ES2331006T3

ES2331006T3 - Inhibicion de actividad de quinasa s6 para el tratamiento de resistencia a la insulina.

Info

Publication number: ES2331006T3
Application number: ES04764350T
Authority: ES
Inventors: Johan Auwerx; Francesca Frigerio; Stefano Fumagalli; Sara Kozma; Frederic Picard; Melanie Sticker-Jantscheff; George Thomas; Sung Hee Um; Mitsuhiro Watanabe
Original assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; Novartis Forschungsstiftung
Current assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; Novartis Forschungsstiftung
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2009-12-18
Anticipated expiration: 2024-08-20
Also published as: ATE438859T1; DE602004022423D1; JP2007503203A; WO2005019829A1; EP1658504A1; US20070191259A1; EP1658504B1

Abstract

Un método para identificar un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, dicho método comprende las etapas de: i) incubar quinasa S6 con un compuesto; ii) detectar la actividad de quinasa S6; y iii) determinar una modulación inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a cuando dicho compuesto está ausente, en donde una inhibición de la actividad 1 quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.

Description

Inhibición de actividad de quinasa S6 para el tratamiento de resistencia a la insulina.

La presente invención se relaciona con resistencia a la insulina y diabetes, en particular con el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes con moduladores de actividad de quinasa S6 (S6K).

Antecedente de la invención

La diabetes Tipo II es la forma más común de diabetes en el mundo Occidental y está fuertemente ligada con la obesidad - más del 80% de los enfermos son obesos. En pacientes con diabetes Tipo II, la insulina es menos capaz de promover la captación de glucosa en el músculo y la grasa, un estado denominado resistencia a la insulina de. La base molecular por la cual la obesidad lleva a acción de insulina deteriorada no se conoce bien.

La insulina actúa normalmente para mantener homeostasis de glucosa al regular su propia producción y secreción mediante células beta pancreáticas, y al controlar la utilización de glucosa en tejidos periféricos. Estudios recientes han implicado la ruta de transducción de señal de mTOR/quinasa S6 en este proceso. La quinasa S6 es una quinasa que fosforila la proteína ribosómica, S6. En particular, los ratones con deficiencia de S6K1 (también conocida como quinasa S6 p70/p85) son ligeramente intolerantes a la glucosa (hiperglicémicos) e hipoinsulinémicos, no debido a una lesión en la sensibilidad a la glucosa o producción de insulina, sino a una reducción en la masa endocrina pancreática, que se cuenta mediante una disminución selectiva en la célula beta. Los ratones con deficiencia de S6K1 mantienen niveles de glucosa en ayuno normal, lo que sugiere que ellos pueden ser hipersensibles a la insulina en sus tejidos periféricos (Pende et al., 2000, Nature, 408, 994-997).

Este fenotipo evoca una forma de diabetes mellitus tipo 2 preclínica, en donde la hipoinsulinemia inducida por malnutrición de proteína predispone los individuos a intolerancia a la glucosa. Un periodo limitado de malnutrición de proteína en ratas también conduce a intolerancia leve a la glucosa que surge de una disminución persistente en el tamaño de células \beta y secreción de insulina, un efecto parcialmente atenuado por hipersensibilidad leve a la insulina en tejidos periféricos (Swenne et al., 1992, Diabetologia 35, 939-945; Swenne et al., J. Endocrinol. 118, 295-302; Grace et al., 1990, Diabetes Metab. 16, 484-491 (1990).

Los ratones con deficiencia de S6K1 son viables y fértiles pero exhiben una reducción visible en el tamaño corporal durante la embriogenia, un efecto superado principalmente por la adultez. Una comparación de ratones mutantes homocigotos de 3.5 semanas de edad demuestran que los pesos de todos los órganos son proporcionales a la reducción en el peso corporal. El tamaño pequeño de los ratones mutantes homocigotos es consistente con un defecto en la capacidad de traducción (Shima et al., 1998, EMBO J., 17, 6649-6659). Cuando los ratones con deficiencia de S6K1 alcanzan la madurez, la diferencia en peso que ellos presentan al nacer, comparada con los ratones genéticamente intactos, disminuye de 20% a 15%. Tales ratones pueden acumular grasa y llegar a ser resistentes a la insulina como una función de la edad y un incremento en la grasa de la dieta, al igual que los ratones genéticamente intactos.

El papel de la actividad de quinasa S6 en la resistencia a la insulina se ha abordado en estudios humanos. Se tratan Indios Pima no diabéticos sensibles a insulina, y resistentes a la insulina con insulina durante 2 horas. Aunque los niveles basales de la actividad de quinasa S6 son similares para ambos grupos, la quinasa S6 se activa solo tres veces en individuos resistentes a la insulina comparado con cinco veces en individuos sensibles a la insulina, lo que sugiere una actividad de quinasa S6 deteriorada en individuos resistentes a la insulina.

La actividad S6K ha estado previamente implicada en el cáncer y la angiogenia. La WO93/19752 describe el uso de rapamicina y sus derivados como inhibidores de quinasa S6 p70 y su uso para inhibir la proliferación o la respuesta inmune de una célula. La US 2003/0083284 describe compuestos anticodificantes para la inhibición de la expresión de quinasa S6 p70 (denominada como las isoformas 85kDa, y 70kDa y nuclear). Se proponen los ácidos nucleicos anticodificantes por ser potencialmente útiles en el tratamiento de infecciones, inflamación y formación de tumor, así como también trastornos metabólicos. La US2003/0143656 propone que los compuestos capaces de incrementar la actividad de S6K p70 puede ser útiles en el tratamiento de diabetes u obesidad, o pueden ser útiles en la inhibición de la apoptosis.

Attoub et al. (2001, Faseb J., 14, 2329-2338) muestra que la rapamicina bloquea la función de leptina, en particular la invasión inducida por leptina de células en geles de colágeno (como un modelo de carcinogenia). Se ha utilizado la terapia de leptina para promover la pérdida de peso aunque preservando la masa magra en pacientes obesos con deficiencia de leptina congénita, sugiriendo la leptina en el tratamiento de obesidad o diabetes.

Subsiste una necesidad de proporcionar nuevos objetivos y desarrollar nuevos medicamentos para el tratamiento de resistencia a la insulina, en particular diabetes Tipo II (también denominada como diabetes mellitus no dependiente de insulina, NIDDM) y esta invención satisface esta necesidad.

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, el método comprende las etapas de: i) incubar quinasa S6 con un compuesto; ii) detectar actividad de quinasa S6; y iii) determinar una inhibición inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a cuando el compuesto está ausente, en donde una inhibición de la actividad de quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina. La inhibición inducida por compuesto es preferiblemente independiente de un efecto de la actividad de Objetivo mamífero de Rapamicina (mTOR). En una realización, la modulación es la inhibición de la actividad de quinasa 1 S6. Se puede ensayar de forma conveniente la actividad de quinasa S6 utilizando S6 como un sustrato y es fácilmente susceptible para ensayos de alto rendimiento.

También se proporciona por la invención métodos de detección de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, que comprenden poner en contacto los componentes celulares activos transcripcionalmente con un ácido nucleico que codifica un gen S6K ligado operablemente a una secuencia promotora o una secuencia promotora S6K ligada operablemente a un gen indicador en la presencia de por lo menos un compuesto; y detectar un efecto del compuesto sobre la expresión o actividad promotora de quinasa S6 de quinasa S6, en donde la detección de una disminución en la expresión o actividad promotora de quinasa S6 es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina. Tales ensayos pueden ser ensayos basados en células, en donde los componentes celulares activos transcripcionalmente y el ácido nucleico están presentes en una célula. En realizaciones preferidas, la quinasa S6 es quinasa 1 S6.

Así, también se proporcionan inhibidores específicos de quinasa S6 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o tratamiento profiláctico de resistencia a la insulina de acuerdo con la reivindicación 8.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para diagnosticar una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes, que comprende: en una muestra de un mamífero, detectar el nivel de actividad de quinasa S6, y correlacionar un cambio en la actividad de quinasa S6 en la muestra cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores con una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes, en donde un incremento en la actividad de quinasa 1 S6 cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores es indicadora de una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes.

Descripción detallada de la invención

Subsiste una necesidad de más terapias efectivas para tratar resistencia a la insulina y diabetes Tipo II en individuos, particularmente en individuos obesos. Los presentes inventores han descubierto que en contraste con estudios publicados previamente, la activación de S6K1 resulta en resistencia a la insulina que proporciona por lo tanto el S6K1 como un objetivo farmacéutico para tratar diabetes y enfermedades relacionadas a través de la inhibición de la actividad S6K1. Aunque se puede objetivar el mTOR (objetivo mamífero de rapamicina, que fosforila y activa la quinasa S6) para modular la actividad S6K1, la objetivación directa de S6K1 evita más efectos colaterales generales de la inhibición de actividad mTOR y proporciona más especificidad para el tratamiento de pacientes con resistencia a la insulina. En particular, el mTOR se conoce por activar el S6K1 y S6K2, aunque los presentes inventores han encontrado que es deseable la inhibición selectiva de S6K1.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un método para identificar un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes (en particular dieta alta en grasa u afecciones inducidas por obesidad), basado en la modulación de actividad de quinasa S6, en particular la actividad de quinasa 1 S6. Típicamente tal un método comprenderá las etapas de incubar quinasa S6 con un compuesto; detectar la actividad de quinasa S6; y determinar la modulación inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a cuando el compuesto está ausente. Una inhibición de la actividad de quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes. Un ensayo de control en la ausencia del compuesto se puede correr en paralelo.

A menos que no sea claro en el contexto, "S6K" o "quinasa S6" se utiliza aquí para abarcar el S6K1 y S6K2 (ver, por ejemplo, Genebank Acceso No. M57428, AJ007938, AB019245, NM003952 y secuencias relacionadas), aunque se prefiere el S6K1. Los equivalentes funcionales de ejemplo (variantes) o derivados de S6K incluyen moléculas en donde S6K se modifica covalentemente mediante sustitución, química, enzimática, u otros medios apropiados con un grupo funcional diferente del aminoácido de ocurrencia natural.

Generalmente hablando, tales variantes serán sustancialmente homólogas al "tipo natural" u otra secuencia especificada aquí es decir compartirá similitud o identidad de secuencia con ella. La similitud o identidad puede estar en el nivel de secuencia de nucleótido y/o secuencia de aminoácido codificada, y preferiblemente, será de por lo menos aproximadamente 50%, 60%, o 70%, o 80%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Se pueden hacer las comparaciones de secuencia utilizando FASTA y FASTP (ver Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98). Preferiblemente se establecen los parámetros, utilizando la matriz por defecto, como sigue: Gapopen (penalidad para el primer residuo en un espacio): -12 para proteínas/-16 para ADN; Gapext (penalidad para residuos adicionales en un espacio): -2 para proteínas/-4 para ADN; longitud de palabra KTUP: 2 para proteínas/6 para ADN. Se puede llevar a cabo análisis para similitud utilizando hibridación. Una fórmula común para calcular las condiciones de restricción requeridas para alcanzar la hibridación entre las moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia específica es: Tm = 81.5oC + 16.6Log [Na+] + 0.41 (% G+C) - 0.63 (% de formamida) - 600/#bp en dúplex (Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Las variantes que retienen rasgos estructurales comunes pueden ser fragmentos de S6K, en particular los fragmentos que mantienen actividad catalítica o rasgos específicos de isoforma. Por ejemplo, las secuencias de terminal carboxi de S6K1 y S6K2 exhiben solo aproximadamente 20% de identidad y por lo tanto pueden ser útiles para incluir tales rasgos específicos a isoformas en los fragmentos cuando se desean ensayos específicos de isoforma. En forma similar, el S6K1 se puede fosforilar en T447, que está ausente en S6K2 proporcionando un rasgo específico de isoforma alternativo o adicional. Preferiblemente, los fragmentos estarán entre 50 y 350 aminoácidos en longitud.

Las variantes de S6K también comprenden mutantes de las mismas, que pueden contener eliminaciones, adiciones o sustituciones de aminoácido, sometidas al requerimiento para mantener por lo menos un rasgo característico de S6K, preferiblemente la actividad catalítica y/o los rasgos específicos a isoforma como se describió anteriormente. Así, se pueden hacer sustituciones de aminoácido conservadoras sin alterar sustancialmente la naturaleza del S6K, como pueden ser las truncaciones. Las adiciones y sustituciones pueden más aún ser hechas de los fragmentos de S6K utilizados en los métodos de detección de la invención, en particular aquellos que mejoran la actividad catalítica S6K o proporcionan algunas otras propiedades deseables. Por ejemplo, los T389, T229 y S371 en ratones S6K1 (también conocidos como p70S6K) son homólogos a T389, T238 y S380 en Drosophila p70S6K. El T389 se indica particularmente para la mutación a un residuo de aminoácido acídico con el fin de producir una quinasa constitutivamente activa. También pueden ser deseables las proteínas de fusión con los fragmentos S6K o S6K referidos anteriormente.

Los ensayos de detección de la invención no se limitan a cualquier método particular para determinar la actividad de quinasa S6. Los ensayos de quinasa S6 se conocen bien en la técnica (ver por ejemplo USPN 6,372,467, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad). En resumen, la quinasa S6 se incubará con un sustrato adecuado, tal como S6, en un amortiguador que permite la fosforilación del S6. La fosforilación del sustrato se puede detectar utilizando un grupo fosfato etiquetado, tal como el uso de la etiqueta radioactiva 32P presente como la fuente ATP en el amortiguador. Alternativamente, se pueden utilizar los anticuerpos específicos para los productos fosforilados de actividad catalítica S6K para detectar actividad. Como será evidente para aquellos medianamente versados en la técnica, los ensayos son fácilmente susceptibles a tecnologías de alto rendimiento utilizando procesos robóticos y automatizados.

Alternativamente, se puede ensayar la actividad de quinasa S6 utilizando un sustrato sintético, tal como aquellos que comprenden Arg-(Arg)-Arg-X-X-Ser-X (por ejemplo, KRRRLASLAA o KRRRLSSLRASTSKSESSQK) (Flowtow and Thomas (1992) J. Biol. Chem. 267: 3074-3078.

También se puede ensayar la actividad S6K al detectar objetivos con dirección 3' de la quinasa. Por ejemplo, la S6K se conoce por afectar la trascripción y traducción de objetivos específicos, tal como genes con tractos de polipirimidina (5'TOPs) y genes ribosómicos. (Fumagalli S, Thomas G. (1999) Ribosmal Protein S6 Fosforylation and Signal Transduction. En: Translational Control. Eds. Hershey, J, Mathews, M, Sonenberg, N. Cold Spring Harbor Press. pp 695-717).

Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, al identificar compuestos que disminuyen la expresión de un gen S6K o un gen expresado bajo el control de secuencias reguladoras S6K.

Tales métodos comprenden poner en contacto componentes celulares activos transcripcionalmente, preferiblemente en una célula, con un ácido nucleico que codifica un gen S6K ligado operablemente a una secuencia promotora o una secuencia promotora S6K (u otras regiones reguladoras S6K que permiten la expresión del gen indicador) ligada operablemente a un gen indicador en la presencia de por lo menos un compuesto; y detectar un efecto del compuesto sobre la expresión de la región de codificación, sea la expresión de quinasa S6 o expresión de gen indicador. Se puede detectar la expresión de quinasa S6 en el nivel transcrito (por ejemplo, mediante hibridación utilizando sondas específicas o PCR) o en el nivel de proteína (por ejemplo, utilizando un anticuerpo). Una disminución en la expresión o actividad promotora de quinasa S6 es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina. Tales ensayos pueden ser ensayos basados en células, en donde los componentes celulares activos transcripcionalmente y el ácido nucleico están presentes en una célula, aunque los ensayos de trascripción in vitro son también conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, la quinasa S6 es quinasa 1 S6.

El gen indicador codifica cualquier molécula capaz de proporcionar un cambio detectable. Tales moléculas indicadoras incluyen grupos funcionales fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes, tales como, proteína fluorescente cian, CFP; proteína fluorescente amarilla, YFP; proteína fluorescente azul, BFP; o proteína fluorescente verde, GFP; todas comercialmente disponibles, Clontech Living Colors User Manual), antígenos, enzimas indicadoras y similares. Las enzimas indicadoras incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: beta-galactosidasa, glucosidasas, cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), glucoronidasas, luciferasa, peroxidasas, fosfatasas, oxidoreductasas, deshidrogenasas, transferasas, isomerasas, quinasas, reductasas, desaminasas, catalasas y ureasa. En la selección de una molécula indicadora a ser utilizada en el método actualmente reivindicado, la molécula indicadora en si misma no puede estar inactiva por ningún agente putativo u otro componente presente en el ensayo de detección, que incluye la inactivación mediante cualquier actividad de proteasa presente en la mezcla de ensayo. La selección de una molécula indicadora apropiada será fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica.

Se proporcionará típicamente el ácido nucleico en un vector que permite la replicación en una o más células anfitrionas seleccionadas, según se conoce bien para una variedad de bacterias, levadura, y células de mamífero. Por ejemplo, varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonare los vectores en células de mamífero. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, fago, o cualquier otro vector o construcción adecuada que se pueda tomar por una célula y utilizar para expresar la secuencia de interés o gen indicador.

Los vectores de expresión contienen usualmente un promotor ligado operablemente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés, con el fin de dirigir la síntesis de mARN. Son bien conocidos los promotores reconocidos por una variedad de células anfitrionas potenciales, como son los promotores S6K1 y S6K2 (secuencias reguladoras con dirección 5'). "Ligado operablemente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, posicionado adecuadamente y orientado para la transcripción a ser iniciada a partir del promotor. El ADN ligado operablemente a un promotor está "bajo control transcripcional" del promotor. Se controla la transcripción de los vectores en células anfitrionas de mamífero, por ejemplo, mediante los promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B y Virus 40 de Simio (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, tales promotores proporcionados son compatibles con los sistemas de célula anfitriona. Los vectores de expresión de la invención también pueden contener uno o más genes de selección, tal como genes que confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas.

Los métodos de la invención pueden por lo tanto incluir adicionalmente la introducción del ácido nucleico en una célula anfitriona. La introducción, que puede ser (particularmente para introducción in vitro) generalmente referida sin limitación como "transformación", puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposoma y transducción utilizando retrovirus u otro virus, por ejemplo vaccinia, como se conoce bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527 537 (1990) and Mansour et al., Nature 336: 348-352 (1988).

Las células anfitrionas transfectadas o transformadas con los vectores de expresión o clonación descritos aquí se pueden cultivar en medio convencional de nutrientes. Las condiciones de cultivo tales como el medio, temperatura, pH y similares, se pueden seleccionar por el experto sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares se puede encontrar en "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) and Sambrook et al, supra.

También se pueden diseñar ensayos específicos para S6K1 al detectar la unión de proteínas específicas, tales como nerabin al dominio de terminal C de S6K1, como se conoce bien en la técnica (Burnett PE, Blackshaw S, Lai MM, Qureshi IA, Burnett AF, Sabatini DM, Snyder SH. Neurabin is a synaptic protein linking p70 S6 kinase and the neuronal cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 7; 95 (14): 8351-6).

Así, en otra realización de la invención se evalúa la inhibición de la interacción de S6K1 con un socio de unión. Esto puede comprender (i) poner en contacto el S6K1 con un socio de unión del mismo en la presencia y ausencia de una sustancia de prueba; y (ii) determinar si la presencia de una sustancia de prueba inhibe la interacción entre el S6K1 y su socio de unión.

Los métodos para evaluar la interacción entre un polipéptido y un socio de unión puede ser cualquiera de los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen aquí. Se puede utilizar cualquiera de estos métodos para evaluar si una sustancia de prueba inhibe la interacción entre un polipéptido (en este caso S6K1) y un socio de unión.

En una realización, los ensayos son aquellos basados en S6K1 y su interacción con neurabin y comprenden la etapa de determinar si la sustancia de prueba inhibe la interacción entre S6K1 y neurabin. Esto se puede lograr al detectar la asociación física entre S6K1 y su socio de unión a través de etiquetar una con una etiqueta detectable y ponerla en contacto con la otra que se ha inmovilizado en un soporte sólido. Las etiquetas detectables adecuadas incluyen metionina 35S que se puede incorporar en el S6K1 producido recombinantemente y/o el socio de unión del mismo. El S6K1 producido recombinantemente y/o socio de unión también se puede expresar como una proteína de fusión que contiene un epítopo que se puede etiquetar con un anticuerpo. Alternativamente, se puede utilizar etiquetado doble como se conoce bien en la técnica, por ejemplo, utilizando una etiqueta radioactiva y un
centellante.

Generalmente, una proteína que se inmoviliza en un soporte sólido se puede inmovilizar utilizando un anticuerpo contra tal proteína unida a un soporte sólido por vía de otras tecnologías que se conocen per se. Una interacción in vitro preferida puede utilizar una proteína de fusión que incluye una etiqueta, tal como glutationa-S-transferasa (GST) o His6. La etiqueta se puede inmovilizar mediante interacción de afinidad, por ejemplo en glóbulos de glutationa agarosa o matrices Ni, respectivamente.

En un formato de ensayo in vitro del tipo descrito anteriormente se puede ensayar el compuesto inhibidor putativo al determinar su capacidad para modular la cantidad de S6K1 etiquetado o socio de unión que se une al socio de unión inmovilizado, por ejemplo, como puede ser el caso de GST-socio de unión o GST-S6K1. Esto se puede determinar al fraccionar los glóbulos de glutationa-agarosa mediante electrólisis de gel de de poliacrilamida SDS. Alternativamente, los glóbulos se pueden enjuagar para remover la proteína no unida y se puede determinar la cantidad de proteína que se ha unido al contar la cantidad de etiqueta presente en, por ejemplo, un contador de centelleo adecuado.

Alternativamente un anticuerpo adherido a un soporte sólido y dirigido contra uno de S6K1 o el socio de unión se pueden utilizar en lugar de GST para adherir la molécula al soporte sólido. Los anticuerpos contra S6K1 y sus socios de unión se pueden obtener en una variedad de formas conocidas como tales en la técnica. En un modo alternativo, uno de S6K1 y su socio de unión se puede etiquetar como un grupo funcional donante fluorescente el otro se etiqueta con un aceptor, que es capaz de reducir la emisión del donante. Esto permite que se conduzca un ensayo de acuerdo con la invención mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En este modo, la señal de fluorescencia del donante se alterará cuando interactúan el S6K1 y su socio de unión. La presencia de un inhibidor candidato que modula la interacción incrementará la cantidad de la señal de fluorescencia del donante.

El FRET es una técnica conocida per se en el arte y así las moléculas de donante y aceptoras precisas y los medios mediante las cuales se ligan a S6K1 y su socio de unión se pueden lograr con referencia a la bibliografía.

Los grupos funcionales donantes adecuados son aquellos capaces de transferir energía fluorogénica a otra molécula o parte fluorogénica de un compuesto e incluyen, pero no se limitan a, coumarinas y tintes relacionados tales como fluoresceínas, rodols y rodaminas, resorufinas, tintes de cianina, bimanos, acridinas, isoindoles, tintes de dansilo, hidracinas aminoeftálicas tales como derivados de luminol e isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos, aminoquinolinas, dicianohidroquinoneas, y complejos de europio y terbio y compuestos relacionados.

Los aceptores adecuados incluyen, pero no se limitan a, coumarinas y fluoróforos relacionados, xantenos tales como fluoresceínas, rodols y rodaminas, resorufinas, cianinas, difluoroboradiazaindacenos, y ftalocianinas.

Un donante preferido es fluoresceína y los aceptores preferidos incluyen rodamina y carbocianina. Los derivados de isotiocianato de esta fluoresceína y rodamina, disponibles de Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Dorset, UK, se pueden utilizar para etiquetar el S6K1 etiqueta y su socio de unión. Para adhesión de la carbocianina, ver por ejemplo Guo et al, J. Biol. Chem., 270; 27562-8, 1995.

Los ensayos de la invención también se pueden desarrollar in vivo. Se puede desarrollar tal un ensayo en una célula anfitriona adecuada, por ejemplo una célula anfitriona de insecto o de mamífero, levadura, bacterias. Son particularmente adecuadas las células anfitrionas de mamífero y levadura. Para desarrollar tal un ensayo in vivo, se pueden introducir las construcciones capaces de expresar S6K1 y su socio de unión y una construcción de gen indicador en las células. Esto se puede lograr mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo precipitación con fosfato de calcio o electroporación. Se pueden expresar las construcciones transitoriamente o como episomas estables, o integradas en el genoma de la célula anfitriona.

Los ensayos in vivo también pueden tomar la forma de dos ensayos híbridos. Los dos ensayos híbridos pueden estar de acuerdo con aquellos descritos por Fields and Song, 1989, Nature 340; 245-246. En tal un ensayo el dominio de unión de ADN (DBD) y el dominio de activación transcripcional (TAD) del factor de transcripción GAL4 de levadura se fusiona con la primera y segunda moléculas respectivamente cuya interacción está por ser investigada. Un factor de transcripción GAL4 funcional se restaura solo cuando interactúan dos moléculas de interés. Así, la interacción de las moléculas se puede medir por el uso de un gen indicador ligado operablemente a un sitio de unión de ADN GAL 4, que es capaz de activar la transcripción de dicho gen indicador. Se pueden utilizar otros dominios de activador transcripcional en lugar del GAL4 TAD, por ejemplo el dominio de activación VP16 vírico.

Independiente de la forma de ensayo utilizada, ellos típicamente correrán con controles adecuados de rutina para aquellos expertos en la técnica y se utilizan preferiblemente para detectar compuestos que pueden estar presentes en colecciones de molécula pequeña, colecciones de péptidos, colecciones de exhibición de fago o colecciones de productos naturales. Los inhibidores actuales o putativos u otros moduladores se pueden proporcionar de cualquier fuente que se desea detectar, y pueden o no pueden ser de ocurrencia natural o sintéticos, y pueden o no pueden ser péptidos o polipéptidos (por ejemplo anticuerpos) o ácidos nucleicos (por ejemplo siARN). Los inhibidores preferidos más adecuados para aplicaciones terapéuticas serán las moléculas pequeñas por ejemplo de una colección combinatoria tal como se conocen bien ahora en la técnica (ver por ejemplo Newton (1997) Expert Opinion Therapeutic Patents, 7(10): 1183-1194). Las sustancias de candidato preferidas pueden incluir moléculas pequeñas tales como inhibidores PKC.

Una modulación inducida por compuesto de la actividad S6K significa que existe un cambio en la actividad S6K (actividad enzimática, actividad de señalización para objetivos en dirección 3', actividad promotora o expresión) en la presencia del compuesto con relación a cuando el compuesto está ausente. En particular una inhibición inducida por compuesto de la actividad S6K se refleja mediante una disminución en la actividad S6K con relación a cuando el compuesto está ausente. Por el contrario, una activación inducida por compuesto de la actividad S6 se refleja por un incremento en la actividad S6K.

Los activadores e inhibidores se denominan aquí colectivamente como moduladores y preferiblemente influencian la actividad quinasa de S6K directamente. Se llevan a cabo ensayos utilizando componentes reconstituidos que se pueden diseñar fácilmente para lograr la inhibición directa del S6K (es decir, inhibición específica de actividad catalítica S6K y sin inhibición de la formación de quinasa activa, por ejemplo, a través de la acción de mTOR). Típicamente, la actividad de quinasa 1 S6 será inhibida selectivamente (es decir, preferencialmente durante la actividad de quinasa 2 S6 y otras quinasas y enzimas.), en particular cuando se desea la inhibición de la señalización de quinasa 1 S6 y tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes. Alternativamente, la actividad de quinasa 2 S6 se activará específicamente para el mismo propósito.

Los inhibidores S6K son compuestos que reducen la actividad S6K, por ejemplo, actividad S6K1 o S6K2. Por ejemplo, los compuestos que inhiben la actividad enzimática S6K típicamente unen a un sitio de unió ATP en S6K o unen a un dominio catalítico de S6K. El compuesto inhibe preferencialmente S6K1 en comparación con S6K2 u otras isoformas S6K, dada la diferencia en los fenotipos observados entre los ratones trasgénicos S6K1 y S6K2. Así, aunque pueden ser útiles los compuestos que inhiben S6K2 o S6K1 y S6K2 (tal como rapamicina, sus derivados u otros inhibidores mTOR), la inhibición selectiva de S6K1 es deseable para el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes. Por lo tanto, los inhibidores S6K1 típicamente reducirán la actividad S6K1 por lo menos 10%, más preferiblemente 20%, 50%, 100% y 200% en comparación con el nivel de reducción de actividad S6K2. Los ensayos de control pueden por lo tanto ser llevados a cabo, por ejemplo con S6K2 inmunoprecipitado y en comparación con S6K1 inmunoprecipitado para establecer la selectividad de un modulador.

Los métodos de detección de la invención pueden comprender opcionalmente un ensayo funcional, que comprende detectar un efecto en la resistencia a la insulina. Los métodos adecuados se establecen en los Ejemplos adelante.

Los métodos de detección pueden incluir opcionalmente la etapa de administrar un modulador potencial a un animal no humano que tiene un gen de quinasa S6 y determinar si la resistencia a la insulina se afecta con relación a cuando el compuesto está ausente, por ejemplo, un efecto en la sensibilidad a la insulina de la alimentación alta en grasa del animal. Los animales no humanos serán típicamente mamíferos de laboratorio tales como ratones o ratas y se pueden administrar varias dosis oralmente mezcladas con el alimento o mediante cualesquier otros medios adecuados, que se pueden escoger dependiendo de las propiedades del compuesto, tales como estabilidad y suministro objetivo. El gen de quinasa S6 puede ser de una especie diferente según el mamífero de laboratorio, por ejemplo, el uso de un ratón que comprende un gen S6K humano, que reemplaza el gen S6K de ratón, será particularmente útil para determinar los efectos de los agentes en S6K humano sin utilizar sujetos humanos.

La potencia y la eficacia de los compuestos para inhibición de S6K1 también se puede evaluar utilizando un modelo de animal para resistencia a la insulina y se compara con animales transgénicos S6K1.

Los equipos útiles para detectar tales compuestos también se pueden preparar de acuerdo con la invención, y comprenderán esencialmente S6K o un fragmento del mismo útil para detección, y las instrucciones. Típicamente el polipéptido S6K será proporcionado junto con medios para detectar la actividad S6K y por lo menos un compuesto (agente putativo) u otra sustancia descrita aquí útil para llevar a cabo los métodos de detección.

El S6K para uso en los equipos de acuerdo con la invención se puede proporcionar en la forma de una proteína, por ejemplo en solución, suspensión o liofilizada, o en la forma de una secuencia de ácido nucleico que permite la producción de S6K o un fragmento del mismo en un sistema de expresión, opcionalmente in situ.

Los compuestos (por ejemplo, agentes putativos) pueden ser inorgánicos u orgánicos, por ejemplo, un antibiótico, anticuerpo, polipéptido o péptido, y se aíslan o purifican típicamente. Una composición "aislada" o "purificada" es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de tejido o célula de la que se deriva, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Un polipéptido que es sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del polipéptido en el que el polipéptido se separa de los componentes de las células de las que éste se aísla, por ejemplo, el polipéptido se produce recombinantemente. Preferiblemente, una preparación de un compuesto terapéutico, por ejemplo, un inhibidor S6K, es por lo menos 75%, más preferiblemente 80%, más preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 98%, y más preferiblemente 99 o 100% del peso seco de la preparación. Las mezclas de los compuestos también se pueden probar durante etapas de detección iniciales.

Los compuestos pueden por lo tanto incluir anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que son específicos para S6K, en particular S6K1, en el sentido de ser capaces de distinguir entre el polipéptido que es capaz de unirse y otros polipéptidos de la misma especie para los que no tienen o sustancialmente no tienen afinidad de unión (por ejemplo una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 1000x peor). Los anticuerpos específicos se unen a un epítopo en la molécula que no está presente o no es accesible en otras moléculas. Por ejemplo, para la inhibición específica de isoforma (inhibición selectiva de actividad S6K1 sobre actividad S6K2), el anticuerpo puede interferir con el dominio de terminal C de S6K, que no se conserva altamente entre S6K1 y S6K2. Se pueden obtener los anticuerpos utilizando técnicas que son estándar en el arte. Por ejemplo, se pueden obtener los anticuerpos de animales inmunizados utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el arte, y detectar, preferiblemente utilizando unión de anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, se puede utilizar técnicas de inmunotransferencia Western o inmunoprecipitación (Armitage et al, Nature, 357:80-82, 1992).

Como una alternativa o complemento para inmunizar un mamífero con un péptido, se puede obtener un anticuerpo específico de una proteína de una colección producida recombinantemente de dominios variables de inmunoglobulina expresados, por ejemplo utilizando bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso que exhiben dominios de unión de inmunoglobulina funcionales en sus superficies; por ejemplo ver WO92/01047.

Se pueden modificar los anticuerpos en un número de formas e incluyen fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, que incluyen moléculas sintéticas y moléculas cuya forma imita aquella de un anticuerpo que le permite unirse a un antígeno o epítopo. Los fragmentos de anticuerpo de ejemplo, capaces de unir un antígeno u otro socio de unión son el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, VH, CI y CH1; el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; el fragmento dAb que consiste de un dominio VH; regiones CDR aisladas y fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de pivote. También se incluyen fragmentos Fv.

Los anticuerpos humanizados en los que los CDR de una fuente no humana se injertan en regiones de estructura humana, típicamente con la alteración de algunos de los residuos de aminoácidos de la estructura, para proporcionar anticuerpos que son menos inmunogénicos que los anticuerpos no humanos progenitores, también se incluyen dentro de la presente invención.

Como es evidente para un experto en la técnica, se puede someter un anticuerpo monoclonal a las técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden involucrar introducir ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las regiones de determinación de complementariedad (CDR), de un anticuerpo a las regiones constantes o regiones constantes más regiones de estructura, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EP-A-184187, GB-A-2188638 o EP-A-0239400. La clonación y expresión de los anticuerpos quiméricos se describe en la EP-A-0120694 y EP-A-0125023.

También se pueden utilizar péptidos como inhibidores de la actividad S6K, tal como un péptido sintético que contiene un dominio autoinhibidor putativo (residuos quinasa 1 S6 400-432; Flowtow and Thomas, 1992) o de hecho los sustratos sintéticos referidos anteriormente (por ejemplo, S6 230-249, Ala 235), que se pueden utilizar adicionalmente para modelar nuevos inhibidores.

Alternativamente, se puede reducir la actividad S6K en una célula utilizando ácidos nucleicos, por ejemplo mediante silenciamiento pre- o post-transcripcional. Así, las secuencias S6K (en particular secuencias específicas para el S6K1) se pueden insertar en los vectores como se describió anteriormente en una orientación anticodificante con el fin de proporcionar la producción de ARN anticodificante o ribozimas.

Las secuencias de ácido nucleico selectivas para S6K1 sobre S6K2 incluyen aquellas que codifican los aminoácidos 33-77 y aminoácidos 454-525 (la numeración se refiere a aquella de la SEQ ID NO:3 en la US2003/0083284, que se incorpora aquí como referencia) o porciones de la misma, que son típicamente de por lo menos 15, 18 o más nucleótidos de longitud. Se pueden hacer comparaciones de secuencias esencialmente como se describió anteriormente utilizando FASTA y FASTP (ver Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98) para establecer la especificidad de las secuencias.

Una alternativa al anticodificante es utilizar ARN bicatenario (dsARN), que se ha encontrado por ser aún más efectivo en el silenciamiento de gen que el anticodificante solo (Fire A. et al Nature, Vol 391, (1998)). El silenciamiento mediado por dsARN es específico a gen y es frecuentemente denominado ARN de interferencia (ARNi) (Ver también Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2: 1110-1119 and Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245).

El ARN de interferencia es un proceso de dos etapas. Primero, se divide el dsARN dentro de la célula para producir los ARN de interferencia corta (siARN) de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud con el fosfato terminal 5' y 3' que sobresale poco (-2 de nucleótidos). Los siARN objetivan la secuencia de ARN correspondiente específicamente para destrucción (Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001). Así en una realización, la inhibición se logra utilizando ARN bicatenario que comprende una secuencia que codifica S6K, en particular una secuencia selectiva para S6K1, que puede por ejemplo ser un ARN bicatenario (que será procesado a siARN, por ejemplo, como se describió anteriormente). Los mecanismos de defensa celular, tal como la ruta PKR necesitarán típicamente ser circunvenidos, por ejemplo utilizando siARN dirigido contra los componentes individuales. Estos productos ARN se pueden sintetizar in vitro, por ejemplo, mediante métodos de síntesis química convencionales.

Sin embargo, para evitar la ruta PKR, se utilizan preferiblemente los dúplex de siARN sintetizado químicamente de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud con extremos que sobresalen 3 (Zamore PD et al Cell, 101, 25-33, (2000)). Se han mostrado los dúplex de siARN sintético para suprimir específicamente la expresión de genes endógenos y heterólogos en un amplio rango de estirpes celulares de mamíferos (Elbashir SM. et al. Nature, 411, 494-498, (2001)).

Así, los dúplex de siARN que contienen entre 20 y 25 bps, más preferiblemente entre 21 y 23 bps, de la secuencia S6K, en particular las secuencias selectivas para S6K1 sobre S6K2, incluyen formar de un aspecto de la invención por ejemplo cuando se produce sintéticamente, opcionalmente en forma protegida para prevenir degradación.

Alternativamente se puede producir siARN a partir de un vector, in vitro (para recuperación y uso) o in vivo. De acuerdo con lo anterior, el vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica S6K (que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante o fragmento de la misma), adecuada para introducir un siARN en la célula en cualquiera de las formas conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe en cualquiera de las referencias citadas aquí, tales referencias se incorporan específicamente aquí como referencia.

En una realización, el vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en la orientación codificante y anticodificante, tal que cuando se expresa como ARN las secciones codificantes y anticodificantes se asociarán para formar un ARN bicatenario. Este puede por ejemplo ser un ARN bicatenario largo (por ejemplo, más de 23 nucleótidos), que se puede procesar in vitro con Dicer para producir los siARN (ver por ejemplo Myers (2003) Nature Biotechnology 21:324-328) o siARN, estructuras de horquillas. Alternativamente, las secuencias codificantes y anticodificantes se proporcionan en diferentes vectores. Estos vectores y productos de ARN son útiles, por ejemplo, para inhibir la producción de novo del polipéptido S6K en una célula. Se pueden introducir tales ácidos nucleicos y vectores en una célula anfitriona a un mamífero en una forma adecuada.

Así, se pueden administrar los ácidos nucleicos, tal como siARN para inhibir la actividad S6K1. Se puede aplicar rutinariamente la tecnología SiARN basada en secuencias específicas para S6K1, tal como AGTGTTTGACA
TAGACCTG o preferiblemente AAGGGGGCTATGGAAAGGTTT. Se puede alcanzar la expresión objetivo de los siARN utilizando promotores específicos para tejidos, tal como promotores específicos para tejido adiposo, de músculo, de hígado u otros tejidos que median la resistencia a la insulina y homeostasis de glucosa.

Para la fácil administración, sin embargo, el compuesto es preferiblemente una molécula pequeña, que se puede unir al sitio catalítico o sitio de unión ATP. Para la inhibición específica de isoforma, el compuesto puede interferir con el dominio de terminal C de S6K, que no se conserva altamente entre S6K1 y S6K2.

Con el fin de mejorar potencialmente los moduladores S6K, se puede utilizar el S6K aislado para establecer la estructura secundaria y terciaria de la proteína completa o por lo menos de las áreas responsables de la actividad enzimática. Los métodos convencionales para la identificación de la estructura tridimensional son, por ejemplo, estudios de rayos X o estudios de RMN. Los datos obtenidos con estos o con otros métodos comparables se pueden utilizar directa o indirectamente para la identificación o mejora de los moduladores de S6K, tal como para proporcionar selectividad entre S6K1 y S6K2. Un método comúnmente utilizado a este respecto es, por ejemplo, diseño de fármaco o modelamiento molecular asistido por computador.

Se pueden identificar los compuestos de acuerdo con la invención mediante detección utilizando las técnicas descritas aquí anteriormente, y preparar mediante la extracción de fuentes naturales o modificadas genéticamente de acuerdo con procedimientos establecidos, o mediante síntesis, especialmente en el caso de compuestos químicos de bajo peso molecular. Se pueden preparar los compuestos proteináceos mediante expresión en sistemas de expresión recombinante, por ejemplo un sistema de baculovirus, o en un sistema bacteriano. Los compuestos proteináceos son principalmente útiles para la investigación de la función de rutas de señalización, aunque pueden tener una aplicación terapéutica, tal como anticuerpos inhibidores humanizados dirigidos contra quinasa 1 S6.

Por otra parte, los compuestos de bajo peso molecular, se producen preferiblemente mediante síntesis química de acuerdo con los procedimientos establecidos. Ellos se indican principalmente como agentes terapéuticos. Los inhibidores PKC, o derivados o modificaciones de los mismos, se pueden utilizar como agentes potenciales efectivos para inhibir selectivamente el S6K1 y en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes. Los compuestos de bajo peso molecular y compuestos orgánicos en general pueden ser útiles como agentes para uso en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes.

La presente invención también proporciona un método para reducir resistencia a la insulina que comprende poner en contacto una célula, in vitro en particular miocitos, adipocitos y/o hepatocitos con una cantidad efectiva de un inhibidor de quinasa 1 S6 de acuerdo con la reivindicación 7. Así, también se proporcionan por la invención compuestos que modulan directamente la actividad de quinasa S6 para uso en el tratamiento de resistencia a la insulina y diabetes. En particular, se proporcionan compuestos que inhiben selectivamente la actividad de quinasa 1 S6 sobre la actividad S6K2 (por ejemplo, un inhibidor de mTOR, que no resultaría en la inhibición de S6K2, que preferiblemente se evita) para uso en el tratamiento de individuos que sufren de o en riesgo de desarrollar resistencia a la insulina o
diabetes.

Diabetes como se utiliza aquí se refiere a diabetes Tipo II que resulta, por ejemplo, de obesidad o afecciones de sobrepeso que resultan de la acumulación de grasa, o de ácidos grasos de alta circulación. Por lo tanto, la resistencia a la insulina o diabetes que resulta de las dietas altas en grasa a diferencia de las afecciones se pretende que resulten en reducción de células beta pancreáticas.

Los moduladores S6K (por ejemplo, inhibidores) para uso en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes se pueden formular como medicamentos de acuerdo con metodologías convencionales, dependiendo de la naturaleza exacta del modulador y comprenderán típicamente el modulador o un precursor del mismo en asociación con un portador biológicamente aceptable. En consideración a varias terapias, se entiende que tales terapias se pueden objetivar a tejidos demostrados para expresar S6K1, en particular a un tejido adiposo, de hígado y de músculo.

Se administran los compuestos en una dosis que es terapéuticamente efectiva. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza aquí significa que la cantidad de un compuesto o composición farmacéutica provoca una respuesta biológica o médica benéfica en un tejido, sistema, animal o humano. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto inhibidor S6K1 es una dosis que lleva a mejora detectable clínicamente en la resistencia a la insulina o diabetes.

El tratamiento incluye el manejo y cuidado de un individuo con el propósito de aliviar un síntoma de la resistencia a la insulina. El tratamiento incluye la administración de un compuesto para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones del trastorno, aliviar los síntomas o complicaciones, o eliminar la afección o trastorno.

El suministro del modulador a las células y tejidos afectados se puede alcanzar utilizando sistemas de empaque o administración. Por ejemplo, se puede formular el modulador para uso terapéutico con agentes aceptables para la administración farmacéutica y suministro al sujeto mediante rutas aceptables para la administración farmacéutica para producir un efecto fisiológico deseable. Una cantidad efectiva es aquella cantidad que produce el efecto fisiológico deseado, tal como, resistencia a la insulina reducida y diabetes Tipo II.

En un aspecto adicional de la invención, la invención también proporciona un modulador (por ejemplo, inhibidor selectivo de quinasa 1 S6) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o tratamiento profiláctico de resistencia a la insulina o diabetes de acuerdo con la reivindicación 8.

Las composiciones pueden incluir, en adición a los constituyentes anteriores, excipientes farmacéuticamente aceptables, agentes de conservación, solubilizadores, sustancias que incrementan la viscosidad, agentes de estabilización, agentes de humectación, agentes de emulsificación, agentes endulzantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, sales para variar la presión osmótica, amortiguadores, o agentes de recubrimiento. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material puede depender de la ruta de administración. Ejemplos de técnicas y protocolos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16th edition, Osol, A. (ed.), 1980.

Cuando la composición se formula en una composición farmacéutica, la administración de la misma se puede efectuar parentalmente tal como oralmente, nasalmente (por ejemplo en la forma de aerosoles nasales) o rectalmente (por ejemplo en la forma de supositorios). Sin embargo, también se puede efectuar la administración parenteralmente tal como intramuscularmente, intravenosamente, cutáneamente, subcutáneamente, o intraperitonealmente (por ejemplo en la forma de soluciones de inyección).

Así, por ejemplo, cuando la composición farmacéutica está en la forma de un comprimido, este puede incluir un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Para la fabricación de comprimidos, comprimidos recubiertos, grajeas y cápsulas de gelatina dura, los compuestos activos y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden procesar con excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente inertes. Se puede utilizar lactosa, maíz, almidón o derivados de los mismos, talco, ácido esteárico o sus sales etc., por ejemplo, tal como excipientes para comprimidos, grajeas y cápsulas de gelatina dura. Los excipientes adecuados para cápsulas de gelatina blanda son, por ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos y líquidos etc. Cuando la composición está en la forma de una formulación farmacéutica líquida, generalmente incluirá un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. También se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Otros excipientes adecuados para la fabricación de soluciones y jarabes son, por ejemplo, agua, polioles, sacarosa, azúcar invertido, glucosa, trehalosa, etc. Excipientes adecuados para soluciones para inyección son, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerol, aceites vegetales, etc. Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o infusión intracatéter en el cerebro, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que es libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuada. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección Ringer de Lactada. Se pueden incluir, según se requiera conservantes, estabilizadores, amortiguadores y/o otros aditivos.

Los presentes inventores han mostrado que los ratones genéticamente intactos alimentados con dieta alta en grasa tienen actividad S6K1 sorprendentemente elevada (ver Ejemplo 9). La invención por lo tanto también proporciona un método para diagnosticar una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes, que comprende: en una muestra de mamífero detectar el nivel de quinasa S6, preferiblemente quinasa 1 S6, en la muestra y correlacionar un cambio en la cantidad de quinasa S6 en la muestra cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores con una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes de acuerdo con la reivindicación 9. La presencia de quinasa S6 se puede determinar fácilmente utilizando anticuerpos o utilizando ensayos de actividad como se describió anteriormente. La expresión S6K también se puede detectar en el nivel transcrito, por ejemplo, utilizando técnicas PCR. Cuando se detectan los niveles de proteína, los anticuerpos específicos para S6K2 se pueden utilizar como un control cuando se desean mediciones específicas de S6K1. En general, un incremento en la actividad de quinasa 1 S6 de por lo menos 10%, preferiblemente por lo menos 20%, 30%, 40% o 50% cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores es indicadora de una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes. Más preferiblemente, el incremento en la actividad es por lo menos 2 veces diferente de un valor de control. La muestra puede ser cualquier muestra de tejido o fluido corporal, pero es preferiblemente tejido adiposo, de músculo o de hígado.

Para determinar la actividad de la quinasa S6K 1 (independiente de las otras isoformas S6K tales como S6K2), se obtiene una muestra de un sujeto de prueba. Se pueden lisar las células presentes en la muestra y se extraen las proteínas. Opcionalmente, se pueden llevar a cabo etapas de purificación adicional. Luego se puede someter la muestra a inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo específico S6K1, que se conoce en la técnica. Luego de la inmunoprecipitación de S6K1, se desarrolla un ensayo de quinasa estándar como se describió anteriormente.

La invención se describe adicionalmente, solo para el propósito de ilustración, en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Métodos de genética molecular, bioquímica e inmunología de péptidos y proteínas se refieren a pero no se describen explícitamente en esta descripción y se reportan ejemplos en la bibliografía científica y se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se llevan a cabo métodos estándar en ingeniería genética esencialmente como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989.

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Ejemplo 1

Los ratones deficientes de S6K1 son más pequeños que los del tipo intacto

Se muestran previamente ratones con deficiencia de S6K1 por tener una reducción en el tamaño corporal durante embriogenia pero el efecto se considera que se supera principalmente en la adultez, disminuyendo de 20 a 15% por 11 semanas de edad. Este Ejemplo demuestra que cuando ellos envejecen, los ratones con deficiencia de S6K1 mantienen un peso corporal más bajo en relación con ratones genéticamente intactos. Los ratones macho en una dieta de concentrado normal (NCD, 4% de calorías totales derivadas de grasa, 3035 kcal kg-1, KLIBA-NAFAG, Suiza) se siguen durante un periodo de diecisiete semanas de diez semanas de edad.

Se generan ratones con deficiencia de S6K1 como se describe por Shima et al. (1998, EMBO J., 17, 6649-6659). Los ratones se mantienen en un antecedente híbrido derivado de las cepas de ratón C57BI/6 y 129Oia, alojados en grupos de 12 (en jaulas de 3) y mantenidos en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad (luces en 06:00 GMT). Se registra el peso corporal semanalmente en los ratones genéticamente intactos (p) y ratones con deficiencia de S6K1 alimentados con dieta de concentrado regular. Inesperadamente, los resultados muestran que la velocidad en que los ratones S6K1-/- ganan peso es mucho más lenta que la de los tipo natural, de tal manera que la diferencia en el peso a las veintisiete semanas, cuando se compara con diez semanas, se ha aumentado al 25%. Se debe notar que los ratones S6K1-/- exhiben poca variación en el peso cuando se comparan con los ratones genéticamente intactos (p).

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Ejemplo 2

Los ratones deficientes de S6K1 tienen grasa corporal reducida

Se disectan ratones para determinar el origen del bajo peso corporal exhibido por los ratones con deficiencia de S6K1 descritos en el Ejemplo 1. Se muestran ratones con deficiencia de S6K1 que tienen menos almohadillas adiposas intrabdominales. Cada masa adiposa y masa de órgano se pesa del tejido removido de ratones macho de 6 meses de edad. La disección de los ratones S6K1 revela una reducción severa de la grasa del tejido adiposo blanco epididímico con relación a los ratones genéticamente intactos (0.8% +/- 0.1% comparado con 3.4% +/- 0.1%; los valores son valores promediados +/- error estándar de la media; E.E.M). El porcentaje de peso corporal de tejido adiposo marrón también se reduce en ratones con deficiencia de S6K1 (0.5% +/- 0.05% comparado con 1.0 +/- 0.1%), mientras que el tamaño del órgano no se afecta esencialmente. Se encuentran resultados similares también en ratones hembra. La reducción en la grasa no se asocia con una reducción selectiva en la deposición de grasa en el hígado o los músculos.

Los resultados establecen que los ratones S6K1 -/- tienen grasa blanca y grasa marrón corporal reducida con relación a los ratones genéticamente intactos.

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Ejemplo 3

Los adipocitos deficientes de S6K1 son más pequeños

Para establecer porqué los ratones con deficiencia de S6K1 exhiben menos grasa, se tiñen secciones de tejido adiposo con hematoxilina y eosina y se visualizan mediante magnificación 20 veces utilizando un microscopio de histología. El tejido adiposo blanco epididímico (WAT) y el tejido adiposo marrón de los ratones con deficiencia de S6K1 exhiben tamaño celular más pequeño cuando se compara con los del tipo intacto.

El análisis del tamaño de las células adiposas en almohadillas adiposas epididímicas mediante microscopía de electrón de exploración o mediante teñido de hematoxilineeosina muestra una reducción sorprendente en el tamaño celular, con cuantificación que revela que los adipocitos de los ratones S6K1-/- es 71% más pequeña que aquellos de los ratones genéticamente intactos (peso: 3129 \pm 904, n=3; S6K1-/-: 918 \pm 189 mm2, n=3, P< 0.05), con muchos adipocitos que exhiben un fenotipo multilocular. Estos estudios también revelan que la distribución del tamaño celular, similar al peso corporal, es mucho más homogéneo en los ratones S6K1-/- cuando se compara con los ratones genéticamente intactos y un cálculo amplio de áreas de superficie celular versus la masa total sugiere que existe poco efecto en el número de células. En resumen, los resultados de la microscopía de electrón, histología y análisis de tamaño/densidad celular establece que la reducción en la grasa en animales deficientes de S6K1 se debe a una reducción en el tamaño de células adiposas.

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Ejemplo 4

La dieta no es la causa de menos grasa en ratones con deficiencia de S6K1

Para establecer sí los ratones S6K1 exhiben diferencias en la dieta sobre los ratones genéticamente intactos, que pudieran explicar la reducción en la grasa en los ratones S6K1, se mide la toma de alimento por ratón cada día durante 15 días utilizando concentrado normal o alto en grasa. Independiente de si se coloca en dieta normal o alta en grasa, los ratones con deficiencia de S6K1 comen la misma cantidad total de alimento como los de tipo genéticamente intacto (aproximadamente 4.6 +/- 0.1 g de alimento/ratón/día), pero comparado con el peso corporal, ellos comen mucho más (aproximadamente 17% o más, o 0.18 comparado con 0.15 g alimento/g de peso corporal/día).

Adicionalmente, a pesar de su delgadez evidente, los ratones no parecen tener inanición cuando la homeostasis de glucosa parece normal (Tabla I adelante), consistente con el hecho de que no hay incremento en la formación de cetona en el cuerpo (valores de D-\beta-hidroxibutirato 1.3 mg/dl \pm 0.05 para los ratones genéticamente intactos, n=8; 1.4 mg/dl \pm 0.1 para los ratones S6K1-/-, n=7; P= 0.8).

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Ejemplo 5

Los ratones con deficiencia de S6K1 exhiben una velocidad metabólica mejorada

La toma de alimento incrementada, combinada con WAT reducido, eleva la posibilidad de actividad metabólica mejorada. La velocidad metabólica de ratones deficientes de S6K1 y los ratones genéticamente intactos se examina mediante calorimetría indirecta para monitorear el consumo de oxígeno y producción de dióxido de carbono cada 15 min durante un periodo de ayuno de ocho horas empleando un Oxymax (Columbus Instruments, Columbus, OH).

Los resultados muestran un sorprendente incremento del 27% en la velocidad del consumo de oxígeno en los ratones S6K1-/- versus los ratones genéticamente intactos a través del experimento. El cálculo de la proporción de intercambio respiratorio (RER = proporción de CO2 producido a O2 consumido) da los valores de 0.713 \pm 0.004 para los ratones genéticamente intactos y 0.709 \pm 0.003 para los ratones S6K1-/-; P< 0.01), argumentando que ambos animales utilizan mucho los ácidos grasos como una fuente de energía.

Se llevan a cabo ensayos de metabolito como sigue. Se recolecta sangre del seno retroorbital después de ayuno durante la noche o 1 hr después del inicio de la comida seguido por ayuno durante la noche. Se determinan los ácidos grasos no esterificados, y triglicéridos mediante ensayos enzimáticos (Boehringer-Mannheim, Alemania). Se mide la leptina en el plasma utilizando el equipo RIA para Leptina de Rata (Linco Research, St Louis, MO.). Los resultados se muestran en la Tabla I. Se reducen significativamente los niveles de leptina en el plasma en los ratones S6K1-/- (Tabla I) al mantener el consumo incrementado de los ratones de alimento con relación al peso corporal.

TABLA 1 Niveles de leptina y ácidos grasos libres, triglicéridos, e insulina postprandial de una hora, después de ayuno durante la noche de ratones macho deficientes de S6K1 y ratones genéticamente intactos de 6 meses de edad alimentados con una dieta normal de o alta en grasa

1

Aunque no se desea estar limitado por la teoría, dada la masa de tejido adiposo reducida, velocidad metabólica incrementada, y el hecho que cuando se corrige para peso corporal, los triglicéridos en el plasma y ácidos grasos libres son similares entre genotipos (Tabla I), se razona que en la ausencia de S6K1, los triglicéridos en el tejido adiposo se utilizan rápidamente o que los ácidos grasos libres nunca alcanzan tejido adiposo para almacenamiento, pero se toman inmediatamente por el músculo y se oxidan.

Aunque el WAT no es normalmente un tejido que consume energía, no existe diferencia entre los niveles basales de ácidos grasos circulantes en los ratones S6K1-/-, cuando se compara con los ratones genéticamente intactos (Tabla I), lo que sugiere que los ácidos grasos libres se pueden oxidar directamente en WAT. Consistente con esta hipótesis, las micrografías de electrón revelan la presencia de muchos adipocitos multiloculares, que exhiben un incremento dramático en el tamaño y número de mitocondria, fenotipos completamente ausentes en adipocitos de los ratones genéticamente intactos. Otros han mostrado que la sobreexpresión de UCP1 en WAT induce un fenotipo similar, y los niveles UCP1, medidos por PCR cuantitativo en tiempo real, se sobreregulan dramáticamente en WAT de los ratones S6K1-/- cuando se compara con WAT de los ratones genéticamente intactos.

Ejemplo 6

Los ratones con deficiencia de S6K1 exhiben lipólisis basal incrementada

La degradación de los triglicéridos en el tejido adiposo (lipólisis) se mide al monitorear la liberación de ácidos grasos o glicerol de adipositos maduros. Se preparan adipocitos primarios de las almohadillas adiposas epididímicas mediante digestión de colagenasa como se describió previamente (Marette et al., 1991). Se incuban células durante 30 min a 37ºC con o sin norepinefrina (Sigma-Aldrich SARL, St-Quentin Fallavier, Francia) en diferentes concentraciones (10^{-8} a 10^{-5}M). La norepineferina es un agonista beta-adrenérgico y estimula la degradación de triglicérido de adipocito a glicerol y ácidos grasos libres (lipólisis) e incrementa la velocidad metabólica basal (termogenia). A pesar de la reducción en el tamaño celular de adipocitos epididímicos (ver Ejemplo 3), los resultados muestran que la velocidad basal de liberación de ácido graso es aproximadamente 5 veces mayor en adipocitos de ratones S6K1-/- cuando se compara con los ratones genéticamente intactos. La velocidad de liberación de ácido graso incrementado en ambos genotipos en una forma dependiente de dosis luego de la adición de norepinefrina, alcanza valores máximos similares, con el incremento en más etapas en los ratones genéticamente intactos. Se obtienen resultados similares para la liberación de glicerol. Por lo tanto, los ratones S6K1-/- se protegen contra la acumulación de grasa debido parcialmente a una forma incrementada en la lipólisis basal.

Ejemplo 7

Los ratones con deficiencia de S6K1 exhiben adipogenia deteriorada

Durante el aislamiento de adipocitos maduros para los estudios de lipólisis, llega a ser evidente que existen pocos preadipocitos presentes en el WAT epididímico de los ratones S6K1-/-. Esto, junto con la incapacidad de los adipocitos para almacenar triglicéridos, experimentos realizados para comparar la capacidad de fibroblastos embriónicos de ratones (MEF) de embriones S6K1-/- y de los tipo genéticamente intactos para diferenciar los adipocitos utilizando una mezcla de diferenciación de adipocito.

Brevemente, se induce diferenciación de adipocito esencialmente como se describió previamente (Hansen et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 2386-2393) utilizando fibroblastos embriónicos de ratones genéticamente intactos o ratones deficientes de S6K1 (MEF). El número de pasaje de los MEF está dentro de un pasaje. Para diferenciación, se tratan células postconfluentes de 2 días (día 0) con medio de crecimiento que contiene dexametasona 1 M (Sigma), 0.5 mM de metulisobutilxantina (Aldrich), 5 \mug/ml de insulina (Boehringer Mannheim), y Ciglitazona (tiazolinodiona, agonista PPAR: BIOMOL, GR-205, 0.5 \muM) durante 2 días. Del día 2, el medio que contiene 5 \mug/ml de insulina y Ciglitazona y renovado cada día. Reñido aceite O rojo: se filtra solución de teñido aceite O rojo (0.5% de aceite O rojo en solución de alcohol isorpropílico-agua destilada (60:40). Las células se lavan con PBS y se tiñen durante 30 min y luego se lavan con agua destilada dos veces. Las células deficientes de S6K1 muestran mucho menos teñido. Por lo tanto, los MEF que carecen de S6K1 tienen un potencial adipogénico reducido, cuando se evalúa por el teñido lípido de aceite O Rojo reducido, consistente con niveles inferiores de aP2 mARN. Tomados juntos los resultados sugieren que lo ratones S6K1-/- tienen WAT reducido debido a la adipogenia deteriorada y una incapacidad para almacenar grasa.

Ejemplo 8

Los ratones con deficiencia de S6K1 se protegen contra la obesidad inducida por dieta

La falla de los ratones S6K1-/- para acumular grasa con la edad combinada con su incremento general en la velocidad metabólica sugiere que ellos se pueden proteger contra obesidad inducida por dieta. En este ejemplo, el peso corporal se registra semanalmente en los ratones genéticamente intactos y ratones deficientes de S6K1 alimentados con dieta alta en grasas (HFD, 60% de calorías total derivadas de grasa, 4057 kcal kg-1, Research diets, USA). Cuando los ratones S6K1 se colocan en una dieta alta en grasa, la ganancia de peso corporal absoluto de ratones con deficiencia de S6K1 es aproximadamente 10.5 g durante el periodo de alimentación de dieta alta en grasa (de la semana 7 a 27 de edad) comparado con aproximadamente 14.4 g en los ratones genéticamente intactos. Similar a la situación en el NCD (Ejemplo 1), los ratones S6K1-/- exhiben poca variación en el peso en un HFD cuando se compara con los ratones genéticamente intactos. Dado el tamaño corporal más pequeño de los transgénicos, la ganancia de peso relativa es similar entre los genotipos (58.9% de incremento del peso corporal en ratones con deficiencia de S6K1 comparado con 58.0% de incremento del peso corporal en los tipo genéticamente intacto después de alimentación con dieta alta en grasa durante 5 meses. Aunque el porcentaje relativo de la ganancia de peso corporal en ratones con deficiencia de S6K1 es similar a los del tipo genéticamente intacto, ellos fallan en acumular grasa al mismo grado que los ratones genéticamente intactos. Durante un periodo de tres meses, los ratones genéticamente intactos ganan 0.1 g/g comparado con 0.02 g/g grasa/peso corporal por ratones con deficiencia de S6K1.

Los ratones de ambos genotipos consumen menos alimento en un HFD que en un NCD, probablemente debido a la mayor densidad calórica del HFD según se compara con el NCD. Aunque en términos absolutos, los ratones S6K1-/- consumen la misma cantidad de alimento como los ratones genéticamente intactos, cuando se normaliza el peso corporal ellos consume 44% más alimento. Así, aunque los ratones S6K1 comen más, ellos no acumulan grasa al mismo grado que los ratones genéticamente intactos.

Se conduce mediciones de calorimetría indirecta durante un periodo de ayuno de ocho horas en ratones HFD y NCD. En ambos genotipos se incrementa el consumo de oxígeno en el HFD, cuando se compara con el NCD, pero el efecto es más pronunciado para los ratones S6K1-/-, de tal manera que la diferencia entre los ratones S6K1-/- y los ratones genéticamente intactos se incrementa de 25% a 30%. Los datos muestran adicionalmente que el RER permanece sin cambio en los ratones S6K1-/- en un HFD versus un NCD, 0.708 \pm 0.002 vs 0.709 \pm 0.004, respectivamente, mientras que en los ratones genéticamente intactos el RER se incrementa de 0.713 \pm 0.004 en NCD a 0.729 \pm 0.002 (n=6, P< 0.01) en una dieta HFD, indicador de un incremento en carbohidrato con relación a la oxidación del ácido graso. A pesar del hecho que los ratones S6K1-/- en dieta exhiben una alta velocidad metabólica, en un HFD ellos exhiben un incremento de tres veces en los niveles de grasas libres circulantes, mientras que en los ratones genéticamente intactos no existe cambio significativo en los niveles de ácidos grasos libres (Tabla I). Por lo tanto, los ratones S6K1-/- fallan en acumular grasa en una velocidad apreciable cuando se exponen con un HFD.

Ejemplo 9

Animales obesos y animales genéticamente intactos en dieta alta en grasa exhiben fosforilación S6K1 elevada en tejido adiposo

Para examinar si el S6K1 se afecta en el tejido adiposo de modelos genéticos normales y obesos, se detecta la fosforilación de S6K1. Esto se puede llevar a cabo fácilmente utilizando anticuerpos fosfoespecíficos. Se determina el nivel de la fosforilación de S6K1 T389 y S6 S240/S244 en el tejido adiposo de los ratones genéticamente intactos en ayuno durante un periodo corto. Luego de la estimulación del factor de crecimiento, el S6 se fosforila múltiples veces en el terminal carboxi en cinco residuos serina en una forma ordenada empezado con Ser236, seguido secuencialmente por > Ser235 > Ser240 > Ser244 y Ser247. Los valores basales de la fosforilación de S6K1 T389 y S6 S240/S244 son bajos en ratones en ayuno durante un corto periodo después de ser mantenidos en un NCD. En contraste, los mismos ratones mantenidos en un HFD y tratados bajo condiciones idénticas, mantienen niveles muy elevados de fosforilación de S6K1 T389 y S6 S240/S244.

Los presentes inventores también examinan la actividad S6K1 en ratones ob/ob, un modelo genético para la obesidad. Los resultados muestran que los ratones ob/ob que mantienen el NCD han elevado la fosrilación de S6K1 T389 y S6 S240/S244 cuando se compara con los ratones genéticamente intactos en un NCD. Los datos humanos preliminares son consistentes con estos datos y proporcionan soporte adicional para S6K1 como un objetivo de fármaco promisorio en el tratamiento de pacientes que sufren de obesidad y como un marcador diagnóstico potencial.

Ejemplo 10

Ratones maduros con deficiencia en S6K1 no exhiben resistencia a la insulina

Se ha sugerido previamente que los ratones con deficiencia de S6K1 son hipersensibles a la insulina en sus tejidos periféricos, debido a que ellos mantienen los niveles de glucosa en ayuno normales, a pesar de su hipoinsulinemia innata y tolerancia leve a la glucosa (Pende et al., 2000).

Se desarrollan pruebas de tolerancia a la glucosa y secreción de insulina in vivo como se describió previamente (Pende et al., 2000). Se desarrollan pruebas de tolerancia a la insulina mediante inyección intraperitoneal de insulina 0.75 U/kg de peso corporal después de 3 horas de ayuno. Se recolecta sangre antes de inyección y 15, 30, 60 y 90 min después de inyección.

En una Dieta de Concentrado Normal, más ratones maduros con deficiencia en S6K1 exhiben una ligera tendencia hacia la sensibilidad de insulina incrementada versus los ratones genéticamente intactos, como se indica por la velocidad de moderadamente, más rápida de la depuración de glucosa luego de la prueba de tolerancia a la insulina. Sin embargo, el efecto es pequeño. Esto aumenta la probabilidad de que el alimento para ratones con deficiencia de S6K1 en una Dieta alta en grasa sería similar a los ratones genéticamente intactos que llegan a ser resistentes a la insulina si se alimentan con en dieta alta en grasa.

Inesperadamente, los resultados de tal un análisis muestran, que a pesar de una forma incrementada en los ácidos grasos libres (Tabla 1), que se implica en la etiología de la resistencia a la insulina, los ratones con deficiencia de S6K1 permanecen sensibles a la insulina, mientras que los ratones genéticamente intactos exhiben fuerte resistencia a la insulina como se espera en una dieta alta en grasa. Consistente con esto los ratones genéticamente intactos llegan a ser intolerantes a la glucosa en una dieta alta en grasa cuando se compara con un conjunto de emparejamiento de ratones en una dieta de concentrado normal. Sin embargo, los ratones con deficiencia de S6K1 en dieta alta en grasa permanecen tolerantes a la glucosa, a pesar de una reducción significativa adicional en los niveles de insulina circulantes postprandiales (1 h) (Tabla 1).

Ejemplo 11

Mecanismo de sensibilidad a la insulina en ratones con deficiencia de S6K1 en dieta alta en grasa

Este Ejemplo aborda cómo los ratones con deficiencia de S6K1 permanecen hipersensibles a la insulina en sus tejidos periféricos en una dieta alta en grasa.

Después de un ayuno de 6 horas, los ratones se anestesian y 0.7 5Ukg-1 de insulina (Eli Lilly) o un volumen igual del vehículo se administra mediante inyección i.v. Se recolectan el hígado, tejido adiposo (almohadillas adiposas epididímicas) y músculo (Gastrocnemio) en nitrógeno líquido 5 minutos después de inyección. Se mide la fosforilación de tirosina del receptor de insulina en el hígado. Los extractos de proteína (1 mg) de las muestras del tejido se preparan para inmunoprecipitación y se analizan como se describe (Hirosumi, 2002). Se compran anticuerpos de Santa Cruz (receptor \beta anti-insulina), Upstate Biotechnology (anti-fosfotirosina) y señalización celular (anti-PKB, anti-fosfo PKB-Ser473, anti-fosfoS6K-Thr 389, anti-fosfo S6 240/244, y Upstate Biotechnology (anti-fosfotirosina).

El examen de la actividad PKB en tejido adiposo luego de inyección de insulina, como un indicador para la ruta de señalización de insulina, revela que la activación de la quinasa se suprime en los ratones genéticamente intactos mantenidos en una dieta alta en grasa versus los ratones que surgen en dieta de concentrado normal. Sin embargo, en contraste con los ratones genéticamente intactos, no existe diferencia significativa en la activación de PKB en ratones con deficiencia de S6K1, independiente de la dieta. La ausencia de un efecto de dieta alta en grasa en la activación PKB en ratones transgénicos S6K1 también es verdadera para el hígado y el músculo.

El examen de la autofosforilación del receptor de insulina muestra que esto también se suprime fuertemente por dieta alta en grasa en el hígado de los ratones genéticamente intactos, pero no en los ratones S6K1-/-, elevando la posibilidad de que el receptor de insulina pueda ser el objetivo del bucle de retroalimentación objetivo.

Dados estos hallazgos, surge la posibilidad de que en una dieta alta en grasa, se eleve la actividad S6K1 y que esta actividad mejorada es responsable de inducir la resistencia a la insulina. Para probar esta posibilidad los presentes inventores examinan el nivel de fosforilación S6K1 T389 y fosforilación S6 en grasa y músculo, cinco minutos luego de una administración intravenosa de insulina. Los resultados muestran que los valores basales de la fosforilación S6K1 T389 son bajos en animales de dieta de concentrado alto en grasa y dieta de concentrado normal, pero en contraste a la fosforilación PKB Ser 473, la insulina estimula estos niveles aún más, suprimiendo potencialmente la señalización de insulina adicional.

Estos hallazgos elevan la posibilidad que un mecanismo potencial por el que humanos obesos llegan a ser resistentes a insulina es a través de la activación S6K1 que induce el nutriente, suprimiendo la señalización de insulina a través de un buque de retroalimentación negativo. Para probar esta posibilidad los presentes inventores examinan la actividad S6K1 en pacientes, que son clínicamente magros, obesos u obesos y diabéticos luego de un periodo de ayuno de seis horas. Los resultados muestran que los pacientes obesos y obesos/diabéticos han elevado los niveles S6K1 cuando se compara con pacientes magros, consistente con el bucle de retroalimentación en el que el S6K1 es un efector negativo principal en la señalización de insulina.

Los resultados tomados juntos sugieren fuertemente que el S6K1 puede ser un objetivo potencial para la intervención de fármaco en el tratamiento de pacientes que sufren de diabetes inducida por obesidad o pacientes que sufren de resistencia a la insulina en sus tejidos periféricos.

Claims

1. Un método para identificar un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, dicho método comprende las etapas de:

i): incubar quinasa S6 con un compuesto;

ii): detectar la actividad de quinasa S6; y

iii): determinar una modulación inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a cuando dicho compuesto está ausente,

en donde una inhibición de la actividad 1 quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende determinar la actividad de quinasa S6 utilizando S6 como un sustrato,

3. El método de la reivindicación 1, que comprende determinar la actividad de quinasa S6 utilizando un péptido como un sustrato.

4. Un método para detección de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, el método comprende

(a): poner en contacto componentes celulares activos transcripcionalmente in vitro con un ácido nucleico que codifica un gen de quinasa 1 S6 ligado operablemente a una secuencia promotora o una secuencia promotora quinasa 1 S6 ligada operablemente a un gen indicador en la presencia de por lo menos un compuesto; y

(b): detectar un efecto de dicho compuesto sobre la expresión de quinasa 1 S6 o actividad promotora de quinasa 1 S6, en donde la detección de una disminución en la expresión o actividad promotora de quinasa 1 S6 es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dichos componentes celulares activos transcripcionalmente y dicho ácido nucleico están presentes en una célula.

6. El método de la reivindicación 4 o 5, que comprende adicionalmente detectar un efecto de dicho agente sobre la resistencia a la insulina.

7. Un método para reducir la resistencia a la insulina, dicho método comprende poner en contacto in vitro un adipocito, miocito o hepatocito con una cantidad efectiva de un inhibidor de quinasa 1 S6, seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para quinasa 1 S6, y anticodificante, ribozima o siARN que reduce preferencialmente la expresión de quinasa 1 S6 comparada con quinasa 2 S6.

8. Uso de una sustancia para la fabricación de un medicamento para tratar o evitar el desarrollo de resistencia a la insulina o diabetes, en donde dicha sustancia es un inhibidor de quinasa S6 seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para quinasa 1 S6, y anticodificante, ribozima o siARN que reduce preferencialmente la expresión de quinasa 1 S6 comparado con la quinasa 2 S6.

9. Un método para diagnosticar la resistencia a la insulina o una predisposición a resistencia a la insulina, que comprende:

(a): detectar el nivel de actividad de quinasa S6 en una muestra de un mamífero; y

(b): correlacionar un cambio en la actividad de quinasa S6 cuando se compara con el valor de control normal o rango de valores con resistencia a la insulina o una predisposición a resistencia a la insulina, en donde un incremento en el nivel de actividad S6K1 comparada con un control normal indica que dicho mamífero que sufre de o tiene una predisposición a desarrollar resistencia a la insulina.