ES2312457T3 - Proceso para enumerar e identificar microorganismos. - Google Patents

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ES2312457T3 ES01951153T ES01951153T ES2312457T3 ES 2312457 T3 ES2312457 T3 ES 2312457T3 ES 01951153 T ES01951153 T ES 01951153T ES 01951153 T ES01951153 T ES 01951153T ES 2312457 T3 ES2312457 T3 ES 2312457T3
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Abstract

Un proceso para enumerar e identificar microorganismos, que comprende: (a) filtrar una muestra líquida a través de una membrana apropiada para la retención de microorganismos, (b) incubar dicha membrana con cualquier microorganismo, (c) aplicar un análisis de enumeración a la superficie de dicha membrana para enumerar las colonias de microorganismos que están presentes y contar el número presente, (d) aplicar una hibridación de PNA a dicha membrana para determinar la presencia/ausencia de uno o más microorganismos especificados, y contar el número detectado, y (e) emparejar los organismos encontrados por dicho análisis de enumeración con las ubicaciones de las colonias de organismos encontrados por dicha etapa de hibridación de PNA y eliminar aquellas ubicaciones encontradas por la hibridación de PNA que no corresponden con las ubicaciones encontradas por el análisis de enumeración.

Description

Proceso para enumerar e identificar microorganismos.
La presente invención se refiere a un proceso para enumerar y luego identificar microorganismos. Más particularmente, se refiere a un proceso para enumerar e identificar microorganismos sobre un dispositivo de membrana.
Antecedentes de la invención
El método tradicional para determinar la presencia o ausencia de microorganismos en líquidos como agua, productos alimentarios como zumos, o medicamentos, ha sido filtrar el líquido a través de una membrana apropiada para atrapar cualquier microorganismo presente en el líquido sobre la superficie de la membrana. Después, la membrana se coloca en una placa de medio de crecimiento, como una Placa Petri rellena de agar u otro medio apropiado y después se incuba durante varios días para permitir el desarrollo de colonias de los organismos capturados. Después, las placas se eliminan y se examinan visualmente para que pueda contarse el número de colonias presentes. Si el número es lo suficientemente alto se pueden realizar más análisis para determinar exactamente qué organismos están presentes. (Normalmente, la mera presencia de organismos no es, en sí, un indicador de que el líquido es peligroso y se requiere más trabajo para identificar los organismos especificados).
Recientemente, se han introducido análisis moleculares como matrices de ADN, amplificación de ácidos nucleicos y secuenciación de ácidos nucleicos. La identificación tradicional se hace utilizando medios de selección y una variedad de análisis bioquímicos.
Se conoce que la simple enumeración de dichos organismos puede agilizarse utilizando un análisis de ATP-bioluminiscencia, como el que se enseña en la Patente de EE.UU. 5.627.042.
También se ha sugerido que se pueden utilizar los ensayos de sonda PNA para detectar la presencia y el número de microorganismos especificados. Véase la Patente de EE.UU. 5.773.571. Un inconveniente para el uso de este sistema es la presencia de puntos que no provienen de la presencia de microorganismos (falsos positivos). Algo, aún no determinado, causa la generación de una señal que indica la presencia de un organismo diana que, cuando se investiga más a fondo, revela que, de hecho, no hay organismo presente en ese lugar. Probablemente, esto está causado por la unión no específica de moléculas sonda a las membranas. Esto hace inútil el análisis por ser poco fiable, e incluso a menudo, la detección de un organismo diana es lo suficientemente fallida en el fluido que está siendo analizado.
Además, ninguno de estos análisis han sido capaces de detectar la presencia de bajos niveles de organismos contaminantes en grandes volúmenes de líquido, e identificar rápidamente los organismos de incumbencia con la misma muestra y en un tiempo relativamente corto.
La presente invención proporciona dicho proceso.
US-A-5 624 815 describe un método para analizar material sólido en una muestra líquida que comprende las etapas de: distribuir equitativamente la muestra por paso a través de un número de pocillos diferenciados adaptados para retener el material sólido, la concentración de material sólido siendo tal que esté ausente en, al menos, un pocillo; y analizar los pocillos para la presencia de material sólido retenido. US-A-5 624 815 también describe un instrumento adaptado pasa su uso en un método para analizar material sólido en una muestra líquida cuyo instrumento comprende la combinación de: un contenedor para la muestra; una unidad que comprende un número de pocillos diferenciados adaptados para retener el material sólido y permitir el paso de líquido bajo la aplicación de presión reducida; estructura para extraer líquido del contenedor y a través de los pocillos bajo presión reducida; y un colector u otro elemento que proporcione distribución uniforme de la muestra que pasa del contenedor a los pocillos.
K. F. Reineke y cols., "Direct enumeration of enteric bacteria in food, beverages and water in situ hybridisation to 16S ribosomal RNA", Abstracts of the General Meeting of the American Society For Microbiology, Vol. 99, 1999, page 516, XP002199783. 99^{th} General Meeting of the American Society for Microbiology describe que se utilizó una sonda de oligonucleótido fluorescente, complementaria a una secuencia de ARN ribosomal 16S de Escherichia coli publicada para dirigir la cuantificación de células por una hibridación in situ sobre filtros de membrana.
WO-A-99/55916 describe métodos, kits y composiciones apropiadas para la detección mejorada, cuantificación y análisis de secuencias diana de ácido nucleico utilizando ensayos de hibridación basados en sondas.
EP-A-0 760 008 describe sondas de ácido nucleico específicas de péptido (PNA) para detectar una enfermedad transmitida sexualmente causada por Neisseria gonorrhoeae o Chlamidia trachomatis, que comprende unidades de N-(2-aminoetil) glicina en enlace amida con la nitrógeno glicina conectada a nucleobases naturales o nucleobases no naturales por un enlazador carbonil metileno y dichas pruebas capaces de hibridar con ARNr 16S o 23S o ADNr de Neisseria gonorrhoeae o Chlamidia trachomatis. PNA es una molécula muy estable con una afinidad muy alta por ácido nucleico, permitiendo que una sonda PNA sea más corta que las sondas convencionales de ácido nucleico.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un proceso para la enumeración e identificación de especies específicas de microorganismos en grandes volúmenes de líquido utilizando primero un análisis de enumeración como un ensayo de ATP-bioluminiscencia o un análisis de indicación de fluorescencia para enumerar el número total de organismos y después, un ensayo de sonda PNA o ensayos para determinar la presencia de organismos seleccionados o diana. Un atributo clave del presente proceso es que, en ambos análisis, se utiliza la misma muestra de membrana y de organismos. Esto permite la rápida detección e identificación de organismos presentes, sólo haciendo e incubando una muestra para ambos análisis. Además, utilizando la misma muestra y membrana para ambos análisis, se puede eliminar cualquier falso positivo, comparando las ubicaciones de los organismos indicados por cada análisis relativo a una o más marcas de registro y eliminando aquellas que no aparecen en el mismo lugar en ambos análisis.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso para enumerar e identificar microorganismos.
La presente invención proporciona un proceso para enumerar y identificar microorganismos, que comprende:
(a) filtrar una muestra líquida a través de una membrana apropiada para la retención de microorganismos, (b) incubar la membrana con cualquier microorganismo, (c) aplicar un análisis de enumeración a la superficie de la membrana para enumerar las colonias de microorganismos que están presentes y contar el número presente, (d) aplicar una hibridación de PNA a la membrana para determinar la presencia/ausencia de uno o más microorganismos especificados, y contar el número detectado, y (e) emparejar los organismos encontrados por el análisis de enumeración con las ubicaciones de las colonias de organismos encontrados por la etapa de hibridación de PNA y eliminar aquellas ubicaciones encontradas por la hibridación de PNA que no corresponden con las ubicaciones encontradas por el análisis de enumeración.
En los dibujos
La Figura 1 muestra un diagrama bloque de una realización preferida de la presente invención.
Descripción detallada de la especificación
La presente invención se relaciona con un proceso para la rápida enumeración e identificación de microorganismos en líquidos o sólidos solubles como polvos, sales, cremas, pastillas, etc. Dichos fluidos incluyen, pero no se limitan a, agua, potable o no, lácteos como leche, cerveza, vino, refrescos, zumos de frutas, medicamentos, parenterales, contadores de aire bacterianos, etc.
La Figura 1 muestra un proceso preferido de acuerdo a la presente invención. En este proceso, como la primera etapa 1, se obtiene una muestra, en forma líquida, del producto a ser diagnosticado. Por ejemplo, en muestras medioambientales, como una fuente de agua, se obtiene una muestra de agua de río, manantial o embalse. Para un producto alimenticio o farmacéutico, se toma una muestra de la mercancía (típicamente es la mercancía terminada, aunque no tiene por qué). Si es en forma líquida, simplemente se utiliza como tal o, si es necesario debido a la viscosidad, se puede diluir con agua desionizada. Si es en forma sólida, se disuelve o dispersa en un líquido apropiado, típicamente agua o una solución amortiguadora u otro medio cualquiera que no mate o estrese excesivamente a los organismos presentes.
Después, en la segunda etapa 2, se filtra a través de un filtro de membrana y luego, el filtro se coloca sobre un medio de crecimiento como agar (típicamente contenido en una Placa Petri) y se incuba como en la tercera etapa 3 para permitir surgir a las micro-colonias (visibles utilizando ATP bioluminiscencia e imagen, pero no visibles a ojo) de los organismos atrapados.
Un instrumento preferido para sujetar el filtro es un filtro embudo MILLIFLEX^{TM} que tiene 50 mm de diámetro y 100 ml de capacidad, disponible en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets. En su lugar, también se pueden usar otras membranas de sujeción como filtros de sujeción o embudos de cristal o acero inoxidable. Dichos instrumentos son bien conocidos y están disponibles en una variedad de fuentes que incluyen Millipore Corporation de Bedford, Massachussets y Fisher Scientific, Inc, de Pittsburg, Pennsylvania. Una membrana preferida es un filtro MicroStar^{TM}, disponible en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets. Este filtro es un filtro de PVDF de un tamaño de poro nominal de 0,45, que tiene una serie de compartimentos hidrofílicos separados por divisiones hidrofóbicas que se extienden a lo largo la toda la profundidad del filtro. Otros filtros que son útiles es esta invención incluyen filtros EZ-Pak^{TM}, filtros S-Pak^{TM}, filtros S-Pak^{TM} Plus y filtros AO^{TM} o SO^{TM}, disponibles en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets.
En la tercera etapa 3, se incuba el filtro/medio de cultivo durante un corto periodo de tiempo, típicamente de 1 a aproximadamente 24 horas. La duración de incubación depende de la precisión necesitada por el análisis, la relación de crecimiento de los microorganismos a detectar, el estrés al que el organismo está sujeto (a mayor estrés impuesto, mayor tiempo de incubación necesario), del tipo de organismo a detectar y de la sensibilidad del análisis utilizado para determinar la presencia de ese organismo (a menor sensibilidad del análisis, mayor tiempo de incubación para asegurar que la colonia del organismo diana ha crecido a un tamaño apropiado), la rapidez deseada del análisis frente a la precisión de los resultados de los análisis y otros muchos factores. La temperatura de incubación puede ser de aproximadamente la temperatura ambiente (24ºC) a aproximadamente 40ºC. Se pueden usar temperaturas más altas o más bajas dependiendo del (los) organismo(s) que se desean detectar y de sus temperaturas óptimas de incubación.
Se debería entender que los ensayos aquí dirigidos con ambos análisis de enumeración y de PNA son sobre micro-colonias de microorganismos que se desarrollan a partir de una sola célula capturada en la membrana, es decir, se enumera el número de organismos individuales en una muestra analizada por detección de colonias que surgen por crecimiento por división de aquellos mismos organismos individuales, más que por detección directa de organismos individuales.
Tras un periodo de incubación apropiado para el filtro sobre el medio, el filtro se extrae del medio, se seca, luego se rocía con reactivos, y se somete a un análisis de enumeración 4.
Un análisis de enumeración preferido es un análisis ATP/bioluminiscencia. En dicho análisis, la muestra se expone a un agente permeabilizante apropiado, como el agente de liberación de ATP del kit de reactivos MicroStar (RMLL00000) disponible en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets. Luego, el ATP se detecta por el uso de un reactivo de bioluminiscencia, como un Reactivo de Bioluminiscencia del kit de reactivos de MicroStar, disponible en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets. Después, la luminiscencia se lee visualmente o digitalmente por un aparato de imagen, como una cámara CCD con procesador de imagen. Dicho sistema se vende como sistema MicroStar^{TM}, disponible de Millipore Corporation de Bedford, Massachussets. Con cualquier medio utilizado, se puede realizar el recuento y la ubicación de las colonia microbianas detectadas.
De forma alternativa, uno puede utilizar el proceso de la Patente de EE.UU. 5.627.042. En este proceso, el ATP se extrae de un organismo vivo sobre una membrana por el uso de un agente de extracción como NRB^{TM} disponible en Lumac, Co. y después, se somete a un agente de bioluminiscencia como Lumit-PM^{TM} de Lumac Co.. Luego, se mide la luminiscencia en un instrumento que detecta y graba la localización de la luz emitida por la reacción ATP/reactivo. Sin embargo, no se prefiere este proceso debido a que actualmente rompe la pared celular, derramando su contenido sobre la superficie de la membrana. Aunque la membrana tiene partes hidrofóbicas, no se garantiza que alguna contaminación cruzada no las tenga.
Una alternativa más es usar un sistema para enumeración que no dependa de la detección de ATP, pero que utilice algún otro mecanismo para determinar la presencia y el número de organismos. Dicho sistema es ScanRDI disponible en Chemunex. En lugar de usar ATP, se utiliza una etiqueta fluorescente que es absorbida por los organismos (análisis de absorción de etiqueta fluorescente) y luego se detecta bajo luz fluorescente.
Tras el análisis de enumeración, la muestra se somete a un ensayo de sonda PNA 5 para los organismos diana. Las sondas PNA son sondas de ácido nucleico peptídicas (más que sondas basadas en ADN) y se diseñan para entrar en la célula e hibridar con una porción seleccionada de una hebra de ARN o ADN de la célula. Deben ser diseñadas de tal forma que hibriden específicamente sólo con una sola especie o con un género entero. Las sondas contienen una etiqueta como una enzima, hapteno, fluoróforo o radioisótopo que indica su presencia en la célula. Dichas sondas están disponibles en una variedad de fuentes que incluyen Sondas Boston, incorporadas para Bedford, Massachussets bajo nombres comerciales como sondas Eco06^{TM} para la detección de E. Coli y sondas BacUni^{TM} para la simple detección de todas las bacterias. El método para hacer y utilizar dichas sondas se enseña en las Patentes de EE.UU. 5.714.331; 5.736.336; 5.773.571; 5.912.145 y 5.985.563 y en las solicitudes de PCT publicadas WO 98/24933 y 99/49293.
En esta etapa, los organismos sobre el mismo filtro, se someten de nuevo a agentes de permeabilización y fijación como etanol y glutaraldehido, y se aplican sondas PNA a las células permeables. Se pueden seleccionar una o más sondas PNA para detectar una o más especies de organismos. Algunas existen para organismos individuales como E. Coli o Salmonella sp., L. Brevis, etc, mientras que otras son más universales y simplemente detectan la presencia de bacterias o levaduras u hongos. Tras la aplicación de la(s) sonda(s), se permite reposar a la membrana durante un periodo de tiempo, típicamente 10 minutos a 1 hora y luego se lava para eliminar cualquier sonda no hibridada. Dependiendo de las sondas seleccionadas y del método utilizado para incorporar una etiqueta detectable sobre ésta, se puede usar una película de rayos X, una película instantánea, fluorescencia, colorimetría o cualquier otro instrumento para detectar la presencia de la etiqueta de las sondas que se han hibridado al ADN o ARN del organismo y con ello, identificar el número y tipo de cada organismo diana presente.
Se prefiere utilizar un material quimioluminiscente y después, detectar la presencia de la luz química por una fotografía o un aparato digital que graba imágenes como el sistema MicroStar^{TM} disponible por Millipore Corporation de Bedford, Massachussets.
En esta realización, tras haber completado las etapas de enumeración y de la sonda PNA, los resultados de cada análisis se comparan entre sí para determinar si hay indicios de colonias de organismos en un análisis en una cierta ubicación que no se encuentren en la misma ubicación con el otro análisis. Esto permite que se determine cualquier falso positivo de los resultados. Esto es particularmente verdadero con el análisis de sonda PNA que a veces identifica una ubicación como que contiene una colonia de un organismo cuando mas análisis indican que no hay colonia presente en esa ubicación. Los medios más simples para realizar este uso es el sistema MicroStar^{TM} disponible en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets y superponer o ver en paralelo las dos imágenes. De forma alternativa, se puede utilizar un programa de software para comparar automáticamente los dos resultados de los análisis y descartar cualquier mancha que no se encuentre en la misma ubicación en ambos análisis.
Esto es particularmente útil en aplicaciones donde se requiere o desea la enumeración e identificación de microorganismos.
Ejemplo
Se realizaron los análisis para determinar si los presentes procesos pueden ser utilizados para enumerar y distinguir don microorganismos estrechamente relacionados, Escherichia coli y Salmonella choleraesuis.
Se diluyeron cultivos puros de Escherichia coli y Salmonella choleraesuis a unas 50 unidades formadoras de colonias estimadas por 100 \mul en una solución salina estéril al 0,85%. Algunos de los dos cultivos se mezclaron y filtraron como una mezcla mientras que el resto se filtró de forma separada a través de discos de filtro MicroStar^{TM} en un embudo filtro de cristal, ambos disponibles en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets.
Las membranas se incubaron durante seis horas. Las membranas de cada conjunto (tanto mezcladas como de organismos individuales) se sometieron a un ensayo de enumeración ATP-bioluminiscencia utilizando el kit de Reactivos de MicroStar^{TM} RMLL00000 disponible en Millipore Corporation de Bedford, Massachussets para determinar el número de colonias sobre cada membrana. También se almacenaron muestras de cada conjunto en placas de medio de crecimiento tradicional y se incubaron durante toda la noche a 30ºC.
Luego, las mismas membranas se sometieron a un ensayo de sonda PNA utilizando sondas Eco06^{TM} específica de E. Coli disponibles en Sondas Boston, Inc. de Bedford, Massachussets y a un ensayo de sonda PNA para detectar todas las bacterias, incluyendo las dos utilizadas en este análisis (sondas BacUni^{TM} disponibles en Sondas Boston, Inc. de Bedford, Massachussets).
En las membranas donde la mezcla de organismos se filtró sobre la misma membrana, el número de colonias detectadas utilizando la sonda PNA específica para E. Coli igualó el número de células de E. Coli filtradas, mientras que las colonias observadas con la sonda universal de bacterias igualó a la suma de ambos organismos presentes.
Por el contrario, se detectaron números equivalentes de colonias sobre las membranas que filtraron sólo la E. Coli, usando cualquier sonda. Las membranas que solo filtraron S. Choleraesuis sólo podían ser detectadas utilizando la sonda universal.
De forma adicional, los organismos detectados por las sondas PNA se emparejaron, en las localizaciones encontradas, por el ensayo de ATP-bioluminiscencia con el fin de eliminar cualquier falso positivo causado por la membrana o su contaminación.
Estos resultados eran consistentes con los números de colonias detectadas por los ensayos de ATP o sobre placas de crecimiento control. Esto demuestra que una especie microbiana específica puede ser detectada y enumerada utilizando una combinación de ensayos de sondas de ATP y PNA sobre la membrana.

Claims (10)

1. Un proceso para enumerar e identificar microorganismos, que comprende:
(a) filtrar una muestra líquida a través de una membrana apropiada para la retención de microorganismos, (b) incubar dicha membrana con cualquier microorganismo, (c) aplicar un análisis de enumeración a la superficie de dicha membrana para enumerar las colonias de microorganismos que están presentes y contar el número presente, (d) aplicar una hibridación de PNA a dicha membrana para determinar la presencia/ausencia de uno o más microorganismos especificados, y contar el número detectado, y (e) emparejar los organismos encontrados por dicho análisis de enumeración con las ubicaciones de las colonias de organismos encontrados por dicha etapa de hibridación de PNA y eliminar aquellas ubicaciones encontradas por la hibridación de PNA que no corresponden con las ubicaciones encontradas por el análisis de enumeración.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde la muestra líquida es de 50 a 1000 mililitros, la membrana se selecciona del grupo que consiste en membrana de PVDF que tiene zonas hidrofílicas separadas por divisiones hidrofóbicas, las membranas se incuban durante 1 a 24 horas a una temperatura de aproximadamente 24ºC a aproximadamente 40ºC y el análisis de enumeración se selecciona del grupo que consiste en un análisis ATP-bioluminiscencia y un análisis de absorción de etiqueta fluorescente.
3. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, donde el análisis de enumeración es un análisis de ATP/bioluminiscencia y se lee por un sistema de imagen digital.
4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la etapa de hibridación de PNA se lee por un proceso seleccionado entre el grupo que consiste en película de rayos X, película instantánea, detección visual de una reacción colorimétrica sobre la membrana, detección visual de una etiqueta fluorescente o por imagen digital.
5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que, adicionalmente comprende entre las etapas (b) y (c) una etapa (b1) de registro de membrana con el fin de indicar un punto específico a lo largo de un borde de la membrana, y tras la etapa (d) una etapa (e) de emparejamiento de los organismos encontrados por el análisis de enumeración de las ubicaciones de los organismos encontrados por los ensayos de sonda PNA por el uso de una marca de registro.
6. El proceso de la reivindicación 5, donde la muestra líquida es de 50 a 1000 mililitros, la membrana se selecciona del grupo que consiste en membrana de PVDF que tiene zonas hidrofílicas separadas por divisiones hidrofóbicas y las membranas se incuban de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 24ºC a aproximadamente 40ºC.
7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde las membranas se incuban de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 horas.
8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el análisis de enumeración es una etapa de ATP/bioluminiscencia que se lee por un sistema de imagen digital.
9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde la etapa de la sonda PNA se lee por un proceso seleccionado del grupo que consiste en película de rayos X, película instantánea, detección visual de una reacción colorimétrica sobre la membrana, detección visual de una etiqueta fluorescente o por imagen digital.
10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, donde el análisis de enumeración es un análisis de absorción de etiqueta fluorescente.
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