ES2312171T3 - Procedimiento para la produccion de derivados de kex2 secretores. - Google Patents

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Abstract

SE DESCRIBEN DERIVADOS DE LA PROTEASA KEX2, OBTENIDOS MEDIANTE TRANSFORMACION DE MICROORGANISMOS ASIMILADORES DE METANOL, CON VECTORES DE EXPRESION, QUE CONTIENEN ADN QUE CODIFICA PARA CUALQUIER SECUENCIA AMINOACIDA QEU SEA LA SECUENCIA DE LA PROTEASA KEX2, EN DONDE EL EXTREMO N-TERMINAL ES LA MET EN POSICION 1 Y EL EXTREMO C-TERMINAL, ES UNO DE LOS AMINOACIDOS SITUADOS ENTRE LAS POSICIONES 618 (INCLUSIVE) Y 698 (INCLUSIVE), O UNA MODIFICACION DE DICHA SECUENCIA AMINOACIDA, CULTIVO DE LOS TRANSFORMANTES RESULTANTES Y RECUPERACION DE LOS DERIVADOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. ASIMISMO, SE DESCRIBEN SISTEMAS GENETICOS QUE CODIFICAN PARA DICHOS DERIVADOS Y UN METODO DE PRODUCCION DE LOS DERIVADOS DE LA PROTEASA KEX2, UTILIZANDO DICHOS SISTEMAS GENETICOS. TAMBIEN SE DESCRIBE UN METIDO DE ESCISION DE LOS PEPTIDOS DESEADOS, UTILIZANDO DICHOS DERIVADOS DE LA PROTEASA KEX2.

Description

Procedimiento para la producción de derivados de Kex2 secretores.
La presente invención se refiere a procesos mediante los cuales se pueden segregar al medio de cultivo grandes cantidades de derivados de Kex2 con actividad de proteasa Kex2.
Se han realizado muchos intentos para obtener métodos de producción de péptidos fisiológicamente activos mediante expresión quimérica de proteínas, y se han usado métodos de ruptura química o enzimática para la liberación de las proteínas deseadas. Los métodos químicos incluyen la ruptura del residuo de asparagina con ácido nitroso y la ruptura del residuo de metionina con CNBr (Itakura y col., Science 198, 1059, 1977). Sin embargo, estos métodos implican necesariamente la modificación de la proteína de interés, así como problemas de coste de purificación.
Los métodos enzimáticos emplean lisil endopeptidasa que ataca específicamente al enlace peptídico del extremo C de la lisina (proteasa I de Achromobacter) y proteasa V8 estafilococal que ataca específicamente al enlace peptídico del extremo C del ácido glutámico (Publicación de Patente Japonesa Examinada Nº 6-87788). Sin embargo, puesto que los métodos químicos y las endoproteasas reconocen un único residuo de aminoácido, una condición necesaria es que el residuo de aminoácido no esté presente en el péptido deseado a fin de permitir una escisión eficiente del péptido deseado de la proteína quimérica, y, por tanto, los péptidos que pueden producirse son limitados. Por lo tanto, se ha dedicado esfuerzo al desarrollo de un método de ruptura altamente universal que reconozca múltiples residuos de aminoácidos.
Las enzimas convertidoras de prohormonas son enzimas que producen hormonas péptido a partir de sus precursores in vivo, y se espera que presenten cualidades favorables como enzimas para la escisión de hormonas péptido a partir de proteínas, incluso in vitro. La proteasa Kex2 es una prohormona que convierte enzima derivada de Saccharomyces cerevisiae, y es una serina proteasa dependiente de calcio que ataca específicamente enlaces peptídicos de los extremos C de las secuencias Lys-Arg, Arg-Arg y Pro-Arg. La proteasa Kex2 es una proteína compuesta por 814 residuos de aminoácidos con una secuencia señal en el extremo N y una región transmembrana en el extremo C con una cuerda continua de aminoácidos hidrófobos, y está localizada en el Golgi trans de las células.
En el Listado de Secuencias se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica para proteasa Kex2 y la correspondiente secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 1. La expresión genética de un derivado de Kex2 que carece de región C-terminal en la Saccharomyces cerevisiae, y el posterior análisis de la misma, reveló que el derivado de Kex2 con la secuencia de aminoácidos 1 a 614 de la SEQ ID NO: 1 retiene la actividad de proteasa Kex2, y es segregada en medio de cultivo (Fuller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1434-1438, 1989, Publicación de Patente No examinada Japonesa Nº 1-199578). En la presente especificación, el derivado de proteasa Kex2 se representa mediante el número de aminoácidos contando a partir del aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el derivado de Kex2 con la secuencia de aminoácidos 1 a 614 de la SEQ ID NO: 1 se representa como Kex2-614.
Los derivados de Kex2 conocidos hasta el momento, cuyos métodos de producción secretora han sido estudiados, incluyen ss-Kex2 y Kex2\Deltap.
El ss-Kex2 es un derivado de Kex2 que tiene una péptido de 3 residuos de aminoácido añadido al Kex2-614, y su producción en Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada (Brenner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 922-926, 1992). Se expresó en un mutante deficiente en proteasa (pep4) como hospedante (en un medio de cultivo de 4 mg/L), y se purificó a partir del sobrenadante del cultivo con un rendimiento de purificación del 20%. La reducción de peso molecular de ss-Kex2 purificado tratado con enzima EndoH de hidrólisis de cadenas de azúcares de tipo Asn sugiere que incluye cadenas de azúcares de tipo Asn. También se han estudiado la dependencia del pH y la especificidad de sustrato de la actividad enzimática usando sustratos sintéticos.
El Kex2\Deltap es un derivado de Kex2 representado en esta especificación como Kex2-666, y los estudios sobre su producción en la línea celular hospedante de insecto Sf9 han demostrado que el 90% de su actividad es segregada al sobrenadante del cultivo, y que el peso molecular del Kex2\Deltap segregado es de 70 kDa, inferior al peso molecular intracelular de 120 kDa (Germain y col., Eur. J. Biochem. 204, 121-126, 1992). Además, puesto que la proteína de 70 kDa de peso molecular se encuentra en el sobrenadante del cultivo en el que se expresa Kex2, y la sustitución del residuo número 385 de Kex2\Deltap (la porción catalítica de la actividad de proteasa Kex2) por alanina da como resultado Kex2\Deltap en el sobrenadante del cultivo con un peso molecular de 120 kDa, igual al peso molecular intracelular, se cree que la proteína de 70 kDa es un autolisato de Kex2\Deltap deficiente en porción C-terminal (120 kDa) en el medio de cultivo.
También se ha intentado la expresión del derivado Kex2\Delta504 en el que la posición de ruptura de la secuencia Lys-Arg (aminoácidos 503-504 de la SEQ ID NO: 1), esperada del peso molecular del producto de descomposición y de la especificidad de sustrato de la proteasa Kex2, es sustituida por la secuencia Lys-Leu. Sin embargo, en este caso también se produce una proteína de 70 kDa en el medio de cultivo, y puesto que la secuencia Lys-Arg no siempre se atacada por Kex2\Deltap durante la autolisis, y no existe ninguna otra secuencia en la posición de reconocimiento de la proteasa Kex2, esto sugiere la posibilidad de que el Kex2\Delta504 reconozca una secuencia completamente diferente de la predicha a partir del sustrato sintético, y se ataca a sí misma.
Por tanto, a pesar de la investigación sobre la especificidad de sustrato de los derivados de Kex2 usando sustratos sintéticos, todavía no se conoce la especificidad de sustrato cuando se usan proteínas. Asimismo, se sabe poco de la cantidad segregada de los diferentes derivados de Kex2, y todavía se desconoce si es posible una producción secretora estable de derivados de Kex2 diferentes del Kex2-614.
El objetivo general del presente trabajo es proporcionar nuevas y útiles técnicas para suministrar una gran cantidad de enzimas con actividad de proteasa Kex2, con demostraciones de usos de dichas enzimas.
Específicamente, el uso de enzimas con actividad de proteasa Kex2 para la producción de péptidos útiles mediante expresión de proteínas quiméricas a escala industrial necesita que se tengan en cuenta particularmente uno o más de las siguientes cuestiones.
Una primera cuestión es el aumento de la cantidad de producción de los derivados de Kex2. La enzima que tiene actividad de proteasa Kex2 con el mayor rendimiento publicado hasta el momento es la ss-Kex2, y dicho rendimiento es de aproximadamente 4 mg por 1 L de medio de cultivo. Sin embargo, dicho rendimiento es bajo en términos de producción de enzima por escisión de los péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas a escala industrial. Además, puesto que se cree que los derivados de Kex2 secretores tales como el Kex2\Deltap posiblemente sufren una autolisis en el medio de cultivo y la zona de ruptura no puede predecirse, no se sabe cómo diseñar derivados para aumentar el rendimiento.
Consecuentemente, sería ventajoso encontrar derivados de Kex2 que no sufran autolisis para construir un sistema de alta expresión para dichos derivados de Kex2. En la presente especificación, autolisis se refiere a la descomposición que conlleva una reducción de la actividad de proteasa Kex2, y no se refiere a la maduración de la proteasa Kex2 que acompaña a la autoruptura de Lys-Arg (aminoácidos 108-109 de la SEQ ID NO: 1) (Brenner y Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 922-926, 1992).
Una segunda cuestión es establecer un proceso de purificación para derivados de Kex2 de alta pureza sin contaminación de otras proteasas. La actividad de los derivados de Kex2 publicada hasta el momento ha sido evaluada usando únicamente sustratos sintéticos y no sustratos proteicos, y por tanto no puede determinarse la presencia de contaminación por otras proteasas. En particular, es difícil lograr un control preciso de las condiciones de reacción cuando se escinden proteínas quiméricas a escala industrial, y puesto que la contaminación por otras proteasas puede reducir notablemente las tasas de recuperación de los péptidos objetivos, las enzimas con actividad de proteasa Kex2 deberían presentar, de forma deseable, un elevado grado de pureza.
Una tercera cuestión es fijar las condiciones para la ruptura de proteínas quiméricas por acción de enzimas con actividad de proteasa Kex2. Los especialistas en la técnica conocen que la estructura terciaria de las proteínas afecta a la actividad enzimática, a la estabilidad enzimática en las condiciones de reacción y al reconocimiento del sustrato. Sin embargo, casi ningún trabajo previo ha tratado estos puntos. En particular, puesto que las proteínas quiméricas a menudo forman cuerpos de inclusión insolubles en los métodos de expresión de proteínas quiméricas, se usan agentes desnaturalizantes tales como urea para su solubilización. Sin embargo, generalmente se desconoce qué estructura de la enzima puede retener la actividad enzimática en presencia de urea. En consecuencia, no está claro si la proteasa Kex2 y los derivados de Kex2 secretores pueden ser usados como enzimas para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas.
La producción masiva de otra prohormona que convierta enzimas tampoco ha tenido éxito, y también se desconoce si dichas enzimas pueden usarse como enzimas para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas in vitro. En consecuencia, a fin de usar enzimas convertidoras de prohormonas, incluyendo la proteasa Kex2, como enzimas para liberar los péptidos deseados a partir de sus proteínas quiméricas, es importante establecer métodos más eficaces de expresión y purificación, y fijar las condiciones de ruptura para usar proteínas como sustratos
in vitro.
Como resultado de la investigación llevada a cabo teniendo en mente estas cuestiones, los presentes inventores han descubierto que los derivados de Kex2 que tienen secuencias de aminoácidos desde la posición 1 en el extremo N hasta un aminoácido en la posición entre la 618 y la 698, tienen una producción secretora notablemente mayor sin sufrir autolisis en el cultivo, y que la producción puede aumentar aún más usando levadura metilotrófica como células hospedantes. Esto puede usarse para el suministro masivo de derivados de Kex2. Adicionalmente, los inventores purificaron los derivados de Kex2 secretores a partir de concentrados de sobrenadante de cultivo hasta obtener bandas sencillas en SDS-PAGE mediante 2 etapas de cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía hidrofóbica, y han confirmado que, en las condiciones en las que se escinden los péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas, los derivados de Kex2 purificados no contienen ninguna otra actividad de proteasa que descomponga los péptidos y reduzca la tasa de recuperación.
Además, se descubrió que en las condiciones en las que se escinden los péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas, la especificidad de sustrato de los derivados de Kex2 secretores se ve alterada por un cambio en la concentración de urea, y se ha demostrado que se puede escindir un péptido deseado a partir de una proteína quimérica con una eficacia del 75%, incluso cuando el péptido deseado incluye 2 posiciones de reconocimiento para proteasa Kex2. También se demostró que el Kex2-660 puede usarse para escindir hPTH (1-34) a partir de la proteína quimérica \betaGal-117S4HPPH34 en una escala semi-industrial, es decir, que el derivado de Kex2 secretor, el rendimiento, la pureza y la eficacia de escisión del péptido deseado a partir de la proteína quimérica, pueden ser adecuados para la producción a escala industrial.
La presente invención proporciona un proceso para la producción de una proteína con actividad enzimática de proteasa Kex2, que comprende las etapas de:
cultivar células de levadura metilotrófica transformadas con vector de expresión de levadura que comprende un ADN que codifica para proteína que tiene
(A) una secuencia de aminoácidos acortada cuyo extremo N es Met en la posición de aminoácido 1 y cuyo extremo C es una aminoácido entre el aminoácido 630 (incluido) y el aminoácido 682 (incluido) de la SEQ ID NO: 1, o
(B) una secuencia de aminoácido acortada cuyo extremo N es Met en la posición de aminoácido 1 y cuyo extremo C es un aminoácido entre el aminoácido 630 (incluido) y el aminoácido 682 (incluido) de la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 es modificada por sustitución, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos en una región de dicha secuencia de aminoácidos acortada a partir del aminoácido 630 (incluido) hasta el extremo C; y
recuperar del cultivo la proteína con actividad enzimática de proteasa Kex2.
La proteína se recupera preferiblemente del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía hidrofóbica.
La proteína puede usarse para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas. Una proteína quimérica es una proteína obtenida añadiendo un péptido protector a un péptido deseado, y el péptido deseado puede ser escindido por la anteriormente mencionada proteína de tal modo que el enlace entre el péptido deseado y el péptido protector es una secuencia de aminoácidos reconocida por la anteriormente mencionada proteína. Asimismo, incluso si la unión entre el péptido deseado y un péptido protector no es una secuencia de aminoácidos reconocida por la anteriormente mencionada proteína, se puede insertar una posición de reconocimiento de la anteriormente mencionada proteína entre el péptido deseado y el péptido protector para permitir que el péptido deseado se escinda usando la anteriormente mencionada proteína.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra las secuencias de un oligómero sintético usado para la construcción de un gen hProPHT (1-84) sintético.
La Figura 2 muestra un proceso para construir el gen hProPTH (1-84) sintético.
La Figura 3 muestra un proceso para construir plásmido pG210S (S/X). Plac representa el promotor operón de lactosa de E. coli y Ttrp representa el terminador atenuador TrpE de E. coli.
La Figura 4 muestra un proceso para construir plásmido pGP nº 19 que expresa la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84.
La Figura 5 muestra un proceso para construir plásmido pPTH(1-34)pro\alpha.
La Figura 6 muestra un proceso para construir plásmido ptacCATPTH(1-34) que expresa la proteína quimérica CATPH34. Ptac representa un promotor sintético de la región -35 del promotor trp y de la región -10 de Plac.
La Figura 7 es una fotografía de SDS-PAGE para una muestra de la proteína quimérica CATPH34 expresada por E. coli, antes y después de la purificación.
La Figura 8 muestra un proceso para construir plásmido pGP nº 19 PPH34 que expresa la proteína quimérica \betaGal-139SPPH34.
La Figura 9 muestra las primeras etapas de un proceso para construir plásmido pG117S4HPPH34 que expresa la proteína quimérica \betaGal-117S4HPPH34.
La Figura 10 muestra las últimas etapas del proceso para construir plásmido pG117S4HPPH34 que expresa la proteína quimérica \betaGal-117S4HPPH34.
La Figura 11 muestra la estructura del gen KEX2 y de las secuencias de los cebadores sintetizados para la construcción de genes de derivados de Kex2 secretores, y sus respectivas posiciones de maduración.
La Figura 12 muestra un proceso para construir plásmido pYE-660 que expresa un derivado de Kex2 secretor. PKEX2 representa un promotor para el gen KEX2 de Saccharomyces cerevisiae.
La Figura 13 muestra un proceso para construir plásmido pYE-614 que expresa Kex2-614.
La Figura 14 es un gráfico que compara actividad Kex2 mediante OD660 de los derivados de Kex2 secretores usando un sustrato sintético. Se muestran las actividades relativas de los cultivos de derivado de Kex2 secretor que produce cepas tomando la actividad de K16-57C[pYE-614] como 1.
La Figura 15 es una fotografía de una electroforesis que proporciona una comparación de rendimientos por 200 \muL de sobrenadante de cultivo de derivados de Kex2 secretores.
La Figura 16 es un gráfico que muestra las actividades de Kex2-660 a diferentes concentraciones de urea, usando el sustrato sintético Boc-Leu-Arg-Arg-MCA. Se proporcionan las actividades relativas para cada concentración de urea tomando la actividad de Kex2-660 en ausencia de urea como 100%.
La Figura 17 es un gráfico que compara las tasas de recuperación de \betaGal(1-14), hPTH(1-84), hPTH(1-44) y [hPTH(1-84) + hPTH(1-44)] a partir de \betaGal-139S(FM)PPH84, a diferentes concentraciones de urea (1,5-3,0 M).
La Figura 18 es un gráfico que compara las tasas de recuperación de \betaGal(1-14), hPTH(1-84), hPTH(1-44) y [hPTH(1-84) + hPTH(1-44)] a partir de \betaGal-139S(FM)PPH84, a diferentes concentraciones de urea (3,0-4,0 M).
La Figura 19 muestra un perfil de elución de HPLC para antes y después del procesado con Kex2-660 de la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84 y una representación esquemática de la relación entre fragmentos de péptido identificados y \betaGal-139S(FM)PPH84. Los números de los picos del perfil corresponden a los números de los fragmentos. Los fragmentos 1, 2, 3 y 4 fueron identificados determinando las secuencias de aminoácidos. El fragmento 7 fue estimado en base al tiempo de elución, y el fragmento 5 fue estimado mediante correlación entre \betaGal(1-14) y hPTH(1-84). El fragmento 6 fue designado así para fragmentos que pueden ser eluídos.
La Figura 20 es un gráfico que compara las tasas de recuperación de hPTH(1-84), hPTH(1-44) y hPTH(45-84) a partir de \betaGal-139S(FM)PPH84, a diferentes concentraciones de enzima. Los cuadrados rellenos, los círculos huecos, los círculos rellenos y los triángulos rellenos representan, respectivamente, las tasas de recuperación correspondientes a \betaGal-139S(FM)PPH84, hPTH(1-84), hPTH(1-44) y hPTH(45-84). Las tasas de recuperación se calcularon del siguiente modo. Para hPTH(1-84) y para \betaGal-139S(FM)PPH84, se usó la relación de área de pico frente a una concentración conocida de una sustancia patrón correspondiente, y para hPTH(1-44) y hPTH(45-84) se usó la relación de área de pico frente a una concentración conocida de hPTH(1-84), y se realizó una compensación en base al número de residuos de aminoácido de los correspondientes péptidos.
La Figura 21 muestra un perfil de elución de HPLC correspondiente a antes y después del procesado de Kex2-660 de la proteína quimérica CATPH34.
La Figura 22 muestra un proceso para construir plásmido pCU660 que expresa Kex2-660.
La Figura 23 es una fotografía de SDS-PAGE que muestra la secreción de Kex2-660 en sobrenadantes de cultivo para diferentes tiempos de cultivo de TK62/pCU660 nº 10.
La Figura 24 muestra un proceso para construir plásmido pG210ShCT[G].
La Figura 25 es un gráfico que compara el rendimiento de cada derivado de Kex2 secretor por OD660 de cultivo en base a las actividades de Kex2 usando un sustrato sintético. Se muestran los rendimientos de cada uno de los derivados de Kex2 secretores junto con el rendimiento de K16-57C[pYE22-614] como 1.
La Figura 26 es una fotografía de SDS-PAGE que proporciona una comparación de rendimientos por 200 \muL de sobrenadante de cultivo de los derivados de Kex2 secretores. Las bandas 1 y 12 se desarrollan a partir de marcadores de peso molecular, y las bandas 2 a 11 proceden de concentrados de sobrenadantes de cultivo de K16-57C[pYE-22m], K16-57C[pYE22-614], K16-57C[pYE22-630], K16-57C[pYE22-640], K16-57C[pYE22-650], K16-57C[pYE22-660], K16-57C[pYE22-679], K16-57C[pYE22-682], K16-57C[pYE22-688] y K16-57C[pYE22-699]. En esta representación del electroferograma, los números a la izquierda de la banda 1 indican el tamaño (kDa) de los marcadores de peso molecular.
La Figura 27 muestra un proceso para la construcción de plásmido de expresión pHIL-660 de Kex2-660 para un hospedante de Pichia pastoris.
Descripción detallada
Como se explica en la presente memoria, las proteínas de acuerdo con la presente invención difieren considerablemente en términos de producción y de eficacia de secreción dependiendo de la longitud de la proteína y particularmente de la posición del extremo C. Encontramos que éstas son proteínas de longitudes que pueden proporcionar una elevada producción y eficacia de secreción; los derivados de Kex2 tienen secuencias de aminoácidos desde Met en el aminoácido 1 hasta cualquiera de los aminoácidos de las posiciones 618 a 698 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1. El extremo C de un derivado de proteasa Kex2 de la presente invención es uno cualquiera de los aminoácidos desde la posición 630 a la posición 682 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente es uno cualquiera de los aminoácidos desde la posición 630 a la posición 679. Las secuencias de aminoácidos mencionadas, compuestas por porciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, a veces se denominan secuencias de aminoácidos naturales para el propósito de la presente invención.
Sin embargo, es bien conocido por los especialistas en la técnica que la actividad enzimática puede mantenerse incluso con sustituciones de múltiples aminoácidos por otros aminoácidos, eliminación de aminoácidos o adición de aminoácidos en regiones de secuencias de aminoácidos de una proteína enzimática diferentes a las regiones que participan en su actividad. Por lo tanto, la presente invención también abarca, además de la producción de derivados de proteasa Kex2 que tienen las anteriores secuencias de aminoácidos naturales, también la producción de proteínas con actividad de proteasa Kex2 que tienen secuencias de aminoácidos que son las anteriores secuencias de aminoácidos naturales modificadas mediante una sustitución, eliminación o adición de uno o más aminoácidos de acuerdo con la parte (B) de la reivindicación 1, normalmente modificaciones que engloban la sustitución, eliminación o adición de entre 1 y 5 ó 10 ó 15 ó 20 ó 30 aminoácidos, siempre sometido a que haya actividad.
Se puede preparar ADN que codifica para los anteriores polipéptidos de acuerdo con un método convencional, por ejemplo a partir de ADN de longitud completa que tenga una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1, u otra secuencia de nucleótidos que codifica para la misma secuencia de aminoácidos, o mediante la ruptura de un ADN que contiene el ADN objetivo, y uniendo el producto de ruptura a un oligonucleótido si se desea, o introduciendo un codón de finalización de la traducción en una localización adecuada del ADN. Alternativamente, se puede preparar ADN que codifica para una de las anteriores secuencias de aminoácidos modificadas empleando un método convencional tal como la mutagénesis dirigida a sitio o la reacción en cadena de polimerasa (PCR), usando como molde el ADN natural de longitud completa que tiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 o por un fragmento de la misma, y usando un oligonucleótido cebador que contiene una mutación deseada como cebador mutagénico.
Un vector de expresión correspondiente contiene una región de regulación de la expresión tal como un promotor que es funcional en el hospedante usado. Por ejemplo, cuando se usan células de levadura como hospedante, se puede usar promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, promotor de glicerofosfato quinasa, promotor de ácido fosfatasa, promotor de alcohol oxidasa, promotor de formato deshidrogenasa, promotor de metanol oxidasa, u otros similares.
Las células hospedantes usadas de acuerdo con la invención son células de levadura de levadura metilotrófica, tales como las de los géneros Candida y Pichia, tales como Candida beidinii y Pichia pastoris.
A fin de proveer a enzimas con actividad de proteasa Kex2 utilizables como enzimas para escisión de péptidos a partir de proteínas quiméricas a escala industrial, los presentes inventores determinaron que era necesario solucionar los problemas de 1) proporcionar elevados rendimientos para un suministro a gran escala, 2) elevada pureza, sin contaminación con otras proteasas que rompan el péptido deseado y 3) establecer las condiciones para la ruptura de la proteína sustrajo, y a este fin los inventores llevaron a cabo la siguiente investigación.
En primer lugar, estudiamos las condiciones para aumentar el rendimiento de enzimas con actividad de proteasa Kex2 para afrontar el primer objetivo. Para la purificación a escala industrial de una gran cantidad de enzimas con actividad de proteasa Kex2, no sólo debe ser alto el rendimiento, sino que la purificación del mismo también debe ser sencilla, y para este propósito los inventores consideraron ventajoso secretar los derivados de Kex2 en medio de cultivo que contiene otras proteínas en pequeña cantidad. El derivado de Kex2 secretor ssKex2 ha sido mencionado anteriormente, pero su rendimiento es de 4 mg/L de medio de cultivo, que es demasiado pequeño para su uso a escala industrial. Por tanto, se prepararon genes que codifican para diferentes derivados de Kex2 secretores y se expresaron en hospedantes de Saccharomyces cerevisiae para examinar los rendimientos de secreción.
Los derivados de Kex2 usados son Kex2-614, Kex2-630, Kex2-640, Kex2-650, Kex2-660, Kex2-679, Kex2-682, Kex2-688 y Kex2-699. Para la expresión de genes de derivado de Kex2, se usó el gen promotor gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) de Saccharomyces cerevisiae. Los plásmidos que contienen estas unidades de expresión fueron introducidos en Saccharomyces cerevisiae, que a continuación se cultivó durante una noche a 30ºC, y se midieron las actividades de proteasa Kex2 en los cultivos usando el sustrato sintético Boc-Leu-Arg-Arg-MCA como sustrato.
Como resultado, se detectó actividad de proteasa Kex2 en los sobrenadantes de cultivo de la levadura en la que se habían introducido unidades de expresión de genes para Kex2-614, Kex2-630, Kex2-640, Kex2-650, Kex2-660, Kex2-679, Kex2-682 ó Kex2-688, pero no se detectó actividad en el sobrenadante de cultivo de la levadura en la que se había introducido la unidad de expresión del gen Kex2-699. Esto demostró que la secreción de derivados de Kex2 en sobrenadantes de cultivo puede lograrse usando genes derivados que incluyen residuos de aminoácidos desde la posición 1 a la posición m (m = 614 a 688) desde el extremo N.
Además, se descubrió en el Ejemplo 1 que los rendimientos de secreción por OD660 eran significativamente mayores para Kex2-660 y Kex2-679 que para lo publicado hasta el momento para Kex2-614. Asimismo, los resultados de los análisis de SDS-PAGE de muestras preparadas hasta una concentración de 1 a 20 mediante membrana de ultrafiltración de fracción de peso molecular 10.000 de los sobrenadantes de cultivo, demostraron que no sólo la actividad de Kex2 sino también la cantidad de secreción de Kex2-660 y Kex2-679 fueron mayores que la de Kex2-614. Se demostró que los pesos moleculares aumentaron con mayores números de residuos de aminoácidos, es decir, no se acumuló autolisis en este cultivo como ocurrió con el Kex2\Deltap en la línea celular hospedante de insecto Sf9.
Además, en el Ejemplo 9 se mostró que las actividades de Kex2 OD660 de los cultivos de Kex2-630, Kex2-640, Kex2-650, Kex2-660 y Kex2-679 fueron al menos 10 veces superiores a las del hasta ahora publicado Kex2-614, y las actividades de Kex2 del Kex2-682 y del Kex2-688 fueron 6 veces y 3,4 veces superiores, respectivamente, a las del Kex2-614, mientras que la actividad de Kex2 del Kex2-699 fue indetectable.
En otras palabras, se demostró que la actividad de Kex2 del cultivo aumenta cuando los residuos de aminoácido del extremo C del derivado de Kex2 expresado son hasta el residuo 630-679 de Kex2, mientras que la actividad disminuye según la región C-terminal se extiende más allá de dicha longitud.
Asimismo, los resultados del análisis de SDS-PAGE confirmaron que la cantidad de secreción de Kex2 había aumentado. También se demostró que los pesos moleculares aumentan con más residuos de aminoácido de los derivados de Kex2, y por tanto no se acumulan autolisatos en dicho cultivo como ocurría con la producción de Kex2\Deltap en la línea celular hospedante de insecto Sf9.
Puesto que se descubrió que los derivados de Kex2 secretores preparados en la presente memoria se acumulan en los sobrenadantes del cultivo sin sufrir autolisis, se llevó a cabo el ensayo de producción de Kex2-660 cambiando el sistema de expresión del sistema de Saccharomyces cerevisiae a, por ejemplo, un sistema de expresión con la levadura metilotrófica Candida boidinii como hospedante, que presenta un rendimiento de producción por cultivo. Como resultado, fue posible incrementar el rendimiento hasta 340 mg por 1 L de sobrenadante de cultivo. Esta es la cantidad capaz de liberar aproximadamente 200 g del péptido hPTH(1-34) fisiológicamente activo a partir de una proteína quimérica, y por tanto se demostró que la presente invención es capaz de suministrar una cantidad de enzima necesaria para la escisión de péptidos útiles a partir de proteínas quiméricas a escala industrial. Adicionalmente, se descubrió que la levadura del género Candida es especialmente preferible como hospedante.
El segundo problema que era necesario abordar fue la pureza de los derivados de Kex2 secretores. En primer lugar, el Kex2-660 que tenía el mayor rendimiento de secreción se purificó a partir de sobrenadante de cultivo. El Kex2-660 secretado extracelularmente por Saccharomyces cerevisiae fue purificado hasta una única banda (rendimiento del 57%) concentrando el sobrenadante del cultivo mediante ultrafiltración (peso molecular 30.000) en presencia de calcio 0,2 mM, y sometiéndolo a cromatografía de intercambio aniónico y a cromatografía hidrofóbica. Esta tasa de recuperación es la mayor publicada hasta el momento, lo que demuestra que este método permite suministrar en grandes cantidades derivados de Kex2 de elevada pureza.
Además, con el objetivo de determinar la especificidad de sustrato de los derivados de Kex2 usando sustratos de proteína, así como la posibilidad de contaminación con otras proteasas, se permitió que actuara un exceso de Kex2-660 purificado sobre la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84, y se determinaron las estructuras de los péptidos resultantes. La \betaGal-139S(FM)PPH84 es una proteína quimérica preparada mediante la unión de hPTH(1-84) a través de la secuencia Phe-Met y una prosecuencia derivada de hormona paratiroidea humana (Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg) para \betaGal-139S, que es un polipéptido desde el extremo N hasta el residuo de aminoácido 139 de \beta-galactosidasa de E. coli que ha sido sustituido con residuos de serina en sus residuos de cisteína 76 y 122. La secuencia de aminoácido de \betaGal-139S está representada como SEQ ID NO: 2, y la secuencia de aminoácidos de hPTH(1-84) está representada como SEQ ID NO: 3.
Como resultado, se descubrió que la secuencia del extremo N del péptido resultante deriva del fragmento peptídico esperado de la especificidad de sustrato de proteasa Kex2, y que el Kex2-660 purificado no tenía contaminación por otras proteasas que pudieran interferir con la escisión del péptido deseado a partir de la proteína quimérica.
Se usó el Kex2-660 purificado para investigar las condiciones de ruptura cuando se usa una proteína como sustrato, a fin de abordar el tercer objetivo.
En primer lugar, estudiamos el efecto de la urea, que se usa normalmente para liberar péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas. Se dejó que el Kex2-660 actuara sobre el sustrato sintético Boc-Leu-Arg-Arg-MCA en presencia de urea de 0 a 4,0 M, y se descubrió que en concentraciones de 1,0 M, 2,0 M y 4,0 M las actividades se redujeron al 70%, 40% y 10%, respectivamente, en comparación con el experimento en ausencia de urea. Cuando se disuelven cuerpos de inclusión insolubles en una disolución de urea y la proteasa actúa sobre ellos, la concentración de la disolución de urea generalmente va de 2,0 a 4,0 M. Así, se concluyó que el Kex2-660 puede usarse para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas, si se determinan aproximadamente las condiciones de disolución de las proteínas quiméricas.
A continuación, se investigó el efecto de urea 1,5 a 3,0 M actuando sobre Kex2-660 en la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84. Las secuencias predichas para la ruptura por medio de la proteasa Kex2 se encuentran en las 4 posiciones de Arg-Arg (aminoácidos 13-14 de la SEQ ID NO: 2, denominada a partir de aquí sitio de ruptura A), Lys-Arg (porción de prosecuencia, denominada a partir de aquí sitio de ruptura B) y Pro-Arg (aminoácidos 43-44 y 51-52 de la SEQ ID NO: 3, denominados a partir de aquí sitios de ruptura C y D, respectivamente). Los extremos C-terminales de cada uno de los sitios son atacados por la proteasa.
Como resultado de la investigación de las estructuras y de la cantidad de fragmentos de péptido producidos por el procesado con proteasa Kex2, se descubrió que las mayores concentraciones de urea, en el rango de 1,5 a 2,5 M, proporcionaron una mayor eficacia de ruptura por Kex2-660, mientras que no se observó diferencia en la eficacia de ruptura con concentraciones de urea de 2,5 M y de 3,0 M. Adicionalmente, con respecto al efecto de la urea sobre la especificidad de sustrato, se descubrió que la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura B mejoró al aumentar la concentración de urea, pero la eficacia de ruptura del sitio de ruptura C alcanzó un máximo a una concentración de urea de 2,5 M, y por tanto concentraciones mayores de urea dieron lugar a mejores rendimientos de hPTH(1-84) a partir de proteínas quiméricas. Asimismo, no se observó ruptura en el sitio de ruptura D. La misma tendencia se observó incluso en concentraciones de urea de 3,0 a 4,0 M. Estos descubrimientos eran impredecibles a partir del uso de sustratos sintéticos, y se han alcanzado por primera vez mediante la presente invención.
Los inventores estudiaron entonces las condiciones para la escisión de hPTH(1-84) a partir de \betaGal-139S(FM)PPH84 usando Kex2-660. Se usó Kex2-660 en diferentes proporciones (25 kU, 50 kU, 100 kU, 150 kU y 200 kU de Kex2-660 a 1 mg de proteína quimérica) en las condiciones en las que hPTH(1-84) se escinde de las proteínas quiméricas, y se examinaron las estructuras de los fragmentos de péptido resultantes y sus rendimientos. Cuando se usó 50 kU/mL de Kex2-660, se escindió hPTH(1-84) con una eficacia de aproximadamente 75%. En este caso quedó aproximadamente el 10% de \betaGal-139S(FM)PPH84.
La \betaGal-139S(FM)PPH84 disminuyó al aumentar la cantidad de Kex2-660, y desapareció casi completamente a 200 kU/mL. Sin embargo, también se descubrió que la proporción de hPTH(1-44) y hPTH(45-84) también aumentó simultáneamente, mientras que la eficacia de hPTH(1-84) no sufrió ningún incremento (Figura 20). Por otro lado, no se observó ninguna disminución de la cantidad de hPTH(1-84) más allá del aumento de hPTH(1-44) incluso con un aumento de la cantidad de Kex2-660, y por tanto se confirmó que el Kex2-660 purificado del Ejemplo 2 descrito más adelante no tenía contaminación por otras proteasas con diferentes especificidades de sustrato que la proteasa Kex2 en las condiciones en las que se escinde hPTH(1-84) a partir de proteínas quiméricas.
Además, se demostró que la selección de las condiciones de reacción permite que los péptidos deseados se escindan eficazmente (con una eficacia de escisión del 75%) a partir de las proteínas quiméricas incluso cuando el péptido deseado incluye un sitio de ruptura para la proteasa Kex2. Esta eficacia de escisión es superior a la eficacia de escisión del 50% para hPTH(1-84) obtenida usando factor-Xa (Gardella y col., J. Biol. Chem. 265, 26, 15854, 15859, 1990).
Gardella y col. sugirieron la posibilidad de que las proteasas contaminantes o el propio factor-Xa degradan hPTH(1-84), a juzgar por las menores tasas de recuperación de hPTH(1-84) cuando la cantidad de enzima aumenta o cuando se extiende el tiempo de reacción, a pesar del hecho de que hPTH(1-84) no incluye la posición de reconocimiento de factor-Xa, es decir la secuencia Ile-Glu-Gly-Arg. El hecho de que hPTH(1-84) se obtiene con una elevada tasa de recuperación a pesar del hecho de que hPTH(1-84) incluye 2 secuencias de sitio de ruptura para proteasa Kex2, sugiere que los derivados de Kex2 purificados con mejores rendimientos son útiles como enzimas para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas.
Además, se descubrió que el Kex2-660 puede escindir hPTH(1-34) a partir de la proteína quimérica soluble CATPH34 en ausencia de urea y a partir de la proteína quimérica insoluble \betaGal-117S4HPPH34 en presencia de urea, y por tanto funciona incluso cuando los sustratos son proteínas quiméricas con diferentes péptidos protectores y diferentes regiones de sitio de ruptura, lo que demuestra que tiene una amplia aplicación industrial. Además, no se detectó contaminación de proteasa incluso en ausencia de urea.
En otras palabras, se descubrió que los derivados de Kex2 secretores con rendimientos mejorados que son purificados hasta una única banda degradan péptidos deseados en condiciones en las que los péptidos deseados son liberados a partir de proteínas quiméricas, independientemente de la presencia o ausencia de urea, y no tienen contaminación de otras proteasas que disminuyan las tasas de recuperación, que la selección de las condiciones permite que estos derivados de Kex2 recuperen los péptidos deseados muy eficazmente incluso cuando los péptidos deseados incluyen sitios de reconocimiento para proteasas Kex2, y que la cantidad de expresión por 1 L de medio de cultivo es suficiente para liberar aproximadamente 200 g de los péptidos deseados y, por tanto, los derivados de Kex2 secretores obtenidos de acuerdo con la invención se suministran en cantidad necesaria para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas a escala industrial.
Ejemplos
La presente invención se explicará a continuación con más detalle por medio de los siguientes Ejemplos de Referencia y Ejemplos que, sin embargo, no pretenden restringir la invención. En primer lugar se describirán los plásmidos, E. coli y levadura usados como materiales y los procedimientos experimentales empleados para todos los ejemplos, y a continuación se presentarán los Ejemplos de Referencia y los Ejemplos.
Plásmidos
El plásmido pG97S4DhCT[G] es un plásmido que es capaz de expresar una proteína quimérica en la que hCT[G] (un péptido que resulta de la adición de un residuo de glicina al extremo C del aminoácido 32 de la calcitonina humana) se ha ligado a un péptido que comprende la región entre el extremo N y el aminoácido 97 de la \beta-galactosidasa (en donde el residuo 76 de cisteína es sustituido por un residuo de serina, y los residuos de ácido glutámico 40, 41, 71 y 75 son sustituidos por residuos de ácido aspártico: denominado \betaGal-97S4D) a través de un residuo de ácido glutámico, bajo el promotor de operón de lactosa de E. coli.
Introduciendo una región de ADN que codifica para el péptido deseado en marca de lectura como un fragmento de ADN EcoRI-SalI, es posible expresar una proteína quimérica con \betaGal-97S4D. La cepa de E. coli W3110 que contiene dicho plásmido se denominó Escherichia coli SBM323, y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology el 8 de agosto de 1991 como FERM BP-3503.
El plásmido ptacCAT es un plásmido que es capaz de expresar el gen de cloranfenicol acetiltransferasa bajo el promotor sintético tac. La cepa de E. coli JM109 que contiene este plásmido se denominó Escherichia coli SBM336, y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology el 1 de Marzo de 1996 como FERM BP-5436. Se usaron pG97S4DhCT[G] y ptacCAT como materiales para construir el vector que expresa proteína quimérica hPTH(1-34) ptacCATPTH(1-34) (Ejemplo de Referencia 2 y Figuras 5 y 6).
El plásmido pG210ShCT[G] es un plásmido en el que el gen que codifica para \betaGal-97S4D a partir de
pG97S4DhCT[G] se sustituye por el gen que codifica para \betaGal-210S (un péptido que va desde el extremo N hasta el aminoácido 210 de la \beta-galactosidasa, en donde los residuos de cisteína 76, 122 y 154 son sustituidos por residuos de serina).
El plásmido PG210ShCT[G] puede obtenerse uniendo un fragmento de ADN que contiene el gen que codifica para \betaGal-210S obtenido mediante digestión de pGH\alpha210(Ser)rop con las enzimas de restricción PvuII y EcoRI, y un fragmento de ADN que contiene una porción de vector obtenida mediante digestión de pG97S4DhCT[G] con enzimas de restricción PvuII y EcoRI (Figura 24). En la Publicación de Patente Examinada Japonesa Nº 6-87788 se describe un método para construir pGH\alpha210(Ser)rop. Se usó pG210ShCT[G] como material para la clonación de un gen de precursor de hormona paratifoidea humana (hProPTH(1-84)) y para la construcción de plásmido pGO nº 19 (Ejemplo de Referencia 1 y Figura 5).
El plásmido pCRII se adquirió a Invitrogen Co. y se usó para la clonación directa de los productos de PCR.
El plásmido pYE-22m es un vector de expresión que utiliza el promotor y el terminador correspondientes al gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) y tiene un sitio de multiclonación (MCS: EcoRI-SalI), con el promotor en el extremo EcoRI, el gen TRP1 como marcador selectivo, y una porción de 2 \mum de ADN (repeticiones invertidas) en el origen de replicación. La cepa JM109 de E. coli que contiene el plásmido pYE-22m se denominó Escherichia coli SBM335, y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology el 1 de marzo de 1996 como FERM BP-5435 (Figura 12).
El plásmido pYE-KEX2 (5,0)b (Mizuno y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254, 1988) se usó como plantilla para construir genes de derivado de Kex2 mediante PCR (Figura 12). El plásmido pYE-KEX2 (RI-PvuII) (Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº 1-199578) se usó para construir el vector de expresión pYE-614 correspondiente a una proteína que comprende un péptido de 14 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) en el extremo C del Kex2-614 (Figura 13).
El plásmido pNOTelI es un vector de expresión que utiliza el promotor y el terminador correspondientes al gen de alcohol oxidasa y que incluye un sitio de enzima de restricción NotI, con el gen URA3 como marcador selectivo (Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº 5-344895).
E. coli y levadura
Se adquirió la línea celular competente JM109 de E. coli a Toyobo y se usó para la preparación de plásmido y para la expresión de proteína quimérica. Se usaron JM101 y M25 de E. coli (Sugimura y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 753-759, 1988) para la producción de las proteínas quiméricas CATPH34 y \betaGal-117S4HPPH34, respectivamente. Los hospedantes usados para la expresión secretora de las proteasas Kex2 fueron Saccharomyces cerevisiae K16-57C (MAT \alpha leu2 trpl ura3 kex2-8: Mizuno y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254, 1988) y Candida boidinii TK62.
TK62 es una línea celular que requiere uracilo obtenida mediante mutación de URA3 a partir de Candida boidinii S2AOU-1 (Sakai, Y. y col., J. Bacteriol., 173, 7458-7463, 1991). Esta cepa de Candida boidinii S2AOU-1 se denominó Candida Boidinii SAM1958, y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology el 25 de febrero de 1992 como FERM BP-3766.
Medios de cultivo
Para el cultivo de E. coli se usó un medio LB (extracto de levadura 0,5% (p/v), triptona 1% (p/v), NaCl 0,5% (p/v)), medio SB (extracto de levadura 1,2% (p/v), tristona 2,4% (p/v), glicerol 0,5% (v/v)), medio SB2 (extracto de levadura 2% (p/v), triptona 1% (p/v), glicerol 0,5% (v/v), K_{2}HPO_{4} 0,3% (p/v)), y medio NU (extracto de levadura 0,3% (p/v), glucosa 1,5% (p/v), KH_{2}PO_{4} 0,3% (p/v), K_{2}HPO_{4} 0,3% (p/v), Na_{2}HPO_{4} 0,27% (p/v), (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,12% (p/v), NH_{4}Cl 0,2 g/L, MgSO_{4} 0,2% (p/v), FeSO_{4}\cdot7H_{2}O 40 mg/L, CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 40 mg/L, MnSO_{4}\cdotnH_{2}O 10 mg/L, AlCl_{3}\cdot6H_{2}O 10 mg/L, CoCl_{2}\cdot6H_{2}O 4 mg/L, ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 2 mg/L, Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O 2 mg/L, CuCl_{2}\cdot7H_{2}O 1 mg/L, H_{3}BO_{3} 0,5 mg/L).
Para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae, se usó medio YCDP (extracto de levadura 1% (p/v), ácido casamino 2% (p/v), glucosa 2% (p/v), fosfato potásico 100 mM (pH 6,0)).
Para el cultivo de Candida boidinii y de Pichia pastoris, se usó medio BMGY (extracto de levadura 1% (p/v), peptona 2% (p/v), glicerol 1% (v/v), YNB w/o AA 1,34% (v/v): Base Nitrogenada de Levadura sin Aminoácidos, biotina 0,4 mg/L, fosfato potásico 100 mM (pH 6,0)), medio BMMY (extracto de levadura 1% (p/v), peptona 2% (p/v), metanol 0,5% (v/v), YNB w/o AA 1,34% (v/v), biotina 0,4 mg/L, fosfato potásico 100 mM (pH 6,0)); medio YPD (extracto de levadura 1% (p/v), peptona 2% (p/v), glucosa 2% (p/v) y medio YPGM (extracto de levadura 1% (p/v), peptona 2% (p/v), glicerol 3% (v/v), metanol 1% (v/v), YNB w/o AA 1,34% (v/v), fosfato potásico 50 mM (pH 6,0)).
Procedimiento experimental básico
A menos que se especifique lo contrario, los procedimientos experimentales de los Ejemplos de Referencia y de los Ejemplos fueron de acuerdo a los siguientes métodos.
Los cebadores de ADN se sintetizaron mediante el método de fosforamidita usando un sintetizador automático (Modelo 380A, Applied Biosystems). Las secuencias de nucleótidos de ADN se determinaron mediante el método didesoxi.
La ruptura del ADN con enzimas de restricción se llevó a cabo mediante reacción durante una hora usando de 3 a 10 veces la cantidad de enzima indicada por el fabricante. El análisis de las estructuras de plásmidos se realizó usando de 0,5 a 1 \mug de ADN en una disolución de reacción de 20 \muL, y se preparó el ADN usando de 3 a 10 \mug de ADN en una disolución de reacción de 50 a 100 \muL. La temperatura de reacción y las condiciones de tampón de reacción fueron las indicadas por el fabricante.
Las muestras de electroforesis de gel de agarosa se prepararon añadiendo un volumen 1/5 de una disolución de pigmento (disolución acuosa de Ficoll al 15% (p/v) que contiene un 0,25% (p/v) de azul de bromofenol) a la disolución de reacción. El tampón de electroforesis de gel de agarosa usado fue un tampón TAE (Tris 10 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM). Para el análisis estructural de los plásmidos, se usó Mupid-2 (Cosmo Bio, KK.) para electroforesis a 100 voltios durante una hora, y para la preparación de los fragmentos de ADN, se usó un gel horizontal (20 cm x 15 cm x 0,7 cm) para electroforesis a 150 voltios durante 4 horas o 35 voltios durante 13 horas. Después de teñir el gel durante 20 minutos con disolución acuosa de bromuro de etidio (0,5 \mug/mL), las bandas de ADN fueron detectadas mediante radiación ultravioleta. Las concentraciones de gel de agarosa usadas fueron 1,0, 1,5 y 2,0% (p/v), dependiendo del tamaño de los fragmentos de ADN a fraccionar.
El ADN del gel de agarosa fue eluído colocando el gel en un tubo de diálisis relleno con 0,1 x tampón TAE y aplicando un voltaje, o mediante extracción a partir del gel usando SUPREC-01 (Takara Shuzo, KK.). Las disoluciones de ADN fueron tratadas con fenol y a continuación fueron precipitadas con etanol.
La reacción de ligadura se llevó a cabo añadiendo 10 unidades de enzima ligasa T4 en 30 \muL de una disolución de reacción (Tris/HCl 67 mM, MgCl_{2} 5 mM, DTT 5 mM, ATP 1 mM) que contenía 0,05-1 \mug de fragmentos de ADN, y haciendo que reaccionase a 16ºC durante 12 - 18 horas, o usando un Kit de Ligadura TAKARA (Takara Shuzo).
La transformación de E. coli se llevó a cabo mediante el método del cloruro cálcico (se compraron células competentes de JM109 para su uso), y los transformantes fueron seleccionados en base a la resistencia a fármaco (ampicilina o tetraciclina). La transformación de la cepa de levadura K16-57C se llevó a cabo mediante el método de acetato de litio (METHODS IN YEAST GENETICS; A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press), y los transformantes fueron seleccionados en base a la complementación de auxotrofia de triptófano. La transformación de la cepa TK62 ha sido descrita por Sakai y col. (Sakai y col., J. Bacteriol., 173, 7458-7463, 1991).
La medida de la actividad de Kex2 se realizó según el método de Mizuno y col. (Mizuno y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254, 1988). A saber, se añadieron 100 \muL de Kex2 diluido con Tris/HCl 100 mM (pH 7,0) a 100 \muL de disolución Tris/HCl 200 mM (pH 7,0) que contenía CaCl_{2} 2 mM, Lubrol al 0,2% (p/v) y Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 100 \muM (Peptide Laboratories, KK.), y se dejó que la mezcla reposara a 37ºC durante 30 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 50 \muL de EGTA 25 mM. Se midió la intensidad fluorescente de la sustancia fluorescente liberada (AMC) usando un sistema PANDEX FCA (Modelo 10-015-1 de Baxter Travenol (longitud de onda de excitación = 365 nm, longitud de onda base = 450 nm)). La cantidad de Kex2 que liberó 1 pmol de AMC en un minuto en las condiciones descritas se definió como 1 U.
La SDS-electroforesis de poliacrilamida (SDS-PAGE) se llevó a cabo de acuerdo con el método de Laemli (Laemli y col., Nature 227, 680-685, 1970). A saber, un ¼ de volumen de 4xSDS tampón de muestra (Tris/HCl 375 mM (pH 6,8), glicerol al 30% (v/v), SDS al 7% (p/v), 2-mercaptoetanol al 15% (v/v), azul de bromofenol al 7% (p/v)) se añadió a la muestra, y la mezcla se calentó a 90ºC durante 5 minutos. Se suministró una porción de 10 \muL a un SDS-gel de poliacrilamida (55 mm x 85 mm x 1 mm ó TEFCO Co.) para electroforesis a 20 mA durante 80 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con una disolución de tinción (ácido acético al 10% (v/v), metanol al 40% (v/v), azul brillante de Coomassie R250 al 0,25% (p/v)).
El resto de la manipulación genética básica, excepto cuando se indique lo contrario, se realizó según el método descrito en Molecular Cloning (editores, Maniatis y col., Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratoy, Nueva York, 1982).
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Ejemplo de Referencia 1
Preparación de proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84 1) Construcción de gen hProPTH(1-84) (Figuras 1 y 2)
El gen hProPTH(1-84) se sintetizó como los 14 fragmentos U1 a U7 (SEQ ID NOS: 5 a 11) y L1 a L7 (SEQ ID NOS: 12 a 18), tal como se muestra en la Figura 1.
El gen hProPTH(1-84) se construyó uniendo cada uno de los fragmentos del siguiente modo (Figura 2). En primer lugar, los fragmentos de ADN U1 (SEQ ID NO: 5) y L7 (SEQ ID NO: 18) (aproximadamente 1 \mug cada uno) se hicieron reaccionar a 37ºC durante 15 minutos en 15 \muL de una disolución de reacción de fosforilización (Tris/HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM) que contiene 16 unidades de polinucleótido T4 quinasa y 0,5 nM de [\gamma-^{32}P]dATP (por encima de 1 MBq). A esto se le añadieron 5 \muL de una disolución de reacción de fosforilación que contiene ATP 5 mM, y se continuó con la reacción a 37ºC durante 45 minutos. Se siguió el mismo procedimiento para U2 (SEQ ID NO: 6) y L6 (SEQ ID NO: 17), U3 (SEQ ID NO: 7) y L5 (SEQ ID NO: 16), U4 (SEQ ID NO: 8) y L4 (SEQ ID NO: 15), U5 (SEQ ID NO: 9) y L3 (SEQ ID NO: 14), U6 (SEQ ID NO: 10) y L2 (SEQ ID NO: 13) y U7 (SEQ ID NO: 11) y L1 (SEQ ID NO: 12).
Las 7 anteriores disoluciones de reacción se reunieron en una sola, y se llevó a cabo una precipitación en etanol para recuperar el ADN. Éste se disolvió en 80 \muL de una disolución de Tris/HCl 100 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 6,5 mM y NaCl 300 mM. Tras permitir que 40 \muL de dicha disolución reposaran a 95ºC durante 5 minutos, se bajó la temperatura a 43ºC durante 30 minutos. Tras enfriar con hielo, se añadieron 40 \muL de disolución de ligación B (Takara Shuzo, KK.) y se dejó que la mezcla reposara a 26ºC durante 15 minutos.
Se sometió la muestra a electroforesis de poliacrilamida al 5%. Tras la electroforesis, los fragmentos de ADN ligado fueron detectados mediante autorradiografía. Se extrajo un fragmento de ADN correspondiente a aproximadamente 280 pb del gel y se purificó de acuerdo a un método establecido.
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2) Construcción del plásmido pGP nº 19 que expresa \betaGal-139S(FM)PPH84 (Figuras 3 y 4)
El fragmento de ADN de aproximadamente 280 pb que contiene el gen sintético hProPTH(1-84) incluye la posición EcoRI de enzima de restricción en el extremo 5' y la posición SalI de enzima de restricción en el extremo 3'. La clonación del gen hProPTH(1-84) se llevó a cabo insertando dicho fragmento de ADN EcoRI/SalI en la posición EcoRI/SalI de pG210ShCT[G].
Tras la ruptura de pG210ShCT[G] con enzimas de restricción EcoRI y SalI, se preparó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb que contiene la porción de vector. Éste se ligó con el fragmento de ADN de aproximadamente 280 pb del gen hProPTH(1-84) obtenido antes en 1), para obtener plásmido pG210ShProPTH (Figura 3). Se usó pG210ShProPTH para transformar JM109 de E. coli, obteniendo JM109[pG210ShProPTH].
Asimismo, los ligandos KM091 (SEQ ID NO: 19) y KM092 (SEQ ID NO: 20) se insertaron en la posición de enzima de restricción XhoI/EcoRI de pG210ShProPTH, para construir plásmido pG210S(S/X) (Figura 3). Este ligando tiene las posiciones de enzima de restricción XhoI y EcoRI en cada extremo, y una posición SacI entre ambas.
Tras digerir plásmido pG210S(S/X) con enzimas de restricción SacI y XhoI, se usó un kit de eliminación Kilo-Sequence Deletion Kit (Takara Shuzo, KK.) para la eliminación dependiente del tiempo específica de la región de ADN que codifica para \betaGal-210S. Tras modificar los extremos con fragmento Klenow, se llevó a cabo una auto-ligadura para obtener plásmido pGP nº 19 que codifica para la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84, que tiene \betaGal-139S y hProPTH(1-84) ligados a través de Phe-Met (Figura 4). El JM109 de E. coli que tiene pGP nº 19 presentado aquí se denomina JM109[pGP nº 19].
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3) Preparación de proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84
Se sembró JM109[pGP nº 19] en un matraz Erlenmeyer de 1 L que contenía 200 mL de medio SB y se cultivó a 37ºC con agitación durante 16 horas. La disolución de precultivo total se transfirió a 3 L de medio UN que contenía 10 \mug/mL de tetraciclina, y se cultivó aeróbicamente con agitación a 37ºC usando un fermentador de 5 L (Modelo KMJ-5B-4U-FP, producto de Mitsuwa Physicochemical Industries, KK.). El volumen de aireación fue de 3 L/min y la velocidad de agitación se ajustó de tal modo que la cantidad de oxígeno disuelto se mantuvo por debajo de 2,0 ppm.
El pH se mantuvo a pH 7 usando agua con amoníaco al 9% (v/v) y ácido fosfórico 1 M. La fuente de carbono proporcionada fue glicerol añadido a 10 mL por 1 L de disolución de cultivo a las 3, 9 y 14 horas después del comienzo del cultivo, y la fuente de nitrógeno fue una concentración de 5 veces medio SB añadido a 10 mL por 1 L de disolución de cultivo a las 9,5 horas tras el inicio del cultivo. Se añadió un agente antiespumante (Disfoam CC-222, Nihon Yushi, KK.) a 300 \muL/L al inicio del cultivo, y después se añadió cuando fue necesario.
La OD660 después de 18 horas de cultivo fue 55, y se produjeron aproximadamente 0,5 mg de la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84 por mL de disolución de cultivo. La proteína quimérica se produjo como cuerpos de inclusión insolubles, que fueron purificados de la siguiente manera. Se sometió una porción de 1,5 L de disolución de cultivo a centrifugación a 6000 rpm, 4ºC durante 10 minutos (20PR-52D, producto de Hitachi Laboratory, KK.), y se recolectaron las células. Las células fueron suspendidas en 320 mL de Tris/HCl 100 mM (pH 7,0) y se rompieron con una prensa de presión celular francesa (dos veces a 10.000 psi).
La disolución de células rotas se centrifugó a 4000 rpm, 4ºC durante 15 minutos (05PR-22, producto de Hitachi Laboratory, KK.: tubo de plástico de 50 mL, producto de Sumitomo Bakelite, KK.). Tras suspender el precipitado en 30 mL de Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía un 0,5% (p/p) de Triton X-100, la suspensión se centrifugó a 3000 rpm, 4ºC durante 15 minutos, y se recuperó el precipitado. Este procedimiento se repitió 4 veces para obtener la proteína quimérica prepurificada.
La pureza de la proteína quimérica prepurificada fue de aproximadamente 70% (estimado mediante SDS-PAGE), y la cantidad de proteína fue aproximadamente 670 mg (determinado mediante el método Bradford usando albúmina de suero bovino como patrón).
La proteína quimérica prepurificada fue sometida a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC: Waters 660E de Millipore, KK.) usando una columna YMC Packed (2 cm x 25 cm, producto de Yamamura Chemical Laboratory) para la purificación. La proteína quimérica fue eluída con un gradiente de concentración lineal de acetonitrilo (A: 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA); B: 0,1% (v/v) de TFA/80% (v/v) de acetonitrilo; %B = 30%-60%/60 minutos, caudal = 10 mL/min). Las fracciones fueron sometidas a SDS-PAGE, y las fracciones con un 95% de pureza o más se agruparon y se liofilizaron.
La proteína quimérica liofilizada se disolvió de nuevo en TFA al 0,1% (v/v), y a continuación se sometió a HPLC para una mayor purificación. (Las condiciones fueron las mismas excepto en que el gradiente fue %B = 40%-60%/60 minutos). Las fracciones de pureza 99% o más fueron recogidas en base al índice de absorbancia a 210 nm de acuerdo con el análisis de HPLC, y fueron liofilizadas en un patrón. La cantidad de proteína en el patrón se estimó a partir del análisis de aminoácidos.
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Ejemplo de Referencia 2
Preparación de proteína quimérica soluble CATPH34 1) Construcción del plásmido ptacCATPH(1-34) que expresa CATPH34 (Figuras 5 y 6)
Se insertó un ligando R4 (R4U: SEQ ID NO: 21 y R4L: SEQ ID NO: 22) en la posición de enzima de restricción EcoRI-XhoI de pG97S4DhT[G] para construir pG97S4DhCT[G]R4. El gen PTH(1-34) preparado mediante PCR y el ligando pro\alpha descrito más adelante (pro\alphaU: SEQ ID NO: 23 y pro\alphaL: SEQ ID NO: 24) se insertó en la posición de enzima de restricción XhoI-KpnI del plásmido obtenido pG97S4DhCT[G]R4, para construir pPTH(1-34)pro\alpha. El gen PTH(1-34) se preparó mediante PCR con pGP nº 19 como plantilla, usando cebadores P1 (SEQ ID NO: 25) y P2 (SEQ ID NO: 26) (Figura 5).
A continuación, se sintetizaron los cebadores CAT1 y CAT3 (SEQ ID NOS: 27 y 28) con el objetivo de insertar la posición de enzima de restricción XhoI en el extremo 3' del gen CAT (cloranfenicol acetiltransferasa). El gen CAT que tiene la posición de enzima de restricción XhoI insertada en su extremo 3' se obtuvo mediante PCR usando CAT1 y CAT3 como cebadores y ptacCAT como plantilla de ADN. Éste fue digerido con las enzimas de restricción NcoI y XhoI, tras lo cual se ligaron el fragmento de ADN SalI-NcoI derivado de ptacCAT (3,6 kpb) y el fragmento de ADN XhoI-SalI derivado de pPTH(1-34)pro\alpha (0,15 kpb) para construir ptacCATPTH(1-34) (Figura 6).
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2) Preparación de proteína quimérica CATPH34 (véase la Figura 7)
Se cultivó la cepa JM101 que contiene ptacCATPTH(1-34) en medio LB a 37ºC. Se añadió IPTG (isopropil-betatiogalactósido) en una concentración final de 2 mM cuando el valor de OD660 de la disolución de cultivo alcanzó 0,6, y se continuó con el cultivo durante 3 horas para producir la proteína quimérica CATPH34. Tras completar el cultivo, se llevó a cabo una centrifugación (8000 rpm, 20 minutos) para recolectar las células, y se añadió disolución A (Tris/HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, PMSF 0,1 mM) hasta que el valor de OD660 de la suspensión alcanzó 70.
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A continuación, se sometió a tratamiento ultrasónico a 3 mL de la suspensión celular, y tras la ruptura de las células, la fracción soluble fue separada mediante centrifugación (12.000 rpm, 10 minutos), y se aplicó a una columna (3 mL) de caproato de cloranfenicol (Sigma C-8899) equilibrada con disolución A. Tras lavar la columna con disolución A que contenía NaCl 1 M, se eluyó la proteína quimérica con disolución A que contenía cloranfenicol 10 mM y NaCl 1 M. La Figura 7 muestra los resultados de SDS-PAGE para muestras antes y después de purificación. La banda 1 es el marcador de peso molecular, la banda 2 es la fracción soluble tras la ruptura celular, y la banda 3 es la proteína quimérica CATPTH(1-34) tras purificación. Los números a la izquierda de la banda 1 indican los tamaños de los marcadores de peso molecular (kDa).
La proteína quimérica se produjo en la fracción soluble, y se purificó fácilmente mediante cromatografía de afinidad usando caproato de cloranfenicol.
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Ejemplo de Referencia 3
Preparación de proteína quimérica insoluble \betaGal-117S4HPPH34 1) Construcción del plásmido pG117S4HPPH34 que expresa \betaGal-117S4HPPH34 (Figuras 8 a 10)
Se usó pGP nº 19 como plantilla y S01 (SEQ ID NO: 29) y S02 (SEQ ID NO: 30) como cebadores para PCR para amplificar un fragmento de ADN en el que el 35º codón GTT de hPTH(1-84) estaba sustituido por el codón de terminación de la traducción TAA, tras lo cual se aisló y purificó el fragmento de ADN de enzima de restricción AatII-SalI empleando métodos comunes, y se intercambió por la porción correspondiente de pGP nº 19 para construir pGP nº19 PPH34 (Figura 8).
A continuación, un fragmento de ADN obtenido mediante amplificación por PCR usando pG210S(S/X) como plantilla y S03 (SEQ ID NO: 31) y S05 (SEQ ID NO: 32) como cebadores, seguido de digestión con enzimas de restricción SalI y SmaI, un fragmento de ADN obtenido mediante amplificación por PCR usando pGP nº 19 PPH34 como plantilla y S07 (SEQ ID NO: 33) y S02 (SEQ ID NO: 30) como cebadores seguido de digestión con enzimas de restricción SalI y SmaI, y un fragmento de ADN de enzima de restricción PvuI-SalI que contiene el origen de inicio de replicación de pGP nº 19 PPH34 fueron ligados con ligasa T4, para construir PG117SPPH34 (Figuras
9 a 10).
Los ligandos S08 (SEQ ID NO: 34) y S09 (SEQ ID NO: 35) que codifican para (His)_{4}-Pro-Gly fueron insertados en la posición de enzima de restricción SmaI de pG117SPPH34 para construir pG117S4HPPH34 (Figura 10). La orientación de los ligandos se confirmó determinando las secuencias de nucleótidos de ADN tras preparar los plásmidos.
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2) Producción de proteína quimérica \betaGal-117S4HPPH34
Para obtener la proteína quimérica \betaGal-117S4HPPH34 en grandes cantidades, se cultivó M25[pG117S4HPPH34] de E. coli en el que se había introducido el vector de expresión para la proteína quimérica a 37ºC en un medio SB2 de 20 L. Con una concentración celular de OD660 = 1,0, se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM, y se continuó con el cultivo hasta que la concentración celular alcanzó OD660 = 12. Se usó Disfoam CC-222 (producto de Nihon Yushi, KK.) como agente antiespumante. Tras recolectar las células, éstas fueron suspendidas en TE (Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0); seguido de ruptura celular con un homogeneizador de alta presión (Manton-Gaullin), centrifugación y suspensión y lavado con TE y agua desionizada, para obtener aproximadamente 100 g de cuerpos de inclusión.
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Ejemplo 1
(Referencia)
Expresión de derivados de Kex2 secretores en Saccharomyces cerevisiae
Para la purificación de una gran cantidad de enzimas con actividad de proteasa Kex2, no sólo los rendimientos deben ser elevados, sino que la purificación de la misma también debe ser sencilla, y para este propósito los inventores han considerado ventajoso llevar a cabo la secreción en una disolución de cultivo que contiene pocas proteínas diferentes. Aunque se ha publicado que el ssKex2 es un derivado de Kex2 secretor, su rendimiento es de 4 mg/L de disolución de cultivo, lo que es demasiado bajo para su uso a escala industrial. Por tanto, primero se construyeron diferentes derivados secretores de Kex2, y se expresaron en Saccharomyces cerevisiae para investigar los rendimientos de secreción, seleccionando entre ellos los derivados de Kex2 con los mayores rendimientos de secreción.
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1) Construcción de plásmidos que expresan derivados de Kex2 secretores (Figuras 11, 12 y 13)
El gen KEX2 secretor se construyó mediante PCR. La secuencia cebadora se muestra en la Figura 11(b). KM085 (SEQ ID NO: 36) tiene la posición de enzima de restricción EcoRI (subrayada) en el extremo 5', y KM088 (SEQ ID NO: 37), KM089 (SEQ ID NO: 38), KM090 (SEQ ID NO: 39) y KM093 (SEQ ID NO: 40) tienen la posición de enzima de restricción SalI en sus extremos 5'.
Estos cebadores se corresponden con la región de gen KEX2 mostrada en la Figura 11(a), incluyendo KM085 una secuencia de nucleótidos que codifica para la metionina inicial del gen KEX2, y teniendo KM088, KM089, KM090 y KM093 secuencias de nucleótidos que son antisentido respecto a las secuencias en las que se añade directamente el codón de terminación de la traducción TAA en los aminoácidos 660, 679 y 699 a partir del extremo N, respectivamente.
Se llevó a cabo una reacción PCR usando plásmido pYE-KEX2(5.0)b, cortado con enzima de restricción EcoRI y en formación lineal como plantilla, usando KM085 y KM088 como cebadores. El producto de purificación de la reacción fue atacado con enzimas de restricción EcoRI y SalI para obtener un fragmento de ADN EcoRI-SalI. Dicho fragmento de ADN tiene la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para Kex2-660 (KEX2-660), con la posición de enzima de restricción EcoRI por encima y la posición de enzima de restricción SalI por debajo.
A continuación, tras atacar el plásmido pYE-22m con las enzimas de restricción EcoRI y SalI, se purificó el fragmento de ADN de aproximadamente 8,3 kb que contiene la porción de vector. Éste fue ligado con el fragmento de ADN EcoRI-SalI que contiene el gen que codifica para Kex2-660 obtenido antes, para obtener plásmido pYE-660 (Figura 12).
Del mismo modo, se usaron KM089, KM090 y KM093 en lugar del cebador KM088, se recuperaron los fragmentos de ADN EcoRI-SalI que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para Kex2-679, Kex2-688 y Kex2-699 (KEX2-679, KEX2-688, KEX2-699) y se ligaron con el fragmento EcoRI-SalI del plásmido pYE-22m, para obtener plásmidos pYE-679, pYE-688 y pYE-699.
El plásmido pYE-614 se construyó reemplazando el fragmento de ADN BglII-SalI que contiene una porción del gen KEX2 de pYE-KEX2 (RI-PvuII) con el fragmento de ADN BglII-SalI que contiene una porción del gen KEX2-660 de pYE-660 (Figura 13).
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2) Transformación y expresión de derivados secretores de Kex2 (véanse las Figuras 14 y 15)
Los plásmidos (pYE-22m, pYE-614, pYE-660, pYE-679, pYE-688 y pYE-699) se introdujeron en la cepa K16-57C para obtener las cepas K16-57C[pYE-22m], K16-57C[pYE-614], K16-57C[pYE-660], K16-57C[pYE-679], K16-57C[pYE-688] y K16-57C[pYE-699].
Las cantidades de secreción de derivado de Kex2 en las disoluciones de cultivo se determinaron mediante ensayo de la actividad de Kex2 en los sobrenadantes del cultivo y mediante SDS-PAGE de sus concentrados.
Las colonias fueron sembradas en 4 mL de medio YCPD y a continuación se cultivaron durante una noche a 32ºC con agitación. Tras transferir 100 \muL de disolución de cultivo a 4 mL de medio YCDP, se cultivó durante una noche a 32ºC con agitación. Se centrifugó un mL de la disolución de cultivo a 12.000 rpm, 5 minutos, 4ºC (MRX-150, Tomy Seiko) para obtener el sobrenadante del cultivo. Tras diluir el sobrenadante de cultivo de 2 a 64 veces con Tris/HCl 100 mM (pH 7,0), se midió la actividad de Kex2. Los resultados se muestran en la Figura 14. Las actividades de Kex2 por OD660 de K16-57C[pYE-660], K16-57C[pYE-679] y K16-57C[pYE-688] fueron 25, 15 y 1,2 veces superiores, respectivamente, que la de K16-57C[pYE-614]. No se detectó actividad de Kex2 en los sobrenadantes de cultivo de K16-57C[pYE-22m] y K16-57C[pYE-699].
Las muestras para SDS-PAGE se prepararon concentrando los sobrenadantes de cultivo hasta 20 veces usando un Ultrafree-C3GC (Millipore, KK.; peso molecular de fraccionamiento = 10.000), y se usaron aproximadamente 200 \muL de sobrenadante de cultivo por banda. Los resultados se muestran en la Figura 15. Las bandas 1 y 7 son marcadores de peso molecular, la banda 2 corresponde a K16-57C[pYE-22m], la banda 3 corresponde a K16-57C[pYE-614], la banda 4 corresponde a K16-57C[pYE-660], la banda 5 corresponde a K16-57C[pYE-679] y la banda 6 corresponde a K16-57C[pYE-688]. Los números a la izquierda de la banda 1 indican los tamaños de los marcadores de peso molecular (kDa).
Se demostró que el Kex2-660 y el Kex2-679 tienen una mayor cantidad de secreción que el Kex2-614, similar a sus actividades. También se demostró que sus pesos moleculares aumentaron correspondientemente con el número de residuos de aminoácido, es decir, no se acumuló autolisis en dicho cultivo como ocurre con el Kex2\Deltap en el hospedante de célula de insecto Sf9.
Se descubrió que los rendimientos secretores de Kex2-660 y Kex2-679 son mucho mayores, al menos 10 veces superiores, que el rendimiento secretor del Kex2-614 publicado hasta el momento. Asimismo, puesto que no se observó una autolisis notable en los sobrenadantes del cultivo, pueden esperarse rendimientos incluso superiores investigando otros métodos de producción.
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Ejemplo 2
(Referencia)
Purificación de Kex2-660
El cultivo de K16-57C[pYE-660] se llevó a cabo a una mayor escala, con el objeto de purificar Kex2-660 a partir del sobrenadante de cultivo.
Se cultivó K16-57C[pYE-660] durante una noche a 32ºC en 3 L de medio YCPD. Se sometió una porción de 2,3 L del sobrenadante de cultivo a concentración e intercambio de la disolución tamponante (Bis-Tris/HCl 20 mM (pH 6,0), NaCl 50 mM, CaCl_{2} 0,2 mM), usando un módulo de ultrafiltración (Sistema UF-LMSII: UF2CS-3000PS, Toso, KK.) (volumen final: 275 mL).
Se adsorbió una porción del mismo en una columna Q-Sepharose XK16 (Pharmacia, KK.) equilibrada de antemano con la misma disolución tampón. Tras lavar con 75 mL de la misma disolución tampón, se llevó a cabo la elución (120 mL) en la misma disolución tampón con un gradiente de concentración lineal de NaCl 50 mM a 350 mM. El caudal fue de 3 mL/minuto. La actividad de Kex2 se recuperó en 24 mL de fracciones eluídas de concentración de 150 a 250 mM de NaCl. Tras añadir 6,6 g de sulfato amónico al eluato, se usó HCl 1 N para ajustar el pH a 6,0, y se incrementó el volumen hasta 30 mL con Bis-Tris/HCl 20 mM (pH 6,0), CaCl_{2} 0,2 mM.
Se adsorbió una porción de 15 mL del mismo sobre una columna Phenyl Superose HR 5/5 (Pharmacia) equilibrada de antemano con una disolución de Bis-Tris/HCl 20 mM (pH 6,0), CaCl_{2} 0,2 mM que contiene sulfato amónico 2 M. Tras lavar con 2,5 mL de la misma disolución tampón, se llevó a cabo la elución (15 mL) en Bis-Tris/HCl 20 mM (pH 6,0), CaCl_{2} 0,2 mM con un gradiente de concentración lineal de 2 a 0 M de sulfato amonio. El caudal fue de 0,5 mL/min. La actividad de Kex2 se recuperó en 2,25 mL de fracciones eluídas de concentración 0,8 a 0,6 M de sulfato amónico. Las tasas de recuperación de Kex2-660 en cada etapa se muestran en la Tabla 1. La tasa de recuperación global se determinó integrando las tasas de recuperación de cada etapa.
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TABLA 1 Purificación de Kex2-660
1
Ejemplo 3
(Referencia)
Efecto de la urea sobre la actividad de proteasa Kex2 del Kex2-660
En el proceso de expresión de proteína quimérica, la proteína quimérica normalmente forma cuerpos de inclusión insolubles, y por tanto se usa urea, u otra sustancia similar, como agente desnaturalizante para solubilizarla. Se desconoce el efecto de la urea sobre la actividad de proteasa Kex2 y sobre los derivados secretores de Kex2. Por tanto, nosotros hemos determinado el efecto de la urea sobre la actividad de proteasa del Kex2-660 usando Boc-Leu-Arg-Arg-MCA y la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84 como sustratos.
1) Efecto de la urea sobre la actividad de proteasa Kex2 del Kex2-660 con sustrato sintético
Se investigó la actividad del Kex2-660 purificado en el Ejemplo 2 (ajustado a una concentración final de 80 a 1200 U/mL) con concentraciones finales de urea de 0, 1, 2 y 4 M usando Boc-Leu-Arg-Arg-MCA- Las condiciones de reacción fueron las mismas empleadas en el método de determinación de actividad de Kex2 descrito antes, exceptuando la presencia de urea. Se descubrió que las actividades a concentraciones de urea de 1, 2 y 4 M eran el 70%, 40% y 10%, respectivamente, referidas al 100% de actividad en ausencia de urea (Figura 16). Para la activación de la proteasa, etc., tras disolver los cuerpos de inclusión insolubles en la disolución de urea, generalmente se usa una concentración de urea de 2 a 4 M. Por tanto, se concluyó que el Kex2-660 puede usarse para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas, si las condiciones de disolución de las proteínas quiméricas son determinadas apropiadamente.
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2) Efecto de la urea sobre la actividad de proteasa Kex2 del Kex2-660 con sustrato proteico
Se investigó el efecto de la urea sobre la actividad de proteasa del Kex2-660 usando la \betaGal-139S(FM)PPH84 preparada en el Ejemplo de Referencia 1, y el Kex2-660 purificado en el Ejemplo 2. En primer lugar, se llevó a cabo la reacción a 37ºC durante 30 minutos en las condiciones de reacción descritas más adelante, usando concentraciones de urea de 1,5 a 3,0 M. Tras añadir un volumen cuatro veces superior de ácido acético 5 N, 50 \muL de la disolución de reacción fueron sometidos a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC: LC6A, producto de Shimazu Laboratories) usando una columna YMC-ODS-A302 (d 4,6 mm x 150 mm, producto de Yamamura Chemical Laboratories), y se eluyó con un gradiente de concentraciones lineal (A: 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA); B: 0,094% (v/v) de TFA/80% (v/v) de acetonitrilo; %B = 30% - 60%/30 minutos, caudal = 1 mL/min).
2 mg/mL
\betaGal-139S(FM)PPH84
100 mM
Tris/HCl (pH 7,0)
1,5 M a 3,0 M
urea
1 mM
CaCl_{2}
50 kU/mL
Kex2-660
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Los nuevos picos que aparecen tras el procesado de Kex2-660 fueron divididos, y se realizó la identificación y el análisis de composición de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos desde el extremo N, \betaGal(1-14), hPTH(1-84) y hPTH(1-44). \betaGal-139S(FM)PPH84 tiene 4 posiciones de secuencias predichas para la ruptura por acción de proteasa Kex2: Arg-Arg (sitio de ruptura A), Lys-Arg (sitio de ruptura B) y Pro-Arg (sitios de ruptura C y D). La ruptura en los sitios de ruptura A, B y C se confirmó a partir de los fragmentos de péptido identificados, pero la ruptura en el sitio de ruptura D no pudo ser confirmada.
Las tasas de recuperación para cada uno de los fragmentos de péptido producidos tras procesamiento con Kex2-660 fueron determinadas de la siguiente manera.
Tasa de recuperación (%) = FPA x CAA x 100/(CPA x FAA)
FPA: Área del pico correspondiente a cada fragmento de péptido tras el procesamiento con Kex2-660.
CAA: Número de aminoácidos de \betaGal-139S(FM)PPH84 (231 aminoácidos).
CPA: Área del pico correspondiente a \betaGal-139S(FM)PPH84 antes del procesamiento con Kex2-660.
FAA: Número de aminoácidos de cada fragmento de péptido.
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Los resultados se muestran en la Figura 17. Los cuadrados huecos, los círculos huecos, los círculos rellenos y los triángulos huecos representan, respectivamente, las tasas de recuperación correspondientes a \betaGal(1-14), hPTH(1-84), hPTH(1-44) y hPTH(1-84) + hPTH(1-44).
Se demostró que en el intervalo de concentraciones de urea de 1,5 a 2,5 M, un incremento de la concentración de urea dio como resultado una mayor tasa de recuperación del péptido escindido por el Kex2-660, es decir, un aumento en la eficacia de ruptura en los sitios de ruptura A, B y C.
Por otro lado, se descubrió que en el intervalo de concentraciones de urea de 2,5 a 3,0 M, la tasa de recuperación correspondiente a \betaGal(1-14) y hPTH(1-44) disminuyó mientras que la tasa de recuperación correspondiente a [hPTH(1-84) + hPTH(1-44)] prácticamente no varió, y la de hPTH(1-84) aumentó; por tanto la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura B permaneció inalterada mientras que la eficacia de ruptura en los sitios de ruptura A y C disminuyó. En otras palabras, esto demostró que la ruptura de \betaGal-139S(FM)PPH84 por Kex2-660, aumentando las concentraciones de urea hasta 2,5 M, proporciona una mayor eficacia de ruptura, mientras que a concentraciones de urea de 2,5 a 3,0 M se producen diferencias en la eficacia de ruptura dependiendo de la secuencia.
El siguiente experimento se llevó a cabo a continuación con mayores concentraciones de urea, de 3,0 a 4,0 M, para determinar las tasas de recuperación de fragmentos de péptido, etc.
2 mg/mL
\betaGal-139S(FM)PPH84
100 mM
Tris/HCl (pH 7,0)
3,0 a 4,0 M
urea
1 mM
CaCl_{2}
20 kU/mL
Kex2-660
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Los resultados se muestran en la Figura 18. Los símbolos y los cálculos de tasas de recuperación se han explicado anteriormente.
Como resultado, no se observó ninguna diferencia notable en las tasas de recuperación de ninguno de los fragmentos a concentraciones de urea de 3,0 a 4,0 M, aunque concentraciones crecientes de urea proporcionaron menores tasas de recuperación para \betaGal(1-14) y hPTH(1-44), y se observó una tendencia de incremento para hPTH(1-84). Es decir, se descubrió que con una concentración de urea creciente la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura B fue ligeramente superior, mientras que la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura C se redujo.
Para resumir los resultados de ruptura de \betaGal-139S(FM)PPH84 por Kex2-660 a concentraciones de urea de 1,5 a 4,0 M, se descubrir que una concentración creciente de urea en el intervalo de concentraciones de urea de 1,5 a 2,5 M proporciona una mayor eficacia de ruptura en los sitios de ruptura A, B y C, y en el intervalo de concentraciones de urea de 2,5 a 3,5 M la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura B aumenta mientras que la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura C disminuye. Estos descubrimientos no eran predecibles a partir de sustratos sintéticos, y se han logrado por vez primera en la presente invención.
Desde el punto de vista de la escisión de hPTH(1-84) a partir de proteínas quiméricas, ha quedado claro que es preferible una concentración de urea de 3,5 a 4,0 M, a la cual la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura B es elevada y la eficacia de ruptura en el sitio de ruptura C es baja.
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Ejemplo 4
(Referencia)
Escisión de hPTH(1-84) a partir de \betaGal-139S(FM) PPH84 con Kex2-660
En el Ejemplo 3, se identificaron \betaGal(1-14), hPTH(1-84) y hPTH(1-44) y se investigó el efecto de la urea sobre la eficacia de ruptura de \betaGal-139S(FM)PPH84 por Kex2-660 en base a sus tasas de recuperación de péptido. Sin embargo, no se pudieron identificar los fragmentos de péptido de hPTH(45-84). Así, se separó una muestra de hPTH(1-84) procesada sin Kex2-660 y se analizó mediante HPLC en diferentes condiciones de elución para identificar hPTH(45-84), y se confirmó que había eluído en la fracción que había pasado durante la elución en las condiciones previas. Estos resultados demostraron que el sitio de ruptura D no sufre virtualmente ninguna ruptura.
A continuación, se dejó que actuaran diferentes proporciones de Kex2-660 (25 kU, 50 kU, 100 kU, 150 kU y 200 kU por 1 mg de proteína quimérica) sobre la proteína quimérica, y tras 30 minutos se investigaron las tasas de recuperación de cada uno de los fragmentos de péptido. El análisis de los fragmentos de péptido resultantes se llevó a cabo del mismo modo que en el Ejemplo 3, excepto que, basado en los resultados mencionados antes, las condiciones de gradiente fueron cambiadas a %B = 0% - 80%/80 minutos.
1 mg/mL
\betaGal-139S(FM)PPH84
100 mM
Tris/HCl (pH 7,0)
4,0 M
urea
1 mM
CaCl_{2}
25 a 200 kU/mL
Kex2-660
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La Figura 19 muestra un perfil de elución de HPLC para muestras no procesadas con Kex2-660 y procesadas con 50 kU de Kex2-660. Las señales 1, 2, 3, 4 y 7 corresponden, respectivamente, a hPTH(45-84) (del aminoácido después del sitio de ruptura C hasta el extremo C de hPTH(1-84)), \betaGal(1-14) (del extremo N de \betaGal-139S hasta el sitio de ruptura A), hPTH(1-84), hPTH(1-44) (desde el aminoácido después del sitio de ruptura B hasta el sitio de ruptura C) y \betaGal-139S(FM)PPH84 (longitud completa de la proteína quimérica).
Las señales 6 y 7 fueron mayores cuando la cantidad de Kex2-660 fue menor, y menores cuando la cantidad fue mayor, y puesto que la señal 5 aumentó al disminuir las señales 6 y 7, se concluyó que la señal 5 era un péptido desde el aminoácido después del sitio de ruptura A hasta el sitio de ruptura B de la proteína quimérica, y la señal 6 era un péptido desde el extremo N de \betaGal-139 hasta el sitio de ruptura B o desde el aminoácido después del sitio de ruptura A hasta el extremo C de hPTH(1-84). (La señal 6 posiblemente puede ser desde el extremo N de \betaGal-139S hasta el sitio de ruptura C, pero es improbable ya que Arg-Arg se corta más fácilmente que Pro-Arg).
Asimismo, los tamaños de las señales 1, 4, 5, 6 y 7 variaron en el intervalo de 25 a 200 kU/mL, mientras que los tamaños de las señales 2 y 3 prácticamente no cambiaron. Incluso cuando se usaron 200 kU/mL de Kex2-660, no aparecieron nuevas señales. En otras palabras, se confirmó que no se detecta ninguna otra actividad de proteasa diferente a la de proteasa Kex2 incluso cuando se usa 8 veces (200 kU/mL) la cantidad necesaria de Kex2-660 (25 kU/mL) para la escisión de hPTH(1-84), y que el Kex2-660 purificado en el Ejemplo 2 no tenía contaminación de otras proteasas que pudieran interferir en las condiciones en las que se escinde hPTH(1-84) a partir de proteínas quiméricas.
Las tasas de recuperación correspondientes a fragmentos de péptido derivados de hPTH(1-84) en el intervalo de 25 a 200 kU/mL se resumen en la Figura 20. Es evidente que cuando se usan 50 kU/mL de Kex2-660, el hPTH(1-84) se recuperó en aproximadamente un 75%. En este caso, aunque quedó aproximadamente el 10% de \betaGal-139S(FM)PPH84, disminuyó al aumentar la cantidad de Kex2-660, desapareciendo casi completamente a 200 kU/mL. Sin embargo, la proporción de hPTH(1-44) también aumentó simultáneamente, y por tanto la tasa de recuperación de hPTH(1-84) no aumentó. Incluso cuando la cantidad de Kex2-660 se elevó, el incremento de los productos de descomposición de hPTH(1-84), hPTH(1-44) y hPTH(45-84), fue moderado, y la tasa de recuperación de hPTH(1-84) fue del 65-75% en el intervalo de 25 a 200 kU/mL.
Estos resultados demuestran que el Kex2-660 es capaz de escindir péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas de un modo eficaz (con una eficacia de escisión del 75%) incluso cuando el péptido deseado tiene un sitio de ruptura para proteasa Kex2- Esta eficacia de escisión es superior que la eficacia de escisión del 50% correspondiente a hPTH(1-84) usando factor-Xa (Gardella y col., J. Biol. Chem. 265 (26), 15854-15859, 1990). Gardella y col. han sugerido la posibilidad de que proteasas contaminantes o el propio factor-Xa degraden hPTH(1-84), a juzgar por las menores tasas de recuperación de hPTH(1-84) cuando aumenta la cantidad de enzima o se alarga el tiempo de reacción, a pesar del hecho de que el hPTH(1-84) no incluye el sitio de reconocimiento de factor-Xa, es decir, la secuencia Ile-Glu-Gly-Arg.
El hecho de que el hPTH(1-84) se obtenga con un elevado rendimiento a pesar del hecho de que el hPTH(1-84) incluya 2 posiciones de secuencias de ruptura para proteasa Kex2 sugiere que los derivados de Kex2 purificados con rendimientos elevados de acuerdo con la invención son útiles como enzimas para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas.
Además, puesto que no se detectó ningún otro fragmento de péptido producido por la ruptura en posiciones diferentes a la posición de la proteasa Kex2 incluso cuando se aumentó la cantidad de Kex2-660, la especificidad de sustrato del Kex2 purificado en el Ejemplo 2 es elevada, a la vez que no se detectó ninguna otra actividad de proteasa en las condiciones en las que se escinden péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas.
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Ejemplo 6
(Referencia)
Escisión de hPTH(1-34) a partir de CATPH34 mediante Kex2-660
Con el objetivo de escindir hPTH(1-34) a partir de la proteína quimérica CATPH34, se añadieron 239 \muL de agua desionizada, 1,32 \muL de CaCl_{2} 1 M y 30 kU de Kex2-660 a 60 \muL tomados del eluato del Ejemplo de Referencia 2, y la mezcla se calentó a 37ºC durante una hora. Después de la reacción se examinaron los picos que aparecieron para realizar un análisis de aminoácidos, y se descubrió que la composición de aminoácidos coincidía con la del hPTH(1-34) (Figura 21).
Es decir, se demostró que no se detecta ninguna otra actividad de proteasa incluso en ausencia de urea en la disolución de reacción, y, por tanto, que el Kex2-660 puede usarse para la escisión de hPTH(1-34) a partir de proteínas quiméricas. Además, el Kex2-660 es capaz de escindir proteínas deseadas incluso cuando las proteínas quiméricas tienen diferentes péptidos protectores y regiones de sitio de ruptura, y por tanto tiene una amplia aplicación industrial.
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Ejemplo 7
(Referencia)
Escisión de hPTH(1-34) a partir de la proteína quimérica \betaGal-139S(FM)PPH84
A 250 mL de la suspensión de cuerpos de inclusión de \betaGal-139S(FM)PPH84 (160 g/L) preparados en el Ejemplo de Referencia 3 se añadieron 100 mL de Tris/HCl 1 M (pH 8,2), 50 mL de NaCl 5 M, 500 mL de agua desionizada y 900 g de urea, y tras agitar hasta disolución durante 30 minutos en un baño de temperatura constante a 30ºC, la disolución se diluyó con agua desionizada templada hasta 5 L a 30ºC.
A ésta se añadió lentamente 50 mL de una disolución de CaCl_{2} 250 mM a la vez que se agitaba, y a continuación se añadió Kex2-660 hasta 20 kU/mL. Tras 2 horas, se escindieron 7 g de hPTH(1-34) con una eficacia por encima del 90%. La cantidad de Kex2-660 usada fue inferior a 1/20.000 de la de proteína quimérica (relación en peso), y esto demostró que el hPTH(1-34) fue escindido eficazmente a partir de la proteína quimérica.
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Ejemplo 8
(Invención)
Expresión de derivados secretores de Kex2 en Candida boidinii
Los resultados del Ejemplo 1 demostraron que el Kex2-660 no sufre una autolisis notable en la disolución de cultivo. Así, pueden esperarse mayores rendimientos usando sistemas de expresión más eficientes. Por lo tanto, intentamos producir Kex2-660 es un sistema de expresión usando la levadura que utiliza metanol Candida boidinii como hospedante.
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1) Construcción de plásmido de expresión usando Candida boidinii (Figuras 11 y 22)
Se construyó el gen NKEX2-660 mediante PCR del mismo modo que en el Ejemplo 1, 1), excepto porque se usaron como cebadores NKEX2 (SEQ ID NO: 41) y KM088. El NKEX2 contiene la secuencia de nucleótidos de la posición de enzima de restricción NotI (subrayada) en el extremo 5', e incluye la secuencia de bases -107 a -132 por encima de la metionina inicial del gen KEX2 (Figura 11). El gen NKEX2-660 (el gen KEX2 con 132 pares base de la región 5' no traducida del gen KEX2) fue clonado en pCRII y a continuación fue escindido usando enzima de restricción NotI. El fragmento de ADN NotI que contiene el gen NKEX2-660 fue insertado en la posición NotI del plásmido pNOTelI bajo control de promotor para permitir la expresión del gen NKEX2-660, y construir de este modo pCU660 (Figura 22).
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2) Producción de derivado secretor de Kex2 con Candida boidinii (Figura 23)
Plásmido pCU660 que había sido digerido con enzima de restricción BamHI en el gen URA3 y en forma lineal fue introducido en TK62, y se seleccionaron las cepas transformadas TK62/pCU660. A continuación se cultivaron veinte cepas TK62[pCU660] (nº 1 a nº 20) a 27ºC con agitación en medio BMGY. Después de 2 días, se transfirieron aproximadamente 10 DO\cdotmL de la disolución de precultivo a un 1 mL de medio BMMY y se siguió con el cultivo a 27ºC con agitación. Tras 30 horas, se midió la actividad de Kex2 del sobrenadante de cultivo. Las 5 cepas con mayor actividad fueron cultivadas del mismo modo, y se selección la TK62[pCU660] nº 10 que presentó una actividad de Kex2 elevada y reproducible, y se cultivó en un fermentador.
Tras transferir 1 mL de reserva congelada en glicerol de TK62[pCU660] nº 10 a un matraz Erlenmeyer de 300 mL que contenía 25 mL de medio YPD, se precultivó a 27ºC durante 16 horas. Se transfirió una porción de 10,5 mL de la disolución de precultivo (DO600 = 38) a 2 L de medio de cultivo YPGM, y se usó un fermentador de 5 L (Modelo KMJ-5B-4U-FP, de Mitsuwa Rika) para cultivar a 27ºC. El volumen de aireación fue de 4 L/min y la velocidad de agitación se ajustó de tal modo que la cantidad de oxígeno disuelto permaneciera por encima de 2,5 ppm. Se suplementó con metanol, glicerol y fuente de nitrógeno (5% (p/v) de extracto de levadura, 10% (p/v) de peptona, 6,7% (v/v) de YNB w/o AA; 1/25 volumen/adición) cuando fue apropiado.
El pH se controló para mantenerlo por encima de pH 5,5 añadiendo agua con amoníaco al 7,5% (v/v). Se añadió un agente antiespumante (Disfoam CC-222, Nihon Yushi, KK.) a 0,5 mL/L, al inicio del cultivo y después se añadió cuando fue necesario. Los resultados de SDS-PAGE correspondientes al sobrenadante del cultivo a cada tiempo de cultivo se muestran en la Figura 23. La OD660 tras 48 horas de cultivo fue de 353, y este cultivo produjo aproximadamente 2800 MU de Kex2-660 (correspondientes a aproximadamente 340 mg) por 1 L de sobrenadante de cultivo.
Este rendimiento es capaz de la escisión de 200 g de hPTH(1-34) del Ejemplo 7, y por tanto se demostró que el derivado de Kex2 de la invención puede ser usado en la práctica para la escisión de péptidos deseados a partir de proteínas quiméricas a escala industrial.
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Ejemplo 9
(Referencia)
Expresión de derivado secretor de Kex2 en Saccharomyces cerevisiae (2)
En el Ejemplo 1 se demostró que los rendimientos de proteasas Kex2 que carecen de región C-terminal (Kex2-660 y Kex2-679) fueron notablemente superiores a los de Kex2-614, Kex2-699 y Kex2-688. En este Ejemplo, se construyeron otras proteasas Kex2 adicionales que carecen de región C-terminal (Kex2-630, Kex2-640, Kex2-650 y Kex2-682), para investigar en más detalle la relación entre la región C-terminal y los rendimientos de proteasa Kex2.
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1) Construcción de plásmidos que expresan derivados secretores de Kex2
Los genes secretores de Kex2 fueron construidos mediante el método del Ejemplo 1, 1). Específicamente, las secuencias cebadoras KM100 (SEQ ID NO: 42), KM102 (SEQ ID NO: 43), KM103 (SEQ ID NO: 44) y KM104 (SEQ ID NO: 45) presentan secuencias de nucleótidos que son cadenas antisentido respecto a secuencias en las que el codón TAA de terminación de la traducción se añade después de los aminoácidos 630, 640, 650 y 682 desde el extremo N, respectivamente.
La construcción de fragmentos de ADN EcoRI-SalI que codifican para los genes de derivado secretor de Kex2 y de los vectores de expresión que los contienen se llevó a cabo mediante el método del Ejemplo 1, 1). Los polipéptidos del extremo N de la proteasa Kex2 hasta los aminoácidos 630, 640, 650 y 682 fueron denominados Kex2-630, Kex2-640, Kex2-650 y Kex2-682, y los genes que codifican para ellos se denominaron KEX2-630, KEX2-640, KEX2-650 y KEX2-682, respectivamente.
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2) Transformación y producción de derivados secretores de Kex2 (véanse las Figuras 25 y 26)
Los plásmidos (pYE-630, pYE-640, pYE-650 y pYE-682) fueron introducidos en la cepa K16-57C para obtener las cepas K16-57C[pYE-630], K16-57C[pYE-640], K16-57C[pYE-650] y K16-57C[pYE-682]. Estos transformantes fueron cultivados a continuación, con las cepas productoras de derivado secretor de Kex2 preparadas en el Ejemplo 1, 2), y los rendimientos de Kex2 (cantidad de Kex2 secretada al medio de cultivo) fueron determinados mediante medidas de la actividad de Kex2 en los sobrenadantes de cultivo y SDS-PAGE de los concentrados de sobrenadante de cultivo.
Las colonias fueron inoculadas en medio YCPD y a continuación fueron cultivadas a 30ºC con agitación para preparar células en la fase de crecimiento logarítmico. Dichas células fueron subcultivadas en medio YCPD hasta que la absorbancia OD660 alcanzó aproximadamente 0,02, y a continuación se siguieron cultivando aproximadamente 16 horas a 30ºC. Los resultados de medida de la actividad de Kex2 se muestran en la Figura 25, y los resultados de SDS-PAGE se muestran en la Figura 26.
Las actividades de Kex2 por OD660 en el sobrenadante de cultivo correspondientes a K16-57C[pYE-630], K16-57C[pYE-640], K16-57C[pYE-650], K16-57C[pYE-660] y K16-57C[pYE-679] fueron aproximadamente 12 veces la de K16-57C[pYE-614], no mostrando ninguna diferencia en los rendimientos de Kex2 para el intervalo de KEX2-630 a KEX2-679.
Además, los rendimientos de Kex2 correspondientes a K16-57C[pYE-682] y K16-57C[pYE-688] fueron, respectivamente, 6 veces y 3,4 veces el de K16-57C[pYE-614], es decir, fueron menores en la región C-terminal más larga (Figura 25). No se detectó actividad de Kex2 en los sobrenadantes de cultivo de K16-57C[pYE-22m] y K16-57C[pYE-699].
Asimismo, los resultados de SDS-PAGE demostraron que los rendimientos correspondientes a Kex2-630, Kex2-640, Kex2-650, Kex2-660, Kex2-679, Kex2-682 y Kex2-688 también fueron mayores que para el Kex2-614, similar a las actividades de Kex2 (Figura 26).
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Ejemplo 10
(Invención)
Expresión de derivado secretor de Kex2 en Pichia pastoris
Los resultados del Ejemplo 8 demostraron que el derivado de Kex2 secretor Kex2-660 puede producirse en grandes cantidades en un sistema de expresión que use Candida boidinii como hospedante. La posibilidad de producir Kex2-660 con otra levadura metilotrófica se investigó usando un sistema de expresión con Pichia pastoris como hospedante (Kit Pichia Expression, Invitrogen Co.).
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1) Construcción de plásmido que expresa derivado secretor de Kex2 en hospedante Pichia pastoris (véanse las Figuras 11 y 27)
Se llevó a cabo una reacción PCR usando plásmido pYE-660, digerido con enzima de restricción EcoRI y en forma lineal, como plantilla y KM085 (SEQ ID NO: 36) y KM088 (SEQ ID NO: 37) como cebadores. El producto de purificación de la reacción se clonó en pCRII (Invitrogen Co.). El plásmido resultante se digirió con enzima de restricción EcoRI, para obtener un fragmento de ADN que consiste en el gen KEX2-660 con la posición de enzima de restricción EcoRI en ambos extremos.
El fragmento de ADN que contiene el gen KEX2-660 se insertó en la posición de enzima de restricción EcoRI del plásmido pHIL-D2 (Kit Pichia Expression), para obtener plásmido pHIL-660 que tiene el gen KEX2-660 insertado en una orientación que permite su expresión bajo promotor AOX (Figura 27).
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2) Producción de derivado secretor de Kex2 en Pichia pastoris
Se introdujo un fragmento que contiene el gen KEX2-660 obtenido mediante digestión del plásmido pHIL-660 con enzima de restricción NotI en GS115 de Pichia pastoris (his^{-}, AOX^{+}, Kit Pichia Expression), y se seleccionaron los transformantes GS115[pHIL-660], que crecieron en medio que no contiene histidina. A partir de estos, se obtuvieron 5 cepas GS115[pHIL-660](AOX^{-}) que no pudieron crecer únicamente con metanol como fuente de carbono. Éstas fueron cultivadas a continuación en medio BMMY, para obtener GS115[pHIL-660] nº 23 que presentó el mayor rendimiento de producción de Kex2.
Entonces se examinó el rendimiento de Kex2 de GS115[pHIL-660] nº 23. En primer lugar, se sembró una colonia en 10 mL de medio BMGY y se cultivó a 30ºC durante 2 días con agitación. Las células obtenidas mediante centrifugación de 10 mL del medio de cultivo fueron suspendidas en 2 mL de medio BMMY y se siguió con su cultivo a 25ºC durante 2 días con agitación, tras lo cual se midió la actividad de Kex2 del sobrenadante del cultivo. Como resultado, se descubrió que la producción de Kex2-660 era aproximadamente de 1350 kU (correspondiente a aproximadamente 160 \mug) por 1 mL de medio de cultivo.
Por tanto, se demostró que el Kex2-660 puede ser producido en grandes cantidades incluso en un sistema de expresión en el cual el hospedante es Pichia pastoris, una levadura metilotrófica diferente de la Candida boidinii.
La Figura 27 muestra el método de construcción del plásmido pHIL-660 que expresa Kex2-660 con Pichia pastoris como hospedante.
SEQ ID NO: 1
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2848
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Doble cadena
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
FUENTE:
\hskip1.5cm ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae
\hskip1.5cm CEPA: X2180-IB
SECUENCIA
2
3
4
5
6
SEQ ID NO: 2
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 139
TIPO DE SECUENCIA: Aminoácido
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
SECUENCIA
7
8
SEQ ID NO: 3
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 84
TIPO DE SECUENCIA: Aminoácido
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
SECUENCIA
9
SEQ ID NO: 4
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14
TIPO DE SECUENCIA: Aminoácido
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
SECUENCIA
10 
\newpage
SEQ ID NO: 5
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 40
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
11
SEQ ID NO: 6
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
12
SEQ ID NO: 7
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
13
SEQ ID NO: 8
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
14
SEQ ID NO: 9
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
15 
\newpage
SEQ ID NO: 10
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 40
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
16
SEQ ID NO: 11
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 40
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
17
SEQ ID NO: 12
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
18
SEQ ID NO: 13
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 40
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
19
SEQ ID NO: 14
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 40
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
20 
\newpage
SEQ ID NO: 15
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
21
SEQ ID NO: 16
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
22
SEQ ID NO: 17
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
23
SEQ ID NO: 18
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 46
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
24
SEQ ID NO: 19
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
25 
\newpage
SEQ ID NO: 20
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
26
SEQ ID NO: 21
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
27
SEQ ID NO: 22
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
28
SEQ ID NO: 23
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 36
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
29
SEQ ID NO: 24
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 30
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
30 
\newpage
SEQ ID NO: 25
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
31
SEQ ID NO: 26
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 34
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
32
SEQ ID NO: 27
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 30
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
33
SEQ ID NO: 28
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
34
SEQ ID NO: 29
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 45
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
35 
\newpage
SEQ ID NO: 30
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
36
SEQ ID NO: 31
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 26
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
37
SEQ ID NO: 32
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULAR: ADN sintético
SECUENCIA
38
SEQ ID NO: 33
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 42
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
39
SEQ ID NO: 34
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
40 
\newpage
SEQ ID NO: 35
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
41
SEQ ID NO: 36
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 37
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
42
SEQ ID NO: 37
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
43
SEQ ID NO: 38
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
44
SEQ ID NO: 39
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
45 
\newpage
SEQ ID NO: 40
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
46
SEQ ID NO: 41
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
47
SEQ ID NO: 42
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 31
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
48
SEQ ID NO: 43
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 31
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
49
SEQ ID NO: 44
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 30
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
50 
\newpage
SEQ ID NO: 45
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33
TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico
CATENARIEDAD: Cadena sencilla
TOPOLOGÍA: Lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
51

Claims (5)

1. Un proceso para la producción de una proteína con actividad enzimática de proteasa Kex2, que comprende las etapas de:
cultivar células de levadura metilotrófica transformadas con vector de expresión de levadura que comprende un ADN que codifica para proteína que presenta
(A) una secuencia de aminoácidos acortada cuyo extremo N es Met en la posición de aminoácido 1 y cuyo extremo C es un aminoácido entre el aminoácido 630 (inclusive) y el aminoácido 682 (inclusive) de la SEQ ID NO: 1, o
(B) una secuencia de aminoácidos acortada cuyo extremo N es Met en la posición de aminoácido 1 y cuyo extremo C es un aminoácido entre el aminoácido 630 (inclusive) y el aminoácido 682 (inclusive) de la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 se modifica mediante sustitución, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos en una región de dicha secuencia de aminoácidos acortada a partir del 630 (inclusive) y hasta el extremo C; y
recuperar la proteína con actividad enzimática de proteasa Kex2 a partir del cultivo.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la levadura metilotrófica es una levadura que pertenece a un género seleccionado entre Pichia, Hansenula y Candida.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la levadura metilotrófica se selecciona entre las especies Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y Candida boidinii.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ADN codifica para dicha secuencia de aminoácidos acortada de la reivindicación 1 parte (A).
5. Un proceso que comprende
- producir una proteína mediante un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y
- usar la proteína para la escisión de un péptido deseado a partir de una proteína quimérica, permitiendo que la proteína actúe sobre una proteína quimérica que contiene el péptido deseado y la secuencia Arg-Arg, Lys-Arg o Pro-Arg posicionada adyacente al extremo N del péptido deseado, para obtener el péptido deseado.
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