ES2313292T3 - Dihidrotetrabenazinas y composiciones farmaceuticas que las contienen . - Google Patents

Abstract

Dihidrotetrabenazinas y composiciones farmacéuticas que las contienen. Se refiere a nuevos isómeros de dihidrotetrabenazina, a las composiciones farmacéuticas que los contienen, a los procesos para su obtención y a sus usos terapéuticos.

Description

Dihidrotetrabenazinas y composiciones farmacéuticas que las contienen.

Esta invención se refiere a nuevos isómeros de dihidrotetrabenazina, a las composiciones farmacéuticas que los contienen, a los procesos para su obtención y a sus usos terapéuticos.

Antecedentes de la invención

La tetrabenazina (nombre químico: 1,3,4,6,7,11b-hexahidro-9,10-dimetoxi-3-(2-metilpropil)-2H-benzo(a)quinolizin-2-ona) se ha estado utilizando como medicamento farmacéutico desde finales de los 50'. Inicialmente utilizada como antipsicótico, actualmente la tetrabenazina se emplea para tratar trastornos de movimiento hipercinéticos tales como la enfermedad de Huntington, el hemibalismo, la corea senil, tics, disquinesia tardía y el síndrome de Tourette, véase por ejemplo Jankovic y col., Am. J. Psychiatry. (1999) Agosto; 156(8):1279-81 y Jankovic y col., Neurology (1997) Feb., 48(2):358-62.

La acción farmacológica principal de la tetrabenazina es reducir el suministro de monoaminas (por ejemplo dopamina, serotonina y norepinefrina) en sistema nervioso central mediante la inhibición de la isoforma 2 del transportador vesicular humano de monoaminas (hVMAT2). El medicamento bloquea también los receptores postsinápticos de la dopamina.

La tetrabenazina es un medicamento eficaz y seguro para el tratamiento de diversos trastornos hipercinéticos del movimiento y, contrariamente a los neurolépticos habituales, no se ha demostrado que cause disquinesia tardía. Sin embargo, la tetrabenazina presenta diversos efectos secundarios relacionados con la dosificación, incluyendo depresión, parkinsonismo, somnolencia, nerviosismo o ansiedad, insomnio y, en algunos caso raros, síndrome neuroléptico maligno.

Los efectos centrales de la tetrabenazina son similares a los de la reserpina, pero difieren de éstos en que no poseen actividad sobre el transportador VMAT1. La falta de actividad sobre el transportador VMAT1 significa que la tetrabenazina tiene menos actividad periférica que la reserpina y, consecuentemente, no produce efectos secundarios relacionados con el VMAT1, tales como hipotensión.

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La estructura química de la tetrabenazina es la mostrada en la Figura 1 siguiente.

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1

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El compuesto tiene centros quirales en los átomos de carbono 3 y 11b y, por tanto, teóricamente puede presentarse en un total de cuatro formas isoméricas, tal como se muestra en la Figura 2.

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En la Figura 2, se define la estereoquímica de cada isómero utilizando la nomenclatura "R y S" desarrollada por Cahn, Ingold and Prelog, véase Advanced Organic Chemistry, de Jerry March, 4ª Edición, John Wiley & Sons, New York, 1992, páginas 109-114. En la Figura 2 y en otros lugares de esta solicitud de patente, las designaciones "R" o "S" se dan en el orden de los indicativos de posición de los átomos de carbono. Así, por ejemplo, RS es una notación abreviada de 3R,11bS. De forma similar, cuando están presentes tres centros quirales, como en las dihidrotetrabenazinas descritas a continuación, las designaciones "R" o "S" se relacionan en el orden de los átomos de carbono 2, 3 y 11b. Así, el isómero 2S,3R,11bR se menciona en una forma abreviada SRR y así sucesivamente.

La tetrabenazina comercial es una mezcla racémica de los isómeros RR y SS y parece que los isómeros RR y SS (en lo que sigue denominados individual o colectivamente como trans-tetrabenazina debido a que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 11b tienen una orientación relativa trans) son los isómeros termodinámicamente más estables.

La tetrabenazina tiene una biodisponibilidad algo escasa y variable. Es ampliamente metabolizada por el metabolismo de primer paso y normalmente se detecta en la orina poca tetrabenazina o tetrabenazina no invariable. El principal metabolito es la dihidrotetrabenazina (nombre químico: 2-hidroxi-3-(2-metilpropil)-1,3,4,6,7,11b-hexahidro-9,10-dimetoxibenzo(a)quinolizina), que se forma por reducción del grupo 2-ceto de la tetrabenazina y que se piensa es el principal responsable de la actividad del medicamento (véase Mehvar y col., Drug Metab. Disp., 15, 250-255 (1987) y J. Pharm. Sci., 76, No. 6, 461-465 (1987)).

Anteriormente se han identificado y caracterizado cuatro isómeros de la dihidrotetrabenazina, todos ellos procedentes de los isómeros más estables RR y SS de la tetrabenazina de origen y que tienen una orientación relativa trans entre los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 11b (véase Kilbourn y col., Chirality, 9:59-62 (1997) y Brossi y col., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp. 1793-1806 (1958)). Los cuatro isómeros son (+)-\alpha-dihidrotetrabenazina, (-)-\alpha-dihidrotetrabenazina, (+)-\beta-dihidrotetrabenazina y (-)-\beta-dihidrotetrabenazina. Se considera que las estructuras de los cuatro isómeros de la dihidrotetrabenazina conocidos son los mostrados en la Figura 3.

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Kilbourn y col., (véase Eur. J. Pharmacol., 278:249-252 (1995) y Med. Chem. Res., 5:113-126 (1994) investigaron la unión específica de los isómeros individuales radiomarcados de la dihidrotetrabenazina en el cerebro de ratas conscientes. Descubrieron que el isómero (+)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina (2R,3R,11bR) acumulado en las regiones del cerebro estaba asociado a concentraciones más altas del transportador de la dopamina (DAT) en la membrana neuronal y del transportador vesicular de monoaminas (VMAT2). Sin embargo, el isómero esencialmente inactivo (-)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina se distribuía casi uniformemente en el cerebro, sugiriendo que no tenía lugar la unión específica a DAT y VMAT2. Los estudios in vivo correlacionados con estudios in vitro demostraron que el isómero (+)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina tiene una K_{i} para [^{3}H]metoxitetrabenazina > 2.000 veces más alta que la K_{i} para el isómero (-)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina.

La US 6.087.376 (Crooks y col.) revela la utilización de lobelina para el tratamiento de enfermedades del SNC. Se describe que la lobelina tiene la capacidad de inhibir la unión de [^{3}H]dihidrotetrabenazina al VMAT2.

Hasta la fecha, por lo que los solicitantes saben, los isómeros de dihidrotetrabenazina procedentes de los isómeros inestables RS y SR (denominados en adelante individual o colectivamente cis-tetrabenazina debido a que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 11b tienen una orientación relativa cis) de la tetrabenazina no han sido aislados ni caracterizados anteriormente, y las actividades biológicas de estos compuestos no se han publicado hasta la fecha.

Sumario de la invención

Se ha descubierto ahora que los isómeros de la dihidrotetrabenazina procedentes de los isómeros inestables RS y SR (isómeros "cis") de la tetrabenazina no sólo son estables, sino que, inesperadamente, tienen buenas propiedades biológicas. En particular, algunos de los isómeros tienen perfiles de actividad receptora, lo que sugiere que existen múltiples ventajas con respecto a los RR/SS de tetrabenazina actualmente utilizados. Por ejemplo, varios isómeros, aunque tienen gran afinidad por VMAT2, muestran una unión muy reducida o insignificante a los receptores de la dopamina, lo que indica que es poco probable que produzcan los efectos secundarios dopaminérgicos encontrados con la tetrabenazina. Ninguno de los isómeros mostró inhibición del transportador de la dopamina (DAT). Además, estudios con ratas de varios isómeros han demostrado que carecen de los efectos secundarios sedantes no deseados asociados a la tetrabenazina. La falta de actividad sedante puede deberse a las muy bajas afinidades de algunos de los isómeros por los receptores adrenérgicos. Además, mientras que uno de los efectos secundarios de la tetrabenazina es la depresión, varios isómeros de la dihidrotetrabenazina muestran afinidad por la proteína transportadora de la serotonina (SERT), lo que indica que pueden tener actividad antidepresiva.

En consecuencia, en un primer aspecto, la invención proporciona 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende 3,11b-cis-dihidrotetra-
benazina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina en su forma sustancialmente pura, por ejemplo con una pureza isomérica superior al 90%, normalmente superior al 95% y en especial superior al 98%.

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El término "pureza isomérica" en el presente contexto se refiere a la cantidad de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina presente con respecto a la cantidad total o a la concentración de dihidrotetrabenazina en todas las formas isoméricas. Por ejemplo, si el 90% de dihidrotetrabenazina total presente en la composición es 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina, entonces la pureza isomérica es del 90%.

La invención proporciona además una composición que comprende 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina sustancialmente libre de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina, preferentemente conteniendo menos del 5% de 3,11b-trans-dihidrotetra-
benazina, en especial menos del 3% de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina y en particular menos del 1% de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina.

En otro aspecto, la invención proporciona 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina para su utilización en medicina o terapia, por ejemplo en el tratamiento de trastornos de movimiento hipercinético tales como la enfermedad de Huntington, hemibalismo, la corea senil, tic, disquinesia tardía y el síndrome de Tourette, o en el tratamiento de la depresión.

En otro aspecto, la invención proporciona la utilización de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos del movimiento hipercinético tales como la enfermedad de Huntington, hemibalismo, la corea senil, tic, disquinesia tardía y el síndrome de Tourette, o para el tratamiento de la depresión.

El término "3,11b-cis-", tal como se emplea aquí, significa que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3- y 11b- de la estructura de la dihidrotetrabenazina están en la orientación relativa cis. Por tanto, los isómeros de la invención son los compuestos de fórmula (I) y sus antipódas (imágenes especulares).

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Existen cuatro posibles isómeros de la dihidrotetrabenazina con la configuración 3,11b-cis y éstos son el isómero 2S,3S,11bR, el isómero 2R,3R,11bS, el isómero 2R,3S,11bR y el isómero 2S,3R,11bS. Se han aislado y caracterizado los cuatro isómeros y, en otro aspecto, la invención proporciona isómeros individuales de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina. En particular, la invención proporciona:

a)

el isómero 2S,3S,11bR de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (Ia):

5

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b)

el isómero 2R,3R,11bS de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (Ib):

6

c)

el isómero 2R,3S,11bR de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (Ic):

7

y

d)

el isómero 2S,3R,11bS de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (Id):

8

Los nuevos isómeros individuales de la invención se pueden caracterizar por sus propiedades espectroscópicas, ópticas y cromatográficas.

Los isómeros preferentes son los isómeros dextrorrotatorios (+).

Sin implicar a ninguna estereoquímica o configuración absoluta particular, los cuatros nuevos isómeros se pueden caracterizar como sigue:

Isómero A

Actividad óptica, como se mide mediante ORD (metanol, 21ºC): levorrotatorio (-).

Espectro IR (KBr sólido), espectro ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) y espectro ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) básicamente tal como se describe en la Tabla 1.

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Isómero B

Actividad óptica, como se mide mediante ORD (metanol, 21ºC): dextrorrotatorio (+)

Espectro IR (KBr sólido), espectro ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) y espectro ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) básicamente tal como se describe en la Tabla 1.

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Isómero C

Actividad óptica, como se mide mediante ORD (metanol, 21ºC): dextrorrotatorio (+).

Espectro IR (KBr sólido), espectro ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) y espectro ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) básicamente tal como se describe en la Tabla 2.

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Isómero D

Actividad óptica, como se mide mediante ORD (metanol, 21ºC): levorrotatario (-) Espectro IR (KBr sólido), espectro ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) y espectro ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) básicamente tal como se describe en la Tabla 2.

Los valores de la ORD para cada isómero se dan en los ejemplos a continuación, pero ha de observarse que estos valores son a modo de ejemplo y pueden variar de acuerdo con el grado de pureza del isómero y la influencia de otras variables, como fluctuaciones de temperatura y los efectos de moléculas de disolvente residual.

Los enantiómeros A, B, C y D pueden presentarse, en cada caso, en una forma en esencia enantioméricamente pura o como una mezcla con otros enantiómeros de la invención.

Los términos "pureza enantiomérica" y "enantioméricamente puro" en el presente contexto se refieren a la cantidad de determinado enantiómero de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina presente con respecto a la cantidad total o a la concentración de dihidrotetrabenazina de todas las formas enantioméricas e isoméricas. Por ejemplo, si un 90% de dihidrotetrabenazina total presente en la composición se encuentra en forma de un enantiómero único, entonces la pureza enantiomérica es del 90%.

A modo de ejemplo, en cada aspecto y realización de la invención, cada enantiómero individual seleccionado a partir de entre los Isómeros A, B, C y D puede estar presente en una pureza enantiomérica de al menos el 55% (por ejemplo, al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5 ó 100%).

Los isómeros de la invención se pueden presentar también en forma de mezcla de uno o más de los Isómeros A, B, C y D. Estas mezclas pueden ser mezclas racémicas o mezclas no racémicas. Ejemplos de mezclas racémicas incluyen la mezcla racémica del Isómero A y del Isómero B y la mezcla racémica del Isómero C y del Isómero D.

Sales Farmacéuticamente Aceptables

Salvo que el contexto lo requiera de otro modo, una referencia en esta solicitud a la dihidrotetrabenazina y a sus isómeros incluye dentro de su alcance no sólo la base libre de la dihidrotetrabenazina sino también sus sales y en particular las sales de adición de ácidos.

Los ácidos particulares a partir de los cuales se forman las sales de adición de ácido incluyen aquellos ácidos que tienen un valor pKa inferior a 3,5 y, más en particular, inferior a 3. Por ejemplo, las sales de adición de ácido se pueden formar a partir de un ácido que tiene un pKa en el rango de +3,5 a -3,5.

Las sales de adición de ácido preferentes incluyen aquellas formadas con ácidos sulfónicos, tales como ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido canforsulfónico y ácido naftalensulfónico.

Un ácido particular a partir del cual se pueden formar sales de adición de ácido es el ácido metanosulfónico.

Las sales de adición de ácidos pueden prepararse mediante los métodos descritos aquí o siguiendo métodos químicos convencionales, tales como los métodos descritos en Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, Agosto de 2002. Generalmente, estas sales se pueden preparar por reacción de la forma de base libre del compuesto con la base o ácido apropiados, en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de ambos; generalmente, se utilizan medios no acuosos, como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo.

Las sales son típicamente sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, se pueden preparar también sales que no sean farmacéuticamente aceptables como formas intermedias, las cuales después se pueden convertir en sales farmacéuticamente aceptables. Estas formas de sales no farmacéuticamente aceptables forman parte también de la invención.

Métodos para la Preparación de Isómeros de la Dihidrotetrabenazina

En otro aspecto, se proporciona un proceso (Proceso A) para preparar una dihidrotetrabenazina de la invención, proceso que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (II):

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con uno o más reactivos adecuados para hidratar el doble enlace 2,3 en el compuesto de fórmula (II) y, a continuación, cuando se requiera, la separación y aislamiento de una forma deseada del isómero de la dihidrotetrabenazina.

La hidratación del doble enlace 2,3 se puede llevar a cabo por hidroboración utilizando un reactivo borano, tal como el diborano o un borano-éter (por ejemplo, borano-tetrahidrofurano (THF)) para producir un aducto intermedio de alquilborano, seguida de oxidación del aducto de alquilborano e hidrólisis en presencia de una base. La hidroboración se lleva a cabo típicamente en un disolvente polar aprótico seco, tal como un éter (por ejemplo THF), normalmente a una temperatura no elevada, por ejemplo a temperatura ambiente. El aducto borano-alqueno se oxida típicamente con un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno, en presencia de una base que proporciona una fuente de iones hidróxido, por ejemplo hidróxido de amonio o un hidróxido de metal alcalino, por ejemplo hidróxido de potasio o hidróxido de sodio. La secuencia hidroboración-oxidación-hidrólisis de las reacciones del Proceso A proporciona típicamente isómeros de dihidrotetrabenazina en los que los átomos de hidrógeno en las posiciones 2 y 3 tienen una orientación relativa trans.

Los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar por reducción de la tetrabenazina para producir una dihidrotetrabenazina, seguida de deshidratación de la dihidrotetrabenazina. La reducción de la tetrabenazina se puede realizar con un reactivo de hidruro de aluminio, tal como hidruro de aluminio-litio, o con un reactivo borohidruro tal como borohidruro de sodio, borohidruro de potasio o un derivado de borohidruro, por ejemplo un borohidruro de alquilo tal como borohidruro tri-sec-butilo-litio. Alternativamente, el paso de reducción se puede llevar a cabo mediante hidrogenación catalítica, por ejemplo sobre un catalizador de óxido de platino o níquel de Raney. Las condiciones adecuadas para realizar el paso de reducción se describen más detalladamente a continuación o se pueden encontrar en la US 2.843.591 (Hoffmann-La Roche) y Brossi y col., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp. 1793-1806 (1958).

Debido a que la tetrabenazina utilizada como materia prima para la reacción de reducción es típicamente una mezcla de los isómeros RR y SS (es decir, trans-tetrabenazina), la dihidrotetrabenazina formada en el paso de reducción tendrá la misma configuración trans en las posiciones 3- y 11b- y adoptará la forma de uno o más de los isómeros conocidos de la dihidrotetrabenazina mostrados en la Figura 3 anterior. Así, el Proceso A puede implicar tomar los isómeros conocidos de la dihidrotetrabenazina, deshidratarlos para formar el alqueno (II) y luego "rehidratar" el alqueno (II) utilizando condiciones que producen los nuevos isómeros de cis-dihidrotetrabenazina requeridos de la invención.

La deshidratación de la dihidrotetrabenazina en el alqueno (II) puede llevarse a cabo bajo diversas condiciones estándar de deshidratación de alcoholes para formar alquenos, véase por ejemplo J. March (idem) páginas 389-390 y las referencias aquí. Los ejemplos de estas condiciones incluyen la utilización de agentes deshidratantes basados en fósforo, tales como haluros de fósforo u oxihaluros de fósforo, por ejemplo POCl_{3} y PCl_{5}. Como alternativa para llevar a cabo la deshidratación, el grupo hidroxilo de la dihidrotetrabenazina se puede convertir en un grupo saliente L tal como un halógeno (por ejemplo cloro o bromo) y luego someterse a determinadas condiciones (por ejemplo presencia de una base) para eliminar H-L. La conversión del grupo hidroxilo en un haluro se puede lograr utilizando métodos bien conocidos por los químicos especializados, por ejemplo mediante la reacción con tetracloruro de carbono o tetrabromuro de carbono en presencia de una trialquil- o triarilfosfina, tal como trifenilfosfina o tributilfosfina.

La tetrabenazina utilizada como materia prima para la reducción en la obtención de la dihidrotetrabenazina se puede obtener comercialmente o se puede sintetizar mediante el método descrito en la US 2.830.993 (Hoffmann-La Roche).

La invención proporciona también un proceso (Proceso B) para preparar una dihidrotetrabenazina de la invención, proceso que comprende someter un compuesto de fórmula (III):

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a unas condiciones de apertura de anillo del grupo 2,3-epóxido en el compuesto de fórmula (III) y después, cuando se requiera, separación y aislamiento de la forma deseada de isómero de la dihidrotetrabenazina.

La apertura del anillo puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos conocidos de apertura de anillos epóxido. Sin embargo, un método actualmente preferente de apertura de anillo epóxido consiste en la apertura reductora del anillo, lo que se puede conseguir utilizando un agente reductor tal como borano-THF. La reacción con borano-THF se puede llevar a cabo en un disolvente polar aprótico, tal como un éter (por ejemplo tetrahidrofurano), normalmente a temperatura ambiente, el complejo de borano así formado se hidroliza posteriormente por calentamiento en presencia de agua y una base a temperatura de reflujo del disolvente. El Proceso B da lugar típicamente a los isómeros de dihidrotetrabenazina en los que los átomos de hidrógeno en las posiciones 2- y 3- tienen una orientación relativa cis.

Los compuestos epóxido de fórmula (III) se pueden preparar por epoxidación del alqueno de fórmula (II) anterior. La reacción de epoxidación se puede llevar a cabo utilizando condiciones y reactivos bien conocidos del químico especializado, véase por ejemplo J. March (idem), páginas 826-829 y las referencias aquí. Típicamente, un perácido como el ácido meta-cloroperbenzoico (MCPBA), o una mezcla de un perácido y otro agente oxidante tal como ácido perclórico, se puede utilizar para provocar la epoxidación.

Cuando las materias primas para los procesos A y B anteriores son mezclas de enantiómeros, entonces los productos de los procesos serán típicamente pares de enantiómeros, por ejemplo mezclas racémicas, posiblemente junto con impurezas diastereoisoméricas. Los diastereoisómeros no deseados se pueden eliminar mediante técnicas tales como cromatografía (por ejemplo HPLC) y los enantiómeros individuales se pueden separar por diversos métodos conocidos del químico especializado. Por ejemplo, se pueden separar por medio de:

i.

cromatografía quiral (cromatografía en un soporte quiral); o

ii.

formación de una sal con un ácido quiral ópticamente puro, separación de las sales de los dos diastereoisómeros por cristalización fraccionada y posterior liberación de la dihidrotetrabenazina de la sal; o

iii.

formación de un derivado (tal como un éster) con un agente derivatizante quiral ópticamente puro (por ejemplo un agente esterificante), separación de los epímeros resultantes (por ejemplo por cromatografía) y posterior conversión del derivado en dihidrotetrabenazina.

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Un método para separar pares de enantiómeros obtenidos de cada uno de los Procesos A y B y cuya eficacia particular ha sido descubierta consiste en esterificar el grupo hidroxilo de la dihidrotetrabenazina con una forma ópticamente activa del ácido de Mosher, tal como el isómero R (+) mostrado a continuación, o una forma activa del mismo:

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Los ésteres resultantes de los dos enantiómeros de la dihidrobenazina entonces se pueden separar mediante cromatografía (por ejemplo HPLC) y los ésteres separados se pueden hidrolizar para producir los isómeros individuales de dihidrobenazina utilizando una base, tal como un hidróxido de metal alcalino (por ejemplo NaOH), en un disolvente polar como metanol.

Como alternativa a la utilización de mezclas de enantiómeros como materias primas en los procesos A y B y luego realización posterior de la separación de los enantiómeros, los procesos A y B se pueden llevar a cabo cada uno sobre materias primas de un único enantiómero, lo que conduce a productos en los que predomina un enantiómero único. Los enantiómeros únicos del alqueno (II) se pueden preparar sometiendo RR/SS-tetrabenazina a una reducción estereoselectiva utilizando borohidruro tri-sec-butilo-litio para producir una mezcla de enantiómeros SRR y RSS de dihidrotetrabenazina, separando los enantiómeros (por ejemplo por cristalización fraccionada) y luego deshidratando un enantiómero único separado de la dihidrotetrabenazina para producir predominante o exclusivamente un enantiómero único del compuesto de fórmula (II).

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Los Procesos A y B se ilustran más detalladamente a continuación en los Esquemas 1 y 2 respectivamente.

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Esquema 1

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El Esquema 1 ilustra la preparación de isómeros individuales de dihidrotetrabenazina con las configuraciones 2S,3S,11bR y 2R,3R,11bS, donde los átomos de hidrógeno unidos en las posiciones 2- y 3- están dispuestos en una orientación relativa trans. Este esquema de reacción incluye el Proceso A definido anteriormente.

El punto de partida para la secuencia de las reacciones del Esquema 1 es la tetrabenazina comercial (IV), que es una mezcla racémica de los isómeros ópticos RR y SS de tetrabenazina. En cada uno de los isómeros RR y SS, los átomos de hidrógeno en las posiciones 3- y 11b- están dispuestos en una orientación relativa trans. Como alternativa a la utilización del compuesto comercial, la tetrabenazina se puede sintetizar de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente de Estados Unidos nº 2.830.993 (véase en particular el ejemplo 11).

La mezcla racémica de tetrabenazina RR y SS se reduce utilizando el agente reductor de borohidruro borohidruro de tri-sec-butilo-litio ("L-Selectride") para producir una mezcla de los isómeros conocidos 2S,3R,11bR y 2R,3S,11bS (V) de la dihidrotetrabenazina, de los cuales sólo se muestra para más sencillez el isómero 2S,3R,11bR. Al utilizar el L-Selectride, más estéricamente exigente como agente reductor de borohidruro, en lugar de borohidruro de sodio, se minimiza o suprime la formación de los isómeros RRR y SSS de la dihidrotetrabenazina.

Los isómeros de dihidrotetrabenazina (V) se someten a reacción con un agente deshidratante tal como pentacloruro de fósforo, en un disolvente aprótico tal como un hidrocarburo clorado (por ejemplo cloroformo o diclorometano, preferentemente diclorometano) para formar el compuesto insaturado (II) como un par de enantiómeros, de los que sólo se muestra el enantiómero R en el Esquema. La reacción de deshidratación se lleva a cabo típicamente a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, por ejemplo alrededor de 0-5ºC.

El compuesto insaturado (II) se somete luego a una rehidratación estereoselectiva para generar la dihidrotetrabenazina (VI) y su imagen especular o antípoda (no mostrada), donde los átomos de hidrógeno en las posiciones 3- y 11b- están dispuestos en una orientación relativa cis y los átomos de hidrógeno en las posiciones 2- y 3- están dispuestos en una orientación relativa trans. La rehidratación estereoselectiva se lleva a cabo mediante un procedimiento de hidroboración utilizando borano-THF en tetrahidrofurano (THF) para formar un complejo intermedio de borano (no mostrado), el cual se oxida luego con peróxido de hidrógeno en presencia de una base tal como hidróxido
de sodio.

Se puede llevar a cabo entonces un paso inicial de purificación (por ejemplo por HPLC) para producir el producto (V) de la secuencia de reacciones de rehidratación como mezcla de los isómeros 2S,3S,11bR y 2R,3R,11bS, de los que se muestra sólo el isómero 2S,3S,11bR en el Esquema. Con el fin de separar los isómeros, se trata la mezcla con el ácido de Mosher R (+) en presencia de cloruro de oxalilo y dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano, para producir un par de ésteres diastereoisoméricos (VII) (de los que se muestra solamente un diastereoisómero), los cuales se pueden separar después mediante HPLC. Los ésteres individuales se pueden hidrolizar luego utilizando un hidróxido de metal alcalino tal como hidróxido de sodio para producir un único isómero (VI).

En una variación de la secuencia de pasos mostrada en el Esquema 1, después de la reducción de la RR/SS-tetrabenazina, la mezcla de enantiómeros de la dihidrotetrabenazina (V) se puede separar para producir enantiómeros individuales. La separación se puede llevar a cabo mediante la formación de una sal con un ácido quiral, tal como ácido (+) ó (-)-canforsulfónico, separación de los diastereoisómeros resultantes por cristalización fraccionada para producir una sal de un enantiómero único y luego liberación de la base libre de la sal.

El enantiómero separado de la dihidrotetrabenazina se puede deshidratar para producir un único enantiómero del alqueno (II). La rehidratación posterior del alqueno (II) producirá entonces, predominante o exclusivamente, un único enantiómero de la cis-dihidrotetrabenazina (VI). Una ventaja de esta variación es que no implica la formación de ésteres del ácido de Mosher y, por tanto, evita la separación cromatográfica típicamente utilizada para separar los ésteres del ácido de Mosher.

El Esquema 2 ilustra la preparación de isómeros individuales de dihidrotetrabenazina con las configuraciones de 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS, donde los átomos de hidrógeno unidos a las posiciones 2- y 3- están dispuestos en una orientación relativa cis. Este esquema de reacción incluye el Proceso B definido anteriormente.

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Esquema 2

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En el Esquema 2, el compuesto insaturado (II) se obtiene por reducción de la tetrabenazina, para dar los isómeros 2S,3R,11bR y 2R,3S,11bS (V) de dihidrotetrabenazina y la deshidratación con PCl_{5} de la forma descrita anteriormente en el Esquema 1. Sin embargo, en lugar de someter el compuesto (II) a hidroboración, el doble enlace 2,3 se convierte en un epóxido mediante reacción con ácido meta-cloroperbenzoico (MCPBA) y ácido perclórico. La reacción de epoxidación se lleva a cabo convenientemente en un disolvente alcohólico, como metanol, típicamente alrededor de la temperatura ambiente.

El epóxido (VII) se somete luego a apertura reductora de anillo utilizando borano-THF como agente reductor electrófilo, para producir un complejo intermedio de borano (no mostrado), que después se oxida y segmenta con peróxido de hidrógeno en presencia de un álcali tal como hidróxido de sodio, para producir una dihidrotetrabenazina (VIII) como mezcla de los isómeros 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS, de los que se muestra solamente para más sencillez el 2R,3S,11bR. El tratamiento de la mezcla de isómeros (VIII) con el ácido R (+) de Mosher en presencia de cloruro de oxalilo y dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano produce un par de ésteres epiméricos (IX) (de los que se muestra solamente uno), que se pueden separar entonces por cromatografía e hidrolizarse con hidróxido de sodio en metanol de la forma descrita anteriormente con relación al Esquema 1.

Se piensa que los intermedios químicos (II) y (III) son nuevos y representan otro aspecto de la invención.

Propiedades Biológicas y Usos Terapéuticos

La tetrabenazina ejerce sus efectos terapéuticos mediante la inhibición del transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) en el cerebro y mediante la inhibición presináptica y postsináptica de los receptores de la dopamina.

Los nuevos isómeros de dihidrotetrabenazina de la invención son también inhibidores de VMAT2, los Isómeros C y B produciendo el mayor grado de inhibición. Como la tetrabenazina, los compuestos de la invención tienen solamente poca afinidad por VMAT1, la isoforma de VMAT encontrada en los tejidos periféricos y algunas células endocrinas, lo cual indica que no deberían producir los efectos secundarios asociados a la reserpina. Los compuestos C y B tampoco muestran actividad inhibidora alguna sobre la catecol-O-metil-transferasa (COMT), las isoformas A y B de la monoamina-oxidasa y las isoformas 1d y 1b de la 5-hidroxitriptamina.

Sorprendentemente, los isómeros C y B muestran también una separación notable de la VAMT2 y de la actividad de los receptores de la dopamina, en lo que, aunque sean muy activos en la unión a VMAT2, ambos compuestos muestran solamente una actividad de unión débil o no-existente a los receptores de la dopamina y carecen de actividad de unión al Transportador de Dopamina (DAT). De hecho, ninguno de los isómeros muestra una actividad significativa de unión a DAT. Esto sugiere que los compuestos pueden carecer de los efectos dopaminérgicos secundarios producidos por la tetrabenazina. Los isómeros C y B son también débilmente activos o inactivos como inhibidores de los receptores adrenérgicos y esto sugiere que los compuestos pueden carecer de los efectos adrenérgicos secundarios frecuentemente encontrados con la tetrabenazina. De hecho, en los estudios del aparato locomotor llevados a cabo en ratas, la tetrabenazina mostraba un efecto sedante asociado a la dosis, mientras que no se observaban efectos sedantes después de la administración de los isómeros B y C de la dihidrotetrabenazina de la invención.

Además, tanto el Isómero C como el Isómero B son potentes inhibidores de la proteína transportadora de la serotonina SERT. La inhibición de SERT es un mecanismo mediante el cual los antidepresivos como la fluoxetina (Prozac®) ejercen sus efectos terapéuticos. Por tanto, la capacidad de los Isómeros C y B para inhibir la SERT indica que estos isómeros pueden actuar como antidepresivos, en contraste notable con la tetrabenazina, para la cual la depresión es un efecto secundario bien reconocido.

En base a los estudios llevados a cabo hasta la fecha, se contempla que los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención sean útiles en la profilaxis o el tratamiento de estados y condiciones de enfermedad para los cuales la tetrabenazina se utiliza o propone actualmente. Así, a modo de ejemplo y sin limitación, los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención se pueden utilizar para el tratamiento de trastornos hipercinéticos del movimiento tales como la enfermedad de Huntington, hemibalismo, la corea senil, trastornos con tics, disquinesia tardía, distonía y el síndrome de Tourette.

Se contempla también que los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención puedan servir para el tratamiento de la depresión.

En general, los compuestos se administrarán a un sujeto que lo necesite, por ejemplo un paciente humano o animal, preferentemente un ser humano.

Los compuestos se administran típicamente en cantidades que son terapéutica o profilácticamente útiles y que generalmente no son tóxicas. Sin embargo, en ciertas situaciones, las ventajas de administrar un compuesto de dihidrotetrabenazina de la invención pueden pesar más que los inconvenientes de cualquier efecto tóxico o secundario, en cuyo caso se puede considerar deseable administrar compuestos en cantidades que estén asociadas a cierto grado de toxicidad.

Una dosis diaria típica del compuesto puede oscilar en el rango de 0,025 miligramos a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal, por ejemplo hasta 3 miligramos por kilogramo de peso corporal y más típicamente de 0,15 miligramos a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal, aunque se pueden administrar dosis más altas o más bajas cuando sea necesario.

A modo de ejemplo, puede administrarse una dosis de partida inicial de 12,5 mg 2 a 3 veces al día. La dosificación puede aumentarse a partir de 12,5 mg al día cada 3 a 5 días, hasta que se alcance la máxima dosis tolerada y eficaz para el individuo tal como lo determinará el médico. En última instancia, la cantidad de compuesto administrado será acorde con la naturaleza de la enfermedad o con la condición fisiológica que se esté tratando y con las ventajas terapéuticas y presencia o ausencia de efectos secundarios producidos por un determinado régimen de dosificación, y serán a discreción del médico.

Formulaciones farmacéuticas

La invención proporciona también compuestos de dihidrotetrabenazina tal como se ha definido aquí anteriormente en forma de composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en cualquier forma adecuada para administración oral, parenteral, tópica, intranasal, intrabronquial, oftálmica, ótica, rectal, intravaginal o transdérmica. Cuando las composiciones se dirigen a la administración parenteral, se pueden formular para su administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o para suministro directo en un órgano objetivo o tejido por inyección, infusión u otro medio de suministro.

Las formas farmacéuticas de dosificación adecuadas para la administración oral incluyen tabletas, cápsulas, comprimidos, píldoras, pastillas, jarabes, soluciones, pulverizaciones, polvos, gránulos, elixires y suspensiones, tabletas sublinguales, sprays, obleas o parches y parches bucales.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas, véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA.

Así, las composiciones en tabletas pueden contener una dosis unitaria del compuesto activo junto con un diluyente inerte o vehículo, tal como un azúcar o un alcohol azúcar, por ejemplo lactosa, sacarosa, sorbitol o manitol; y/o un diluyente que no proceda de azúcar, como carbonato de sodio, fosfato de sodio, talco, carbonato de calcio o una celulosa o un derivado de la misma, tal como metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, y almidones como almidón de maíz. Las tabletas pueden contener también ingredientes estándar tales como agentes aglutinantes y de granulación como polivinilpirrolidona, desintegrantes (por ejemplo polímeros reticulados hinchables como carboximetilcelulosa reticulada), agentes lubricantes (por ejemplo estearatos), conservantes (por ejemplo parabenos), antioxidantes (por ejemplo BHT), agentes tampón (por ejemplo tampones fosfato o citrato) y agentes efervescentes, como mezclas citrato/bicarbonato. Estos excipientes son bien conocidos y no hace falta hablar de ellos detalladamente aquí.

Las formulaciones en cápsulas pueden ser de la variedad de gelatina dura o gelatina blanda y pueden contener el componente activo en forma sólida, semisólida o líquida. Las cápsulas de gelatina se pueden formar a partir de gelatina animal o de equivalentes sintéticos o derivados vegetales de la misma.

Las formas sólidas de dosificación (por ejemplo, tabletas, cápsulas, etc.) se pueden o no revestir, pero tienen típicamente un revestimiento, por ejemplo un revestimiento de película protector (por ejemplo una cera o barniz) o un revestimiento que controla la liberación. Se puede diseñar el revestimiento (por ejemplo un polímero del tipo Eudragit^{TM}) para liberar el componente activo en un lugar deseado dentro del tracto gastrointestinal. Así, el revestimiento se puede seleccionar para que se degrade en ciertas condiciones de pH dentro del tracto gastrointestinal, liberando así selectivamente el compuesto en el estómago o en el íleon o duodeno.

En lugar de, o además de, un revestimiento, el medicamento puede presentarse en una matriz sólida que comprende un agente controlador de la liberación, por ejemplo un agente retardante de la liberación, que se puede adaptar para liberar selectivamente el compuesto en condiciones de acidez o alcalinidad variables en el tracto gastrointestinal. Alternativamente, el material de la matriz o el revestimiento retardante de la liberación puede tomar la forma de un polímero erosionable (por ejemplo un polímero de anhídrido maleico) que sustancialmente se erosiona continuamente a medida que la forma de dosificación pasa por el tracto gastrointestinal.

Las composiciones para uso tópico incluyen ungüentos, cremas, sprays, parches, geles, gotas líquidas e injertos (por ejemplo injertos intraoculares). Estas composiciones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos.

Las composiciones para la administración parenteral se presentan típicamente como soluciones aceitosas o acuosas estériles o como suspensiones finas, o se pueden proporcionar en forma de polvo estéril finamente dividido para su formación in situ con agua estéril para inyección.

Los ejemplos de formulaciones para la administración rectal o intravaginal incluyen pesarios y supositorios, que se pueden formar, por ejemplo, a partir de un material ceroso o moldeable preformado que contiene el compuesto
activo.

Las composiciones para la administración por inhalación pueden tener forma de composiciones en polvo inhalables o sprays líquidos o de polvo, y se pueden administrar de forma estándar utilizando dispositivos inhaladores de polvo o dispositivos dispensadores de aerosol. Estos dispositivos son bien conocidos. Para la administración por inhalación, las formulaciones en polvo comprenden típicamente el compuesto activo junto con un diluyente inerte sólido en polvo tal como lactosa.

Los compuestos de la invención se presentarán generalmente en forma de dosificación unitaria y, como tales, contendrán típicamente suficiente compuesto para proporcionar un nivel deseado de actividad biológica. Por ejemplo, una formulación prevista para administración oral puede contener de 2 miligramos a 200 miligramos de ingrediente activo, más habitualmente de 10 miligramos a 100 miligramos, por ejemplo, 12,5 miligramos, 25 miligramos y 50 miligramos.

El compuesto activo se administrará a un paciente que lo necesite (por ejemplo un paciente humano o animal) en una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la síntesis y las propiedades de los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de los Isómeros 2S,3S,11bR y 2R,3R,11bS de dihidrotetrabenazina 1A. Reducción de RR/SS-tetrabenazina

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Se añadió lentamente L-Selectride® 1M en tetrahidrofurano (135 ml, 135 mmol, 2,87 eq) durante 30 minutos a una solución agitada del racemato RR/SS-tetrabenazina (15 g, 47 mmol) en etanol (75 ml) y tetrahidrofurano (75 ml) a 0ºC. Cuando finalizó la adición, se agitó la mezcla a 0ºC durante 30 minutos y luego se dejó calentar a temperatura ambiente.

Se vertió la mezcla sobre hielo picado (300 g) y se añadió agua (100 ml). Se extrajo la solución con dietil éter (2 x 200 ml) y los extractos etéreos combinados se lavaron con agua (100 ml) y se secaron parcialmente sobre carbonato de potasio anhidro. Se terminó el secado utilizando sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida (protegido contra la luz, temperatura del baño <20ºC) para proporcionar un sólido amarillo pálido.

El sólido se redujo a pasta con éter de petróleo (30-40ºC) y se filtró para proporcionar un sólido pulverulento blanco (12 g, 80%).

1B. Deshidratación de la tetrabenazina reducida

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Se añadió poco a poco pentacloruro de fósforo (32,8 g, 157,5 mmol, 2,5 eq.) durante 30 minutos a una solución agitada del producto de tetrabenazina reducida procedente el Ejemplo 1A (20 g, 62,7 mmol) en diclorometano (200 ml) a 0ºC. Cuando finalizó la adición, la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 30 minutos más y se vertió lentamente la solución en una disolución acuosa de carbonato de sodio 2M que contenía hielo picado (0ºC). Una vez cesó la evolución inicial de gas ácido, se basificó la mezcla (aprox. pH 12) utilizando carbonato de sodio sólido.

La solución alcalina se extrajo utilizando acetato de etilo (800 ml) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar un aceite marrón, que se purificó por cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) para proporcionar el alqueno semipuro en forma de un sólido amarillo (10,87 g, 58%).

1C. Hidratación del alqueno bruto procedente del Ejemplo 1B

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Una solución del alqueno bruto (10,87 g, 36,11 mmol) procedente del Ejemplo 1B en THF seco (52 ml) a temperatura ambiente se trató con borano-THF 1M (155,6 ml, 155,6 mmol, 4,30 eq) añadido gota a gota. Se agitó la reacción durante 2 horas, se añadió agua (20 ml) y se basificó la solución a pH 12 con una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 30%.

Se añadió una solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% (30 ml) a la mezcla de reacción alcalina agitada y se calentó la solución a reflujo durante 1 hora antes de dejar que se enfriase. Se añadió agua (100 ml) y se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 250 ml). Los extractos orgánicos se combinaron y secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar un aceite amarillo (9 g).

Se purificó el aceite utilizando HPLC preparativa (Columna: Lichrospher Si60, 5 \mum, 250 x 21,20 mm, fase móvil: hexano:etanol:diclorometano (85:15:5); UV 254 nm, caudal: 10 ml\cdotmin^{-1}) a 350 mg por inyección seguida de concentración de las fracciones de interés al vacío. El aceite del producto se disolvió luego en éter y se concentró una vez más al vacío para producir el racemato de dihidrotetrabenazina indicado anteriormente en forma de una espuma amarilla (5,76 g, 50%).

1D. Preparación de derivados de éster de Mosher

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Se añadió ácido R-(+)-\alpha-metoxi-\alpha-trifluorometilfenilacético (5 g, 21,35 mmol), cloruro de oxalilo (2,02 ml) y DMF (0,16 ml) a diclorometano anhidro (50 ml) y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 45 minutos. La solución se concentró bajo presión reducida y el residuo se recogió una vez más en diclorometano anhidro (50 ml). La solución resultante se enfrió utilizando un baño de agua helada y se añadió dimetilaminopiridina (3,83 g, 31,34 mmol), seguido de una solución presecada (en tamices de 4\ring{A}) en diclorometano anhidro del producto sólido del Ejemplo 1C (5 g, 15,6 mmol). Después de su agitación a temperatura ambiente durante 45 minutos, se añadió agua (234 ml) y la mezcla se extrajo con éter (2 x 200 ml). El extracto de éter se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se pasó por un bloque de sílice y el producto se eluyó utilizando éter.

El eluato de éter recogido se concentró a presión reducida para proporcionar un aceite que se purificó utilizando una cromatografía en columna (sílice, hexano:éter (10:1)). La evaporación de las fracciones de columna de interés recogidas y la eliminación del disolvente a presión reducida produjeron un sólido, que se purificó luego mediante una cromatografía en columna (sílice, hexano:acetato de etilo (1:1)) para producir tres componentes principales, que se resolvieron parcialmente en los picos 1 y 2 de éster de Mosher.

La HPLC preparativa de los tres componentes (Columna: 2 x Lichrospher Si60, 5 \mum, 250 x 21,20 mm, fase móvil: hexano:isopropanol (97:3), UV 254 nm; caudal: 10 ml\cdotmin^{-1}) a una carga de 300 mg seguido de la concentración de las fracciones de interés al vacío produjeron los derivados puros de éster de Mosher.

Pico 1 (3,89 g, 46,5%)

Pico 2 (2,78 g, 33%).

Las fracciones correspondientes a los dos picos se sometieron a hidrólisis para liberar los isómeros individuales de dihidrotetrabenazina identificados y caracterizados como Isómeros A y B. Se piensa que los Isómeros A y B tienen cada uno una de las siguientes estructuras:

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1E. Hidrólisis del Pico 1 para producir el Isómero A

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (87,5 ml) a una solución del pico 1 de éster de Mosher (3,89 g, 7,27 mmol) en metanol (260 ml) y la mezcla se agitó y calentó a reflujo durante 150 minutos. Después de su enfriamiento a temperatura ambiente, se añadió agua (200 ml) y la solución se extrajo con éter (600 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de filtración, se concentró a presión reducida.

Se disolvió el residuo utilizando acetato de etilo (200 ml), se lavó la solución con agua (2 x 50 ml), se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se concentró a presión reducida para producir una espuma amarilla. Este material se purificó por cromatografía en columna (sílice, gradiente de elución acetato de etilo:hexano (1:1) a acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo se recogió en éter y el disolvente se eliminó a presión reducida una vez más para producir el Isómero A en forma de una espuma blanquecina (1,1 g, 47%).

El Isómero A, del que se piensa tiene la configuración 2S,3S,11bR o 2R,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó mediante ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS para el isómero A figuran en la Tabla 1 y los datos de la HPLC Quiral y ORD figuran en la Tabla 3.

1F. Hidrólisis del Pico 2 para producir el Isómero B

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (62,5 ml) a una solución del pico 2 de éster de Mosher (2,78 g, 5,19 mmol) en metanol (185 ml) y la mezcla se agitó y se calentó a reflujo durante 150 minutos. Después de su enfriamiento a temperatura ambiente, se añadió agua (142 ml) y la solución se extrajo con éter (440 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se concentró a presión reducida.

El residuo se disolvió utilizando acetato de etilo (200 ml), la solución se lavó con agua (2 x 50 ml), la fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración, se concentró a presión reducida. Se añadió al residuo éter de petróleo (30-40ºC) y la solución se concentró al vacío una vez más para producir el Isómero B en forma de una espuma blanca (1,34 g, 81%).

El Isómero B, del que se piensa tiene la configuración 2S,3S,11bR o 2R,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó por ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS para el Isómero B figuran en la Tabla 1 y los datos de la HPLC quiral y ORD figuran en la Tabla 3.

Ejemplo 2 Preparación de los Isómeros 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS de la dihidrotetrabenazina 2A. Preparación de 2,3-dihidrotetrabenazina

Una solución que contenía una mezcla racémica (15 g, 47 mmol) de los enantiómeros RR y SS-tetrabenazina en tetrahidrofurano se sometió a reducción con L-Selectride® mediante el método del Ejemplo 1A para producir una mezcla de los enantiómeros 2S,3R,11bR y 2R,3S,11bS de dihidrotetrabenazina en forma de un sólido arenoso blanco (12 g, 80%). La dihidrotetrabenazina parcialmente purificada se deshidrató entonces utilizando PCl_{5} según el método del Ejemplo 1B para producir una mezcla semipura de los isómeros 11bR y 11bS de 2,3-dihidrotetrabenazina (cuyo enantiómero 11bR se muestra a continuación) en forma de un sólido amarillo (12,92 g, 68%).

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2B. Epoxidación del alqueno bruto procedente del Ejemplo 2A

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A una solución agitada del alqueno bruto procedente del Ejemplo 2A (12,92 g, 42,9 mmol) en metanol (215 ml) se añadió una solución de ácido perclórico al 70% (3,70 ml, 43 mmol) en metanol (215 ml). Se añadió ácido 3-cloroperoxibenzoico al 77% (15,50 g, 65 mmol) a la reacción y la mezcla resultante se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente protegida de la luz.

La mezcla de reacción se vertió en una disolución saturada acuosa de sulfito de sodio (200 ml) y se añadió agua (200 ml). Se añadió cloroformo (300 ml) a la emulsión resultante y la mezcla se basificó con bicarbonato de sodio saturado acuoso (400 ml).

Se recogió la capa orgánica y se lavó la fase acuosa con más cloroformo (2 x 150 ml). Las capas combinadas de cloroformo se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida para producir un aceite marrón (14,35 g, rendimiento > 100% -queda probablemente en el producto disolvente). Este material se utilizó sin más purificación.

2C. Apertura reductora del anillo epóxido procedente de 2B

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Una solución agitada del epóxido bruto procedente del Ejemplo 2B (14,35 g, 42,9 mmol, asumiendo un rendimiento del 100%) en THF seco (80 ml) se trató lentamente con borano/THF 1M (184,6 ml, 184,6 mmol) durante 15 minutos. Se agitó la reacción durante dos horas, se añadió agua (65 ml) y la solución se calentó con agitación a reflujo durante 30 minutos.

Después del enfriamiento, se añadió una disolución de hidróxido de sodio al 30% (97 ml) a la mezcla de reacción, seguido de una disolución de peróxido de hidrógeno al 30% (48,6 ml) y la reacción se agitó y calentó a reflujo durante 1 hora más.

Se extrajo la mezcla de reacción enfriada con acetato de etilo (500 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida para producir un aceite. Se añadió hexano (230 ml) al aceite y se reconcentró la solución a presión reducida.

Se purificó el residuo aceitoso por cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó el residuo una vez más utilizando una cromatografía en columna (sílice, gradiente, hexano a éter). Las fracciones de interés se combinaron y los disolventes se sometieron a evaporación a presión reducida para producir un sólido amarillo pálido (5,18 g, 38%).

2D. Preparación de derivados de éster de Mosher de los Isómeros 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS de la dihidrotetrabenazina

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Se añadió ácido R-(+)-\alpha-metoxi-\alpha-trifluorometilfenilacético (4,68 g, 19,98 mmol), cloruro de oxalilo (1,90 ml) y DMF (0,13 ml) a diclorometano anhidro (46 ml) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. La solución se concentró a presión reducida y el residuo se recogió una vez más en diclorometano anhidro (40 ml). La solución resultante se enfrió utilizando un baño de agua helada y se añadió dimetilaminopiridina (3,65 g, 29,87 mmol), seguido de una solución presecada (sobre tamices de 4\ring{A}) en diclorometano anhidro (20 ml) del producto sólido del Ejemplo 2C (4,68 g, 14,6 mmol). Después de agitación a temperatura ambiente durante 45 minutos, se añadió agua (234 ml) y la mezcla se extrajo con éter (2 x 200 ml). El extracto de éter se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se pasó por un bloque de sílice y el producto se eluyó con éter.

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El eluato de éter recogido se concentró a presión reducida para proporcionar un aceite, que se purificó utilizando una cromatografía en columna (sílice, hexano:éter (1:1)). La evaporación de las fracciones de columna de interés recogidas y la eliminación del disolvente a presión reducida produjeron un sólido de color rosa (6,53 g).

La HPLC preparativa del sólido (Columna: 2 x Lichrospher Si60, 5 \mum, 250 x 21,20 mm, fase móvil: hexano:isopropanol (97:3), UV 254 nm; caudal: 10 ml\cdotmin^{-1}) a una carga de 100 mg seguido de la concentración de las fracciones de interés al vacío produjeron un sólido, que se redujo a pasta con éter de petróleo (30-40ºC) y se recogió por filtración para producir los derivados puros de éster de Mosher.

Pico 1 (2,37 g, 30%)

Pico 2 (2,42 g, 30%).

Las fracciones correspondientes a los dos picos se sometieron a hidrólisis para liberar los isómeros individuales de dihidrotetrabenazina identificados y caracterizados como Isómeros C y D. Se piensa que los Isómeros C y D tienen cada uno una de las siguientes estructuras:

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2F. Hidrólisis del Pico 1 para producir el Isómero C

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (53 ml) a una solución agitada del pico 1 de éster de Mosher (2,37 g, 4,43 mmol) en metanol (158 ml) y la mezcla se agitó a reflujo durante 150 minutos. Después se añadió agua de refrigeración (88 ml) a la mezcla de reacción y la solución resultante se extrajo con éter (576 ml). Se secó el extracto orgánico sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida. Se añadió acetato de etilo (200 ml) al residuo y la solución se lavó con agua (2 x 50 ml). Se secó la solución orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida.

Este residuo se trató con éter de petróleo (30-40ºC) y se recogió el sólido suspendido resultante mediante filtración. El filtrado se concentró a presión reducida y el segundo lote de sólido suspendido se recogió por filtración. Ambos sólidos recogidos se combinaron y secaron a presión reducida para producir el Isómero C (1,0 g, 70%).

El Isómero C, del que se piensa tiene la configuración 2R,3S,11bR o 2S,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó por ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS para el Isómero C figuran en la Tabla 2 y los datos de la HPLC Quiral y ORD figuran en la Tabla 4.

2G. Hidrólisis del Pico 2 para producir el Isómero D

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (53 ml) a una solución agitada del pico 2 de éster de Mosher (2,42 g, 4,52 mmol) en metanol (158 ml) y la mezcla se agitó a reflujo durante 150 minutos. Después se añadió agua de refrigeración (88 ml) a la mezcla de reacción y la solución resultante se extrajo con éter (576 ml). Se secó el extracto orgánico sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida. Se añadió acetato de etilo (200 ml) al residuo y la solución se lavó con agua (2 x 50 ml). Se secó la solución orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, se eliminó el disolvente a presión reducida.

Este residuo se trató con éter de petróleo (30-40ºC) y se recogió el sólido suspendido resultante de color naranja mediante filtración. El sólido se disolvió en acetato de etilo:hexano (15:85) y se purificó por cromatografía en columna (sílice, gradiente, acetato de etilo:hexano (15:85) a acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo se redujo a pasta con éter de petróleo (30-40ºC) y la suspensión resultante se recogió mediante filtración. El sólido recogido se secó a presión reducida para producir el Isómero D en forma de un sólido blanco (0,93 g, 64%).

El Isómero D, del que se piensa tiene la configuración 2R,3S,11bR o 2S,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó por ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS para el Isómero D figuran en la Tabla 2 y los datos de la HPLC Quiral y ORD figuran en la Tabla 4.

En las Tablas 1 y 2, los espectros de infrarrojo se determinaron utilizando el método de discos de KBr. Los espectros ^{1}H-NMR se llevaron a cabo en solución en cloroformo deuterizado utilizando un espectrómetro NMR de Varian Gemini (200 MHz). Los espectros ^{13}C-NMR se llevaron a cabo en solución en cloroformo deuterizado utilizando una NMR Varian Gemini (50 MHz). Los espectros de masas se obtuvieron utilizando un espectrómetro Micromass Platform II (condiciones ES^{+}). En las Tablas 3 y 4, las cifras de Dispersión Óptica Rotatoria se obtuvieron utilizando un instrumento de Actividad Óptica PolAAr 2001 en una solución de metanol a 24ºC. Las mediciones del tiempo de retención de HPLC se llevaron a cabo utilizando un cromatógrafo de HPLC HP1050 con detección de UV.

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TABLAS 1 y 2 Datos Espectroscópicos

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TABLAS 3 y 4 Datos de Cromatografía y ORD

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Ejemplo 3 Método alternativo de preparación del Isómero B y preparación de la sal mesilato 3A. Reducción de la RR/SS-tetrabenazina

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Se añadió lentamente L-Selectride® 1M en tetrahidrofurano (52 ml, 52 mmol, 1,1 eq) durante 30 minutos a una solución refrigerada (baño de hielo), agitada, de racemato de tetrabenazina (15 g, 47 mmol) en tetrahidrofurano (56 ml). Después de terminar la adición, se dejó que la mezcla se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante seis horas más. El análisis TLC (sílice, acetato de etilo) mostró que quedaban solamente cantidades muy pequeñas de materia prima.

Se vertió la mezcla en una mezcla agitada de hielo picado (112 g), agua (56 ml) y ácido acético glacial (12,2 g). La solución amarilla resultante se lavó con éter (2 x 50 ml) y se basificó mediante la adición lenta de carbonato de sodio sólido (aprox. 13 g). Se añadió a la mezcla éter-pet. (30-40ºC) con agitación y se recogió por filtración el \beta-DHTBZ bruto en forma de un sólido blanco.

El sólido bruto se disolvió en diclorometano (aprox. 150 ml) y la solución resultante se lavó con agua (40 ml), se secó utilizando sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró a presión reducida a aprox. 40 ml. Se formó una suspensión espesa de sólido blanco. Se añadió éter-pet. (30-40ºC) (56 ml) y la suspensión se agitó durante quince minutos a temperatura de laboratorio. El producto se recogió por filtración y se lavó en el filtro hasta un color blanco como nieve utilizando éter-pet. (30-40ºC) (40 a 60 ml) antes del secado al aire a temperatura ambiente, para producir \beta-DHTBZ (10,1 g, 67%) en forma de un sólido blanco. El análisis por TLC (sílice, acetato de etilo) mostró solamente un componente.

3B. Preparación y cristalización Fraccionada de la sal de ácido canforsulfónico de \beta-DHTBZ racémica

El producto del Ejemplo 3A y 1 equivalente de ácido (S)-(+)-canfor-10-sulfónico se disolvieron bajo calentamiento en una cantidad mínima de metanol. Se dejó enfriar la solución resultante y luego se diluyó lentamente con éter hasta que finalizara la formación de la precipitación sólida resultante. El sólido cristalino blanco resultante se recogió por filtración y se lavó con éter antes del secado.

La sal de ácido canforsulfónico de (10 g) se disolvió en una mezcla de etanol absoluto caliente (170 ml) y metanol (30 ml). La solución resultante se agitó y se dejó enfriar. Después de dos horas, se recogió por filtración el precipitado formado en forma de un sólido cristalino blanco (2,9 g). Una muestra del material cristalino se agitó en un embudo de separación con carbonato de sodio acuoso saturado en exceso y diclorometano. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró a presión reducida. El residuo se trituró utilizando éter-pet. (30-40ºC) y la solución orgánica se concentró una vez más. El análisis por HPLC quiral de la sal utilizando una columna Chirex (S)-VAL y (R)-NEA 250 x 4,6 mm, y un eluyente de hexano:etanol (98:2) a un caudal de 1 ml/minuto mostró que la \beta-DHTBZ aislada estaba enriquecida en un enantiómero (e.e. aprox. 80%).

La sal de ácido canforsulfónico enriquecida (14 g) se disolvió en etanol absoluto caliente (140 ml) y se añadió 2-propanol (420 ml). La solución resultante se agitó y empezó a formarse en un minuto un precipitado. Se dejó enfriar la mezcla a temperatura ambiente y se agitó durante una hora. El precipitado formado se recogió por filtración, se lavó con éter y se secó para producir un sólido cristalino blanco (12 g).

El material cristalino se agitó en un embudo de separación con carbonato de sodio acuoso saturado en exceso y diclorometano. Se separó la fase orgánica, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró a presión reducida. El residuo se trituró utilizando éter-pet. (30-40ºC) y la solución orgánica se concentró una vez más para producir (después de secado al vacío) (+)-\beta-DHTBZ (6,6 g, ORD + 107,8º). El enantiómero aislado tiene un e.e. > 97%.

3C. Preparación del Isómero B

Una solución de pentacloruro de fósforo (4,5 g, 21,6 mmol, 1,05 eq.) en diclorometano (55 ml) se añadió con regularidad durante diez minutos a una solución agitada, enfriada (baño de agua helada), del producto del Ejemplo 3B (6,6 g, 20,6 mmol) en diclorometano (90 ml). Cuando terminó la adición, la solución amarilla resultante se agitó durante diez minutos más antes de verterla en una mezcla rápidamente agitada de carbonato de sodio (15 g) en agua (90 ml) y hielo picado (90 g). Se agitó la mezcla durante 10 minutos más y se trasladó a un embudo de separación.

Una vez separadas las fases, se eliminó la capa marrón de diclorometano, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró a presión reducida, para producir el intermedio de alqueno bruto en forma de un aceite marrón (aprox. 6,7 g). El análisis por TLC (sílice, acetato de etilo) mostró que no quedaba (+)-\beta-DHTBZ en el producto bruto.

Se recogió el alqueno bruto (medio de nitrógeno seco) en tetrahidrofurano anhidro (40 ml) y una solución de borano en THF (solución 1M, 2,5 eq, 52 ml) se añadió agitando durante quince minutos. La mezcla de reacción se agitó entonces a temperatura ambiente durante dos horas. El análisis por TLC (sílice, acetato de etilo) mostró que no quedaba intermedio de alqueno en la mezcla de reacción.

Una disolución de hidróxido de sodio (3,7 g) en agua (10 ml) se añadió a la mezcla de reacción agitada, seguido de una disolución acuosa de peróxido de hidrógeno (50%, aprox. 7 ml) y la mezcla en dos fases formada se agitó a reflujo durante una hora. El análisis por TLC de la fase orgánica en ese momento (sílice, acetato de etilo) mostró la aparición de un producto con Rf tal como se esperaba para el Isómero B. Se observó también un componente no polar característico.

La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en un embudo de separación. La capa orgánica superior se eliminó y se concentró a presión reducida para eliminar la mayor parte del THF. El residuo se recogió en éter (estabilizado (BHT), 75 ml), se lavó con agua (40 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró a presión reducida para producir un aceite amarillo pálido (8,1 g).

Se purificó el aceite amarillo utilizando una cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo:hexano (80:20), aumentando al 100% el acetato de etilo) y las fracciones de columna deseadas se recogieron, combinaron y concentraron a presión reducida, para producir un aceite pálido que se trató con éter (estabilizado, 18 ml) y se concentró a presión reducida para producir el Isómero B en forma de una espuma sólida de color amarillo pálido (2,2 g).

La HPLC quiral utilizando las condiciones expuestas en el Ejemplo 3B confirmó que el Isómero B se había producido en un exceso enantiomérico (e.e.) superior al 97%.

Se midió la rotación óptica por medio de un polarímetro Bellingham Stanley ADP220 y dio un [\alpha_{D}] de +123,5º.

3D. Preparación de la sal mesilato del Isómero B

La sal metanosulfonato del Isómero B se preparó mediante la disolución de una mezcla de 1 equivalente del Isómero B procedente del Ejemplo 3C y 1 equivalente de ácido metanosulfónico en la cantidad mínima de etanol y luego mediante la adición de dietil éter. El precipitado blanco resultante que se formó se recogió por filtración y se secó al vacío para producir la sal mesilato con un rendimiento de aprox. el 85% y una pureza (por HPLC) de aprox. el 96%.

Ejemplo 4 Examen en busca de la actividad de unión a VMAT-2 utilizando el ensayo de unión a [^{3}H]-dihidrotetrabenazina

La dihidrotetrabenazina es un inhibidor muy potente y selectivo de VMAT-2, y se une por alta afinidad (rango nM) a este transportador vesicular. Se ha utilizado con éxito durante muchos años la [^{3}H]-dihidrotetrabenazina como radioligando para marcar el VMAT-2 en el cerebro humano, bovino y roedor (por ejemplo, Scherman y col., J. Neurochem. 50, 1131-1136 (1988); Near y col., Mol. Pharmacol. 30, 252-257 (1986); Kilbourn y col., Eur. J. Pharmacol. 278, 249-252 (1995); y Zucker y col., Life Sci. 69, 2311-2317 (2001)).

Los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D se sometieron a ensayo en busca de su capacidad para inhibir el transportador VMAT-2 por medio del ensayo descrito a continuación.

Métodos y Materiales

Se prepararon membranas de prosencéfalo de rata adulta (variedad Wistar) esencialmente tal como se describe en Chazot y col.(1993) Biochem. Pharmacol. 45, 605-610. Las membranas vesiculares estriatales de rata adulta se prepararon esencialmente tal como se describe en Roland y col.,(2000), JPET 293, 329-335. Se incubaron 10 \mug de membranas a 25ºC con [^{3}H]-dihidrotetrabenazina (18-20 nM) en 50 mM de HEPES con pH 8,0 (tampón de ensayo) durante 60 minutos y se recogió el radioligando unido mediante filtración rápida al vacío en filtros de fibras de vidrio GF/B. La unión no-específica se determinó en muestras paralelas en presencia de tetrabenazina 2 \muM no marcada. El recuento de la radioactividad se realizó con un fluido de escintilación en un \beta-contador. Un rango completo de concentración (unidades log y semilog) de cuatro compuestos de prueba (Isómeros A, B, C y D) se sometió a prueba (rango: 10^{-11} - 10^{-4} M) por triplicado. Los compuestos de prueba y la tetrabenazina se disolvieron en DMSO a una concentración stock de 10 mM, y se prepararon entonces diluciones en el tampón de ensayo. Se realizaron tres experimentos independientes para cada compuesto. Se analizaron los datos y se ajustaron las curvas utilizando el paquete GraphPad Prism 3.2.

Resultados

Inicialmente se preparó una membrana de prosencéfalo P_{2} de rata adulta (Chazot y col.,1993) y se sometió a ensayo tal como se describe en el protocolo original. Esto produjo un nivel muy bajo de actividad específica de unión.

Se preparó entonces la preparación vesicular estriatal de rata adulta que produjo un nivel significativo de sitios de unión específicos estables a [^{3}H]-dihidrotetrabenazina (5-6 pmol/mg de proteína). Esto resulta ser mejor que los datos publicados (Roland y col.,2000). Esta preparación se utilizó para todos los ensayos posteriores.

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TABLA 5 Parámetros de unión competitiva para los compuestos de prueba

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Los datos son media \pm SD para tres experimentos independientes. Los valores K_{I} se determinaron en base a un valor K_{D} estriatal de rata de 1,2 nM (Roland y col.,2000).

El perfil farmacológico general en términos de valores K_{I} generales es Isómero C > Isómero B > Isómero D >> Isómero A.

Notablemente, ambos Isómero B e Isómero A produjeron curvas de competición poco pronunciadas que se adaptaban mejor a un modelo de unión en dos sitios.

El Isómero A mostró un sitio de gran afinidad (K_{I} = 59 nM) y de baja afinidad (K_{I} < 5,9 \muM de afinidad), cada uno contribuyendo aprox. a un 50% de todos los sitios. Esto puede indicar que el Isómero A puede diferenciar entre los distintos sitios estriatales de unión a VMAT-2.

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Ejemplo 5 Ensayos Funcionales de VMAT A. Ensayo Funcional de VMAT-2

Se prepararon vesículas sinápticas estriatales de rata esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 3. Así, una preparación de membrana P_{2} estriatal de rata (Chazot y col., 1993) se resuspendió y homogeneizó en agua helada destilada. Se restauró la osmolaridad mediante la adición de HEPES 25 mM y tartrato de potasio 100 mM (pH 7,5, 4ºC). Luego se centrifugó la preparación durante 20 minutos a 20.000 x g (4ºC). La fracción S_{3} resultante se eliminó, se añadió sulfato de magnesio (para dar una concentración final de 1 mM, pH 7,5, 4ºC) y la mezcla se centrifugó a 100.000 x g durante 45 minutos. La fracción P_{4} final contiene las vesículas sinápticas para el ensayo.

Una parte alícuota de 100 \mul (aprox. 2,5 \mug de proteína) de vesículas sinápticas se preincubó con concentraciones en aumento de los compuestos de prueba C y B (preparadas frescas como stock de 10^{-2} M en DMSO) durante 30 minutos (rango de concentración 10^{-9} M - 10^{-4} M), y después durante 3 minutos en el tampón de ensayo (HEPES 25 mM, tartrato de potasio1 00 mM, ácido ascórbico 1,7 mM, EGTA 0,05 mM, EDTA 0,1 mM, ATP-Mg^{2+} 2 mM, pH 7,5), en presencia de [^{3}H]-dopamina (30 nM de concentración final) a 30ºC. La reacción concluyó entonces con la adición del tampón de ensayo de tampón enfriado con hielo de pH 7,5, que contenía MgSO_{4} 2 mM en lugar de ATP-Mg^{2+} 2 mM y se consiguió una filtración rápida a través de filtros de Whatman impregnados en un 0,5% de polietilenimina. Se lavaron los filtros tres veces con tampón frío utilizando una cosechadora Brandel. La radioactividad retenida en los filtros se recontó utilizando un contador de escintilación líquida y se determinó la unión no específica mediante medida de la captación de [^{3}H]-dopamina vesicular a 4ºC. El método se basaba en el que se describe en Ugarte YV y col. (2003) Eur. J. Pharmacol. 472, 165-171. La captación selectiva de VMAT-2 se definió utilizando tetrabenazina 10 \muM.

Ambos Compuesto C (IC_{50} aparente = 18 \pm 2 nM) y Compuesto B (IC_{50} aparente = 30 \pm 3 nM) inhibieron la captación de [^{3}H]-dopamina en vesículas estriatales de rata a través del transportador VMAT-2 con afinidades funcionales (perfil C > B) similares a sus afinidades respectivas de unión determinadas mediante el ensayo de unión a [^{3}H]-dihidrotetrabenazina.

B. Ensayo funcional de VMAT-1

Existen tejidos nativos muy limitados que poseen el VMAT-1 solo, aisladamente de VMAT-2. Sin embargo, la tetrabenazina muestra una afinidad al menos 200 veces más alta por VMAT-2 en comparación con VMAT-1, y esta discriminación se puede utilizar para bloquear la influencia de VMAT-2 en el ensayo funcional (Erickson y col., (1996) PNAS (USA) 93, 5166-5171). Se aislaron células de cromafina adrenales de ratas SD adultas jóvenes esencialmente tal como se describe en Moshharov y col., (2003) J. Neurosci. 23, 5835-5845. Así, las glándulas adrenales se diseccionaron en PBS helado, se eliminaron la cápsula y corteza de las glándulas y las médulas restantes se picaron. Después de múltiples lavados con PBS, el tejido se incubó con una solución de colagenasa IA exenta de Ca^{2+} (250 U/ml) durante 30 minutos a 30ºC con agitación suave. El tejido digerido se enjuagó tres veces y las células disociadas se centrifugaron a 3.000 rpm para formar un gránulo, que se resuspendió en PBS. La fracción vesicular se aisló de una manera idéntica a la descrita para la preparación del cerebro.

100 \mul (aprox. 2,5 \mug de proteína) de vesículas sinápticas se preincubaron con concentraciones progresivas del compuesto de prueba (preparado tal como se ha descrito anteriormente para el ensayo de unión) durante 30 minutos (rango de concentración de 10^{-9} M - 10 ^{-4} M). El ensayo se realizó durante 3 minutos a 30ºC en el tampón de ensayo (HEPES 25 mM , 100 mM tartrato de potasio, 1,7 mM ácido ascórbico, 0,05 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 2 mM ATP-Mg^{2+}, pH 7,5), en presencia de [^{3}H]-dopamina (30 nM de concentración final). Se midió la captación de [^{3}H]-dopamina en presencia de 10 \muM de tetrabenazina (bloquea selectivamente el VMAT-2 a esta concentración). Se determinó la captación no específica midiendo la captación de [^{3}H]-dopamina vesicular a 4ºC. La reacción concluyó entonces con la adición del tampón de ensayo de tampón enfriado con hielo de pH 7,5, que contenía 2 mM MgSO_{4} en lugar de 2 mM ATP-Mg^{2+}, y se consiguió una filtración rápida a través de filtros de Whatman impregnados en un 0,5% de polietilenimina. Se lavaron los filtros tres veces con tampón frío utilizando una cosechadora Brandel y la radioactividad retenida en los filtros se recontó utilizando un contador de escintilación líquida.

\newpage

En presencia de 10 \muM de tetrabenazina, ambos Compuesto B y Compuesto C inhibieron escasamente la captación de [^{3}H]-dopamina, siendo los valores de IC_{50} superiores a 10^{-5} M para ambos compuestos. Esto indica que ambos compuestos tienen poca afinidad por VMAT-1. Además los datos muestran que ambos compuestos tienen al menos 2 órdenes de magnitud de selectividad por VMAT-2 con respecto a VMAT-1.

Ejemplo 6 Estudios de unión a proteína receptora y transportadora

Los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D sometidos a ensayos específicos de unión para someter a prueba su capacidad para unirse a las proteínas receptoras y transportadoras se describen a continuación. Los resultados se exponen en la Tabla 6.

(a)

Receptor Adrenérgico \alpha_{2A}:

Referencia:

S. Uhlen y col., J. Pharmacol. Exp. Ther., 271:1558-1565 (\underline{1994})

Fuente:

Células de insecto Sf9 recombinantes humanas

Ligando:

1 nM [^{3}H]-MK-912

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

60 minutos a 25ºC

Tampón de incubación:

75 mM Tris-HCl, pH 7,4, 12,5 mM MgCl_{2}, 2 mM EDTA

Ligando no-específico:

10 \muM WB-4101

K_{d}:

0,6 nM

B_{máx}:

4,6 pmol/mg de proteína

Unión específica:

95%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

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(b)

Receptor Adrenérgico \alpha_{2B}:

Referencia:

S. Uhlen y col., Eur. J. Pharmacol., 33 (1): 93-1-1 (\underline{1998})

Fuente:

Células de CHO-K1 recombinantes humanas

Ligando:

2,5 nM [3H]-Rauwolscina

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

60 minutos a 25ºC

Tampón de incubación:

50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl_{2}, pH 7,4, 0,2% de BSA a 25ºC

Ligando no específico:

10 \muM de Prazosina

K_{d}:

2,1 nM

B_{máx}:

2,1 pmol/mg de proteína

Unión específica:

90%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

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(c)

Receptor de Dopamina D_{1}:

Referencia:

Dearry y col., Nature, 347:72-76, (\underline{1990})

Fuente:

Células CHO recombinantes humanas

Ligando:

1,4 nM [^{3}H]-SCH-23390

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

2 horas a 37ºC

Tampón de incubación:

50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 nM NaCl, 1,4 nM ácido ascórbico, 0,001% de BSA

Ligando no específico:

10 \muM de (+)-butaclamol

K_{d}:

1,4 nM

B_{máx}:

0,63 pmol/mg de proteína

Unión específica:

90%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

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(d)

Receptor de Dopamina D_{2L}:

Referencia:

Bunzo y col., Nature, 336:783-787, (\underline{1988})

Fuente:

Células CHO recombinantes humanas

Ligando:

0,16 nM de [^{3}H]-Espiperona

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

2 horas 25ºC

Tampón de incubación:

50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 nM NaCl, 1,4 nM ácido ascórbico, 0,001% de BSA

Ligando no específico:

10 \muM de Haloperidol

K_{d}:

0,8 nM

B_{máx}:

0,48 pmol/mg de proteína

Unión específica:

85%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

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(e)

Receptor de Dopamina D_{3}:

Referencia:

Sokoloff y col., Nature, 347:146-151, (\underline{1990})

Fuente:

Células CHO recombinantes humanas

Ligando:

0,7 nM [^{3}H]-Espiperona

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

2 horas a 37ºC

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Tampón de incubación:

50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,4 nM ácido ascór- bico, 0,001% de BSA

Ligando no específico:

25 \muM de S(-)-Sulpirida

K_{d}:

0,36 nM

B_{máx}:

1,1 pmol/mg de proteína

Unión específica:

85%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

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(f)

Receptor de Imidazolina I_{2} (Central):

Referencia:

Brown y col., Brit. J. Pharmacol., 99:803-809, (\underline{1990})

Fuente:

Corteza cerebral de rata Wistar

Ligando:

2 nM [^{3}H]Idazoxan

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

30 minutos a 25ºC

Tampón de incubación:

50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 7,4 a 25ºC

Ligando no-específico:

1 \muM de Idazoxan

K_{d}:

4 nM

B_{máx}:

0,14 pmol/mg de proteína

Unión específica:

85%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

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(g)

Receptor Sigma \sigma_{1}:

Referencia:

Ganapathy y col., Pharmacol. Exp. Ther., 289:251-260, (\underline{1999})

Fuente:

Células Jurkat humanas

Ligando:

8 nM [^{3}H]-Haloperidol

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

4 horas a 25ºC

Tampón de incubación:

5 mM de tampón K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, pH 7,5

Ligando no-específico:

10 \muM de Haloperidol

K_{d}:

5,8 nM

B_{máx}:

0,71 pmol/mg de proteína

Unión específica:

80%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

\global\parskip1.000000\baselineskip

(h)

Receptor Sigma \sigma_{2}:

Referencia:

Hashimoto y col., Eur. J. Pharmacol., 236:159-163, (\underline{1993})

Fuente:

Cerebro de rata Wistar

Ligando:

3 nM [^{3}H]-Ifenprodil

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

60 minutos a 37ºC

Tampón de incubación:

50 mM Tris-HCl, pH 7,4

Ligando no-específico:

10 \muM de Ifenprodil

K_{d}:

4,8 nM

B_{máx}:

1,3 pmol/mg de proteína

Unión específica:

85%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

\vskip1.000000\baselineskip

(i)

Transportador de serotonina (SERT):

Referencia:

Gu y col., J. Biol. Chem., 269(10):7124-7130, (\underline{1994})

Fuente:

Células HEK-293 recombinantes humanas

Ligando:

0,15 nM [^{125}I]-RTI-55

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

3 horas a 4ºC

Tampón de incubación:

100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, 1 \muM Leupeptina, 10 \muM PMSF, pH 7,4

Ligando no-específico:

10 \muM de Imipramina

K_{d}:

0,17 nM

B_{máx}:

0,41 pmol/mg de proteína

Unión específica:

95%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

\vskip1.000000\baselineskip

(j)

Transportador de Dopamina (DAT):

Referencia:

Giros y col., Trends Pharmacol. Sci., 14, 43-49 (\underline{1993})

\quad

Gu y col., J. Biol. Chem., 269(10):7124-7130, (\underline{1994})

Fuente:

Células CHO recombinantes humanas

Ligando:

0,15 nM [^{125}I]-RTI-55

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

3 horas a 4ºC

Tampón de incubación:

100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, 1 \muM Leupeptina, 10 \muM PMSF, pH 7,4

Ligando no-específico:

10 \muM de Nomifensina

K_{d}:

0,58 nM

B_{máx}:

0,047 pmol/mg de proteína

Unión específica:

90%

Método de cuantitación:

Unión de radioligando

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima.

TABLA 6

31

Ejemplo 7 Ensayos de Enzimas

Se sometieron a prueba los isómeros B y C en busca de su capacidad para inhibir las enzimas implicadas en el procesamiento de monoaminas en el SNC, a saber Catecol-O-Metil-Transferasa (COMT), Monoamina-Oxidasa A y Monoamina-Oxidasa B. Los métodos de ensayo utilizados se describen a continuación y los resultados figuran en la Tabla 7.

(a)

\underbar{Inhibición de la Catecol-O-Metil-Transferasa (COMT)}

Fuente:

Hígado Porcino

Substrato:

3 mM de catecol + S-adenosil-L-[^{3}H]metionina

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de preincubación:

Ninguna

Tiempo de incubación:

60 minutos a 37ºC

Tampón de incubación:

100 mM fosfato de potasio, 10 mM MgCl_{2}, 3 mM DTT conteniendo 12 unidades/ml de adenosina-deaminasa, pH 7,4

Método de cuantitación:

Cuantitación de [^{3}H]-guiacol

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(b)

\underbar{Inhibición de la Monoamina-Oxidasa MAO-A}

Fuente:

Recombinante humana

Substrato:

50 \muM quinuramina

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de preincubación:

15 minutos a 37ºC

Tiempo de incubación:

60 minutos a 37ºC

Tampón de incubación:

100 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,4

Método de cuantitación:

Cuantitación espectrofluorimétrica de 4-hidroxiquinolina

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(c)

\underbar{Inhibición de la Monoamina-Oxidasa MAO-B}

Fuente:

Recombinante humana

Substrato:

50 \muM quinuramina

Vehículo:

1% de DMSO

Tiempo/temp. de preincubación:

15 minutos a 37ºC

Tiempo de incubación:

60 minutos a 37ºC

Tampón de incubación:

100 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,4

Método de cuantitación:

Cuantitación espectrofluorimétrica de 4-hidroxiquinolina

Criterios de significación:

\geq 50% de estimulación o inhibición máxima.

TABLA 7

32

Ejemplo 8 Ensayos Celulares

La capacidad de los isómeros B y C para inhibir la captación de serotonina (5-hidroxitriptamina) por células de riñón embrionario humano se midió utilizando las siguientes condiciones de ensayo:

Objetivo:

Células HEK-293 humanas

Vehículo:

0,4% de DMSO

Tiempo/temp. de incubación:

10 minutos a 25ºC

Tampón de incubación:

5 mM Tris-HCl, 7,5 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,2 mM CaCl_{2}, 1,2 mM MgSO_{4}, 5 mM glucosa, 1 mM ácido ascórbico, pH 7,1.

Método de cuantitación:

Cuantitación de la captación de [^{3}H] -serotonina

Criterios de significación:

\geq 50% de inhibición de la captación de [^{3}H]-serotonina con respecto a la respuesta a fluoxetina.

Resultados

Se mostró que el Compuesto B era un antagonista y produjo un 56% de inhibición de la captación de serotonina a una concentración de 10 \muM. El Compuesto B tenía un IC_{50} de 7,53 \muM.

Se mostró que el Compuesto C era también un antagonista y produjo un 86% de inhibición de la captación de serotonina a una concentración de 10 \muM. El Compuesto B tenía un IC_{50} de 1,29 \muM.

Ejemplo 9 Ensayo de Unión de 5-HT_{1D/1B}

La capacidad del Compuesto B y del Compuesto C para unirse a los receptores 5-HT_{1D/1B} se sometió a prueba utilizando un ensayo basado en el que se describe en Millan, MJ y col., (2002), Pharmacol. Biochem. Behav. 71, 589-598. Se utilizó [N-metil ^{3}H]-GR-125743 como radioligando para ambos receptores 5-HT_{1D} y 5-HT_{1B}. Se utilizaron para el ensayo membranas de prosencéfalo P_{2} de rata SD adulta (Chazot y col., 1993). El tampón de ensayo utilizado fue 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, a temperatura ambiente, conteniendo 4 mM cloruro de calcio, un 0,1% de ácido ascórbico y 10 \muM pargilina. Se utilizó 5-HT (10 \muM) para definir la unión no-específica. La incubación con 1 nM [^{3}H]-GR-125743 se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente, y la reacción finalizó por una filtración rápida mediante una cosechadora Brandel a través de filtros GF/B preimpregnados en un 0,1% de polietilenimina, seguido de tres lavados con tampón helado (complementado por un 0,1% de BSA). Se utilizó un rango de dosificación de 10^{-10} - 10^{-4} M. Las curvas de competición resultantes se analizaron utilizando el paquete GraphPad Prism 4.

Ambos compuestos B y C mostraron poco desplazamiento de la unión [^{3}H] [N-metil] GR-125743 a las membranas de prosencéfalo de rata (valores IC_{50} > 10^{-4}M), lo que sugiere que tanto B como C tienen poca afinidad por los receptores 5-HT_{1D/1B}.

Ejemplo 10 Determinación de la permeabilidad intestinal de los isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D utilizando el ensayo de absorción en Caco-2

El ensayo de absorción en Caco-2 es un sistema bien establecido para la estimación in vitro de la absorción intestinal in vivo de medicamentos - véase Meunier y col., Cell Biology and Toxicology, 11:187-194, Wils y col., Cell Biology and Toxicology, 10:393-397, y Gres y col., Pharm. Sci., 15(5):726-732.

El ensayo cuenta con la capacidad de las células Caco-2 para diferenciarse a enterocitos cuando se cultivan en un filtro microporoso durante un período de aproximadamente 21 días. Durante el período de cultivo, las células Caco-2 experimentan cambios morfológicos y bioquímicos espontáneos que producen una monocapa polarizada con un ribete en cepillo bien definido en la superficie apical, así como uniones celulares estrechas. Por tanto, estas células se pueden utilizar como modelo in vitro para el análisis de la permeabilidad a los medicamentos.

La absorción a través de la monocapa de Caco-2 se puede medir en dos direcciones: apical a basolateral o basolateral a apical, por medio de la adición del compuesto respectivamente a la cámara apical o basolateral. En varios momentos, se recogen muestras de la cámara receptora para analizar la velocidad de absorción según es medida por el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) a través de la monocapa.

El valor Papp refleja una combinación de la permeabilidad del artículo de prueba por las vías tanto de uniones transcelulares (a través de membranas celulares) como paracelulares (a través de las uniones estrechas entre las células). La contribución relativa de estas vías depende del pKa, coeficiente de partición (log D), radio molecular y la carga del artículo de prueba a determinado pH. Los valores Papp se pueden utilizar entonces para jerarquizar los compuestos en busca de su permeabilidad por las monocapas de Caco-2.

Los coeficientes de permeabilidad aparente (Papp) de los cuatros isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D a 50 \muM se determinaron utilizando el modelo de absorción en Caco-2 y se clasificaron con respecto a los compuestos de referencia de permeabilidad baja, mediana y alta. Los estándares de referencia radiomarcados de manitol (bajo), ácido salicílico (mediano) y testosterona (alto) se utilizaron para establecer una jerarquía de permeabilidad. El valor Papp de cada artículo de prueba de dihidrotetrabenazina se estimó midiendo su concentración en los compartimentos donadores y receptores después de 1 hora. La absorción se determinó a pH 7,4 a través de las monocapas celulares en la dirección apical a basolateral. Las células de Caco-2 utilizadas para estimar los valores Papp se cultivaron durante 26 días en insertos de Transwell en placas de 12 pocillos. Se comprobó la integridad de la monocapa antes y después del ensayo de absorción por medio de los métodos de resistencia eléctrica transepitelial (Ohm-cm^{2}) y amarillo
Lucifer.

Materiales y Métodos

Las soluciones stock de manitol, ácido salicílico y testosterona se prepararon en metanol a 50 mM. El día del ensayo, los estándares de referencia se diluyeron en una solución de sal equilibrada de Hank (HBSS), pH 7,4, hasta una concentración final de 50 \muM. ^{14}C-manitol, ^{3}H-testosterona y ácido ^{14}C-salicílico radiomarcados se añadieron entonces a sus medios no marcados correspondientes para tener una actividad específica final de 0,35-0,65 \muCi/ml. Se prepararon muestras de isómeros de dihidrotetrabenazina a una concentración de 50 mM en DMSO. Cada solución stock se diluyó luego en tampón HBSS (pH 7,4) hasta una concentración útil final de 50 \muM.

Las suspensiones de células Caco-2 se prepararon como sigue. Un vial de célula inicial Caco-2 ID No. Caco-29-080299 procedente del número de paso 29 (Colección de Cultivos de Tipo Americano (VA, USA)) se descongeló y se sometió a cultivo en un matraz de 150 cm^{2} que contenía el medio de cultivo de Caco-2. A la confluencia, el medio de cultivo se eliminó y las células se lavaron con 5 ml de PBS. Las células se separaron después de la adición y se incubaron con un 0,25% de tripsina-EDTA (2,0 ml por matraz) durante 10 minutos aproximadamente a 37ºC. La separación de las células fue controlada por microscopio y se interrumpió mediante la adición de 10 ml de medio de cultivo de Caco-2. La viabilidad y concentración de las células fueron evaluadas por el método de exclusión con azul tripán. Una vez determinadas la densidad y viabilidad celulares, se diluyeron las células Caco-2 en el medio de cultivo hasta una concentración útil final de 2,0 x 10^{5} células/ml. El medio de cultivo de Caco-2 contenía Dulbecco's Modified Eagle Medium, un 10% de suero bovino fetal, 100 \muM de aminoácidos no esenciales, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.

Membranas de policarbonato Costar (tamaño de poro de 0,4 \mum) fueron preequilibradas con medio de cultivo de Caco-2 durante 1 hora en un incubador con camisa de agua a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El contenido de la cámara apical se eliminó y sustituyó por 500 \mul de suspensión de células Caco-2 (200.000 células/ml). Luego se mantuvieron las células en cultivo durante 26 días en un incubador con camisa de agua a 37ºC con un 5% de CO_{2}.

Antes del ensayo, se lavaron dos veces todas las monocapas con HBSS y se midió su resistencia eléctrica transepitelial (TEER) con un contador Millicell-ERS. Los valores TEER obtenidos en ausencia de células fueron sustraídos como señal de fondo. Se utilizaron solamente monocapas con valores TEER por encima de 150 Ohm-cm^{2} para el experimento del ensayo de absorción.

Todos los experimentos de absorción se realizaron por triplicado a un pH 7,4. La velocidad de absorción de cada estándar de referencia y la muestra de prueba de dihidrotetrabenazina se evaluó en la dirección apical a basolateral. Partes alícuotas (100 \mul) de cada solución de trabajo (estándares de referencia y artículos de prueba a 50 \muM) se dejaron a un lado al principio del ensayo para la determinación de la concentración inicial (C_{o}).

Los experimentos de absorción empezaron por la sustitución del contenido de la cámara donadora por 500 \mul de Solución de Sal Equilibrada de Hanks que contenía las muestras de prueba o los compuestos de referencia. Las células se devolvieron al incubador con CO_{2} para el ensayo de absorción. Se recogieron muestras de 100 \mul de las cámaras receptoras y donadoras después de 1 hora y se utilizaron para determinar el porcentaje de recuperación. Los estándares de referencia radiomarcados, manitol, ácido salicílico y testosterona se utilizaron como controles de calidad y para la clasificación comparativa de las muestras de prueba de dihidrotetrabenazina.

Al final del experimento de absorción, la integridad de cada monocapa celular se evaluó monitorizando la fuga de Amarillo Lucifer del lado apical a basolateral. Se retiraron todas las soluciones de las cámaras apicales y basolaterales. Las cámaras basolaterales se rellenaron con 1,5 ml de HBSS fresco, mientras que las cámaras apicales se rellenaron con 0,5 ml de 120 \mug/ml de una solución de Amarillo Lucifer. Se devolvieron las células al incubador durante un período de 1 hora, después de lo cual se recogieron muestras de 100 \mul y se cuantificaron de forma espectrofotométrica con el lector de placas SpectraMax 340PC a 428 nm.

Un volumen de 20 \mul de cada muestra radiomarcada se añadió a 10 ml de cocktail de escintilación (30% de ScintiSafe) y se contó durante 5 minutos con un analizador de escintilación líquido (1900CA Tri-Carb).

Se analizaron las incubaciones de células Caco-2 en busca de la presencia de dihidrotetrabenazina utilizando un método de cromatografía líquida-espectrometría de masa/en tándem (LC-MS/MS).

Los coeficientes de permeabilidad aparente se calcularon utilizando la ecuación Papp = dQ/dt x 1/A x 1/C_{o} (cm/seg) en la que dQ/dt es la velocidad de difusión del compuesto (\mug/s o área de integración /s), A es el área superficial total de la membrana celular (cm^{2}) y C_{o} es la concentración inicial (\mug/ml o área de integración/s).

Los valores Papp apicales a basolaterales de los distintos artículos de prueba de dihidrotetrabenazina se compararon con los valores Papp determinados para los estándares de referencia. Se muestran los resultados en la Tabla 8. Los compuestos C, D y A de dihidrotetrabenazina tienen un valor Papp de 21,14 x 10^{-6}, 24,87 x 10^{-6} y 25,52 x 10^{-6} cm/s, que es comparable con el estándar de referencia de testosterona.

El compuesto B tiene un valor Papp de 11,98 x 10^{-6} cm/s, que es similar al estándar de referencia del ácido salicílico.

TABLA 8

33

Los compuestos C, D y A tienen un valor Papp cerca del valor de la testosterona, indicando que estos compuestos tienen una permeabilidad alta en el modelo Caco-2, mientras que el Compuesto B tiene un valor Papp situado entre los valores del ácido salicílico y la testosterona, indicando que tiene una permeabilidad mediana en el modelo Caco-2. Estos resultados sugieren que los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina deberían ser altamente absorbidos por el epitelio intestinal in vivo.

Ejemplo 11 Comparación de las propiedades sedantes de la tetrabenazina y los isómeros de dihidrotetrabenazina B y C

Se llevó a cabo un estudio en ratas para determinar si los isómeros de dihidrotetrabenazina de la invención tenían propiedades sedantes. Los efectos de los isómeros sobre la actividad locomotora espontánea en ratas se compararon con los efectos producidos por la tetrabenazina y el haloperidol utilizando los métodos expuestos a continuación.

Métodos

Se utilizaron para los estudios ratas Sprague-Dawley machos (Charles River Laboratories, Saint-Germain/
L'Arbresle, Francia), que pesaban 200-250 g al principio del estudio. Se alojaron 2 o 3 ratas por jaula en jaulas Makrolon de tipo III, en una sala provista de las siguientes condiciones ambientales: temperatura: 20\pm2ºC, humedad: mínimo un 45%, cambios de aire: > 12 por hora, ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h [empezando a las 7:00 h]. Se dejó que las ratas se aclimataran a sus condiciones durante al menos cinco días antes de empezar el estudio. Las ratas recibieron comida (Dietex, Vigny, Francia, ref. 811002) y agua (agua de grifo en botella de agua) a voluntad.

Se prepararon el día del experimento soluciones frescas de cada compuesto de prueba en aceite de maíz. Se preparó haloperidol en hidroxietilcelulosa, un 0,5% en agua desionizada. El véhiculo o los compuestos de prueba se administraron en una única dosis (0,3, 1, 3 y 10 mg/kg, 2 ml/kg i.p.). Se administró i.p. (2 ml/kg) el compuesto de referencia haloperidol (1 mg/kg).

Se colocaron los animales en jaulas de plexiglass con una videocámara en una sala con baja intensidad de luz (máximo 50 lux). 3 horas y cuarenta y cinco minutos después de la administración, se determinó la actividad locomotora durante períodos de 20 minutos utilizando un analizador de videoimágenes (Videotrack, View Point, Francia). Se registró la actividad locomotora en el grupo de referencia (haloperidol) 1 hora después de la administración. Se midió el número y la duración de los movimientos ambulatorios, así como la duración de inactividad. Al final de la medición de la actividad locomotora (45 minutos y 3 horas), se anotaron en la jaula de plexiglass la apertura y cierre palpebral como sigue:

Cierre palpebral:

0:

(normal) párpados muy abiertos

1:

párpados cayéndose ligeramente

2:

ptosis, párpados cayéndose aproximadamente a la mitad

3:

párpados completamente cerrados

\vskip1.000000\baselineskip

Apertura:

1:

muy baja, aturdimiento, en coma, receptividad escasa o nula

2:

baja, un poco de aturdimiento, "apagada", algún movimiento de la cabeza o del cuerpo

3:

algo baja, ligero aturdimiento, algunos movimientos exploratorios con períodos de inmovilidad

4:

normal, alerta, movimientos exploratorios/hipotermia lenta

5:

algo alta, ligera excitación, tensa, movimientos rápidos súbitos o hipotermia

6:

muy alta, hiperalerta, excitada, ataques para correr o movimientos del cuerpo.

\vskip1.000000\baselineskip

El número de incidencias y la duración (en segundos) de los movimientos ambulatorios (amplios), así como la duración de los períodos de inactividad (segundos) se determinó durante dos períodos de 20 minutos (45 minutos y 3 horas después de la administración) utilizando un analizador de videoimágenes (Videotrack, ViewPoint, Lyon, Francia). El seguimiento de las imágenes se realizó con una videocámara situada encima de la jaula de plexiglass, registrando la actividad locomotora general. Las imágenes registradas con la videocámara se digitalizaron y el desplazamiento del centro de gravedad de los puntos de imagen digital se rastrearon y analizaron por medio del método siguiente: la velocidad de desplazamiento del centro de gravedad del punto se midió y se establecieron dos valores umbral para definir el tipo de movimiento: umbral 1 (alta velocidad) y umbral 2 (baja velocidad). Cuando el animal se desplazó y la velocidad de desplazamiento del centro de gravedad del punto estaba por encima del umbral 1, el movimiento se consideró como movimiento ambulatorio. Cuando el animal permaneció inactivo y la velocidad se encontraba por debajo del umbral 2, el movimiento se consideró como inactividad.

Los resultados se expresaron como media \pm SEM de los valores individuales. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando ANOVA (una vía) y la prueba-t de Dunnett, así como con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, seguido de una prueba-U de Mann & Whitney para la cuota de sedación. Se tomó un valor p de p<0,05 como indicación de la significación.

Protocolo

Tamaño del grupo, n = 12

Grupo 1: Referencia, haloperidol (1 mg/kg i.p.)

Grupo 2: Grupo de control del vehículo (2 ml/kg i.p.)

Grupo 3: Tetrabenazina (0,3 mg/kg i.p.)

Grupo 4: Tetrabenazina (1 mg/kg i.p.)

Grupo 5: Tetrabenazina (3 mg/kg i.p.)

Grupo 6: Tetrabenazina (10 mg/kg i.p.)

Grupo 7: Isómero C (0,3 mg/kg i.p.)

Grupo 8: Isómero C (1 mg/kg i.p.)

Grupo 9: Isómero C (3 mg/kg i.p.)

Grupo 10: Isómero C (10 mg/kg i.p.)

Grupo 11: Isómero B (0,3 mg/kg i.p.)

Grupo 12: Isómero B (1 mg/kg i.p.)

Grupo 13: Isómero B (3 mg/kg i.p.)

Grupo 14: Isómero B (10 mg/kg i.p.).

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\vskip1.000000\baselineskip

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(Tabla pasa a página siguiente)

Resultados

34

35

Los resultados demuestran que la tetrabenazina produce un efecto sedante dependiente de la dosis 45 minutos y 3 horas después de la administración, mientras que el Isómero B y el Isómero C no muestran efectos sedantes en ningún momento, aunque el Isómero C muestra un ligero y no significativo efecto hiperlocomotor 3 horas después de la administración.

Ejemplo 12 Composiciones Farmacéuticas (i) Formulación para tabletas-I

Una composición para tabletas que contiene una dihidrotetrabenazina de la invención se prepara mezclando 50 mg de la dihidrotetrabenazina con 197 mg de lactosa (BP) como diluyente y 3 mg de estearato de magnesio como lubricante y se comprime para formar una tableta de una manera conocida.

(ii) Formulación para tabletas-II

Una composición para tabletas que contiene una dihidrotetrabenazina de la invención se prepara mezclando el compuesto (25 mg) con óxido de hierro, lactosa, estearato de magnesio, almidón de maíz blanco y talco y se comprime para formar una tableta de una manera conocida.

(iii) Formulación para cápsulas

Se prepara una formulación para cápsulas mezclando 100 mg de una dihidrotetrabenazina de la invención con 100 mg de lactosa y rellenando con la mezcla resultante cápsulas de gelatina dura opacas estándar.

Claims (29)

1. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina.

2. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1, que está en una forma (+)-isomérica.

3. Composición que comprende 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1, estando la composición sustancialmente exenta de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina.

4. Composición según la reivindicación 3, caracterizada porque la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina es un (+)-isómero.

5. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 que es el isómero 2S,3S,11bR de fórmula (Ia):

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

6. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 que es el isómero 2R,3R,11bS de fórmula (Ib):

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

7. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 que es el isómero 2R,3S,11bR de fórmula (Ic):

\vskip1.000000\baselineskip

38

\newpage

8. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 que es el isómero 2S,3R,11bS que fórmula (Id):

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

9. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 en forma del Isómero A que tiene:

(a) las características espectroscópicas siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

(b) las características cromatográficas siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

y

(c) actividad óptica levorrotatoria.

\newpage

10. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 en forma del Isómero B que tiene:

(a) las características espectroscópicas siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\newpage

(b) las características cromatográficas siguientes:

44

y

(c) actividad óptica dextrorrotatoria.

11. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 en forma del Isómero C que tiene:

(a) las características espectroscópicas siguientes:

46

47

(b) las características cromatográficas siguientes:

48

y

(c) actividad óptica dextrorrotatoria.

\vskip1.000000\baselineskip

12. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 1 en forma del Isómero D que tiene:

(a) las características espectroscópicas siguientes:

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

(b) las características cromatográficas siguientes:

51

y

(c) actividad óptica levorrotatoria.

\newpage

13. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en forma de base libre.

14. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en forma de una sal de adición de ácido.

15. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según la reivindicación 14, caracterizada porque la sal es una sal metanosulfonato.

16. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en medicina o terapia.

17. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de trastornos hipercinéticos del movimiento o para el tratamiento de la depresión.

18. 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina para su uso según la reivindicación 17, caracterizado porque los trastornos hipercinéticos del movimiento son la enfermedad de Huntington, hemibalismo, corea senil, tic, disquinesia tardía o el síndrome de Tourette.

19. Composición farmacéutica que comprende una 3,11b-cis- dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Utilización de una 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos hipercinéticos del movimiento o para el tratamiento de la depresión.

21. Utilización según la reivindicación 20, caracterizada porque el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Huntington, hemibalismo, corea senil, tic, disquinesia tardía o el síndrome de Tourette.

22. Proceso para preparar 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 9 y 10, proceso que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (II):

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con un reactivo o reactivos adecuados para hidratar el doble enlace 2,3 del compuesto de fórmula (II) y a continuación, cuando se requiera, separación y aislamiento de una forma deseada del isómero de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina.

23. Proceso para preparar 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina según cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, 11 y 12, proceso que comprende someter un compuesto de fórmula (III):

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a condiciones de apertura del anillo del grupo 2,3-epóxido en el compuesto de fórmula (III) y después, cuando se necesite, separación y aislamiento de una forma deseada del isómero de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina.

24. Proceso para preparar un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 23, proceso que comprende la reacción de un compuesto alqueno de fórmula (II) según la reivindicación 22 con un agente oxidante adecuado para formar un grupo epóxido.

25. Proceso según la reivindicación 24, caracterizado porque el agente oxidante es un peroxiácido.

26. Proceso para preparar un compuesto de fórmula (II) según la reivindicación 22, proceso que comprende la deshidratación de una 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina con un agente deshidratante tal como un haluro de fósforo o un oxihaluro de fósforo.

27. Compuesto de fórmula (II):

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28. Compuesto de fórmula (III)

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29. Éster del ácido de Mosher de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.