ES2313104T3

ES2313104T3 - Metodo para detectar polimorfismo genico.

Info

Publication number: ES2313104T3
Application number: ES04799608T
Authority: ES
Inventors: Makoto Koizumi
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: ATE404697T1; EP1688493A1; DK1688493T3; US7906639B2; DE602004015832D1; EP1688493A4; US20070009897A1; TW200530396A; EP1688493B1; WO2005045033A1

Abstract

Oligonucleótido, (a) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3'' del mismo es una unidad 2''-O,4''-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales; y (b) donde el oligonucleótido tiene un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana en la posición del extremo 3'' del mismo, y tiene nucleótidos complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana en las otras posiciones, o una sal del mismo.

Description

Método para detectar polimorfismo génico.

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a un método para detectar polimorfismo génico por PCR usando un oligonucleótido que comprende una unidad ENA, un oligonucleótido usado en la detección de polimorfismo génico, y un kit ("kit" = conjunto de materiales y utensilios) para detectar polimorfismo génico que comprende dicho oligonucleótido.

Antecedentes de la técnica

Como resultado de los avances en la farmacogenómica, es actualmente posible predecir los efectos o efectos secundarios de los fármacos en los pacientes individuales mediante diagnosis génica basada en la relación entre el polimorfismo génico y los efectos de los fármacos, o entre el polimorfismo génico y los efectos secundarios. Un ejemplo es el polimorfismo génico de las enzimas metabolizadoras de fármacos. Los ejemplos de enzimas metabolizadoras de fármacos conocidas cuya actividad es incrementada o disminuida por tal polimorfismo incluyen el citocromo P4501A2, el citocromo P4502A6, el citocromo P4502C9, el citocromo P4502C19, el citocromo P4502D6 y el citocromo P4502E1. Ha sido descrito adicionalmente que entre las de un grupo de enzimas conocidas como enzimas de conjugación, tales como la tiopurina metiltransferasa, la N-acetiltransferasa, la UDP-glucuronosiltransferasa o la glutationa S-transferasa, existe tal polimorfismo génico, y que las actividades de dichas enzimas son disminuidas por tal polimorfismo ("SNP Idenshi Takei no Senryaku (Strategy of SNP Gene Polymorphism)", redactado por Yusuke Nakamura, Nakayama Shoten, 5 de junio de 2000).

Además, examinando la relación entre el polimorfismo génico y las enfermedades, deviene posible la prediagnosis de varias enfermedades o la determinación de prognosis. Han sido descritos los de un gran número de genes asociados a enfermedades que han sido descubiertos como resultado de análisis de polimorfismo. Los ejemplos de tales genes asociados a enfermedades que han sido descritos incluyen: el HLA, que es un gen causativo de la colitis ulcerosa; el TCR\alpha, que es un gen causativo de la artritis reumatoide; el APOE4, que es un gen causativo de la enfermedad de Alzheimer; un receptor D3 de dopamina, que es un gen causativo de esquizofrenia; la triptófano hidroxilasa, que es un gen causativo de la psicosis maníaco-depresiva; un precursor de angiotensina, que es un gen causativo de albuminuria; el factor VII de coagulación sanguínea, que es un gen causativo de infarto de miocardio; y la leptina, que es un gen causativo de adiposis (Nature Genetics, 1999, vol. 22, pp. 139-144).

Los ejemplos de métodos que han sido desarrollados para detectar polimorfismo génico incluyen: el método PCR-RFLP, que supone una combinación del método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y del clivaje con enzimas de restricción (Science, 1991, vol. 252, p. 1643); el método SSCP (polimorfismo de conformación de hebra sencilla), basado en el principio de que el ADN y el ARN de hebra sencilla que tienen distintas secuencias presentan distinta movilidad electroforética en geles de poliacrilamida; y el método AS-PCR (PCR aleloespecífica), que se basa en el principio de que los emparejamientos incorrectos que existen en el extremo 3' de un cebador oligonucleotídico inhiben el alargamiento del cebador.

Puesto que el método PCR-RFLP comprende un tratamiento con enzimas de restricción por espacio de un periodo de tiempo de 3 a 24 horas en su proceso de ensayo, es difícil decir que éste sea un método rápido. El método SSCP es excelente por cuanto que cuando existen una o varias mutaciones en cualquier parte de la secuencia nucleotídica que se usa como diana de ensayo, este método es capaz de detectar tal existencia con alta sensibilidad. Sin embargo, puesto que las condiciones experimentales son estrictamente controladas para detectar una sutil diferencia de movilidad, esto es extremadamente complicado, y además no puede identificarse por este método la posición de la mutación. Adicionalmente, a fin de ejecutar el método SSCP usando analitos reales tales como sangre o tejidos, es necesario preparar de antemano una gran cantidad de ácido nucleico mediante clonación o el método PCR. Así, este método no es adecuado para someter eficazmente a ensayo a un gran número de analitos.

El método AS-PCR es un método que supone una modificación de la PCR. Para este método no es necesario preparar de antemano una gran cantidad de ácido nucleico. Este método se basa en el hecho de que puede obtenerse un producto amplificado solamente cuando se usan cebadores que no tienen emparejamiento incorrecto en torno a los extremos 3'. Éste es un método adecuado para someter eficazmente a ensayo a un gran número de analitos. Sin embargo, hay casos en los que puede obtenerse un producto amplificado en PCR ordinaria, aunque existan en los cebadores emparejamientos incorrectos. Por consiguiente, dicho método ha resultado ser problemático en cuanto a rigurosidad.

También se ha descrito que cuando dicho método AS-PCR es modificado, y cuando se prepara un cebador que tiene un nucleósido con una base que no es complementaria del gen diana en la segunda posición desde el extremo 3', y cuando la parte polimórfica a detectar se pone en el extremo 3' del mismo, en comparación con un cebador que tiene un nucleósido con una base complementaria del gen diana en la segunda posición desde el extremo 3', mejora la detección de la parte polimórfica existente en el extremo 3' (Bioorganic & Medical Chemistry, 2003, vol. 11, pp. 2211-2226). Sin embargo, incluso cuando se usa este método hay casos en los cuales puede ser obtenido un producto amplificado incluso si existe emparejamiento incorrecto en el extremo 3' del cebador. En consecuencia, es de desear que se desarrolle un método para detectar el polimorfismo génico con una más alta sensibilidad de
detección.

Un 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (a veces llamado de aquí en adelante "nucleótido ENA") es un nucleótido no natural. Un oligonucleótido en el cual ha sido introducido un nucleótido ENA de este tipo tiene una alta capacidad de fijación al ARN de hebra complementaria (Patente Japonesa Nº 3420984 (Copia Impresa de las Piezas de la Solicitud de Patente Japonesa Distribuida al Público Nº 12-297097) y Bioorganic & Medical Chemistry, 2003, vol. 11, pp. 2211-2226). Adicionalmente, los nucleótidos ENA están caracterizados por tener una más alta resistencia a la nucleasa que los nucleótidos LNA (2'-O,4'-C-metileno nucleótido (Copia Impresa de las Piezas de la Solicitud de Patente Japonesa Distribuida al Público Nº 10-304889), que son formados reticulando, con una cadena de metileno, un átomo de oxígeno en la posición 2' y un átomo de carbono en la posición 4' de una parte de azúcar (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, Vol. 12, pp. 73-76)). Sin embargo, no era sabido si el uso de nucleótidos ENA en un cebador mejoraría la sensibilidad de la AS-PCR.

Como resultado de los estudios dirigidos a resolver dichos problemas de los métodos de detección de polimorfismo, los presentes inventores han descubierto que cuando un oligonucleótido usando como cebador de PCR tiene una parte polimórfica en el extremo 3' del mismo y la tercera posición desde el extremo 3' está modificada con ENA, disminuye la cantidad de producto amplificado generado debido a los emparejamientos incorrectos, y el polimorfismo génico puede ser detectado con alta precisión. Los inventores han aportado adicionalmente un kit destinado a ser usado en dicho método de detección.

Además, los presentes inventores también han descubierto que cuando un oligonucleótido usado como cebador de PCR tiene una parte polimórfica en el extremo 3', y un nucleótido que tiene una base que no es complementaria de un gen a detectar como segundo nucleótido desde el extremo 3', y cuando la tercera posición desde el extremo 3' está modificada con ENA, disminuye la cantidad de producto amplificado generado debido a emparejamientos incorrectos, y el polimorfismo génico puede ser detectado con alta precisión. Los inventores han aportado adicionalmente un kit destinado a ser usado en dicho método de detección, habiendo con ello completado la presente invención.

Exposición de la invención

Es un objeto de la presente invención aportar un método para detectar polimorfismo génico, un oligonucleótido destinado a ser usado en dicho método, y un kit que es para la detección de polimorfismo génico y comprende dicho oligonucleótido.

La presente invención se refiere a un método que es para detectar polimorfismo génico y hace uso de un fenómeno en virtud del cual durante la síntesis de un cebador oligonucleotídico sintético que tiene una secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica del ácido nucleico usado como plantilla, si el nucleótido en el extremo 3' del cebador oligonucleotídico sintético es un nucleótido que no es complementario de los nucleótidos de la plantilla, no tiene lugar un alargamiento del cebador con ADN polimerasa, pero si se usa un cebador oligonucleotídico sintético que es completamente complementario de la secuencia nucleotídica del ácido nucleico usando como plantilla, tiene lugar un alargamiento del cebador con ADN polimerasa.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un método que es para detectar polimorfismo génico y está caracterizado por usar como cebador un oligonucleótido sintético, donde el extremo 3' de la secuencia nucleotídica del mismo es una parte polimórfica, y el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA).

Además, la presente invención se refiere a un método que es para detectar polimorfismo génico y está caracterizado por usar como cebador un oligonucleótido sintético, donde el extremo 3' de la secuencia nucleotídica del mismo es una parte polimórfica, donde el segundo nucleótido desde el extremo 3' del mismo es un nucleótido que tiene una base que no es complementaria de un gen a detectar, y el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA).

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Como medios específicos para alcanzar el objetivo de la presente invención, la presente invención incluye las características siguientes:

(1) Un oligonucleótido,

(a) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales; y

(b) donde el oligonucleótido tiene un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana en la posición del extremo 3' del mismo, y tiene nucleótidos complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana en las otras posiciones,

o una sal del mismo.

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(2) Un oligonucleótido,

(b) donde el oligonucleótido tiene un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana en la posición del extremo 3' del mismo, y tiene nucleótidos complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana en las otras posiciones,

o una sal del mismo.

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(3) Un oligonucleótido,

(a) donde el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana;

(b) donde el segundo nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es un nucleótido que no es complementario del nucleótido de un gen de referencia;

(c) donde el oligonucleótido tiene nucleótidos complementarios de los nucleótidos del gen diana en las otras posiciones; y

(d) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales;

o una sal del mismo.

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(4) Un oligonucleótido,

(a) donde el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana;

(d) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales,

o una sal del mismo.

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(5) Un oligonucleótido o una sal del mismo según cualquiera de los anteriores puntos (1) a (4), caracterizado por tener una longitud en bases de 18 a 25 bases.

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(6) Un método que es para detectar polimorfismo génico y está caracterizado por usar un oligonucleótido según cualquiera de los anteriores puntos (1) a (5).

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(7) Un método que es para determinar la secuencia nucleotídica de una secuencia genéticamente polimórfica y está caracterizado por usar un oligonucleótido según cualquiera de los anteriores puntos (1) a (5).

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(8) Un método que es para detectar polimorfismo génico y comprende los siguientes pasos (a) y (b):

(a) un paso de llevar a cabo PCR con un ácido nucleico que comprende una secuencia genéticamente polimórfica como plantilla usando un oligonucleótido según cualquiera de los anteriores puntos (1) a (5) y un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés junto con dicho oligonucleótido en la PCR; y

(b) un paso de determinar la presencia o ausencia de polimorfismo génico en el ácido nucleico sobre la base de si puede ser o no puede ser generado un producto de reacción en el paso (a).

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(9) Un método que es para determinar la secuencia nucleotídica de una secuencia genéticamente polimórfica y comprende los siguientes pasos (a) y (b):

(b) un paso de determinar la secuencia nucleotídica de una secuencia genéticamente polimórfica en el ácido nucleico sobre la base de si puede o no puede ser generado un producto de reacción en el paso (a).

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(10) Un método según (8) o (9), caracterizado por usar para la detección de la presencia o ausencia de generación de un producto de reacción uno o varios métodos seleccionados de entre los miembros del grupo que consta del método de electroforesis, PCR TaqMan, y MALDI-TOF/MS.

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(11) Un método según cualquiera de los anteriores puntos (6) a (10), caracterizado porque el polimorfismo génico es un polimorfismo de un solo nucleótido.

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(12) Un kit para detectar polimorfismo génico, que comprende lo siguiente de (a) a (d):

(a) un oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(b) un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido descrito en el anterior punto (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

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(13) Un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(a) un oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(b) un cebador capaz de amplificar una parte de una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido descrito en el anterior punto (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

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(14) Un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (e):

(b) un oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana, y en la otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(c) un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido descrito en los anteriores puntos (a) o (b);

(d) ADN polimerasa; y

(e) un tampón de PCR.

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(15) Un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(a) un oligonucleótido,

(i) donde el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana;

(ii) donde el segundo nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es un nucleótido que no es complementario del nucleótido de un gen de referencia;

(iii) donde el oligonucleótido tiene nucleótidos complementarios de los nucleótidos del gen diana en las otras posiciones; y

(iv) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales,

o una sal del mismo;

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

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(16) Un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(a) un oligonucleótido,

(i) donde el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana;

o una sal del mismo;

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

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(17) Un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (e):

(a) un oligonucleótido,

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(iv) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales,

o una sal del mismo;

(b) un oligonucleótido,

(iv) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y donde los otros nucleótidos son nucleótidos naturales,

o una sal del mismo;

(c) un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido descrito en el anterior punto (a) o (b);

(d) ADN polimerasa; y

(e) un tampón de PCR.

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(18) Un kit que es para detectar polimorfismo génico según cualquiera de los anteriores puntos (12) a (17), caracterizado porque el oligonucleótido, y el oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés junto con el oligonucleótido anteriormente mencionado, tienen cada uno una longitud en bases de 18 a 25 bases.

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(19) Un kit según cualquiera de los anteriores puntos (12) a (18), caracterizado porque el polimorfismo génico es un polimorfismo de un solo nucleótido.

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El principio del método para detectar polimorfismo génico de la presente invención es el siguiente:

(1) El extremo 3' de un cebador es dirigido a la parte polimórfica de una secuencia en la cual se pretende detectar polimorfismo génico (la secuencia de interés), y el tercer nucleótido desde el extremo 3' del cebador es modificado con una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA). Cuando se hace que este cebador y ácido nucleico que contiene una secuencia nucleotídica que es la diana de detección del polimorfismo génico reaccionen con una mezcla de enzimas sintetizadoras de ácido nucleico en una solución de reacción, si el extremo 3' del cebador casa (es decir si la base es complementaria), tiene lugar una reacción de síntesis de ácido nucleico. Por el contrario, si el extremo 3' no casa, no tiene lugar una reacción de síntesis de ácido nucleico. Haciendo uso de la diferencia entre la situación en la cual tiene lugar una reacción de síntesis de ácido nucleico cuando el extremo 3' casa y la situación en la que no tiene lugar una reacción cuando el extremo 3' no casa, puede detectarse mutación en una secuencia nucleotídica. Este principio está explicado en las Figuras 1 y 2.

La Figura 1 muestra la situación en la que no hay mutación (polimorfismo) en una secuencia de ácido nucleico. (I) Es un ácido nucleico plantilla de una diana en la cual se pretende examinar la mutación (el polimorfismo) en la secuencia de ácido nucleico, y tiene la secuencia 3'-ATGC-5' como parte de la secuencia nucleotídica del mismo. Este ácido nucleico plantilla es hibridado con oligonucleótido (II) en el cual la tercera posición desde el extremo 3' del mismo ha sido modificada con ENA (una unidad 2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina está representada por eT), para así formar una doble hebra. En este caso, al menos el extremo 3' de la secuencia nucleotídica de (II) tiene una estructura que es complementaria de la correspondiente base, y (II) y (I) forman una doble hebra. La parte del extremo 3' del oligonucleótido (II) que forma tal doble hebra es reconocida por la enzima sintetizadora de ácido nucleico (III), y es continuada la reacción de síntesis de ácido nucleico. Se usan para la explicación las secuencias nucleotídicas específicas que se muestran en la figura, pero ello no significa que la presente invención sea eficaz solamente para tales secuencias nucleotídicas.

La Figura 2 muestra un caso en el que hay mutación (polimorfismo) en una secuencia de ácido nucleico. (I) Es un ácido nucleico plantilla de una diana en la cual se pretende examinar la mutación (el polimorfismo) en la secuencia de ácido nucleico, y tiene la secuencia 3'-ATAC-5' como parte de la secuencia nucleotídica del mismo. Este ácido nucleico plantilla es hibridado con oligonucleótido (II) en el cual la tercera posición desde el extremo 3' del mismo ha sido modificada con ENA (una unidad 2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina está representada por eT), para así formar una doble hebra. En este caso, al menos el extremo 3' de la secuencia nucleotídica de (II) no tiene una estructura que sea complementaria de la correspondiente base, y C en el extremo 3' de (II) y A de (I) no forman un par de bases de Watson-Crick. La parte del extremo 3' del oligonucleótido (II) que no forma un par de bases de Watson-Crick no puede ser reconocida por la enzima sintetizadora de ácido nucleico (III), y no puede ser continuada la reacción de síntesis de ácido nucleico. Se usan para la explicación las secuencias nucleotídicas específicas que se muestran en la figura, pero ello no significa que la presente invención sea efectiva solamente para tales secuencias nucleotídicas.

Otro principio del método de detección de polimorfismo génico de la presente invención es el siguiente:

(2) El extremo 3' de un cebador es dirigido a la parte polimórfica de una secuencia en la cual se pretende detectar polimorfismo génico (la secuencia de interés), y un nucleótido que tiene una base que no es complementaria del gen a detectar es usado como segundo nucleótido desde el extremo 3' del cebador. Adicionalmente, el tercer nucleótido desde el extremo 3' del cebador es modificado con una unidad ENA. Cuando se hace que este cebador, un ácido nucleico que contiene una secuencia nucleotídica como diana de detección de polimorfismo génico y un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés junto con dicho cebador en PCR reaccionen con una mezcla de enzimas sintetizadoras de ácido nucleico en una solución de reacción, si el extremo 3' del cebador casa (es decir, si la base es complementaria), tiene lugar una reacción de síntesis de ácido nucleico, y el gen es amplificado. Por el contrario, si el extremo 3' no casa, no tiene lugar una reacción de síntesis de ácido nucleico, y el gen no es amplificado. Haciendo uso de la diferencia entre la situación en la cual tiene lugar una reacción de síntesis de ácido nucleico cuando la base en el extremo 3' es complementaria y la situación en la que no tiene lugar una reacción cuando la base en el extremo 3' no es complementaria, puede detectarse mutación en una secuencia nucleotídica. El principio se explica en las Figuras 3 y 4.

La Figura 3 muestra una situación en la cual no hay mutación (polimorfismo) en una secuencia de ácido nucleico. (I) Es un ácido nucleico plantilla de una diana en la cual se pretende examinar la mutación (el polimorfismo) en la secuencia de ácido nucleico, y tiene la secuencia 3'-ATGC-5' como parte de la secuencia nucleotídica del mismo. (II) Es un cebador. En este cebador, el segundo nucleósido desde el extremo 3' es un nucleósido que no es complementario del gen a detectar (guanina (G) en la figura), y los otros nucleósidos son complementarios del gen a detectar. Adicionalmente, la tercera posición desde el extremo 3' es un oligonucleótido modificado con un ENA (una unidad 2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina está representada por eT). En esta situación, la secuencia nucleotídica de (II) exceptuando la segunda posición desde el extremo 3' del mismo es complementaria de la correspondiente secuencia nucleotídica de (I). A pesar de que hay un emparejamiento incorrecto en la segunda posición desde el extremo 3' de la secuencia nucleotídica de (II), el ácido nucleico plantilla es hibridado con el cebador de detección de polimorfismo, formando así una doble hebra. La parte del extremo 3' del oligonucleótido (II) que forma tal hebra complementaria es reconocida por la enzima sintetizadora de ácido nucleico (III), y es continuada la reacción de síntesis de ácido nucleico.

Se usan sólo para la explicación las secuencias nucleotídicas específicas que se muestran en la figura, pero ello no significa que la presente invención sea eficaz solamente para tales secuencias nucleotídicas.

La Figura 4 muestra la situación en la cual hay mutación (polimorfismo) en una secuencia de ácido nucleico. (I) Es un ácido nucleico plantilla de una diana en la cual se pretende examinar la mutación (el polimorfismo) en la secuencia de ácido nucleico, y tiene la secuencia 3'-ATAC-5' como parte de la secuencia nucleotídica del mismo. (II) Es un cebador. En este cebador, el nucleósido en el extremo 3' y el segundo nucleósido desde el extremo 3' son nucleósidos que no son complementarios de los del gen a detectar (guanina (G) en la figura), y los otros nucleósidos son complementarios de los del gen a detectar. Adicionalmente, la tercera posición desde el extremo 3' es un oligonucleótido modificado con un ENA (una unidad 2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina está representada por eT). En esta situación, el nucleósido en el extremo 3' y el nucleósido en la segunda posición desde el extremo 3' en la secuencia nucleotídica de (II) no son complementarios de los correspondientes nucleósidos. Así, la parte del extremo 3' de (II) no forma un par de bases de Watson-Crick. La parte del extremo 3' del oligonucleótido (II) que no forma un par de bases de Watson-Crick no puede ser reconocida por la enzima sintetizadora de ácido nucleico (III), y por consiguiente no progresa la reacción de síntesis de ácido nucleico.

Se usan solamente para la explicación las secuencias nucleotídicas específicas que se muestran en la figura, pero ello no significa que la presente invención sea eficaz solamente para tales secuencias nucleotídicas.

La presente invención aporta un nuevo método para detectar polimorfismo génico. Usando un método para detectar polimorfismo génico de la presente invención, es ahora posible detectar el polimorfismo con mayor precisión que cuando se usa un oligonucleótido natural.

Además, la presente invención también aporta un oligonucleótido destinado a ser usado en detección de polimorfismo génico y un kit para detectar polimorfismo génico, el cual comprende dicho oligonucleótido, el cual puede ser usado para dicho método.

1. Explicación de términos

El término "polimorfismo génico" es usado en la presente memoria para hacer referencia a un determinado locus génico, lo cual comprende (a) la sustitución de una sola base por otra base (polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)) y/o (b) la deleción o inserción de una a varias decenas de bases (siendo el número de bases en algunos casos de varios miles de bases) (polimorfismo de inserción/deleción). En la presente memoria se usa también la abreviatura SNP para aludir al polimorfismo de un solo nucleótido, y la misma significa una diferencia de una sola base en las secuencias nucleotídicas entre individuos.

Es sabido que en una posición de polimorfismo de un solo nucleótido pueden estar presentes nucleótidos alternativos (como por ejemplo adenina o guanina, timina o citosina, etc.). El porcentaje de estas variantes varía en dependencia del gen diana. En el sentido en el que se le utiliza en la presente memoria, el término "gen diana" significa un gen usado como diana para el polimorfismo génico.

En la presente memoria, una secuencia que contiene un nucleótido con una alta frecuencia de aparición entre variantes alternativas en un sitio polimórfico de un solo nucleótido de un gen diana está definida como secuencia de referencia, y el nucleótido en el sitio polimórfico de un solo nucleótido en tal secuencia de referencia está definido como nucleótido de referencia. Por otro lado, una secuencia que contiene un nucleótido con una baja frecuencia de aparición está definida como secuencia mutante, y el nucleótido en el sitio polimórfico de un solo nucleótido en tal secuencia mutante está definido como nucleótido mutante.

Además, cuando el polimorfismo es polimorfismo de deleción, una secuencia que no tiene deleción está definida como la secuencia de referencia, y una secuencia que tiene una deleción está definida como la secuencia mutante.

Además, cuando el polimorfismo es polimorfismo de inserción, una secuencia que no tiene inserción está definida como la secuencia de referencia, y una secuencia que tiene una inserción está definida como la secuencia
mutante.

En la presente memoria, la expresión "tiene polimorfismo" es usada para expresar que una secuencia que comprende un polimorfismo de interés en un gen diana tiene una secuencia mutante, y la expresión "no tiene polimorfismo" es usada para expresar que una secuencia que comprende un polimorfismo de interés en un gen diana es una secuencia de referencia.

En la presente memoria, el término "nucleótido natural" incluye los términos nucleótido de adenina, nucleótido de guanina, nucleótido de citosina, nucleótido de uracilo y nucleótido de timina. Adicionalmente, el término "oligonucleótido natural" es usado para aludir a un oligonucleótido que se compone de nucleótidos naturales tales como nucleótido de adenina, nucleótido de guanina, nucleótido de citosina, nucleótido de uracilo o nucleótido de
timina.

En la presente memoria, nucleótido de adenina puede representarse con A^{p}, nucleótido de guanina se representa con G^{p}, nucleótido de citosina se representa con C^{p}, y nucleótido de timina se representa con T^{p}. Además, con respecto al nucleótido en el extremo 3' de un oligonucleótido natural, nucleósido de adenina se representa con A^{t}, nucleósido de guanina se representa con G^{t}, nucleósido de citosina se representa con C^{t}, y nucleósido de timina puede representarse con T^{t}.

Se muestran a continuación las fórmulas estructurales de los nucleótidos naturales.

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En la presente memoria, el término "nucleótido ENA" (o también de aquí en adelante "ENA") es usado para aludir a un nucleótido que es formado reticulando el átomo de oxígeno en la posición 2' de una parte de azúcar y el átomo de carbono en la posición 4' del mismo usando una cadena de etileno (véase la Patente Japonesa Nº 3420984).

En la presente memoria, cada uno de los términos "unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido" y "unidad ENA" es usado para aludir a A^{2ep}, G^{2ep}, C^{2ep}, 5C^{2ep} o T^{2ep}, o cuando el extremo 3' de un oligonucleótido tiene tal unidad, o cuando se trata a ENA como nucleósido, significa cualquier grupo seleccionado de entre C^{2et}, 5C^{2et} y T^{2et}. Se muestran a continuación las estructuras de los mismos. Además se muestra también a continuación como unidad LNA la estructura de C^{e1p}.

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El término "nucleótido complementario" es usado en la presente memoria para aludir a un nucleótido con una parte de bases complementaria de la de otro nucleótido. Específicamente, los pares de bases nucleotídicas que son complementarias unas de otras son los de adenina y timina, guanina y citosina, o adenina y uracilo.

El término "sal del mismo" es usado en la presente memoria para aludir a una sal en la que puede ser convertido un compuesto de la presente invención. Los ejemplos preferidos de una sal de este tipo incluyen las siguientes: sales de metales alcalinos tales como una sal de sodio, una sal de potasio o una sal de litio; sales de metales alcalinotérreos tales como una sal de calcio o una sal de magnesio; sales metálicas tales como una sal de aluminio, una sal de hierro, una sal de cinc, una sal de cobre, una sal de níquel o una sal de cobalto; sales inorgánicas tales como una sal de amonio; sales de aminas incluyendo sales orgánicas tales como sal de t-octilamina, una sal de dibencilamina, una sal de morfolina, una sal de glucosamina, una sal de éster alquílico de fenilglicina, una sal de etilenodiamina, una sal de N-metilglucamina, una sal de guanidina, una sal de dietilamina, una sal de trietilamina, una sal de diciclohexilamina, una sal de N,N'-dibenciletilenodiamina, una sal de cloroprocaína, una sal de procaína, una sal de dietanolamina, una sal de N-bencil-fenetilamina, una sal de piperazina, una sal de tetrametilamonio o una sal de tris(hidroximetil)aminometano; sales de hidrácidos halogenados tales como hidrofluoruro, hidrocloruro, hidrobromato o hidroyoduro; sales de ácidos inorgánicos tales como nitrato, perclorato, sulfato o fosfato; alcanosulfonatos inferiores tales como metanosulfonato, trifluorometanosulfonato o etanosulfonato; arilsulfonatos tales como bencenosulfonato o p-toluenosulfonato; sales de ácidos orgánicos tales como acetato, malato, fumarato, succinato, citrato, tartrato, oxalato o maleato; y sales de aminoácidos tales como una sal de glicina, una sal de lisina, una sal de arginina, una sal de ornitina, una sal glutamato o una sal aspartato.

Un compuesto de la presente invención y una sal del mismo pueden también estar presentes en forma de hidrato. La presente invención incluye tales hidratos.

2. Analito

Puede usarse como analito usado como diana en la que debe detectarse polimorfismo génico en la presente invención una muestra que contenga ácido nucleico. Un ejemplo de tal ácido nucleico es el ADN genómico, pero los ejemplos no quedan limitados al mismo.

Por ejemplo, a fin de detectar polimorfismo génico humano puede usarse un analito que contenga ADN genómico humano. A fin de detectar polimorfismo génico murino puede usarse ADN genómico murino. Tal ADN genómico puede ser obtenido por métodos que son conocidos para los expertos en la materia. De aquí en adelante se usará como ejemplo ADN genómico humano. Sin embargo, puede también obtenerse de la misma manera ADN genómico sacado de otros organismos.

Como material para obtener ADN genómico pueden usarse todos los tipos de células (excluyendo las células de gérmenes), tejidos, órganos, etc. que se tomen de un sujeto. Los ejemplos preferidos de tales materiales incluyen leucocitos o monocitos separados de sangre periférica, siendo el ejemplo más preferido los leucocitos. Tales materiales pueden tomarse por métodos comúnmente usados en los ensayos clínicos.

Cuando se usan leucocitos, los leucocitos son primeramente separados de la sangre periférica tomada de un sujeto por métodos perfectamente conocidos. A continuación se añaden proteinasa K y dodecilsulfato sódico (SDS) a los leucocitos así obtenidos para digerir y desnaturalizar las proteínas, efectuándose a continuación de ello extracción con fenol/cloroformo para obtener ADN genómico (incluyendo ARN). El ARN es retirado con ARNsa, según sea necesario. Sin embargo, la presente invención no queda limitada al método anteriormente mencionado. A fin de extraer ADN genómico de una muestra que contenga ADN genómico humano, se prefieren los métodos que son del dominio público en el ámbito técnico de la presente invención, tales como los métodos que están descritos en publicaciones (véase Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY, por ejemplo), o un método que usa un kit que es para la extracción de ADN y está disponible comercialmente.

No hay limitación particular alguna con respecto a la pureza de un analito que contenga ADN, siempre que el mismo pueda ser usado para PCR. Puede usarse un extracto crudo, un producto purificado, etc. obtenido de una muestra.

3. Selección del gen diana

Puede usarse cualquier gen como diana para la detección de polimorfismo génico en el mismo, siempre que al menos una parte de la secuencia nucleotídica del mismo sea ya conocida y que exista polimorfismo en esa parte. Los ejemplos de tales genes diana incluyen a conocidos genes de metabolización de fármacos asociados a los efectos de los fármacos o a los efectos secundarios de los fármacos, tales como citocromo P4501A2, citocromo P4502A6, citocromo P4502C9, citocromo P4502C19, citocromo P4502D6 o citocromo P4502E1. Adicionalmente, adicionales ejemplos incluyen a la tiopurina metiltransferasa, la N-acetiltransferasa, la UDP-glucuronosiltransferasa, la glutationa S-transferasa, y a genes asociados a enfermedades, tales como el HLA, que es un gen causativo de la colitis ulcerosa, el TCR\alpha, que es un gen causativo de la artritis reumatoide, el APOE4, que es un gen causativo de la enfermedad de Alzheimer, un receptor D3 de dopamina, que es un gen causativo de la esquizofrenia, triptófano hidroxilasa, que es un gen causativo de la psicosis maníaco-depresiva, un precursor de angiotensina que es un gen causativo de la albuminuria, el factor VII de coagulación sanguínea, que es un gen causativo del infarto de miocardio, o la leptina, que es un gen causativo de la adiposis. Un ejemplo adicional es la protrombina humana.

Cuando se usa ADN genómico murino como analito, los ejemplos de polimorfismo incluyen el polimorfismo de un promotor del gen 3 tipo angiopoyetina de ratón y el polimorfismo de deleción.

La posición del polimorfismo en un gen puede ser cualquiera de las siguientes: una región traducida, una región no traducida, una región reguladora tal como un promotor o un intrón, y otras regiones.

4. Cebador oligonucleotídico

Pueden sintetizarse los siguientes oligonucleótidos usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

Pueden sintetizarse oligonucleótidos naturales usando fosforamidita natural. Un 2'-O,4'-C-etileno nucleótido puede ser sintetizado usando los compuestos siguientes: (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita (Ejemplo 14 de la Patente Japonesa Nº 3420984), 5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-2-N-isobutirilguanosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita (Ejemplo 27), 5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-4-N-benzoilcitidina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita (Ejemplo 5), 5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-4-N-benzoil-5-metilcitidina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita (Ejemplo 22), y 5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita (Ejemplo 9).

(1) Oligonucleótidos usados en detección de polimorfismo génico

(1)-1 Los oligonucleótidos usados en detección de polimorfismo génico en la presente invención incluyen lo indicado a continuación en (a) y (b):

(a) un oligonucleótido que tiene una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia de referencia,

(i) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales;

(ii) donde el oligonucleótido tiene un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana en la posición del extremo 3' del mismo, y tiene nucleótidos complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana en la otras posiciones; y

(iii) donde no hay limitación particular alguna con respecto a la longitud del cebador oligonucleotídico, siempre que el mismo sea capaz de amplificar ácido nucleico en PCR, pero la longitud es preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos, más preferiblemente de 18 a 35 nucleótidos, y aún más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos.

De aquí en adelante, a un oligonucleótido que tenga las características anteriormente mencionadas se le llamará "CEBADOR X".

(b) un oligonucleótido que tiene una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia mutante,

(ii) donde el oligonucleótido tiene un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana en la posición del extremo 3' del mismo, y tiene nucleótidos complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana en la otras posiciones; y

(iii) donde no hay limitación particular alguna con respecto a la longitud del oligonucleotídico, siempre que el mismo sea capaz de amplificar un ácido nucleico en PCR, pero la longitud es preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos, más preferiblemente de 18 a 35 nucleótidos, y aún más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos.

El hecho de que el tercer nucleótido desde el extremo 3' del oligonucleótido es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA) en los anteriores puntos (a) y (b) significa que el tercer nucleótido no es un nucleótido natural sino un nucleótido ENA. Ello significa, por ejemplo, que se usa A^{e2p} en lugar A^{p}, se usa G^{e2p} en lugar de G^{p}, se usa 5C^{e2p} o C^{e2p} en lugar de C^{p}, y se usa T^{e2p} en lugar de T^{p}, por ejemplo.

De aquí en adelante, a un oligonucleótido que tenga las características anteriormente mencionadas se le llama "CEBADOR Y".

(1)-2 Los oligonucleótidos usados en detección de polimorfismo génico en la presente invención incluyen adicionalmente lo que se indica a continuación en (c) y (d):

(c) un oligonucleótido que comprende una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia de referencia, exceptuando el segundo nucleótido desde el extremo 3' de la misma;

(i) donde el extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana;

(iii) donde el oligonucleótido tiene nucleótidos complementarios de los nucleótidos del gen diana en las otras posiciones;

(iv) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales; y

(v) donde no hay limitación particular alguna con respecto a la longitud en nucleótidos del mismo, siempre que el mismo sea capaz de amplificar un ácido nucleico en PCR, pero la longitud es preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos, más preferiblemente de 18 a 35 nucleótidos, y aún más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos.

De aquí en adelante, a un oligonucleótido que tenga las características anteriormente mencionadas se le llama "CEBADOR N".

(d) un oligonucleótido que comprende una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia mutante, exceptuando el segundo nucleótido desde el extremo 3' del mismo,

(i) donde el extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana;

De aquí en adelante, a un oligonucleótido que tenga las características anteriormente mencionadas se le llama "CEBADOR P".

El hecho de que el tercer nucleótido desde el extremo 3' del oligonucleótido es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA) es los anteriores puntos (a) a (d) significa que el tercer nucleótido no es un nucleótido natural sino un nucleótido ENA. Ello significa, que usa A^{e2p} en lugar A^{p}, se usa G^{e2p} en lugar de G^{p}, se usa 5C^{e2p} o C^{e2p} en lugar de C^{p}, y se usa T^{e2p} en lugar de T^{p}, por ejemplo.

Estos oligonucleótidos descritos en los anteriores puntos (a) a (d) pueden ser llamados cebadores directos.

(2) Los oligonucleótidos usados como pareja (a) Oligonucleótidos usados en PCR

No hay limitación particular alguna con respecto a la secuencia nucleotídica de un oligonucleótido usado en PCR como una parte de una pareja con cualquier oligonucleótido de los descritos anteriormente en (1) de (a) a (d), siempre que el mismo sea capaz de amplificar la secuencia de interés en un gen usado como diana en PCR, junto con el oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico y descrito anteriormente en (1) de (a) a (d), en la secuencia nucleotídica de un gen usado como diana para la detección de polimorfismo génico. Específicamente, una secuencia nucleotídica de este tipo puede ser cualquier secuencia parcial determinada que conste de 15 a 40, preferiblemente de 18 a 35, y más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos continuos en una secuencia que en lugar de estar en una posición cercana al extremo 5' de la secuencia de la hebra que es complementaria del cebador X, exista en una región situada hacia el extremo 5' de la hebra. Sin embargo, si un oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico y un oligonucleótido usado con el mismo tienen secuencias complementarias una de otra, los mismos se hibridarán uno con el otro, con lo cual es amplificada una secuencia no específica, siendo con ello ocasionado un riesgo de que se impida la detección de un polimorfismo génico específico. Por consiguiente, es preferible que los oligonucleótidos sean diseñados para evitar tal combinación.

En la presente memoria, a un oligonucleótido de este tipo usado como parte de una pareja puede llamársele cebador inverso.

(b) Sonda TaqMan

El extremo 5' de un oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico en PCR TaqMan (sonda TaqMan) es marcado con un colorante reportero fluorescente tal como FAM o VIC, y el extremo 3' del mismo es marcado con un extintor de la fluorescencia [Genet. Anal., 14, pp. 143-149 (1999); J. Clin. Microbiol.], 34, pp. 2933-2936 (1996)].

No hay limitación particular alguna con respecto a la secuencia nucleotídica de la sonda TaqMan usada en pareja con cualquiera de los oligonucleótidos que se han descrito anteriormente en (1) de (a) a (d), siempre que la misma sea capaz de amplificar la secuencia de interés en un gen usado como diana para detección de polimorfismo génico en PCR, junto con un oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico y descrito anteriormente en (1) de (a) a (d). Específicamente, una secuencia nucleotídica de este tipo puede ser cualquier secuencia parcial determinada que conste de 15 a 40, preferiblemente de 18 a 35, y más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos continuos en una secuencia que en lugar de estar en una posición cercana al extremo 5' de la secuencia de la hebra que es complementaria del cebador X, exista en una región situada hacia el extremo 5' de la hebra. Sin embargo, si un oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico y la sonda TaqMan tienen secuencias complementarias una de otra, los mismos se hibridarán el uno con la otra, con lo cual es amplificada una secuencia no específica, siendo con ello ocasionado un riesgo de que se impida la detección de un polimorfismo génico específico. Por consiguiente, es preferible que el oligonucleótido y la sonda TaqMan anteriormente mencionados sean diseñados para evitar tal combinación.

5. Método para detectar polimorfismo génico a. Detección de polimorfismo génico por PCR (1) PCR

El oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico, descrito en cualquiera de los anteriores puntos (a) a (d), el cual fue diseñado en la parte "(1) Oligonucleótidos usados en detección de polimorfismo génico" en el anterior capítulo "4. Cebador oligonucleotídico", y un oligonucleótido usado como parte de una pareja con dicho oligonucleótido, son usados para llevar a cabo una reacción PCR, para detectar polimorfismo en una posición determinada de un gen diana. Aquí, la PCR puede ser realizada mediante cualquiera de las combinaciones siguientes: (i) la combinación de un "CEBADOR X" con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador; (ii) la combinación de un "CEBADOR Y" con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador; (iii) la combinación de un "CEBADOR N" con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador; (iv) la combinación de un "CEBADOR P" con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador; (v) la combinación de (i) con (ii); y (vi) la combinación de (iii) con (iv).

No hay limitación particular alguna con respecto a las condiciones de reacción para la PCR, siempre que pueda ser amplificada bajo tales condiciones una secuencia de ácido nucleico deseada. Así, la PCR puede ser realizada bajo las condiciones que son generalmente aplicadas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la PCR puede ser realizada como se indica a continuación.

(a) Enzima sintetizadora de ácido nucleico

Como enzima sintetizadora de ácido nucleico puede seleccionarse apropiadamente una enzima de entre los miembros del grupo que consta de ADN polimerasa, ARN polimerasa y transcriptasa inversa, en dependencia del tipo de ácido nucleico usado como plantilla. Los ejemplos de ADN polimerasa que aquí se usa incluyen Taq ADN polimerasa sacada de Thermus aquaticus, Tth ADN polimerasa sacada de Thermus thermophilus, KOD, Pfu, o Pwo ADN polimerasa sacada de Pyrococcus, y una mezcla que consta de dichas polimerasas resistentes al calor. Sin embargo, los ejemplos no quedan limitados a éstos. Puesto que la Tth ADN polimerasa también tiene actividad RT, esta enzima está caracterizada porque puede ser usada en solitario cuando se realiza RT-PCR en un método en el que se usa un tubo y un paso. Transcriptasa inversa significa una enzima que es capaz de retrotranscribir ARN a cADN. Los ejemplos de tal transcriptasa inversa incluyen transcriptasas inversas sacadas de Retrovirus aviares tales como el virus asociado con Rous (RAV) o el virus de la mieloblastosis Aviar (AMV), transcriptasas inversas sacadas de retrovirus murinos tales como el virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), y dicha Tth ADN polimerasa. Sin embargo, los ejemplos no quedan limitados a éstos.

(b) Reacción PCR

Por ejemplo, una reacción PCR se realiza de la manera siguiente:

Ejemplo de composición de la solución de reacción

Cloruro de magnesio 2 a 2,5 mM (preferiblemente 2,5 mM);

1 x tampón de PCR (Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a pH 9,0 a 25ºC (preferiblemente pH 8,3)), cloruro potásico 50 mM);

dNTPs 0,2 a 0,25 mM (preferiblemente 0,25 mM);

El oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico y el oligonucleótido usado en pareja con dicho nucleótido 0,2 a 0,5 \muM (preferiblemente 0,2 \muM); y Taq polimerasa 1 a 2,5 unidades (preferiblemente 2,5 unidades).

Se añade agua esterilizada a la solución anteriormente descrita, para ajustar el volumen total a 80 \mul, y el volumen total de la solución es entonces añadido al volumen total de la solución de reacción obtenida tras la conclusión de la reacción de transcripción inversa.

A continuación de ello, es iniciada la PCR.

Condiciones de temperatura de reacción

La solución de reacción es primeramente calentada a 94ºC por espacio de 2 minutos. A continuación de ello se repite haciendo de 28 a 50 ciclos (y preferiblemente 30 ciclos) un ciclo de temperatura que se desarrolla de la manera siguiente: de 90ºC a 95ºC (preferiblemente 94ºC), 30 segundos; de 40ºC a 65ºC (y preferiblemente hasta una temperatura 20ºC inferior a la temperatura de disociación (Tm) calculada sobre la base de las propiedades de los cebadores), 30 segundos; y de 70ºC a 75ºC (preferiblemente 72ºC) por espacio de 1,5 minutos. A continuación de ello, la solución de reacción es enfriada hasta 4ºC.

(2) Detección de polimorfismo génico

Una vez concluida la PCR, la solución de reacción es sometida a electroforesis, para detectar si ha sido o no ha sido amplificada una banda del tamaño de la secuencia de interés.

(a) Ejemplo usando un "CEBADOR X"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés ha sido confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR X, y que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando tal secuencia de interés no puede ser amplificada, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica no es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR X, y que hay polimorfismo.

(b) Ejemplo usando un "CEBADOR Y"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de CEBADOR Y con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR Y, y que hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando tal secuencia de interés no puede ser amplificada, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica no es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR Y, y que no hay polimorfismo.

(c) Ejemplo usando tanto un "CEBADOR X" como un "CEBADOR Y"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando la amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que hay polimorfismo.

(d) Ejemplo usando un "CEBADOR N"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR N, y que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando tal secuencia de interés no puede ser amplificada, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica no es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del "CEBADOR N", y que hay polimorfismo.

(e) Ejemplo usando un "CEBADOR P"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR P, y que hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando tal secuencia de interés no puede ser amplificada, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica no es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR P, y que no hay polimorfismo.

(f) Ejemplo usando tanto un "CEBADOR N" como un "CEBADOR P"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando la amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que hay polimorfismo.

Cuando un experimento como se describe en cualquiera de los anteriores puntos (a) a (f) es realizado usando un oligonucleótido que no contiene un oligonucleótido ENA, puede confirmarse que aparece una banda debido a la fijación de cebador no complementario incluso en el ácido nucleico que actúa como plantilla que en general no genera tal banda. Así, puede confirmarse que el presente método permite la detección de polimorfismo génico con un más alto nivel de sensibilidad en comparación con el método convencional. Adicionalmente, incluso cuando se usa LNA en lugar de la unidad ENA, puede confirmarse cierta fijación de cebador no complementario. Por consiguiente, usando LNA la precisión de detección de polimorfismo génico es inferior a la que se logra con ENA.

Además, cuando se usa un oligonucleótido en el cual la unidad ENA está dispuesta en una posición distinta de la tercera posición del extremo 3' del mismo, disminuyen la precisión y la sensibilidad de detección de polimorfismo génico.

B. Detección de polimorfismo génico por PCR TaqMan

Usando el oligonucleótido que se usa en la detección de polimorfismo génico que se describe en la anterior parte "A." y la sonda TaqMan que se describe en la anterior parte "4.", se realiza PCR TaqMan empleando un ABI PRISM fabricado por ABI según los protocolos que ahí se incluyen, para detectar el polimorfismo génico.

(a) Ejemplo usando un "CEBADOR X"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con la sonda TaqMan, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR X, y que no hay polimorfismo.

(b) Ejemplo usando un "CEBADOR Y"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con la sonda TaqMan, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR Y, y que hay polimorfismo.

(c) Ejemplo usando tanto un "CEBADOR X" como un "CEBADOR Y"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con la sonda TaqMan, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con la sonda TaqMan, puede determinarse que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando la amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con la sonda TaqMan, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con la sonda TaqMan, puede determinarse que no hay polimorfismo.

(d) Ejemplo usando un "CEBADOR N"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con la sonda TaqMan, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR N, y que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando tal secuencia de interés no puede ser amplificada, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica no es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR N, y que hay polimorfismo.

(e) Ejemplo usando un CEBADOR P

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con la sonda TaqMan, puede determinarse que el oligonucleótido en la parte polimórfica es complementario del oligonucleótido en el extremo 3' del CEBADOR P, y que hay polimorfismo.

(f) Ejemplo usando tanto un "CEBADOR N" como un "CEBADOR P"

Cuando la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con la sonda TaqMan, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con la sonda TaqMan, puede determinarse que no hay polimorfismo.

Por otro lado, cuando la amplificación de una secuencia de interés no puede ser confirmada como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con la sonda TaqMan, pero cuando tal amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada por un incremento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con la sonda TaqMan, puede determinarse que no hay polimorfismo.

C. Detección de polimorfismo génico por un método MALDI-TOF/MS

Modificando parcialmente el método que se describe en "A method for detecting polymorphism by MALDI-TOF/MS method", ("SNP Idenshi Yakei no Senryaku (Strategy of SNP Gene Polymorphism)", (redactado por Yusuke Nakamura), Nakayama Shoten, Tokio, (2000), pp. 106-117), puede detectarse polimorfismo génico. Se describe específicamente a continuación este método.

Se amplifica a partir de ADN genómico un producto de PCR que contiene una parte polimórfica. En esta reacción, las bases correspondientes a la parte polimórfica y los cebadores de PCR se diseñan de forma tal que no se solapen mutuamente.

A continuación son eliminados el dNTP que queda en el sistema de reacción PCR y un oligonucleótido usado como cebador, para así obtener un producto de PCR purificado.

El producto de PCR purificado es usado como plantilla. El oligonucleótido que se describe en la parte: "(1) Oligonucleótidos usados en detección de polimorfismo génico" en el anterior capítulo "4." es añadido a dicha plantilla en exceso, tal como 10 veces más o más, y los mismos son entonces hibridados a una temperatura de entre 90ºC y 95ºC, siendo a continuación efectuada una reacción de ciclo térmico. No hay limitación particular alguna con respecto al tipo de reacción de ciclo térmico, siempre que pueda confirmarse en la misma el alargamiento del oligonucleótido. Por ejemplo, la reacción puede ser repetida 25 veces entre las dos temperaturas de 94ºC y 37ºC, para así obtener un adecuado rendimiento de alargamiento.

El producto de la reacción de alargamiento obtenido es purificado, para retirar las sales, el tampón, el agente superficiactivo y la proteína. El producto purificado es sometido a preparación sobre una placa MALDI, y la masa del mismo es luego analizada por MALDI-TOF/MS.

Cuando la parte polimórfica de un gen diana es un oligonucleótido que es complementario de un oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico, se confirma que es amplificado un producto de reacción de alargamiento que es formado añadiendo ddNTP al oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico. Sin embargo, cuando la parte polimórfica no es complementaria del oligonucleótido usado en detección de polimorfismo génico, no es amplificado tal producto de reacción de alargamiento.

Si un producto de reacción de alargamiento es confirmado cuando se usa un CEBADOR X, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido de referencia y no tiene polimorfismo génico. Si tal producto de reacción de alargamiento no es confirmado, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido mutante y tiene polimorfismo génico.

Si es confirmado un producto de reacción de alargamiento cuando se usa un CEBADOR Y, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido mutante y tiene polimorfismo génico. Si no es confirmado tal producto de reacción de alargamiento, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido de referencia y no tiene polimorfismo génico.

Si es confirmado un producto de reacción de alargamiento cuando se usa un CEBADOR N, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido de referencia y no tiene polimorfismo génico. Si no es confirmado tal producto de reacción de alargamiento, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido mutante y tiene polimorfismo génico.

Si es confirmado un producto de reacción de alargamiento cuando se usa un CEBADOR P, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido mutante y tiene polimorfismo génico. Si no es confirmado tal producto de reacción de alargamiento, puede determinarse que la parte polimórfica es un nucleótido de referencia y no tiene polimorfismo génico.

Adicionalmente es también posible medir un producto de PCR detectando la presencia o ausencia del producto de PCR generado usando el sistema Quiagen LightCycler y aplicándolo a un kit para detectar un producto de PCR de este tipo (como p. ej. el kit de PCR Quantitect SYBR Green).

6. Confirmación de la existencia de polimorfismo génico

El método de la presente invención permite la determinación con respecto a si el polimorfismo en ácido nucleico usado como plantilla está presente en estado hetero o en estado homo. Específicamente, ello puede ser determinado mediante cualquiera de los métodos que se describen en los siguientes puntos (a) a (f).

(a) Usando un "CEBADOR X"

En el caso en el que la cantidad de una banda de interés vista es aproximadamente la mitad de la de un analito del que se sabe que está en estado homo, cuando la amplificación de una secuencia de interés ha sido confirmada por PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el polimorfismo está en un estado hetero que consta de un nucleótido de referencia y un nucleótido mutante.

(b) Ejemplo usando un CEBADOR Y

En el caso en el que la cantidad de una banda de interés vista es aproximadamente la mitad de la de un analito del que se sabe que está en estado homo, cuando la amplificación de una secuencia de interés ha sido confirmada por PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el polimorfismo está en un estado hetero que consta de un nucleótido de referencia y un nucleótido mutante.

(c) Ejemplo usando tanto un "CEBADOR X" como un "CEBADOR Y"

En el caso en el que la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR X con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, y en el que la amplificación de una secuencia de interés puede también ser confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR Y con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el polimorfismo está en estado hetero.

(d) Ejemplo usando un "CEBADOR N"

En el caso en el que la cantidad de una banda de interés vista es aproximadamente la mitad de la de un analito del que se sabe que está en estado homo, cuando la amplificación de una secuencia de interés ha sido confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el polimorfismo está en un estado hetero que consta de un nucleótido de referencia y un nucleótido mutante.

(e) Ejemplo usando un "CEBADOR P"

En el caso en el que la cantidad de una banda de interés vista es aproximadamente la mitad de la de un analito del que se sabe que está en estado homo, cuando la amplificación de una secuencia de interés ha sido confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el polimorfismo está en un estado hetero que consta de un nucleótido de referencia y un nucleótido mutante.

(f) Ejemplo usando tanto un "CEBADOR N" como un "CEBADOR P"

En el caso en el que la amplificación de una secuencia de interés puede ser confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR N con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, y en el que la amplificación de una secuencia de interés puede también ser confirmada como resultado de PCR con el uso combinado de un CEBADOR P con un oligonucleótido usado en pareja con dicho cebador, puede determinarse que el polimorfismo está en estado hetero.

7. Kit para detectar polimorfismo génico

Los cebadores y reactivos que se usan para ejecutar los métodos de la presente invención pueden ponerse en forma de kit para detectar polimorfismo génico. Un kit de este tipo puede comprender los artículos siguientes.

Kit 1

(a) Oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 30 del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(b) Oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido que ha sido descrito en el anterior punto (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) Tampón de PCR.

Kit 2

Un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente:

(a) Oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(b) Cebador capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido descrito en el anterior punto (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) Tampón de PCR.

Kit 3

(a) Oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido de referencia de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(b) Oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(c) Oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido que se ha descrito en los anteriores puntos (a) o (b);

(d) ADN polimerasa; y

(e) Tampón de PCR.

Kit 4

(a) Oligonucleótido,

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(v) donde no hay limitación particular alguna con respecto a la longitud del oligonucleótido, siempre que el mismo sea capaz de amplificar un ácido nucleico en PCR, pero tal longitud es preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos, más preferiblemente de 18 a 35 nucleótidos, y aún más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos;

(c) ADN polimerasa; y

(d) Tampón de PCR.

Kit 5

(a) Oligonucleótido,

(iv) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y donde los otros nucleótidos son nucleótidos naturales; y

(v) donde no hay limitación particular alguna con respecto a la longitud del oligonucleótido, siempre que el mismo sea capaz de amplificar ácido nucleico en PCR, pero tal longitud es preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos, más preferiblemente de 18 a 35 nucleótidos, y aún más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos;

(b) Cebador capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido que se describe en el anterior punto (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) Tampón de PCR.

Los kits 1 a 5 de la presente invención pueden también comprender varios tipos de reactivos usados en electroforesis, dNTPs, un marcador usado en electroforesis, etc., según sea necesario.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista que muestra el principio de un método para detectar polimorfismo génico cuando no hay polimorfismo;

la Figura 2 es una vista que muestra el principio de un método para detectar polimorfismo génico cuando hay polimorfismo;

la Figura 3 es una vista que muestra el principio de un método para detectar polimorfismo génico cuando no hay polimorfismo;

la Figura 4 es una vista que muestra el principio de un método para detectar polimorfismo génico cuando hay polimorfismo;

la Figura 5 es una vista que muestra los resultados de PCR usando Premix Taq y varios tipos de cebadores;

la Figura 6 es una vista que muestra los resultados de PCR usando Premix EX Taq y varios tipos de cebadores;

la Figura 7 es una vista que muestra la intensidad de fluorescencia de cada banda detectada por PCR, la cual ha sido convertida en valores numéricos;

la Figura 8 es una vista que muestra polimorfismo en un promotor del gen 3 tipo angiopoyetina;

la Figura 9-A es una vista que muestra los resultados de PCR usando ADN genómico sacado de la cepa AKR de ratón (AKR) como plantilla;

la Figura 9-B es una vista que muestra los resultados de PCR usando ADN genómico sacado de la cepa Nga de ratón KK (KK/Nga) como plantilla;

la Figura 10 es una vista que muestra los resultados de PCR usando como plantillas ADN genómico AKR, ADN genómico KK/Nga, ADN genómico de la cepa Snk de ratón KK (KK/Snk), y ADN formado mezclando cantidades iguales de ADNs genómicos AKR y KK/Nga;

la Figura 11 es una vista que muestra polimorfismo en un promotor de gen 3 tipo angiopoyetina; y

la Figura 12 es una vista que muestra los resultados de PCR usando Premix Taq y varios tipos de cebadores.

En mejor modo de realizar la invención

Se describe más específicamente a continuación la presente invención en los siguientes ejemplos, ejemplos de referencia y ejemplos de ensayo. Sin embargo, estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la presente invención. En los ejemplos siguientes, cada técnica de manipulación genética es ejecuta usando un método descrito en Molecular Cloning, Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, o bien cuando se usan reactivos o kits disponibles comercialmente, los mismos son usados siguiendo las instrucciones que se incluyen con los mismos, a no ser que se especifique otra cosa.

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Ejemplo 1

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-5C^{E2P}-T^{P}-C^{T}

Usando un sintetizador automático de ácido nucleico (sintetizador de ADN/ARN ABI modelo 394, fabricado por Perkin Elmer), el programa fue ejecutado a una escala de 40 nmoles. Con respecto a las concentraciones de disolvente, reactivo y fosforamidita en cada ciclo de síntesis, fueron aplicadas las mismas concentraciones como las aplicadas para la síntesis de un oligonucleótido natural. Se usaron aproximadamente 0,1 \mumoles de CPG. Como fosforamidita no natural se usó el compuesto que se describe en el Ejemplo 22 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno 4-N-benzoil-5-metilcitidina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). Un análogo oligonucleotídico protegido que tenía una secuencia de interés fue tratado con agua amoniacal concentrada, para separar el oligómero del soporte y retirar un grupo cianoetilo como grupo protector sobre un átomo de fósforo y grupo protector sobre una nucleobase. El disolvente fue evaporado bajo presión reducida y el residuo fue purificado por HPLC de fase inversa (LC-10VP fabricado por la Shimadzu Corporation, columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm), solución A: acetonitrilo al 5%, solución acuosa de acetato de trietilamina 0,1M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo, B%: 10% \rightarrow 50% (10 min., gradiente lineal); 60ºC; 2 ml/mm.; 254 nm), para recoger el pico de un producto de interés que tiene un grupo dimetoxitritilo. A continuación de ello fue añadida agua a ello, y la mezcla fue entonces concentrada bajo presión reducida, para retirar el TEAA. A continuación de ello fue añadida una solución acuosa de ácido acético al 80% (200 \mul) y la mezcla se dejó entonces en reposo por espacio de 20 minutos, para desproteger el grupo dimetoxitritilo. El disolvente fue retirado por destilación, y el residuo fue purificado por HPLC de fase inversa (LC-10VP fabricado por la Shimadzu Corporation, columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 nm); solución A: acetonitrilo al 5%, TEAA 0,1M, pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1M, B%: 0% \rightarrow 40% (10 min.; gradiente lineal); 60ºC; 2 ml/min.; 254 nm), para recoger el pico de un producto de interés. El disolvente fue retirado por destilación bajo presión reducida y el residuo fue disuelto en 1 ml de agua (9,4 unidades A_{260}). Adicionalmente, el presente compuesto fue identificado por espectrometría de masa ESI de ion negativo (valor calculado: 6214,11, valor de medición: 6214,62).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 26784-26803 de un gen de protrombina humana (Nº de accesión al GenBank M17262).

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Ejemplo 2

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-5C^{E2P}-T^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo 2 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (21 unidades A_{260}). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6229,12, valor de medición: 6229,21).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 26784-26803 de un gen de protrombrina humana (Nº de accesión al GenBank M17262), donde G está mutada a A en el nucleótido Nº 26784.

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Ejemplo 3

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-5C^{E2P}-A^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo 3 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (8,9 unidades A_{260}). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8530,67, valor de medición: 8530,75).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto corresponde a los nucleótidos Núms. 60529-60556 que se describen en el Nº de accesión al GenBank, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60556.

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Ejemplo 4

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-5C^{E2P}-A^{P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo 4 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (10,1 unidades A_{260}). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8515,66, valor de medición: 8515,56).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto corresponde a los nucleótidos Núms. 60529-60556 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.

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Ejemplo de Referencia 1

HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 1 fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 26784-26803 de un gen de protrombina humana (Nº de accesión al GenBank M17262), y se muestra en la ID SEC Nº: 1 del listado de secuencias.

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Ejemplo de Referencia 2

HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 2 fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 26784-26803 de un gen de protrombina humana (Nº de accesión al GenBank M17262), donde G está mutada a A en el nucleótido Nº 26784. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 2 del listado de secuencias.

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Ejemplo de Referencia 3

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-C^{E2T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 3 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (03 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 5 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-4-N-benzoilcitidina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita, y como soporte sólido se usaron aproximadamente 0,1 \mumoles de universal-Q 500 CPG (fabricado por Glen Research). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6200,08, valor de medición: 6200,25).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 26784-26803 del gen de protrombina humana (Nº de accesión al GenBank M17262).

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Ejemplo de Referencia 4

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{E2T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 4 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (0,94 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 9 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita), y como soporte sólido se usaron aproximadamente 0,1 \mumoles de universal-Q 500 CPG (fabricado por Glen Research). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6215,09, valor de medición: 6215,06).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 26784-26803 del gen de protrombina humana (Nº de accesión al GenBank M17262), donde G está mutada a A en el nucleótido Nº 26784.

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Ejemplo de Referencia 5

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{E2P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 5 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (2,28 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 9 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6200,08, valor de medición: 6200,26).

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Ejemplo de Referencia 6

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{E2P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 6 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (4,98 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 9 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6215,09, valor de medición: 6215,26).

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Ejemplo de Referencia 7

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-GP-A^{P}-G^{P}-G^{2EP}-C^{P}-T^{P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 7 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (4,32 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 27 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-2-N-isobutirilguanosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6200,02, valor de medición: 6199,95).

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Ejemplo de Referencia 8

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{2EP}-C^{P}-T^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 8 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (8,0 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 27 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-2-N-isobutirilguanosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6215,09, valor de medición: 6215,06).

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Ejemplo de Referencia 9

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{E1P}-T^{P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 9 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (13,28 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto (C^{e1p}), 5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-metileno-4-N-benzoilcitidina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita, que se describe en la publicación Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6186,05, valor de medición: 6186,45).

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Ejemplo de Referencia 10

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-T^{P}-G^{P}-A^{P}-G^{P}-G^{P}-C^{E1P}-T^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 10 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (8,0 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto (C^{e1p}), 5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-metileno-4-N-benzoilcitidina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita, que se describe en la publicación Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 6201,07, valor de medición: 6201,14).

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Ejemplo de Referencia 11

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 11 fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

La secuencia nucleotídica del presente compuesto corresponde a los nucleótidos Núms. 60529-60556 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60556. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 3 del listado de secuencias.

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Ejemplo de Referencia 12

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 12 fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

La secuencia nucleotídica del presente compuesto corresponde a los nucleótidos Núms. 60529-60556 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 4 del listado de secuencias.

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Ejemplo de Referencia 13

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{E2T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 13 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (7,8 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 9 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etinelo-5-metiluridina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita), y como soporte sólido fueron usados aproximadamente 0,1 \mumoles de universal-Q 500 CPG (fabricado por Glen Research). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8516,64, valor de medición: 8515,88).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto corresponde a los nucleótidos Núms. 60529-60556 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60556.

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Ejemplo de Referencia 14

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-5C^{2ET}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 14 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (7,4 unidades A_{260}). Sin embargo, como soporte en fase sólida fueron usados aproximadamente 0,1 \mumoles de universal-Q 500 CPG (fabricado por Glen Research). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8516,66, valor de medición: 8516,00).

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Ejemplo de Referencia 15

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{2EP}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 15 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (8,4 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 14 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etinelo-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8516,64, valor de medición: 8516,32).

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Ejemplo de Referencia 16

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{E2P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 16 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (7,9 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 14 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etinelo-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8501,63, valor de medición: 8500,70).

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Ejemplo de Referencia 17

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{2EP}-C^{P}-A^{P}-T^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 17 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (9,7 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 14 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etinelo-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8516,64, valor de medición: 8517,14).

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Ejemplo de Referencia 18

Síntesis de HO-A^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{E2P}-C^{P}-A^{P}-C^{T}

El compuesto del Ejemplo de Referencia 18 fue sintetizado de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1 (7,2 unidades A_{260}). Sin embargo, como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 14 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etinelo-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas ESI de ion negativo (valor calculado: 8501,63, valor de medición: 8501,65).

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Ejemplo de ensayo 1

Detección de SNP en el gen de protrombina humana

A fin de detectar SNP (F2 20210G-A) en un gen de la protrombrina humana (factor II de coagulación; Nº de accesión al GenBank M17262), fueron preparados un cebador inverso y ADN humano usando el TrueSNP Demo Kit (Proligo) según los protocolos que ahí se incluyen. La secuencia nucleotídica del cebador inverso corresponde a los nucleótidos Núms. 26588-26605 del Nº de accesión al GenBank M17262. La secuencia es la siguiente:

5'-GGGTGAAGGCTGTGACCG-3' (ID SEC Nº: 5 del listado de secuencias)

Como cebador directo fue usado el compuesto (1,25 \muM) que se describe en cualquiera de los Ejemplos 1 y 2 y de los Ejemplos de Referencia 1 a 8. Una solución que comprendía 5 \mul del cebador directo, 1,3 \mul del cebador inverso, 12,5 \mul de Premix Taq (fabricado por la Takara Shuzo Co., Ltd.), 1 \mul de una solución de ADN humano y 5,2 \mul de agua esterilizada fue sometida a una reacción PCR (método Hot Start) usando un Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240). Como ciclo de reacción, tras un tratamiento a 94ºC por espacio de 10 minutos fue repetido haciendo 31 ciclos un ciclo que constaba de 94ºC, 1 minuto, 63ºC, 1 minuto y 72ºC, 1 minuto. Una vez concluida la reacción, 1 \mul de una solución de carga fue añadido a 5 \mul de la solución de reacción, efectuándose a continuación de esto electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% (1 x TBE, voltaje constante de 200 V, aproximadamente 1 hora). A continuación de ello, el gel resultante fue coloreado con SYBR Green I (fabricado por Cambrex), y fue usado el sistema Molecular Imager FX Flourescent Imager (Bio-Rad) para visualizar la banda. A continuación de ello se efectuó cuantificación usando el software Quantity One (Bio-Rad).

Los resultados se muestran en la Figura 5. Cuando un compuesto en el que una unidad ENA había sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' del mismo fue usado como cebador directo, en el caso del compuesto del Ejemplo 1 pudo confirmarse la amplificación del gen de interés (216 bp), pero en el caso del compuesto del Ejemplo 2 no pudo ser confirmada la amplificación del gen de interés (216 bp). Por el contrario, cuando los compuestos de los Ejemplos de Referencia 1 y 2, que eran oligonucleótidos naturales, fueron usados como cebadores directos, no solamente en el caso del compuesto del Ejemplo de Referencia 1, sino también en el caso del compuesto del Ejemplo de Referencia 2 fue confirmada la amplificación del gen de interés, y por consiguiente tuvo lugar amplificación del gen debido a fijación no complementaria. Por otro lado, en el caso de los compuestos de los Ejemplos de Referencia 3 y 4, donde una unidad ENA había sido introducida en el extremo 3' de los mismos, y en el caso de los compuestos de los Ejemplos de Referencia 5 y 6, donde una unidad ENA de este tipo había sido introducida en la segunda posición desde el extremo 3' de los mismos, no fue confirmada la amplificación de un gen de interés. Estos resultados revelaron que cuando un compuesto en el que una unidad ENA ha sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' del mismo es usado como cebador, casi no hay fijación no complementaria, con lo que se amplifica selectivamente el gen (216 bp).

La Figura 6 muestra un ejemplo usando Premix EX Taq (fabricado por la Takara Shuzo Co., Ltd.) en lugar de Premix Taq (fabricado por la Takara Shuzo Col., Ltd.). También en este caso, cuando se usaba un cebador en el que una unidad ENA había sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' del mismo, casi no tenía lugar fijación no complementaria, y cuando se usaba el cebador del Ejemplo 1, el gen era amplificado más eficaz y selectivamente.

La intensidad de fluorescencia de la banda detectada fue convertida en un valor numérico y el mismo fue luego registrado gráficamente como se muestra en la Figura 7. En el caso de los compuestos de los Ejemplos de Referencia 9 y 10, una unidad LNA fue introducida en la tercera posición desde el extremo 3' de los mismos. Cuando el compuesto del Ejemplo de Referencia 10 fue usado como cebador directo, se observó un 15% de amplificación del gen debido a fijación no complementaria. Por el contrario, cuando el compuesto del Ejemplo 2, en el que una unidad ENA había sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' del mismo, fue usado como cebador directo, se observó solamente un 6% de amplificación del gen debido a fijación no complementaria. Así, fue revelado que una unidad ENA de este tipo redunda en poca fijación no complementaria, presentando una alta selectividad.

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Ejemplo de ensayo 2

Detección de polimorfismo en el promotor del gen 3 tipo angiopoyetina (1) Preparación de ADN genómico de ratón

Una punta de cola (de 1,5 cm) tomada de cada uno de los ratones (cepa AKR de ratón, cepa Nga de ratón KK y cepa Snk de ratón KK (de 4 semanas de edad)) fue sumergida en 840 \mul de una solución disolvente (que constaba de 720 \mul de 1 x SSC, 80 \mul de SDS al 10% y 40 \mul de proteinasa K a razón de 10 mg/ml) y las muestras fueron entonces sacudidas durante la noche mientras eran incubadas a 50ºC. A continuación fueron añadidos a la solución de reacción 20 \mul de ribonucleasa A a razón de 1 mg/ml, y ello fue entonces incubado a 50ºC por espacio de 1 hora. A continuación de ello se efectuó dos veces extracción con fenol-cloroformo, y luego fue efectuada una vez una operación de precipitación en etanol. El precipitado fue disuelto en 150 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM. A continuación de ello, la solución fue sometida a espectrofotometría (U-3000, fabricado por la Hitachi, Ltd.), para medir la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm. A continuación de ello fue añadida a ello agua esterilizada para ajustar la concentración a 24 ng/\mul, preparando con ello una muestra de ADN genómico.

(2) PCR

A la luz de los resultados de secuenciación directa, el polimorfismo del promotor del gen 3 de proteína tipo angiopoyetina es como se muestra en la Figura 8. La Figura 8 muestra que al ser comparada con la cepa KK/Nga de ratón y con la cepa KK/Snk, la cepa AKR de ratón tiene polimorfismo, de forma tal que están delecionadas 2 bases (CA) indicadas con la marca ":".

Como cebador inverso para PCR fue usado un cebador que tenía la secuencia siguiente:

5'-GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3'(ID SEC Nº: 6 del listado de secuencias).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms 60658-60682 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325. Como cebador directo fue usado un compuesto (1,25 \muM) descrito en cualquiera de los Ejemplos 3 y 4 y los Ejemplos de Referencia 11 a 18. Una solución que comprendía 5 \mul (1,25 \muM) del cebador directo, 5 \mul (1,25 \muM) del cebador inverso, 12,5 \mul de Premix Taq (fabricado por la Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,125 \mul de la solución de ADN genómico (100 ng/1 \mul) y 2,30 \mul de agua esterilizada fue sometida a una reacción PCR (método Hot Start), usando un Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240). Como ciclo de reacción, tras un tratamiento térmico a 94ºC por espacio de 10 minutos fue repetido haciéndose 30 ciclos un ciclo que constaba de 94ºC, 1 minuto, 63ºC, 1 minuto y 72ºC, 1 minuto. Una vez concluida la reacción, 1 \mul de una solución de carga fue añadido a 5 \mul de la solución de reacción, efectuándose a continuación de ello electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% (1 x TBE, voltaje constante de 200 V, aproximadamente 1 hora). A continuación de ello, el gel resultante fue colorado con SYBR Green I (fabricado por Cambrex), y fue usado para visualizar la banda el sistema Molecular Imager FX Fluorescent Imager (Bio-Rad).

(3) Resultados

Se muestran en la Figura 9-A los resultados obtenidos usando el ADN genómico sacado de la cepa AKR de ratón (AKR) como plantilla. Se descubrió que en los compuestos de los Ejemplos 3 y 4, en los que una unidad ENA ha sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' de los mismos, en el caso en el que se usa el compuesto del Ejemplo 3 como cebador directo, fue amplificado selectivamente un gen (154 bp).

Se muestran en la Figura 9-B los resultados obtenidos usando el ADN genómico sacado de la cepa Nga de ratón KK (KK/Nga) como plantilla. Se descubrió que en los compuestos de los Ejemplos 3 y 4, en los que una unidad ENA ha sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' de los mismos, en el caso en el que se usa el compuesto del Ejemplo 4 como cebador directo, el gen (154 bp) fue amplificado con la máxima eficacia y selectividad.

La Figura 10 muestra los resultados de PCR usando los compuestos del Ejemplo 3 y 4 como cebadores directos y también usando como plantilla ADN genómico AKR, ADN genómico KK/Nga, ADN genómico (KK/Snk) de cepa Snk de ratón KK y ADN (mezcla) formado mezclando cantidades iguales de ADNs genómicos AKR y KK/Nga. Como se muestra en la Figura 10A, en el caso de AKR, cuando el compuesto del Ejemplo 3 fue usado en calidad del cebador directo, fue confirmada la amplificación selectiva del gen. En el caso de KK/Nga y KK/Snk, cuando el compuesto del Ejemplo 4 fue usado en calidad del cebador directo, fue confirmada la amplificación selectiva del gen. En el caso de la Mezcla, en ambos casos en los que se usó el compuesto del Ejemplo 3 o el compuesto del Ejemplo 4 en calidad del cebador directo, fue confirmada la amplificación del gen. Así, fue indicado que aunque el polimorfismo esté en estado hetero, el mismo es distinguible. Además, como se muestra en la Figura 10B, cuando fueron usados como cebadores directos los compuestos de los Ejemplos de Referencia 11 y 12, que son cebadores de ADN natural, se observaban subproductos además de la amplificación de la banda de interés. Así, se descubrió que la combinación del compuesto del Ejemplo 3 con el del Ejemplo 4, donde una unidad ENA ha sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' del mismo, es mucho mejor en cuanto a detección de polimorfismo génico.

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Ejemplo 5

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-T^{P}-G^{T}

Usando un sintetizar automático de ácido nucleico (sintetizador de ADN/ARN ABI modelo 394, fabricado por la Perkin Elmer), el programa fue ejecutado a una escala de 40 nmoles, para sintetizar HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-T^{P}-G^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador A"). Con respecto a las concentraciones de disolvente, reactivo y fosforamidita en cada ciclo de síntesis, fueron aplicadas las mismas concentraciones que se usan para la síntesis del oligonucleótido natural. Fueron usados aproximadamente 0,1 \mumoles de CPG. Como fosforamidita no natural fue usado el compuesto que se describe en el Ejemplo 27 de la Patente Japonesa Nº 3420984 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-2-N-isobutirilguanosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforamidita). Un análogo oligonucleotídico protegido que tenía una secuencia de interés fue tratado con agua amoniacal concentrada, para separar el oligómero del soporte y también para retirar el grupo cianoetilo como grupo protector sobre el átomo de fósforo y el grupo protector sobre la nucleobase. El disolvente fue retirado por destilación bajo presión reducida y el residuo fue purificado por HPLC de fase inversa (LC-10VP fabricado por la Shimadzu Corporation, columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm), solución A: acetonitrilo al 5%, solución acuosa de acetato de trietilamina 0,1M (TEAA), pH 7,0, solución B: acetonitrilo, B%: 10% \rightarrow 50% (10 min., gradiente lineal); 60ºC; 2 ml/mm.; 254 nm), para recoger el pico con el producto de interés que tiene un grupo dimetoxitritilo. A continuación se añadió agua a ello, y la mezcla fue entonces concentrada bajo presión reducida, para retirar el TEAA. A continuación fue añadida a ello una solución acuosa de ácido acético al 80% (200 \mul), y la mezcla fue entonces dejada en reposo por espacio de 20 minutos, para desproteger el grupo dimetoxitritilo. El disolvente fue evaporado, y el residuo fue purificado por HPLC de fase inversa (LC-10VP fabricado por la Shimadzu Corporation, columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm), solución A: acetonitrilo al 5%, TEAA 0,1M, pH 7,0, solución B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1M, B%: 0% \rightarrow 40% (10 min., gradiente lineal); 60ºC; 2 ml/min.; 254 nm), para recoger el pico con el producto de interés. El disolvente fue retirado por destilación bajo presión reducida y el residuo fue disuelto en 1 ml de agua. El presente compuesto fue identificado por espectrometría de masas MALDI-TOF (valor calculado: 7625,0, valor de medición: 7624,1).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto (cebador A) es complementaria de una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60522 y donde A está convertida en G en el nucleótido Nº 60523.

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Ejemplo 6

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-T^{P}-A^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-T^{P}-A^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador B") fue sintetizado por el mismo método como el del Ejemplo 5, y el compuesto fue luego identificado por espectrometría de masas MALDI-TOF (valor calculado: 7609,0, valor de medición: 7609,2).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto (cebador B) es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60522.

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Ejemplo 7

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-G^{P}-G^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-G^{P}-G^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador C") fue sintetizado por el mismo método como el del Ejemplo 1, y el compuesto fue luego identificado por espectrometría de masas MALDI-TOF (valor calculado: 7650,0, valor de medición: 7649,4).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto (cebador C) es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en G en el nucleótido Nº 60522 y donde A está convertida en G en el nucleótido Nº 60523.

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Ejemplo 8

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-G^{P}-A^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{2EP}-G^{P}-A^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador D") fue sintetizado por el mismo método como el del Ejemplo 5, y el compuesto fue luego identificado por espectrometría de masas MALDI-TOF (valor calculado: 7634,1, valor de medición: 7634,2).

La secuencia nucleotídica del presente compuesto (cebador D) es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en G en el nucleótido Nº 60522.

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Ejemplo de Referencia 19

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador E") fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico. La secuencia nucleotídica del presente compuesto (cebador E) es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60522 y donde A está convertida en G en el nucleótido Nº 60523. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 7.

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Ejemplo de Referencia 20

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-A^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-A^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador F") fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico. La secuencia nucleotídica del presente compuesto (cebador F) es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en T en el nucleótido Nº 60522. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 8.

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Ejemplo de Referencia 21

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-G^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador G") fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

La secuencia nucleotídica del cebador G es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en G en el nucleótido Nº 60522 y donde A está convertida en G en el nucleótido Nº 60523. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 9.

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Ejemplo de Referencia 22

Síntesis de HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{T}

HO-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-T^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-G^{P}-C^{P}-T^{P}-A^{P}-C^{P}-T^{P}-T^{P}-C^{P}-A^{P}-C^{P}-A^{P}-T^{P}-G^{P}-G^{P}-A^{T} (llamado de aquí en adelante "cebador H") fue sintetizado por un método común usando un sintetizador automático de ácido nucleico.

La secuencia nucleotídica del cebador H es una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60499-60523 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325.14, donde C está convertida en G en el nucleótido Nº 60522. Esta secuencia se muestra en la ID SEC Nº: 10.

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Ejemplo de ensayo 3

Detección de SNP en promotor de gen 3 tipo angiopoyetina

Una punta de cola (de 1,5 cm) tomada de cada uno de los ratones de la cepa AKR de ratón y de la cepa Nga de ratón KK (de 4 semanas de edad) fue sumergida en 840 \mul de una solución disolvente (que constaba de 720 \mul de 1 x SSC, 80 \mul de SDS al 10%, y 40 \mul de proteinasa K a razón de 10 mg/ml), y fue luego sacudida durante la noche mientras se efectuaba incubación a 50ºC. A continuación fueron añadidos a la solución de reacción 20 \mul de ribonucleasa A a razón de 1 mg/ml, y se efectuó luego incubación a 50ºC por espacio de 1 hora. A continuación de ello se efectuó dos veces extracción con fenol-cloroformo, y se efectuó una vez una operación de precipitación en etanol. El precipitado fue disuelto en 150 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM. A continuación de ello, la solución fue sometida a espectrofotometría (U-3000, fabricado por la Hitachi, Ltd.), para medir la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm. A continuación fue añadida a ello agua esterilizada para ajustar la concentración a 25 ng/\mul, preparando con ello una muestra de ADN genómico.

A la luz de los resultados de secuenciación directa, el SNP en el promotor del gen 3 tipo angiopoyetina es como se muestra en la Figura 11.

La secuencia nucleotídica del cebador inverso es la siguiente:

5'GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3'(ID SEC Nº: 6 del listado de secuencias)

(La secuencia nucleotídica del presente compuesto es complementaria de una secuencia que corresponde a los nucleótidos Núms. 60658-60682 que se describen en el Nº de accesión al GenBank AL935325).

Se prepararon 5 \mul de una solución a base de 12,5 \mul de Premix Taq (fabricado por la Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,125 \mul de una solución de ADN genómico (100 ng/1 \mul), 5 \mul (1,25 \muM) del cebador inverso y 2,38 \mul de agua esterilizada, y en calidad del cebador directo (cebador A, B, C, D, E, F, G o H) (1,25 \muM) se usó un compuesto como el que se describe en cualquiera de los ejemplos y los ejemplos de referencia. La solución preparada fue sometida a una reacción PCR (método Hot Start), usando un Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240). Como ciclo de reacción, tras un tratamiento a 94ºC por espacio de 10 minutos fue repetido haciéndose 30 ciclos un ciclo que constaba de 94ºC, 1 minuto, 63ºC, 1 minuto, y 72ºC, 1 minuto.

Una vez concluida la reacción, 1 \mul de una solución aditiva (solución de carga) fue añadido a 5 \mul de la solución de reacción, efectuándose a continuación electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% (1 x TBE, voltaje constante de 200 V, aproximadamente 1 hora). A continuación de ello, el gel resultante fue coloreado con SYBR Green I (fabricado por Cambrex), y se usó para visualizar la banda el sistema Molecular Imager FX Flourescent Imager (Bio-Rad).

Se predijo que cuando la reacción PCR fuese realizada correctamente, si se usaba el ADN genómico (AKR) sacado de la cepa AKR de ratón, sería amplificado selectivamente un gen (de 182 bp), y que si se usaba el ADN genómico (KK/Nga) sacado de la cepa Nga de ratón KK, sería amplificado selectivamente un gen (184 bp).

Los resultados se muestran en la Figura 12. En el caso en el que la PCR fue realizada usando cebador E o cebador F como cebador directo, cuando se usó cebador E como cebador para el ADN genómico sacado de la cepa AKR de ratón, fue confirmada la amplificación de un gen. Por otro lado, para el ADN genómico sacado de la cepa Nga de ratón KK, en ambos casos en los que se usó como cebador cebador F o cebador E, se observó amplificación de un gen.

Además, en el caso en el que la PCR fue realizada usando cebador A o cebador B como cebador, cuando se usó cebador A como cebador para ADN genómico sacado de la cepa AKR de ratón, fue confirmada la amplificación de un gen. Por otro lado, para ADN genómico sacado de la cepa Nga de ratón KK, cuando se usó cebador B como cebador, se observó amplificación de un gen.

En el caso en el que se usó como cebador cebador G o cebador H, para ADN genómico sacado de la cepa AKR de ratón, cuando se usó cebador G como cebador, fue amplificado un producto génico de interés. Cuando se usó cebador H como cebador, fue obtenido un producto amplificado que se consideró que era un subproducto de tamaño menor que el del producto de interés. Adicionalmente, para el ADN genómico sacado de la cepa Nga de ratón KK, cuando se usó cebador H como cebador, fue obtenido no tan sólo un producto génico de interés, sino también un producto amplificado que se consideraba que era un subproducto que tenía una longitud de cadena menor que el tamaño de un producto de interés.

Cuando se usó como cebador cebador C o cebador D, para ADN genómico sacado de la cepa AKR de ratón, cuando se usó cebador C como cebador, fue amplificado un gen. Además, para ADN genómico sacado de la cepa Nga de ratón KK, cuando se usó como cebador cebador D, se observó la amplificación de un gen.

A la luz de los resultados anteriormente mencionados, pudo confirmarse que el uso de un cebador en el que una unidad ENA ha sido introducida en la tercera posición desde el extremo 3' del mismo mejora la eficacia de detección, en comparación con un cebador convencional.

Aplicabilidad industrial

El método de la presente invención permite la detección de polimorfismo génico. Adicionalmente, usando un método de detección de polimorfismo génico de la presente invención resulta posible detectar polimorfismo con mayor precisión que cuando se usa un oligonucleótido natural.

Además, cuando se usa en dichos métodos un oligonucleótido para la detección de polimorfismo génico y un kit que es para detectar polimorfismo génico y comprende dicho oligonucleótido, pueden ser detectados varios tipos de polimorfismo génico. La presente invención puede ser usada en varios campos tales como los de la medicina, la agricultura, la elaboración de comestibles o la industria, pero tales campos industriales no están limitados, siempre que tales campos requieran la detección de polimorfismo génico.

<110> SANKYO COMPANY, LIMITED

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<120> Método de Detección de Polimorfismo Genético

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<130> FP0427 - EPP91741

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<140> EP04799608.7

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<150> JP 2003-378039

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<151> 2003-11-07

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<150> JP 2004-121080

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<151> 2004-04-16

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<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Inventor: Koizumi, Makoto

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<400> 1

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10

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> alelo

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<222> (20)..(20)

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<223> C está sustituida por T

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<400> 2

\hskip1cm

11

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<210> 3

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> alelo

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<222> (28)..(28)

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<223> C está sustituida por T

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<400> 3

\hskip1cm

12

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<210> 4

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 4

\hskip1cm

13

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<210> 5

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

\hskip1cm

14

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<210> 6

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 6

\hskip1cm

15

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<210> 7

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<222> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador E

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<400> 7

\hskip1cm

16

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<210> 8

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador F

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<400> 8

\hskip1cm

17

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<210> 9

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador G

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<400> 9

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18

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<210> 10

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador H

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<400> 10

\hskip1cm

19

Claims

1. Oligonucleótido,

o una sal del mismo.

2. Oligonucleótido,

o una sal del mismo.

3. Oligonucleótido,

o una sal del mismo.

4. Oligonucleótido,

o una sal del mismo.

5. Oligonucleótido o una sal del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por tener una longitud en bases de 18 a 25 bases.

6. Método para detectar polimorfismo génico, caracterizado por usar un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Método para determinar la secuencia nucleotídica de una secuencia genéticamente polimórfica, caracterizado por usar un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Método para detectar polimorfismo génico y comprende los siguientes pasos (a) y (b):

(a) un paso de llevar a cabo PCR con un ácido nucleico que comprende una secuencia genéticamente polimórfica como plantilla usando como cebadores un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés junto con dicho oligonucleótido en la PCR; y

(b) un paso de determinar la presencia o ausencia de polimorfismo génico en el ácido nucleico sobre la base de si puede o no puede ser generado un producto de reacción en el paso (a).

9. Método para determinar la secuencia nucleotídica de una secuencia genéticamente polimórfica y comprende los siguientes pasos (a) y (b):

(a) un paso de llevar a cabo PCR con un ácido nucleico que comprende una secuencia genéticamente polimórfica como plantilla usando como cebadores un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un oligonucleótido capaz de amplificar la secuencia de interés junto con dicho oligonucleótido en la PCR; y

10. Método según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado por usar para la detección de la presencia o ausencia de generación de un producto de reacción uno o varios métodos seleccionados del grupo que consta de electroforesis, PCR TaqMan y un método MALDI-TOF/MS.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque el polimorfismo génico es un polimorfismo de un solo nucleótido.

12. Kit para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(b) un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido que ha sido descrito anteriormente en (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

13. Kit para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(b) un cebador capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido descrito anteriormente en (a);

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

14. Kit para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (e):

(b) un oligonucleótido, donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), los otros nucleótidos son nucleótidos naturales, el nucleótido del extremo 3' del mismo es un nucleótido complementario del nucleótido mutante de un gen diana, y en las otras posiciones los nucleótidos son complementarios de la secuencia nucleotídica del gen diana;

(c) un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido que se ha descrito anteriormente en (a) o (b);

(d) ADN polimerasa; y

(e) un tampón de PCR.

15. Kit para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(a) un oligonucleótido,

o una sal del mismo;

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

16. Kit para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (d):

(a) un oligonucleótido,

(iv) donde el tercer nucleótido desde el extremo 3' del mismo (cuando el nucleótido en el extremo 3' está definido como el primer nucleótido) es una unidad 2'-O,4'-C-etileno nucleótido (ENA), y los otros nucleótidos son nucleótidos naturales;

o una sal del mismo;

(c) ADN polimerasa; y

(d) un tampón de PCR.

17. Kit para detectar polimorfismo génico y comprende lo siguiente de (a) a (e):

(a) un oligonucleótido que tiene las siguientes características (i) a (iv)

o una sal del mismo;

(b) un oligonucleótido,

o una sal del mismo;

(c) un oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés, junto con el oligonucleótido que ha sido descrito anteriormente en (a) o (b);

(d) ADN polimerasa; y

(e) un tampón de PCR.

18. Kit para detectar polimorfismo génico según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque el oligonucleótido y el oligonucleótido capaz de amplificar una secuencia de interés junto con dicho oligonucleótido tienen cada uno una longitud en bases de 18 a 25 bases.

19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, caracterizado porque el polimorfismo génico es un polimorfismo de un solo nucleótido.