ES2312857T3 - Composiciones y metodos para estabilizar la transtiretina e inhibir el mal replegamiento de la transtiretina. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (Ver fórmula) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde Ar es 3,5-difluorofenilo, 2,6-difluorofenilo, 3,5-diclorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 2-(trifluorometil)fenilo o 3-(trifluorometil)fenilo.
Description
Composiciones y métodos para estabilizar la
transtiretina e inhibir el mal replegamiento de la
transtiretina.
La invención se refiere, en general, a un
plegamiento anómalo de proteínas. Más particularmente, esta
invención proporciona composiciones y métodos para estabilizar la
transtiretina e inhibir el plegamiento anómalo de la transtiretina
y composiciones para tratar enfermedades de amiloides asociadas con
la misma.
La transtiretina (TTR) es una proteína
homotetramérica de 55 kDa presente en suero y en el líquido
cefalorraquídeo. La función de la TTR es transportar
L-tiroxina (T_{4}) y proteína de unión a
holo-retinol (RBP). La TTR es una de las más de 20
proteínas amiloidogénicas no homólogas que pueden transformarse en
fibrillas y otros agregados ocasionando una patología en seres
humanos. Estas enfermedades no parecen producirse por una pérdida
de función debida a la agregación de proteínas, sino que más bien,
la agregación parece producir una disfunción neuronal/celular por
un mecanismo que aún no está claro.
En condiciones desnaturalizantes, la disociación
del tetrámero de TTR de tipo silvestre limitante de la velocidad y
el rápido plegamiento anómalo de los monómeros facilita el
ensamblaje anómalo de amiloide, que produce supuestamente la
amiloidosis sistémica senil (SSA). La disociación y plegamiento
anómalo de una de las más de ochenta variantes de TTR produce la
polineuropatía amiloide familiar (FAP) y la cardiomiopatía amiloide
familiar (FAC).
El tetrámero de TTR tiene dos sitios de unión a
T_{4} simétricos C_{2}. Se sabe que la unión cooperativa
negativamente de T_{4} estabiliza el tetrámero de TTR e inhibe la
formación de fibrillas amiloides. Desafortunadamente, menos de 1%
de TTR tiene T_{4} unida en el suero humano, porque la globulina
de unión al tiroides (TBG) tiene una afinidad un orden de magnitud
mayor por T_{4} que la TTR. Además, la concentración sérica de
T_{4} es relativamente baja (0,1 \muM) en comparación con la de
TTR (3,6-7,2 \muM).
La invención se basa, al menos en parte, en el
descubrimiento de que la estabilización cinética del estado nativo
de la transtiretina inhibe el plegamiento anómalo de la proteína. El
descubrimiento es importante debido al papel que juega el
plegamiento anómalo de la proteína en una diversidad de procesos de
enfermedad, incluyendo enfermedades amiloides por transtiretina. Al
inhibir el plegamiento anómalo de la transtiretina se puede
intervenir en dicha enfermedad, mejorar los síntomas y/o, en
algunos casos, prevenir o curar la enfermedad.
El descubrimiento de que la estabilización
cinética del estado nativo de la transtiretina inhibe eficazmente
el plegamiento anómalo permite el desarrollo de composiciones
terapéuticas con una especificidad potencialmente elevada y baja
toxicidad. De esta manera, aunque en la presente memoria se
describen reactivos de biarilo ilustrativos que tienen la capacidad
de estabilizar la transtiretina, se pueden diseñar otros reactivos
que estabilicen selectivamente la proteína. Por ejemplo, como se
describe en la presente memoria, es posible diseñar y preparar
bifenilos policlorados, análogos de diflunisal o benzoxazoles muy
selectivos para unirse a la transtiretina y estabilizar el estado
nativo de la transtiretina.
La solicitud describe un método para seleccionar
un compuesto que prevenga o reduzca la disociación de un tetrámero
de transtiretina. El método puede incluir las siguientes etapas:
poner en contacto un tetrámero de transtiretina con un compuesto
candidato; y determinar si el compuesto candidato aumenta la energía
de activación asociada con la disociación del tetrámero de
transtiretina, previendo de esta forma o reduciendo la disociación
del tetrámero de transtiretina. El método opcionalmente puede
incluir una etapa adicional de medir la capacidad del compuesto
candidato para inhibir la formación de fibrillas.
La solicitud describe un método que incluye una
etapa para determinar si el compuesto previene la disociación del
tetrámero de transtiretina por medio de la desestabilización del
estado de transición de disociación del tetrámero de transtiretina.
La solicitud también describe un método que incluye la etapa de
determinar si el compuesto previene la disociación del tetrámero de
transtiretina por medio de la estabilización del tetrámero de
transtiretina en lugar del estado de transición de disociación.
El compuesto candidato usado en dicho método
opcionalmente puede ser una molécula pequeña. Dicha molécula
pequeña puede estabilizar el estado nativo de la transtiretina a
través de la unión al tetrámero, ralentizando de esta manera la
disociación y la amiloidosis en condiciones desnaturalizantes y
fisiológicas a través de un mecanismo de estabilización cinética.
El compuesto opcionalmente presenta una estequiometría de unión a
TTR que excede de 0,1 en sangre humana cuando se administra a una
concentración de 10,6 \muM.
Opcionalmente, una molécula pequeña puede tener
un peso molecular menor de 1500 y unirse a la transtiretina
cooperativamente de forma positiva o no y conferir una energía de
unión > 2,3 kcal/mol. La molécula pequeña puede presentar
valores de K_{d1} y K_{d2} < 100 nM (por ejemplo < 10 nM)
y/o una elevada concentración plasmática, contribuyendo ambas cosas
a una estabilización de la proteína superior a 2,0 kcal/mol. La
molécula pequeña también puede reducir el rendimiento de
amiloidosis y reducir la velocidad de amiloidogénesis mediada por
ácidos o mediada por MeOH y/o reducir la velocidad de disociación de
TTR mediada por urea.
La solicitud describe una molécula pequeña que
incluye bifenilaminas, bifenilos, éteres de oxima, benzazoles u
otras estructuras compuestas de dos anillos aromáticos donde uno
lleva grupos hidrófilos tales como un ácido o un fenol y el otro
lleva grupos hidrófobos tales como halógenos o alquilos. La molécula
pequeña de la invención incluye benzazoles.
La solicitud describe un compuesto candidato,
siendo el compuesto candidato un biarilo donde un anillo lleva un
uno o más sustituyentes hidrófilos y el otro tiene sustituyentes
hidrófobos o un biarilo donde los dos anillos llevan al menos un
sustituyente hidrófilo. El grupo hidrófilo puede ser un fenol, un
COOH, un alcohol bencílico, un ácido borónico o un éster, un
tetrazol, un aldehído o un aldehído hidratado o un grupo funcional
que sirve como donador o aceptor de enlaces de H en la proteína
directamente o a través de un enlace de H mediado por agua. El
biarilo puede ser un biarilo simétrico que tiene los dos anillos
sustituidos con funcionalidad hidrófila incluyendo fenoles,
carboxilatos y alcoholes, y en algunos casos halógenos para rellenar
los huecos de unión a halógeno de la TTR, por ejemplo, un biarilo
con la siguiente funcionalidad: 3-Cl,
4-OH, 5-Cl y 3'-Cl,
4'-OH, 5'-Cl. En una realización, al
menos un anillo del biarilo está sustituido con sustituyentes
2,4-difluoro o 3,5-difluoro o
2,6-difluoro o 3,5-dicloro o
3-Cl, 4-OH, 5-Cl o
3-F, 4-OH, 5-F,
3-COOH, 4-OH o 3-OH
o 3-COOH o 4-COOH o
3-CH_{2}OH o 4-CH_{2}OH. Un
biarilo ilustrativo es un Bifenilo policlorado, por ejemplo, un
bifenilo policlorado hidroxilado donde al menos un anillo lleva
sustituyentes OH y/o Cl incluyendo 3-Cl,
4-OH, 5-Cl o 2-Cl,
3-Cl, 4-OH, 5-Cl o
3,4-DiCl o 2,3,4-tricloro o
2,3,4,5-tetracloro. En el compuesto candidato
pueden usarse halógenos distintos de cloruro. El compuesto candidato
de la presente invención es un benzoxazol.
La solicitud describe un compuesto candidato que
es un análogo de diflunisal. En la presente memoria se describe la
estructura del diflunisal así como una diversidad de análogos de
diflunisal. El análogo de diflunisal puede tener opcionalmente una
actividad AINE reducida o ausente en comparación con el diflunisal.
Por ejemplo, el análogo de diflunisal puede tener una actividad
inhibidora de la ciclooxigenasa reducida o ausente en comparación
con el diflunisal.
La solicitud describe un método que incluye una
etapa adicional de determinar si el análogo de diflunisal presenta
actividad como AINE. Por ejemplo, el método puede incluir una etapa
para determinar si el análogo de diflunisal presenta actividad
inhibidora de la ciclooxigenasa.
La transtiretina usada en los métodos de
selección puede ser transtiretina de tipo silvestre o una
transtiretina mutante, tal como una transtiretina mutante natural
asociada causalmente con la incidencia de una enfermedad amiloide
por transtiretina tal como la polineuropatía amiloide familiar o la
cardiomiopatía amiloide familiar. Las transtiretinas mutantes
naturales ilustrativas incluyen, pero sin limitación, V122I, V30M,
L55P (la nomenclatura de mutantes describe la sustitución en la
posición de aminoácido mencionada con respecto al tipo silvestre;
véase, por ejemplo Saraiva et al. (2001) Hum. Mut.
17-493-503).
La invención también proporciona el uso de los
compuestos de la invención para la preparación de un medicamento
para estabilizar la transtiretina en un tejido o un fluido
biológico, y que de esta forma inhibe el plegamiento anómalo. En
general, el uso del medicamento comprende administrar al tejido o
fluido biológico una composición que comprende una cantidad
estabilizadora de un compuesto descrito en la presente memoria que
se une a transtiretina y previene la disociación del tetrámero de
transtiretina por estabilización cinética del estado nativo del
tetrámero de transtiretina.
De esta manera, los métodos que estabilizan la
transtiretina en un tejido enfermo mejoran el plegamiento anómalo y
reducen los síntomas de una enfermedad asociada y, dependiendo de la
enfermedad, pueden contribuir a la curación de la enfermedad. La
invención contempla la inhibición del plegamiento anómalo de
transtiretina en un tejido y/o dentro de una célula. El grado de
plegamiento anómalo y, por lo tanto, el grado de inhibición
conseguida por los presentes métodos puede evaluarse por una
diversidad de métodos tales como los descritos en los ejemplos.
Por consiguiente, en otro aspecto, la invención
incluye el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto que previene la disociación de un tetrámero de
transtiretina mediante la estabilización cinética del estado nativo
del tetrámero de transtiretina, para la preparación de un
medicamento para tratar una enfermedad amiloide por transtiretina
en un sujeto al que se le ha diagnosticado una enfermedad amiloide
por transtiretina.
La solicitud describe el uso de una cantidad
terapéuticamente eficaz de un análogo de diflunisal (por ejemplo,
un análogo de diflunisal que previene la disociación de un tetrámero
de transtiretina) que previene la disociación de un tetrámero de
transtiretina, para la preparación de un medicamento para tratar una
enfermedad amiloide por transtiretina, adecuada para administrarse
a un sujeto al que se le ha diagnosticado una enfermedad amiloide
por transtiretina. El análogo de diflunisal opcionalmente puede
tener una actividad AINE reducida o ausente (por ejemplo, una
actividad inhibidora de ciclooxigenasa) en comparación con el
diflunisal.
La solicitud también describe el uso de una
cantidad terapéuticamente eficaz de un bifenilo policlorado (por
ejemplo, un bifenilo policlorado que previene la disociación de un
tetrámero de transtiretina) que previene la disociación de un
tetrámero de transtiretina, para la preparación de un medicamento
para tratar la enfermedad amiloide por transtiretina, adecuada para
administrarse a un sujeto al que se le ha diagnosticado enfermedad
amiloide por transtiretina. El bifenilo policlorado puede ser un
bifenilo policlorado hidroxilado.
En una realización particular, la invención se
refiere al uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
benzoxazol (por ejemplo, un benzoxazol que previene la disociación
de un tetrámero de transtiretina) que previene la disociación de un
tetrámero de transtiretina, para la preparación de un medicamento
para tratar una enfermedad amiloide por transtiretina, adecuada
para administrarse a un sujeto al que se le ha diagnosticado una
enfermedad amiloide por transtiretina.
La enfermedad amiloide por transtiretina puede
ser, por ejemplo, polineuropatía amiloide familiar, cardiomiopatía
amiloide familiar o amiloidosis sistémica senil.
El sujeto tratado en los presentes métodos puede
ser un ser humano, aunque debe entenderse que los principios de la
invención indican que la invención es eficaz con respecto a todos
los mamíferos. En este contexto, se entiende que un "mamífero"
incluye cualquier especie de mamífero en la que es deseable el
tratamiento de enfermedades asociadas con el plegamiento anómalo de
transtiretina, particularmente especies de mamíferos de ganado y
domésticos.
Los compuestos descritos en la presente memoria
(por ejemplo, compuestos de biarilo tales como análogos de
diflunisal, bifenilos policlorados o benzoxazoles) pueden formularse
con un vehículo farmacéuticamente aceptable para preparar una
composición farmacéutica que comprende el compuesto. Como se usa en
la presente memoria, las expresiones "farmacéuticamente
aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones
gramaticales de las mismas, cuando se refieren a composiciones,
vehículos, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y
significan que los materiales pueden administrarse a un mamífero sin
la producción de efectos fisiológicos indeseables.
La invención también incluye el uso de
cualquiera de los compuestos o composiciones farmacéuticas descritas
en la presente memoria en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad amiloide por transtiretina (por
ejemplo, polineuropatía amiloide familiar, cardiomiopatía amiloide
familiar o amiloidosis sistémica senil).
Los compuestos y el uso para la preparación de
un medicamento descrito en la presente memoria proporcionan
ventajas significativas con respecto a las opciones de tratamiento
disponibles actualmente para la amiloidosis por TTR. La amiloidosis
por TTR típicamente conduce a la muerte en 10 años, y hasta hace
poco se consideraba incurable. El trasplante hepático es un medio
eficaz para reemplazar el alelo asociado con la enfermedad por un
alelo WT en los casos familiares, ya que el hígado típicamente es la
fuente de TTR amiloidogénica. Aunque el trasplante hepático es
eficaz como forma de terapia génica, no carece de problemas. El
trasplante se complica por la necesidad de una cirugía invasiva
tanto para el receptor como para el donante, una terapia
inmunosupresora a largo plazo después del trasplante, escasez de
donantes, su alto coste y el gran número de pacientes con
amiloidosis TTR que no son buenos candidatos debido a la progresión
de su enfermedad. Desafortunadamente, la amiloidosis cardiaca
progresa en algunos pacientes familiares incluso después de
trasplante hepático porque con frecuencia sigue depositándose la
TTR WT. Tampoco se alivia la deposición de TTR en el sistema
nervioso central (SNC) por medio de un trasplante, ya que se
sintetiza en el plexo coroides. El trasplante no es una opción
viable para la enfermedad TTR más prevalente, la amiloidosis
sistémica senil (SSA), que afecta a aproximadamente 25% de los
pacientes con más de 80 años debido a la deposición de TTR WT.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria
tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un
especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta
invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención
pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los
descritos en la presente memoria, más adelante se describen los
métodos y materiales preferidos.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes tras la siguiente descripción detallada, y las
reivindicaciones.
La Fig. 1 es un diagrama esquemático que
representa el sitio de unión a T4 de la transtiretina.
Las Figs. 2A y 2B son gráficos que representan
la evolución a lo largo del tiempo del desplegamiento de
transtiretina en presencia de diferentes inhibidores. Las Figs. 3A
y 3B son gráficos que representan la evolución a lo largo del
tiempo de la formación de fibrillas en presencia de diferentes
inhibidores.
Las Figs. 4A y 4B son gráficos que representan
la evolución a lo largo del tiempo de la formación de fibrillas en
presencia de diferentes inhibidores.
La Fig. 5 representa las estructuras de
bifenilos policlorados seleccionados para la unión a la
transtiretina en plasma sanguíneo.
La Fig. 6 representa las estructuras de
bifenilos policlorados hidroxilados de los que se evaluó la unión a
la transtiretina en plasma junto con sus propiedades de inhibición
de fibrillas amiloides in vitro.
La Fig. 7 es un gráfico que representa la
supresión de la formación de fibrillas de transtiretina por
compuestos de benzoxazol. La posición del carboxilo en el
benzoxazol se muestra en el lado izquierdo, mientras que el anillo
de fenilo C(2) se muestra en la parte inferior. Las barras
indican el porcentaje de formación de fibrillas (ff), es
decir, la cantidad de fibrillas formadas a partir de la
transtiretina (3,6 \muM) en presencia del compuesto de benzoxazol
(7,2 \muM) con respecto a la cantidad formada por transtiretina en
ausencia de inhibidor (que se define como 100%).
La Fig. 8 es un gráfico que representa la
estequiometría (s) de benzoxazoles unidos a transtiretina
después de la incubación en plasma sanguíneo humano. Se usó
inmunoprecipitación con un anticuerpo unido a resina para capturar
la transtiretina. Después de liberar la transtiretina de la resina,
se cuantificaron las cantidades de transtiretina e inhibidor a
partir de las áreas bajo sus picos en un cromatograma de HPLC. El
valor máximo posible de s es 2. Los números de los
compuestos se muestran a lo largo del eje inferior. Las líneas
verticales finas indican el error de medición.
La Fig. 9 es un gráfico que representa la
disociación en función del tiempo (t) para la transtiretina
wt (1,8 \muM) en urea 6 M sin inhibidor, o en presencia de una
concentración 3,6 \muM de compuestos 20, 21 o 27, o una
concentración 1,8 \muM de compuesto 20.
La Fig. 10 representa la estructura
co-cristalina de rayos X del compuesto 20 unido a
transtiretina. Los restos equivalentes en diferentes subunidades se
distinguen por medio de números de restos con comilla y sin comilla,
así como los pares de huecos de unión a halógeno.
Al menos algunas enfermedades amiloides parecen
producirse por la deposición de una cualquiera de más de 20
proteínas o fragmentos proteicos no homólogos, que finalmente
producen una estructura cuaternaria de lámina \beta cruzada
fibrilar. La formación de fibrillas amiloides a partir de una
proteína plegada normalmente tal como la transtiretina requiere un
plegamiento anómalo de la proteína para producir un intermedio
competente con el ensamblaje. El proceso de amiloidogénesis por
transtiretina (TTR) parece producir tres enfermedades amiloides
diferentes - amiloidosis sistémica senil (SSA), polineuropatía
amiloide familiar (FAP) y cardiomiopatía amiloide familiar (FAC).
La SSA está asociada con la deposición de TTR de tipo silvestre,
mientras que la FAP y FAC se producen por la amiloidogénesis de una
de más de 80 variantes de TRR. Véase, por ejemplo, Colon, W.;
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8654-60; Kelly, J.W. Curr. Opin. Struct.
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Ann. Rev. Med. 2000, 51,
543-569; y Saraiva, M. J. Hum. Mutat.
1995, 5, 191-6.
La TTR es un homotetrámero de 55 kDa
caracterizado por simetría 2,2,2, que tiene dos sitios de unión con
forma de embudo idénticos en la interfaz
dímero-dímero, al que puede unirse la hormona
tiroidea (T4) en el plasma sanguíneo y el CSF. La TTR típicamente
se une a menos de un equivalente de proteína de unión a
holo-retinol. El plegamiento anómalo de TTR
incluyendo la disociación del tetrámero en monómeros seguido de
cambios estructurales terciarios dentro del monómero hace que la
proteína sea capaz de montarse de forma anómala, produciendo
finalmente amiloide. El tratamiento disponible para la FAP emplea
la terapia génica mediada por trasplante hepático para reemplazar
la TTR variante en la sangre por la proteína de tipo silvestre (WT).
Esta estrategia tiene poca probabilidad de ser eficaz en caso de
FAC debido a la deposición continua de TTR WT, y no sería útil para
el tratamiento de SSA, donde el proceso de deposición de TTR WT
parece ser el causante de la enfermedad. La terapia de trasplante
hepático también fallaría para aproximadamente 10 de las variantes
de TTR que depositan fibrillas de amiloide en las leptomeninges
produciendo la enfermedad en el SNC, ya que esta TTR se sintetiza
por el plexo coroides. Por lo tanto, es deseable crear una
estrategia terapéutica basada en fármacos no invasiva general.
Puede ser deseable que el fármaco no esté basado en proteínas, en
péptidos ni en ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Blake, C.C.;
et al., J. Mol. Biol., 1978, 121,
339-56; Wojtczak, A.; et al., Acta Crystallogr.
Sect. D. 1996, 758-810; Monaco, H.L.;
Rizzi, M.; Coda, A. Science 1995, 268,
1039-41; Lai, Z.; Colon, W.; Kelly, J. W.
Biochemistry 1996, 35, 6470-82;
Holmgren, G.; et al. Lancet 1993, 341,
1113-6; Suhr, O.B.; Ericzon, B.G. Friman, S.
Liver Transpl. 2002 8, 787-94;
Dubrey, S.W.; et al. Transplantation 1997,
64, 74-80; Yazaki, M.; et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun.: 2000, 274, 702,-6; y
Cornwell, G.G. III; et al. Am. J. of Med. 1983,
75, 618-623.
El plegamiento anómalo de TTR que lleva a la
formación de fibrillas amiloides puede prevenirse por medio de la
estabilización del tetrámero mediada por T4. Varias familias
estructuralmente diversas de estabilizadores del tetrámero se unen
a uno o a los dos sitios de T4 dentro de TTR y previenen la
amiloidosis sin los efectos secundarios probables de la hormona T4.
Estos compuestos estabilizadores del tetrámero incluyen varios
fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como ácido
flufenámico, diclofenaco, flurbiprofeno y diflunisal, que parecen
funcionar aumentando la barrera cinética asociada con la disociación
del tetrámero a través de la unión y la estabilización del estado
basal. Como TTR es el vehículo secundario de la T_{4} en el plasma
sanguíneo, queda sin utilizarse más de 95% de la capacidad de unión
a T4 de TTR, permitiendo la administración de un compuesto
estabilizador del tetrámero que se dirija a estos sitios. Como el
diflunisal es un inhibidor de la ciclooxigenasa-2,
la administración a largo plazo podría producir efectos secundarios
gastrointestinales. Por lo tanto, son deseables análogos de
diflunisal que tengan una actividad AINE reducida o ausente pero que
posean alta afinidad por TTR en el plasma sanguíneo. La primera
etapa hacia este objetivo es el diseño y síntesis de análogos de
diflunisal como inhibidores de la formación de fibrillas amiloides.
Véase, por ejemplo, Miroy, G.J.; et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 1996, 93,
15051-6; Klabunde, T.; et al., Nat. Struct.
Biol., 2000, 7, 312-21; Baures,
P.W.; Peterson S.A; Kelly, J. W. Bioorg. Med. Chem.
1998, 6, 1389-401; Petrassi, H.M.;
et al., J. Am. Chem. Soc. 2000,
122, 2178-2192; Baures, P.W.; et al.
Bioorg. Med. Chem. 1999, 7,
1339-47; Sacchettini, J.C.; Kelly, J. W. Nat.
Rev. Drug. Disc. 2002, 1,
267-275; Oza, V. B.; et al., J. Med. Chem.
2002, 45, 321-32; Bartalena, L.;
Robbins, J. Clin. Lab. Med. 1993, 13,
583-98; Aldred, A.R.; Brack, C.M.; Schreiber, G.
Comp. Biochem: Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 1995,
111, 1-15; y Mao, H.Y.; et al., J. Am.
Chem. Soc. 2001 , 123,
10429-10435.
Las subunidades del tetrámero de TTR están
relacionadas por tres ejes C_{2} perpendiculares. La Fig. 1 es
una representación esquemática del sitio de unión a T4 de TTR, que
demuestra el modo de unión directo donde el carboxilato inhibidor
participa en las interacciones electrostáticas con el amonio
\varepsilon de Lys 15 y 15'. Los dos sitios de unión a T4
equivalentes creados por la interfaz estructural cuaternaria se
intercambian por los dos ejes C_{2} que son perpendiculares al
eje de simetría C_{2} cristalográfico. Cada sitio de unión a T4
puede dividirse en un hueco de unión interna y externa. Véase, por
ejemplo, Blake, C.C.; Oatley, S.J. Nature, 1977, 268,
115-20, que se incorpora como referencia en su
totalidad. El hueco de unión interno comprende un par de huecos de
unión a halógeno (HBP), denominados HBP3 y 3', formados por las
cadenas laterales de Leu 17, Ala 108, Val 121 y Thr 119. La
convergencia de cuatro cadenas laterales de Ser 117 a partir de
cada subunidad define la región más interna y la interfaz entre los
dos sitios de unión idénticos. Los grupos hidroxilo de Ser 117
pueden servir como donadores o aceptores de enlaces de hidrógeno
para la funcionalidad complementaria en el compuesto (por ejemplo,
un inhibidor de la formación de amiloides) o mediar interacciones
electrostáticas con el compuesto a través de moléculas de agua. El
sitio de unión exterior se compone de HBP 1 y 1', mientras que HBP
2 y 2' se colocan en la interfaz de los huecos de unión interno y
externo. Los grupos amonio \varepsilon de la Lys 15 y 15' definen
los límites más externos del hueco de unión externo, permitiendo
interacciones electrostáticas con sustituyentes aniónicos en un
compuesto. Muchos de los compuestos estabilizadores de tetrámeros
de TTR se unen en el modo de unión directo, donde un sustituyente
aniónico en el anillo de fenilo hidrófilo colocado en el hueco de
unión exterior encaja en una interacción electrostática con los
grupos amonio \varepsilon de la Lys 15. En el modo de unión
directo, un anillo de fenilo hidrófobo (a menudo sustituido con
halógenos) puede ocupar el hueco de unión interno. Sin embargo,
también se han observado ejemplos de unión en la orientación
opuesta (el modo de unión inversa). En el modo de unión inversa, un
anillo aromático hidrófilo puede colocarse en el hueco interno,
permitiendo que un carboxilato forme un enlace de hidrógeno con Ser
117 y Ser 117'. En el modo de unión inversa, en el hueco exterior
puede colocarse un anillo hidrófobo sustituido con halógeno.
El diflunisal puede reducir la amiloidogénesis
mediada por ácido de TTR. La estructura del diflunisal (véase el
Ejemplo 2) puede usarse como base para diseñar nuevos compuestos que
puedan inhibir la amiloidogénesis por TTR. Véase, por ejemplo,
Verdeeck, R.K.; et al., Biochem. Pharm. 1980,
29, 571-576; y Nuernberg, B.; Koehler, G.;
Brune, K. Clin. Pharmacokin. 1991, 20,
81-89.
El compuesto puede tener la fórmula:
en la que Ar^{1} es un grupo
arilo o heteroarilo, donde Ar^{1} está opcionalmente sustituido
con uno o más de: halo,
-R^{1}, -OR^{1}, -OC(=O)R^{1}, -OC(=O)OR^{1}, -OC(=O)NHR^{1}, -SR^{1}, -S(=O)R^{1}, -S(=O)_{2}R^{1}, -C(=O)R^{1}, -CO_{2}R^{1}, -C(=O)NHR^{1}, -NR^{1}R^{2}, -NHC(=O)R^{1}, -NHC(=O)NHR^{1}, -NHC(=O)OR^{1} o -NHS(=O)_{2}R^{1}.
-R^{1}, -OR^{1}, -OC(=O)R^{1}, -OC(=O)OR^{1}, -OC(=O)NHR^{1}, -SR^{1}, -S(=O)R^{1}, -S(=O)_{2}R^{1}, -C(=O)R^{1}, -CO_{2}R^{1}, -C(=O)NHR^{1}, -NR^{1}R^{2}, -NHC(=O)R^{1}, -NHC(=O)NHR^{1}, -NHC(=O)OR^{1} o -NHS(=O)_{2}R^{1}.
Ar^{2} es un grupo arilo o heteroarilo, donde
Ar^{2} está opcionalmente sustituido con uno o más de: halo,
-R^{1}, -OR^{1}, -OC(=O)R^{1}, -OC(=O)OR^{1},
-OC(=O)NHR^{1}, -SR^{1}, -S(=O)R^{1},
-S(=O)_{2}R^{1}, -C(=O)R^{1}, -CO_{2}R^{1},
-C(=O)NHR^{1}, -NR^{1}R^{2}, -NHC(=O)R^{1},
-NHC(=O)NHR^{1}, -NHC(=O)OR^{1} o
-NHS(=O)_{2}R^{1}.
Cada R^{1} es, independientemente, hidrógeno o
un grupo alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, alquenilo,
cicloalquenilo, heterocicloalquenilo, alquinilo, arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir.
Cada R^{2} es, independientemente, hidrógeno o
un grupo alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, alquenilo,
cicloalquenilo, heterocicloalquenilo, alquinilo, arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir.
En algunas circunstancias, Ar^{1} puede ser
fenilo sustituido o sin sustituir. Ar^{2} puede ser
independientemente fenilo sustituido o sin sustituir. Ar^{1} y
Ar^{2} pueden ser simultáneamente fenilo sustituido o sin
sustituir. Los sustituyentes pueden ser flúor, cloro, hidroxi,
-CO_{2}H, -CO_{2}Me, -OMe, -CH_{2}OH o formilo. R^{1} puede
ser alquilo inferior.
Los compuestos pueden usarse en forma de sales
farmacéuticamente aceptables obtenidas a partir de ácidos y bases
inorgánicas u orgánicas. Entre estas sales de ácidos se incluyen las
siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato,
bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato,
canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato,
dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato,
glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro,
hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato,
lactato, maleato, metanosulfonato,
2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato,
pectinato, persulfato,
3-fenil-propionato, picrato,
pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y
undecanoato. Las sales de bases incluyen sales de amonio, sales de
metales alcalinos tales como sales sódicas y potásicas, sales de
metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio,
sales con bases orgánicas tales como sales de diciclohexilamina y
N-metil-D-glucamina,
y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares.
Además, los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden estar
cuaternizados con agentes tales como haluros de alquilo inferior
tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y
butilo; sulfatos de dialquilo tales como sulfatos de dimetilo,
dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tales como
cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y
estearilo, haluros de aralquilo tales como bromuros de bencilo y
fenetilo y otros. De esta manera, se obtienen productos solubles o
dispersables en agua o aceite.
Los compuestos pueden estabilizar los tetrámeros
de TTR e inhibir la formación de amiloide de TTR. Los compuestos
pueden ser análogos de diflunisal caracterizados por pequeños
cambios estructurales. Los compuestos pueden usarse para evaluar
relaciones de estructura-actividad, ya que están
relacionados con la inhibición de amiloides de TTR. Los patrones de
sustitución y el número de sustituyentes incluyendo halógenos,
carboxilatos, acilo, alcoxi e hidroxilo pueden variar. Los datos de
estructura-actividad de otras clases de compuestos
revelan que un sustituyente carboxilato o un grupo aniónico análogo
o que forma enlaces de hidrógeno parece ser importante,
participando posiblemente en interacciones electrostáticas con el
grupo \varepsilon-amonio de la Lys 15 y 15' o en
las interacciones de enlaces de hidrógeno con las Ser 117 y 117,
mientras que el anillo hidrófobo sustituido con halógeno rellena
los huecos de unión a halógeno de la TTR. Pueden evaluarse arilos
sustituidos tanto con flúor como con cloro, incluyendo
2-fluoro-, 4-fluoro-,
3,5-difluoro-, 2,4-difluoro- y
2,6-difluoro-. Los grupos arilo sustituidos con
yodo pueden ser menos deseables debido a su susceptibilidad y
potencial para actuar como agonistas de tiroxina. El sustituyente
carboxilato (aniónico) puede estar ausente en algunos análogos para
evaluar su influencia sobre la inhibición de las fibrillas y su
selectividad de unión al plasma. Pueden sintetizarse compuestos que
contienen una funcionalidad de aldehído o alcohol para evaluar la
influencia de un aceptor o donador de enlaces de hidrógeno no
cargado sobre la selectividad de unión e inhibición de las
fibrillas de amiloide. La forma gem-diol del
aldehído puede ser la especie de unión
principal.
principal.
En general, los compuestos pueden sintetizarse
por métodos conocidos en la técnica. Un método para preparar los
compuestos es un acoplamiento de Suzuki:
- BY_{2} =
- B(OH)_{2}, B(OR)_{2}, 9-BBN, B(CHCH_{3}CH(CH_{3})_{2})_{2}
- X =
- I, Br, Cl, OSO_{2}(C_{n}F_{2n+1}), n = 0, 1, 4
- R_{1} =
- arilo, alquenilo, alquilo
- R_{2} =
- arilo, alquenilo, bencilo, alilo, alquilo
Por ejemplo, un compuesto de bifenilo puede
formarse por un acoplamiento de Suzuki de un ácido fenilborónico
con un bromobenceno o un yodobenceno. Pueden necesitarse grupos
protectores apropiados para evitar la formación de productos
secundarios durante la preparación de un compuesto. Por ejemplo, un
sustituyente amino puede protegerse por un grupo protector de amino
adecuado tal como trifluoroacetilo o
terc-butoxicarbonilo. Pueden encontrarse otros
grupos protectores y otras condiciones de reacción en T. W. Greene,
Protective Groups in Organic Synthesis, (3ª, 1999, John
Wiley &, Sons, New York, N.Y.).
Los compuestos descritos en la presente memoria
(por ejemplo, análogos de diflunisal, bifenilos policlorados o
benzoxazoles) pueden formularse en composiciones farmacéuticas que
pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante una
pulverización por inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal,
vaginal o mediante un reservorio implantado. El término
"parenteral", como se usa en la presente memoria, incluye
técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa,
intramuscular, intra-articular,
intra-sinovial, intraesternal, intratecal,
intrahepática, intralesional e intracraneal.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir
cualquiera de los compuestos, o derivados farmacéuticamente
aceptables de los mismos, junto con cualquier soporte
farmacéuticamente aceptable. El término "soporte", como se usa
en la presente memoria, incluye adyuvantes y vehículos aceptables.
Los soportes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las
composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero sin
limitación, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de
aluminio, lecitina, proteínas séricas tales como albúmina de suero
humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido
sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de
ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales
como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico,
hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice
coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias
basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica,
poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de
polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y
lanolina.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en
forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo una
suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión
puede formularse de acuerdo con técnicas conocidas en este campo
usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión
adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una
solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o
disolvente no tóxico aceptable parala vía parenteral, por ejemplo
como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los
vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua,
solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además,
convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente
o medio de suspensión. Para este propósito, puede emplearse
cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o
di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales
como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos son útiles en la
preparación de inyectables, como lo son los aceites
farmacéuticamente aceptables naturales, tales como el aceite de
oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones
polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceite también
pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena
larga.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación
aceptable por vía oral incluyendo, pero sin limitación, cápsulas,
comprimidos y suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de los
comprimidos para uso oral, los soportes que se usan habitualmente
incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente
agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para la
administración oral en forma de una cápsula, los diluyentes útiles
incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren
suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina
con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también
pueden añadirse algunos agentes edulcorantes, aromatizantes o
colorantes.
Como alternativa, las composiciones
farmacéuticas pueden administrarse en forma de supositorios para
administración rectal. Éstas pueden prepararse mezclando el agente
con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura
ambiente pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se
fundirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales
incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
administrarse por vía tópica, especialmente cuando la diana de
tratamiento incluye áreas u órganos a los que se puede acceder
fácilmente por aplicación tópica, incluyendo enfermedades del ojo,
la piel o el tracto intestinal inferior. Para cada una de estas
áreas u órganos se preparan fácilmente formulaciones tópicas
adecuadas.
La aplicación tópica para el tracto intestinal
inferior puede realizarse en una formulación de supositorio rectal
(véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada.
También pueden usarse parches transdérmicos tópicamente.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones
farmacéuticas pueden formularse en una pomada adecuada que contiene
el componente activo suspendido o disuelto en uno o más soportes.
Los soportes para administración tópica de los compuestos incluyen,
pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina
blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de
polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, las
composiciones farmacéuticas pueden formularse en una loción o crema
adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o
disueltos en uno o más soportes farmacéuticamente aceptables. Los
soportes adecuados incluyen, pero sin limitación, aceite mineral,
monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de cetil ésteres,
alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol
bencílico y agua.
Para el uso oftálmico, las composiciones
farmacéuticas pueden formularse como suspensiones micronizadas en
solución salina isotónica de pH ajustado o, preferiblemente, como
soluciones en solución salina estéril isotónica de pH ajustado, con
o sin un conservante tal como cloruro de bencilalconio. Como
alternativa, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticas
pueden formularse en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
administrarse mediante un aerosol nasal o por inhalación por medio
del uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador
de dosis medida. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con
técnicas bien conocidas en este campo de la formulación farmacéutica
y pueden prepararse en forma de soluciones en solución salina,
empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados,
promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad,
fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes
convencionales.
La cantidad de ingrediente activo que puede
combinarse con los materiales de soporte para producir una forma de
dosificación individual variará dependiendo del paciente tratado y
del modo de administración particular. Sin embargo, debe entenderse
que una dosificación y régimen de tratamiento específicos para
cualquier paciente particular dependerán de una diversidad de
factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado,
la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo, momento de
administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos y
el criterio del médico a cargo del caso y la gravedad de la
enfermedad particular que se esté tratando. La cantidad de
ingrediente activo también puede depender del agente terapéutico o
profiláctico, si lo hay, con el que se coadministra el
ingrediente.
Una cantidad eficaz de una composición
farmacéutica es la cantidad que se requiere para otorgar un efecto
terapéutico al paciente tratado, y dependerá de una diversidad de
factores tales como la naturaleza del inhibidor, las dimensiones
del paciente, el objetivo del tratamiento, la naturaleza de la
patología a tratar, la composición farmacéutica específica usada y
el criterio del médico a cargo del caso. Como referencia, véase
Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219 y
Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970,
537. Pueden ser útiles niveles de dosificación comprendidos entre
aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal
al día, y entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg de
peso corporal al día del compuesto ingrediente activo.
A continuación se proporcionan ejemplos de la
práctica de la invención.
Cientos de enfermedades humanas, incluyendo las
amiloidosis, están asociadas con un plegamiento anómalo de las
proteínas. Las 80 mutaciones familiares que exacerban [por ejemplo,
Val30 \rightarrow Met30 (V30M) y Leu55 \rightarrow Pro55
(L55P)] o mejoran [Thr119 \rightarrow Met119 (T119M)] la patología
amiloide por transtiretina (TTR) proporcionan perspectivas valiosas
en relación con el mecanismo. Todas las mutaciones asociadas con la
enfermedad caracterizadas hasta ahora desestabilizan el tetrámero de
TTR, y pueden influir en la velocidad de disociación del tetrámero
limitante de la velocidad, acelerando las velocidades rápidas y
ralentizando las velocidades lentas la amiloidosis. Los presentes
solicitantes aprovecharon el mecanismo por medio del cual T119M
previene la enfermedad en heterocigotos de compuesto V30M para
desarrollar inhibidores de amiloide de TTR de molécula pequeña que
ralentizan espectacularmente el acontecimiento de plegamiento
anómalo inicial (disociación del tetrámero) necesario para la
desnaturalización parcial del monómero, que permite un ensamblaje
anómalo en amiloide y otros agregados.
Se aislaron tetrámeros híbridos para entender
mejor el mecanismo de trans-supresión. El aumento de
la estequiometría de la subunidad T119M con respecto a V30m [o
L55P] desplazó el máximo para la formación de fibrillas mediada por
ácido a un menor pH, redujo la producción total de amiloide a
valores de pH fisiológicamente accesibles (> 4,0) y redujo la
velocidad de amiloidogénesis inducida por ácido (pH 4,4) y mediada
por metanol. Se han descubierto varios inhibidores de fibrillas de
amiloide de TTR de molécula pequeña, de las que se estudió en la
presente memoria descriptiva una subserie, incluyendo dos fármacos
aprobados por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados
Unidos (FDA) (inhibidores 8 y 10) (Sacchettini et al., Nature
Rev. Drug Discovery 1, 267 (2002)). La influencia de la unión al
inhibidor de molécula pequeña sobre la producción y velocidad de
formación de fibrillas de TTR de tipo silvestre (WT) fue similar a
la de la incorporación de subunidades de T119M. Sin embargo, no se
observó el cambio a un valor óptimo de pH inferior para la formación
de fibrillas con ninguno de los inhibidores. Estos inhibidores
funcionan por medio de la unión a los dos sitios de tiroxina
(T_{4}) equivalentes dentro del tetrámero de TTR, no el
monómero.
Las velocidades de disociación del tetrámero se
midieron asociando cambios estructurales cuaternarios lentos con la
transición de desplegamiento, con una velocidad de 5 x 10^{5}
veces la de disociación (Hammarströn et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 99, 16472 (2002)). La disociación detectada por
desnaturalización es irreversible porque la concentración de urea
usada (> 6,0 M) no puede soportar el replegamiento. El aumento
de la estequiometría de la subunidad T119M con respecto a las
subunidades V30M [o L55P] reveló una reducción de la velocidad de
disociación del tetrámero de TTR (1,8 \muM) espectacular
(limitante de la velocidad para la amiloidogénesis) en tres medios
de desnaturalización diferentes (pH ácido, metanol acuoso o urea),
explicando el origen de la prevención de la enfermedad.
Las mediciones de la velocidad de disociación
del tetrámero de TTR WT (1,8 \muM) en presencia de inhibidores 6
a 10 (1,8 y 3,6 \muM) mostraron una ralentización dependiente de
la dosis para todos los complejos inhibidores de TTR. La velocidad
inicial de disociación del tetrámero fue, en general, inversamente
proporcional a la fracción molar del tetrámero unido a dos
inhibidores (T \cdot I_{2}). En el caso de los inhibidores 6, 7
y 9 (1,8 \muM), la amplitud del exponencial sencillo se
correlacionaba principalmente con la disociación del tetrámero sin
ligando (y en un menor grado, T \cdot I), lo cual implicaba que T
\cdot I_{2} prevenía la disociación del tetrámero en urea 6 M.
Por el contrario, la formación de T \cdot I y T \cdot I_{2}
para los inhibidores 8 y 10 no protegía al tetrámero sustancialmente
de la disociación en urea, revelando que la unión sola era
insuficiente. La inhibición eficaz observada en el caso de 6, 7 y 9
(3,6 \muM) fue el resultado de la energía de unión que
estabilizaba el complejo T \cdot I_{2} por energías libres que
excedían de 2,3 kcal/mol (Delta G1 = RT ln([T \cdot I]/[T]) = RT
ln([I]/Kd1) y Delta G2 = RT ln([T \cdot I_{2}]/[T]) = RT
ln{[I]2/(Kd1*Kd2)). La estabilización de T \cdot I_{2}
con respecto a T por 2,7 kcal/mol se traduciría en una reducción de
dos órdenes de magnitud en la velocidad de disociación del tetrámero
de TTR. La fuerte unión cooperativa negativamente de inhibidores 8
y 10 (3,6 \muM) indica que la unión al segundo sitio (T \cdot
I_{2}, constantes de disociación \muM) no estabilizaría
adicionalmente TTR con respecto a la unión al primer sitio (T
\cdot I). Las constantes de disociación nM (Kd1 y Kd2) de los
inhibidores 6, 7 y 9 asegurarían que la estabilización en estado
basal (> 2,3 kcal/mol) sería suficiente para aumentar
sustancialmente la barrera de activación para la disociación del
tetrámero de TTR, siempre que los inhibidores no se unan y
estabilicen de forma similar el estado de transición de disociación.
Las velocidades de disociación del inhibidor del complejo T \cdot
I_{2} y T \cdot I también podrían participar en la eficacia de
los inhibidores 6, 7 y 9. TTR saturado con inhibidor se inmovilizó
por una resina con anticuerpo, sobre la que se pasó tampón acuoso a
5,0 ml/min para evaluar velocidades de disociación eficaces de 6 a
10. Los mejores inhibidores fueron los que tenían las menores
velocidades de disociación aparentes.
Aunque generalmente hay una correlación muy
buena entre las velocidades de amiloidogénesis (condiciones ácidas)
y las velocidades de disociación de tetrámeros (en urea) en
presencia de inhibidores, esto no ocurre necesariamente. La
amiloidogénesis requiere un ensamblaje anómalo dependiente de la
concentración después de la disociación. De esta manera, las
moléculas pequeñas generalmente serán más eficaces para prevenir la
formación de fibrillas que la disociación del tetrámero,
especialmente cuando el inhibidor puede mantener la concentración
del intermedio amiloidogénico monomérico baja (< 3,6 \muM),
cuando la formación de fibrillas es muy ineficaz. Ocasionalmente,
las velocidades de disociación de tetrámero medidas en urea no
predirán de forma precisa el orden de clasificación de eficacias de
inhibidor en condiciones ácidas. Por ejemplo, el fármaco diflunisal
(8) aprobado por la FDA era un inhibidor de amiloides mucho mejor
que un inhibidor de disociación del tetrámero. Una explicación
probable de esta observación es que los valores de Kd1 y/o Kd2 son
menores en ácido que en urea (18). Además, algunos inhibidores se
comportan mucho mejor en condiciones de desnaturalización que lo que
sugerirían sus constantes de unión determinadas en condiciones
fisiológicas. Por ejemplo, el compuesto (9) era más o igual de
eficaz para prevenir la disociación de tetrámeros (urea) y la
formación de fibrillas (ácido) que el inhibidor 7, a pesar de que
el inhibidor 9 tenía valores de Kd1 y Kd2 que eran 10 y 83 veces el
de 7, respectivamente (medidos en condiciones fisiológicas). De
esta manera, es importante juzgar la eficacia de los inhibidores de
plegamiento anómalo en una diversidad de condiciones de
desnaturalización y no sólo en condiciones fisiológicas.
La inclusión de subunidades de
trans-supresor T119M en tetrámeros compuestos de
otra manera de subunidades asociadas con la enfermedad podría
reducir la velocidad de disociación del tetrámero estabilizando el
estado basal tetramérico en una mayor medida que el estado de
transición (como ocurre con los inhibidores de molécula pequeña)
y/o desestabilizando el estado de transición de disociación. Para
distinguir entre estas posibilidades, se compararon las cinéticas
de reconstitución de homotetrámeros WT y T119M. El replegamiento de
monómeros de T119M fue rápido y dentro del error de la velocidad de
plegamiento de los monómeros de TTR WT. Sin embargo, el
re-ensamblaje de monómeros plegados de T119M fue dos
órdenes de magnitud más lento que la tetramerización de monómeros
de TTR WT iniciada por dilución con urea. El proceso de
re-ensamblaje es bifásico, lo cual puede explicarse
por la presencia de un intermedio observable en la ruta de
ensamblaje (probablemente un dímero). En la dirección opuesta, el
tetrámero de T119M se disocia a 1/37 la velocidad presentada por el
tetrámero de TTR WT. Esos efectos cinéticos no pueden atribuirse a
las diferencias en la estabilidad estructural terciaria y/o
estabilidad del tetrámero. Una comparación directa de la estabilidad
termodinámica de monómeros WT y T119M (empleando una construcción
de TTR monomérica modificada por ingeniería genética
(M-TTR)) reveló una diferencia en la energía libre
Delta Delta G para el desplegamiento de solo 0,4 kcal/mol, mucho
menor que las 2,1 y 2,7 kcal/mol requeridas para explicar las
diferencias de la velocidad de disociación y ensamblaje,
respectivamente. Un análisis de ciclo termodinámico de T119M y TTR
WT reveló que T119M impide la disociación del tetrámero
desestabilizando el estado de transición de disociación por
aproximadamente 3,1 kcal/mol, no por estabilización del tetrámero.
De acuerdo con este análisis, el tetrámero de T119M actualmente se
desactabiliza por 0,9 kcal/mol con respecto a WT, lo que confirma
adicionalmente un mecanismo de estabilización cinético. La
diferencia de energía libre entre la disociación del tetrámero WT y
T119M no puede medirse por medio de un desplegamiento mediado por
urea porque la desnaturalización de T119M en urea requiere periodos
de incubación muy largos (varias semanas), durante los cuales la
TTR se modifica. Las comparaciones de curvas de desnaturalización de
cloruro de guanidinio (GdmCl) y tiocianato de guanidinio (GdmSCN)
revelaron que TTR WT era más resistente a la desnaturalización de
GdmCl que T119M, mientras que en GdmSCN ocurría lo contrario. Estas
diferencias en los puntos medios de desnaturalización pueden
atribuirse a la estabilización diferencial de aniones, lo que
sugiere que las verdaderas estabilidades termodinámicas de estas
proteínas son muy similares, aunque no es posible un análisis
cuantitativo en estos caótropos.
La trans-supresión de T119M está
mediada principalmente por la desestabilización del estado de
transición de disociación, coherente con la colocación de T119M en
la interfaz dímero-dímero. Al aumentar la energía
del estado de transición disociativo en 3,1 kcal/mol se previene
eficazmente la disociación del tetrámero porque la barrera de
activación se convierte en insuperable (la vida media de disociación
t1/2 aumenta de aproximadamente 42 horas a > 1500 horas). La
unión de moléculas pequeñas aumenta de forma similar la barrera de
activación asociada con la disociación de tetrámeros de una manera
dependiente de la dosis, aunque esto está mediado por la
estabilización del tetrámero (con respecto a la estabilización del
estado de transición). La medida de la estabilización es máxima
cuando las constantes de disociación de molécula pequeña Kd1 y Kd2
tienen el mínimo valor posible y la concentración de inhibidor es la
máxima posible. Las concentraciones usadas en los experimentos de
los presentes solicitantes para la estabilización en estado basal
son comparables a las observadas en plasma para numerosos fármacos
disponibles por vía oral.
La unión de moléculas pequeñas y la
trans-supresión aumentan la energía de activación
asociada con la disociación del tetrámero, la etapa limitante de la
velocidad de la formación de fibrillas de TTR. El establecimiento
de esta analogía es importante porque se sabe que la
trans-supresión previene la enfermedad en
heterocigotos para el compuesto V30M. La estabilización cinética
del estado nativo es una estrategia particularmente atractiva,
considerando las pruebas que están apareciendo de que los oligómeros
con plegamiento anómalo pequeños son neurotóxicos. Ahora debería
considerarse el descubrimiento de agentes de unión de molécula
pequeña o el desarrollo de una estrategia de
trans-supresión para ajustar el cuadro de energía de
otras proteínas patológicamente relevantes con una predilección por
el plegamiento anómalo.
El diflunisal (I) puede reducir la
amiloidogénesis de transtiretina (TTR). Por ejemplo, en ciertas
condiciones (por ejemplo, TTR 3,6 \muM, diflunisal 3,6 \muM, pH
4,4, 72 h, 37ºC), el diflunisal reduce la amiloidogénesis de TTR en
63%. En estas condiciones, al doblar la concentración de diflunisal
(a 7,2 \muM) se reduce la amiloidogénesis en 97%. El diflunisal
es uno de los mejores inhibidores de fibrillas de amiloide
presentados hasta la fecha y el diflunisal administrado por vía
oral presenta una alta biodisponibilidad, produciendo una
concentración plasmática sostenida que excede de 100 \muM a dosis
de 250 mg dos veces al día. Como el diflunisal es un inhibidor de
la ciclooxigenasa 2, la administración a largo plazo produciría
efectos secundarios gastrointestinales. Por lo tanto, podrían ser
deseables análogos de diflunisal que tengan una actividad AINE
reducida o ausente, pero posean alta afinidad por TTR en plasma
sanguíneo. De esta manera, la estructura del diflunisal puede
usarse como base para diseñar nuevos compuestos que puedan inhibir
la amiloidogénesis de TTR. Véase, por ejemplo, Verbeeck, R.K.;
et al. Biochem. Pharm. 1980, 29, 571; 576; y
Nuemberg, B.; Koehler, G.; Brune, K. Clin. Pharmacoldn.
1991, 20, 81-89.
Se sintetizaron análogos de diflunisal usando
acoplamiento de Suzuki mediado por Pd entre un haluro de arilo y un
ácido aril borónico. La síntesis de los análogos
2-10 se consiguió por acetilación de 3- ó
4-yodofenol con anhídrido acético y piridina,
seguido de acoplamiento de Suzuki con el ácido fluorofenil borónico
apropiado en condiciones de reacción de acoplamiento de Suzuki
convencionales, como se muestra en el Esquema I. La eliminación del
éster con Na^{0} y MeOH (condiciones de Zemplén) proporcionó los
fenoles 2-10. Véase, por ejemplo, Miyaura, N.;
Yanagi, T.; Suzuki, A. Synth. Commun. 1981, 11,
513-519; Sharp, M.J.; Snieckus, V.
Tetrahedron Lett. 1985, 26,
5997-6000; Sharp, M.J.; Cheng, W.; Snieckus, V.
Tetrahedron Lett. 1987, 28,
5093-5096; Pozsgay, V.; Nanasi, P.; Neszmelyi, A.
Carbohydr. Res. 1981, 90,
215-231; Jendralla, H.; Chen, L.-J.
Synthesis 1990, 827-833; y Kelm, J.;
Strauss, K. Spectrochim. Acta, Part A. 1981,
37, 689-692.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análogo de diflunisal 11 se sintetizó usando
métodos de fase sólida, como se muestra en el Esquema 2. Se acopló
ácido 3-yodobenzoico a resina de Wang mediante un
enlazador de éster, produciendo el yoduro de bencilo unido a
resina, que después se acopló con el ácido
2,4-difluorofenilborónico y se escindió de la resina
con una mezcla 1:1 de TFA:CH_{2}Cl_{2}. Véase, por ejemplo,
Guiles, J. W.; Johnson, S. G.; Murray, W. V. J. Org. Chem.
1996, 61, 5169-5171.
\newpage
Esquema
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los sustratos que contienen el carboxilato
12-22 se reunieron por acoplamiento de
3-bromobenzoato de metilo o
4-bromobenzoato de metilo (ambos disponibles en el
mercado) con el ácido fluorofenilborónico apropiado utilizando
condiciones de acoplamiento de Suzuki (véase anteriormente), como se
muestra en el Esquema 3. Después, el éster se saponificó con
LiOH\cdotH_{2}O para proporcionar el carboxilato
correspondiente. Véase, por ejemplo, Burnagin, N. A.; Bykov, V. V.
Tetrahedron 1997, 53,
14437-14450; Ananthakrishnanadar, P.; Kannan, N.
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 1982,
1305-1308; Hornsi, F.; Nozaki, K.; Hiyama, T.
Tetrahedron Lett. 2000, 41,
5869-5872; y Hajduk, P. J.; et al. J. Med.
Chem. 1997, 40, 3144-3150.
Esquema
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se esterificó ácido
5-yodosalicílico usando
TMS-CH_{2}N_{2} y el fenol se convirtió en un
éter metílico empleando MeI. El ácido salicílico protegido se
acopló con los diversos ácidos fluorofenilborónicos y posteriormente
se desprotegió mediante saponificación con LiOH\cdotH_{2}O y
desmetilación con BBr_{3} para proporcionar los derivados de
ácido salicílico 23-27, como se muestra en el
Esquema 4. Véase, por ejemplo, Nicolaou, K. C; et al. Chem. Eur.
J. 1999, 5, 2602-2621; y
Chu-Moyer, M. Y.; et al. J. Med. Chem.
2002, 45, 511-528.
\newpage
Esquema
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos que contienen
3',5'-dihalo-4'-hidroxilo
28-31 se sintetizaron protegiendo primero el
bromofenol disponible en el mercado en forma del éter metílico (MeI
y K_{2}CO_{3}). El acoplamiento de Suzuki con un ácido
(metoxicarbonilfenil)borónico dio como resultado la formación
de los sustratos de bifenilo totalmente protegidos. La escisión del
éter metílico de BBr_{3} y la saponificación con
LiOH-H_{2}O proporcionaron los análogos de
diflunisal totalmente funcionalizados 28-31, como se
muestra en el Esquema 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de éter metílico y éster metílico
de diflunisal se sintetizaron por esterificación del ácido
carboxílico con TMS-diazometano para proporcionar
32, seguido opcionalmente de eterificación con MeI y K_{2}CO_{3}
e hidrólisis del éster con LiOH-H_{2}O para
producir 33. Véase el Esquema 6.
Esquema
6
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\vskip1.000000\baselineskip
Una serie de bifenilos halogenados
34-38 se reunieron por acoplamiento de Suzuki de
yodobenceno con una serie de ácidos borónicos que contienen
halógeno, como se muestra en el Esquema 7. Véase, por ejemplo,
Patrick, T. B.; Wiilaredt, R. P. DeGonia, D. J. J. Org.
Chem. 1988, 50, 2232-2235; Kuchar,
M.; et al. Collection of Czedhoslovak Chemical
Communications 1988, 53,
1862-1872; Alien, K. J.; Bolton, R.; Williams, G.
H. J. Chem. Soc, Pertin Traits. 2 1983,
691-695; Nakada, M.; et al. Bull Chem. Sac
Jpn. 1989, 62, 3122-3126; y
Weingarten, H. J. Org. Chem. 1961, 26,
730-733.
\newpage
Esquema
7
\vskip1.000000\baselineskip
Los aldehídos de biarilo clorados se reunieron
usando 3,5-dicloroyodobenceno y ácido 2-, 3- o
4-formilfenilborónico, como se muestra en el
Esquema 8. Los aldehídos 42-44, que carecían de
sustitución con halógeno, se prepararon de forma análoga. Los
aldehídos 39-41 se oxidaron con KMnO_{4} en
acetona/agua para proporcionar los ácidos carboxílicos
correspondientes 45-57 o se redujeron con NaBH_{4}
en MeOH para proporcionar los alcoholes bencílicos correspondientes
48-50, Esquema 8. La reducción de los aldehídos no
clorados 42-44 con NaBH_{4} y MeOH produjo los
alcoholes bifenilbencílicos 51-53. Véase, por
ejemplo, Song, X. P.; He, H. T.; Siahaan, T. J. Org. Lett.
2002, 4, 549-552; y Nicolaou, K. C.;
et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,
9313-9323; Hashizume, H.; et al. Chem. Pharm.
Bull. 1994, 42, 512-520; Indolese,
A. F. Tetrahedron Lett. 1997, 38,
3513-3516; Pridgea, L. N.; Snyder, L.; Prol, J.
J. Org. Chem. 1989, 54,
1523-1526; Huang, C. G.; Beveridge, K. A.; Wan, P.
J. Am. Chem. Soc 1991, 113,
7676-7684; Wendeborn, S.; et al. Synlett.
1998, 6, 671-675; Stevens, C. V.;
Peristeropoulou, M.; De Kimpe, N. Tetrahedron 2001,
57, 7865-7870; Tanaka, K.; Kishigami, S.;
Toda, F. J. Org. Chem. 1990, 55,
2981-2983; y Clive, D. L. J.; Kang, S. Z. J.
Org. Chem. 2001, 66,
6083-6091.
Esquema
8
\vskip1.000000\baselineskip
Los bifenilos funcionalizados con
3',5'-difluoroformilo 54 y 55 se sintetizaron por
acoplamiento de Suzuki de ácido
3,5-difluorofenilborónico con 2- o
3-yodobenzaldehído, como se muestra en el Esquema 9.
Todos los demás inhibidores se sintetizaron por métodos similares y
se informaron previamente. Los compuestos 10, 21, 35, 36 y 43 están
disponibles en el mercado.
Esquema
9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos y disolventes se adquirieron de
Aldrich Lancaster, Acrbs, Combi-Blocks, Matrix y
Pfaltz-Bauer. El THF y el CH_{2}Cl_{2} se
secaron pasándose por Al_{2}O_{3}. Se obtuvieron otros
disolventes y reactivos de proveedores comerciales y se usaron sin
purificación adicional, a menos que se indique otra cosa. Las
reacciones se controlaron por cromatografía analítica de capa fina
(TLC) sobre placas recubiertas previamente de gel de sílice 60 F254
con indicador de fluorescencia adquirido de EM Science. La
visualización de las placas de TLC se realizó por iluminación con
UV, tratamiento con ácido fosfomolíbdico seguido de calor o
tratamiento con molibdato de amonio y cerio seguido de calor. La
cromatografía ultrarrápida se realizó usando gel de sílice 60
(malla 230-400) de EM Science. La pureza de los
nuevos compuestos que eran esenciales para las conclusiones
extraídas en el texto se determinó por HPLC. La HPLC de fase normal
se realizó con una bomba/controlador Waters 600, un detector de
series de fotodiodos Waters 996 y una columna de sílice Waters
NovaPak. El sistema de disolventes empleado fue hexanos y acetato
de etilo, y los gradientes se realizaron de 50:50 de hexanos:acetato
de etilo a 0:100 de hexanos:acetato de etilo durante 30 min. La
HPLC de fase inversa se realizó con una bomba/controlador Waters
600, un detector de longitud de onda dual Waters 2487 y una proteína
Vydac y columna de péptidos C18. El sistema de disolvente A fue
95:5 de agua:acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,5% y el
disolvente B fue 5:95 de agua:acetonitrilo con ácido
trifluoroacético al 0,5%. Los gradientes se realizaron de 100:0 de
A:B a 0:100 de A:B durante 20 min con un mantenimiento en 100% de B
durante 10 min más. La espectroscopía de dicroísmo circular se
realizó en un espectrómetro AVIV Instruments, modelo 202SF. Los
espectros de RMN se registraron en un espectrómetro de RMN Variari
FT a una frecuencia de protones de 400 MHz. Los desplazamientos
químicos de protones se informan en partes por millón (ppm) con
respecto a CHCl_{3} como patrón interno de desplazamientos
químicos (7,26 ppm) a menos que se indique otra cosa. Las constantes
de acoplamiento se informan en hertzios (Hz). Los desplazamientos
químicos de carbono se informan en partes por millón (ppm) con
respecto a CDCl_{3} como patrón de desplazamientos químicos (77,23
ppm) a menos que se indique otra cosa. Todos los espectros de masas
se obtuvieron en The Scripps Research Institute Center for Mass
Spectrometry o el University of Illinois Mass Spectrometry
Laboratory.
Los compuestos 2-10 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 1. A una solución del
yodofeniléster del ácido acético apropiado (1,0 equiv.) disuelto en
suficiente cantidad de tolueno para dar una concentración de 0,05
M, se le añadió una solución de ácido fenilborónico (1,1 equiv.)
disuelto en EtOH para dar una solución 0,6 M con respecto al ácido
borónico. Se añadió una solución acuosa 2 M de Na_{2}CO_{3} para
dar una concentración de reacción final de 0,03 M con respecto al
yodofenil éster del ácido acético, seguido de la adición de
Pd(PPh_{3})_{4} (al 4,0% en moles). La reacción
se calentó a reflujo en una atmósfera de Ar durante 20 h, y después
de que se completara, se enfrió a ta y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2} (2 x), se lavó con salmuera (1 x), se secó sobre
MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo se purificó por
cromatografía ultrarrápida (10:1 de hexano:acetato de etilo) para
producir el bifenilo acetilado.
Se añadió una cantidad catalítica de Na^{0} a
una solución del bifenilo acetilado en MeOH para proporcionar una
concentración de reacción final de 0,3 M. La reacción se dejó en
agitación a ta en una atmósfera de Ar durante 12 h, después de lo
cual se añadió resina de intercambio catiónico Dowex
50W-X8 para neutralizar la mezcla de reacción. La
resina se filtró y el filtrado se concentró al vacío y se sometió a
cromatografía ultrarrápida (3:1 de hexano:acetato de etilo) para
producir los productos de hidroxibifenilo en forma de sólidos de
color blanco con rendimientos de 22-75%.
2',4'-Difluorobifenil-3-ol
(2). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 9,63 (s a, 13), 7,54 (td, 1H, J = 8,9, 6,7 Hz),
7,34 (ddd, 1H, J = 11,1, 9,2, 2,6 Hz), 7,27 (m, 1H), 7,17
(tdd, 1H, J = 8,3, 2,6, 1,2 Hz), 6,92 (m, 2H), 6,81 (ddd,
1H, J = 8,1, 2,5, 1,0 Hz). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 162,8, 160,3,
157,4, 135,4, 131,8, 129,7, 119,4, 115,6, 114,9, 111,9, 104,4.
HRESIMS calculado para C_{12}H_{8}F_{2}O
(M-H) 205,0466, encontrado 205,0465. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 10,5 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 1,3 min. > 99% de pureza.
\newpage
2',4'-Difluorobifenil-4-ol
(3). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6},400 MHz) \delta
7,49 (td, 1H, J = 9,4, 8,6 Hz), 7,34 (AA'XX', 2H,
J_{AA'} = J_{XX'} = 2,5 Hz, J_{XA} = 8,7
Hz, J_{X'A'} = 8,5 Hz, J_{XA'} = 0,3 Hz,
J_{XA'} = 0,3 Hz, \nu_{A} = \nu_{A'} = 2934,1 Hz,
\nu_{X} = \nu_{X'} = 2746,2 Hz), 7,28 (ddd, 2H, J =
11,3, 9,4, 2,6 Hz), 7,13 (dddd, 1H, J = 8,3, 7,5, 2,8, 1,0
Hz), 6,87 (AA'XX', 2H, como antes). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 162,3, 160,0,
157,2, 131,4, 129,9, 124,8, 115,4, 111,8, 104,3. HRESIMS calculado
para C_{12}H_{8}F_{2}O (M-H) 205,0464,
encontrado 205,0465. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
11,2 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,6 min.
> 98% de pureza.
3',5'-Difluorobifenil-3-ol
(8). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 9,65 (s a, 1H), 7,34 (m, 2H), 7,28 (t, 1H, J = 7,9
Hz), 7,19 (tt, 1H, J = 9,1, 2,2 Hz), 7,13 (ddd, 1H, J
= 7,8, 1,8, 1,0 Hz), 7,08 (t, 1H, J = 2,1 Hz), 6,86 (ddd,
1H, J = 8,0, 2,4, 1,0 Hz). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 162,9, 158,0,
144,1, 139,1, 130,1, 117,6, 115,7, 109,7, 102,6. HRESIMS calculado
para C_{12}H_{8}F_{2}O (M-H) 205,0465,
encontrado 205,0468. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
11,4 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,9 min.
> 99% de pureza.
3',5'-Difluorobifenil-4-ol
(9). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,44
(AA'XX', 2H, J_{AA'} = J_{XX'} = 3,0 Hz,
J_{XA} = 8,0 Hz, J_{X'A'} = 8,5 Hz,
J_{X'A} = 0,7 Hz, J_{XA'} = 0,5, Hz, \nu_{A}
= \nu_{A'} = 2973,8 Hz, \nu_{X} = \nu_{X'} = 2766,0 Hz),
7,05 (dtd, 2H, J = 6,6, 2,4, 0,7 Hz), 6,92 (AA'XX',
2H, como antes), 6,74 (tt, 1H, J = 8,9, 2,4 Hz), 5,11 (s,
1H). ^{13}C RMN (CDCl_{3},100 MHz) \delta 164,7, 156,1, 144,2,
131,8, 128,6, 116,1, 109,6, 102,1. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{2} (M-H) 205,0465,
encontrado 205,0465. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
10,8 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,9 min.
> 99% de pureza.
Ácido
2',4'-difluorobifenil-3-carboxílico
(11). El compuesto 11 se preparó de acuerdo con el Esquema 2. Se
añadieron ácido 3-yodobenzoico (200 mg, 0,81 mmol),
DIEA (140 \mul, 0,81 mmol), EDCI-HCl y HOBt a una
solución de resina de Wang (265 mg, 0,67 mmol, 2,53 mmol/g)
hinchada en CH_{2}Cl_{2} (10 ml). Después de la agitación
vigorosa en un agitador de péptidos durante 22 h a ta, el disolvente
se retiró y la resina se lavó con DMF (3 x 10 ml) y
CH_{2}Cl_{2} (3 x 10 ml) y se secó minuciosamente al vacío.
Se añadieron ácido
2,4-difluorofenilborónico (112 mg, 0,71 mmol),
K_{2}CO_{3} (98 mg, 0,71 mmol) y
Pd_{2}(dba)_{3} (4 mg, 0,01 mmol) a una solución
de resina de Wang funcionalizada (140 mg, 0,35 mmol) hinchada en DMF
(2 ml). Después de agitar a ta, la reacción se filtró y la resina
se lavó con DMF (3 x), H_{2}O (3 x), CH_{2}Cl_{2} (3 x) y
MeOH (3 x) y se secó minuciosamente al vacío.
A la resina funcionalizada se le añadió una
solución de TFA:CH_{2}Cl_{2} (3 ml, 1:1) (140 mg, 0,35 mmol) y
se agitó vigorosamente en un agitador de péptidos durante 13 h a ta.
Después de que se completara, la reacción se filtró, la resina se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (3 x) y el filtrado se concentró al vacío
y se purificó por cromatografía ultrarrápida (2:1 de hexano:acetato
de etilo, ácido acético al 0,5%), para producir el compuesto 11 (81
mg, 100%) en forma de un sólido de color blanco. ^{1}HRMN
(DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta 13,19 (s a, 1H),
8,07 (c, 1H, J = 1,7 Hz), 7,99 (dt, 1H, J = 7,9, 1,6
Hz), 7,78 (dc, 1H, J = 7,8, 1,3 Hz), 7,64 (m, 2H), 7,40
(ddd, 1H, J = 11,1, 8,8'', 2,5 Hz), 7,22 (tdd, 1H, J =
8,4, 2,8, 1,0 Hz). ^{13}CRMN (DMSO-d_{6},100
MHz) \delta 167,0, 160,7, 160,4, 134,5, 133,0, 132,0, 131,3,
129,4, 129,1, 128,7, 123,9, 112,2, 104,6. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{8}F_{2}O_{2} (M-H) 233,0414,
encontrado 233,0426. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
13,7 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,5 min.
> 99% de pureza.
Los compuestos 12-22 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 3. A una solución del
bromobenzoato de metilo apropiado (1,0 equiv.) disuelto en
suficiente cantidad de tolueno para dar una concentración de 0,1 M
se le añadió una solución de ácido fenilborónico (2,0 equiv.)
disuelto en EtOH para dar una solución 1,0 M de ácido borónico. Se
añadió una solución acuosa 2 M de Na_{2}CO_{3} para dar una
concentración de reacción final de 0,06 M con respecto al
bromobenzoato, seguido de la adición de
Pd(PPh_{3})_{4} (al 10,0% en moles). La reacción
se agitó a 70ºC en una atmósfera de Ar durante 25 h y, después de
que se completara, se enfrió a ta y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}
(2 x), se lavó con salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se
concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía
ultrarrápida (10:1 de hexano:acetato de etilo) para producir el
éster metílico.
A una solución de éster metílico (1,0 equiv.) en
THF:MeOH:H_{2}O (1:1:1) a una concentración de 0,06 M se le
añadió LiOH\cdotH_{2}O (3,0 equiv.). La reacción se agitó a ta
durante 4 h y, después de que se completara, se acidificó con HCl
al 30%, se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 ml), se secó sobre
MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo se purificó por
cromatografía ultrarrápida (CH_{2}Cl_{2}, MeOH al 1%, ácido
acético al 0,2%) para producir los ácidos bifenilcarboxílicos en
forma de sólidos de color blanco con rendimientos de 6 - 93%.
Ácido
2',4'-difluorobifenil-4-carboxílico
(12). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 13,09 (s a, 1H), 8,04 (AA'XX', 2H, J_{AA'}
= J_{XX'} = 2,0 Hz, J_{XA} = J_{X'A'} =
8,0 Hz, J_{X'A} = J_{XA'} = 0,7 Hz, \nu_{A} =
\nu_{A'} = 3213,3 Hz, \nu_{X} = \nu_{X'} = 3056,2 Hz),
7,65 (AA'XX', 2H, como antes), 7,63 (m, 1H), 7,38 (ddd,
1H, J = 11,2, 9,0, 2,8 Hz), 7,21 (td, 1H, J = 8,4,
2,2 Hz). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz)
\delta 167,1, 160,8, 158,0, 138,6, 132,1, 130,1, 129,6, 129,0,
123,9, 112,2, 104,7. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{8}F_{2}O_{2} (M-H) 233,0414,
encontrado 233,0407. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
13,3 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,6 min.
> 99% de pureza.
Ácido
2'-fluorobifenil-3-carboxílico
(15). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 8,18 (c, 1H,
J = 1,4 Hz), 8,03 (dt, 1H, J = 7,8, 1,3 Hz), 7,76 (dc,
1H, J = 7,7, 1,5 Hz), 7,55 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,48
(td, 1H, J = 7,8, 1,7 Hz), 7,38 (dddd, 1H, J = 8,3,
7,5, 5,1, 1,8 Hz), 7,26 (td, 1H, J = 7,6, 1,3 Hz), 7,20
(ddd, 1H, J = 11,0, 8,2, 1,2 Hz). ^{13}C RMN (CD_{3}OD,
100 MHz) \delta 169,7, 161,2, 137,5, 134,6, 132,4, 132,0, 131,3,
130,1, 129,9, 129,5, 126,0, 117,2. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{9}FO_{2} (M-H) 215,0508, encontrado
215,0498. Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 10,6 min.
Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,1 min. > 99% de
pureza.
Ácido
2'-fluorobifenil-4-carboxílico
(16). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 13,10 (s a, 1H), 8,05 (AA'XX', 2H, J_{AA'}
= J_{XX'} = 1,7 Hz, J_{XA} = J_{X'A'} = 8,5 Hz,
J_{X'A} = J_{XA'} = 0,3 Hz, \nu_{A} =
\nu_{A'} = 3217,9 Hz, \nu_{X} = \nu_{X'} = 3070,0 Hz),
7,67 (AA'XX', 2H, como antes), 7,58 (td, 1H, J = 8,0,
1,8 Hz), 7,34 (m, 1H). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6},
100 MHz) \delta 167,1, 159,1, 139,4, 130,8, 130,3, 130,2, 129,6,
129,0, 127,3, 125,1, 116,2. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{9}FO_{2} (M-H) 215,0508, encontrado
215,0515. Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 12,3 min.
Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,2 min. > 99% de
pureza.
Ácido
3',5'-difluorobifenil-3-carboxílico
(17). ^{1}H RMN (acetona-d_{6}, 400 MHz)
\delta 8,30 (td, 1H, J = 2,0,5 Hz), 8,10 (dtd,
1H, J = 7,6, 1,1, 0,5 Hz), 7,97 (ddd, 1H, J = 7,8,
2,0, 1,1 Hz), 7,64 (td, 1H, J = 7,8, 0,6 Hz), 739 (m, 2H),
7,06 (tt, 1H, J = 9,3, 2,4 Hz). ^{13}C RMN
(acetona-d_{6}, 100 MHz) \delta 167,4, 165,6,
163,2, 144,6, 139,8, 132,5, 132,4, 130,6, 130,3, 128,9, 111,0,
103,7. HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{2}
(M-H) 233,0414, encontrado 233,0425. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 13,5 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 12,7 min. > 99% de pureza.
Ácido
3',5'-difluorobifenil-4-carboxílico
(18). ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 13,15 (s a, 1H), 8,02 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,85 (d,
2H, J = 8,5 Hz), 7,49 (m, 2H), 7,26 (tt, 1H, J = 9,4,
2,4 Hz). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz)
\delta 166,4, 164,1, 161,7, 142,6, 141,6, 130,9, 130,0, 127,1,
110,2, 103,5. HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{2}
(M-H) 233,0414, encontrado 233,0423. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 13,0 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 12,8 min. > 99% de pureza.
Ácido
2',6'-Difluorobifenil-3-carboxílico
(19). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 8,03 (dt, 1H, J = 7,8, 1,6 Hz), 8,00 (m, 1H), 7,72
(dt, 1H, J = 7,8, 1,4 Hz), 7,64 (t, 1H, J = 7,7 Hz),
7,53 (m, 1H), 7,26 (t, 2H, J = 8,3 Hz). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6},100 MHz) \delta 167,7, 158,7, 135,0,
132,2, 131,4, 131,1, 129,9, 129,5, 129,5, 112,8, 110,9. HRESIMS
calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{2} (M-H)
233,0414, encontrado 233,0410. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 12,1 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,1
min. > 97% de pureza.
Ácido
2',6'-Difluorobifenil-4-carboxílico
(20). ^{1}HRMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 8,06 (AA'XX', 2H, J_{AA'} =
J_{XX'} = 2,0 Hz, J_{XA} = J_{X'A'} = 8,0
Hz, J_{X'A} = J_{XA'} = 0,7 Hz, \nu_{A} =
\nu_{A'} = 3243,6 Hz, \nu_{X} = \nu_{X'} = 3018,6 Hz),
7,60 (AA'XX', 2H, como antes), 7,54 (m, 1H), 7,27 (t, 2H,
J = 8,3 Hz). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100
MHz) \delta 171,0, 164,0, 134,1, 125,7, 122,0, 121,9, 121,1,
103,4. HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{2}
(M-H) 233,0414, encontrado 233,0425. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 14,5 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 12,1 min. > 99% de pureza.
Ácido
bifenil-4-carboxílico (22).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta 13,07
(s a, 1H), 8,03 (AA'XX', 2H, J_{AA'} = J_{XX'} = 1,8 Hz,
J_{XA} = J_{X'A'} = 8,3 Hz, J_{X'A} =
J_{XA'} = 0,3 Hz, \nu_{A} = \nu_{A'} = 3210,7 Hz,
\nu_{X} = \nu_{X'} = 3122,0 Hz), 7,81 (AA'XX', 2H,
como antes), 7,75 (m, 2H), 7,51 (tt, 2H, J = 7,2, 1,1 Hz),
7,43 (tt, 1H, J = 7,4, 1,2 Hz). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 167,2, 144,2,
139,0, 130,0, 129,8, 129,1, 128,3, 127,0, 126,8. HREIMS calculado
para C_{13}H_{10}O_{2} (M+) 198,0683, encontrado 198,0683.
Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 13,8 min. Tiempo de
retención de HPLC de fase inversa: 12,2 min. > 99% de pureza.
5-Yodo-2-metoxibenzoato
de metilo. Se añadió TMS-diazometano (19,25 ml,
38,50 mmol, solución 2 M en hexano) a una solución de ácido
5-yodosalicílico (5,08 g, 19,24 mmol) en MeOH (20
ml) y se agitó a ta durante 11 h. Después de que se completara, la
reacción se concentró al vacío y el residuo se llevó a la siguiente
etapa sin purificación adicional.
Se añadieron yoduro de metilo (2,40 ml, 38,48
mmol) y K_{2}CO_{3} (10,60 g, 76,96 mmol) a una solución de
5-yodo-2-metoxibenzoato
(5,37 g, 19,24 mmol) en DMF (20 ml) y la mezcla se agitó a ta en una
atmósfera de Ar durante 24 h. Después de que se completara, se
añadió acetato de etilo y la reacción se lavó con HCl al 1% (2 x 20
ml) y salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al
vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (3:1
de hexano:acetato de etilo) para producir
5-yodo-2-metoxibenzoato
de metilo (4,93 g, 88%) en forma de un sólido de color blanco.
Véase, por ejemplo, Corey, E. J.; Myers, A. G. J. Am, Chem.
Soc. 1985, 107, 5574-5576, que se
incorpora como referencia en su totalidad. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta 7,90 (d, 1H,
J = 2,4 Hz), 7,80 (dd, 1H, J = 8,8, 2,4 Hz), 6,96 (d,
1H, J = 9,0 Hz), 3,81 (s, 3H), 3,79 (s, 3H). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6,} 100 MHz) \delta 164,7, 158,0,
141,6, 138,5, 122,2, 115,2, 82,1, 55,9, 52,0. HREMS calculado para
C_{9}H_{9}IO_{3} (M+) 291,9608, encontrado 291,9596.
Los compuestos 23-27 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 4. A una solución de
5-yodo-2-metoxibenzoato
de metilo (1,0 equiv.) disuelto en suficiente cantidad de tolueno
para dar una concentración de 0,08 M se le añadió una solución de
ácido fenilborónico (2,0 equiv.) disuelto en EtOH para dar una
solución 0,8 M de ácido borónico. Se añadió una solución acuosa 2 M
de Na_{2}CO_{3} para dar una concentración de reacción final de
0,06 M con respecto al metoxibenzoato, seguido de la adición de
Pd(PPh_{3})_{4} (10,0% en moles). La reacción se
agitó a 60ºC en una atmósfera de Ar durante 15 h y, después de que
se completara, se enfrió a ta y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2
x), se lavó con salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se
concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía
ultrarrápida (3:1 de hexano:acetato de etilo) para producir los
salicilatos metilados.
A una solución del salicilato metilado (1,0
equiv.) en suficiente cantidad de CH_{2}Cl_{2} para dar una
concentración de 0,06 M se le añadió BBr_{3} (2,0 equiv, solución
1 M en CH_{2}Cl_{2}). La reacción se agitó a ta en una
atmósfera de Ar durante 4 h y, después de que se completara, se
interrumpió con H_{2}O (10 ml), se extrajo con CH_{2}Cl_{2}
(2 x), se lavó con salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se
concentró al vacío. El residuo se llevó a la siguiente etapa sin
purificación adicional.
A una solución de éster metílico (1,0 equiv.) en
THF:MeOH:H_{2}O (1:1:1) a una concentración de 0,06 M se le
añadió LiOH\cdotH_{2}O (3,0 equiv.). La reacción se agitó a ta
durante 4 h y, después de que se completara, se acidificó con HCl
al 30%, se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 ml), se secó sobre
MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo se purificó por
cromatografía ultrarrápida (CH_{2}Cl_{2},MeOH al 1%, ácido
acético al 0,2%) para producir los salicilatos de bifenilo en forma
de sólidos de color blanco con rendimientos de 12 - 42%.
Ácido
4'-fluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico
(23). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 8,01 (d, 1H,
J = 2,5 Hz), 7,65 (dd, 1H, J = 8,7, 2,5 Hz), 7,51 (m,
2H), 7,11 (tt, 2H, J = 10,0, 3,0 Hz); 6,97 (d, 1H, J
= 8,7 Hz. ^{13}C RMN (CD_{3}OD, 100 MHz) \delta 173,5, 165,0,
162,7, 137,7, 135,1, 132,6, 129,6, 129,3, 118,9, 116,7, 116,6,
114,2. HRESIMS calculado para C_{13}H_{9}FO_{3}
(M-H) 231,0459, encontrado 231,0457. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 14,2 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 12,8 min. > 99% de pureza.
Ácido
2'-fluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico
(24). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 7,98 (dd,
1H, J = 2,2, 1,4 Hz), 7,59 (ddd, 1H, J = 8,7, 2,4, 1,7
Hz), 7,36 (td, 1H, J = 7,8, 1,7 Hz), 7,26 (dddd, 1H,
J = 9,9, 7,4, 4,9, 1,7 Hz), 7,16 (td, 1H, J = 7,5, 1,2
Hz), 7,10 (ddd, 1H, J = 11,1, 8,2, 1,3 Hz), 6,95 (d, 1H,
J = 8,5 Hz). ^{13}C RMN (CD_{3}OD, 100 MHz) \delta 173,5,
162,9, 162,4, 137,2, 131,8, 130,2, 130,1, 129,1, 128,1, 125,1,
118,5, 117,1, 114,0. HRESIMS calculado para C_{13}H_{9}FO_{3}
(M-H) 231,0457, encontrado 231,0446. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 13,8 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 12,7 min. > 99% de pureza.
Ácido
3',5'-difluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico
(25). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 8,07 (d, 1H,
J- 2,5 Hz), 7,73 (dd, 1H, J = 8,5, 2,7 Hz), 7,15 (m, 2H); 101
(d, 1H, J = 8,9 Hz), 6,86 (tt, 1H, J = 9,0, 2,5 Hz).
^{13}C RMN (CD_{3}OD, 100 MHz) \delta 173,3, 156,3, 163,8,
145,1, 135,2, 131,0, 129,8, 119,2, 114,4, 110,4, 103,0. HRESIMS
calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{3} (M-H)
249,0363, encontrado 249,0356. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 145 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 13,3
min. > 99% de pureza.
Ácido
2',4'-dicloro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico
(26). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 7,83 (d, 1H,
J = 2,2 Hz), 7,70 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,58 (dd, 1H,
J = 8,6, 2,4 Hz), 7,48 (ABX, 1H, J_{AB} =
8,4 Hz, J_{AX} = 2,2 Hz, J_{BX} = 0,0 Hz,
\nu_{A}= 2989,4 Hz, \nu_{B} = 2973,0 Hz), 7,44 (ABX,
1H, como antes), 7,06 (d, 1H, J = 8,7 Hz). ^{13}C RMN
(CD_{3}OD, 100 MHz) \delta 171,6, 160,8, 137,5, 136,4, 132,8,
132,6, 132,4, 130,8, 129,2, 128,5, 127,7, 117,2, 112,9. HRESIMS
calculado para C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{3} (M-H)
280,9772, encontrado 280,9782. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 13,1 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 14,4
min. > 93% de pureza.
Ácido
4-hidroxibifenil-3-carboxílico
(27). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 8,08 (d, 1H,
J = 2,4 Hz), 7,73 (dd, 1H, J = 8,7, 2,3 Hz), 7,54 (m,
2H), 7,41 (tt, 2H, J = 7,3, 1,8 Hz), 7,29 (tt, 1H, J
= 7,8, 1,7 Hz), 7,38 (dddd, 1H, J = 8,8, 6,4 Hz), 7,05 (d,
1H, J = 8:7 Hz), 6,93 (m, 1H), 6,90 (ddd, 1H, J =
7,3, 1,9 Hz), 7,00 (d, 1H, J = 8,5 Hz). ^{13}C RMN
(CD_{3}OD, 100 MHz) \delta 151,5, 140,1, 134,0, 132,4, 128,7,
128,3, 126,9, 126,3, 117,5, 112,9. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{10}O_{3} (M-H) 213,0552, encontrado
213,0545. Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 12,9 min.
Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 12,6 min. > 99% de
pureza.
4-Bromo-2,6-difluoroanisol.
Se añadieron yoduro de metilo (580 \mul, 10,06 mmol) y
K_{2}CO_{3} (2,80 g, 20,12 mmol) a una solución de
4-bromo-2,6-difluorofenol
(1,05 g, 5,03 mmol) en DMF (10 ml) y se agitó a ta en una atmósfera
de Ar durante 24 h. Después de que se completara, se añadió acetato
de etilo y la reacción se lavó con HCl al 1% (2 x 20 ml) y salmuera
(1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo
se purificó por cromatografía ultrarrápida (hexano) para producir
4-bromo-2,6-difluoroanisol
(747 mg, 67%) en forma de un sólido de color blanco. Véase, por
ejemplo, Chambers, R. D.; et al. J. Fluorine Chem.
2000, 102, 169-174. ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,06 (m, 2H), 3,97 (c, 3H, J =
1,1 Hz). ^{13}C RMN (CDCl_{3},100 MHz) \delta 155,8, 136,3,
116,2, 113,8, 61,9. LREIMS encontrado para C_{7}H_{8}F_{2}OBr
(M+) 223,0.
4-Bromo-2,6-dicloroanisol.
Se añadieron yoduro de metilo (67 \mul, 8,12 mmol) y
K_{2}CO_{3} (2,24 g, 16,24 mmol) a una solución de
4-bromo-2,6-diclorofenol
(982 mg, 4,06 mmol) en DMF (10 ml) y se agitó a ta en una atmósfera
de Ar durante 40 min. Después de que se completara, se añadió
acetato de etilo y la reacción se lavó con HCl al 1% (2 x 20 ml) y
salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío. El
residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (hexano) para
producir
4-bromo-2,6-dicloroanisol
(768 mg, 74%) en forma de un sólido de color blanco. Véase, por
ejemplo, Li, J.; et al. J. Med. Chem. 1996, 39,
1846-1856. ^{1}HRMN
(DMSO-d_{6}, 400 MHz) 8 7,75 (s, 2H), 3,81 (s,
3H). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta
151,3, 131,5, 129,6, 116,5, 60,6. HREIMS calculado para
C_{7}H_{5}BrCl_{2}O (M+) 253,8905, encontrado 253,8901.
Los compuestos 28-31 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 5. A una solución del
halo-anisol apropiado (1,0 equiv.) disuelto en
tolueno suficiente para dar una concentración de 0,25 M, se le
añadió una solución de ácido fenilborónico (2,0 equiv.) disuelto en
EtOH para dar una solución 1,5 M de ácido borónico. Se añadió una
solución acuosa 2 M de Na_{2}CO_{3} para dar una concentración
de reacción final de 0,08 M con respecto al
halo-anisol, seguido de la adición de
Pd(PPh_{3})_{4} (10,0% en moles). La reacción se
agitó a 65ºC durante 17 h y, después de que se completara, se
enfrió a ta y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x), se lavó con
salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío. El
residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (20:1 de
hexano:acetato de etilo) para producir el bifenilo metilado en forma
de un sólido de color blanco.
A una solución del bifenilo metilado (1,0
equiv.) en suficiente cantidad de CH_{2}Cl_{2} para dar una
concentración de 0,20 M se le añadió BBr_{3} (2,0 equiv, solución
1 M en CH_{2}Cl_{2}). La reacción se agitó a ta en una
atmósfera de Ar durante 3 h y, después de que se completara, se
interrumpió con H_{2}O (10 ml), se extrajo con CH_{2}Cl_{2}
(2 x), se lavó con salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se
concentró al vacío. El residuo se llevó a la siguiente etapa sin
purificación adicional.
A una solución de éster metílico (1,0 equiv.) en
THF:MeOH:H_{2}O (1:1:1) a una concentración de 0,04 Mse le añadió
LiOH-H_{2}O (3,0 equiv.). La reacción se agitó a
ta durante 5 h y, después de que se completara, se acidificó con
HCl al 30%, se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 ml), se secó
sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo se purificó
por cromatografía ultrarrápida (CH_{2}Cl_{2}, MeOH al 1%, ácido
acético al 0,2%) para producir los productos de bifenilo en forma
de sólidos de color blanco con un rendimiento de 14 - 39%.
Ácido
3',5'-Difluoro-4'-hidroxibifenil-3-carboxílico
(28). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 10,60 (s a, 1H), 8,14 (t, 1H, J = 1,7 Hz), 7,91
(dt, 1H, J = 7,7, 1,1 Hz), 7,88 (ddd, 1H, J = 8,0,
2,0, 1,1 Hz), 7,55 (t, 1H, J = 7,9 Hz), 7,41 (m, 2H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 167,3,
154,0, 151,5, 138,4, 133,6, 131,6, 130,8, 129,9, 129,4, 128,4,
127,1, 110,3. HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{3}
(M-H) 249,0363, encontrado 249,0358. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 18,3 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 10,5 min. > 98% de pureza.
Ácido
3',5'-difluoro-4'-hidroxibifenil-4-carboxílico
(29). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 7,98 (AA'XX', 2H, J_{AA' =} J_{XX'} =
1,7 Hz, J_{XA} = J_{X'A'} = 8,2 Hz, J_{XA'} = J_{XA'} = 0,5
Hz, \nu_{A} = \nu_{A'} = 3189,9 Hz, \nu_{X} =
\nu_{X'} = 3122,0 Hz), 7,81 (AA'XX', 2H, como antes), 7,51 (m,
2H). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta
167,7, 154,5, 142,5, 136,0, 130,5, 130,5, 130,4, 126,9, 111,0,
HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O_{3}
(M-H) 249,0363, encontrado 249,0375. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 18,9 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 10,2 min. > 99% de pureza.
Ácido
3',5'-dicIoro-4'-hidroxibifenil-3-carboxílico
(30). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 8,13 (t, 1H, J = 1,6 Hz), 7,91 (m, 2H), 7,70 (s,
2H), 7,56 (t, 1H, J = 7,8 Hz). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6},100 MHz) \delta 167,2, 149,0,
137,9, 132,2, 131,6, 130,8, 129,3, 128,4, 127,1, 126,8, 122,9,123,0.
HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{3}
(M-H) 280,9772, encontrado 280,9767. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 16,2 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 11,6 min. > 99% de pureza.
Ácido
3',5'-dicloro-4'-hidroxibifenil-4-carboxílico
(31). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 7,98 (AA'XX', 2H, J_{AA'} = J_{XX'} =
1,7 Hz, J_{XA} = J_{X'A'} = 8,1 Hz, J_{X'A} =
J_{XA'} = 0,5 Hz, \nu_{A} = \nu_{A'} = 3189,9 Hz,
\nu_{X} = \nu_{X'} 3110,0 Hz), 7,81 (AA'XX', 2H,
como antes), 7,78 (s, 2H). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 167,2, 141,8,
141,7, 134,7, 129,9, 129,7, 126,9, 126,4, 123,0. HRESIMS calculado
para C1_{3}H_{8}Cl_{2}O_{3} (M-H) 280,9772,
encontrado 280,9785. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
15,9 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 11,4 min.
> 97% de pureza.
2',4'-difluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxilato
de metilo (32). Los compuestos 32 y 33 se prepararon de acuerdo
con el Esquema 6. Se añadió TMS-diazometano (5,87
ml, 11,75 mmol, solución 2 M en hexano) a una solución de
diflunisal (1,03 g, 4,11 mmol) en MeOH (10 ml) y se agitó a ta
durante 5 h. Después de que se completara, la reacción se concentró
al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida
(10:1 de hexano:acetato de etilo) para producir el compuesto 32
(774 mg, 71%) en forma de un sólido de color blanco. ^{1}HRMN
(CDCl_{3},400 MHz) \delta 7,97 (dd, 1H, J = 2,2, 1,3
Hz), 7,59 (dt, 1H, J = 8,8, 2,1 Hz), 7,36 (dc, 1H, J
= 7,7, 1,5 Hz), 7,48 (td, 1H, J = 7,8, 1,7 Hz), 7,38 (dddd,
1H, J = 8,8, 6,4 Hz), 7,05 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 6,93
(m, 1H), 6,90 (ddd, 1H, J = 10,6, 8,9, 2,5 Hz), 3,96 (s, 3H).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170,6, 163,6, 161,3,
158,5, 136,4, 131,2, 130,3, 126,2, 124,2, 118,0, 112,6, 111,8,
104,6, 52,6, 124,2. HRFABMS calculado para
C_{14}H_{10}F_{2}O_{3} (M+) 264,0596, encontrado 264,0598.
Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 6,9 min. Tiempo de
retención de HPLC de fase inversa: 14,7 min. > 99% de
pureza.
Ácido
2',4'-difluoro-4-metoxibifenil-3-carboxílico
(33). Se añadieron yoduro de metilo (350 \mul, 1,16 mmol) y
K_{2}CO_{3} (320 mg, 2,32 mmol) a una solución del compuesto 32
(152 mg, 0,58 mmol) en DMF (4 ml) y se agitó a ta en una atmósfera
de Ar durante 14 h. Después de que se completara, se añadió acetato
de etilo y la reacción se lavó con HCl al 1% (2 x 20 ml) y salmuera
(1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío y se llevó
a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Se añadió LiOH\cdotH_{2}O (60 mg, 1,43 mmol)
a una solución de diflunisal totalmente metilado (140 mg, 0,50
mmol) en MeOH:THF:H_{2}O (4,5 ml 1:1:1) y se agitó a ta durante 4
h. Después de que se completara, la reacción se acidificó con HCl
al 30%, se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 ml), se secó sobre
MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo se purificó por
cromatografía ultrarrápida (2:1 de acetato de etilo:hexano, ácido
acético al 1%) para producir 33 (122 mg, 93%) en forma de un sólido
de color blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 10,77
(s a, 1H), 8,31 (dd, 1H, J = 2,5, 0,9 Hz), 7,75 (dt, 1H,
J = 8,6, 2,1 Hz), 7,41 (dt, 1H, J = 8,9, 6,6Hz), 7,15
(d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,94 (m, 1H), 4,13 (s, 3H). ^{13}C RMN
(CDCl_{3},100 MHz) \delta 177,7, 161,4, 158,2, 135,7, 133,9,
131,4, 129,0, 123,5, 118,1, 112,2, 112,0, 104,6, 56,9. HRESIMS
calculado para C_{14}H_{10}F_{2}O_{3} (M-H)
263,0520, encontrado 263,0514. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 21,6 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 11,9
min. > 99% de pureza.
Los compuestos 34-38 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 7. Los compuestos
39-44 se prepararon de acuerdo con el Esquema 8. A
una solución de yoduro de arilo (1,0 equiv.) en suficiente cantidad
de tolueno para dar una concentración de 0,07 M, se le añadió un
ácido formilfenilborónico apropiado disuelto en suficiente cantidad
de EtOH para proporcionar una concentración de 0,4 M de ácido
borónico. Se añadió una solución acuosa 2 M de Na_{2}CO_{3}
para dar una concentración de reacción final de 0,04 M con respecto
al yoduro de arilo, seguido de la adición de
Pd(PPh_{3})_{4} (3,0% en moles). La reacción se
calentó a reflujo en una atmósfera de Ar durante 18 h y, después de
que se completara, se enfrió a ta y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}
(2 x), se lavó con salmuera (1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se
concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía
ultrarrápida (40:1 de hexano:acetato de etilo) para producir los
aldehídos de bifenilo en forma de sólidos de color blanco con
rendimientos de 40 - 91%.
3',5'-Dicloro-3-formilbifenilo
(39). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 10,09 (s, 1H),
8,04 (t, 1H, J = 1,8 Hz), 7,91 (dt, 1H, J = 7,6, 1,3
Hz), 7,80 (ddd, 1H, J = 7,8, 2,0, 1,3 Hz), 7,64 (t, 1H,
J = 7,8 Hz), 7,49 (d, 2H, J = 1,8 Hz), 7,38 (t, 1H,
J = 1,9 Hz). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 192,0,
142,8, 139,7, 137,2, 135,8, 133,0, 130,1, 130,0, 128,1, 128,0,
125,9, HRFABMS calculado para C_{13}H_{8}Cl_{2}O (M+H)
251,0027, encontrado 251,0027. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 8,0 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 15,2
min. > 99% de pureza.
3',5'-Dicloro-4-formilbifenilo
(40). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,99
(AA'XX', 2H, J_{AA'}- = J_{XX'} = 2,1 Hz, J_{XA} =
J_{X'A'} = 8,5 Hz, J_{X'A} = J_{XA'} = 0,7 Hz, \nu_{A} =
\nu_{A'} = 3193,7 Hz, \nu_{X} = \nu_{X'} = 3077,8 Hz),
7,70 (AAXX', 2H, como antes), 7,47 (t, 1H, J = 1,9
Hz), 7,39 (d, 2H, J = 1,9 Hz). ^{13}C RMN (CDCl_{3},100
MHz) \delta 191,8, 144,4, 142,9, 136,2, 135,8, 130,6, 128,5,
127,9, 126,1, HREIMS calculado para C1_{3}H_{8}Cl_{2}O
(M-H) 248,9873, encontrado 248,9874. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 7,9 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 15,2 min. > 99% de pureza.
3',5'-Dicloro-formilbifenilo
(41). ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 9,98 (s, 1H),
8,03 (dd, 1H, J = 7,8, 1,3 Hz), 7,66 (td, 1H, J =
7,6, 1,5 Hz), 7,55 (tt, 1H, J = 7,6, 1,0 Hz), 7,44 (t, 1H,
J = 1,9 Hz), 7,39 (dd, 1H, J = 7,7, 1,0 Hz), 7,27 (d,
2H, J = 1,9 Hz). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta
191,4, 142,9, 141,0, 135,3, 134,0, 133,7, 130,7, 129,0, 128,5,
128,4, 128,4, HRFABMS calculado para C_{13}H_{8}Cl_{2}O (M+H)
251,0030, encontrado 251,0029. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 7,0 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 14,9
min. > 99% de pureza.
Los compuestos 45-47 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 8. A una solución de bifenilo
aldehído (1,0 equiv.) en suficiente cantidad de acetona para dar
una concentración de 0,07 M, se le añadió KMnO_{4} (2,0 equiv.)
en suficiente cantidad de H_{2}O para dar una concentración de 0,2
M de permanganato. La reacción se agitó durante 16 h a ta y después
de que se completara, se concentró al vacío y el residuo resultante
se disolvió de nuevo en 10:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH y se filtró a
través de un lecho de lana de vidrio. El producto en bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida (10:1 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir los ácidos carboxílicos (58
mg, 100%) en forma de sólidos blancos con rendimientos de 82
-100%.
Ácido
2',4'-diclorobifenil-3-carboxílico
(45). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz)
\delta 8,22 (s a, 1H), 8,00 (s a, 1H), 7,94 (d, 1H, J =
7,5 Hz), 7,76 (s, 2H), 7,63 (s, 1H), 7,60 (s a, 1H). ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 168,0, 143,7,
138,1, 135,4, 131,6, 129,9, 127,9, 126,2. HRESIMS calculado para
C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{2} (M-H) 264,9823,
encontrado 264,9810. Tiempo de retención de HPLC de fase normal:
12,3 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 14,2 min.
> 99% de pureza.
Ácido
2',4'-diclorobifenil-4-carboxílico
(46). ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 8,11 (s a, 2H),
7,72 (m, 2H), 7,64 (d, 2H, J = 1,9 Hz), 7,46 (t, 1H, J
= 1,7 Hz). ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz)
\delta 170,3, 140,6, 135,2, 127,2, 126,4, 119,3, 118,6, 117,4,
HRESIMS calculado para C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{2}
(M-H) 264,9830, encontrado 264,9823. Tiempo de
retención de HPLC de fase normal: 12,5 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 14,4 min. > 99% de pureza.
Ácido
2',4'-diclorobifenil-2-carboxílico
(47). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6},400 MHz)
\delta 7,75 (s a, 1H), 7,56 (s,2H), 7,48 (m, 2H), 7,36 (m, 2H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta 170,1,
152,5, 145,2, 133,3, 130,0, 129,6, 128,0, 127,2, 126,3. HRESIMS
calculado para C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{2} (M-H)
264,9823, encontrado 264,9834. Tiempo de retención de HPLC de fase
normal: 11,4 min. Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 13,6
min. > 99% de pureza.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos 48-53 se
prepararon de acuerdo con el Esquema 8. A una solución de bifenilo
aldehído (1,0 equiv.) en suficiente cantidad de MeOH para dar una
concentración de 0,1 M, se le añadió NaBH_{4} (2,0 equiv.) en
suficiente cantidad de MeOH para dar una concentración de 0,3 M de
borohidruro. La reacción se agitó a 0ºC, se calentó lentamente
hasta la ta, después se agitó durante 16 h, se concentró al vacío y
se purificó por cromatografía ultrarrápida (3:1 de hexano:acetato
de etilo) para producir los bifenil alcoholes en forma de sólidos
de color blanco con rendimientos de 94 -100%.
3',5'-Diclorobifenil-3-il-metanol
(48). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,54 (m, 1H),
7,46 (d, 2H, J = 1,8 Hz), 7,45 (m, 2H), 7,39 (m, 1H), 7,34
(t, 1H, J = 1,9 Hz), 4,77 (s, 2H), 1,90 (s a, 1H). ^{13}C
RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 144,1, 141,9, 139,0, 135,5,
129,5, 127,4, 127,1, 126,5, 125,8, 125,7, 65,3. HREIMS calculado
para C_{13}H_{10}Cl_{2}O (M+) 252,0103, encontrado 252,0109.
Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 13,9 min. Tiempo de
retención de HPLC de fase inversa: 14,0 min. > 99% de
pureza.
3',5'-Diclorobifenil-4-il-metanol
(49). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,53
(AA'XX', 2H, J_{AA'} = 1,9 Hz, J_{XX'} = 3,1 Hz,
J_{XA} = 8,7 Hz, J_{X'A'} = 6,4 Hz, J_{X'A} = J_{XA'} = 0,5
Hz, \nu_{A} = \nu_{A'} = 3009,8 Hz, \nu_{X} =
\nu_{X'} = 2977,8 Hz), 7,45 (AA'XX', 2H, como antes),
7,45 (d, 2H, J = 1,9 Hz), 7,33 (t, 1H, J = 1,9 Hz),
4,75 (d a, 2H, 7= 4,8 Hz), 1,81 (t a, 1H, J = 5,2 Hz).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 144,0, 141,4, 138,0,
135,5, 127,8, 127,4, 127,4, 125,8, 65,1. HREIMS calculado para
C_{13}H_{10}Cl_{2}O (M+) 251,0110, encontrado 252,0109. Tiempo
de retención de HPLC de fase normal: 15,4 min. Tiempo de retención
de HPLC de fase inversa: 14,0 min. > 97% de pureza.
3',5'-Diclorobifenil-2-il-metanol
(50). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7,55 (dd,
1H, J = 7,5, 1,3 Hz), 7,43 (td, 2H, J = 7,5, 1,4 Hz),
7,38 (m, 2H), 7,29 (d, 2H, J = 1,9 Hz), 7,24 (dd, 1H,
J = 7,4, 1,4 Hz), 4,58 (s, 2H), 1,79 (s, 1H). ^{13}C RMN
(CDCl_{3}, 100 MHz)_{ }\delta 143,7, 138,9, 137,9,
134,9, 130,0, 129,0, 128,9, 128,2, 127,9, 127,6, 63,0. HREIMS
calculado para C_{13}H_{10}Cl_{2}O (M+) 252,0110, encontrado
252,0109. Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 11,5 min.
Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 14,0 min. > 99% de
pureza.
Los compuestos 54 y 55 se prepararon de acuerdo
con el Esquema 9. A una solución del yodobenzaldehído (1,0 equiv.)
en suficiente cantidad de tolueno para dar una concentración de 0,07
M, se le añadió ácido 3,5-difluorofenil borónico
(2,0 equiv.) disuelto en suficiente cantidad de EtOH para
proporcionar una concentración 1,0 M de ácido borónico. Se añadió
una solución acuosa 2 M de Na_{2}CO_{3} para dar una
concentración de reacción final de 0,04 M con respecto al
yodobenzaldehído, seguido de la adición de
Pd(PPh_{3})_{4} (4,0% en moles). La reacción se
agitó a 60ºC durante 17 h y, después de que se completara, se enfrió
a ta y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x), se lavó con salmuera
(1 x), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío. El residuo
se purificó por cromatografía ultrarrápida (10:1 de hexano:acetato
de etilo) para producir los bifenil aldehídos en forma de sólidos
de color blanco con rendimientos de 78 - 80%.
3',5'-Difluoro-3-formilbifenilo
(54). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 10,06 (s, 1H),
8,02 (t, 1H, J = 1,4 Hz), 7,88 (dt, 1H, J = 7,8, 1,4
Hz), 7,78 (ddd, 2H, J = 7,8, 2,0, 12 Hz), 7,61 (t, 2H,
J = 7,7), 7,10 (m, 2H), 6,80 (tt, 1H, J = 8,8, 2,3 Hz).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 192,0, 164,8, 162,3,
143,0, 139,8, 137,1, 132,9, 129,9, 127,9, 110,4, 103,5. HRFABMS
calculado para C_{13}H_{8}F_{2}O (M+H) 219,0620, encontrado
219,0621. Tiempo de retención de HPLC de fase normal: 8,9 min.
Tiempo de retención de HPLC de fase inversa: 13,7 min. > 99% de
pureza.
3',5'-Difluoro-4-formilbifenilo
(55). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 9,98 (s, 1H),
8,02 (dd, 1H, J = 7,8, 1,5 Hz), 7,65 (td, 1H, J =
7,3, 1,4 Hz), 7,54 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,40 (dd, 1H,
J = 7,6, 1,2 Hz), 6,90 (m, 3H). ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 100
MHz) \delta 191,5, 164,1, 161,6, 143,4, 141,3, 134,0, 133,7,
130,6, 129,0, 128,3, 113,3, 103,8, HRFABMS calculado para
C_{13}H_{8}F_{2}O (M+H) 219,0620, encontrado 219,0621. Tiempo
de retención de HPLC de fase normal: 7,0 min. Tiempo de retención de
HPLC de fase inversa: 13,4 min. > 99% de pureza.
Pueden usarse varios ensayos in vitro
para evaluar la capacidad de los compuestos para estabilizar los
tetrámeros de transtiretina o prevenir la formación de fibrillas.
Los ensayos pueden incluir un ensayo de formación de fibrillas, un
ensayo de selectividad en plasma, determinación de la estructura
tridimensional de un complejo de transtiretina:compuesto (por
ejemplo, por cristalografía de rayos X), cinéticas de disociación
de tetrámeros de transtiretina o formación de fibrillas, y la
determinación de la estequiometría y energética de las
interacciones de transtiretina:compuesto, por ejemplo, por
centrifugación o calorimetría. Más adelante se presentan detalles
de los ensayos ilustrativos in vitro.
Cada compuesto se sometió a un ensayo de
formación de fibrillas inmovilizado. Los compuestos se secaron sobre
P_{2}O_{5} durante una noche y se disolvieron en DMSO a una
concentración final de 7,2 mM para proporcionar una solución madre
primaria (solución madre 10x). Se preparó una solución madre
secundaria por medio de la dilución 5 veces de la solución madre
primaria con DMSO a una concentración final de 1,44 mM (solución
madre 2x). La amiloidogenicidad mediada por ácido de TTR (3,6
\muM) en presencia de inhibidores (1,44 mM) se midió como se
indica a continuación: en un cubeta UV desechable se añadieron 495
\mul de una solución de proteína TTR WT de 0,4 mg/ml en fosfato
sódico 10 mM, KCl 100 mM y EDTA 1 mM (pH 7,6) y 5 \mul de la
solución madre secundaria de inhibidor 1,44 mM en DMSO (solución
madre 2x). La mezcla se sometió a agitación vorticial y se incubó
durante 30 minutos (25ºC), después de lo cual el pH se redujo a 4,4
con 500 \mul de acetato 200 mM, KCl 100 mM, y EDTA 1 mM (pH 4,2).
Un mililitro de solución final se agitó vorticialmente y se incubó
durante 72 horas a 37ºC sin agitación. Después de 72 horas, las
cubetas se sometieron a agitación vorticial para suspender
cualquier fibrilla presente y se midió la turbidez de la suspensión
a 350 y 400 nm usando un espectrómetro UV-vis. El
porcentaje de formación de fibrillas se obtuvo por la relación de
las turbideces observadas para cada TTR más muestra de inhibidor
con respecto a la de una muestra preparada de la misma manera pero
sin inhibidor, multiplicada por 100. Se realizó un ensayo de
formación de fibrillas empleando concentraciones equimolares de
inhibidor y TTR (3,6 \muM) como se ha indicado anteriormente
usando una solución madre secundaria 1x. La solución madre 1x se
preparó diluyendo 10 veces la solución madre primaria 10x 7,2 mM con
DMSO a una concentración final de 0,72 mM y se usó en el ensayo de
formación de fibrillas descrito anteriormente. Todos los ensayos se
realizaron por triplicado y todos los compuestos se ensayaron usando
TTR de tipo silvestre. Se descubrió que todos los compuestos eran
solubles a lo largo de todo el trascurso del experimento ensayando
la turbidez de las soluciones en ausencia de TTR WT, lo que asegura
que la turbidez era el resultado de la formación de amiloides de
TTR.
Las estequiometrías de unión de los inhibidores
potenciales a TTR en plasma sanguíneo se evaluaron por un método de
captura de anticuerpo/HPLC. Un tubo Eppendorf de 1,5 ml se rellenó
con 1,0 ml de plasma sanguíneo humano y 7,5 \mul de una solución
en DMSO 1,4 mM del inhibidor bajo evaluación. La solución se incubó
y se agitó suavemente a 37ºC durante 24 horas. A la solución se le
añadió una suspensión 1:1 de gel:TSA (solución salina Tris) (125
\mul) de sepharose inactivada y se agitó suavemente a 4ºC durante
una hora. La solución se centrifugó (16.000 x g) y el sobrenadante
se dividió en dos alícuotas de 400 \mul, que después se añadieron
a diferentes muestras de 200 \mul de una suspensión 1:1 de gel:TSA
de la sepharose conjugada con anticuerpo anti-TTR.
Las soluciones se agitaron suavemente a 4ºC durante 20 minutos, se
centrifugaron (16.000 x g) y el sobrenadante se retiró. El gel se
lavó con 1 ml de TSA/saponina al 0,05% (3x, 10 minutos cada x) a
4ºC, seguido de 1 ml de TSA (2x, 10 minutos cada x) a 4ºC. Las
muestras se centrifugaron (16.000 x g), se retiró el líquido de
lavado final y se añadieron 155 \mul de trietilamina 10 mM, pH
11,5 para eluir la TTR y los inhibidores unidos de los anticuerpos.
Después de una agitación suave a 4ºC durante 30 minutos, la muestra
de elución se centrifugó (16.000 x g) y se retiraron 145 \mul del
sobrenadante que contenía TTR e inhibidor. Después, el sobrenadante
se analizó por HPLC de fase inversa como se ha descrito previamente.
Véase, por ejemplo, Purkey, H.E.; Dorrell, M.L.; Kelly, J.W.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98,
5566-71.
Se obtuvieron cristales de TTR WT a partir de
soluciones de proteína a 7 mg/ml (en KC1 100 mM, EDTA 1 mM; fosfato
sódico 10 mM, pH 7,0, sulfato amónico 0,35-0,50 M)
equilibrado frente a sulfato amónico 2 M en gotas colgantes. Los
complejos de TTR-ligando se prepararon a partir de
cristales empapados durante más de 3 semanas con un exceso molar de
10 veces del ligando. Se usó un detector
CCD-PXL-L600 (Broker instruments)
acoplado a un generador de rayos X de ánodo giratorio RU200 para
recoger los datos de los cristales empapados con 20 ó 26. Para
recoger los datos de los cristales empapados con 1 ó 18 se usó el
detector Quantum-4 con la fuente de alta energía
monocromática de 14-BM-C, BIOCARS,
Advance Photon Source. Los cristales se pusieron en aceite Paratone
como crioprotector y se enfriaron para los experimentos de
difracción (120 K para 20 y 26 y 100 K para 1 y 18). Los cristales
de las estructuras complejas de TTR\cdotligando son isomorfas con
la forma de cristal apo con dimensiones de celdas unitarias
próximas a \alpha = 43 \ring{A}, b = 85 \ring{A} y
c = 66 \ring{A}; grupo espacial P2_{1}2_{1}2 con
dos monómeros en la unidad asimétrica. Las series de datos de 1 y
18 se redujeron con DENZO y SCALEPACK. Véase Otwinowski, Z.; Minor,
W. Macromolecular Crystallography, Part A, in Methods in
Enzymology, Carter, C.W., Sweet, R. M. Eds.; Academic Press:
1997; Vol. 276, pág. 307-326. Las series de datos
de 20 y 26 se redujeron con SAINT y PROSCALE (Broker AXS, Inc.).
Las coordenadas atómicas de la proteína para TTR
del banco de datos de proteínas (número de acceso IBMZ) se usaron
como modelo de partida durante la búsqueda de reemplazo molecular
por EPMR. Las mejores soluciones para EPMR se refinaron por
protocolos de dinámica molecular y minimización de energía de CNS.
Los mapas de Fourier de diferencias resultantes revelaron la unión
de los ligandos (en dos conformaciones para 18, 20 y 26, y cuatro
conformaciones para 1) en cada hueco de unión del tetrámero de TTR.
Usando estos mapas, el ligando podía colocarse inequívocamente en
la densidad y se incluyó en el refinado cristalográfico. Después de
varios ciclos de templado simulado y el posterior refinado del
factor de temperatura y posicional, se pusieron moléculas de agua
en los mapas de Fourier de diferencias. El ciclo final de ajuste de
mapas se realizó usando el mapa de densidad de electrones ponderado
no sesgado calculado por el protocolo de retirada de sesgo
"shake/warp". Todas las conformaciones de unión del ligando
estaban de acuerdo con los mapas de omisión templados sin sesgo así
como con los mapas ponderados no sesgados "shake/warp" con
fases en ausencia del inhibidor. Los ciclos finales del refinado se
realizaron por el protocolo de refinado limitado de Refmac. Debido a
la ausencia de densidades electrónicas interpretables en el mapa
final, en el modelo final no se incluyeron los nueve restos
N-terminales y los tres restos C-terminales. En la
Tabla 2 se presenta un resumen del análisis cristalográfico. Véase,
por ejemplo, Kissinger, C.R.; Gehlhaar, D.K.; Fogel, D.B. Acta
Crystallogr., Sect. D 1999, 55,
484-491; Brunger, A.T.; et al. Acta Crystallogr.,
Sect. D 1998, 54, 905-921;
Kantardjieff; K.; et al., Acta Crystallogr., Sect. D
2002, 58, 735-743; Bailey, S. Acta
Crystallogr., Sect. D 1994, 50,
760-763; y Murshudov, G.N.; Vagin, A.A.; Dodson,
E.J. Acta Crystallogr., Sect. D 1997, 53,
240-25.
La cinética de disociación del tetrámero de TTR
se evalúo por medio del desplegamiento del monómero unido en urea.
Una disociación lenta del tetrámero no se puede detectar por
espectroscopia ultra-UV CD, pero está asociada a la
rápida etapa de desplegamiento (500.000 veces más rápida) que puede
detectarse fácilmente usando ultra-UV CD como se ha
descrito previamente. Se evalúo la cinética de disociación del
tetrámero de TTR (3,6 \muM) en función de inhibidor (3,6 \muM)
añadiendo 3,6 \mul de una solución 1 mM (en etanol) del inhibidor
de interés a 69 \mul de TTR WT (2,90 mg/ml, fosfato sódico 10 mM,
KCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0) a la que se habían añadido 127,4
\mul de tampón fosfato. Para una concentración de inhibidor (7,2
\muM) dos veces mayor que la concentración de TTR (3,6 \muM),
se añadieron 7,2 \mul de una solución 1 mM (en etanol) del
inhibidor de interés a 69 \mul de TTR WT (2,90 mg/ml, fosfato
sódico 10 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0) a la que se habían
añadido 123,8 \mul de tampón fosfato. Se añadieron 100 \mul de
la solución de proteína-inhibidor de interés a una
solución de 600 \mul de urea 10,3 M y 300 \mul de tampón
fosfato, para producir una concentración final de urea de 6,5 M.
Las soluciones se agitaron vorticialmente y se recogieron los
espectros de dicroismo circular a los siguientes intervalos: 0, 5,
8, 23, 46, 71, 95, 118, 144 y 168 h. Se preparó una muestra de
control que contenía 7,2 \mul de etanol en lugar de inhibidor para
la comparación y los espectros se recogieron en los mismos puntos
de tiempo identificados anteriormente. Los espectros de CD se
recogieron entre 220 y 213 nm, con exploración cada 0,5 nm y un
tiempo de promediado de 10 segundos. Cada longitud de onda se
exploró una vez. Los valores para la amplitud se promediaron entre
220 y 213 nm para determinar el grado de pérdida de lamina \beta
a lo largo del experimento.
La velocidad de formación de fibrillas mediada
por ácidos se siguió a pH 4,4 por medio de la turbidez. Los
compuestos se secaron sobre P_{2}O_{5} durante una noche y se
disolvieron en DMSO a una concentración final de 7,2 mM para
proporcionar una solución madre primaria (solución madre 10x). Se
preparó una solución madre secundaria diluyendo en DMSO 5 veces la
solución madre primaria para producir una concentración final de
1,44 mM (solución madre 2x). El ensayo de formación de fibrillas
empleando una concentración del inhibidor de 7,2 \muM con
respecto a TTR 3,6 \muM (tetrámero) se realizó como se indica a
continuación: a una cubeta UV desechable se le añadieron 495 \mul
de una solución de proteína TTR WT a 0,4 mg/ml en fosfato sódico 10
mM, KCl 100 mM y EDTA 1 mM (pH 7,6) y 5 \mul de la solución madre
secundaria de inhibidor 1,44 mM (solución madre 2x). La mezcla se
sometió agitación vorticial y se incubó durante 30 minutos (25ºC).
Después de 30 minutos, el pH se redujo a 4,4 con 500 \mul de
acetato 200 mM, KCl 100 mM y EDTA 1 mM (pH 4,2). La solución final
de 1 ml de agitó vorticialmente y se incubó a 37ºC sin agitación.
Las soluciones se agitaron vorticialmente y se midió la turbidez a
350 y 400 nm. Los espectros UV se recogieron a los siguientes
intervalos: 0, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 192 h después
de la acidificación. Se preparó una muestra de control que contenía
5 \mul de DMSO para la comparación y los espectros se recogieron a
los puntos de tiempo anteriores. Cada solución de inhibidor se
preparó en grupos de 10 para impedir la alteración de las cubetas
antes de tomar una lectura. Después de obtener una absorbancia UV,
se desecharon las cubetas correspondientes a ese punto de tiempo.
El ensayo de formación de fibrillas empleando concentraciones
equimolares (3,6 \muM) de TTR e inhibidor se realizó como se ha
indicado anteriormente usando una solución madre secundaria de
inhibidor 1x preparada como se indica a continuación. Se preparó
una solución madre diluyendo 10 veces la solución madre primaria
10x 7,2 mM con DMSO a una concentración final de 0,72 mM y se usó en
el ensayo de formación de fibrillas como se ha descrito
anteriormente. Se descubrió que todos los compuestos eran solubles a
lo largo de todo el experimento, asegurando que la turbidez era el
resultado de la formación de amiloides de TTR.
Se analizó la estructura cuaternaria de TTR en
presencia de inhibidores a pH 4,4. El mecanismo por el cual 18 y 20
estabilizan TTR se evaluó incubando la proteína (3,6 \muM) durante
72 horas en las condiciones del ensayo de formación de fibrillas
inmovilizado en presencia de inhibidor a una concentración 3,6
\muM o 7,2 \muM. Después de 72 horas, las muestras se volvieron
a centrifugar (14.000 x g) y el sobrenadante se retiró de cualquier
sólido que se formara en el ensayo. El análisis de
ultracentrifugación de velocidad y equilibrio y se consiguió con
una ultracentrífuga analítica Beckman XL-I. La
adquisición y análisis de los datos se realizó como se ha descrito
previamente. Véase, por ejemplo, Lashuel, H.A.; Lai, Z.; Kelly,
J.W., Biochemistry 1998, 37,
17851-64; y Lashuel, H.A.; et al.,
Biochemistry 1999, 38,
13560-73.
Las constantes de disociación que caracterizan
la unión de 18 y 20 a TTR WT se determinaron por calorimetría de
valoración isotérmica usando un Microcal Instrument (Microcal Inc.,
Nothhampton, MD). Se preparó una solución de inhibidor (300 \muM
o 500 \muM en tampón Tris 25 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM; EtOH al
12%, pH 8,0) y se tituló en una celda ITC que contenía TTR WT (15
\muM o 25 \muM en tampón Tris 25 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM,
EtOH al 12%, pH 8,0). La inyección inicial de 2,5 \mul se continúo
por 50 inyecciones de 5,0 \mul cada una (25ºC). La integración
del termograma después de restar los blancos produjo una isoterma de
unión que se ajustaba mejor a un modelo de dos sitios de unión
secuenciales con cooperatividad negativa. Los datos se ajustaron
por una estrategia de mínimos cuadrados no lineal con cuatro
parámetros ajustables, particularmente K_{1}, \DeltaH_{1},
K_{2} y \DeltaH_{2} usando el módulo de análisis de datos de
ITC ORIGIN versión 2.9 proporcionada por Microcal.
Los compuestos descritos se evaluaron como
inhibidores de fibrillas de amiloides de TTR usando un ensayo de
turbidez. La amiloidosis de TTR WT se inició por acidificación de
TTR preincubada con inhibidor (25ºC, 30 minutos), empleando adición
de tampón para elevar el pH a un valor final de 4,4. Después de la
incubación de cada mezcla durante 72 horas (37ºC), se midió la
turbidez a 350 y 400 nm usando un espectrómetro
UV-vis. Todos los datos de formación de fibrillas
de amiloide se normalizaron para la amiloidogénesis de TTR WT en
ausencia de inhibidor, a la que se asignó una formación de fibrillas
de 100%. Por lo tanto, una formación de fibrillas de 5% corresponde
a un compuesto que inhibe 95% de la formación de fibrillas de TTR WT
después de 72 horas. Cada inhibidor potencial primero se evaluó a
una concentración de 7,2 \muM con respecto a la concentración de
tetrámero de TTR de 3,6 \muM. Los compuestos que permitieron una
formación de fibrillas menor de 15% se volvieron a evaluar a una
concentración igual a la concentración de TTR (3,6 \muM) para
seleccionar los inhibidores con la mayor eficacia. Una formación de
fibrillas menor de 40% en estas condiciones es característica de un
inhibidor muy bueno, mientras que una inhibición de
40-70% indica un compuesto modesto. En la Tabla 1
se presentan los datos de formación de fibrillas.
Basándose en la eficacia del inhibidor para los
compuestos 2-55, se aprecia que un anillo hidrófilo
sustituido con carboxilato unido directamente a un anillo hidrófobo
funcionalizado es suficiente para una actividad excelente (Tabla
1). Un sustituyente fenólico en lugar de un carboxilato
(2-10) produce considerablemente menos inhibidores
activos, muy inferior al compuesto parental 1. Los inhibidores que
tienen un halógeno en la posición orto o meta del anillo hidrófobo
son superiores a los compuestos halógenos o ésos tienen un solo
halógeno en posición para. Esto sugiere que los halógenos en
posición para no cumplen el HBP de la misma manera que los biarilos
halogenados en posición meta y orto. La completa eliminación de
todos los halógenos puede dar como resultado un inhibidor
deficiente, presumiblemente debido a la pérdida de complementariedad
estérica para rellenar las bolsas de unión de halógenos (por
ejemplo, los compuestos 10, 21-22, 27,
42-44 y 51-53). En las condiciones
ensayadas, el mejor compuesto fenólico (8) es inferior a 1, que
lleva tanto una funcionalidad fenólica como carboxílica en el
anillo hidrófilo. Los compuestos biarilo estabilizados con un solo
carboxilato (tal como 11-12) pueden ser excelentes
inhibidores de fibrillas de amiloide, por ejemplo, los compuestos
11, 12, 15-20. Éstos rivalizan con el diflunisal
para la inhibición, siendo la excepción los que contienen únicamente
un halógeno para (por ejemplo, los compuestos 13 y 14). Un aril
carboxilato sustituido en posición meta o para puede ser suficiente
para proporcionar excelentes propiedades de inhibición, lo que
sugiere que el sustituyente hidroxilo en 1 no es necesario para una
buena actividad inhibidora. Además, la colocación para del
carboxilato parece proporcionar inhibidores superiores, lo que
sugiere que un carboxilato para es más capaz de aprovechar las
interacciones electrostáticas con los grupos
\varepsilon-amonio de las Lys 15 y 15' (modo de
unión directa), como ocurre en el caso de 20, o las interacciones
de enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxilo de las Ser 117 y
117' (modo de unión inversa) como en el caso de 18. Los biarilos
donde el anillo hidrófobo está sustituido con halógenos en
posiciones distintas de la posición para y el anillo hidrófilo con
carboxilatos meta y particularmente para producen inhibidores de la
formación de fibrillas de amiloide de TTR muy eficaces.
La adición de un sustituyente hidroxilo en el
anillo que contiene un sustituyente carboxilato (la sustitución de
ácido salicílico, por ejemplo, 23-27) también puede
producir inhibidores con alta actividad similar al diflunisal. En
los biarilos con el núcleo de ácido salicílico, la colocación exacta
de los halógenos no parece ser tan vital como en los casos previos,
lo que sugiere que este anillo contribuye de manera desproporcionada
a la energía de unión. El hidroxilo en posición para puede
participar en la formación de enlaces de hidrógeno con los grupos
\varepsilon-amonio de las Lys 15 y 15' (modo de
unión directa) o con los hidroxilos de las Ser 117 y 117' (modo de
unión inversa). La sustitución de flúor en 1 por cloro (26) puede
dar como resultado un inhibidor con una actividad igual o superior,
mientras que la eliminación completa de los halógenos (27) puede
producir un inhibidor modesto. Debe tenerse en cuenta que 27 es sólo
ligeramente superior que un carboxilato en posición para 22 in
vitro, y los dos son superiores a los inhibidores sin halógeno
con el carboxilato en la posición meta, 21, y el análogo que
contiene hidroxilo 10.
La inclusión de un sustituyente
3',5'-dihalo-4'-hidroxilo
en el anillo que contiene halógeno, con carboxilatos en las
posiciones para o meta (28-31), puede producir una
actividad inhibidora elevada, similar al diflunisal. La sustitución
4-hidroxilo se incluyó para conseguir un mayor
parecido con la tiroxina, el ligando natural de la TTR. Estos
inhibidores también pueden imitar la actividad hormonal de la
tiroxina y, por lo tanto, pueden actuar como agonistas o
antagonistas del tiroides, un efecto que puede ser indeseable.
La protección del carboxilato como un éster
metílico o del hidroxilo como un éter metílico (32 y 33) puede
producir inhibidores inferiores en comparación con 1. Probablemente,
una combinación de la pérdida de carga y el aumento del volumen
estérico explica estas observaciones. La eliminación de todos los
sustituyentes hidrófilos (por ejemplo, 34-38) puede
dar como resultado inhibidores deficientes. Un compuesto de biarilo
que contiene solo sustitución de cloro en posición meta (por
ejemplo, 38) puede ser un inhibidor modesto, lo que sugiere que los
cloros hacen mejores contactos en los huecos de unión a halógeno en
comparación con los biarilos que contienen flúor (37).
Se sintetizaron varios inhibidores que contenían
cloro y se evaluó su actividad de inhibición de fibrillas de TTR.
Cuando miembros de esta clase de inhibidores contienen carboxilatos
en las posiciones meta o para (por ejemplo, 45 y 46) pueden poseer
una alta actividad, mientras que los que tienen un carboxilato orto
(tal como 47) pueden ser inhibidores inferiores. Esta observación
sugiere que el carboxilato orto puede estar demasiado lejos de los
grupos \varepsilon-amonio de las Lys 15 y 15' para
realizar interacciones electrostáticas favorables (modo de unión
directa) o de los grupos hidroxilo de las Ser 117 y 117' para
experimentar interacciones de enlaces de hidrógeno (modo de unión
inversa). Los alcoholes bencílicos 48-50
sorprendentemente resultaron ser excelentes inhibidores de la
formación de fibrillas. La sustitución dicloro en posición meta en
el anillo parece estar complementada por la funcionalidad alcohol
del bencilo en la posición orto, meta o para, potencialmente debido
a la formación de enlaces de hidrógeno o enlaces de hidrógeno
mediados por agua. Una serie de análogos de aldehído
(39-41) donde los grupos-CH_{2}OH
se reemplazaron por una funcionalidad aldehído, mostraron una buena
inhibición excepto en el caso del aldehído 41 en posición para,
posiblemente debido a la hidratación del aldehído para dar un
gem-diol. Es posible que los aldehídos, los
alcoholes bencílicos y los carboxilatos se unan al hueco a través
de un mecanismo diferente. En ausencia de información estructural,
sin embargo, no puede descartarse un modo de unión similar. También
es posible que los aldehídos se unan covalentemente a la Ser 117
(117') a través de un hemiacetal o a la Lys 15 (15') a través de un
enlace imina. La sustitución de los cloros con átomos de flúor (54
y 55) en el caso de los aldehídos puede dar como resultado
inhibidores más bien deficientes (39 y 41). Como se ha indicado
anteriormente, la eliminación completa de los halógenos puede
producir inhibidores con mala actividad (42 y 44), excepto en el
caso del aldehído meta 43 donde la actividad es modesta. Esta
actividad modesta puede deberse a un alto grado de hidratación. Es
sorprendente que el
3',5'-difluoro-meta aldehído (54),
sea inferior a los halógenos que carecen de aldehído (42).
Se evaluaron adicionalmente inhibidores que
mantenían la formación de fibrillas de TTR por debajo de 50% a una
concentración igual a la de la TTR (3,6 \muM) con respecto a su
capacidad de unirse a TTR selectivamente en relación con las demás
proteínas del plasma sanguíneo. La concentración de diflunisal en
sangre puede exceder de 30 \muM 20 h después de una sola dosis de
500 mg, o de 300 \muM 4 h después de la misma dosis. Aunque este
alto nivel de concentración plasmática sostenida sugiere una
excelente biodisponibilidad, los inhibidores más selectivos
permitirán una menor dosificación y efectos secundarios
potencialmente menores; por lo tanto, se incubó plasma humano con
esta subserie de inhibidores a una concentración final de 10,8
\muM (la concentración media de TTR en plasma humano es de
aproximadamente 5 \muM). Después se capturó la TTR usando un
anticuerpo unido a resina, y la TTR inmovilizada se lavó tres veces
con una solución de TSA (solución tris salina)/saponina al 0,05%,
seguido de dos lavados con TSA. El complejo de
TTR-inhibidor se liberó de la resina con
trietilamina 100 mM (pH 11,5), y se determinó la estequiometría del
inhibidor presente con respecto a la TTR por análisis de HPLC de
fase inversa. Puede unirse un máximo de 2 equivalentes de inhibidor
por tetrámero de TTR. En la Tabla 1 se resumen las estequiometrías
de unión al plasma después del lavado, que representan los límites
inferiores debido a las pérdidas asociadas con el lavado.
Los bifenilos que contienen cloro pueden ser
selectivos para la unión a TTR en plasma sanguíneo humano
(estequiometría media de 0,8, con una estequiometría máxima teórica
de 2,0, véase la Tabla 1). La estequiometría media observaba fue de
0,4 para todos los inhibidores ensayados. De los inhibidores que
contenían flúor, 18 y 20 presentaron una selectividad de unión muy
buena y aceptable para TTR, respectivamente, superior a la
estequiometría de 0,13 presentada por 1 en condiciones similares.
Los valores de estequiometría presentados en la Tabla 1 pueden
representar un límite inferior debido a las pérdidas asociadas con
el lavado del inhibidor con respecto a la TTR complejada en una
resina con anticuerpo policlonal. Los resultados de selectividad de
unión de la TTR para 39 y 41 deben considerarse con precaución,
porque estos compuestos pueden unirse covalentemente a TTR como se
ha descrito anteriormente.
Los inhibidores que presentan excelentes datos
de inhibición de fibrillas de amiloide de TTR in vitro,
aunque presentan una mala selectividad plasmática, pueden unirse
preferiblemente a los sitios de unión del fármaco en albúmina y/o a
sitios similares en otras proteínas encontradas en el plasma. Es
poco probable que estos inhibidores impidan el plegamiento anómalo
de TTR y la amiloidosis en un entorno complejo como el del plasma
sanguíneo o CSF.
Se obtuvieron estructuras
co-cristalinas de rayos X de alta resolución de 1 y
de tres de sus análogos: 26, 18 y 20 unidos a TTR remojando
cristales de TTR con un exceso molar de 10 veces de inhibidor
durante más de tres semanas. En la Tabla 2 se resumen los
parámetros estadísticos cristalográficos.
El diflusinal (1) se une a TTR tanto en modo
directo como en modo inverso. En cada sitio de unión a hormona de
la TTR, se encontraron cuatro conformaciones de unión diferentes de
diflunisal con una ocupación aproximadamente igual - un modo de
unión directa e inversa, cada uno con dos modos de unión
simétricamente equivalentes. El sistema biarílico de diflunisal se
desplazó del centro del hueco de unión a hormona y ocupa dos
posiciones distintas para formar un cono con forma en "V" de
densidad electrónica en el hueco de unión a hormona de la TTR. Este
modo de unión mejora tanto las interacciones hidrófobas como las
interacciones de van der Waals entre el inhibidor y el hueco
hidrófobo de la TTR formado por Leu 17, Ala 108, Leu 110, Thr 119 y
Val 121. El modo de unión inversa de diflunisal se aumentó por la
interacción de enlaces de hidrógeno entre el grupo carboxilo y el
oxígeno de la cadena lateral de Thr 119 y el oxígeno de la cadena
principal de la Ala 108 en el hueco de unión interno.
Sorprendentemente, la Ser 117 ni adopta múltiples conformaciones ni
forma ninguna interacción electrostática con el inhibidor. En el
modo de unión inversa, uno de los sustituyentes flúor del
diflusinal estaba dentro de la distancia de los enlaces de hidrógeno
entre el oxígeno de la cadena lateral de la Thr 119 (3,3
\ring{A}). En el hueco de unión externo, la densidad electrónica
para los átomos de la cadena lateral del Lys 15' sólo era visible a
un bajo nivel sigma, indicando que puede estar en más de una
conformación. La mejor conformación posible para el resto de Lys 15
estaba modelada a una distancia de enlaces de hidrógeno del grupo
carboxilo del diflusinal en el modo de unión directa.
El compuesto 20 se une a la TTR en el modo de
unión directa, con el anillo hidrófilo sustituido con carboxilato
orientado en el hueco de unión externo para interaccionar
electrostáticamente con las Lys 15 y 15'. El anillo de arilo
fluorado está colocado en el hueco de unión interno donde los
halógenos están situados en HBP 2 y 2'. De manera interesante, una
inspección cuidadosa de los dos sitios de unión revela una
diferencia significativa en la orientación de los anillos de
bifenilo. Los ángulos entre los planos de los anillos de fenilo
varían de 32,6 grados en un sitio de unión a 63,8 grados en el
otro. Esta observación puede ser el resultado de la unión
cooperativa negativamente de 20 con TTR.
El compuesto 18 se une a TTR en el modo inverso
con el anillo de arilo hidrófilo sustituido con carboxilato
orientado en el hueco interno, dentro de una distancia de enlaces de
hidrógeno de Ser 117 y Ser 117'. Los anillos de arilo están girados
34 grados entre sí para aprovechar las interacciones hidrófobas con
Leu 17, Ala 108, Val 121 y Thr 119. Los átomos de flúor están
colocados en los huecos de unión a halógenos 1 y 1'. No se esperaba
el modo de unión inversa, en su lugar, se preveía que el carboxilato
se colocara en el hueco externo para aprovechar las interacciones
electrostáticas con Lys 15 y 15', con los átomos de flúor
complejados en los huecos de unión a halógeno 2 y 2'. Sin embargo,
el modo de unión inversa no era una sorpresa total, ya que se había
observado previamente para el diclofenaco (una biaril amina) y
varios análogos de diclofenaco.
La sustitución con átomos de cloro en lugar de
átomos de flúor en el diflunisal induce diferencias significativas
en la unión de 26 a TTR. El compuesto 26 se une a TTR en el modo de
unión inversa con el anillo de arilo sustituido con carboxilo
orientado en el hueco de unión interno y cloros complejados en los
huecos de unión a halógeno 2 y 2'. Al igual que 18 y 20, el
compuesto 26 también ocupa el centro del hueco de unión a hormona.
Los restos Ala 108, Lys 15, Leu 17, Leu 110, Lys 17 y Thr 119 de
los protómeros de TTR forman interacciones de van der Waals e
hidrófobas con el inhibidor. En el hueco de unión interno, la cadena
lateral de la Ser 117 existe en dos conformaciones para
interaccionar con la sustitución carboxilo de 26 y la Ser 117 de los
otros monómeros. El mismo oxígeno de carboxilo de 26 también forma
una interacción de enlace de hidrógeno con el oxígeno de la cadena
principal de la Ser 117. El otro oxígeno de carboxilo de 26 forma un
enlace de hidrógeno con el oxígeno de la cadena principal de la Ala
108. A diferencia del diflusinal, el resto Thr 119 se orienta para
alejarse del inhibidor, contribuyendo a la hidrofobia del hueco de
unión en lugar de a la formación de enlaces de hidrógeno con el
inhibidor.
Para explorar adicionalmente el mecanismo de
acción de estos inhibidores, se evaluó su capacidad de estabilizar
a la TTR frente a la disociación inducida por urea en función del
tiempo. La velocidad de disociación del tetrámero se asoció
irreversiblemente al desplegamiento rápido de los monómeros,
controlado fácilmente, empleando concentraciones de urea superiores
a las que permiten el replegamiento de los monómeros. La disociación
controlada por el desplegamiento se exploró por ultra
UV-CD en urea 6,5 M, revelando que los buenos
inhibidores de la amiloidogénesis mediada por ácido ralentizaban la
velocidad de disociación de tetrámeros de una forma dependiente de
la dosis (Figs. 1A y 2B). Varios inhibidores, incluyendo 20, 46 y
48, muestran un efecto sorprendente sobre la disociación del
tetrámero de TTR, la etapa limitante de la velocidad de la
amiloidogénesis. Véase, por ejemplo, Hammarstrom, P.; et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 25,
16427-32.
Como se sospecha que el modo de inhibición de la
formación de fibrillas de TTR por estos compuestos es un afinado
dependiente de la dosis de la barrera de disociación del tetrámero
por medio de la estabilización del estado basal, los mejores
inhibidores deben ser los que más ralentizan la disociación del
tetrámero. La velocidad de formación de fibrillas se controló por
la turbidez a un pH final de 4,4 durante 192 h. Véanse las Figs.
3A, 3B, 4A y 4B. Los inhibidores que poseen la capacidad de
estabilizar la TTR tetramérica a un bajo pH impedirán la
disociación del tetrámero, el plegamiento anómalo y el ensamblaje
anómalo para dar amiloide. Los mejores inhibidores de la formación
de fibrillas de amiloide son los que más ralentizan la disociación
del tetrámero (Figs. 2A y 2B). Sin embargo, la correlación no es
perfecta, ya que algunos inhibidores se unen mejor en urea que en
condiciones ácidas y viceversa.
Para asegurar que los inhibidores estabilizan la
forma tetramérica de la TTR (3,6 \muM), la estructura cuaternaria
de TTR se exploró con estudios de ultracentrifugación analíticos de
velocidad y equilibrio. Se determinó la estructura cuaternaria de
la proteína después de 72 h de incubación con 18 y 20 (3,6 \muM ó
7,2 \muM) a pH 4,4. El tetrámero era la especie dominante, tanto
a una concentración de inhibidor de 3,6 \muM como de 7,2 \muM
en los estudios de AUC en equilibrio así como en los estudios de
velocidad.
Se empleó calorimetría de valoración isotérmica
(ITC) para determinar las constantes de unión de 18 y 20 a la TTR a
pH 8,0 (25ºC). El diflunisal y los dos análogos se unen a la TTR con
cooperatividad negativa, una característica presentada por muchos
otros ligandos. La unión al primer sitio es 15 veces mayor que la
unión al segundo sitio en el caso del diflunisal y 20. El biarilo
18 posee una K_{d1} aproximadamente 120 veces menor que la
K_{d2} (Tabla 3). La Tabla 3 resume la primera y segunda
constantes de disociación para la unión de 1, 18 y 20 a la TTR de
tipo silvestre determinada por ITC. Las constantes de unión para 1
se notificaron previamente, y se proporcionan en la presente
memoria con fines comparativos. Véase el Ejemplo 1.
La TTR WT tetramérica se disocia con una
t_{1/2} de 42 h, y se despliega 500.000 veces más rápido. Por lo
tanto, su velocidad de disociación puede explorarse por medio de su
asociación al desplegamiento, que es irreversible en urea 6,5 M.
Como la disociación del tetrámero es limitante de la velocidad para
la amiloidogénesis, todos los inhibidores que presentan una
excelente actividad in vitro y una estequiometría de unión
que excede de 0,50 en plasma deberían ralentizar la disociación del
tetrámero si es correcto el mecanismo supuesto de acción, la
estabilización cinética por la unión selectiva al estado nativo
(véanse las Figs. 2A 2B).
Las velocidades de disociación del tetrámero de
TTR se midieron en función de la concentración de inhibidor durante
un periodo de 168 h en urea 6,5 M. La selección de inhibidores,
específicamente 18, 20, 39, 41, 45, 46, 48 y 49 demuestra una
reducción global en el grado de disociación del tetrámero durante
160 h como se refleja en los cambios de amplitud con respecto a TTR
sin inhibidor. La velocidad de disociación de tetrámero también se
ralentiza espectacularmente en presencia de inhibidor, como se
refleja en la reducción en la pendiente del transcurso de tiempo.
Los inhibidores 20, 45, 46 y 48 son superiores, presumiblemente
porque el inhibidor se disocia muy lentamente de TTR\cdotI y
TTR.I_{2} debido a su alta afinidad de unión en urea. La formación
de TTR\cdotI y TTR\cdotI_{2} puede estabilizar
significativamente el estado nativo debido a los bajos valores de
K_{d} de estos complejos, y eleva la barrera cinética para la
disociación del tetrámero, sustancialmente en el caso de 20, 45, 46
y 48. Aunque 16 y 18 se unen a TTR, parece ser que su afinidad es
insuficiente para afectar a la estabilización cinética.
Probablemente es significativo que el orden de clasificación de
eficacia del inhibidor en urea a una concentración de inhibidor de
3,6 \muM (proteína 3,6 \muM) sea 20 \approx45 > 46
\approx48, que es diferente que una concentración de inhibidor de
7,2 \muM (20 \approx46 > 45 \approx48). Esto probablemente
refleja una diferencia en los valores de K_{d} en urea.
La estabilización cinética del estado nativo es
una estrategia terapéutica atractiva debido a las pruebas que están
apareciendo de que los oligómeros plegados de forma anómala, tanto
si están en la ruta amiloide o fuera de ella, son neurotóxicos. La
obtención de una estabilización cinética con inhibidores puede
proporcionar un tratamiento no invasivo para SSA, FAP y FAC.
Las velocidades de disociación del tetrámero en
urea en presencia de un inhibidor dado no siempre predicen la
capacidad del inhibidor de impedir la amiloidosis a bajo pH. Como no
está claro cómo y cuándo se forma el amiloide en un ser humano, son
deseables estabilizadores del tetrámero de TTR que funcionen bien en
una diversidad de medios desnaturalizantes. Se exploró la velocidad
de formación de fibrillas de TTR en función de la concentración de
inhibidor en condiciones ácidas (Figs. 3A, 3B, 4A y 4B). Los
inhibidores 20, 45 y 48 también se comportan excepcionalmente bien
en este entorno. El inhibidor 46 es un estabilizador del tetrámero
mejor en urea que en ácido, mientras que 1 es mucho mejor en ácido
que en urea. La energía libre de estabilización asociada con la
formación de los complejos TTR\cdotI y TTR\cdotI_{2} en un
entorno dado determina el grado de estabilización del estado basal
y el aumento asociado en la energía libre de activación para la
disociación del tetrámero. Estos datos sugieren que los inhibidores
ralentizan la amiloidogenésis de TTR a bajo pH mucho más
eficazmente que la disociación del tetrámetro de TTR en urea de 6,5
M. Esto puede deberse a que la amiloidogénesis requiere un
reensamblaje dependiente de la concentración después de la
disociación. Los inhibidores más eficaces son los que pueden
mantener la concentración del intermedio amiloidogénico monomérico
de TTR a niveles suficientemente bajos como para hacer que la
formación de fibrillas sea muy ineficaz. Como se observa en la
desnaturalización por urea de TTR en presencia de inhibidores, el
orden de clasificación de eficacia de inhibidor a bajo pH difiere
significativamente desde una concentración de inhibidor de 3,6
\muM (Figs. 3A y 3B) a una concentración de inhibidor de 7,2
\muM (Figs. 4A y 4B). Esta observación probablemente refleja las
diferencias en los valores de K_{d2} de cada uno de los
inhibidores a bajo pH. El ejemplo más espectacular es el del
diflunisal - uno de los inhibidores más eficaces de la formación de
fibrillas a 3,6 \muM, pero uno de los menos eficaces a 7,2
\muM, debido a su K_{d2} relativamente elevada.
Los análogos de diflunisal representan una clase
prometedora de compuestos para el tratamiento de la amiloidosis por
TTR. Aunque varios análogos de diclofenaco son inhibidores muy
buenos de la formación de fibrillas, los análogos de diflusinal
ofrecen una clase adicional de estabilizadores del tetrámero de TTR
muy eficaces. Varios análogos de diclofenaco ofrecen la capacidad
de inhibir la formación de fibrillas resultante de la disociación y
plegamiento anómalo de dos mutantes de TTR - Val30Met y Leu55Pro.
Las estructuras co-cristalinas de rayos X
demuestran que los análogos de diclofenaco principalmente se unen en
el modo de unión inversa, sin embargo, pequeñas perturbaciones en
las estructuras de los análogos de diflusinal permiten una unión
inversa o directa. Además, el diflusinal puede unirse en el modo de
unión directa o inversa, con una ocupación casi igual en los dos
modos. Las constantes de disociación obtenidas para el diclofenaco
(60 nM para K_{d1} y 1.200 nM para K_{d2}) fueron comparables a
las obtenidas para el diflusinal y 20, demostrando 18 una unión casi
10 veces más fuerte para el primer acontecimiento de unión como se
ilustra por su valor de K_{d1}. Además, las dos clases de
inhibidores presentaron una unión cooperativa negativamente. Lo más
destacable es que varios análogos de diflusinal fueran muy
selectivos para la TTR en plasma sanguíneo humano, ofreciendo la
posibilidad de reducir la toxicidad y los efectos secundarios.
Véase Oza, V.B.; et al. J. Med. Chem 2002, 45,
321-32.
Veintiocho de los compuestos sintetizados pueden
inhibir sustancialmente la amiloidogénesis por TTR. De éstos,
varios mostraron una estequiometría de unión superior a 0,50
equivalentes en plasma sanguíneo humano. Las subestructuras de
arilo clorado y fluorado de los mejores inhibidores se encuentran en
fármacos conocidos, por lo tanto, hay buenas razones para creer que
estos compuestos o sus análogos podrían evolucionar para dar
fármacos que no presenten la actividad AINE de 1. Los compuestos
fluorados 18 y 20 pueden unirse y estabilizar a la TTR tetramérica
en urea 6,5 M, reduciendo espectacularmente la primera etapa del
plegamiento anómalo y la amiloidogénesis, la disociación del
tetrámero de TTR. Estos compuestos y otros también ralentizan
espectacularmente la amiloidogénesis por TTR mediada por ácido. De
los compuestos ensayados, 18, 20, 39, 41, 45, 46, 48 y 49 fueron
los que mejor se comportaron en la estabilización del tetrámero de
TTR en urea y en condiciones ácidas. Estos compuestos de biarilo
parecen aumentar la barrera de activación asociada con la
disociación del tetrámero, la etapa limitante de la velocidad para
la formación de amiloide, por estabilización del estado basal.
La transtiretina (TTR) es una proteína
homotetramérica que transporta tiroxina y proteína de unión a
holo-retinol. En condiciones desnaturalizantes, la
disociación del tetrámero limitante de la velocidad y el plegamiento
anómalo rápido del monómero permite un ensamblaje anómalo para dar
amiloide, produciéndose amiloidosis sistémica senil, polineuropatía
amiloide familiar y cardiomiopatía amiloide familiar. Se sabe que la
unión del diflunisal a al menos uno de los dos sitios de unión a
tiroxina no ocupados en la TTR estabiliza el tetrámero de TTR
aumentando también la barrera de activación de disociación in
vitro. Se investigó la posibilidad de usar diflunisal para el
tratamiento de la amiloidosis por TTR.
Se incluyeron 30 voluntarios sanos (25 hombres,
5 mujeres) después de dar el consentimiento informado. Los sujetos
variaban de 23 a 53 años (edad media, 37,6 \pm 8,8) con un peso
corporal medio de 78,0 \pm 12,1 kg. Cada sujeto se trató con
diflunisal (Dolobid®) a una dosis de 125, 250 ó 500 mg dos veces al
día (cada 12 horas) durante 7 días (13 dosis en total). Se recogió
sangre el día 1 antes del tratamiento y el día 8, 4 y 12 h después
de tomar diflunisal. El diseño de este estudio se aprobó por el
Human Subjects Committee of Scripps Clinic, Scripps Green Hospital,
The Scripps Research Institute, y The Scripps General Clinical
Research Center.
Se midieron los niveles séricos de diflunisal.
Se añadió 100 \mul de suero a 900 \mul de acetonitrilo para
precipitar las proteínas. Después de la centrifugación, se añadieron
100 \mul de sobrenadante a 900 \mul de trietilamina acuosa 100
mM, pH 11,5. Después de la filtración, se inyectaron 100 \mul de
cada muestra en una columna de fase inversa C18 Keystone de 3 cm
usando un gradiente de 40-100% de solución B durante
10 min (solución A: 94,8% de agua/5% de acetonitrilo/0,2% de ácido
trifluoroacético; solución B: 94,8% de acetonitrilo/5% de agua/0,2%
de ácido trifluoroacético), con control por medio de un sistema de
administración multidisolvente Waters 600E. La detección se realizó
a 280 nm con un detector de absorbancia sintonizable Waters 486 y
los picos se integraron para dar la concentración de diflunisal a
partir de las curvas patrón.
Se analizó la estequiometría de la unión del
diflunisal a TTR en suero humano. Se añadió una suspensión 1:1 de
gel/Tris\cdotHCl 10 mM, pH 8,0/NaCl 140 mM/NaN_{3}(TSA)
al 0,025% (62,5 \mul) de Sepharose a 500 \mul de suero y la
mezcla se incubó a 4ºC durante 1 h. Después de la centrifugación se
añadieron 400 \mul de sobrenadante a 200 \mul de una suspensión
1:1 de gel/TSA de la Sepharose conjugada con anticuerpo
anti-TTR y se agitó lentamente a 4ºC durante 20
minutos. Después de la centrifugación, el gel se lavó con 1 ml de
TSA/saponina al 0,05% (Fisher Scientific) (dos veces, 10 min cada
x), y además con 1 ml de TSA (una vez, 10 min) a 4ºC. Después se
añadieron 150 \mul de trietilamina acuosa 100 mM, pH 11,5, para
eluir la TTR y el diflunisal unido de los anticuerpos. Después de
una agitación suave a 4ºC durante 30 min, la muestra se centrifugó y
se retiraron 145 \mul del sobrenadante. Se separó una inyección
de 135 \mul de muestra y se analizó como se ha descrito
previamente (Purkey et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001;
98:5566-71).
Se evaluó la estabilidad del tetrámero de TTR en
suero frente a la desnaturalización con urea. Se incubaron muestras
de 10 \mul de suero (25ºC) en 90 \mul de diversas
concentraciones de urea en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0: KCl,100
mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). Las soluciones de urea se comprobaron por
el índice de refracción para verificar las concentraciones
preparadas en peso. Se realizó el entrecruzamiento por
glutaraldehído de la proteína añadiendo 10 \mul de glutaraldehído
(25%). Se dejó que la reacción de entrecruzamiento continuara
durante 4 min antes de inactivarse por la adición de 10 \mul de
NaBH_{4} (al 7% en NaOH 0,1 M). Las muestras se mezclaron con 120
\mul de cóctel de carga de gel reductor de SDS (concentración
final de SDS = 2,5%) y se llevaron a ebullición durante 5 min. Las
muestras se separaron usando SDS-PAGE al 12% y los
geles se analizaron por inmunotransferencia usando antisuero
anti-TTR (Purkey et. al., supra).
Se evaluó la estabilidad del tetrámero de TTR en
suero frente a la desnaturalización con ácido. Se incubaron
muestras de diez \mul de suero (37ºC) en 90 \mul de tampón de
acidificación 100 mM. Se usó tampón citrato cuando se deseaba un pH
final \leq 3,8; y se empleó tampón acetato cuando el intervalo de
pH a evaluar era 4,2-5,4. Después del
entrecruzamiento, las muestras se analizaron por
SDS-PAGE e inmunotransferencia como se ha descrito
anteriormente.
Se expresaron TTR-WT
recombinante y variantes en Escherichia coli Epicurian
BL21/DE3 gold (Strategene) transformada con el plásmido
pmmH\alpha que contenía los genes de TTR y de resistencia a
ampicilina. La expresión y purificación se realizaron como se ha
descrito previamente (Lashuel et al., Biochemistry 1999; 38:
13560-73).
La velocidad de disociación del tetrámero de TTR
se midió por espectroscopía de dicroísmo circular. La evaluación de
las velocidades de disociación del tetrámero se realizó usando
muestras de TTR recombinante (3,6 \muM) en urea 6,5 M, una
concentración en la región posterior a la transición para el cambio
estructural terciario (Hammarström et al., Proc Natl Acad
Sci USA 2002; 99: 16427-32). Se midió el espectro
ultra UV CD de TTR (210 - 220 nm) en función del tiempo para
evaluar la ralentización de la velocidad de disociación del
tetrámero por asociación a cambios estructurales terciarios
rápidos.
El ensayo de formación de fibrillas se realizó
como se indica a continuación. Una solución madre de TTR
recombinante (7,2 \muM) se diluyó 1:1 con tampón de acidificación
100 mM. Se usó tampón citrato cuando se deseaba un pH final de
\leq 3,8; se empleó tampón acetato cuando el intervalo de pH a
evaluar era 4,2 - 6,0, y se utilizó tampón fosfato para evaluar la
amiloidogénesis a pH 6,5. Las muestras se incubaron a 37ºC durante
72 h sin agitación después de la acidificación. El grado de
formación de fibrillas se exploró por mediciones de turbidez a 400
nm.
La cinética de formación de fibrillas se midió
como se indica a continuación. Se mezclaron soluciones de TTR
recombinante (7,2 \muM) con un volumen igual de tampón acetato 100
mM para producir un pH final de 4,4. Las muestras se incubaron a
37ºC y se controló la turbidez a 400 nm durante el transcurso de 168
h. Se obtuvo una muestra separada para cada punto de tiempo.
El efecto del diflunisal sobre la disociación de
tetrámeros mediada por urea y la formación de fibrillas mediada por
el pH se evaluó añadiendo diflunisal a una solución de TTR que se
incubó durante 3 h (37ºC) antes de someter la proteína a
desnaturalización con urea o amiloidosis mediada por el pH.
Las concentraciones medias de diflunisal en
suero, medidas por HPLC, 4 y 12 h después de tomar la 13ª dosis
fueron 20,1 \pm 7,1 y 6,9 \pm 3,0 \muM en el grupo de 125 mg
bid, 233,5 \pm 76,0 y 145,8 \pm 38,9 \muM en el grupo de 250
mg bid, y 517,0 \pm 79,5 y 421,9 \pm 78,1 \muM en el grupo de
500 mg bid. Más de 99% de diflunisal está unido a proteína. Estas
concentraciones observadas en el grupo de 250 mg bid y 500 mg bid
son muy elevadas con respecto a la concentración de TTR en suero
(3,6 - 7,2 \muM) y producirían una estequiometría de unión a
diflunisal que se aproxima al máximo de 2 si la unión a proteínas
competidoras tales como TBG (0,3 - 0,5 \muM) y/o albúmina (580 -
725 \muM), que tiene múltiples sitios de unión para moléculas
pequeñas, no es de alta afinidad.
El diflunisal preferiblemente se une a la TTR
tetramérica en la sangre con una estequiometría de al menos 1 e
idealmente de 2 para observar una estabilización cinética máxima.
Para poner un límite inferior a la estequiometría de diflunisal en
cada sujeto, se inmunoprecipitó transtiretina en suero con
anticuerpos policlonales unidos a una resina en fase sólida como se
ha descrito previamente (Purkey et al., supra).
Después de lavar la TTR inmovilizada 3 veces para eliminar la unión
no específica, el complejo de TTR-diflunisal se
disoció de la resina y la estequiometría del diflunisal se
determinó por HPLC empleando curvas patrón. La estequiometría del
diflunisal unido a TTR en suero 4 y 12 h después de la toma fue de
0,45 \pm 0,11 y 0,31 \pm 0,12 en el grupo de 125 mg bid, 1,12
\pm 0,08 y 0,95 \pm 0,13 en el grupo de 250 mg bid y 1,51 \pm
0,09 y 1,48 \pm 0,08 en el grupo de 500 mg bid. La estequiometría
del diflunisal aumentó con su concentración sérica hasta
\approx300 \muM. La estequiometría máxima de 1,5, menor de la
esperada, a una concentración sérica de 300 \muM se debe a una
limitación del método (pérdidas asociadas con el lavado) y/o a la
unión del diflunisal a otras proteínas plasmáticas, por lo tanto se
realizó un estudio de estequiometría de unión de diflunisal con TTR
recombinante. Las pérdidas asociadas al lavado explican la máxima
estequiometría de unión de 1,5 debido principalmente a la
disociación del sitio de baja afinidad. El diflunisal se une a la
TTR con cooperatividad negativa, por lo tanto, la disociación del
sitio de baja afinidad es espectacularmente más rápida. La
estequiometría de unión esperada en tampón se calculó basándose en
las constantes de disociación determinadas por calorimetría de
valoración isotérmica (K_{d1}, 75 nM; K_{d2}, 1,1 \muM). La
representación conjunta de la estequiometría calculada y
determinada experimentalmente, obteniéndose esta última por
inmunoprecipitación (3 lavados) y análisis de HPLC, permite estimar
la verdadera estequiometría a 1,75 - 1,91 a 250 mg bid, lo que
sugiere que esta dosis podría utilizarse.
Una comparación de la estequiometría de unión
del diflunisal (100 \muM) en sujetos (0,8 - 1) con la TTR
recombinante (1,5) revela una unión significativa a proteínas
séricas aparte de la TTR, proporcionando el incentivo de
desarrollar análogos de diflunisal que se unen más selectivamente a
la TTR. El nivel sérico de TTR se aumentó y los niveles séricos de
T_{4} total y RBP se redujeron después de la administración de
diflunisal en todos los grupos. Estos descubrimientos sugieren que
el diflunisal influye en el metabolismo de TTR. No se observaron
efectos secundarios evidentes durante o después del estudio. Sin
embargo, el nivel sérico de albúmina se redujo significativamente y
los niveles de BUN y creatinina aumentaron ligeramente en el grupo
de 500 mg bid. En el grupo de 250 mg bid, el nivel sérico de
albúmina se redujo moderadamente y el nivel de BUN aumentó
ligeramente.
Se creó un nuevo método para demostrar que el
diflunisal administrado por vía oral estabiliza a la TTR sérica
frente a las tensiones de desnaturalización incluyendo la
amiloidosis. Este método sirve como un marcador sustituido para
identificar compuestos que prevengan enfermedades de plegamiento
anómalo de TTR. El suero entero de los sujetos se sometió a
desnaturalización añadiendo urea (0 - 9 M) o añadiendo ácido (pH 3,8
- 5,4). Como la TTR debe disociarse para desnaturalizarse, pueden
usarse cambios estructurales cuaternarios para controlar el grado
de desplegamiento (Hammarström et al., supra). Se
añadió glutaraldehído para reticular todas las proteínas en suero
después de someterse a tensiones de desnaturalización y de
establecer la fracción de TTR que se pliega normalmente (tetrámero
o dímero) frente a la que se desnaturaliza (monómero). La
SDS-PAGE de suero entero separa el tetrámero y el
dímero de TTR reticulada (representando éstos la TTR plegada) del
monómero. La inmunotransferencia permite comparaciones cuantitativas
de la cantidad de TTR plegada. Los anticuerpos policlonales no se
unen al monómero de TTR no plegado ni mucho menos tan bien como a la
TTR plegada, por lo tanto, lo más útil es comparar la intensidad de
las bandas de tetrámero y dímero en ausencia y presencia de
diflunisal. Por este método también puede evaluarse la dependencia
del tiempo de la inhibición por diflunisal de la desnaturalización
de TTR. La dependencia del tiempo apenas detectable de este proceso
en presencia de diflunisal confirma claramente el mecanismo de
estabilización cinética (véase el Ejemplo 1) donde la estabilización
del estado basal por el diflunisal hace que la barrera de
disociación del tetrámero sea insuperable. La eficacia del
diflunisal (250 mg bid) en estos cursos de tiempo de
desnaturalización es mejor que la que se predeciría por la
estequiometría medida (0,8 - 1,2), proporcionando pruebas
adicionales de que el método de inmunoprecipitación infraestima la
estequiometría de unión real, especialmente cuando excede de 1.
El conocimiento del intervalo de las
estequiometrías de unión de diflunisal en seres humanos y de la
concentración de diflunisal necesaria para simular esas
estequiometrías en un tubo de ensayo permite la realización de
estudios biofísicos relevantes in vitro para explorar el
mecanismo por medio del cual los complejos de TTR\cdotdiflunisal
y TTR\cdotdiflunisal_{2} previenen la disociación y la
amiloidosis. La velocidad de disociación mediada por urea (6,5 M) y
la velocidad de formación de fibrillas amiloides mediada por ácido
(pH 4,4) se estudiaron en función de la concentración de diflunisal
(5, 10, 20 y 60 \muM), revelando una ralentización dependiente de
la dosis. Como la disociación del tetrámero es limitante de la
velocidad para la formación de fibrillas de amiloide, se deduce que
las velocidades de disociación del tetrámero en urea deben ser
predictivas del grado de formación de fibrillas de amiloide mediada
por acidificación. El diflunisal es mejor para inhibir la
amiloidosis que para inhibir la disociación mediada por urea porque
también se requiere el reensamblaje dependiente de la concentración
para la amiloidosis. También es posible que los valores de K_{d1}
y K_{d2} asociados con la unión de diflunisal a la TTR sean
menores en ácido que en urea.
\global\parskip0.880000\baselineskip
Más de 80 mutaciones de TTR predisponen a los
individuos a una amiloidosis hereditaria por alteraciones
dependientes de la secuencia del panorama de la energía de
desnaturalización. De éstas, la deposición de amiloide de V122I
produce una cardiomiopatía amiloide familiar (FAC) en
3-4% de los afroamericanos, mientras V30M es la
mutación principal de la polineuropatía amiloide familiar (FAP). El
diflunisal inhibe tanto la amiloidogénesis por V122I como la
amiloidogénesis por V30M de una forma dependiente de la dosis, lo
que demuestra la generalidad de esta estrategia.
Es muy deseable desarrollar una estrategia
terapéutica general no invasiva para mejorar la amiloidosis por
TTR. Los resultados obtenidos en la presente memoria indican que la
administración oral de diflunisal puede ralentizar la disociación
del tetrámero por unión y estabilización del estado nativo no
amiloidogénico. La estabilización del estado nativo es una
estrategia particularmente atractiva dados los informes recientes
de que los oligómeros mal plegados y no las fibrillas de amiloide
producen neurodegeneración. El uso clínico del diflunisal (250 -
500 mg bid) para la artritis reumatoide y la osteoartritis demuestra
su baja toxicidad para el uso a largo plazo. La vida media sérica
de la TTR es de 12-15 h, por lo tanto la
dosificación dos veces al día parece óptima dada la vida media de
8-10 h del diflunisal. El diflunisal sería eficaz
contra SSA, FAC y FAP, porque se une tanto a la TTR WT como a la
TTR variante imponiendo una estabilización cinética, de una forma
análoga al mecanismo utilizado por la inclusión de subunidades de
trans-supresores en tetrámeros de TTR compuestos de
otra manera de subunidades asociadas con la enfermedad, lo que se
sabe que mejora la enfermedad humana. El diflunisal puede ser menos
eficaz contra la amiloidosis del SNC porque no puede atravesar la
barrera hematoencefálica, aunque ciertos análogos de diflunisal (por
ejemplo, un análogo descrito en la presente memoria) pueden tener
dicha capacidad.
Los bifenilos policlorados (PCB) son
contaminantes ambientales persistentes que, según se ha notificado,
son tóxicos para roedores y posiblemente para los seres humanos. La
longevidad de estos compuestos en el medio ambiente se debe a su
lenta degradación y alta lipofilia, que permite que se bioacumulen y
concentren según ascienden en la cadena alimentaria. Los PCB
hidroxilados (OH-PCB) son metabolitos formados por
oxidación de PCB por las P450 monooxigenasas. Es difícil encontrar
datos definitivos sobre la toxicidad de los compuestos PCB
individuales en seres humanos debido al hecho de que los PCB
disponibles en el mercado generalmente son mezclas que contienen
muchos isómeros diferentes, así como pequeñas cantidades de toxinas
conocidas, por ejemplo, dibenzofuranos clorados. Sin embargo, se ha
demostrado en animales de laboratorio la toxicidad de varios PCB
purificados. Con la administración de estos compuestos está asociada
una pérdida ósea, toxicidad inmunológica, neurotoxicidad y
reducción de los niveles de hormonas tiroideas, además de la
estrogenicidad de los OH-PCB.
Numerosos estudios demuestran que los PCB y
OH-PCB se unen a la transtiretina (TTR) in
vitro. Se ha sugerido que la TTR es la proteína diana en la
sangre humana que contribuye a la persistencia de los
OH-PCB en individuos expuestos. Aunque numerosos
informes sugieren a la TTR como una proteína de unión a PCB in
vivo, no hay pruebas definitivas de que los PCB se unan a la
transtiretina en plasma. Se ha desarrollado un método de
inmunoprecipitación que puede usarse para poner un límite inferior
a la estequiometría de unión de moléculas pequeñas a TTR en fluidos
biológicos. En la presente memoria se evaluó la estequiometría de
unión a TTR de los PCB y OH-PCB a la TTR de plasma
humano.
La amiloidogénesis
post-secreción de la TTR plasmática que requiere la
disociación del tetrámero limitante de la velocidad, el plegamiento
anómalo del monómero y el ensamblaje anómalo, supuestamente produce
amiloidosis sistémica senil, cardiomiopatía amiloide familiar y las
polineuropatías amiloides familiares. En la presente memoria se ha
demostrado que varios OH-PCB se unen selectivamente
a la TTR en plasma humano e inhiben la formación de fibrillas de
amiloide por medio de la estabilización del tetrámero conduciendo a
una estabilización cinética parcial o completa del estado nativo.
Se caracterizaron cuatro complejos de
TTR\cdot(OH-PCB)_{2}
representativos por cristalografía de rayos X para entender mejor
la base molecular de la unión y proporcionar la base para el diseño
de inhibidores de la amiloidogénesis de TTR optimizados.
Se evaluó la selectividad de unión de ocho PCB
(compuestos 1-8, Fig. 5) que, según se ha informado,
desplazan la hormona tiroidea de la TTR con un valor de CI_{50}
menor de 50 nM y catorce OH-PCB (compuestos
9-22, Fig. 6), metabolitos de PCB conocidos que,
según se ha informado, se unen a TTR o reducen los niveles de
tiroxina en ratones o ratas. Se establecieron los límites
inferiores sobre la estequiometría de unión de PCB a TTR en plasma
usando anticuerpos policlonales contra TTR unidos covalentemente a
una resina de sepharose que se mezcló con plasma sanguíneo humano
pretratado con PCB u OH-PCB (10,8 \muM). Después
del lavado, se evaluó la estequiometría de unión de PCB u
OH-PCB a TTR (\approx5 \muM) por HPLC de fase
inversa.
Hasta dos PCB pueden unirse a los dos sitios de
unión de hormona tiroidea idénticos en un tetrámero de TTR. Con la
excepción de los PCB 1 & 3, los PCB no hidroxilados restantes
presentaron una selectividad de unión relativamente baja para la
TTR plasmática (Tabla 4). Por el contrario, los
OH-PCB mostraron una selectividad de unión de buena
a excelente para la TTR plasmática (Tabla 5). Varios de los PCB
hidroxilados (por ejemplo, 16 y 22) se aproximan a una
estequiometría de unión de 2. La selectividad de unión de los
OH-PCB en sangre entera es muy similar a la
observada en plasma, por lo tanto, las membranas de eritrocitos no
complejan significativamente los OH-PCB
estudiados.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La captura de anticuerpos del complejo de
TTR\cdotPCB podría infraestimar la estequiometría de unión de PCB
debido a la disociación de PCB de la TTR durante las 5 etapas de
lavado. Se incubaron PCB y OH-PCB (10,8 \muM) con
TTR recombinante (3,6 \muM) para evaluar la estequiometría de
moléculas pequeñas unidas a la TTR inmovilizada después de cada
etapa de lavado. La estequiometría se redujo en
10-17% para PCB 2 y OH-PCB 18
después de 5 lavados, mientras que para el PCB 4 se redujo en 45%.
La cuantificación de pérdidas asociadas con el lavado permite
estimar la verdadera estequiometría de unión de PCB y
OH-PCB en plasma. Además, una buena correlación
entre la estequiometría final del OH-PCB unido a TTR
recombinante y la cantidad unida a TTR en plasma indica que el
compuesto es un agente de unión a TTR muy selectivo en plasma, por
ejemplo, OH-PCB 18. Por el contrario, los PCB 2 y 4
presentan una estequiometría de unión a TTR mayor en tampón que en
plasma, lo que sugiere claramente que se unen a proteínas
competidoras, así como a la TTR en plasma.
Se evaluó la capacidad de los
OH-PCB y del PCB 3 de inhibir la formación de
fibrillas de TTR in vitro porque estos compuestos presentan
una buena selectividad de unión a TTR en sangre. La TTR secretada en
sangre procedente del hígado parece ser la fuente de amiloide de
TTR sistémico. Aunque no está claro dónde o cuándo se forma el
amiloide en los seres humanos, el desnaturalizante típico en las
células es ácido, lo cual es eficaz para convertir casi todos los
péptidos y proteínas amiloidogénicas en agregados amiloides y/o
relacionados. Por lo tanto, se empleó la formación de fibrillas
mediada por ácido (pH 4,4) controlada por la turbidez para controlar
la eficacia de los PCB como inhibidores. Los PCB hidroxilados y el
PCB 3 fueron muy eficaces como inhibidores de las fibrillas de TTR.
A una concentración de inhibidor igual a la concentración de TTR WT
(3,6 \muM), sólo se observó 12-50% de la cantidad
normal de formación de fibrillas después de un período de incubación
de 72 h. Esta actividad es equivalente a la presentada por los
mejores inhibidores de fibrillas descubiertos hasta la fecha, tales
como el ácido flufenámico (Flu), que se incluyó como control
positivo.
Los experimentos previos de espectrometría de
masas sugieren que el OH-PCB 18 presenta una
cooperatividad de unión positiva con dos sitios de unión a hormona
tiroidea relacionados con C_{2} de la TTR. Cuando se añaden
cantidades subestequiométricas (<1:1) de 18 a TTR, las especies
predominantes observadas en el espectrómetro de masas son
apo-TTR y el complejo TTR\cdot18_{2}, lo cual es
coherente con la unión cooperativa de forma positiva. Las
características de unión a TTR de 18 son contrarias a las
presentadas con otros numerosos inhibidores de fibrillas de
amiloide de TTR que se unen con cooperatividad negativa.
Los estudios de calorimetría de valoración
isotérmica realizados en condiciones fisiológicas revelan que la
unión de OH-PCB 18 a TTR WT se ajusta mejor a un
modelo en el que las constantes de disociación son K_{d}
idénticas (3,2 \pm 1,8 nM). Este resultado no rebate la unión
cooperativa de forma positiva, ya que no se puede conseguir una
concentración suficientemente baja de TTR para explorar la
cooperatividad positiva debido al insuficiente calor liberado. Los
intentos de ajustar los datos recogidos a modelos de unión
cooperativa positiva o negativamente produjeron malos ajustes.
Se obtuvieron cristales de
OH-PCB 12, 16, 17 y 18 unidos a TTR WT humedeciendo
los cristales de TTR con un exceso de 10 veces de inhibidor durante
cuatro semanas. Después se resolvieron las estructuras de rayos X
para cada uno de los complejos. El dímero de TTR dentro de la unidad
asimétrica cristalográfica forma la mitad de los dos huecos de
unión al ligando. Como los dos sitios de unión se dividen en dos
partes por los mismos ejes dobles de simetría, típicamente se
observan dos modos de unión equivalentes de simetría de los
inhibidores. Cada sitio de unión a TTR puede subdividirse en
cavidades interna y externa. Estas cavidades comprenden tres de los
denominados huecos de unión a halógeno (HBP) porque están ocupadas
por los yodos de los dos anillos aromáticos de la tiroxina. Los HPB
3 y 3' están localizados de forma profunda dentro de la cavidad de
unión interna, los HPB 2 y 2' definen el límite entre la cavidad de
unión interna y externa, mientras que los HPB 1 y 1' están
localizados cerca de la periferia de la cavidad de unión externa.
Las estructuras co-cristalinas revelan que el
enlace C-C que conecta los dos anillos aromáticos
del OH-PCB está casi centrado en el eje de simetría
doble, proporcionando el aspecto de una sola conformación de unión.
El ángulo diédrico entre dos anillos de fenilo es de 59º para 12,
de 37º para 16 y 17, y de 44º para 18. Todos los
OH-PCB ocupan posiciones similares en dos huecos de
unión interno y externo. La complementariedad de van der Waals del
sistema de anillo biarilo facilita varias interacciones entre
subunidades en las que están implicados los restos X, Y y Z de una
subunidad y los restos n' y m' y o' en la otra subunidad que
constituyen cada sitio de unión. Varios de los sustituyentes en los
anillos de fenilo están fuera del eje y pueden modelarse en
múltiples posiciones dentro de la densidad electrónica
observada.
La estructura de rayos X de 1,8 \ring{A} del
complejo TTR\cdot18_{2} demuestra que el inhibidor tiene una
excelente complementariedad estérica con el sitio de unión a TTR. La
mecánica molecular (Insight II, Accelrys) indica que la
conformación no unida de 18 está próxima a su estructura unida. La
estructura refinada define interacciones electrostáticas directas y
mediadas por agua que contribuyen a la unión de alta afinidad de
18. Uno de los anillos aromáticos sustituidos de forma idéntica con
3-Cl, 4-OH, 5-Cl
ocupa el hueco de unión interno, proyectando sus sustituyentes
cloro en los HPB 3 y 3'. Las cadenas laterales de la Ser 117 y la
Thr 119 adoptan una conformación alternativa por rotación alrededor
de sus enlaces C\alpha-C\beta como se aprecia
por los mapas de densidad electrónica no sesgados. La cadena lateral
de Ser 117 adopta las tres conformaciones de rotámero como se
aprecia por la distribución de la densidad electrónica. De manera
interesante, dos moléculas de agua están localizadas entre los
restos de Ser 117 adyacentes en el eje doble con 50% de ocupación,
facilitando una red de enlaces de hidrógeno que conectan los restos
de Ser 117, las moléculas de agua próximas y la funcionalidad fenol
de 18. Basándose en la inspección de la estructura no está clara la
razón de que 18 se una con un comportamiento cooperativo
positivamente o no. El otro anillo sustituido de forma idéntica
ocupa el hueco de unión a TTR exterior con sus halógenos que se
proyectan al interior de los HBP 1 y 1'.
El anillo fenólico
tri-sustituido con 3-Cl,
4-OH, 5-Cl de 16 está orientado
hacia el interior del sitio de unión interno de TTR formando las
mismas interacciones electrostáticas e hidrófobas con TTR que forma
este anillo en la estructura de TTR\cdot18_{2} descrita
anteriormente. El anillo aromático 3,4-diclorado
ocupa el hueco de unión exterior, con el halógeno dirigido hacia el
interior de los HBP-1 o 1' dependiendo del modo de
unión equivalente de simetría que se considere. La densidad
electrónica de 16, al igual que la de OH-PCB 18, es
simétrica y, por lo tanto, no es posible colocar el OH para y el Cl
para de forma inequívoca basándose en el mapa de densidad
electrónica. El mapa de densidad electrónica no sesgado es coherente
con tres conformaciones de rotámero de la Ser 117 y contiene dos
moléculas de agua entre los restos de Ser 117, de forma análoga a
la estructura de TTR\cdot18_{2}.
El inhibidor 17 se une al anillo arilo
sustituido con 3-Cl, 4-OH,
5-Cl orientado hacia el interior del hueco de unión
interno utilizando las mismas interacciones que usa este anillo en
las estructuras TTR\cdot16_{2} y TTR\cdot18_{2} descritas
anteriormente. El anillo
2,3,4-tri-clorado ocupa el hueco de
unión externo utilizando interacciones con HPB-1,
HBP-1', HBP-2 y
HBP-2' en los dos modos de unión equivalentes de
simetría. Las múltiples conformaciones de Ser 117 y las dos
moléculas de agua conservadas también son características de la
estructura TTR\cdot17_{2}. Según los mapas de densidad
electrónica no sesgados fue evidente un cambio conformacional de la
cadena lateral de Thr 119.
El biarilo 12 pone su anillo arilo sustituido
con 3-Cl, 4-OH en el hueco de unión
externo, interaccionando sus dos cloros con HBP-1 y
1'. Esto contrasta con las estructuras de TTR\cdot16_{2} y
TTR\cdot17_{2} donde el fenol está localizado en el hueco de
unión interno. El grupo hidroxilo (probablemente en forma ionizada)
está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno de las cadenas
laterales de la Lys 15. El anillo tetra-clorado se
sitúa en el hueco de unión interno donde los halógenos están
orientados en HBP 2 y 2' así como 3 y 3'. Las cadenas laterales de
Ser 117 y Thr 119 adoptan conformaciones que son idénticas a las
encontradas en la estructura de apo-TTR, a
diferencia de la situación en 16, 17 y 18.
En la presente memoria, de los 8 PCB indicados
previamente que desplazan T4 con un valor de CI_{50} menor de 50
nM, sólo 1 y 3 mostraron unión a TTR con una estequiometría
apreciable en plasma humano. Por el contrario, los catorce
OH-PCB presentados previamente que se unían a TTR
presentaban una selectividad de unión significativa a TTR en
plasma. Esto es coherente con la observación de que los
OH-PCB se observan principalmente en plasma y
parecen retenerse de forma selectiva allí, en lugar de retenerse en
lípidos y en otros tejidos en los que típicamente se acumulan los
PCB. Los OH-PCB también se unen selectivamente a TTR
en sangre entera, lo cual es coherente con la idea de que no se
dividen dentro de las membranas lipídicas.
La cantidad de PCB (u OH-PCB)
que se retira por lavado del complejo de
anticuerpo\cdotTTR\cdotPCB durante las etapas de lavado se
evaluó usando TTR WT recombinante. El grado de disociación de PCB
asociada con el lavado es específico de la molécula. Algunos
compuestos presentan una alta estequiometría de unión después de
los lavados, lo cual es coherente con una unión inicial
significativa y bajas pérdidas asociadas con el lavado, lo cual
implica una lenta velocidad de disociación. Los compuestos que
presentan una baja estequiometría de unión se clasifican en al
menos dos categorías: una alta estequiometría de unión inicial con
pérdidas significativas asociadas con el lavado o una baja
estequiometría de unión inicial sin pérdidas significativas
asociadas con el lavado, siendo este último escenario aplicable a
compuestos que se unen con alta afinidad a TTR, pero con una
afinidad incluso mayor a otras proteínas plasmáticas. Los PCB 2 y 4
presentan una baja estequiometría después del lavado a TTR
recombinante. Se perdió cuarenta y cinco % de PCB 4 debido a los
lavados, mientras que PCB 2 simplemente presenta una baja
estequiometría de unión inicial con pérdidas mínimas asociadas con
el lavado (10%). Los valores de selectividad después del lavado
reflejan un límite inferior de la cantidad de PCB que se une
inicialmente en plasma. Los compuestos tales como PCB 18 que se
caracterizan por una elevada estequiometría de unión después del
lavado, deben tener una alta afinidad de unión y selectividad, lo
cual es coherente con la baja velocidad de disociación
observada.
Además de su alta selectividad de unión por la
TTR plasmática, los OH-PCB y el PCB 3 también
presentan una excelente inhibición de la formación de fibrillas de
TTR in vitro. La eficacia de los inhibidores 14, 15 y 18 se
encuentra entre la mayor observada hasta la fecha a la concentración
de inhibidor y TTR equimolar (3,6 \muM). Probablemente esto se
pueda atribuir a su alta afinidad de unión (también coherente con su
baja velocidad de disociación) y a sus propiedades de unión a TTR
cooperativas de forma positiva o no positiva, que son poco
habituales. Las K_{d} nM presentadas por el mejor inhibidor,
OH-PCB 18, indican que el estado nativo de la TTR
se estabilizará por >3 kcal/mol. La estabilización del estado
basal eleva la barrera de disociación del tetrámero (etapa
limitante de la velocidad en la amiloidogenésis por TTR)
sustancialmente, de tal forma que el tetrámero no puede disociarse
en una escala de tiempo biológicamente relevante. La estabilización
cinética del estado no amiloidogénico nativo mediada por la unión
de 18 al estado basal se confirmó por una disociación del tetrámero
ralentizada espectacularmente en urea 6 M y una amiloidogenicidad
lenta a pH 4,4. Se cree que OH-PCB 18 (3,6 \muM)
es un inhibidor de amiloide impresionante porque es un excelente
estabilizador cinético de la TTR tetramérica, es decir, impide que
2/3 de una muestra de TTR 3,6 \muM sea amiloidogénica a pH 4,4
porque TTR\cdot18 y TTR\cdot18_{2} son incompetentes para
formar amiloide, el resto de TTR (1,18 \muM) forma amiloide de
forma muy ineficaz debido a su baja concentración. Las velocidades
de disociación de los mejores inhibidores de OH-PCB
también pueden ser menores que las esperadas debido al templado
estructural de TTR alrededor del OH-PCB, pero esto
aún no se ha evaluado tan cuidadosamente como se necesita. Como
mínimo, estos compuestos proporcionan directrices para la síntesis
de inhibidores excepcionales o pueden resultar útiles por sí mismos
como inhibidores dependiendo de su perfil de toxicidad.
La información estructural sobre la TTR unida a
los OH-PCB 12, 16, 17 y 18 revela que estos biarilos
generalmente se unen a lo largo del eje de simetría doble
cristalográfico. El ángulo diédrico entre los dos anillos varía de
\sim40-60º, permitiendo que los huecos de unión a
halógeno (HBP) en dos subunidades vecinas encajen simultáneamente,
lo cual conduce a la estabilización de la interfaz estructural
cuaternaria tetramérica. El PCB 18 hidroxilado tiene una
complementariedad estructural óptima con TTR ya que sus cloros
pueden unirse a HBP 1 y 1', así como a 3 y 3' de forma simultánea.
Esto no ocurre con 16 y 17, que requieren la consideración de los
dos modos de unión equivalentes de simetría para extender los al
interior de los HBPS 1, 1', 3 y 3'.
La orientación del anillo fenólico hacia el
interior del hueco de unión interno parece jugar un papel
importante, ya que permite que se forme una red de enlaces de
hidrógeno mediados por agua entre él y las subunidades de TTR
vecinas, que supuestamente estabiliza adicionalmente la estructura
cuaternaria nativa de TTR. Un red de enlaces de H en la que están
implicadas las tres conformaciones escalonadas de Ser 117, el grupo
fenólico del inhibidor y las dos moléculas de agua conservadas crea
una red electrostática que interconecta las dos subunidades que
forman el sitio de unión de PCB. En las tres estructuras, Thr 119
también ocupa múltiples conformaciones de rotámero. Por el
contrario, esta red de interacciones electrostáticas está ausente en
el complejo 12_{2}\cdotTTR en el que el anillo de fenilo
sustituido con hidroxilo está orientado en el hueco de unión
exterior y donde la Ser 117 y la Thr 119 adoptan conformaciones de
cadenas laterales apo.
La toxicidad de los OH-PCB no
está bien establecida en la bibliografía. En una diversidad de
estudios in vitro y en animales, los OH-PCB
parecen ser levemente estrogénicos o
anti-estrogénicos. Se han sugerido otros mecanismos
de toxicidad y también hay informes de una reducción de los niveles
de hormonas tiroideas en animales expuestos a estos compuestos. La
sugerencia de que la unión de OH-PCB a TTR reduce
los niveles de T4 y que la reducción de los niveles de T4 refleja
la unión de TTR de molécula pequeña es difícil de confirmar
directamente. Como aproximadamente la mitad de la T4 se transporta
por albúmina, el desplazamiento de la T4 de los sitios de unión a
albúmina parece ser la causa más probable de la reducción de niveles
de T4 en individuos expuestos a PCB. La globulina de unión al
tiroides tiene la máxima afinidad por la tiroxina y es un
transportador importante en seres humanos, pero no está presente en
muchos mamíferos inferiores, incluyendo ratas y ratones donde se
han estudiado muchos de los perfiles toxicológicos de estos
compuestos. De esta manera, en estas especies es más probable que
los compuestos que se unen a TTR tengan un efecto sobre la unión y
el transporte global de T4. Los datos que muestran la unión de PCB
a TBG sugieren poca interacción, con la excepción de uno o dos
compuestos de unión débil. Por lo tanto, el efecto de los
OH-PCB sobre los niveles tiroideos humanos debe ser
mínimo a menos que se unan a la albúmina. También hay informes que
indican que estos compuestos pueden interferir con la activación de
hormonas tiroideas o aumentar la velocidad de sulfatación y, por lo
tanto, la inactivación de la T4. Los OH-PCB también
podrían unirse a otras hormonas tiroideas diana incluyendo
receptores de hormonas tiroideas, lo cual parece razonable dada la
analogía estructural con la T4.
Está claro que hay poco establecido en relación
con la toxicidad de los PCB hidroxilados, especialmente en seres
humanos. Es de esperar que la toxicología en roedores sea más severa
debido al papel de la TTR como transportador principal de hormonas
tiroideas. Lo que está claro es que los PCB hidroxilados presentan
una excelente actividad como inhibidores de la formación de
fibrillas de transtiretina, lo que sugiere que esta clase de
compuestos tiene una utilidad potencial para la inhibición de la
formación de fibrillas de amiloide.
Se produjeron anticuerpos, se purificaron y se
acoplaron a Sepharose. La resina se almacenó como una suspensión
1:1 en TSA (Tris 10 mM, pH 8,0/NaCl 140 mM/NaN_{3} al 0,025%).
Además se preparó Sepharose inactivada por acoplamiento de Tris 200
mM, pH 8,0, a la resina en lugar del anticuerpo.
Se extrajo sangre entera de voluntarios sanos en
el Scripps General Clinical Research Center's Normal
Blood-Drawing Program y se transfirió a tubos
cónicos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 3.00o rpm (1730 x g)
en una centrífuga de sobremesa Sorvall RT7 equipada con un rotor de
cubeta basculante durante 10 min a 25ºC. Se extrajo el sobrenadante
del plasma y se centrifugó de nuevo a 3000 rpm durante 10 min para
retirar el resto de las células. Se añadió azida sódica para dar
una solución al 0,05%. El plasma se almacenó a 4ºC hasta el uso.
Se rellenó un tubo eppendorf de 2 ml con 1,5 ml
de plasma sanguíneo humano y 7,5 \mul de una solución en DMSO
2,16 mM de PCB bajo evaluación. Esta solución se incubó a 37ºC
durante 24 h. Se añadió una suspensión 1:1 de resina/TSA (187
\mul) de Sepharose inactivada a la solución y se agitó suavemente
a 4ºC durante 1 h. La solución se centrifugó (16.000 x g) y el
sobrenadante se dividió en 3 alícuotas de 400 \mul cada una. Cada
una de éstas se añadió a 200 \mul de una suspensión 1:1 de
resina/TSA de la Sepharose conjugada con anticuerpo
anti-transtiretina y se agitó lentamente a 4ºC
durante 20 min. Las muestras se centrifugaron (16.000 x g) y se
retiró el sobrenadante. La resina se lavó con 1 ml de TSA/Saponina
al 0,05% (Acros) (3 x 10 min) a 4ºC y además con 1 ml de TSA (2 x
10 min) a 4ºC. Las muestras se centrifugaron (16.000 x g), se retiró
el lavado final y se añadieron 155 \mul de trietilamina 100 mM,
pH 11,5 para eluir la TTR y las moléculas pequeñas unidas de los
anticuerpos. Después de una agitación suave a 4ºC durante 30 min,
las muestras se centrifugaron (16.000 x g) y se retiraron 145
\mul del sobrenadante, que contenía TTR e inhibidor.
Las muestras de elución de sobrenadante de las
perlas de anticuerpo contra TTR (145 \mul) se cargaron en un
automuestreador Waters 71P. Se separó una inyección de 135 \mul de
cada muestra en una columna de fase inversa C18 Keystone de 3 cm
utilizando un gradiente de 40-100% de B durante 8
min (A: 94,8% de H_{2}O/5% de acetonitrilo/0,2% de TFA; B: 94,8%
de acetonitrilo/5% de H_{2}O/0,2% de TFA), controlado por un
sistema de administración de multidisolvente Waters 600E. La
detección se realizó a 280 nm con un detector de absorbancia
sintonizable Waters 486 y los picos se integraron para dar el área
de TTR y de la molécula pequeña. Para determinar la cantidad de
cada especie, se inyectaron cantidades conocidas de TTR tetramérica
o PCB en la HPLC. Los picos se integraron para crear curvas de
calibración a partir de regresiones lineales de los datos usando
Kaleidagraph (Synergy Software). Las curvas de calibración se
usaron para determinar el número de moles de cada especie presentes
en las muestras de plasma. Se calculó la relación entre la molécula
pequeña y la proteína para producir la estequiometría de la
molécula pequeña unida a TTR en plasma.
Los compuestos se disolvieron en DMSO a una
concentración de 720 \muM. Se añadieron 5 \mul de una solución
del compuesto a evaluar a 0,5 ml de una solución de TTR 7,2 \muM
en fosfato 10 mM pH 7,6, KCl 100 mM y tampón EDTA 1 mM, y se dejó
incubar el compuesto con TTR durante 30 min. Se añadieron 495 \mul
de acetato 0,2 mM pH 4,2, KCl 100 mM y EDTA 1 mM para producir
concentraciones finales de proteína e inhibidor de 3,6 \muM y un
pH de 4,4. Posteriormente, la mezcla se incubó a 37ºC durante 72 h,
después de lo cual los tubos se agitaron vorticialmente durante 3 s
y se midió la densidad óptica a 400 nm. El grado de formación de
fibrillas se determinó normalizando cada densidad óptica por la de
la TTR sin inhibidor, definida como una formación de fibrillas de
100%. También se ensayaron soluciones de control de cada compuesto
en ausencia de TTR y ninguno absorbió apreciablemente a
400 nm.
400 nm.
Una solución 25 \muM de compuesto 18 (en
fosfato 10 mM pH 7,6, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, DMSO al 8%) se valoró
en una solución 1,2 \muM de TTR en un tampón idéntico usando un
calorímetro de valoración isotérmica Microcal MCS (Microcal,
Northampton, MA). Una inyección inicial de 2 \muL se continuó por
25 inyecciones de 10 \mul a 25ºC. El termograma se integró y se
restó un blanco para producir una isoterma de unión que se ajustaba
mejor a un modelo de dos sitios de unión idénticos usando el paquete
de análisis de datos ITC en ORIGIN 5.0 (Microcal).
Se obtuvieron cristales de TTR recombinante a
partir de soluciones de proteína a 5 mg/ml (en KCl 100 mM,
fosfato100 mM, pH 7,4, sulfato amónico 1 M) equilibradas frente a
sulfato amónico 2 M en experimentos de gotas colgantes. Los
complejos de TTR\cdotligando se prepararon a partir de cristales
humedecidos durante 2 semanas con un exceso molar de 10 veces del
ligando para asegurar una saturación completa de los dos sitios de
unión. Como agente para humedecer se usó una solución 1:1 de
acetona:agua. Para recoger los datos se usó un sistema de placas de
imágenes DIP2030b (MAC Science, Yokohama, Japón) acoplado a un
generador de rayos X de ánodo giratorio RU200. Los cristales se
pusieron en aceite paratone como crioprotector y se enfriaron a 120
K para los experimentos de difracción. Los cristales de todos los
complejos de TTR\cdotligando son isomorfos, conteniendo la forma
de cristal apo dimensiones de celda unitaria a=43 \ring{A}, b=86
\ring{A} y c=65 \ring{A}. Pertenecen al grupo espacial
P2_{1}2_{1}2 y contienen la mitad del homotetrámero en la unidad
asimétrica. Los datos se redujeron con DENZO y SCALEPACK.
Las coordenadas atómicas de la proteína para TTR
procedentes del Banco de Datos de Proteínas (número de acceso 1BMZ)
se usaron como modelo de partida para el refinado de la TTR nativa y
los complejos de TTR-ligando por dinámica molecular
y minimización de energía usando el programa CNS. Se calcularon
mapas a partir de datos de difracción recogidos sobre cristales de
TTR humedecidos con PCB o co-cristalizados
simultáneamente. Para los complejos de TTR con los PCB, los mapas
resultantes revelaron posiciones aproximadas del ligando en los dos
huecos de unión del tetrámero de TTR, con alturas de picos por
encima de 5-9 r.m.s. Para mejorar adicionalmente la
densidad electrónica de molécula pequeña y eliminar los sesgos del
modelo, el modelo se sometió a varios ciclos del protocolo de
warp/shake, lo cual tuvo como resultado una notable mejora en el
mapa, especialmente alrededor del inhibidor. Posteriormente se
realizó un ajuste de modelos usando estos mapas y la molécula de
ligando se puso en la densidad. En los tres casos, la conformación
de mínima energía del inhibidor calculada por el programa InsightII
(Accelrys) estaba de acuerdo con el mapa. Debido al eje de simetría
cristalográfico doble a lo largo del canal de unión debe aplicarse
un modelo de trastorno estadístico, que da lugar a dos modos de
unión de ligando en cada uno de los dos sitios de unión de la TTR
tetramérica. Se añadieron moléculas de agua basándose en el mapa de
densidad electrónica no sesgado. Debido a la falta de densidades
electrónicas interpretables en el mapa final, en el modelo final no
se incluyeron los 9 restos N-terminales y los tres
restos C-terminales.
Se crean dos sitios de unión a tiroxina de
transtiretina por su interfaz estructural cuaternaria. El tetrámero
puede estabilizarse por unión de moléculas pequeñas a esos sitios,
proporcionando potencialmente una forma para tratar la enfermedad
amiloide por TTR con fármacos de molécula pequeña. Se han
descubierto muchas familias de compuestos cuya unión estabiliza el
estado basal tetramérico en un grado proporcional a las constantes
de disociación de molécula pequeña K_{d1} y K_{d2}. Esto también
aumenta eficazmente la barrera de activación de disociación e
inhibe la amiloidosis por estabilización cinética. Estos inhibidores
típicamente se componen de dos anillos aromáticos, llevando un
anillo sustituyentes halógeno y llevando el otro anillo
sustituyentes hidrófilos. Los benzoxazoles sustituidos con un ácido
carboxílico en C(4)-C(7) y un anillo
de fenilo halogenado en C(2) también parecían complementar
el sitio de unión a tiroxina de la TTR. Por lo tanto, se preparó una
biblioteca pequeña de estos compuestos por deshidrociclación de
ácidos N-acilo
amino-hidroxibenzoicos como se ilustra en el
Esquema 1.
Esquema
1
Síntesis General de
Benzoxazoles
Reactivos: (a) ArCOCl, THF, piridina (Ar =
Fenilo, 3,5-Difluorofenilo,
2,6-Difluorofenilo,
3,5-Diclorofenilo,
2,6-Diclorofenilo, 2-(Trifluorometil)fenilo,
y 3-(Trifluorometil)fenilo); (b) TsOH\cdotH_{2}O, xilenos
a la temperatura de reflujo; (c) TMSCHN_{2}, benceno, MeOH; (d)
LiOH, THF, MeOH, H_{2}O (rendimiento de 8-27% en
4 etapas).
Los benzoxazoles se evaluaron usando una serie
de análisis de incremento de estringencia. Se incubaron TTR WT (3,6
\muM) durante 30 min (pH 7, 37ºC) con un compuesto de ensayo (7,2
\muM). Aunque al menos una molécula del compuesto de ensayo debe
unirse a cada molécula de tetrámero de TTR para conseguir
estabilizarlo, una concentración de compuesto de ensayo de 7,2
\muM es sólo dos veces la concentración mínima eficaz. Después,
el Ph se ajustó a 4,4, el pH óptimo para la fibrilización. La
cantidad de amiloide formado después de 72 h (37ºC) en presencia
del compuesto de ensayo se determinó por turbidez a 400 nm y se
expresó como % de formación de fibrillas (ff), siendo 100%
la cantidad formada por TTR solo. De los 28 compuestos ensayados, 11
redujeron la formación de fibrillas a niveles indetectables
(ff < 10%; Fig. 7).
Después se evaluaron los 11 compuestos más
activos para su capacidad de unirse selectivamente a TTR sobre
todas las demás proteínas en la sangre. Se incubó plasma de sangre
humana (conc. de TTR 3,6 - 5,4 \muM) durante 24 horas con el
compuesto de ensayo (10,8 \muM) a 37ºC. El TTR y cualquier
inhibidor de unión se inmunoprecipitaron usando un anticuerpo de
TTR policlonal unido a sepharose. El TTR con o sin unión de
inhibidor se liberó de la resina a un alto pH y la estequiometría
de inhibidor:TTR se determinó por análisis de HPLC (Fig. 8). Los
benzoxazoles con ácidos carboxílicos en la posición 5 ó 6 y los
sustituyentes 2,6-diclorofenilo (13, 20) o
2-trifluorometilfenilo (11, 18) en la posición 2
muestras las mayores estequiometrías de unión. Por lo tanto, su
mecanismo de acción se caracterizó adicionalmente.
Para confirmar que 20 inhibe la formación de
fibrillas de TTR uniéndose fuertemente al tetrámero, se realizaron
experimentos de velocidad de sedimentación y calorimetría de
valoración isotérmica (ITC) con TTR wt. La ITC demostró que los dos
equivalentes de 20 se unen con constantes de disociación medias de
K_{d1}=K_{d12}=55 (\pm10) nM en condiciones fisiológicas.
Estos valores son comparables a las constantes de disociación de
muchos otros inhibidores de la amiloidogénesis de TTR eficaces. Para
los experimentos de la velocidad de sedimentación, se incubó TTR
(3,6 \muM) con 20 (3,6 \muM, 7,2 \muM, 36 \muM) en
condiciones óptimas para la formación de fibrillas (72 horas, pH
4,4, 37ºC). El tetrámero (55 kDa) fue la única especie detectable en
solución con 20 a 7,2 o 36 \muM. Se formaron algunos agregados
grandes con 20 a 3,6 \muM, pero el TTR que quedaba en solución
era tetramérico.
La inclusión de subunidades de T119M y la unión
de moléculas pequeñas prevenía la formación de amieloides de TTR
elevando la barrera de activación para la disociación del tetrámero.
La capacidad de un inhibidor para hacer esto se ensaya de forma más
rigurosa midiendo su eficacia para ralentizar la disociación del
tetrámero en urea 6 M, un estrés de desnaturalización severo. De
esta forma, se compararon las velocidades de disociación del
tetrámero de TTR en urea 6 M en presencia y ausencia de 20, 21 o 27
(Fig. 9). TTR (1,8 \muM) se desnaturalizó completamente después
de 168 horas en urea 6 M. Por el contrario, 20 a 3,6 \muM previno
la disociación del tetrámero durante al menos 168 horas (> 3x la
vida media de TTR en plasma humano). Con una cantidad equimolar de
20, solo 27% de TTR se desnaturalizó en 168 horas. El compuesto 27
(3,6 \muM) tenía mucha menos capacidad de prevenir la disociación
del tetrámero (90% de desplegamiento después de 168 horas) aunque
era activo en el ensayo de formación de fibrillas. El compuesto 21
no impedía la disociación de TTR en absoluto. Estos resultados
demuestran que el inhibidor que se une a TTR es necesario pero no
suficiente para estabilizar cinéticamente al tetrámero de TTR en
condiciones muy desnaturalizantes; también es importante que las
constantes de disociación sean muy bajas (o que las velocidades de
inactivación sean muy lentas). Además, la presentación de grupos
funcionales en 20 aparentemente es óptima para estabilizar el
tetrámero de TTR; al mover el ácido carboxílico de C(6) a
C(7), como en 27, o retirar los cloros, como en 21, se reduce
fuertemente su actividad.
El papel de los sustituyentes en 20 es evidente
por su estructura co-cristalina con TTR (Fig. 10).
El compuesto 20 orienta sus dos átomos de cloro cerca de los huecos
de unión a halógeno 2 y 2' (denominados así porque están ocupados
por yodos cuando la tiroxina se une a TTR). El patrón de sustitución
2,6 en los anillos de fenilo fuerza a los anillos de benzoxazol y
fenilo a salir de la planaridad, colocándose óptimamente el ácido
carboxílico del benzoxazol para formar enlaces de hidrógeno con los
grupos \varepsilon-NH_{3}^{+} de Lys 15/15'.
Las interacciones hidrófobas entre los anillos aromáticos de 20 y
las cadenas laterales de Leu, 17, Leu 110, Ser 117 y Val 121
aportan una energía de unión adicional.
A continuación se detalla el procedimiento
general para la síntesis de benzoxazol y la caracterización de los
productos (espectros de ^{1}H y ^{13}C-RMN y
espectros de masas de alta resolución).
Se observó la estructura cuaternaria de TTR en
presencia de 20 usando ultracentrifugación analítica de la
velocidad de sedimentación. Las muestras se incubaron con 20 a
concentraciones de 3,6, 7,2 ó 36 \muM durante 72 horas. Los datos
se recogieron en una ultracentrífuga analítica Beckman
XL-I de temperatura controlada (equipada con un
rotor An60Ti y un explorador fotoeléctrico). Una celda de doble
sector, equipada con una pieza central Epon de 12 mm y ventanas de
zafiro, se rellenó con 400-420 \mul de muestra
usando una jeringa. Los datos se recogieron a velocidades del rotor
de 3000 y 50000 rpm en un modo continuo a 25ºC, con un tamaño de
paso de 0,005 cm empleando una media de una exploración por punto.
La detección se realizó a 280 nm. Los datos se sometieron a un
análisis de derivada en el tiempo usando el programa DCDT+
desarrollado por Philo (Philo, 2000; Stafford, 1992). El análisis
demostró la distribución de especies en solución se representaba
por un intervalo de valores de s. Esta distribución después
se ajustó a diversos modelos para determinar los coeficientes de
sedimentación y difusión para especies en el sistema. El peso
molecular de cada especie se determinó por métodos presentados
previamente (Petrassi, et al., 2000). Los valores de s
encontrados para TTR demostraron que seguía siendo tetramérica en
presencia de concentraciones 7,2 y 36 \muM de 20, mientras que a
3,6 \muM, la TTR que quedaba en solución era tetramérica a pesar
de la formación de algunos agregados.
Se obtuvieron cristales de TTR wt a partir de
soluciones de proteína a 12 mg/ml (en KCl 100 mM, EDTA 1 mM,
fosfato sódico 10 mM y sulfato amónico 0,35 M, pH 7,0) equilibrado
frente a sulfato amónico 2 M en experimentos de gota colgante. El
complejo de TTR-20 se preparó a partir de cristales
empapados durante 3 semanas con un exceso molar de 10 veces del
ligando para asegurar la saturación completa de los dos sitios de
unión. El cristal empapado con ligando tuvo una difracción de hasta
1,55 \ring{A} en un detector Quantum-4 en la
fuente de alta energía monocromática de
14-BM-C, BIOCARS, Advanced Photon
Source (Argonne National Laboratory). Los cristales se empaparon en
aceite Paratone y se enfriaron inmediatamente a 100 K para los
experimentos de difracción. Los cristales del complejo de
TTR-20 son isomorfos con la forma de cristal apo con
dimensiones de celda unitaria \alpha = 43,1 \ring{A}, b
= 84,7 \ring{A} y c = 64,7 \ring{A}, grupo espacial
P2_{1}2_{1}2 con dos subunidades TTR en la unidad asimétrica.
Los datos se redujeron con DENZO y SCALEPACK del grupo HKL2000
(Otwinowski, 1997).
Como modelo de partida para las búsquedas de
reemplazo molecular se usaron las coordenadas atómicas de proteínas
para TTR del banco de datos de proteínas (número de acceso 1BMZ). El
refinado de la estructura del complejo de TTR-20 se
realizó usando los protocolos de dinámica molecular y de
minimización de energía de CNS. Los mapas de Fourier de diferencias
resultantes revelaron la unión del ligando en los dos huecos de
unión del tetrámero de TTR. Usando estos mapas, el ligando podía
colocarse de forma inequívoca en la densidad y se incluyó en el
refinado cristalográfico. Como modelo inicial para el refinado
cristalográfico se usó la conformación de energía mínima del
inhibidor calculada por el programa Insight II (Accelrys Inc.). Como
el eje de simetría cristalográfico duplicado está a lo largo del
canal de unión, tuvo que aplicarse un modelo de trastorno
estadístico, dando lugar a dos modos de unión de ligando por hueco
de unión de TTR. Después de varios ciclos de templado simulado y
del posterior refinado con el factor de temperatura y posicional, se
pusieron moléculas de agua en los mapas de Fourier de diferencias.
El ciclo final del ajuste de mapas se realizó usando el mapa de
densidad electrónica ponderado no sesgado calculado por el
protocolo de retirada de sesgo de shake n'warp. La conformaciones
de unión del ligando relacionadas con la simetría estaban de acuerdo
con los mapas de omisión templados no sesgados así como con los
mapas ponderados no sesgados shake n'warp con fases en ausencia del
inhibidor. Debido a la falta de densidades electrónicas
interpretables en el mapa final, en el modelo final no se incluyeron
los nueve restos N-terminales y los tres restos
C-terminales. En la Tabla 6 se presenta un resumen
del análisis cristalográfico.
A menos que se indique otra cosa, todas las
reacciones se realizaron en artículos de vidrio secados al horno en
una atmósfera seca de argón usando un FirstMate Organic Synthesizer
(Argonaut Technologies). Todos los disolventes (anhidros) y
reactivos se adquirieron en Aldrich y se usaron sin purificación
adicional. Los espectros de ^{1}H RMN se midieron a 500 MHz en un
espectrómetro Broker DRX-500 o a 600 MHz en un
espectrómetro Bruker DRX-600, y usaron como
referencia
CHD_{2}-S(O)-CD_{3} (2,49
ppm) como patrón interno. Los espectros de ^{13}C se realizaron a
125 MHz en un Bruker DRX-500 o a 150 MHz en un
instrumento Bruker DRX-600 y utilizaron como
referencia
(CD_{3})_{2}SO (39,5 ppm). Los análisis cromatográficos de capa fina se realizaron en placas analíticas de capa fina con soporte de vidrio (Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, EM Science nº 5715-7). La visualización se realizó usando absorbancia UV o ácido fosfomolíbdico al 10% en etanol. La cromatografía se realizó en un cromatotrón (Harrison Research, Model 7924T, placa de 2 mm) o en una placa de gel de sílice preparativa (Kieselgel 60 F254,1 mm, EM Science nº 13895-7).
(CD_{3})_{2}SO (39,5 ppm). Los análisis cromatográficos de capa fina se realizaron en placas analíticas de capa fina con soporte de vidrio (Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, EM Science nº 5715-7). La visualización se realizó usando absorbancia UV o ácido fosfomolíbdico al 10% en etanol. La cromatografía se realizó en un cromatotrón (Harrison Research, Model 7924T, placa de 2 mm) o en una placa de gel de sílice preparativa (Kieselgel 60 F254,1 mm, EM Science nº 13895-7).
Una mezcla de ácido aminohidroxibenzoico (0,2
mmol) en THF (3 ml) se trató secuencialmente con piridina (500
\mul, 0,6 mmol) y el cloruro de ácido deseado (0,2 mmol). La
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 h, se
calentó a reflujo durante 1 h, se concentró al vacío y se usó en la
siguiente etapa sin purificación.
A la mezcla de reacción en bruto se le añadió
ácido p-toluenosulfónico monohidrato (380,4 mg, 2,0 mmol) en
xilenos (5 ml) y la mezcla resultante se agitó a la temperatura de
reflujo durante una noche. Después de 12 h, la reacción se enfrió a
temperatura ambiente, se interrumpió con NaOH (2 ml, 1 N) y las
fases se separaron. La capa acuosa se acidificó con HCl (1 N) a pH
2 y se extrajo con EtOAc (4 x 3 ml). Las capas orgánicas combinadas
se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron al
vacío. El residuo resultante se disolvió en una mezcla de
MeOH:Benceno (2 ml; 1:4), se trató con TMSrCHN_{2} (200 \mul de
una solución 2,0 M en hexanos, 0,4 mmol) a 25ºC y el progreso de la
reacción se controló por TLC (normalmente se completó después de 0,5
h). La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se
cromatografió (gradiente de EtOAc del 10 al 25%/hexanos) para
producir el éster metílico de benzoxazol deseado.
El éster metílico de benzoxazol se disolvió en
una mezcla de THF:MeOH:H_{2}O (3:1:1, 0,07 M) y se trató con
LiOH\cdotH_{2}O (4 equiv.). La reacción se agitó a temperatura
ambiente y se controló por TLC. Después de que se completara, la
mezcla se acidificó a pH 2 con HCl 1 N y se extrajo con EtOAc (4 x).
Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO_{4}, se
filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por
cromatografía preparativa de capa fina (MeOH al 4,9%,
CH_{2}Cl_{2} al 95%, HOAc al 0,1%) para dar el producto en forma
de un sólido de color blanco.
4-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
(1). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el
procedimiento general, para producir 1 en forma de un sólido de
color blanco (7,0 mg, 13%). Datos para 1: ^{1}H RMN (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,70-12,50
(s a, 1H, CO_{2}H), 8,04 (AMX, 1H, J = 8,1
Hz, Ar), 7,94 (AMX, 1H, J = 7,3 Hz, Ar), 7,84 (d a,
2H, J = 5,6 Hz, Ar), 7,62-7,58 (m, 1H, Ar),
7,56 (AMX, 1H, J = 7,3, 8,1 Hz, Ar); ^{13}C RMN (125
MHz, DMSO-d_{6}) \delta 165,8,162,7 (d, J
= 248 Hz), 162,6 (d, J = 248 Hz), 161,1, 151,0, 140,3,
129,3, 127,0, 125,8, 123,6, 115,2, 110,8 (d, J = 28 Hz),
107,8 (t, J = 26 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calc.
para C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH+) 276,0467, encontrado
276,0463.
4-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
(2). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el
procedimiento general, para producir 2 en forma de un sólido de
color blanco (8,2 mg, 15%). Datos para 2: ^{1}HRMN (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,06 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar),
7,94 (AMX, 1H, J = 7,6 Hz, Ar),
7,80-7,74 (m, 1H, Ar), 7,57 (AMX, 1H,
J = 7,6, 8,1 Hz, Ar), 7,40-7,38 (m, 2H, Ar);
^{13}C RMN (125 MHz,.DMSO-d_{6}) \delta 166,1,
160,4 (d, J = 256-Hz), 160,3 (d, J =
256 Hz), 154,9, 150,6, 139,6, 134,7 (t, J = 10 Hz), 126,8,
125,8, 114,8, 112,8 (d, J = 22 Hz), 105,2 (t, J = 16
Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH+) 276,0467, encontrado
276,0461.
4-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(3). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el
procedimiento general, para producir 3 en forma de un sólido de
color blanco (9,5, mg, 15%). Datos para 3: ^{1}H RMN (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,70-12,80
(s a, 1H, CO_{2}H), 8,50 (ABX, 1H, J = 7,8
Hz, Ar), 8,43 (s, 1H, Ar), 8,06 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz,
Ar), 8,03 (ABX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar), 7,94
(AMX, 1H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,88 (ABX, 1H,
J = 7,8 Hz, Ar), 7,54 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar);
^{13}C RMN (125 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 165,8,
161,9, 151,0, 140,6, 131,4, 130,8, 130,0 (c, J = 33 Hz),
128,7 (d, J = 4 Hz), 127,2, 127,0, 125,5, 123,8, 123,7 (c,
J = 273 Hz), 123,2, 115,2; HRMS (MALDI-FTMS)
calc. para C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH+) 308,0529, encontrado
308,0535.
4-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(4). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el
procedimiento general, para producir 4 en forma de un sólido de
color blanco (15,2 mg, 25%). Datos para 4: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,15 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,18 (d, 1H, J = 7,6 Hz, Ar), 8,06
(AMX, 1H, J = 0,9, 8,2 Hz, Ar), 8,02 (d, 1H, J
= 7,9 Hz, Ar), 7,96 (AMX, 1H, J = 0,9, 7,9 Hz, Ar),
7,94-7,87 (m, 2H, Ar), 7,58 (AMX,
1H, J = 8,2 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 165,8, 161,6, 151,2, 140,0,
133,0, 132,6, 132,3, 127,6 (c, J = 32 Hz), 127,2 (c, J
= 6 Hz), 127,0, 125,6, 124,9, 123,5, 123,4 (c, J = 273 Hz),
115,2; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH^{+}) 308,0529, encontrado
308,0531.
4-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
(5). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el
procedimiento general, para producir 5 en forma de un sólido de
color blanco (8,0 mg, 13%). Datos para 5: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,60-12,60
(s a, 1H, CO_{2}H), 8,16 (A_{2}M, 2H, J =
2,0 Hz, Ar), 8,05 (AMX, 1H, J = 0,9, 8,2 Hz, Ar), 7,96
(A_{2}M, 1H, J = 2,0 Hz, Ar), 7,94 (AMX, 1H,
J = 0,9, 7,6 Hz, Ar), 7,56 (AMX, 1H, J = 7,9
Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 165,8, 160,8, 151,0, 140,4, 135,2, 131,5, 129,4, 127,0,
126,3, 125,9, 125,8, 123,6, 115,2; HRMS (MALDI-FTMS)
calc. para C_{14}H_{7}C_{12}NO_{3} (MH+) 307,9876,
encontrado 307,9876.
\newpage
4-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
(6). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el
procedimiento general, para producir 6 en forma de un sólido de
color blanco (5,2 mg, 8%). Datos para 6: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,80-12,50
(s a, 1H, CO_{2}H), 8,07 (AMX, 1H, J = 8,2
Hz, Ar), 7,95 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar),
7,77-7,71 (m, 3H, Ar), 7,59 . (AMX, 1H,
J = 7,9, 8,2 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 165,8, 158,2, 150,8, 139,3,
134,8, 134,0, 128,7, 126,8, 126,7, 125,9, 122,4; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH^{+})307,9876,
encontrado 307,9880.
4-Carboxi-2-fenil-benzoxazol
(7). Se preparó a partir de ácido
3-hidroxiantranílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 7 en forma de un sólido de color blanco
(10,2 mg, 21%). Datos para 7: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,50-12,60
(s a, 1H, CO_{2}H), 8,24-8,22 (m, 2H, Ar),
8,03 (AMX, 1H, J = 0,9; 8,2 Hz, Ar), 7,91
(AMX, 1H, J = 0,9, 7,9 Hz, Ar),
7,68-7,61 (m, 3H, Ar), 7,51 (AMX, 1H,
J = 7,9, 8,2 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,0, 163,4, 151,0, 140,8,
132,4, 129,4, 127,6, 126,7, 126,1, 125,0, 123,0, 115,0; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para C_{14}H_{9}NO_{3}
(MH^{+}) 240,0655, encontrado 240,0656.
5-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
(8). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 8 en forma
de un sólido de color blanco (10,2 mg, 19%). Datos para 8: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta
13,60-12,80 (s a, 1H, CO_{2}H), 8,32
(ABM, 1H, J = 1,5 Hz, Ar), 8,07 (ABM,
1H, J = 1,5, 8,5 Hz, Ar), 7,90 (ABM, 1H, J =
8,5 Hz, Ar), 7,86-7,85 (m, 2H, Ar), 7,60 (tt,
1H, J = 2,4, 9,2 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,8, 162,8 (d, J =
248 Hz), 162,7 (d, J = 248 Hz), 161,5, 153,0, 141,2, 129,1
(t, J = 11 Hz), 128,2, 127,7, 121,4, 111,2, 110,8 (d,
J = 23 Hz), 110,7 (d, J = 22 Hz), 107,8 (t, J = 26
Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH+) 276,0467, encontrado
276,0469.
5-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
(9). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 9 en forma
de un sólido de color blanco (6,8 mg, 12%). Datos para 9: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta
13,50-12,80 (s a, 1H, CO_{2}H); 8,39
(ABM, 1H, J = 0,7, 1,6 Hz, Ar), 8,10 (ABM,
1H, J = 1,6, 8,7 Hz, Ar), 7,95 (ABM, 1H, J =
0,7, 8,7 Hz, Ar), 7,77 (m, 1H, Ar), 7,40 (t, 2H, J = 8,8
Hz,-Ar); ^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 166,8,160,4 (d, J = 257,Hz), 160,3 (d, J =
257 Hz), 155,4, 152,6, 140,8, 134,8 (t, J = 11 Hz), 128,2,
127,7, 121,6, 113,0 (d, J = 22 Hz), 112,9 (d, J = 22
Hz), 111,2, 104,9; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH^{+})276,0467,
encontrado 276,0467.
5-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(10). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 10 en forma
de un sólido de color blanco (6,7 mg, 11%). Datos para 10: ^{1}H
RMN (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta
13,30-12,80 (s a, 1H, CO_{2}H), 8,51 (ABX,
1H, J = 7,8 Hz, Ar), 8,45 (s, 1H, Ar), 8,35 (ABM,
1H, J = 1,7 Hz, Ar), 8,08 (ABM, 1H, J = 1,7,
8,6 Hz, Ar), 8,04 (ABX, 1H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,93
(ABM, 1H, J = 8,6 Hz, Ar), 7,89 (ABX, 1H,
J = 7,8 Hz, Ar); ^{13}C RMN (125 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,8, 162,2, 153,1, 141,4,
131,4, 130,9, 130,1 (c, J = 33 Hz), 128,8, 128,2, 127,5,
127,1, 123,8 (c, J = 4 Hz), 123,7 (c, J = 273 Hz),
121,3,111,2; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{2} (MH^{+}) 308,0529, encontrado
308,0530.
5-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(11). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 11 en forma
de un sólido de color blanco (10,3 mg, 17%). Datos para 11: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,19 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,38 (m, 1H, Ar), 8,19 (d, 1H, J = 7,6
Hz, Ar), 8,09 (dd, 1H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 8,03 (d, 1H,
J = 7,9 Hz, Ar), 7,94-7,88 (m, 3H, Ar);
^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 166,8,
161,6, 153,2, 141,1, 133,1, 132,5, 132,4, 128,2, 127,6, 127,5
(c, J = 32 Hz), 127,2 (c, J = 6 Hz), 124,7, 123,4
(c, J = 274 Hz), 121,6,111,2; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH^{+}) 308,0529,
encontrado
308,0531.
308,0531.
5-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
(12). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 12 en forma
de un sólido de color blanco (7,3 mg, 12%). Datos para 12: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,14 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,33 (AMX, 1H, J = 0,6, 1,8 Hz,
Ar), 8,16 (AM, 2H, J = 1,8 Hz, Ar), 8,08 (AMX,
1H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 7,95 (AM, 1H, J =
1,8 Hz, Ar), 7,91 (AMX, 1H, J = 0,6, 8,5 Hz, Ar);
^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta
166,7, 161,1, 153,0, 141,3, 135,2, 131,6, 129,2, 128,2, 127,7, 125,9
121,4, 111,3; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH+) 307,9876, encontrado
307,9879.
5-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
(13). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 13 en forma
de un sólido de color blanco (10,8 mg, 18%). Datos para 13: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,08 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,43 (AMX, 1H, J = 0,6, 1,8 Hz, Ar), 8,13
(AMX, 1H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 7,98 (AMX,
1H, J = 0,6, 8,5 Hz, Ar), 7,77-7,72 (m, 3H,
Ar); ^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta
166,7, 158,6, 152,8, 140,4, 134,8, 134,2, 128,8, 128,4, 127,8,
126,2, 121,8, 111,5; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH^{+}) 307,9876, encontrado
307,9879.
5-Carboxi-2-fenil-benzoxazol
(14). Se preparó a partir de ácido
3-amino-4-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 14 en forma
de un sólido de color blanco (11,5 mg, 24%). Datos para 14: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,12 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,30 (ABX, 1H, J = 1,8 Hz, Ar), 8,20 (dt,
2H, J = 1,5, 6,7 Hz, Ar), 8,03 (ABX, 1H, J =
1,8, 8,5 Hz, Ar), 7,87 (ABX, 1H, J = 8,5 Hz, Ar),
7,67-7,60 (m, 3H, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,9, 163,6, 153,0, 141,6,
132,4, 129,4, 127,9, 127,5, 127,0, 126,0, 121,0, 111,0; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para C_{14}H_{9}NO_{3}
(MH^{+}) 240,0655, encontrado 240,0656.
\newpage
\global\parskip0.850000\baselineskip
6-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
(15). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 15 en forma
de un sólido de color blanco (10,3 mg, 19%). Datos para 15: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d6) \delta 13,22 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,20 (ABM, 1H, J = 1,5 Hz, Ar),
7,98 (ABM, 1H, J = 1,5, 8,2 Hz, Ar), 7,86 (ABM,
1H, J = 8,2 Hz, Ar), 7,79-7,78 (m, 2H, Ar),
7,57 (tt, 1H, J = 2,4, 9,4 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,7,162,7 (d, J =
248 Hz), 162,6 (d, J = 248 Hz), 162,4, 150,0, 144,7, 129,0
(t, J = 11 Hz), 128,7, 126,5, 120,0, 112,1, 110,9 (d,
J = 23 Hz), 110,8 (d, J = 22 Hz), 108,0 (t, J = 26
Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH^{+}) 276,0467, encontrado
276,0468.
6-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
(16). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 16 en forma
de un sólido de color blanco (8,5 mg, 15%). Datos para 16: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,25 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,30 (ABM, 1H, J = 0,6, 1,5 Hz,
Ar), 8,04 (ABM, 1H, J = 1,5, 8,2 Hz, Ar), 7,96
(ABM, 1H, J = 0,6, 8,2 Hz, Ar), 7,76 (m, 1H, Ar),
7,39 (t, 2H, J = 8,8 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,7, 160,4 (d, J =
257 Hz), 160,3 (d, J = 257 Hz), 156,6, 149,7, 144,2, 134,9
(t, J = 11 Hz),. 128,8, 126,4, 120,4, 113,1, 112,9, 112,2
(d, J = 5 Hz), 105,0 (t, J = 16 Hz); HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH+) 276,0467, encontrado
276,0466.
6-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(17). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 17 en forma
de un sólido de color blanco (7,4 mg, 12%). Datos para 17: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,20 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,48 (ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar),
8,41 (s, 1H, Ar), 8,28 (ABM, 1H, J = 1,5 Hz, Ar), 8,03
(ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 8,02 (ABM, 1H,
J = 1,5, 8,2 Hz, Ar), 7,90 (ABM, 1H, J = 8,2 Hz,
Ar), 7,86 (ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); ^{13}C RMN
(150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 168,0, 164,6,
151,4, 146,2, 132,8, 132,2, 131,4 (c, J = 32 Hz), 130,2,
129,8, 128,4, 127,8, 125,2, 125,0 (c, J = 272 Hz), 121,2,
113,6; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH^{+}) 308,0529, encontrado
308,0530. HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH+) 308,0529, encontrado
308,0531.
6-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(18). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 18 en forma
de un sólido de color blanco (6,6 mg, 11%). Datos para 18: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,22 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,30 (ABX, 1H, J = 0,6, 1,5 Hz,
Ar), 8,20 (d, 1H, J = 7,3 Hz, Ar), 8,06 (ABX, 1H,
J = 1,5, 8,2 Hz, Ar), 8,04 (d, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,98
(ABX, 1H, J = 0,6, 8,2 Hz, Ar), 7,94 (t, 1H, J
= 7,3 Hz, Ar), 7,90 (t, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); ^{13}C RMN
(150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 168,0, 164,0,
151,6, 145,9, 133,8, 130,0, 129,0 (c, J = 32 Hz), 128,6 (c,
J = 6), 127,7, 126,0, 124,7 (c, J = 273 Hz), 121,6,
113,6; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH+) 308,0529, encontrado
308,0530.
6-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
(19). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 19 en forma
de un sólido de color blanco (6,0 mg, 10%). Datos para 19: ^{1}H
RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,20 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,17 (ABX, 1H, J = 0,6, 1,5 Hz,
Ar), 8,00 (AB, 1H, J = 2,0 Hz, Ar), 7,96 (ABX,
1H, J = 1,5, 8,5 Hz, Ar), 7,83 (AB, 1H, J =
2,0 Hz, Ar), 7,82 (ABX, 1H, J = 0,6, 8,5 Hz, Ar);
^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta
166,6, 161,9, 150,0, 144,6, 135,1, 131,6, 129,0, 128,7, 126,4,
125,8, 119,9, 112,1; HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH^{+}) 307,9876, encontrado
307,9879.
6-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
(20). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 20 en forma
de un sólido de color blanco (12,7 mg, 21%), Datos para 20: ^{1}H
RMN (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,27 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,38 (ABX, 1H, J = 0,5, 1,5 Hz,
Ar), 8,09 (ABX,1H, J = 1,5, 8,3 Hz, Ar), 8,02
(ABX, 1H, J = 8,3, 0,5 Hz, Ar),
7,78-7,71(m, 3H, Ar); ^{13}C RMN (125 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,6, 159,8, 150,0, 143,8,
134,8, 134,2, 129,1, 128,8, 126,4, 126,3, 120,4, 112,6; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH+) 307,9876, encontrado
307,9877.
6-Carboxi-2-fenil-benzoxazol
(21). Se preparó a partir de ácido
4-amino-3-hidroxibenzoico
de acuerdo con el procedimiento general, para producir 21 en forma
de un sólido de color blanco (7,0 mg, 15%). Datos para 21: ^{1}H
RMN. (600 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,16 (s a,
1H, CO_{2}H), 8,27 (d, 1H, J = 0,9 Hz, Ar),
8,25-8:22 (m, 2H, Ar), 8,01 (dd, 1H, J = 1,5,
8,5 Hz, Ar), 7,89 (d, 1H, J = 8,5 Hz, Ar),
7,69-7,62 (m, 3H, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 166,8, 164,7,150,0, 145,2,
132,6, 129,4, 128,0, 127,6, 126,3, 126,0, 119,6, 112,0; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para C_{14}H_{9}NO_{3}
(MH^{+}) 240,0655, encontrado 240,0655.
7-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
(22). Se preparó a partir de ácido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 22 en forma de un sólido de color blanco (8,8
mg, 16%). Datos para 22: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,55 (s a,
CO_{2}H), 8,10 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz,
Ar), 7,97 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar),
7,80-7,79 (m, 2H, Ar), 7,63 (tt, 1H, J = 2,4,
9,2 Hz, Ar), 7,55 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); ^{13}C
RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 164,5, 162,8
(d, J = 248 Hz), 162,6 (d, J = 248 Hz), 160,9, 149,2,
142,6, 129,2, 128,0, 125,2, 124,9, 116,1, 110,6 (d, J = 28
Hz), 107,7 (c, J = 25 Hz); HRMS (MALDI-FTMS)
calc. para C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH+) 276,0467,
encontrado 276,0469.
7-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
(23). Se preparó a partir de ácido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 23 en forma de un sólido de color blanco (7,3
mg, 13%). Datos para 23: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,48 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,16 (ABX, 1H, J = 1,2, 8,2 Hz,
Ar), 8,00 (ABX, 1H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar), 7,78 (m, 1H,
Ar), 7,57 (ABX, 1H, J = 7,6, 8,2 Hz, Ar), 7,40 (t,
2H, J = 8,5 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 164,5,160,4 (d, J =
256 Hz), 160,3 (d, J = 257 Hz), 154,9, 148,9, 142,1, 134,8
(t, J = 10 Hz), 128,0, 125,1, 125,0, 116,0, 113,0 (d,
J = 22 Hz), 112,9 (c, J = 21 Hz), 105,1 (t, J = 17
Hz);. HRMS (MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}F_{2}NO_{3} (MH+) 276,0467, encontrado
276,0467.
\global\parskip1.000000\baselineskip
7-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil-benzoxazol
(24). Se preparó a partir de ácido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 24 en forma de un sólido de color blanco (7,9
mg, 13%). Datos para 24: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,51 (s a,
CO_{2}H), 8,48 (ABX, 1H, J = 8,2 Hz, Ar),
8,40 (s, 1H, Ar), 8,10 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar),
8,05 (ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,96 (AMX,
1H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar), 7,94 (ABX, 1H, J =
7,9 Hz, Ar), 7,54 (AMX, 1H, J = 7,9, 7,6 Hz, Ar);
^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 164,6,
161,7, 149,3, 142,7, 131,3, 131,0, 130,0 (c, J = 32 Hz),
128,6 (d, J = 3 Hz), 127,7, 127,2, 125,0, 124,8, 123,7 (c,
J = 212 Hz), 123,5, 116,0; HRMS (MALDI-FTMS)
calc. para C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH+) 308,0529, encontrado
308,0532.
7-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
(25). Se preparó a partir de ácido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 25 en forma de un sólido de color blanco
(13,8 mg, 22%). Datos para 25: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,46 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,18 (d, 1H, J = 7,6 Hz, Ar), 8,14
(AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar), 8,03 (d, 1H, J
= 7,9 Hz, Ar), 7,98 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar),
7,94 (t, 1H, J = 7,3 Hz, Ar), 7,89 (t, 1H, J = 7,6 Hz,
Ar), 7,56 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); ^{13}C RMN
(150 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 164,6, 161,1,
149,3, 142,4, 133,0, 132,4, 132,2, 127,8, 127,6, 127,2 (c, J
= 6 Hz), 125,0, 124,9, 123,4 (c, J = 273 Hz), 116,2; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para
C_{15}H_{8}F_{3}NO_{3} (MH+) 308,0529, encontrado
308,0534.
7-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
(26). Se preparó a partir de ácido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 26 en forma de un sólido de color blanco (7,0
mg, 11%). Datos para 26: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 14,00-12,80
(s a, CO_{2}H), 8,10-8,08 (m, 3H, Ar),
7,98-7,96 (m, 2H, Ar), 7,55 (t, 1H, J = 7,8
Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 164,5, 160,5, 149,2, 142,6, 135,2, 131,5, 129,4, 128,0,
125,6, 125,2, 124,8, 116,2; HRMS (MALDI-FTMS) calc.
para C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH^{+}) 307,9876, encontrado
307,9874.
7-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
(27). Se preparó a partir de ácido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 27 en forma de un sólido de color blanco
(10,3 mg, 17%). Datos para 27: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,90-13,10
(s a, CO_{2}H), 8,16 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz,
Ar), 8,02 (AMX, 1H, J = 1,9Hz, Ar),
7,78-7,72 (m, 3H, Ar), 7,60 (AMX, 1H,
J = 7,9 Hz, Ar); ^{13}C RMN (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 164,4, 158,3, 149,1, 141,7,
134,9, 134,2, 128,8, 128,2, 126,5, 125,3, 125,2, 116,2; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para
C_{14}H_{7}Cl_{2}NO_{3} (MH^{+}) 307,9876, encontrado,
307,9875.
7-Carboxi-2-fenil-benzoxazol
(28). Se preparó a partir de acido
3-aminosalicílico de acuerdo con el procedimiento
general, para producir 28 en forma de un sólido de color blanco
(13,1 mg, 27%). Datos para 28: ^{1}H RMN (600 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,48 (s a, 1H,
CO_{2}H), 8,20-8,19 (m, 2H, Ar),
8,05 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar), 7,92
(AMX, 1H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar),
7,65-7,62 (m, 3H, Ar), 7,50 (AMX, 1H,
J = 7,9 Hz, Ar); ^{13}C RMN. (150 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 164,8, 163,1, 149,2, 142,9,
132,2, 129,4, 127,4, 127,2, 126,0, 124,7, 124,4; 115,8; HRMS
(MALDI-FTMS) calc. para C_{14}H_{9}NO_{3}
(MH^{+}) 240,0655, encontrado 240,0656.
Claims (37)
1. Un compuesto de fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, donde Ar es 3,5-difluorofenilo,
2,6-difluorofenilo,
3,5-diclorofenilo,
2,6-diclorofenilo, 2-(trifluorometil)fenilo o
3-(trifluorometil)fenilo.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el compuesto es:
4-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
4-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
4-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
5-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
6-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
7-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
\vskip1.000000\baselineskip
3. El uso de un compuesto de fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, donde Ar es fenilo,
3,5-difluorofenilo,
2,6-difluorofenilo,
3,5-diclorofenilo,
2,6-diclorofenilo, 2-(trifluorometil)fenilo o
3-(trifluorometil)fenilo, para la fabricación de un
medicamento para tratar una enfermedad amiloide por
transtiretina.
4. Un compuesto de fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, donde Ar es fenilo,
3,5-difluorofenilo,
2,6-difluorofenilo,
3,5-diclorofenilo,
2,6-diclorofenilo, 2-(trifluorometil)fenilo o
3-(trifluorometil)fenilo para tratar una enfermedad amiloide
por
transtiretina.
5. El uso de la reivindicación 3 o el compuesto
de la reivindicación 4, donde el compuesto es:
4-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
4-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
4-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
4-Carboxi-2-fenil-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
5-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
5-Carboxi-2-fenil-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
6-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
6-Carboxi-2-fenil-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
7-Carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol;
7-Carboxi-2-fenil-benzoxazol;
\vskip1.000000\baselineskip
6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el compuesto es
4-carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el compuesto es
4-carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el compuesto es
4-carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el compuesto es
4-carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
4-carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
4-carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
5-carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
5-carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
5-carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
\global\parskip0.930000\baselineskip
15. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
5-carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
16. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
5-carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
17. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
5-carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
18. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
6-carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
19. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
6-carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
20. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
6-carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
21. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
6-carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
6-carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
23. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
6-carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
24. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
7-carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
25. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
7-carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
26. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
7-carboxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
27. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
7-carboxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
28. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
7-carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
29. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 4 o el uso de la reivindicación 3, donde el
compuesto es
7-carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
30. El uso de la reivindicación 3 o el compuesto
de la reivindicación 4, donde el compuesto es
4-carboxi-2-fenil-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
31. El uso de la reivindicación 3 o el compuesto
de la reivindicación 4, donde el compuesto es
5-carboxi-2-fenil-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
32. El uso de la reivindicación 3 o el compuesto
de la reivindicación 4, donde el compuesto es
6-carboxi-2-fenil-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
33. El uso de la reivindicación 3 o el compuesto
de la reivindicación 4, donde el compuesto es
7-carboxi-2-fenil-benzoxazol
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
34. El compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 33, o el uso de cualquiera de las
reivindicaciones 3 ó 5 a 33, en el que la sal farmacéuticamente
aceptable es
N-metil-D-glucamina.
35. Una composición farmacéutica que comprende
un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2
ó 4 a 34 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
36. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 35, en la que la composición farmacéutica se
formula para administración de dosificación unitaria.
37. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
3 ó 5 a 34 en el que la enfermedad amiloide por transtiretina es
polineuropatía amiloide familiar, cardiomiopatía amiloide familiar,
amiloidosis sistémica senil o amiloidosis cardiaca posterior a
trasplante de órganos.
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