems, Inc. (Minneapolis, MN). Los límites de cuantificación inferiores y superiores fueron 312-20.000 pg/ml, 40-907 ng/ml y 10-206 ng/ml, respectivamente. El coeficiente de variación entre ensayos varió de 4,48-8,4%, 3,8-5,0% y 5,5-9,0%, respectivamente. De acuerdo con el fabricante del kit, los valores séricos normales varían de 676-2, 132 pg/ml, respectivamente.

El MMP-3 se midió usando un kit de EIA colorimétrico comercialmente disponible de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Los límites de cuantificación inferiores y superiores fueron 30-7.680 ng/ml. El coeficiente de variación entre ensayos varió de 6,3-10,6%. De acuerdo con el fabricante del kit, los valores séricos normales varían de 28-99 ng/ml.

Los niveles de IL-6 y TNF\alpha se midieron usando kit de EIA quimioluminiscente disponibles comercialmente de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). Los límites de cuantificación inferiores y superiores fueron 0,3-3.000 pg/ml y 0,7-7.000 respectivamente. El coeficiente de variación entre ensayos varió de 3,1-5,7%.y 6,4-20,7%, respectivamente. De acuerdo con el fabricante del kit, los valores séricos normales varían de <0,3-12 pg/ml y < 0,7-7,5 pg/ml.

Ensayos con anticuerpos

Se obtuvieron muestras de suero para la evaluación de anticuerpos específicos del fármaco antes de la administración de la dosis el día 1 y aproximadamente los días 15, 29, 5 7, 85 y 169. Debido a los elevados títulos preexistentes dirigidos contra la porción inmunoglobulina (Ig) de la molécula, también se expresó la formación de anticuerpos específicos contra CTLA4Ig Y LEA29Y sin las regiones constantes de Ig.

Placas de ELISA Immulon II de noventa y seis pocillos (Dynex, Chantilly, Virginia) se recubrieron con CTLA4Ig, CTLA4Ig sin las regiones constantes Ig, LEA29Y o LEA29Y sin las regiones constantes Ig a 2, 4, 2 ó 1 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), respectivamente, y se incubaron durante la noche a 2-8ºC. Las placas se lavaron con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 y se bloquearon durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía 1% de seroalbúmina bovina (BSA). A continuación las placas se lavaron y se añadieron diluciones seriadas de los sueros problema o de los sueros para control de calidad (CC) en los pocillos adecuados y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los sueros se diluyeron tres veces en PBS con 0,25% de BSA y 0,05% de Tween 20 comenzando a una dilución 1:10. Se lavaron las placas y se añadió un cóctel de anticuerpos de cabra kappa y lambda anti-humano conjugados con fosfatasa alcalina (Southern Biotechmology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). Después de una incubación de 1 hora a 37ºC, se lavaron las placas y a cada pocillo se añadió 1 mg/ml de para-nitrofenil fosfato en tampón de dietanolamina. Después de 30 minutos a 25ºC, las reacciones se detuvieron con NaOH 3N y se registró la absorbancia (longitud de onda dual: 405 nm y 55º nm). Los resultados se expresaron como título del criterio de valoración (EPT), definido como la recíproca de la dilución más elevada que tuvo como resultado una lectura de absorbancia cinco veces mayor o igual a la absorbancia media de fondo de las placas. La absorbancia de fondo de las placas se determinó como la medida de la absorbancia registrada en ausencia de suero. Los valores se consideraron positivos para seroconversión si había al menos dos diluciones seriadas (por nueve) o más en relación con los valores de EPT previos a la dosis. Las muestras de suero para CC positivas para anticuerpos específicos de CTLA4Ig o LEA29Y se generaron a partir de monos inmunizados. Una alícuota de la muestra para CC adecuada se analizó durante cada ciclo analítico. Los ciclos analíticos sólo se aceptaron cuando las muestras para CC estaban dentro de los criterios de aceptación
del ensayo.

Resultados

En general CTLA4Ig y LE104EA29YIg se toleraron bien a todos los niveles de dosis. Los acontecimientos adversos peri-infusión fueron similares en todos los grupos de dosis, con excepción de los dolores de cabeza. La respuesta de dolor de cabeza de los pacientes el día 85 aumentó de forma dependiente de la dosis un 23%, 44% y 53% en los pacientes tratados con CTLA4Ig y 34%, 45% y 61% en los pacientes tratados LE104EA29YIg, a 0,5, 2,0 y 10,0 mg/kg respectivamente. En contraste con ello, el 31% de los pacientes a los que se administró placebo experimentó dolores de cabeza.

El porcentaje de pacientes que abandonaron el estudio clínico debido a brotes de la artritis y a otros acontecimientos adversos se resume en la figura 2. Un porcentaje mucho mayor de pacientes tratados con placebo abandonaron el tratamiento debido a brotes de artritis. Los pacientes tratados con CTLA4Ig abandonaron el tratamiento menos con dosis crecientes. Muy pocos pacientes tratados con L104EA29YIg abandonaron el tratamiento. Estos resultados indican una buena respuesta inversa dependiente de la dosis para CTLA4Ig y una respuesta terapéutica más fuerte con el tratamiento con L104EA29YIg.

Las respuestas ACR-20, -50 y -70 de los pacientes tratados con CTLA4Ig, L104EA29YIg o placebo el día 85 se resumen en la figura 3A. De igual forma, las figuras 3B y C describen las respuestas ACR-20 con límites de confianza del 95%. Las respuestas parecen depender de la dosis con una clara respuesta significativa a 10 mg/kg de peso corporal del paciente.

En las figuras 4A y B se muestra el porcentaje de pacientes con reducción de recuentos de articulaciones tumefactas y sensibles en comparación con los pacientes que no tienen respuesta al tratamiento con CTLA4YIg, L104EA29YIg o placebo. Las respuestas terapéuticas parecen depender de la dosis. Un porcentaje mayor de pacientes muestran mejora del 20, 50, 70 e incluso 100% en los grupos de 2 y 10 mg/kg para ambos productos.

En las figuras 5A, B, C y D se muestra el porcentaje de pacientes en los que se ha reducido el dolor, la actividad de la enfermedad evaluada por el paciente y por el médico en unidades de puntuación media con CTLA4Ig, L104EA29YIG o placebo. Las respuestas terapéuticas, monitorizadas mediante la escala de Likert, parecen ser dependientes de la dosis a favor de los grupos de tratamiento activo en comparación con el placebo el día 85. La escala de Likert es una escala validada de clasificación verbal que utiliza adjetivos para clasificar los síntomas (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740).

\newpage

En las figuras 6A y 6B se muestran las evaluaciones realizadas por el paciente y por el médico del cambio en la actividad de la enfermedad con respecto a la situación basal en al menos 2 unidades, resultante del tratamiento con CTLA4Ig, L104EA29YIg o placebo. Las respuestas parecen ser dependientes de la dosis con una mejora más marcada para las dosis superiores de los fármacos activos.

El porcentaje de reducción de los niveles de proteína C reactiva (PCR) en pacientes tratados con CTLA4Ig, L104EA29YIg o placebo se muestra en las figuras 7A y B. Las respuestas parecen depender de la dosis, con una clara disminución para los grupos de tratamiento activo con 2 y 10 mg/kg. Además, la figura 7B mostró que la diferencia es bastante significativa en comparación con placebo con el intervalo de confianza del 95%. La Figura 7C muestra los cambios en los cambios del nivel en suero con respecto a la situación basal el día 85.

En la figura 8 se muestra la cantidad de receptor soluble de IL-2 en suero en pacientes tratados con CTLA4Ig, L104EA29YIg o placebo. La reducción de los niveles de receptor soluble de IL-2 parece ser dependiente de la
dosis.

En la figura 22 se muestra la cantidad de ICAM-1 soluble y de E-selectina soluble en pacientes tratados con CTLA4Ig, L104EA29YIg o placebo. La reducción de los niveles de ICAM-1 soluble y de E-selectina soluble parece ser dependiente de la dosis.

En las figuras 9A y B se muestran la mediana y la media del recuento de articulaciones sensibles en pacientes tratados con CTLA4Ig o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción de las articulaciones sensibles) parece ser más importante en los grupos tratados con 2 y 10 mg/kg que en los grupos tratados con placebo o con 0,5 mg/kg.

En las figuras 10A y B se muestran la mediana y la media de los recuentos de articulaciones tumefactas en pacientes tratados con CTLA4Ig o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción de las articulaciones tumefactas) parece ser más importante en los grupos tratados con 2 y 10 mg/kg que en los grupos tratados con placebo o con 0,5 mg/kg.

En la figura 11 se muestran las puntuaciones medias de la evaluación del dolor en el tiempo en pacientes tratados con CTLA4Ig o placebo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción del dolor) parece ser más importante en los grupos tratados con 2 y 10 mg/kg que en los grupos tratados con placebo o con 0,5 mg/kg.

En las figuras 12A y B se muestran las puntuaciones medias de la evaluación de la actividad de la enfermedad evaluada por el paciente o por el médico en pacientes tratados con CTLA4Ig o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción en la actividad de la enfermedad) parece ser más importante en los grupos tratados con 2 y 10 mg/kg que en los grupos tratados con placebo o con 0,5 mg/kg.

En las figuras 13A y B se muestran la media y la mediana de los recuentos de articulaciones sensibles en pacientes tratados con L104EA29YIg (indicado como LEA en las figuras) o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción de las articulaciones sensibles) parece ser dependiente de la dosis.

En las figuras 14A y B se muestran la media y la mediana de los recuentos de articulaciones tumefactas en pacientes tratados con L104EA29YIg (indicado como LEA en las figuras) o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción de las articulaciones tumefactas) parece ser más importante en los grupos tratados con 2 y 10 mg/kg que en los grupos tratados con placebo o con 0,5 mg/kg.

En la figura 15 se muestran las puntuaciones medias de la evaluación del dolor en pacientes tratados con
L104EA29YIg (indicado como LEA en las figuras) o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción del dolor) parece ser dependiente de la dosis.

En las figuras 16A y B se muestran las puntuaciones medias de la evaluación de la actividad de la enfermedad evaluada por el paciente o por el médico en pacientes tratados con L104EA29YIg (indicado como LEA en las figuras) o placebo en el tiempo. El cambio con respecto a la situación basal (p. ej., reducción en la actividad de la enfermedad) parece ser dependiente de la dosis.

En la figura 17 se muestra el porcentaje de mejora de la discapacidad física evaluada mediante el HAQ el día 85 para pacientes tratados con CTLA4Ig, L104EA29YIg o placebo (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J. F., y col., 1982 J. of Rheumatology 9:789-793). Con este parámetro existe una calda mejora dependiente de la
dosis.

Los cambios con respecto a la situación basal de los niveles de IL-2r soluble y de proteína C reactiva eran dependiente de la dosis en ambos grupos de tratamiento. Tras el tratamiento, los nivele de IL-2r soluble fueron -2%, -10% y -22% para CTLA4Ig Y -4%, -18% y -32% para L104EA29YIg a 0,5, 2.0 y 10,0 mg/kg, respectivamente, en comparación con +3% para el placebo. Los niveles de proteína C reactiva fueron -12%, -15% y -32% para CTLA4Ig y +47%, -33% y -47% para L104EA29YIg a 0,5, 2.0 y 10,0 mg/kg, respectivamente, en comparación con +20% para el placebo (figura 7A).

No se observaron hallazgos clínicamente importantes con respecto a los análisis hematológicos de rutina, los análisis químicos de laboratorio con la excepción de ligeras supresiones de los niveles de IgA e IgG a las dosis más elevadas de ambos fármacos, ni hallazgos físicos no en las evaluaciones de las constantes vitales. Notablemente, ninguna de las medicaciones indujo anticuerpos específicos de fármaco.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Los ejemplos siguientes describen estudios clínicos de fase II de pacientes humanos a los que se administrará L104EA29YIg para reducir o prevenir el daño estructural, incluida la erosión ósea o articular usando escalas radiográficas validadas. Esta mejora en la reducción o prevención del daño estructural es paralela a la mejora clínica medida mediante los parámetros clínicos.

El estado de la estructura ósea se monitoriza en algunos de los pacientes humanos antes del tratamiento con CTLA4Ig o L104EA29YIg. A estos pacientes se administran entre 0,5 y 20 mg/kg de CTLA4Ig o L104EA29YIg crónicamente cada dos a doce semanas (solos o en combinación con otros agentes) para mantener su mejora terapéutica en el tiempo. Las radiografías de las manos y pies de los pacientes se toman a intervalos predefinidos: 6 meses y después anualmente, tal y como recomiendan las directrices de la FDA. Estos pacientes se monitorizan en una extensión a largo plazo tras 6 y 12 meses para determinar si el tratamiento con CTLA4Ig o L104EA29YIg reduce la progresión del deterioro ósea, y después anualmente. Los pacientes se monitorizan mediante procedimientos radiográficos de imagen, incluidos rayos X y/o resonancia magnética (RM), de acuerdo con la práctica estándar en la técnica (Larsen, A. K. y M. Eek 1977 Acta Radiol. Diag. 18:481-491; Sharp, J. T., y col., 1985 Arthritis and Rheumatism 28:1326-1335). Los resultados de los datos radiográficos se evalúan para la prevención del daño estructural, incluida la ralentización de la progresión de la erosión ósea y el daño al cartílago, con estrechamiento del espacio articular, y/o prevención de nuevas erosiones.

Claims

1. El uso de una molécula soluble de fusión de CTLA4, que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en la que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que terminan con ácido aspártico en la posición +124, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar un sujeto que tiene artritis reumatoide, en el que el sujeto ha presentado una respuesta insuficiente a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME).

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el FAME es metotrexato, ciclofosfonamida, azatioprina, ciclosporina A o un bloqueante o antagonista del factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha).

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para reducir un síntoma de artritis reumatoide.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que el síntoma se selecciona del grupo compuesto por tumefacción articular, sensibilidad articular, inflamación, rigidez matutina y dolor.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la composición farmacéutica es para administrar la molécula soluble de fusión de CTLA4 en una cantidad de 10 mg/kg de peso del sujeto.

6. Una molécula soluble de fusión de CTLA4 que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en la que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que terminan con ácido aspártico en la posición +124, para usar en un procedimiento de tratar a un sujeto que tiene artritis reumatoide, en el que el sujeto no ha respondido a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME).

7. El uso de una molécula soluble de fusión de CTLA4 que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en la que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que terminan con ácido aspártico en la posición +124, en la fabricación de una composición farmacéutica para reducir o prevenir el daño estructural en un sujeto que tiene artritis reumatoide.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que el daño estructural es erosión ósea o articular.

9. El uso de la reivindicación 7 u 8, en el que la composición farmacéutica es para administrar la molécula soluble de fusión de CTLA4 en una cantidad de entre 0,5 y 20 mg/kg de peso del sujeto.

10. Una molécula soluble de fusión de CTLA4 que comprende un dominio extracelular de una molécula de CTLA4, en la que el dominio extracelular de la molécula de CTLA4 comprende los aminoácidos que se muestran en la figura 19 que comienzan con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que terminan con ácido aspártico en la posición +124, para usar en un procedimiento de reducir o prevenir daño estructural en un sujeto que tiene una enfermedad reumática.

11. El uso de un primer agente y un segundo agente, en el que

b): el segundo agente se selecciona de un grupo compuesto por corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, prednisona, azatioprina, metotrexato, bloqueantes o antagonistas de TNF\alpha, hidroxicloroquina, sulfasalazina, sales de oro, anakinra, ciclofosfamida y leflunomida,

12. El uso de la reivindicación 11, en el que el bloqueante o antagonista del TNF\alpha es infliximab o etanercept.

13. El uso de la reivindicación 11 ó 12, en el que la composición farmacéutica es para la administración secuencial o concomitante del primero y el segundo agente.

14. El uso de la reivindicación 7 u 11, en el que la enfermedad reumática se selecciona de artritis reumatoide, polimiositis, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, reumatismo inflamatorio, reumatismo degenerativo, reumatismo extraarticular, enfermedades del colágeno, poliartritis crónica, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, panarteritis nodosa, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia sistémica progresiva, periartritis humeroescapular, artritis urática, condrocalcinosis, dermatomiositis, reumatismo muscular, miositis y miogelosis.

15. El uso de la reivindicación 7 u 11, en el que la enfermedad reumática es artritis reumatoide.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula soluble de fusión de CTLA4 comprende una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma.

17. El uso de la reivindicación 16, en el que la molécula soluble de fusión de CTLA4 es CTLA4Ig.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que la molécula soluble de fusión de CTLA4 es CTLA4Ig mostrada en la figura 20 que tiene la secuencia que comienza con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y termina con lisina en la posición +357.

19. El uso de la reivindicación 17, en el que la molécula soluble de fusión de CTLA4 es CTLA4Ig codificada por una molécula de ácido nucleico designada con el Nº ATCC 68629.

20. Un primer agente y un segundo agente, en el que

para usar en un procedimiento para tratar una enfermedad reumática.

21. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de un primer agente y un segundo agente, en la que

b): el segundo agente se selecciona de un grupo compuesto por corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, prednisona, azatioprina, metotrexato, bloqueantes o antagonistas de TNF\alpha, hidroxicloroquina, sulfasalazina, sales de oro, anakinra, ciclofosfamida y leflunomida.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, en la que el bloqueante o antagonista de TNF\alpha es infliximab o etanercept.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 21 ó 22, en la que la molécula soluble de fusión de CTLA4 comprende una región constante de inmunoglobulina o porción de la misma.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en la que la molécula soluble de fusión de CTLA4 es CTLA4Ig.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, en la que la molécula soluble de fusión de CTLA4 es CTLA4Ig mostrada en la figura 20 que tiene la secuencia que comienza con metionina en la posición +1 o con alanina en la posición -1 y que termina con lisina en la posición +357.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, en la que la molécula soluble de fusión de CTLA4 es CTLA4Ig codificada por una molécula de ácido nucleico designada con el Nº ATCC 68629.