ES2312630T3 - Composiciones de emulsion. - Google Patents
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Abstract
Emulsión que comprende un surfactante, una fase hidrófoba y una fase hidrófila que comprende una pluralidad de microcápsulas que contienen un sistema funcional de expresión eucariótico in vitro, en el que el surfactante es un surfactante químicamente inerte a base de silicona.
Description
Composiciones de emulsión.
La presente invención se refiere, inter
alia, a emulsiones adecuadas para la compartimentación de las
reacciones de transcripción/traducción y a procedimientos que
utilizan dichas emulsiones. En particular, las emulsiones son
útiles para compartimentar las reacciones eucarióticas de
transcripción/traducción in vitro.
Recientemente se han desarrollado procedimientos
de compartimentación a base de emulsiones
agua-en-aceite con el fin de
utilizarlas en procedimientos de selección de repertorio (Tawfik
& Griffiths 1998, Ghadessy et al 2001). La
compartimentación segrega genes individuales y sus productos
codificados (ya sea administrados mediante células (Ghadessy et
al., 2001) o expresados in situ (Tawfik & Griffiths,
1998)) en compartimentos acuosos, discretos, físicamente separados,
asegurando así la conexión de genotipo y fenotipo durante el
procedimiento de selección.
El documento WO99/02671 describe un
procedimiento de aislamiento de uno o más elementos genéticos
codificantes de un producto génico con una actividad deseada.
Primero se compartimentan los elementos genéticos en microcápsulas,
que preferentemente se forman por emulsificación y a continuación se
transcriben y/o traducen con el fin de generar los productos
génicos respectivos (ARN o proteína) en el interior de las
microcápsulas. Por el contrario, los elementos genéticos pueden
estar comprendidos en las microcápsulas de la emulsión y la
transcripción y/o traducción (expresión) del producto génico puede
tener lugar en el interior de éstas utilizando la maquinaria
celular. Los elementos genéticos que generan el producto génico con
la actividad deseada se pueden separar a continuación. Por ejemplo,
en algunos casos la separación puede producirse debido a que la
actividad deseada induce un cambio en la microcápsula. En otros
casos la separación puede ser consecuencia de que la actividad
deseada induce un cambio en el elemento genético.
El procedimiento dado a conocer en el documento
WO99/02671 funciona bien con bacterias. Aunque la estrategia de
compartimentación subcelular pueda extenderse en principio para
comprender las células eucarióticas, por ejemplo, las levaduras,
células de insecto o mamífero, en algunas aplicaciones sería
deseable proporcionar la expresión in situ directamente en
microcápsulas utilizando un sistema de transcripción/traducción
eucariótico in vitro.
Se ha informado del éxito de la expresión de un
enzima eucariótico, metilasa Hae, utilizando una emulsión de
extracto S30 bacteriano (Tawfik D. & Griffiths A.D. 1998). Sin
embargo, dichos procedimientos no son adecuados para algunas
proteínas de interés, por ejemplo, proteínas grandes multidominio y
ribonucleoproteínas que frecuentemente no se pueden expresar en
forma funcional utilizando extractos bacterianos.
Por consiguiente, se puede observar que un
procedimiento que permita la expresión in situ directamente
en microcápsulas utilizando un sistema de transcripción/traducción
eucariótico in vitro proporcionaría una contribución en la
técnica.
En consecuencia, en un primer aspecto de la
presente invención, se proporciona una emulsión que comprende un
surfactante, una fase hidrófoba y una fase hidrófila que comprende
una pluralidad de microcápsulas que comprenden un sistema de
expresión eucariótico in vitro, en el que dicho surfactante
es un surfactante a base de silicona químicamente inerte.
Durante el desarrollo de dicho procedimiento,
los inventores encontraron repetidamente problemas para el
mantenimiento de la capacidad para una eficaz
transcripción/traducción de un sistema eucariótico, en particular
del sistema de reticulocito de conejo lisado en emulsión. Tal como
se describe más adelante, las múltiples modificaciones de las
composiciones de emulsión utilizadas con los sistemas de expresión
eucarióticos no tuvieron éxito en conferir dicha capacidad. Sin
embargo, fue sorprendente descubrir que, cuando se utilizaron
surfactantes de silicona químicamente inertes en las composiciones
de emulsión, la eficacia de la transcripción de los sistemas de
transcripción/traducción eucarióticos mejoró notablemente.
La emulsión permite la conexión del genotipo y
el fenotipo debido a la compartimentación del sistema de expresión
eucariótico, a la vez que evita muchas de las desventajas de los
sistemas a base de células. Así, por ejemplo, permite que los
productos génicos se obtengan sin la necesidad de extracción o
secreción de las células.
En consecuencia, en un segundo aspecto de la
presente invención, se proporciona un procedimiento de aislamiento
de uno o más elementos genéticos que codifican el producto génico
con la actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas formadas a partir de la emulsión de la presente invención,
- (b)
- expresar los elementos genéticos con el fin de preparar los productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas;
- (c)
- separar los elementos genéticos que producen los productos génicos con la actividad deseada.
En un tercer aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento destinado a preparar un producto
génico, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- preparar un elemento genético codificante del producto génico;
- (b)
- compartimentar elementos genéticos en microcápsulas formadas a partir de una emulsión de la presente invención;
- (c)
- expresar los elementos genéticos con el fin de preparar los respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas;
- (d)
- separar los elementos genéticos que producen los productos génicos con la actividad deseada; y
- (e)
- expresar los productos génicos con la actividad deseada.
Según este aspecto de la presente invención, la
etapa (a) preferentemente comprende preparar un repertorio de
elementos genéticos, en el que cada elemento genético codifica el
producto génico potencialmente diferente. Los repertorios se pueden
generar mediante procedimientos convencionales, tales como los
utilizados en la generación de bibliotecas destinadas a la
selección mediante procedimientos tales como el despliegue en fagos.
Los productos génicos provistos de la actividad deseada se pueden
seleccionar de entre los repertorios, según la presente
inven-
ción.
ción.
Un cuarto aspecto de la presente invención
proporciona un producto seleccionado mediante la utilización del
procedimiento del segundo aspecto de la presente invención destinado
o preparado según el tercer aspecto de la presente invención. Tal
como se utiliza en la presente memoria, un "producto" se
refiere al producto génico seleccionado o preparado según este
aspecto, o el elemento genético (o la información genética
comprendida en el mismo).
Se describe asimismo un procedimiento destinado
a cribar un compuesto o compuestos capaces de modular la actividad
del producto génico, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- preparar un repertorio de elementos genéticos codificantes del producto génico;
- (b)
- compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas formadas a partir de una emulsión de la presente invención;
- (c)
- expresar los elementos genéticos con el fin de preparar los respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas;
- (d)
- separar los elementos genéticos que producen los productos génicos provistos de la actividad deseada; y
- (e)
- poner en contacto el producto génico provisto de la actividad deseada con el compuesto o compuestos y seguir la modulación de una actividad del producto génico por el compuesto o compuestos.
En el contexto de la presente invención, se
considera que un surfactante es "químicamente inerte" si está
sustancialmente libre de especies oxidantes, tales como peróxidos y
aldehídos y especies desnaturalizantes de las proteínas. Se
consideran "sustancialmente libre" de especies oxidantes y
especies desnaturalizantes a los surfactantes 40%, preferentemente
50%, más preferentemente 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% menos de
especies oxidantes y especies desnaturalizantes de las proteínas
que cualquiera de entre el monooleato de sorbinato convencional
(Span®80; ICI) y el emulgente monooleato de polioxietilensorbitano
(Tween® 80; ICI).
En la presente memoria se utilizan los términos
"aislando", "separando" y "seleccionando", así como
también las variaciones de los mismos. Aislamiento, según la
presente invención, se refiere a un procedimiento de separación de
una entidad de una población heterogénea, por ejemplo, una mezcla,
de tal modo que queda libre de por lo menos una sustancia con la
que se encontraba asociada antes del procedimiento de aislamiento.
En una forma de realización preferida de la presente invención,
aislamiento se refiere a la purificación de una entidad
esencialmente hasta la homogeneidad. Separación de una entidad se
refiere a un procedimiento de aislar preferentemente las entidades
deseadas de las entidades no deseadas. En lo que se refiere al
aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislando"
y "separando" son equivalentes. El procedimiento de la presente
invención permite la separación de los elementos genéticos deseados
de un conjunto (librerías o repertorios) de elementos genéticos que
comprenden el elemento genético deseado. En la presente invención
"seleccionando" se utiliza con el fin de significar el
procedimiento (incluyendo el procedimiento de separar) de aislar una
entidad según una propiedad particular del mismo.
En una forma de realización preferida de los
procedimientos de la presente invención, la separación de elementos
genéticos se puede realizar mediante uno de entre esencialmente
cuatro procedimientos, cuyos detalles se dan a conocer en el
documento WO99/02671.
- (I)
- En una primera forma de realización, las microcápsulas se separan según una actividad del producto génico o un derivado del mismo que hace que las microcápsulas sean detectables en conjunto. En consecuencia, la invención proporciona un procedimiento según el segundo aspecto de la presente invención en el que el producto génico con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula, o una modificación de una o más moléculas en el interior de la microcápsula, que permite la separación de la microcápsula que comprende el producto génico y el elemento genético que lo codifica. En esta forma de realización, por consiguiente, las microcápsulas se separan físicamente entre sí según la actividad del producto génico expresado a partir del elemento genético comprendido en ellas, lo que hace posible enriquecer selectivamente las microcápsulas que comprenden los productos génicos con la actividad deseada.
- (II)
- En una segunda forma de realización, los elementos genéticos se separan después de la acumulación de las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, el producto génico con la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica (y que reside en la misma microcápsula) de tal modo que la hace seleccionable en una etapa siguiente. Las reacciones se detienen y las microcápsulas se abren de modo que se acumule el contenido de las microcápsulas individuales. La selección de los elementos genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el producto génico con la actividad deseada. En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento según el segundo aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) el producto génico con la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica con el fin de permitir el aislamiento del elemento genético. Se deberá entender, evidentemente, que la modificación puede ser directa, producida por la acción directa del producto génico sobre el elemento genético, o indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las cuales implica el producto génico que tiene la actividad deseada, conducen a la modificación del elemento genético.
- (III)
- En una tercera forma de realización, los elementos genéticos se separan después de acumular las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un gen con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que comprende el producto génico y el elemento genético que lo codifica. Este cambio, cuando se detecta, dispara la modificación del gen en la microcápsula. Las reacciones se detienen y se rompen las microcápsulas de modo que se acumula todo el contenido de las microcápsulas individuales. La selección de los elementos genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el (los) producto(s) génico(s) con la actividad deseada. En consecuencia, la invención proporciona un procedimiento según un segundo aspecto de la presente invención, en el que en la etapa (b) el producto génico con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que se detecta y dispara la modificación del elemento genético en la microcápsula de modo que permite su aislamiento. Se deberá entender que el cambio detectado en la microcápsula puede estar causado por la acción directa del producto génico, o por la acción indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las cuales implica el producto génico con la actividad deseada, conducen al cambio detectado.
- (IV)
- En una cuarta forma de realización, los elementos genéticos se pueden separar mediante un proceso de múltiples etapas, que implica por lo menos dos etapas, por ejemplo, con el fin de permitir la exposición de los elementos genéticos a unas condiciones que permitan que tengan lugar por lo menos dos reacciones diferentes. Tal como resultará evidente para los expertos en la materia, la primera etapa de encapsulación de la presente invención debe producir condiciones que permitan la expresión de los elementos genéticos - sea esta transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o similares. En estas condiciones, puede no ser posible seleccionar la actividad del producto génico en particular, por ejemplo, debido a que el producto génico puede ser inactivo en dichas condiciones, o porque el sistema de expresión comprenda una actividad interferente. La presente invención, por consiguiente, proporciona un procedimiento según un segundo aspecto de la presente invención, en el que la etapa (b) comprende expresar los elementos genéticos con el fin de preparar los respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas, conectando los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican y aislando los complejos así formados. Esto permite aislar los elementos genéticos y los productos génicos asociados a ellos de las microcápsulas antes de que tenga lugar la separación según el producto génico. En una forma de realización preferida, los complejos se someten a una etapa adicional de compartimentación antes de aislar los elementos genéticos que codifican el producto génico con la actividad deseada. Esta etapa de compartimentación adicional, que tiene lugar ventajosamente en las microcápsulas, permite la realización de reacciones adicionales, en diferentes condiciones, en un ambiente en el que los elementos genéticos y sus productos respectivos están físicamente conectados. La separación eventual de los elementos genéticos se puede realizar según las anteriores formas de realización (I), (II) o (III).
También se puede realizar la "encapsulación
secundaria" con los elementos genéticos conectados a los
productos génicos mediante otros procedimientos, tales como
mediante despliegue en fagos, despliegue en polisomas, fusión de
ARN-péptido o fusión de represor
lac-péptido.
\newpage
El (los) elemento(s) genético(s)
seleccionado(s) también se puede(n) someter a ciclos
siguientes, posiblemente más astringentes de separación en etapas
reiterativamente repetidas, reaplicando el procedimiento de la
invención en su totalidad o en solamente etapas seleccionadas.
Mediante el ajuste de las condiciones adecuadas, se pueden aislar,
después de cada ciclo de selección, elementos genéticos que
codifican productos génicos con actividades más optimizadas.
Además, los elementos genéticos aislados después
del primer ciclo de separación se pueden someter a mutagénesis
antes de repetir la separación mediante repeticiones reiteradas de
las etapas del procedimiento de la presente invención según se ha
descrito anteriormente. Después de cada ciclo de mutagénesis,
algunos elementos genéticos habrán sido modificados de tal modo que
se habrá amplificado la actividad de los productos génicos.
Además, los elementos genéticos seleccionados se
pueden clonar en vectores de expresión con el fin de permitir una
caracterización adicional de los elementos genéticos y sus
productos. Los expertos en la materia conocen una pluralidad de
vectores adecuados. Los vectores pueden ser, por ejemplo, virus,
plásmidos o vectores de fago provistos de un origen de replicación,
opcionalmente un promotor para la expresión del elemento genético y
opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden
comprender un marcador genético seleccionable, por ejemplo, el gen
de resistencia a la neomicina para los vectores de mamíferos.
La Figura 1 muestra emulsiones formadas mediante
la mezcla de una fase oleosa con un lisado de reticulocitos de
conejo (RRL) durante 1,5 minutos y fotografiado en el espectro
visible después de 15 minutos de incubación a 30ºC. De izquierda a
derecha: 1) mezcla CSR, 2) mezcla CSR + DTT, 3) 1,5% Span® 80 en
aceite mineral, 4) 1,5% Span® 80 en aceite mineral + DTT, 5) 4%
Abil EM90, 6) 4% Abil EM90 + DTT.
La Figura 2 muestra la imagen en modo de
contraste de fase de una emulsión de 4% Abil EM90 en aceite mineral.
La distancia entre las barras es de 10 \mum.
La Figura 3 muestra los resultados de expresión
de telomerasa:
Panel A (no emulsionado); Carril 1, hTERT (75
ng); Carril 2, hTR (75 ng); Carril 3, hTERT + hTR; Carril 4, sin
construcción; Carril 5, Construcción de expresión WT en secuencia
(150 ng); Carril 6, construcción de mutantes de deleción en
secuencia (150 ng).
Panel B: En emulsión, la anotación de los
carriles es como en el panel A.
Las emulsiones son sistemas heterogéneos de dos
fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersada en la
otra en forma de pequeñas gotas microscópicas o de tamaño coloidal
(Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1984). Las emulsiones de la
presente invención deben permitir la formación de microcápsulas.
Las emulsiones se pueden preparar a partir de
cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. La emulsión
de la presente invención presenta una fase hidrófila (que comprende
los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de
pequeñas gotas finamente divididas (la fase dispersa, interna o
discontinua) y una fase hidrófoba, líquido inmiscible (un aceite)
como matriz en la que las pequeñas gotas están suspendidas (la fase
no dispersa, continua o fase externa). Dichas emulsiones se refieren
como "agua-en-aceite" (W/O).
Esto tiene la ventaja de que toda la fase acuosa que comprende los
componentes bioquímicos está compartimentada en pequeñas gotas
discretas (la fase interna). La fase externa, siendo un aceite
hidrófobo, generalmente no comprende ningún componente bioquímico y
por consiguiente es inerte.
La preparación de una emulsión necesita
generalmente la aplicación de energía mecánica con el fin de forzar
la unión de las fases. Existe una pluralidad de formas para ello que
utilizan múltiples dispositivos mecánicos, que comprenden
agitadores (tales como barras magnéticas agitadoras, agitadores de
hélice y turbina, mecanismos de palas y batidoras),
homogeneizadores (que comprenden los homogeneizadores de rotor
estator, homogeneizadores de válvula de presión elevada y
homogeneizadores de chorro), molinos coloidales, aparatos
emulsificadores de ultrasonidos y de membrana (Becher, 1957;
Dickinson, 1994).
Es deseable que la emulsión sea estable durante
la incubación a 30ºC durante por lo menos una hora. En algunos
casos es preferible que también sea estable a temperaturas más
elevadas, especialmente si se utiliza termociclaje durante los
procedimientos de amplificación por PCR y otros.
Las emulsiones de la presente invención se
estabilizan mediante la adición de uno o más agentes de acción
superficial (surfactantes). Dichos surfactantes se refieren como
agentes emulgentes y funcionan en la interfase agua/aceite evitando
(o por lo menos retardando) la separación de las fases. Se pueden
utilizar muchos aceites y muchos emulgentes con el fin de generar
emulsiones de agua en aceite, una compilación reciente lista más de
16.000 surfactantes, muchos de los cuales se utilizan como
emulgentes (Ash y Ash, 1993).
Sin embargo, tal como se describe en los
Ejemplos, los surfactantes utilizados convencionalmente en las
aplicaciones de emulsiones tales como los surfactantes no iónicos
(Schick, 1966), por ejemplo, el monooleato de sorbitano (Span®80;
ICI) y el monooleato de polioxietilensorbitano (Tween®80; ICI) no
son adecuados para una expresión eucariótica in vitro eficaz
con lisado de reticulocitos de conejo.
Sin embargo, tal como se describe en la presente
memoria, dicha expresión se puede mantener cuando se utilizan
surfactantes a base de silicona químicamente inerte.
Preferentemente, el surfactante a base de
silicona químicamente inerte de la emulsión es
co-polímero de silicona.
Más preferentemente el surfactante comprende un
co-polímero de
polisiloxano-policetil-polietilenglicol
(Copoliol de cetildimeticona) por ejemplo Abil® EM90
(Goldschmidt).
El surfactante a base de silicona químicamente
inerte se puede proporcionar como el único surfactante en la
composición de emulsión o se puede proporcionar como uno de entre
múltiples surfactantes. Por ejemplo se puede utilizar una mezcla de
surfactantes diferentes.
En una forma de realización preferida, el
surfactante se proporciona a una concentración volumen/volumen en
la fase oleosa de la emulsión comprendida entre el 0,5 y el 20%,
preferentemente entre el 1 y el 10%, más preferentemente entre el 3
y el 5%.
En una forma de realización muy preferida, el
surfactante se proporciona a una concentración v/v en la fase
oleosa del 4%.
En una forma de realización muy preferida de la
presente invención, la emulsión se prepara mediante la adición gota
a gota de una fase acuosa a la fase oleosa en presencia de un
surfactante que comprende entre el 3 y el 5% (v/v) de copolímero
polisiloxano-policetil-polietilenglicol
en aceite mineral, preferentemente en una proporción de fase
oleosa:fase acuosa de 2,5:1.
El surfactante puede estar presente inicialmente
con la composición hidrófoba. Por consiguiente, una composición que
comprenda el surfactante y la composición hidrófoba representa un
aspecto adicional de la presente invención.
Por el contrario, el surfactante se puede añadir
en una etapa más adelante, por ejemplo, durante o después de
mezclar las fases hidrófoba e hidrófila.
En esta forma de realización, el surfactante se
puede proporcionar en un equipo, junto con la composición
hidrófoba. El equipo puede comprender además opcionalmente un
sistema de expresión eucariótico tal como lisado de reticulocitos
de conejo y/o un mecanismo para mezclar las fases hidrófoba e
hidrófila. Puede comprender además instrucciones para su
utilización con el fin de proporcionar una emulsión de la presente
invención.
Por el contrario, el surfactante puede estar
presente inicialmente en la composición hidrófila.
El término "microcápsula" es sinónimo de
"compartimento" y los términos se utilizan de modo
intercambiable. En esencia, una microcápsula es un compartimento
artificial cuyos bordes de delimitación limitan el intercambio de
los componentes del mecanismo molecular descrito en la presente
memoria, lo que permite la separación de los elementos genéticos
según la función de los productos génicos que los codifican.
Las microcápsulas formadas por la emulsión
requieren propiedades físicas apropiadas para que pueda funcionar
la invención. En particular, el contenido de cada microcápsula debe
estar aislado del contenido de las microcápsulas circundantes.
Preferentemente, las microcápsulas utilizadas en
el procedimiento de la presente invención se podrán preparar en
grandes cantidades, y de ese modo compartimentar una biblioteca de
elementos genéticos que codifica un repertorio de productos
génicos. La función de las microcápsulas es permitir la
co-localización del ácido nucleico y el
correspondiente polipéptido codificado por el ácido nucleico. Esto
se logra preferentemente debido a la capacidad de las microcápsulas
para limitar sustancialmente la difusión de las cadenas patrón y
producto a otras microcápsulas.
En segundo lugar, los procedimientos de la
presente invención requieren que exista solamente un número limitado
de elementos genéticos por microcápsula formada en la emulsión.
Esto asegura que el producto génico de un elemento genético
individual esté aislado de los demás elementos genéticos. Así, el
acoplamiento del elemento genético y el producto génico será muy
específico. El factor de enriquecimiento es máximo con un promedio
de uno o menos elementos genéticos por microcápsula, o dos o más
copias de un solo elemento genético por microcápsula, siendo la
conexión entre el ácido nucleico y la actividad codificada por el
producto génico lo más próxima posible, ya que el producto génico
de un elemento genético individual estará aislado de los productos
de los demás elementos genéticos. Sin embargo, incluso si la
situación teóricamente óptima de, en promedio, un solo elemento
genético o menos por microcápsula no se utilice, una proporción de
5, 10, 50, 100 ó 1.000 o más elementos genéticos por microcápsula
puede demostrar ser beneficiosa para separar una biblioteca grande.
Subsiguientes ciclos de separación, que comprende nuevas
encapsulaciones con distribuciones diferentes de elementos
genéticos, permitirá una separación más astringente de los
elementos genéticos. Preferentemente, hay uno o menos elementos
genéticos por microcápsula.
En tercer lugar, la formación y la composición
de las microcápsulas no debe abolir el funcionamiento de la
maquinaria de expresión de los elementos genéticos y la actividad
del producto génico utilizando sistemas de expresión eucariótica
in vitro.
En consecuencia, las microcápsulas formadas
mediante la emulsión deben cumplir estos tres requisitos. La
emulsión apropiada puede oscilar dependiendo de la naturaleza
precisa de las necesidades en cada aplicación de la presente
invención, tal como resultará evidente para un experto en la
materia.
El tamaño preferido de microcápsula dependerá de
los requisitos precisos de cada procedimiento de selección
individual que se deba realizar según la presente invención. En
todos los casos, la principal consideración es la necesidad de la
concentración necesaria de componentes en los compartimentos
individuales para lograr una transcripción/traducción eficaz. Esto
puede estar equilibrado con otros requisitos que pueden estar
relacionados con el tamaño de la biblioteca de genes,
enriquecimiento o procedimiento de separación.
Si se proporcionan microcápsulas pequeñas, se
puede proporcionar un gran número de microcápsulas discretas en un
pequeño volumen de emulsión. Además la provisión de pequeñas
microcápsulas incrementa la selectividad al incrementar la
posibilidad de que solo se produzca el producto génico en una
microcápsula determinada. Por consiguiente es preferible que en
promedio no haya más de un elemento genético que se deba
transcribir/traducir por compartimento, con el fin de mantener la
conexión entre el ácido nucleico y la actividad del producto
codificado por el gen lo más próxima posible. Sin embargo, incluso
si no se utiliza la situación teóricamente óptima de, en promedio,
un solo elemento genético o menos por microcápsula, una proporción
de 5, 10, 50, 100 ó 1.000 o más elementos genéticos por
microcápsula puede resultar beneficiosa en la separación de un
librería grande. Los siguientes ciclos de separación, comprendiendo
encapsulación renovada con una distribución diferente de elementos
genéticos, permitirán una separación más astringente de los
elementos genéticos. Preferentemente, en promedio no debe haber más
de un solo elemento genético por microcápsula.
Sería deseable que el volumen medio de las
microcápsulas fuese inferior a 5,2 x 10^{-16} m^{3},
(correspondiente a una microcápsula esférica de diámetro inferior a
10 \mum), más preferentemente inferior a 6,5 x 10^{-17} m^{3}
(correspondiente a una microcápsula esférica de diámetro inferior a
5 \mum), todavía más preferentemente aproximadamente 4,2 x
10^{-18} m^{3} (correspondiente a una microcápsula esférica de
un diámetro aproximado de 2 \mum).
La concentración efectiva de ADN o ARN en las
microcápsulas puede incrementarse artificialmente mediante múltiples
procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la
materia. Éstos comprenden, por ejemplo, la adición de productos
químicos que excluyen el volumen, tales como los polietilenglicoles
(PEG) y múltiples procedimientos de amplificación génica,
comprendiendo transcripción utilizando ARN polimerasas comprendiendo
las de las bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969;
Blattner and Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg
et al., 1975), eurcariotas, por ejemplo (Weil et al.,
1979; Manley et al., 1983) y de bacteriófago tales como la
T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984); la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988); amplificación por
replicasa Q\beta (Miele et al, 1983; Cahill et al.,
1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al.,
1988; Barany, 1991); y los sistemas de replicación de secuencias
autosostenidos (Fahy et al., 1991) y la amplificación por
desplazamiento de cadena (Walker et al., 1992). Los
procedimientos de amplificación de genes que utilizan
ventajosamente el termo ciclado (tal como la PCR y LCR) se pueden
utilizar si la emulsión y los sistemas de transcripción in
vitro o la transcripción acoplada a traducción son
termoestables.
El incremento de la concentración local efectiva
de ácido nucleico permite que las microcápsulas se utilicen más
efectivamente. Así, se pueden utilizar microcápsulas con volúmenes
de hasta 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondientes a diámetros
esféricos de 10 \mum) para múltiples propósitos, aunque desde
luego también se pueden utilizar microcápsulas de volúmenes
superiores, si se desea.
El tamaño de las microcápsulas deberá ser
suficientemente grande para alojar todos los componentes necesarios
para las reacciones bioquímicas que deberán tener lugar en el
interior de las microcápsulas. Por ejemplo, in vitro, las
reacciones de transcripción y las reacciones acopladas de
transcripción-traducción requieren una
concentración total de nucleósido trifosfatos de aproximadamente 2
mM.
También se deberá advertir que, con el fin de
transcribir un gen en una sola molécula de ARN corto de 500 bases
de longitud, se necesitaría un mínimo de 500 moléculas de nucleósido
trifosfato por microcápsula (8,33 x 10^{-22} moles). Con el fin
de generar una disolución 2 mM, este número de moléculas debe estar
comprendido en una microcápsula con un volumen de 4,17 x 10^{-19}
litros (4,17 x 10^{-22} m^{3}), que, si es esférica, tendría un
diámetro de 93 nm.
Además, particularmente en el caso de reacciones
que implican traducción también se deberá advertir que los
ribosomas eucarióticos necesarios para que tenga lugar la traducción
son propiamente de aproximadamente 30 nm en diámetro. En
consecuencia, el límite inferior preferido para las microcápsulas es
un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum (100 nm).
Por consiguiente, el volumen de las
microcápsulas es del orden de entre 5,2 x 10^{-22} y 5,2 x
10^{-16} m^{3} que corresponde a esferas de un diámetro
comprendido entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de
entre aproximadamente 5,2 x 10^{-19} m^{3} y 6,5 x 10^{-17}
m^{3} (1 \mum y 5 \mum).
Aunque las microcápsulas pequeñas son
preferibles en ciertas aplicaciones, tales como los procedimientos
dados a conocer en el documento WO99/02671, es importante advertir
que la presente invención no está en modo alguno limitada a
proporcionar microcápsulas pequeñas y que los sistemas de
transcripción y traducción también funcionan en microcápsulas
grandes.
El tamaño de las microcápsulas de la emulsión se
puede modificar simplemente ajustando las condiciones de la
emulsificación utilizadas con el fin de generar la emulsión según
los requisitos del sistema de selección.
El tamaño del compartimento se puede modificar
(dentro de ciertos límites de estabilidad de la emulsión e
inactivación del RRL) mediante 1) el incremento del tiempo de
mezclado, 2) diferentes proporciones W/O, 3) diferente
concentración de surfactante.
La distribución de los tamaños de las
microcápsulas en las emulsiones se puede determinar mediante
procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por
ejemplo, la distribución de tamaños se puede ensayar utilizando
difracción de láser (por ejemplo, utilizando un Coulter LS230
Particle Size Analyzer) o mediante examen al microscopio.
"Expresión", tal como se utiliza en la
presente memoria, tiene un significado amplio, se refiere a que un
ácido nucleico comprendido en el elemento genético se convierte en
el producto génico. Así, cuando el ácido nucleico es ADN, expresión
se refiere a la transcripción del ADN en ARN; cuando este ARN
codifica una proteína, "expresión" también se puede referir a
la traducción del ARN a proteína. Cuando el ácido nucleico es ARN,
"expresión" puede referirse a la replicación de este ARN en
otras copias de ARN, la transcripción inversa del ARN en ADN y
opcionalmente la transcripción de este ADN en moléculas adicionales
de ARN, así como opcionalmente la traducción de cualquier especie
de ARN generada en proteína. Preferentemente, por consiguiente, la
"expresión" se realiza mediante uno o más de los procesos
seleccionados de entre el grupo que comprende transcripción,
transcripción inversa, replicación y traducción.
La "expresión" del elemento genético puede
por consiguiente estar dirigida a ADN, ARN o proteína, o ácido
nucleico o proteína que comprende bases o aminoácidos no naturales
(el producto génico) en el interior de la microcápsula de la
presente invención, de modo que el producto génico esté confinado en
el interior de la misma microcápsula que el elemento genético.
Se puede utilizar un sistema de expresión
eucariótico in vitro cualquiera en la emulsión de la presente
invención, con la condición de que comprenda los componentes para
la transcripción y/o traducción. Si se desea glicosilación, también
pueden estar presentes una o más glicosilasas, según sea apropiado
con el fin de lograr el patrón de glicosilación deseado.
El sistema de expresión puede, por ejemplo,
comprender la totalidad o parte de un lisado celular o extracto,
por ejemplo se puede utilizar extracto de germen de trigo (Anderson
et al., 1983) y está disponible de Promega. Deseablemente,
sin embargo, el lisado celular es un lisado celular de mamífero.
Puede ser un lisado de reticulocitos. Un lisado de reticulocitos
preferido es el lisado de reticulocitos de conejo (un "RRL").
El sistema de RRL está bien caracterizado (véase por ejemplo, Pelma
y Jackson, 1976) y se encuentra disponible en Promega.
Sin embargo, se puede utilizar cualquier sistema
de expresión eucariótico conveniente preparado a partir de
extractos celulares. Los extractos deben comprender todos los
componentes necesarios para la traducción del ARN (por ejemplo
ribosomas, ARNt, aminoacil-ARNt sintetasa, factores
de iniciación, elongación y terminación etc., estando los extractos
preferentemente suplidos con aminoácidos, ATP, GTP, fosfato de
creatina y creatina fosfoquinasa, otros cofactores tales como
Mg^{2+}.
Mediante la utilización de las emulsiones de la
presente invención es posible obtener una expresión apreciable de
un elemento genético y/o la actividad del producto génico utilizando
un sistema de expresión eucariótica in vitro presente en la
emulsión. La expresión y/o actividad son deseables a un nivel de por
lo menos el 1% de la obtenible por el producto génico con el
sistema de expresión antes de la formación de la emulsión. Más
preferentemente es de por lo menos el 10%, 20% o 30% de dicho nivel
y/o actividad.
Un "elemento genético" es una molécula o
construcción molecular que comprende ácido nucleico. Los elementos
genéticos de la presente invención pueden comprender un ácido
nucleico cualquiera (por ejemplo ADN, ARN o cualquier análogo,
natural o artificial, de los mismos).
En los sistemas de transcripción y/o traducción
se pueden utilizar ácidos nucleicos codificantes de un producto
cualquiera adecuado. Además de las secuencias codificantes, los
ácidos nucleicos pueden, por ejemplo, comprender promotores,
operadores, amplificadores, secuencias iniciadoras de la traducción
y transcripción, secuencias de poliadenilación, lugares de corte,
regiones reguladoras corriente arriba y corriente abajo, etc., tal
como se requiere en la transcripción y/o traducción. En algunos
casos puede ser preferible utilizar promotores inducibles y/o
sensibles a la temperatura con el fin de asegurar que la expresión
tiene lugar solamente en una etapa particular.
El componente de ácido nucleico del elemento
genético puede además estar conectado, covalentemente o
no-covalentemente, a una o más moléculas o
estructuras, que comprenden polipéptidos, péptidos, entidades
químicas y grupos, soportes de fase sólida tales como cuantas
magnéticas y similares. En los procedimientos de la presente
invención, estas estructuras o moléculas se pueden diseñar con el
fin de asistir en la separación y/o separación de los elementos
genéticos que codifican el producto génico con la actividad
deseada.
Tal como resultará evidente a partir de lo que
sigue, en muchos casos el polipéptido u otro grupo molecular o
construcción es un ligando o un sustrato que directa o
indirectamente se une, o reacciona con el producto génico con el
fin de marcar el elemento genético. Esto permite la separación del
elemento genético con base en la actividad del producto génico.
El ligando o sustrato se pueden conectar al
ácido nucleico mediante una pluralidad de medios que resultarán
evidentes para los expertos en la materia (véase, por ejemplo,
Hermanson, 1996). Será suficiente una etiqueta cualquiera que
permita la subsiguiente selección del elemento genético. La
separación puede ser mediante un procedimiento cualquiera que
permita la separación preferente, amplificación o supervivencia del
elemento genético etiquetado. Los ejemplos comprenden la selección
mediante la unión (comprendiendo las técnicas basadas en separación
magnética, por ejemplo Dynabeads®) y mediante la resistencia a la
degradación (por ejemplo por nucleasas, comprendiendo endonucleasas
de restricción).
Un modo en que se puede unir la molécula de
ácido nucleico a un ligando o sustrato es mediante biotinilación.
Esto se puede realizar mediante amplificación PCR con un cebador
5'-biotinilado de modo que la biotina y el ácido
nucleico se enlazan covalentemente. Un ácido nucleico biotinilado se
puede enlazar a una microcuenta de poliestireno (0,035 a 0,2 \mum
de diámetro) recubierta de avidina o estreptavidina, que por
consiguiente se unirá al ácido nucleico con elevada afinidad. Esta
cuenta se puede derivatizar con un sustrato o ligando mediante
cualquier procedimiento adecuado tal como mediante la adición de un
sustrato biotinilado o mediante enlace covalente.
Por el contrario, un ácido nucleico biotinilado
se puede acoplar a avidina o estreptavidina acomplejada a una
molécula de proteína grande tal como tiroglobulina (669 Kd) o
ferritina (440 Kd). Este complejo se puede derivatizar con sustrato
o ligando, por ejemplo mediante enlace covalente al grupo amino de
la lisina o a través de una interacción no covalente tal como la de
biotina-avidina. El sustrato se puede encontrar en
forma no enlazada al elemento genético pero comprendiendo una
etiqueta inactiva que necesita una etapa adicional para activarse,
tal como una fotoactivación [por ejemplo un análogo "enjaulado"
de la biotina, (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang,
1996)]. El catalizador que se debe seleccionar convierte a
continuación al sustrato en producto. La "etiqueta" puede
activarse a continuación y el sustrato "etiquetado" y/o el
producto unido por una molécula unida a la etiqueta (por ejemplo
avidina o estreptavidina) puede acomplejarse al ácido nucleico. La
proporción entre sustrato y producto unido al ácido nucleico
mediante la "etiqueta" reflejará en consecuencia la proporción
de sustrato y producto en disolución.
Una alternativa es unir el ácido nucleico a un
anticuerpo específico al producto (u otra molécula con especificidad
por el producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los
sustratos) se encuentra en cada microcápsula desconectado del
elemento genético, pero tiene una molécula de "etiqueta" (por
ejemplo biotina, DIG o DNP). Cuando un catalizador que se debe
seleccionar convierte el sustrato en el producto, el producto
retiene la "etiqueta" y a continuación es capturado en la
microcápsula por el anticuerpo específico del producto. De este
modo el elemento genético solamente se asocia a la etiqueta cuando
codifica o produce un enzima capaz de convertir el sustrato en
el
producto.
producto.
Cuanto se detienen todas las reacciones y se
combinan las microcápsulas, los elementos genéticos que codifican
enzimas activos se pueden enriquecer utilizando un anticuerpo u otra
molécula que se une, o reacciona específicamente con la
"etiqueta". Aunque ambos, sustrato y producto, tienen la
etiqueta molecular, solamente se co-purificarán los
elementos genéticos que codifican productos activos génico.
En una forma de realización muy preferida, los
procedimientos de la presente invención son útiles en la separación
de librerías de elementos genéticos. La presente invención, en
consecuencia proporciona un procedimiento según los anteriores
aspectos de la invención, en el que los elementos genéticos se
aíslan de una librería de elementos genéticos que codifican un
repertorio de productos genéticos. En la presente memoria, los
términos "librería", "repertorio" y "conjunto" se
utilizan según su significado ordinario en la materia, de modo que
una librería de elementos genéticos codifica un repertorio de
productos génicos. En general, las librerías se construyen a partir
de conjuntos de elementos genéticos y tienen propiedades que
facilitan su separación.
La selección inicial de un elemento genético de
una librería de elementos genéticos que utiliza la presente
invención requerirá en la mayoría de los casos el cribado de gran
número de elementos genéticos variantes. Las librerías de elementos
genéticos se pueden crear en una gran pluralidad de formas
diferentes, que comprenden las siguientes.
Se pueden clonar conjuntos de elementos
genéticos naturales a partir de ADN genómico o ADNc (Sambrook et
al., 1989); por ejemplo, las librerías de anticuerpos en fagos,
generadas mediante la amplificación de repertorios de genes de
anticuerpos derivados de donantes inmunizados o no inmunizados han
demostrado ser fuentes muy efectivas de fragmentos funcionales de
anticuerpos (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Las
librerías de genes se pueden hacer también codificando todos (véase
por ejemplo Smith, 1985; Pamley y Smith, 1988) o parte de los genes
(véase por ejemplo Lowman et al., 1991) o conjuntos de genes
(véase por ejemplo Nissim et al., 1994) mediante un
oligonucleótido al azar o sintético dopado. Las librerías también se
pueden generar mediante la introducción de mutaciones en un
elemento genético o un conjunto de elementos genéticos "al
azar" mediante una pluralidad de procedimientos in vivo,
que comprenden: utilizar "cepas mutadoras" de bacterias tales
como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et
al., 1990; Low et al., 1996); utilizando el sistema de
hipermutación de anticuerpos de los linfocitos-B
(Yelamos et al., 1995). Las mutaciones al azar se pueden
introducir también tanto in vivo como in vitro
mediante mutágenos químicos y radiación ionizante o UV (véase
Friedberg et al., 1995), o mediante la introducción de
análogos mutagénicos de una base (Freese, 1959; Zaccolo et
al., 1996). También se pueden introducir mutaciones "al
azar" en los genes in vitro durante la polimerización, por
ejemplo, mediante la utilización de polimerasas con tendencia a
hacer errores (Leung et al., 1989).
Se puede introducir diversificación adicional
mediante la utilización de recombinación homóloga tanto in
vivo (véase Kowalozykowski et al., 1994) o in
vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).
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La presente invención por consiguiente se puede
utilizar con el fin de preparar productos génicos específicos
deseados o con el fin de preparar una gama de múltiples productos
génicos (que pueden ser desconocidos en parte o totalmente) para
cribado.
El término "producto génico" se utiliza en
la presente invención en su sentido más amplio, que comprende no
solamente polipéptidos sino también productos de ARN génico. Así,
comprende los productos de transcripción solamente, así como
también los productos de transcripción y traducción.
Los productos génicos preferidos son
polipéptidos naturales de las células eucarióticas (especialmente
células de mamífero o humanas pero no en células procarióticas, o
formas mutantes de dichos polipéptidos con cambios en uno o más
aminoácidos, relativos al polipéptido eucariótico silvestre. Las
formas mutantes son útiles en la generación de diversidad, por
ejemplo, con el fin de realizar cribas. Sin embargo, si se realizan
cambios de aminoácidos es preferible que el número de estos cambios
esté limitado, por ejemplo, que en relación al polipéptido
silvestre el número de aminoácidos cambiado sea inferior a 50,
inferior a 25, inferior a 10 o inferior a 5. Las formas mutantes
pueden, por ejemplo, funcionar como antagonistas o agonistas de una
o más de las actividades biológicas de un polipéptido silvestre.
Pueden por consiguiente ser útiles en el estudio de la relación
estructura-función, en cribados, en programas de
desarrollo de fármacos, etc. Las mutaciones se pueden introducir en
los ácidos nucleicos mediante los procedimientos adecuados. Por
ejemplo, se puede proporcionar la secuencia de un ácido nucleico
que comprende un cambio deseado en la secuencia mediante mutagénesis
dirigida. Ésta se puede utilizar con el fin de permitir la
expresión de un ARN o un polipéptido con el correspondiente cambio
en la secuencia. Por el contrario, se puede sintetizar un ácido
nucleico que comprende una mutación determinada. Las mutaciones se
pueden proporcionar también mediante la utilización de un agente
mutante y/o irradiación.
En ciertas aplicaciones el sistema de expresión
se puede utilizar con el fin de expresar el producto génico útil en
la replicación, reparación mantenimiento o replicación de un ácido
nucleico de una célula eucariótica, preferentemente de una célula
de mamífero o humana. El producto génico puede por consiguiente
tener actividad de polimerasa, transcriptasa inversa, ligasa o
telomerasa, por ejemplo. Puede tener más de una actividad. Si está
implicado en la reparación de un ácido nucleico, puede tener
actividad editora.
Los productos génicos se pueden preparar en los
compartimentos formados por la fase hidrófila de la emulsión que
comprende el sistema de expresión.
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Los procedimientos se pueden configurar para
seleccionar ARN, ADN o moléculas de proteína productos génicos
provistos de actividad catalítica, reguladora o de enlace.
En el caso de la selección de un producto génico
con afinidad por un ligando específico el elemento genético puede
estar unido al producto génico en la microcápsula mediante el
ligando. Solamente los productos génicos con afinidad por el
ligando se unirán al elemento genético propiamente y por
consiguiente solamente los elementos genéticos que generan producto
activo serán retenidos en la etapa de selección. En esta forma de
realización, el elemento genético comprenderá, por consiguiente, un
ácido nucleico que codifica el producto génico unido a un ligando
para el producto génico.
En esta forma de realización, todos los
productos génicos que se desea seleccionar comprenden un dominio de
enlace putativo, que se debe seleccionar y una característica común,
una etiqueta. El elemento genético en cada microcápsula está
físicamente unido a un ligando. Si el producto génico preparado a
partir del elemento genético tiene afinidad por el ligando, se
unirá al mismo y quedará físicamente unido al mismo elemento
genético que lo codifica, resultando en el etiquetado del elemento
genético. Al final de la reacción, todas las microcápsulas se
combinan y todos los elementos genéticos y productos genéticos se
acumulan en un ambiente. Los elementos genéticos que codifican
productos génicos que muestran la unión deseada se pueden
seleccionar mediante purificación por afinidad utilizando una
molécula que se una específicamente, o reaccione específicamente con
la etiqueta.
En una forma de realización alternativa, los
elementos genéticos se pueden separar con base en que el producto
génico, que se une al ligando, meramente esconde al ligando de, por
ejemplo, otros compañeros de unión. En esta eventualidad, el
elemento genético, en lugar de ser retenido durante la etapa de
purificación por afinidad, se puede eluir selectivamente mientras
otros elementos genéticos quedan unidos.
En una forma de realización alternativa, la
presente invención proporciona un procedimiento según el segundo
aspecto de la presente invención, en el que en la etapa (b) los
productos génicos se unen a los elementos genéticos que los
codifican. Los productos génicos junto con los elementos genéticos
unidos se separan a continuación como resultado de la unión de un
ligando a los productos génicos que disponen de la actividad
deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos pueden comprender
una región invariable que se une covalentemente o no covalentemente
al elemento genético y una segunda región que está diversificada de
modo que genera la actividad de unión deseada.
La separación por afinidad depende de la
presencia de dos miembros de una pareja de unión en condiciones
tales que pueda tener lugar la unión. Se puede utilizar una pareja
de unión cualquiera con este fin. Tal como se utiliza en la
presente memoria, el término pareja de unión se refiere a un par de
moléculas capaz de unirse entre sí. Los ejemplos de parejas de
unión que se pueden utilizar en la presente invención comprenden un
antígeno y un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse al
antígeno, el par biotina-avidina/estreptavidina
(Savage et al., 1994), un polipéptido de unión dependiente
del calcio y un ligando del mismo (por ejemplo calmodulina y un
péptido que se une a la calmodulina (Stofko et al., 1992;
Montigiani et al., 1996), pares de polipéptidos que se
ensamblan para formar un cremallera de leucina (Tripete et
al., 1996), histidinas (típicamente péptidos de hexahistidina)
y Cu^{2+}, Zn^{2+} y Ni^{2+} quelados (por ejemplo
Ni-NTA; Hochuli et al., 1987), proteínas de
unión al ADN o ARN (Klug, 1995) incluyendo las que comprenden
motivos de dedos de zinc (Klug y Schwabe, 1995) y ADN
metiltransferasas (Anderson, 1993) y sus lugares de unión a los
ácidos nucleicos.
Sin embargo, la utilidad de ciertos
procedimientos de selección basados en afinidad puede ser limitada.
Especialmente en las interacciones de afinidad media a baja, la
vida media de las interacciones puede ser frecuentemente demasiado
corta en comparación con el tiempo necesario para detectar las
interacciones.
Así, en una forma de realización de la presente
invención, los procedimientos de selección se basan en aumentar la
afinidad de las interacciones intermoleculares permitiendo que
tengan lugar interacciones multivalentes. El aparente incremento en
afinidad resultante logrado mediante interacciones multivalentes,
también denominado avidez, es debido al hecho de que cuando tienen
lugar dos o más interacciones de unión en el mismo complejo
molecular, solamente se paga un precio entrópico adicional muy
pequeño por la segunda y adicionales interacciones. Ello es debido
a que la mayoría de los grados de libertad se perdieron cuando la
unión a través de un lugar de unión inmovilizó el ligando
multivalente. Sin embargo, la avidez puede tener efectos
particularmente drásticos en la cinética de disociación
(k_{off}), ya que todas las interacciones se deben romper antes de
que tenga lugar la disociación.
Por consiguiente, en esta forma de realización,
las moléculas que interactúan se pueden seleccionar permitiendo que
ocurran interacciones multivalentes entre las moléculas,
incrementando así la estabilidad de cualquier complejo formado en
comparación con una interacción monovalente.
Preferentemente, la primera y segunda molécula
que interactúan, por ejemplo, el producto génico y la molécula
ligando a la que se une, han sido modificadas con el fin de
incrementar su valencia. Preferentemente, en el producto génico o
en la molécula ligando o en los dos, hay uno o más grupos reactivos,
de tal modo que las moléculas producto génico (y/o el ligando) se
asocian entre sí formando complejos multivalentes de los productos
génicos y/o complejos de moléculas ligando multivalentes. Los
complejos multivalentes se pueden seleccionar por unión según la
presente invención. Preferentemente, los grupos reactivos forman un
enlace covalente cuando interactúan.
El término "complejos multivalentes" tal
como se utiliza en la presente memoria se refiere a complejos
moleculares que comprenden (i) por lo menos dos moléculas del
producto génico o por lo menos una molécula de un producto
multivalente génico y (ii) una molécula ligando multivalente, en la
que por lo menos las por lo menos dos moléculas del producto génico
se encuentran interactuando con la molécula ligando o la por lo
menos una molécula de un producto multivalente génico interactúa
con la molécula ligando mediante por lo menos dos valencias.
En dichos procedimientos de selección por
avidez, la molécula ligando es preferentemente multivalente. Por
ejemplo, cuando la molécula ligando es un polipéptido, la molécula
ligando puede ser multivalente en virtud de estar expresada como
una proteína de fusión a un tercer polipéptido que se
multimeriza.
Las moléculas de producto génico y/o ligando
pueden comprender una etiqueta, por ejemplo una biotina o una
etiqueta de epítopo o parte de myc, con el fin de asistir en la
purificación de los complejos formados entre ellas, y/o asistir en
la recuperación de las moléculas producto génico y/o ligando para el
análisis y la identificación.
La molécula ligando es típicamente un multímero,
tal como un dímero, o capaz de formar un homomultímero en las
condiciones de reacción utilizadas en el procedimiento de la
presente invención. Por el contrario, la molécula ligando puede ser
un heteromultímero. Es preferible utilizar moléculas ligando que son
polipéptidos diseñados para que sean multiméricos pero cuyas
unidades constituyentes normalmente no formen multímeros. Se puede
lograr esto mediante la unión química de dos o más moléculas con el
fin de formar un multímero covalentemente enlazado. Por el
contrario, en el caso de moléculas ligando que son polipéptidos y
que se unen a polipéptidos productos génicos, las moléculas se
pueden expresar como una fusión a un tercer polipéptido, formando el
tercer polipéptido homomultímeros, lo que efectivamente resulta en
la multimerización de la secuencia del polipéptido ligando
fusionado. Un ejemplo de tercer polipéptido adecuado (referido en la
presente memoria como polipéptido "gancho") es la
glutation-S-tranferasa (GST), que
forma dímeros. Los péptidos gancho preferidos proporcionan buenos
niveles de expresión de productos solubles. En una forma de
realización, son preferibles los polipéptidos gancho adecuados para
secreción en el periplasma bacteriano (por ejemplo, GST después de
escindir los 3 residuos Cys superficiales (Tudyka y Skerra, 1997).
La molécula ligando se puede proporcionar como una pluralidad de
moléculas ligando.
En una forma de realización particularmente
preferida de la presente invención, los productos génicos son
polipéptidos codificados por primeros polinucleótidos y los
polinucleótidos están asociados con los correspondientes
polipéptidos de tal modo que cuando un primer polipéptido se
selecciona durante el procedimiento de cribado de la presente
invención, la secuencia del polinucleótido que codifica el
polipéptido seleccionado está físicamente unida, o en la
proximidad, y se puede recuperar con facilidad y, por ejemplo,
secuenciar con el fin de determinar la identidad del polipéptido
seleccionado. Con el fin de lograr esto, la pluralidad de primeros
polinucleótidos en un compartimento puede ser tal que en promedio
haya solamente un polinucleótido utilizando la emulsión de la
presente invención.
En la solicitud de patente
co-pendiente GB nº 114856.8. se describen detalles
adicionales sobre los procedimientos de selección por avidez que se
pueden utilizar en los procedimientos de la presente invención.
Cuando se selecciona para catálisis, el elemento
genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato de la
reacción. Si el elemento genético codifica el producto génico capaz
de funcionar como catalizador, el producto génico catalizará la
conversión del sustrato en el producto. Por consiguiente, al final
de la reacción el elemento genético está físicamente unido al
producto de la reacción catalizada. Cuando las microcápsulas se
combinan y se acumulan los reactantes, los elementos genéticos que
codifican moléculas catalíticas se pueden enriquecer mediante la
selección de cualquier propiedad específica del producto.
Por ejemplo, el enriquecimiento puede ser
mediante purificación por afinidad utilizando una molécula (por
ejemplo, un anticuerpo) que se una específicamente al producto.
Asimismo, el producto génico puede tener el efecto de modificar un
componente del ácido nucleico del elemento genético, por ejemplo
mediante metilación (o desmetilación) o mutación del ácido
nucleico, haciéndolo resistente, o susceptible al ataque por
nucleasas, tales como endonucleasas de restricción.
Por el contrario, la selección se puede realizar
directamente mediante acoplamiento de una primera reacción a
reacciones siguientes que tienen lugar en la misma microcápsula. Hay
dos formas generales en las que se puede realizar esto. En primer
lugar, el producto de la primera reacción se puede hacer reaccionar,
o unir a una molécula que no reaccione con el sustrato de la
primera reacción. Una segunda reacción acoplada solamente procederá
en presencia del producto de la primera reacción. Un elemento
genético activo puede purificarse a continuación mediante la
selección de las propiedades del producto de la segunda
reacción.
Por el contrario, el producto de la reacción que
se selecciona puede ser el sustrato o cofactor de una segunda
reacción catalizada por un enzima. El enzima que cataliza la segunda
reacción puede estar traducido in situ, en la microcápsula o
incorporado en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación.
Solamente cuando proceda la primera reacción el enzima acoplado
generará un producto seleccionable.
Este concepto de acoplamiento se puede elaborar
con el fin de incorporar una pluralidad de enzimas, cada uno de
ellos utilizando como sustrato el producto de la reacción anterior.
Esto permite la selección de enzimas que no reaccionarán con un
sustrato inmovilizado. También se puede diseñar con el fin de
producir un incremento de sensibilidad mediante amplificación de la
señal si el producto de una reacción es un catalizador o un cofactor
de una segunda reacción o serie de reacciones que conducen a un
producto seleccionable (por ejemplo, véase Johannsson y Bates,
1988; Johannsson, 1991). Además, un sistema de cascada enzimática se
puede basar en la preparación de un activador par un enzima o en la
destrucción de un inhibidor de un enzima (véase Mize et al.,
1989). El acoplamiento tiene la ventaja de que se puede utilizar un
sistema de selección común para todo un grupo de enzimas que
generan el mismo producto y permite la selección de transformaciones
químicas complejas que no se pueden realizar en una sola
etapa.
etapa.
Dicho procedimiento de acoplamiento permite así
la evolución de nuevas "sendas metabólicas" in vitro en
etapas, seleccionando y mejorando primero una etapa y a continuación
la siguiente. La estrategia de selección se basa en el producto
final de la senda, de modo que todas las etapas anteriores pueden
evolucionar independientemente o en secuencia sin tener que montar
un nuevo sistema de selección para cada etapa de la reacción.
Expresado en forma alternativa, se proporciona
un procedimiento de aislamiento de uno o más elementos genéticos
que codifican el producto génico con la actividad catalítica
deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (1)
- expresar elementos genéticos con el fin de preparar los respectivos productos génicos;
- (2)
- permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato en un producto, que puede o no ser directamente seleccionable, según la actividad deseada;
- (3)
- opcionalmente acoplar la primera reacción a una o más reacciones siguientes, estando cada una de las reacciones modulada por el producto de la reacción anterior, y conduciendo a la generación de un producto final seleccionable;
- (4)
- unir el producto seleccionable de la catálisis a los elementos genéticos mediante:
- a)
- el acoplamiento del sustrato a los elementos genéticos de tal modo que el producto permanezca asociado con los elementos genéticos, o
- b)
- la reacción o el enlace del producto seleccionable a los elementos genéticos mediante una etiqueta molecular adecuada unida al sustrato que permanece en el producto, o
- c)
- el acoplamiento del producto seleccionable (pero no el sustrato) a los elementos genéticos mediante una reacción específica del producto o interacción con el producto; y
- (5)
- seleccionar el producto de la catálisis, junto con el elemento genético al que está unido, mediante una reacción específica o la interacción con el producto, o mediante purificación por afinidad utilizando una "etiqueta" molecular unida al producto de la catálisis, en el que en las etapas (1) a (4) cada elemento genético y los respectivos productos génicos están comprendidos en el interior de una microcápsula formada a partir de una emulsión de la presente invención.
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Se puede utilizar un sistema similar para
seleccionar las propiedades reguladoras de los enzimas.
En el caso de selección para una molécula
reguladora que funciona como activador o inhibidor de un proceso
bioquímico, los componentes del proceso bioquímico se pueden
traducir in situ en cada microcápsula o se pueden incorporar
en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. Si el
elemento genético que se está seleccionando es para codificar un
activador, la selección se puede realizar para el producto de la
reacción regulada, tal como se ha descrito anteriormente en
conexión con la catálisis. Si se desea un inhibidor, la selección
puede ser para una propiedad química específica del sustrato de la
reacción regulada.
Por consiguiente, se proporciona un
procedimiento para separar uno o más elementos genéticos que
codifican el producto génico que muestra una actividad reguladora
deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (1)
- expresar los elementos genéticos con el fin de preparar los respectivos productos génicos;
- (2)
- permitir que los productos génicos activen o inhiban una reacción bioquímica, o una secuencia de reacciones acopladas, de acuerdo con la actividad deseada, de tal modo que permita la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;
- (3)
- asociar la molécula seleccionable a los elementos genéticos mediante
- a)
- la disposición de la molécula seleccionable, o el sustrato del que se deriva, unida a los elementos genéticos, o
- b)
- la reacción o unión del producto seleccionable a los elementos genéticos, mediante una "etiqueta" molecular adecuada unida al sustrato que permanece en el producto, o
- c)
- el acoplamiento del producto de la catálisis (pero no el sustrato) a los elementos genéticos, mediante una reacción de específica del producto o la interacción con el producto;
- (4)
- seleccionar el producto seleccionable, junto con el elemento genético al que está unido, mediante una reacción específica o la interacción con el producto seleccionable, o mediante purificación por afinidad utilizando una "etiqueta" molecular unida al producto de la catálisis.
en la que en las etapas (1) a (4) cada elemento
genético y el respectivo producto génico están comprendidos en el
interior de una microcápsula formada mediante una emulsión de la
presente invención.
La presente invención proporciona la separación
de microcápsulas intactas que se efectúa mediante los procedimientos
de separación utilizados. Las microcápsulas se pueden separar como
tales cuando el cambio inducido por el producto genético deseado
tiene lugar o se manifiesta en la superficie de la microcápsula o es
detectable desde el exterior de la microcápsula. El cambio puede
estar producido por la acción directa del producto génico, o
indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las
cuales implica al producto génico que tiene la actividad deseada,
conducen al cambio. Por ejemplo, la microcápsula puede estar
configurada de tal modo que el producto génico esté desplegado en
su superficie y por consiguiente sea accesible a reactivos. Cuando
la microcápsula es una microcápsula membranosa, el producto génico
puede ser la diana o puede causar la dirección de una molécula a la
membrana de la microcápsula. Esto se puede lograr, por ejemplo,
utilizando una secuencia de localización a la membrana, tal como
las derivadas de proteínas de membrana, que favorecerán la
incorporación de una molécula fundida o unida en la membrana de la
microcápsula. Por el contrario, cuando se forma una microcápsula
mediante reparto de fases tal como en las emulsiones
de-agua-en-aceite,
una molécula con partes que son más solubles en la fase
extra-capsular se dispondrán de tal modo que se
encuentren en el límite de la microcápsula.
En un aspecto preferido de la presente
invención, sin embargo, se aplica la separación de microcápsulas a
sistemas de separación basados en un cambio de las propiedades
ópticas de la microcápsula, por ejemplo las características de
absorción o emisión de la misma, por ejemplo la alteración de las
propiedades ópticas de la microcápsula resultantes de una reacción
que conduce a cambios en absorción, luminiscencia, fosforescencia o
fluorescencia asociados a la microcápsula. Todas estas propiedades
están comprendidas en el término "óptico". En tal caso, las
microcápsulas se pueden separar mediante separación activada por
luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una forma de
realización muy preferida, se utiliza separación activada por
fluorescencia con el fin de separar microcápsulas en las que la
preparación del producto génico con la actividad deseada está
acompañada por la preparación de una molécula fluorescente en la
cápsula. Por ejemplo, el propio producto génico puede ser
fluorescente, por ejemplo una proteína fluorescente tal como la GFP.
Por el contrario, el producto génico puede inducir o modificar la
fluorescencia de otra molécula, tal como por la unión o la reacción
con ella.
Las microcápsulas se pueden identificar en
virtud de un cambio inducido por el producto génico deseado que
ocurre o se manifiesta en la superficie de la microcápsula o es
detectable desde el exterior tal como se describe en la sección
(IV) (Separación de microcápsulas). Este cambio, cuando se
identifica, se utiliza con el fin de iniciar la modificación génica
en el interior del compartimento. En un aspecto preferido de la
presente invención, la identificación de la microcápsula se basa en
un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula que
resultan de una reacción que produce luminiscencia, fosforescencia o
fluorescencia en el interior de la microcápsula.
La modificación génica en el interior de la
microcápsula sería iniciada mediante la identificación de
luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Por ejemplo, la
identificación de luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia
puede iniciar el bombardeo del compartimento con fotones (u otras
partículas u ondas) lo que conduce a la modificación del elemento
genético. Se ha descrito anteriormente un procedimiento similar para
la separación rápida de células (Keij et al., 1994). La
modificación de los elementos genéticos puede resultar, por
ejemplo, de acoplar una "etiqueta" molecular, enjaulada en un
grupo protector fotolábil a los elementos genéticos: el bombardeo
con fotones de longitud de onda adecuada conduce a la eliminación de
la jaula. Después, todas las microcápsulas se combinan y se
acumulan los elementos genéticos en un ambiente. Los elementos
genéticos que codifican productos génicos que muestran la actividad
deseada se pueden seleccionar mediante purificación por afinidad
utilizando una molécula que se une específicamente, o reacciona
específicamente con la "etiqueta".
Se apreciará asimismo que según la presente
invención, no es necesario que procedan en una sola etapa todos los
procesos de transcripción/replicación y/o traducción y selección,
teniendo lugar todas las reacciones en una microcápsula. El
procedimiento de selección puede comprender dos o más etapas.
Primero, la transcripción/replicación y/o traducción de cada
elemento genético de una librería de elementos genéticos puede tener
lugar en una primera microcápsula. El producto de cada gen se
asocia a continuación al elemento genético que lo codifica (que
reside en la misma microcápsula). Las microcápsulas se rompen a
continuación, y los elementos genéticos unidos a los productos
génicos respectivos son opcionalmente purificados. Por el contrario,
los elementos genéticos se pueden unir a los productos génicos
respectivos utilizando procedimientos que no dependen de la
encapsulación. Por ejemplo, despliegue en fagos (Smith, G.P.,
1985), despliegue en polisomas (Matheakkis et al., 1994),
fusión ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997) o
fusión del represor lac péptido (Cull, et al., 1992).
En una segunda etapa del procedimiento, cada
elemento genético purificado unido al producto de su gen se
introduce en una segunda microcápsula que comprende los componentes
de la reacción que se debe seleccionar. A continuación se inicia
esta reacción. Una vez completas las reacciones, las microcápsulas
se rompen otra vez y los elementos genéticos modificados se
seleccionan. En el caso de reacciones complejas de múltiples etapas
en las que se encuentran implicados muchos componentes individuales
y etapas de reacción, se pueden realizar una o más etapas
intermedias entre la etapa inicial de creación de la unión del
producto génico al elemento genético y la etapa final de generar un
cambio seleccionable en el elemento genético.
Se puede configurar el sistema de tal modo que
la unión deseada, la actividad catalítica o reguladora codificada
por el elemento genético conduzca, directa o indirectamente a la
activación de la expresión de un "gen reportero" que se
encuentra presente en todas las microcápsulas. Solamente los
productos génicos con la actividad deseada activarán la expresión
del gen reportero. La actividad resultante de la expresión del gen
reportero permite la selección del elemento genético (o del
compartimento que lo comprende) mediante cualquiera de los
procedimientos descritos en la presente memoria.
Por ejemplo, la activación del gen reportero
puede ser el resultado de una actividad enlazante del producto
génico en modo análogo al del sistema de "dos híbridos" (Fields
y Song, 1989). La activación puede también resultar del producto de
una reacción catalizada por el producto génico deseable. Por
ejemplo, el producto de reacción puede ser un inductor
transcripcional del gen reportero. Por ejemplo la arabinosa se puede
utilizar con el fin de inducir transcripción a partir del promotor
araBAD. La actividad del producto génico deseable también puede
producir la modificación de un factor de transcripción, lo que
resulta en la expresión del gen reportero. Por ejemplo, si el
producto deseado génico es una quinasa o fosfatasa la fosforilación
o defosforilación de un factor de transcripción puede conducir a la
activación de la expresión del gen reportero.
Según otro aspecto de los procedimientos de la
presente invención, los procedimientos pueden comprender la etapa
adicional de amplificar los elementos genéticos. La amplificación
selectiva se puede utilizar como unos medios de enriquecimiento
para los elementos genéticos según el producto génico deseado.
En todas las configuraciones anteriores, el
material genético comprendido en los elementos genéticos se puede
amplificar y repetir el procedimiento en etapas reiterativas. La
amplificación puede realizarse mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (Saiki et al., 1988) o mediante la utilización de
una de entre la pluralidad de otros procedimientos de amplificación
de genes que comprenden: amplificación por Q\beta replicasa
(Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev,
Kurnasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR)
(Landegren et al., 1988; Barny, 1991); el sistema de
replicación de secuencias auto-sostenido (Fahy,
Kwoh y Gingeras, 1991) y la amplificación por desplazamiento de
cadena (Walter et al., 1992).
Se utilizó una formulación de fase oleosa que
comprende 4,5% v/v de monooleato de sorbitano (Span® 80, Fluka;
85548) y 0,4% v/v de monooleato de polioxietilensorbitan (Tween® 80,
Sigma Ultra; P-8074, y 0,05% v/v de
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton® X 100, Sigma)
en aceite mineral (Sigma; M-3516) ("mezcla
original CSR") con el fin de emulsionar una reacción de
expresión RRL. Todas las reacciones se realizaron utilizando el
sistema de transcripción/traducción acoplado TNT T7 quick (Promega)
que expresa luciferasa de luciérnaga a partir de un plásmido patrón.
Se ensambló una reacción de expresión de 50 \mul en hielo que
comprendía 80% RRL (v/v), metionina 0,02 mM y plásmido patrón de
luciferasa (1 \mug). Una alícuota de 40 \mul se emulsionó
mediante la adición gota a gota (1 gota cada 5 segundos) a 100
\mul de fase oleosa enfriado en hielo con agitación constante
(1000 rpm). Después de la adición de la última gota
(aproximadamente 20 segundos) se continuó la agitación durante 3 a 4
minutos adicionales.
Las reacciones emulsionadas se incubaron a 30ºC
durante 1 hora y se extrajeron utilizando éter tal como se ha
descrito anteriormente. La actividad de luciferasa se midió en un
lector de placas de 96 pocillos utilizando el reactivo de ensayo de
luciferasa (Promega). La reacción no emulsionada se extrajo también
con éter para permitir una justa comparación de las actividades.
Esto demostró que los niveles de expresión en el interior de la
emulsión fueron muy bajos, típicamente el 0,1% el de la reacción no
emulsionada.
Utilizando una formulación de fase oleosa
"reducida", que comprendía 1,5% (v/v) Span® 80 (Sigma) en
aceite mineral (Sigma), se observaron rendimientos ligeramente
mejores de hasta el 0,7%, especialmente con la adición de DTT 20
\muM. La inclusión de DTT con la mezcla de aceite original CSR fue
muy perjudicial para la formación de la emulsión. Se ensayaron
múltiples proporciones de fase acuosa a fase oleosa y múltiples
tiempos de mezclado. Las condiciones descritas anteriormente dieron
la actividad más elevada con retención de la integridad de la
emulsión durante el período de incubación.
Por consiguiente, la emulsificación de una
reacción RRL utilizando la formulación de emulsión "clásica" a
base de Span® 80 sola o en combinación con Triton® 80 y Triton®
X-100 resultó en una pérdida completa de la
actividad de traducción in vitro (< 1% de la expresión
fuera de la emulsión (Tabla 2)) tal como se puede juzgar por la
expresión del enzima luciferasa de luciérnaga.
Además, se observó un cambio de color en el
componente hemo del RRL de un color rosado oscuro a un marrón óxido
en cuestión de minutos después de la emulsificación (véase la Figura
1), lo que indica la oxidación del hemo, presumiblemente atribuible
a un componente de la fase oleosa.
La traducción en mamíferos está regulada,
inter alia, por una familia de kinasas
elF-2\alpha en respuesta al estrés celular
(revisado por Dever (1999), TIBS, 24:398-403). Las
kinasas elF-2\alpha comprenden un dominio sensor
y dominio elF2 kinasa conservado. Su función es fosforilar
elF-2\alpha (lo que inhibe la traducción) en
respuesta a los estímulos recibidos a través del dominio sensor.
Esto sirve para proteger a la célula en circunstancias de estrés
celular debido a disminución de recursos (la traducción de proteínas
consume grandes cantidades de energía celular) o como defensa
antivírica evitando la expresión del genoma vírico. Se conocen 4
kinasas que responden a diferentes tipos de señales de estrés (Tabla
1).
Se razonó que una de las razones de la total
inhibición de la traducción (considerando la decoloración del hemo
en el RRL) era el estrés oxidativo producido por la difusión de
especies oxidantes del aceite en la fase acuosa.
Se identificó que el componente responsable de
la descoloración y la inhibición de la traducción estaba comprendido
tanto en el surfactante Span® 80 como en el Tween® 80 pero no en el
aceite mineral.
Se intentó tamponar el cambio redox mediante la
provisión de compuestos antioxidante o reductores en la fase oleosa
(BDH, BDA) y/o en la fase acuosa (DTT, ácido ascórbico). Además, se
intentó eliminar las especies oxidantes de la fase oleosa mediante
reacción de la fase oleosa (la mezcla de aceite mineral surfactante)
o Span® 80 solamente con cuentas de borohidruro de
poliesterilmetil)trimetilamonio (Novabiochem) o DTT antes de
la emulsión. Aunque ralentizaron la descoloración (Fig. 1), esto
solamente produjo una mejora ligera en la eficacia de la traducción
(Tabla 2). Además, el tratamiento de la fase oleosa con cuentas de
borohidruro pareció reducir las propiedades de formar emulsión de
la fase surfactante/aceite lo que condujo a emulsiones muy
desestabilizadas.
El DTT solo (a 20 \muM concentración final)
produjo una mejora ligera pero consistente en los niveles de
expresión en el interior de la emulsión en comparación con la
reacción no emulsionada (Tabla 2). Niveles de DTT superiores
demostraron ser perjudiciales para el sistema de expresión RRL (no
mostrado). En general el DTT también demostró desestabilizar la
emulsión.
También se intentó una inhibición directa de la
senda elF2 kinasa utilizando AMPc o 2-aminopurina
(2-AP). Aunque el AMPc produjo una pequeña mejora
cuando se utilizó por sí solo, demostró no ser aditivo al efecto
beneficioso del DTT (no mostrado). Tanto el AMPc como el
2-AP son inhibidores de las kinasas elF2 más bien
inespecificos (no se dispone en la actualidad de inhibidores
específicos) y presumiblemente interfieren con otros procesos del
sistema de traducción RRL.
El hecho de que incluso a elevadas
concentraciones de DTT no se rescatase más que una actividad
traduccional residual sugirió que otros factores además de la
oxidación debían contribuir a la inhibición de la traducción. Un
sospechoso fue la desnaturalización de las proteínas producida por
el procedimiento de emulsión, es decir, el mezclado vigoroso de la
fase hidrófila de agua y la fase hidrófoba de aceite. Desde luego,
se conoce desde hace tiempo que la adición de BSA (que
presumiblemente comprende alguna proteína desnaturalizada generada
por la congelación-descongelación) resulta en la
inhibición de la traducción [Matts et al., Biochemistry,
32:7323-7328 (1993)], incluso sin emulsión. Se
confirmaron los resultados de Matts 93 con y sin emulsión. También
se intentó tamponar el efecto supliendo el lisado de RRL con
chaperonas, en particular HSP70 y HSP90 (Sigma). De nuevo, esto
produjo solamente una pequeña mejora (no aditiva) (no mostrada), que
se podía igualar o superar mediante la adición de pequeñas
cantidades (5%) de glicerina (no mostrada), de la que se sabe que
protege a las proteínas frente a la desnaturalización.
Dado el bajo nivel de actividad, se realizaron
esfuerzos para identificar una nueva formulación de fase oleosa con
menor potencial para generar estrés oxidativo o desnaturalización de
las proteínas durante el procedimiento de emulsión.
Después de que fallasen los intentos de mejorar
la actividad con las emulsiones a base de Span® 80 se ensayaron
nuevos surfactantes.
Se realizaron reacciones de emulsión tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, pero con la sustitución de los
surfactantes utilizados en esta reacción (Span®80, Tween®80 y
Triton®) por surfactantes a base de silicona. De entre éstos, se
descubrió que tuvieron éxito los surfactantes a base de silicona
químicamente inertes.
El copolímero de
polisiloxano-policetil-polietilenglicol
(ABIL EM90) (Goldschmidt) utilizado al 4% (v/v) en aceite mineral
produjo mejoras considerables. Emulsionando tal como se describe en
el Ejemplo 1, con la excepción de un tiempo de agitación reducido
(1,5 minutos), los niveles de expresión incrementaron dramáticamente
hasta un 39% (Tabla 2) de los de la reacción no emulsionada. Esta
emulsión fue estable a través del período de incubación, y la
visualización al microscopio reveló que la mayoría de los
compartimentos presentaban un diámetro comprendido entre 2 y 5
micras (Fig.2).
\vskip1.000000\baselineskip
Los telómeros son estructuras de ADN específicas
que se encuentran en los extremos de los cromosomas en los
eucariotas. Están añadidas en el extremo 3' (permaneciendo después
de eliminar el cebador de ARN utilizado en la replicación del ADN)
por el enzima especializado telomerasa, que comprende un componente
de ARN y un componente de proteína. En los humanos, el enzima
comprende ARN telomérico humano (hTR) y el polipéptido telomerasa
humano (hTERT) y añade copias repetidas de la secuencia hexamérica
(TTAGGG) a los extremos de los cromosomas. La actividad telomerasa
ha sido implicada tanto durante el desarrollo tumoral como en la
progresión así como también en la senescencia y muerte celular
programada.
La telomerasa, hasta la fecha, no se ha
expresado con éxito en forma funcional en los procariotas,
presumiblemente porque necesita chaperonas especializadas (por
ejemplo, HSP 90) y factores accesorios para su ensamblaje y
función. Pero se puede expresar en las células eucarióticas y
también en los sistemas de traducción de lisado de reticulocito de
conejo in vitro [Weinrich et al., Nat. Genet.,
17:498-502 (1997); Beatie et al.,
(8:177-180 (1998)].
La fase oleosa del Ejemplo 5 se ensayó para la
expresión de telomerasa humana funcional en RRL. Se prepararon
mediante ampliación por PCR patrones lineales regulados por T7
codificantes tanto de hTERT como de hTR en tándem clonados
corriente abajo del IRES de pCITE4a (Novagen) o hTERT clonado en
pCITE4a con hTR clonado por separado en una variante de pCITE4a (en
el que el IRES está eliminado (pCITE-E)) o un
mutante de deleción inactivo de la telomerasa, utilizando los
plásmidos parentales y cebadores CITET7ba
(5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAA-3') y
CITerto
(5'-CCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC-3').
Las reacciones de expresión (50 \mul)
comprendían RRL (80% v/v), construcción de telomerasa (véase la
leyenda de la Fig. 3), metionina (1 mM), sustrato de telomerasa (TS
(cebador telomerasa) cebador
(5'-AATCCGTCGAGCA
GAGTT-3') (Intergen) 1 \muM), amplificador PCR (Promega) (3 \mul), dNTPs (25 \mul), DTT (20 \muM). Se formaron las emulsiones en condiciones refrigeradas (en hielo) exactamente como se ha descrito anteriormente y se incubaron a 30ºC durante 1,5 horas. A continuación se extrajeron las emulsiones con 200 \mul de cloroformo-alcohol isoamílico, seguido de extracción de la fase acuosa con 1 volumen de fenol-cloroformo.
GAGTT-3') (Intergen) 1 \muM), amplificador PCR (Promega) (3 \mul), dNTPs (25 \mul), DTT (20 \muM). Se formaron las emulsiones en condiciones refrigeradas (en hielo) exactamente como se ha descrito anteriormente y se incubaron a 30ºC durante 1,5 horas. A continuación se extrajeron las emulsiones con 200 \mul de cloroformo-alcohol isoamílico, seguido de extracción de la fase acuosa con 1 volumen de fenol-cloroformo.
Los productos de la reacción de telomerasa se
precipitaron con etanol y se resuspendieron en 20 \mul de agua
estéril. A continuación se utilizó un ensayo TRAP (Kim 94)
(Intergen) a base de PCR con el fin de detectar productos de
extensión de la telomerasa formados en la emulsión. La actividad
telomerasa produce una escalera característica (con un espaciado de
6 bp entre cada repetición) (véase la Fig. 3).
Los resultados indican expresión de telomerasa
funcionalmente activa a partir del patrón WT en emulsión. Los
experimentos control tanto omitiendo la adición del gen de
telomerasa como utilizando un mutante de deleción inactivo dieron
resultados negativos (Fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (21)
1. Emulsión que comprende un surfactante, una
fase hidrófoba y una fase hidrófila que comprende una pluralidad de
microcápsulas que contienen un sistema funcional de expresión
eucariótico in vitro, en el que el surfactante es un
surfactante químicamente inerte a base de silicona.
2. Emulsión según la reivindicación 1, en la que
el surfactante a base de silicona es un copolímero de silicona.
3. Emulsión según la reivindicación 2, en la que
el surfactante a base de silicona es el copolímero
polisiloxano-policetil-polietilenglicol.
4. Emulsión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el surfactante está provisto
en una concentración v/v en la fase oleosa del 4%.
5. Emulsión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la emulsión comprende un
sistema de expresión eucariótico in vitro.
6. Emulsión según la reivindicación 5, en la que
el sistema de expresión eucariótico comprende la totalidad o parte
de un lisado celular de mamífero.
7. Emulsión según la reivindicación 6, en la que
el lisado es un lisado de reticulocitos.
8. Emulsión según la reivindicación 5, en la que
el lisado es un lisado de reticulocitos de conejo.
9. Emulsión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que la expresión y/o la actividad del
producto génico en el interior de la emulsión está a un nivel de
por lo menos el 1% del nivel del producto génico que se puede
obtener mediante el sistema de expresión antes de la formación de la
emulsión.
10. Emulsión según la reivindicación 9, en la
que la expresión y/o la actividad del producto génico en el
interior de la emulsión es de un nivel de por lo menos el 10%, por
lo menos el 20% o por lo menos el 30% del nivel del producto génico
que se puede obtener mediante el sistema de expresión antes de la
formación de la emulsión.
11. Emulsión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la emulsión es estable
durante la incubación a 30ºC durante por lo menos una hora.
12. Emulsión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la fase hidrófoba comprende
un aceite mineral.
13. Procedimiento de obtención de una emulsión
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
agitar juntos en presencia de un surfactante químicamente inerte a
base de silicona una composición hidrófoba y una composición
hidrófila que comprende un sistema de expresión eucariótico.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el surfactante está presente en la composición hidrófoba.
15. Procedimiento de obtención de un producto
génico que comprende formar una emulsión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, permitiendo que el producto génico se
exprese mediante el sistema de expresión y, opcionalmente,
purificar el producto génico.
16. Producto génico obtenido mediante un
procedimiento según la reivindicación 15.
17. Procedimiento para aislar uno o más
elementos genéticos codificantes del producto génico que presenta
una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas formadas a partir de una emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12;
- (b)
- expresar los elementos genéticos con el fin de preparar sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas;
- (c)
- separar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que presenta la actividad deseada.
18. Procedimiento para compartimentar un
elemento genético y expresar el elemento genético con el fin de
formar su producto génico en el interior del compartimento, que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- formar una disolución acuosa que comprende el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo con el fin de formar su producto génico;
- (b)
- microencapsular la disolución con el fin de formar una microcápsula discreta que comprende el elemento genético;
- (c)
- exponer las microcápsulas a condiciones adecuadas para la expresión del elemento genético para formar su producto génico; en el que las microcápsulas se forman a partir de una emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
19. Procedimiento de preparación de un producto
génico, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- preparar un elemento genético que codifica el producto génico;
- (b)
- compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas formadas a partir de una emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12;
- (c)
- expresar los elementos genéticos con el fin de preparar sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas;
- (d)
- separar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que presenta(n) la actividad deseada; y
- (e)
- expresar el producto génico que presenta la actividad deseada.
20. Elemento genético aislado mediante la
utilización del procedimiento según la reivindicación 17.
21. Producto génico aislado mediante la
utilización del procedimiento según la reivindicación 17 o preparado
mediante la utilización del procedimiento según la reivindicación
19.
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