RS50660B - Dihidrotetrabenazini i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže - Google Patents

Abstract

3,11 b-cis-dihidrotetrabenazin. Prijava sadrži još 28 patentnih zahteva.

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na nove izomere dihidrotetrabenazina, farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, postupke za njihovo dobijanje i terapeutsku upotrebu.

Stanje tehnike

Tetrabenazin (Hemijsko ime: 1,3,4,6,7,1 lb-heksahidro-9,10-dimetoksi-3- (2-metilpropil) -2H-benzo (a) hinolizin-2-on) se upotrebljava kao lek još od kasnih 50-ih. Prvobitno se koristio kao antipsihotik, tetrabenazin se trenutno upotrebljava za lečenje hiperkinetičkih poremećaja kao što je Huntington'ova bolest, hemibalizam, senilna horea, tikovi, tardivna diskmezija i Tourette'ov sindrom, videti na primer Jankovic et al., Sm. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156 (8): 1279-81 and Jankovic et al., Neurologv (1997) Feb; 48 (2): 358-62.

Primarno farmakološko dejstvo tetrabenazina je da smanji snabdevanje monoaminima (npr dopamina, serotonina, i norepinefrina) u centralnom nervnom sistemu inhibiranjem humanog vezikularnog monoamin transporter izoforma 2 (hVMAT2). Lek takođe blokira postsinapučke dopamin receptore.

Tetrabenazin je efikasan i bezbedan lek za lečenje različitih hiperkinetičkih poremećaja i, na suprot tipičnim neurolepticima, nije pokazano da izaziva tardivnu diskineziju. Ipak, t etral^azin ne pokazuje brojne sporedne efekte povezane sa dozom, uključujući izazivanje depresije, parkinsonizam, pospanost, nervozu ili anksioznost, inzomniju i u retkim slučajevima, neuroleptički maligni sindrom.

Centralni efekti tetrabenazina pokazuju sličnost sa efektima reserpina, ali se razlikuju od reserpina po tome što nema aktivnosti na VMAT1 transporteru. Nedostatak aktivnosti na VMAT1 transporteru znači da tetrabenazin ima manju perifernu aktivnost od reserpina i prema tome ne proizvodi VMATl-srodne sporedne efekte kao što je hipotenzija.

Hemijska struktura tetrabenazina je data na slici Slici 1 u daljem tekstu.

Jedinjenje ima hiralne centre na 3 i 1 lb atomima ugljenika i prema tome može teorijski da postoji u ukupno četiri izomerna oblika, kao što je prikazano na Slici 2.

Na Slici 2, steirahemija svakog izomera je definisana pomoću "R i S" nomenklature koju su razvili Cahn, Ingold and Prelog, videti Advanced Organic Chemistry by Jerry March, 4th Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, strane 109-114. Na Slici 2 i u tekstu predmetne prijave, oznake "R" ili "S"su date da bi se odredio položaj brojeva atoma uglljenika. Tako, na primer, RS je skraćenica oznake za 3R, 1 IbS. Slično, kada su prisutna tri hiralna centra, kao kod dihidrotetrabenazina opisanih u daljem tekstu. Oznake "R"ili "S" su naveđene4>rema redosledu atoma ugljenika 2,3 i 1 lb. Tako, 2S, 3R, 1 lbR izomer je kraće označen kao SRR i tako dalje.

Komercijalno dostupan tetrabenazin je racemska smeša RR i SS izomera i čini se da su RR i SS izomeri (u daljem tekstu pojedinačno ili zajedno označeni kao trans-tetrabenazin zato što atom vodonika na položajima 3 i 1 lb imaju relativnu trans orijentaciju) termodinamički najstabilniji izomeri.

Tetrabenazin ima donekle malu i varijabilnu bioraspoloživost. Produženo je metabolisan prilikom metabolizma prvog prolaza i obično se u urinu detektuje malo ili neizmenjen tetrabenazin. Glavni metabolit je dihiđrotetrabenazin (hemijski naziv: 2-hidroksi-3- (2-metilpropil)-l, 3,4, 6,7,11 b-heksahidro-9, 10- dimetoksi-benzo (a) hinolizin) koji je dobijen redukcijom 2-keto grupe u tetrabenazinu, i pretpostavlja se daje prvenstveno odgovoran za aktivnost leka (viđeti Mehvar et al., Drug Metab. Disp, 15,250-255 (1987) and J. Pharm. Sci., 76, No. 6,461-465 (1987) ).

Četiri izomera dihidrotetrabenazina su prethodno identifikovani i okarakterisani, svi vode poreklo od stabilnijih RR i SS izomera osnovnog tetrabenazina i imaju relativnutransorijentaciju između atoma vodonika na 3 i 1 lb položajima ) (viđeti Kilboum et al., Chiralitv, 9: 59-62 (1997) i Brossi et al., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, ppl793-1806(1958). Četiri izomera su (+) -a-dihidrotetrabenazin, (-)-a-dihidrotetrabenazin, (+)-p- dihiđrotetrabenazin i (-)-p-đihidrotetrabenazin. Smatra se da su strukture četiri poznata izomera dihidrotetrabenazina kao što je dato na slici 3.

Kilboum et al., (see Eur. J. Pharmacol., 278: 249-252 (1995) i Med. Chem. Res., 5: 113-126 (1994) ) su ispitali specifično vezivanje individualnih radioaktivno-obeleženih izomera dihidrotetrabenazina u mozgu svesnog pacova. Oni su pronašli daje (+)-ct- [<U>G] dihiđrotetrabenazin (2R, 3R,1 VoR)izomer nagomilan u đelovima mozga sa većim koncentracijama neuron membranskog dopamin transportera (DAT) i vezikularni monoamin transportera (VMAT2). Međutim, u suštini neaktivan (-)-ct-[HC] dihiđrotetrabenazin izomer je gotovo uniformno distribuiran u mozgu, što govori o tome da ne dolazi do specifičnog vezivanje za DAT i VMAT2.In vivoispitivanja povezana sainvitroispitivanjima pokazuju da izomer (+)-a-[<n>C] dihidrotetrabenazina ima K ; za [3H] metoksitetrabenazin >2000-puta veću nego Kj; za izomer (-)-a- [<U>C] dihidrotetrabenazina.

Do danas, koliko je prijaviocu poznato, izomeri dihidrotetrabenazina izvedeni od nesatbilnih RS i SR izomera (u daljem tekstu pojedinačno ili zajedno označeni kao cis-tetrabenazin zato što su atomi vodonika na položajima 3 i 11b u relativnojcisorijentaciji) tetrabenazina nisu prethodno izolovani i okarakterisani, i bološke aktivnosti ovih jedinjenja nisu objavljena.

Opis pronalaska

Nađeno je da izomeri diMdrotetrabenazina izvedeni od nestabilnih RS i SR izomera ("c£y"izomeri") tetrabenazina nisu samo stabilni već imaju neočekivano dobre biološke aktivnosti. Naime, određeni izomeri imaju profile receptor-aktivnosti koji ukazuju na brojne prednosti u odnosu na RR/SS tetrabenazina koji je trenutno u upotrebi. Na primer, nekoliko izomera, iako imaju visok afinitet za VMAT2, pokazuje veoma smanjen ili neznatno vezivanje dopaminskih receptom što ukazuje na to daje malo verovatno da povećavaju dopaminergičke sporedne efekte koji prate tetrabenazin. Ni jedan od izomera nije pokazao inhibiciju dopaminskih transportera (DAT). Dodatno, ispitivanja nekolicine izomera na pacovima su pokazala da oni nemaju neželjene sedativne sporedne efekte koje prate tetrabenazin. Uzrok nedostatka sedativne aktivnosti mogu da budu veoma mali afiniteto nekih izomera za adrenergičke receptore.

Dalje, dok je jedan od sporednih efekata tetrabenazina, depresija, nekoliko izomera dihidrotetrabenazina pokazuje afinitet za serotonin transporter (SERT) protein ukazujući na to da mogu da imaju antidepresivnu aktivnost.

Shodno tome, u prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje«}, 1 lb-cis- dihiđrotetrabenazin.

U drugom aspektu,pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 3, 11b-cis-dihidrotetrabenazin i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Pronalazak takođe obezbeđuje 3,1 lb-cis-dihiđrotetrabenazin u suštinski čistom obliku, na primer u izmernoj čistoći većoj od 90%, obično većoj od 95% i još većoj od 98%.

Izraz "izomerna čistoća " u ovom konteksta odnosi se na količinu prisutnog 3,1 lb- cis-dihidrotetrabenazina u odnosu na ukupnu količinu ili koncentraciju dihidrotetrabenazina svih izomernih oblika. Na primer, ako 90% od ukupnog dihidrotetrabenazina prisutnog u kompozicji je 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazin, onda je izomerna čistoća 90%.

Predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže3,1 lb- cis-dihiđrotetrabenazin u suštini bez 3,1 lb-/ra«5-dihidrotetrabenazin, preferentno manje od 5% 3, 1 lb-trans-dihidrotetrabenazina, još bolje manje od 3% 3, 1 lb-fra/is-diru'drotetrabenazinl, i najbolje manje od 1% 3, llb-trans-dihidrotetrabenazina.

U sleđećem apsketu, pronalazak obezbeđuje 3, 1 lb-cts-đihidrotetrabenazin za upotrebu u medicini ili terapiji (lečenju), na primer, za lečenje hiperkinetičkih poremećaja kao što je Huntington'ova bolest, hemibalizam, senilna horea, tikovi, tardivna diskinezija i Tourette'ov sindrom, ili za lečenje depresije.

U narednom aspketu, pronalazak obezbeđuje upotrebu 3,1 lb-cu-dihidrotetrabenazina za proizvodnju leka za lečenje hiperkinetičkih poremećaja kao što je Huntington'ova bolest, hemibalizam, senilna horea, tikovi, tardivna diskinezija i Tourette'ov sindrom, ili za lečenje depresije.

Izraz "3,1 lb-cis-" kao što je ovde upotrebljen označava da atomi vodonika na 3- i 1 lb-položajima strukture dihidrotetrabenazina su u relativnoj cis orijentaciji. Izomeri pronalaska su prema tome jedinjenja formule (I) i njihovi antipodi (likovi u ogledalu).

Postoje četiri moguća izomera dihidrotetrabenazina sa 3,1 lb-cis konfiguracijom i to su: 2S, 3S, 1 lbR izomer, 2R, 3R, 1 lbS izomer, 2R, 3S, 1 lbR izomer i 2S, 3R, 1 lbS izomer. Četiri izomera su izolovana i okarakterisana i, u sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje individualne izomere 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazina. Posebno, pronalazak obezbeđuje :

(a) 2S, 3S, llbR izomer 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazin formule (Ia) :

(b) 2R, 3R, 1 lbS izomer 3,1 lb-ris-dihidrotetrabenazin formule (lb) : (c) 2R, 3S, 1 lbR izomer 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazin formule (Ic): i (d) 2S, 3R, 1 lbS izomer 3,11 b-cis-dihidrotetrabenazin formule (Id) :

Individualni novi izomeri pronalaska se mogu okaratekrisati svojim spectroskopskim, optičkim i hromatografskim osobinama.

Preferentni izomeri su dekstrogjrni (+) izomeri.

Bez nukarivanja na neku posebnu apsolutne konfiguracije ili stereohemije, četiri nova izomera se mogu okarakterisati na sledeći način:

Izomer A

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21 °C) : levogiri (-) IR Spektar (čvrst KBr), 'H-NMR spektar (CDClj) i<13>C-NMR spektar (CDC13) u suštini kao što je opisano u Tabeli 1.

Izomer B

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21°C): đekstrogiri (+) IR Spektar (čvrst KBr),<!>H-NMR spektar (CDC13) i<I3>C-NMR spektar (CDC13) u suštini kao što je opisano u Tabeli 1.

Izomer C

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21°C) : đekstrogiri (+) IR Spektar (čvrst KBr), 'H-NMR spektar (CDCI3) i "C-NMR spektar (CDC13) u suštini kao što je opisano u Tabeli 2.

Izomer D

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21 °C): levogiri (-) IR Spektar (čvrst KBr), 'H-NMR spektar (CDCI3) i<13>C-NMR spektar (CDCI3) u suštini kao što je opisano u Tabeli 2.

ORD vrednosti za svaki izomer su date u primerima u daljem teksta ali treba napomenuti da su ove vrednosti date kao primer i mogu da variraju u zavisnosti od čistoće izomera i uticaja drugih promenljivih kao što su temperaturske fluktuacije i efekti moelkula rezidulanog rastvarača.

Enantiomeri A, B, C i D mogu da budu prisutni u suštini čistom obliku ili kao smeše sa drugim enantiomerima pronalaska.

Izrazi "enantiomerna čistoća" i "enantiomerno čist" u ovom kontektstu odnose se na količinu prisutnog datog enantiomera 3,1 lb-cw-dihidrotetrabenazina u odnosu na ukupnu količinu dihidrotetrabenazina svih enantiomernih i izomernih oblika. Na primer, ako je-90% od ukupnog dihidrotetrabenazina prisutnog u kompoziciji u obliku jednog enantiomera, onda je enantiomerna čistoća, 90%.

Kao primer, u svakom apsketa i realizaciji pronalaska, svaki individualni enantiomer odabran od Izomera A, B, C i D može da bude prisutan u enantiomernoj čistoći od najmanje 55% (npr. najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 100%).

Izomeri pronalaska takođe mogu da budu prisutni u obliku smeša jednog ili više Izomera A, B, C i D. Ove smeše mogu da budu racemske smeše ili ne-racemiske smeše. Primeri racemskih smeša obuhvataju racemske smeše Izomera A i Izomera B i racemska smeša Izomera C i Izomera D.

Farmaceutski prihvatljive soli

Osim ako kontekst zahteva durgačije tumačenje, referenca u predmetnoj prijavi koja upućuje na dihiđrotetrabenazin i njegove izomere, obuhvata u obim pronalaska ne samo slobodnu bazu dihidrotetrabenazina već i njegove soli, a posebno adicione soli kiselina.

Naznačene kiseline od kojih se dobijaju adicione soli kiselina, obuhvata kiseline koje imaju vrednosti za pKa manje od 3.5, a češće manje od 3. Na primer, adicione soli kiselina se mogu dobiti od kiselina koje imaju vrednosti za pKa u opsegu od + 3.5 do - 3. 5.

Preferentne adicione soli kiseline su one dobijene od sulfonskih kiselina kao što su metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, benzen sulfonska kiselina, toluen sultanska kiselina, kamfor sulfonska kiselina i naftalen sulfonska kiselina.

Jedna posebna kiselina od koje se mogu dobiti soli adicionih kiselina je metansulfonska kiselina.

Soli adicionih kiselina mogu se pripremiti prema postupcima koji su ovde opisani ili konvencionalnim hemijskim postupcima kao što su postupci opisani u Pharmaceutical Salts : Properties, Selection, i Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002. Generalno, ove soli se mogu dobiti reakcijom jedinjenja u obliku slobodne baze sa odgovarajućom bazom ili kiselinom u vodi ili organom rastvaraču, ili smeši ova dva; generalno, upotrebljeni su navođeni medijum kao što je etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril.

Soli su obično farmaceutski prihvatljive soli. Međutim, soli koje nisu farmaceutski prihvatljive se takođe mogu pripremiti kao intermedijerni oblici koji se naknadno mogu konvertovati u farmaceutski prihvatljive soli. Ove farmaceutski neprihvatljive soli takođe čine deo pronalaska.

Postupci za dobiianie izomera dihidrotetrabenazina

U sledećem aspektu, dat je proces (Proces A) za dobijanje dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska, koji obuhvata reakciju jedinjenja formule (II): sa reagensom ili reagensima koji su pogodni za hidrataciju 2,3-dvostruke veze u jedinjenje formule (II) i u daljem tekstu zahteva odvajanje i izolovanje željenog dihiđrotetrabenazin izomernog oblika.

Hidratacija 2,3-dvostruke veze se može izvesti bidroboracija upotrebom reagensa borana kao što je diboran ili boran-etar (npr. boran-tetraat\irofuran (THF) ) da bi se dobio intermeđijedni adukt alkil borana nakon čega sledi oksidacija adukta alkil borana i hidrolize u prisustvu baze. Hiđroboracija se obično izvodi u suvom polarnom ne-protičnom rastvaraču kao što je etar (npr. THF), obično ne na povišenoj temperaturi, na primer, sobnoj temperaturi. Adukt boran- alken je obično oksidovan pomoću reagensa oksidacije kao što je vođonik peroksid u prisustvu baze obezbeđujući tako izvor hidroksidnih jona, kao što je amonijum hidroksid ili hidroksiđ alkalnog metala, npr. kalijum hidroksid ili natrijum hidroksid. Redosled reakcija Procesa A: hidroboracija-oksidacija-hiđroliza obično daje izomere dihidrotetrabenazina gde su atomi vođonika na položajima 2- i 3- u relativnojtransorijentaciji.

Jedinjenja formule (II) mogu se dobiti redukcijom tetrabenazina pri čemu se dobija dihiđrotetrabenazin nakon čega sledi dehidratacija dihidrotetrabenazina. Redukcija tetrabenazina se može postići pomoću aluminijum hidridnog reagensa kao što je Iitijum aluminium hidrid, ili borhidridnog reagensa kao što je natrijum borohidrid, kalijum borohidrid ili borohidrid derivat, na primer alkil borohidrid kaoo što je Iitijumtri-se/t-butilborohidrid.

Alternativno, korak redukcije se može izvesti katalitičkom hidrogenacijom, na primer, iznad Raney nikla ili platina oksid katalizatora. Odgovarajuća stanja za izvođenje koraka redukcije detaljnije su opisana u daljem tekstu ili se mogu naći u US 2,843, 591 (Hoffmann-La Roche) and Brossi et al., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, ppl793-1806(1958).

Budući daje tetrabenazin koji je upotrebljen kao polazni materijal za reakciju redukcije obično u obliku smeše RR i SS izomera (tj.frans-tetrabenazin), dihiđrotetrabenazin dobijen u koraku redukcije će imati istotranskonfiguraciju oko položaja 3-i 1 lb- i imaće oblik jednog ili više poznatih izomera dihidrotetrabenazina kao što je dato na Slici 3. Tako Proces A može da obuhvati dehidrataciju poznatih izomera dihidrotetrabenazina, do alkena (II) i zatim "rehidrataciju" alkena (II) pod uslovima koji će dati tražene novecis

dihiđrotetrabenazin izomere pronalaska.

Dehidratacija dihidrotetrabenazina do alkena (II) može se izvesti pod različitim standardnim uslovima za dehidrataciju alkohola za dobijanje alkena, viđeti na primer J. March( idem)strane 389-390 i tamo navedene reference. Primeri datih uslova uključuju upotrebu reagensa za dehidarataciju bazioranog na fosforu kao što su fosfor halidi ili fosfor oksihalidi, npr. POCU i PCI5. Kao alternativa direktnoj dehidrataciji, hidroksilna grupa dihidrotetrabenazina s emože konvertovati u odlazeću grupu L kao što je halogen (npr.. hlor ili brora) i zatim izloženi naznačenim uslovima (npr. prisustvu baze) za eliminaciju H-L. Konverzija hidroksime grupe u halid može se postići primenom postupaka koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku -hemičaru, na primer, reakcijom sa ugljentetrahloridom ili ugljen tetrabromidom u prisustvu tri alkil ili triaril fosfina kao što je trifenil fosfin ili tributil fosfin.

Tetrabenazin koji je upotrebljen kao polazni materijal za redukciju u cilju dobijanja dihidrotetrabenazina, može se nabaviti iz komercijalnih izvora ili sintetisati prema postupcima koji su opisani u US 2,830, 993 (Hofrmann-La Roche).

Pronalazak takođe obezbeđuje proces (Proces B) za dobijanje dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska, pri čemu proces obuhvata izlaganje jedinjenja formule (III):

uslovima za otvaranje prstenan 2,3-epoksid grupe ujedinjenju formule (III), i dalje, po potrebi, razdvajanje i izolovanje željenog izomerog oblika dihidrotetrabenazina.

Otvaranje prstena se može izvesti u skladu sa poznatim postupcima otvaranja epoksidnog prstena. Međutim, trenutno preferentan postupak za otvaranje epoksidnog prstena je reduktivno otvaranje prstena koje se može postući upotrebom redukujućeg agensa kao što je boran-THF. Reakcija sa boran-THF-om može se izvesti u polarnom ne-protičnom rastvaraču kao što je etar (npr, tetrahiđrofuran) obično na temperaturi ambijenta, ovako dobijeni kompleksi borana su zatim hidrolizovani zagrevanjem u prisustvu vode i baze na temperaturi refluksa rastvarača. Proces B obično dovodi do dihiđrotetrabenazin izomera u kojima atomi vodonika na položajima 2-i 3 imaju relativnucisorijentaciju.

Epoksidna jedinjenja formule (III) mogu se dobiti epoksiđacijom alkena formule (II). Reakcija epoksidacije može se izvesti pod uslovima i sa reagensima koji su dobro poznati za prosečnog stručnjaka - hemičara, videti na primer J. March{ idem),str. 826-829 i tu navedene reference. Obično, per-kiselina kao što je meta-hloroperbenzojeva kiselina (MCPBA), ili smeša per-kiseline i neki oksidujući reagens kao što je perhloma kiselina, se može upotrebiti za izvođenje epoksidacije.

Kada su polazni materijali za prethodno date procese A i B smeše enantiomera, onda će proizvodi procesa obično biti parovi enantiomera, na primer, racemske smeše, moguće zajedno sa dijastereoizomernim nečistoćama. Neželjenoi dijastereoizomeri se mogu ukloniti tehnikama kao što je hromatografija (npr. HPLC) i individualni enantiomeri se mogu odvojiti različitim metodama koje su poznate prosečnom stručnjaku -hemičaru. Na primer, mogu se razdvojiti pomoću:

(i) hiralnom hromatografijom (hromatografija na hiralnoj podlozi); ili

(ii) formiranjem soli sa optički aktivnom hiralnom kiselinom, odvajanjem soli dva dijastereoizomera frakcionom kristalizacijom i zatim oslobađanje dihidrotetrabenazina iz soli; ili (iii) formiranjem derivata (kao što je estar) sa optički Čistim hiralnim derivatizujućim agensom (npr. agensom za esterifikaicju), razdvajanje dobijenih epknera (npr.hromatografijom) i zatim konverovanje derivata u mhiclrotetarbenazin.

Jedan postupak razdvajanja para enantiomera dobijenih pema svakom od Procesa A i B, i za koje je nađeno da su posebno efikasni (delotvomi), je da se esterifikuje hidroksilna grupa dihidrotetrabenazina sa optički aktivnim oblikom Mosher'ove kiseline, kao što je R (+) izomer prikazan niže, ili njegov aktivan oblik:

Dobijem' estri dva enantiomera đihidrobenazina se mogu razdvojiti hromatografijom (npr. HPLC) i razdvojeni estri su hidrlozovani dajući individualne izomere đihidrobenazina pomoću baze kao što je hidroksid alkalnog metala (npr. NaOH) u polarnom rastvaraču kao što je metanol.

Kao alternativa upotrebe smeše enantiomera kao što polaznih materijala u procesima A i B i zatim izvođenjem razdvajanja enantiomera, procesi A i B mogu se izvesti na pojedinačnom enantiomera kao polaznom materijalu dajući proizvode u kojima prevladava jedan enantiomer. Pojedinačni enantiomeri alkena (II) mogu se pripremiti izlaganjem RR/SS tetrabenazina stereoselektivnoj redukciji pomoću Iitijum tri-se/fc-butil borohidrida pri čemu se dobija smeša SRR i RSS enantiomera dihidrotetrabenazina, razdvajanje enantiomera (npr. frakcionom kristalizacijom) i zatim đehidratacijom izdvojenog enanatiomera dihidrotetrabenazina dobija se pretežno ili isključivo pojedinačan enantiomer jedinjenja formule (II).

Procesi A i B su detaljnije ilustrovani u Shemama 1 i 2 respektivno.

Shema 1 ilustruje dobijanje pojedinačnih izomera dihidrotetrabenazina koji imaju 2S, 3S, 11 bR i 2R, 3R, 1 lbS konfiguracije gde su atomi vodonika vezani za 2-i 3-položaje raspoređeni u relativnu trans orijentaciju. Ova reakciona shema obuhvata prethodno deri nišan Proces A.

Polazna tačka za redosled reakcija u Shemi 1 je komercijalno dostupan tetrabenazin (IV) koji je racemska smeša RR i SS optičkih izomera tetrabenazina. U svakom od RR i SS izomera, atomiv vodonika na položajima 3-i 1 lb- su raspoređeni u relativnu trans orijentaciju. Kao alternativa upotrebi komercijalno dostupnog jedinjenja, tetrabenazin se može sintetisati prema proceduri opisanoj u US patentu broj 2,830, 993 (posebno viđeti primer 11).

Racemska smeša RR i SS tetrabenazina je ređukovana pomoću borohidrid redukujućeg agensa Iitijum tri-sek-butil borohidrida(" L- Selectrid")dajući smešu poznatih 2S, 3R, llbR i 2R, 3S, 1 lbS izomere (V) dihidrotetrabenazina, od kojih je prikazan samo 2S, 3R, 1 lbR izomer zbog pojednostavljenja. Upotrebom stemo zahtevnijeg L-Selectriđa kao borohidridnog redukujećeg agensa pre nego natrijum borohidrida, dobijanje RRR i SSS izomera dihidro- tetrabenazina je minimizirana ili je potisnuta.

Izomeri ihidrotetrabenazina (V) reaguju sa reagensom za dehidrataciju, kao što je fosfor pentachlorid u ne-protičnom rastvaraču kao što je hloriran ugljovodonik (na primer hloroform ili dihlorometan, preferenmo dihlorometan) dajući nezasićeno jedinjenje (II) kao par enantiomera, od kojih je samo R-enantiomer prikazan u Shemi. Reakcija dehidratacije se obično izvodi na temperaturi ispod sobne temperature, na primer oko 0-5°C.

Nezasićeno jedinjenje (II) je zatim podvrgnuto stereoselectivnoj re-hidratciji za dobijanje dihidrotetrabenazina (VI) i njegovog lika u ugledalu ili antipoda (nije prikazan) gde su atomi vodonika na položajima 3- i 1 lb- u relativnojcisorijantaciji i atomi vodonika na položajima 2-i 3- su postavljeni u relativnutransorijentaciju. Stereoselektivna rehidratacija je postignuta procedurom hiđroboracije upotrebom boran-THF -a u tetrahidrofuranu (THF) za dobijanje intermedijernog kompleksa borana (nije prikazan) koji je zatim oksidovan vodonik peroksidom u prisustvu baz ekao što je natrijum hidroksid.

Početni korak prečišćavanja može se izvesti (npr. HPLC-om) dajući proizvod (V) sekvence reakcije rehhidratacije kao smešu 2S, 3S, 1 lbR i 2R, 3R, 1 lbS izomera od kojih je samo 2S, 3S, 1 lbR izomer prikazan na Shemi. Da bi se odvojitli izomeri, smeša je tretirana R (+) Mosher-ovom kiselinom, u prisustvu oksalil hlorida i dimetilaminopiridina (DMAP) u dihlorometanu dajući par dijastereoizomernih estara (VII) (od kojih je samo jedan dijastereoizomer prikazan) koji se zatim mogu razdvojiti HPLC-om. Individualni estri se zatim mogu hidrolizovati pomoću hidroksid alkalnog metala kao što je natrijum hidroksid pri čemu se dobija pojedinačan izomer (VI).

U varijacijama sekvence koraka prikazan na Shemi 1, nakon redukcije RR/SS tetrabenazina, dobij ena smeša enantiomera dihidrotetrabenazina (V) može se razdvojiti dajući individualne enantiomere. Razdvajanje se može izvesti formiranjem soli sa hiralnom kiselinom kao što je (+) ili (-) kamforsulfonska kiselina, razdvajanje dobijenih dijastereoizomera frakcionom kristalizacijom za dobijanje pojedinačnog enantiomera i zatim oslobađanje slobodne baze iz soli.

Odvojen enantiomer dihidrotetrabenazina s emože dehidratisai dajući pojedinačni enantiomer alkena (II). Naknadna rehidratacija alkena (II)će prvenstveno ili isključivo dati pojedinačan enantiomer cis- dihidrotetrabenazina (VI). Prednost ove varijacije je u tome da ne uključuje stvaranje estara Mosher'ove kiseline i tako izbegne hromatografsko razdvjanje koje se obično primenjuje za razdvajanje estara Mosher'ove kiseline.

Shema 2 ilustruje dobijanje individualnih izomera dihidrotetrabenazina koji imaju 2R, 3S, 1 llbR i 2S, 3R, 1 lbS konfiguracije gde su atomi vodonika vezani za 2- i 3-položaje u relativnojcisorijentaciji. Ova reakciona shema obuhvata prethodno definisan Proces B.

U Shemi 2, nezasićeno jedinjenje (II) je dobijeno redukcijom tetrabenazina pri čemu se dobijaju 2S, 3R, llbR i 2R, 3S, llbS izomeri (V) dihidrotetrabenazina i dehidratacijom sa PCI5na način opisan u prethodnoj Shemi 1. Međutim, umesto izlaganja jedinjenja (II) hidroboraciji, dvostruka 2,3 veza je konvertovana u epoksid reakcijom sameta-hloroperbenzojevom kiselinom (MCPBA) i perhlornom kiselinom. Reakcija epoksidacije je obično izvodi u alkoholnom rastvaraču kao što je metanol, obično oko sobne temperature.

Epoksid (VH) je zatim ozložen reduktivnom otvaranju prstena pomoću boran-THF -a kao elekrofilnog redukujućeg agensa dajući Lntermedijemi kompleks borana (nije prikazan) koji je zatim oksidovan i rascepljen dodatkom vodonik peroksida u prisustvu alkalija kao što je natrijum hidroksid dajući dihiđrotetrabenazin (VIII) kao smešu 2R, 3S, 1 lbR i 2S, 3R, 1 lbS izomera, od kojih je prikazan samo 2R, 3S, 11 bR zbog pojednostavljenja. Reakcija smeše izomera (VIII)sa R (+) Mosher'ovom kiselinom u prisustvu oksalil hlorid i dimeulaniinopiridina (DMAP) u dihlorometanu dalo je par epimernih estara (IX) (od kojih je prikazan samo jedan epimer) koji se zatim može odvojiti hromatografijom i hidrolizovati natrijum hidroksidom u metanom na način koji je prethodno opisan za Shemu 1.

Pretposatavlja se da su hemijski mtermedijeri (II) i (III) novi i predstavljaju dalje apskete predmetnog pronalaska.

Biološkeosobineiterapeutske primane

Tetrabenazin ispoljava svoje teraoeutske efekte inhibiranje veszikularnog monoamin transporter VMAT2 u mozgu i inhibiranjem pre-sinaptičkih i post- sinaptičkih dopaminskih receptom.

Novi zomeri dMdrotetrabenazinapredmetnog pmalaskasu takođe inhibitori VMAT2, sa Izomerima C i B proizvode najviši stepen inhibicije. Slično tetrabenazinu, jedinjenja predmetnog pronalaska imaju samo mali afinitet za VMAT1, VMAT izoform nađen u perifernim tkivima i nekim endokrinim ćelijama, ukazuijući tako da ne bi trebalo da proizvode sporedne efekte povezane sa reserpinom. Jedinjenja C i B takođe pokazuju ne-inhibitomu aktivnost na katehol O-metil transferazu (COMT), izoforme A i B monoamin oksidaze, i izoforme ld i lb 5- hidroksitriptamina.

Neočekivano, izomeri C i B takođe pokazuju značajno razdvajanaje VAMT2 i dopaminskih receptora tako da iako su visoko aktivnu u vezivanju VMAT2, oba jedinjenja pokazuju samo albu ili ne pokazuju dopamin receptor vezujuću aktivnost i nedostatak Dopamin Transporter (DAT) vezujuće aktivnosti. U stvari, ni jedan od izomera ne pokazuje značajnu DAT vezujuću aktivnost. Ovo ukazuje na to da jedinjenja mogu da nemaju dopaminergičke sporedne efekte koje proizvodi tetrabenazin. Izomeri C i B su ili slabo aktivni ili neaktivni kao inhibitori adrenergičkih receptora i ovo ukazuje na to da jedinjenja mogu da nemaju adrenergičke sporedne efekte koje prate tetrabenazin. U stvari,u lokomotornim ispitivanjima izvedenim na pacovima, tetrabenazin pokazuje sedativne efekte povezane sa dozom, dok je uočeno danema sedativnih efekata posle adminsitracije izomera B i C dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska.

Dalje, Izomer C i Izomer B su snažni inhibitori serotonin transporter proteina SERT. Inhibibicija SERT -a je jedan mehanizam po kojem antidepresanti poput fluoksetina (Prozac®) pokazuju svoje terapeutske efekte. Shodno tome, sposobnost Izomera C i B sa inhibiraju SERT ukazuje na to da ovi izomeri mogu da đeluju kao antidepresanti, u obeleženim kontrastima na tetrabenazin za koje je depresija poznat sporedan efekat.

Na osnovu ispitivanja sporvedenih do sada, predviđeno je da jedinjenja dihiđrotetrabenazin pronalaska će biti korisna u profilaksi ili lečenju oboljenja ili stanja za koja se tetrabenazin trenutno koristi ili predlaže. Tako, kao primer i bez ograničenja, jedinjenja dihidrotetrabenazina pronalaska se mogu upotrebiti za lečenje hiperkinetičkih poremećaja kao što je Huntington'ova bolest, hemibalizam, senilna horea, tikovi, tardivna diskinezija i Tourette'ov sindrom.

Takođe je predviđeno da jeđinejnja dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska mogu da budu korisna za lečenje depresije.

Jedinjenja će*e generalno administrirati obolelom subjektu/pacijentu, na primer čoveku ili životinji, preferentno čoveku.

Jedinjenja će se obično admimstrirati u količinama koje su terapeutske ili profilaktčki korisne i koje su generalno netoksične. Međutim, u određenim situacijama, benefiti administirranjima, jedinjenje dihiđrotetrabenazin predmetnog pronalaska prevazilazi nedostatke bilo kojih toksičnih ili sporednih efekata, u kom slučaju se može smatrati poželjnim administrirati jedinjenja u količinama koje su povezane sa stepenom toksičnosti. Tipična dnevna doza jedinjenja može da bude u opsegu od 0.025 miligrama do 5 miligrama po kilogramu telesne težine, na primer do 3 miligrama po kilogramu telesne težine, odnosno 0.15 miligrama do 5 miligrama po kilogramu telesne težine, mada se mogu administrirati veće ili manje doze po potrebi.

Na primer, početna doza od 12.5 mg se može administrirati 2 do 3 puta na dan. Doza se može povećati po 12.5 mg svakog dana tokom 3do 5 dana do postizanja maksimalne tolerisane i efikane doze za pojedince kao što odredi Iekar. Konačno, količina adnunistriranog jedinjenja će biti proporcionalna prirodi bolesti ili fiziološkog stanja koje se leči i terapeutskih benefita i prisustvo ili odsustvo sporednih efekata koji je nastao datim doznim režimom, i prepušten je diskreciji lekara.

Farmaceutske formulacije

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenja dihidrotetrabenazina kao što je u daljem tekstu definisano u obliku farmaceutskih kompozicija.

Farmaceutske kompozicije mogu da budu u bilo kom obliku koji je pogodan za oralnu, parenteralnu, topikalnu, intranazalnu, intrabronhijalnu, očnu, ušnu, rektalnu, intra-vaginalnu, ili transđermalnu administraciju. Kada su kompozicije namenjen za parenteralnu administraciju, mogu se formulisati za intravenozu, intramuskularnu, intraperitonealnu, subkutanu administraciju ili za direktnu distiribuciju u ciljni organ ih tkivo i to injekcijom, infuzijom ili na drugi način.

Faarmaceutski dozni oblici pogodni za oralnu administraciju su tablete, kapsule, kaplete, pilule, lozengete, sirupi, rastvori, sprejovi, praškovi, granule, eliksiri i suspenzije, sublingvalne tabl«te,.sprejovi, vaferiili flasteri i bukalni flasteri.

Farmaceutske kompozicije jedinjenja dihidrotetrabenazina pronalaska mogu se formulisati u skladu sa poznatim tehnikama, viđeti na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companv, Easton, PA, USA

Tako, kompozicije u obilku tableta mogu da sadrže jediničnu dozu aktivnog jedinjenja zajdno sa inertnim raszblaživačem ili nosačem kao što je šećer ili šećerni alkohol, tj.; laktoza, sukroza, sorbitol ili manitol; i/ih ne-šećerni razblaživač kao što je natrijum karbonat, kalcijum fosfat, talk, kalcijum karbonat, ili celuloza ili njihovih derivata kao što je metil celuloza, etil celuloza, hidroksipropil metil celuloza, i škrob kao što je kukuruzni škrob. Tablete takođe mogu da sadrže standardne sastojke kao što su vezivna sredstva i sredstva za granulaciju poput polivinilpirohdona, dezintegranti (npr. umreženi polimeri koji mogu da bubre kao što je umrežena carboksimetilceluloza), sredstva za klizenje (npr. stearati), konzervansi (npr. parabenz), antioksidanti (npr. BHT), puferi (na primer citratni puferi), i sredstva za penušanje, kao što su smeše citrat/bikarbonat. Ovi eksipijensi su dobro poznati i ne moraju se ovde detaljno opisivati.

Formulacije kapsula mogu da budu od tvrdog ili mekog želatina i mogu da sadrže aktivnu komponentu u čvrstom, polu-čvrstom, ili tečnom -obliku. Želatinske kapsule mogu se dobiti od životinjskog želtaina ili se mogu sintetisati ili dobiti od biljke.

Čvrsti dozni oblici (npr.; tablete, kapsule itd.) mogu se obložiti ili mogu da budu neobloženi, ali obično su obloženi, na primer, zaštitnim filmom (npr.vosak il uljani lak) ili oblogom koja kontroliše oslobađanje aktivne supstance. Obloge (npr. polimer tipa Eudragit ™) mogu se prilagoditi tako da oslobađaju aktivnu komponentu na željenom mestu unutar gastro-intestinalnog trakta. Prema tome, obologa se može odabrati tako da će se degradirati pod određenim uslovima pH unutar gastrointestinalnog trakta, na tak način selektivno oslobađajući jedinjenje u stomaku ili u ileumu ili u duodenumu.

Umesto ili pored obloge, lek se može staviti i u čvrsti matriks koji sadrži agens za kontolu oslobađanja, na primer, agens za odloženo oslobađanje koji se može prilagoditi tako da selektivno oslobađan jedinjenja koji zavise od kiselosti ili baznosti u gastrointestinalnom traktu. Alternativno, materijal za matriks ili obloga za usporeno oslobađanje može biti u obliku erodirajućeg pclimera (npr. polimer anhidrida maleinske kiseline) kojeje u suštini kontinualno erodiran po prolasku doznog oblika kroz gastrointestinalni trakt.

Kompozicije za topikalnu primenu uključuju meleme, kreme, sprejeve, flastere, gelove, kapi i umetke (na primer intraokulami umetci). Ove kompozicije semogu formulisati u skladu sa poznatim postupcima.

Kompozicije za parenteralnu adrninistraciju su obično prisutne kao sterilni vodeni ili uljani rastvori ili fine suspenzije, ili mogu biti u obliku fino podeljenog sterilnog praha za pripremanje sterilnih vodenih injekcija.

Primeri formulacija za rektalnu ili intra-vaginalnu aćininistraciju su čepići i supozitoriji koji mogu, na primer, da budu u obliku materijala koji se može presovati u kalupima ili voskastog materijal koji sadrži aktivno jedinjenje.

Kopozicije za adrninistraciju inhalacijom mogu biti u obliku praha ili tečnosti za inhaliranje ili praškasti sprejova, i mogu se adnunistrirati u standardnom obliku pomoću pumpice za inhalanje praha ili uređaji za aerosol. Ovi uređaji su poznati. Za administraciju inhaliranjem, praskaste formulacije obično sadrže aktivno jedinjenje zajedno sa inertnim čvrstim praškastim razblaživačem kao što je laktoza.

Jedinjenja pronalaska će biti u jediničnom doznom obliku i, kao takvi, občino će da sadrže dovoljno jedinjenja da obezbeđi željeni nivo biološke aktivnost. Na primer, formulacija namenjena za oralnu administraciju može da sadrži od 2 miligrama do 200 miligrama aktivne komponente, odnosno od 10 miligrama do 100 miligrama, na primer, 12.5 miligrama, 25 miligrama i 50 miligrama.

Aktivno jedinjenje će se adnunistrirati pacijentu (na primer čoveku ili životinji) u količini koja je dovoljna za postizanje željenog terapeutskog efekta.

PRIMERI

Sleđeći primeri ilustruju sintezu i osobine jedinjenja d^idrotetrabenazina predmetnog pronalaska.

PRIMER 1

Pobijanje 2S. 3S. 1 lbR i 2R. 3R, 1 lbS izomera dihidrotetrabenazina

1A. Redukcija RR/SS Tetrabenazina

IM L-Selectride® u tetraMdrofuranu (135 ml, 135 mmol, 2.87 ekv. ) je polako dodat tokom 30 minuta u mešani rastvor racemata RR/SS tetrabenazin (15 g, 47 mmol) u etanolu (75 ml) i tetrahiđrofuranu (75 ml) na 0 °C. Po završenom dodavanju, smeša je mešana na 0 °C tokom 30 minuta i zatim ostavljena da se ugreje do sobne temperature.

Smeša je sipana preko smrvljenog leda (300 g) i dodata je voda (100 ml). Rastvor je ekstrahvoan sa dietil etrom (2 x 200 ml) i kombinovani etarski ekstrakti su isprani vodom (100 ml) i delimično osušeni iznad anhidrovanog kalijum karbonata. Sušenje je završeno pomoću anhiđroganog magnezijum sulfata i, posle filtracije, rastvarač je uapren pod sniženim pritiskom (zaštićen od svetla, temperatura < 20 °C) dajući bledo žuti čvrsti ostatak.

Čvrsti ostatak je razmućen u petrol etru (30-40 °C) i profiltriran dajući belu praškastu suptancu (12 g, 80%).

1B. Debidraciia redukovanog Tetrabenazin

Fosfor pentahlorid (32.8 g, 157.5 mmol, 2.5 ekv) je dodat uporcijama tokom 30 minuta u mešani rastvor redukovanog tetrabenazina, proizvoda iz Primera 1A (20 g, 62.7 mmol) u dihlorometanu (200 ml) na 0 °C. po završenom dodavanju, reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 30 minuta i rastvor je polako dodat u 2M vodeni rastvor natrijum karbonata sa smrvljenim ledom (0 °C). Po završenom izdvajanju kiselog gasa smeši je povećana baznost (oko pH 12) dodatkom čvrstog natrijum karbonata.

Alkalni rastvor je ekstrahovan etil acetatom (800 ml) i kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata. Posle filtracije, rastvarač je uparen pod sriiženim pritiskom dajući braon ulje, koje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silika gel, etil acetat) dajući polu-čist alken kao žut čvrsti ostatak (10.87 g, 58%).

1C. Hidratacija sirovog alkena iz Primera 1B

Rastvor sirovog alkena (10.87 g, 36.11 mmol) iz Primera 1B u suvom THF -u (52 ml) na sobnoj temperaturi je tretiran u kapima sa IM boran-THF-om (155.6 ml, 155.6 mmol, 4.30 ekv). Reakciona smeša je mešana 2 sata, dodata je voda(20 ml) i rastvoru je povećana baznost do pH 12 dodatkom 30% vodenog rastvora natrijum hidroksida.

Vodeni rastvor 30% vodonik peroksida (30 ml) je dodat u mešanu baznu reakcionu smešu i rastvor je zagrevan da refiuksuje 1 sat pre nego što je ostavljen da se ohladi. Dodata je voda (100 ml) i smeša ekstrahovana etil acetatom (3 x 250 ml). Organski ekstrakti su kombinovani i osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije ratvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom dajući žuto ulje (9 g).

Ulje je prečišćeno preparativnom HPLC (Kolona: Lichrospher Si60,5 pm, 250 x 21.20 mm, mobilna faza : heksane : etanol: dihlorometan (85 :15: 5); UV 254 nm, protok: 10 ml min"<1>) na 350 mg po injektiranju, zatim koncentrovanjem frakcijaod interesa pod vakuumom. Dobijeno ulje je zatim rastvoreno u etru i još jednom koncentrovano pod vakuumom dajući racemat dihidrotetrabenazina kao žutu penu (5.76 g, 50%).

1D. Dobijanje derivata Mosher' ovog estra

R- (+)-a-metoksi-a-trifluorometilfenil sirćetna kiselina (5 g, 21.35 mmol), oksalil blorid

(2.02 ml) i DMF (0.16 ml) su dodati u anhidrovani dihlorometan (50 ml) i rastvor je mesa na sobnoj temperaturi 45 minuta. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskm i ostatku je dodat anhidrovan dihlorometan (50 ml) još jednom. Dbieni rastvorj e ohlađen u ledenom kupatilu i dodat je dimetOammopiridin (3.83 g, 31.34 mmol), pa zatim prethodno osušen

rastvor (sitom od 4A) čvrstog proizvoda iz Primera 1C (5 g, 15. 6 mmol) u anhidrovanom dihlorometanu. Posle mešanja na sobnoj temperaturi od 45 minuta, dodata je voda(234 ml) i smeša ekstrahovana etrom (2 x 200 ml). Etarski ekstrakti su osušeni iznad anhidroanog magnezijum sulfata, propušteni kroz sloj slika gela i proizvod eluiran etrom.

Prikupljen etarski eluat je koncentrovan pod sniženim pritiskom dajući ulje koje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silika gel, heksan: etar (10:1)). Uparavanjem prikupljanjih frakcija od interesa, sa kolone i uklanjanjem rastvarača pri sniženom pritisku dobija se čvrsti ostatak koji je dalje prečišćen hrmoatografijom na koloni (silika gel, heksan: etil acetat (1 :1)) dajući tri glavne komponente koje su deluimično razdvojene u Mosher'ove estar pikove 1 i 2.

Preparativna HPLC ove tri komponente (kolona: 2 x Lichrospher Si60,5 um, 250 x 21.20 mm, mobilna faza. heksan: izopropanol (97: 3), UV 254 nm; protok: 10 ml min"<1>) sa nanetih 300 mg, pa zatim koncentzrovanje frakcija od interesa u vakuumu dobijaju se čisti derivati Mosher'ovih estara

Pik 1 (3.89 g, 46.5%)

Pi 2 (2.78 g, 33%)

Frakcije koje ogovaraju ova dva pika su podvrgnuti hidrolizi da bi se oslobodili individualni izomeri dihidrotetrabenazina i identifiikovani i okarakterisani kao Izomeri A i B. Izomeri A i B imaju sledeće strukture

IE. Hidroliza Pika 1 za dobijanje Izomera A

Vodeni 20% rastvor natrijum hiđroksida (87.5 ml) je dodat u rastvor Mosher'ovog estra pik 1 (3.89 g, 7.27 mmol) u metanolu (260 ml) i smeša je mešana i zagrevana da refluksuje 150 minuta. Posle hlađenja do sobne temperature dodata je voda (200 ml) i rastvor je ekstrahovan etrom (600 ml), osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, koncentrovan pod sniženim pruskom.

Ostatak je rastvoren u etil acetateu (200 ml), rastvor je ispran vodom (2 x 50 ml), organska faza je osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, koncentrovan pod sniženim pruskom dajući žutu penu.Ovaj materijal je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, gradijent eluiranje etil acetat: heksan (1: 1) do etil acetat). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač uparen pod sniženim pritiskom. Ostatku je dodat etar i rastvarač jeuparen pri sniženom pritisku još jednom dajući Izomer A kao beličastu penu (1. lg.47%).

Izomer A, za koji se pretpostavlja da ima ili 2S, 3S, 1 lbR ili 2R, 3R, 1 lbS konfiguraciju (apsolutna stereohemija nije određena) je okarakterisan sa 'H-NMR,<I3>C-NMR,TR, masenom spektrometrijom, hiralnom HPLC i ORD. Podaci dobijeni od IR, NMR i MS za izomer A su dati u Tabeli 1 i podaci dobijeni sa hiralnom HPLC i ORD su dati u Tabeli 3.

IF. Hidroliza Pika 2 za dobijanje Izomera B

Vodeni 20% rastvor natrijum hiđroksida (62.5 mije dodat u rastvor Mosher'ovog estra pik 2 (2.78 g, 5.19 mmol) u metanolu (185 ml) i smeša je mešana i zagrevana da refluksuje 150 minuta. Posle hlađenja do sobne temperature dodata je voda (142 ml) i rastvor je ekstrahovan etrom (440 ml), osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, koncentrovan pod sniženim prtiskom.

Ostatak je rastvoren u etil acelatu (200 ml), rastvor je ispran vodom (2 x 50 ml), organska faza je osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, koncentrovana pod sniženim prtiskom. Dodat je petrol etar (30-40 °C) u ostatak i rastvor jekoncentrovan u vakuumu još jednom dajući Izomer B kao belu penu (1.34 g, 81%).

Izomer B, za koji se pretpostavlja daje ima ili 2S, 3S, 1 lbR ili 2R, 3R, 1 lbS konfiguraciju (nije određena apsolutna stereohemija), je okarakterisan sa "H-NMR, "C-NMR, IR, raasenom spektrometijom, hiralnom HPLC i ORD. Podaci dobijeni od IR, NMR i MS za Izomer B su dati u Tabeli 1, a podaci dobijeni od hiralne HPLC i ORD dati su u Tabeli 3.

PRIMER 2

Pobijanje 2R. 3S. llbR i 2S. 3R. 1 lbS izomera Dihidrotetrabenazina

2A. Pobijanje 2 3- Dehtdrotetrabenazin

Rastvor koji sadrži racemsku smešu (15 g, 47 mmol) RR i SS enantiomera tetrabenazina u tetrahidrofuranu podvrgnut je redukciji sa L- Selectride® prema postupku iz Primera 1A dajući smešu 2S, 3R, 1 lbR i 2R, 3S, 1 lbS enantiomera dihidrotetrabenazina kao belu praškastu suptancu (12 g, 80%). Delimično prečišćen dihiđrotetrabenazin je zatim dehidratisan sa PCI5prema postupku iz Primera 1B dajući polu-čistu smešu 1 lbR i 1 lbS izomera 2, 3-dehidrotetrabenazina (1 lbR enantiomer koji je prikazan u daljem tekstu) kao žutu čvrstu suptancu (12.92 g, 68%). 2B. E<p>oksidacija sirovog alkena iz Primera 2A

U mešani rastvor sirovog alkena iz Primera 2A (12,92 g, 42.9 mmol) u metanolu (215 ml) dodat je rastvor 70% perhlorne kiseline (3.70 ml, 43 mmol) u metanolu (215 ml). U reakcionu smešu je dodata 77% 3-hloroperoksibenzojeva kiselina (15.50 g, 65 mmol) i dobijena smeša je mešana 18 sati na sobnoj temperaturi zaštićena od svetla.

Reakciona smeša je dodata u zasićen vodeni rastvor natrijum sulfita (200 ml) i dodata je voda (200 ml). U nastalu emulziju je dodat hloroform (300 ml) i povećana je baznost smeše dodatkom zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (400 ml).

Organski sloje je sakupljen i vođena faza je isprana sa hloroformom (2 x 150 ml). Kombinovani hloroformski slojevi su osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, rastvarač je uparen pod nsiženim pritiskom dajući braon ulje (14.35 g, prinos > 100%-verovatno zaostali rastvarač uproizvodu). Ovaj materijalje upotreblljen bez daljeg prečišćavanja.

2C. Reduktivno otvaranje prstena epoksida iz 2B

Mešani rastvor sirovog epoksida iz Primera 2B (14.35 g, 42.9 mmol, pretposataljajući daje prinos 100%) u suvom THF-u (80 ml) je pažljivo tretiran sa IM boran/THF (184.6 ml, 134.6 mmol) tokom 15 minuta. Reakcijaje mešana dva sata, dodata je voda (65 ml) i rastvor je zagrevan da refluksuje 30 minuta, uz mešanje.

Posle hlađenja, u reakcionu smešu je dodat 30% rastvor natrijum hiđroksida (97 ml), pa zatim i 30% vodeni rastvor vodonik peroksida (48.6 ml) i smeša je mešana i zagrevana da refluksuje još 1 sat.

Ohlađena reakciona smeša je ekstrahovana etil acetatom (500 ml) osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije ratvarač je uparen pod sniženim pritiskom dajući ulje. U ulje je dodat heksan (230 ml) i rastvor je ponovo koncentrovan pod sniženim pritiskom.

Uljani ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel etil acetat). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen još jednom hrmatografijom na koloni (silika gel, gradijent, heksan do etra). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarači upareni pod sniženim pritiskom dajući bledo žuti čvrsti ostatak (5.18 g, 38%).

2D. Dobijanje derivata Mosher' ovih estara 2Rs3S 1 lbR i 2S, 3R, 1 lbS izomera

dihidrotetrabenazina

R- (+)-a-metoksi-o-trifluorometilfenil sirćetna kiselina (4.68 g, 19. 98 mmol), oksalil

hlorid (1.90 ml) i DMF (0.13 ml) su dodati u anhidrovani dihlormetan (46 ml) i rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 45 minuta. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatku je dodat u anhidrovan dihlormetan (40 ml) još jednom. Dobijem rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i dodat je dimetilaminopiridin (3.65 g, 29.87 mmol) pa zatim prethodno osušeni rastvor (propištanjem kroz sito od 4A) u anhiđrovanom dihlormetanu (20 ml) čvrstog proizvoda iz Primera 2C (4.68 g, 14.6 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi od 45 minuta, dodata je voda (234 ml) i smeša je ekstrahovana etrom (2 x 200 ml). Etarski extrakt je osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, propušten korz sloj silika gela i proizvod je eluiran etrom.

Prikupljeni eluat je koncentrovan pod sniženim pritiskom dajući ulje koje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silika gel, heksan: etar (1: 1) ). Uparavanjem prikupljenih frakcija od interesa, sa kolone i uklanjanjem rastvarača pod sniženim pritiskom dobijena je ružičasta čvrsta suptanca (6.53 g)

Preparativna HPLC čvrstog ostataka (Kolona: 2 x Lichrospher Si60,5 um, 250 x 21.20 mm; mobilna faza heksan: izopropanol (97: 3); UV 254 nm; protok: 10 ml min"<1>) nanetih 100 mg pazarim koncentrovanjm frakcija od interesa u vakuumu dobijen je čvrsti ostatak koji je razmućen u petrol etru (30-40 °C) i sakupljen filtacijom u cilju dobijanja čistih derivata Mosher'ovih estara.

Pik 1 (2.37 g, 30%)

Pik 2 (2.42 g, 30%)

Frakcije koje ogovaraju ova dva pika su podvrgnuti hidrolizi da bi se oslobodili individualni izomeri dihidrotetrabenazina i identifiikovani i okarakterisani kao izomeri C i D. Izomeri C i D imaju sleđeće strukture

2F. Hidroliza Pika 1 za dobijanje izomera C

20% vodeni rastvor natrijum hiđroksida (53 ml) je dodat u mešani rastvor Mosher'ovog estra pik 1 (2.37 g, 4.43 mmol) u metanolu (158 ml) i smeša je jmešana na refluksu 150 minuta. Nakon hlađenja u reakcionu smešu je dodata voda (88 ml) i dobijeni rastvor ekstrahovan etrom (576 ml).Organski ekstrakti su osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom U ostatak je dodat etil acetat (200 ml) i rastvor ispran vodom (2 x 50 ml). Organski ratvor je osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle fitlracijc rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom.

Ovaj ostatak je tretiran petrol etrom (30-40 °C) i dobijeni suspendova čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom. Fittrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i druga serija suspendedovanog Čvrstog ostatka je sakupljena filtracijom. Kombinovani su profiltrirani Čvrsti ostaci i osušeni pod nsiženim pritiskom dajući Izomer C (1. 0 g, 70%).

Izomer C, za koji se pretpostavlja da ima ili 2R, 3S, 1 lbR ili 2S, 3R, 1 lbS konfiguraciju (apsolutna stereohemija nije određena), okaraktersan je sa 'H-NMR,<13>C-NMR, IR, masenom spektrometrijom, hiralnom HPLC i ORD. Podaci dobijeni od IR, NMR i MS za Izomer C su dati u Tabeli 2, a podaci dobijeni od hiralne HPLC i ORD dati su u Tabeli 4.

2G. Hidroliza Pika 2 za dobijanje izomera D

20% vodeni rastvor natrijum hiđroksida (53 ml) je dodat u mešani rastvor Mosher'ovog estra pik 2 (2.42 g, 4.52 mmol) u metanolu (158 ml) i smeša je mešana na refluksu 150 minuta. Nakon hlađenja e u reakcionu smešu je dodata voda (88 ml) i odbijenii rastvor je ekstrahovan etrom (576 ml). Organski ekstrakt je osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtriranja, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. U ostatak je dodat etil acetat (200 ml) rastvor je ispran vodom(2 x 50 ml). Organski rastvor je osušen izna anhidrovanog magnezijum sulfata i posle flitriranja rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom.

Ovaj ostatak je tretiran petroletrom (30-40 °C) i dobijeno suspendovano ulje narandžaste boje je sakupljeno filtracijom. Čvrsti ostatak je rastvoren u smeši etil acetat: heksan (15: 85) i prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, gradijent etil acetat: heksan (15: 85) do etil acetata). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je razmućen u petrol etru (30-40 °C) i dobijena uspenzija je sakupljena filtracijom. Sakupljen čvrsti ostatak solid je osušen pod sniženim pritisko dajući tako Izomer D kao belu čvrstu suptancu (0.93 g, 64%).

Izomer D, za koji se pretpostavlja da ima ili 2R, 3S, 1 lbR ili 2S, 3R, 1 lbS konfiguraciju (aposlutna stereohemija nije određena),okarakterisan je sa 'H-NMR,<13>C-NMR, IR, masenom spektrometrijom, hiralnom HPLC i ORD. Podaci dobijeni od IR, NMR i MS za Izomer D su dati u Tabeli 2, a podaci dobijeni od hiralne HPLC i ORD dati su u Tabeli 4.

In Tabelama 1 i 2, infracrveni spektri su određeni metodom KBr tableta.

'H NMR spektri su određeni u rastvorima u deuterizovanom hloroformu na Varian Gemini NMR spektrometru (200 MHz.).<13>C NMR spektri su određeni u rastvorima deuterizovanom hloroformu na Varian Gemini NMR spektrometru (50MHz). Maseni spektri su određeni na Micromass Platform II (ES+ uslovi) spektrometru. U Tabelama 3 i 4, dobijene su Optical Rotatorv Dispersion slike na Optical Activitv PoIAAr 2001

instrumentu u metanolnom rastvoru na 24°C. Merenja HPLC retencionih vremena izvedena su HP1050 HPLC hromatografu sa UV detektorom.

PRIMER 3

Alternativni postu pci za dobijanje izomera B i dobijanje Mezilatnc soli

3A. Redukcija RP/ SS Tetrabenazina

1M L-Selectride™ u tetrahiđrofuranu (52 ml, 52 mmol, 1.1 ekv.) je pažljivo dodat tokom 30 minuta u ohlađen (ledeno kupatilo), mešani rastvor racemata tetrabenazina (15 g, 47 mmol) u tetrahiđrofuranu (56 ml). Po završenom dodavanju, smeša je ostavljen da se ugreje do sobne temperature i mešana još Šest sati. TLC analiza (silika gel, etil acetat) pokazala je da su zaostale veoma male količine polaznih materijala

Smeša je dodata u mešanu smešu izmrvljenog leda (112 g), vođe (56 ml) i glacialne sirćetne kiseline (12.2 g). Dobijeni žuti rastvor je isppran etrom (2 x 50 ml) i povećana mu je baznost dodatkom čvrstog natrijum karbonata (ca 13 g). Pet-etar (30-40 °C) (56 ml)je dodat u smešu uz mešanje i sirov p-DHTBZ je prikupljen filtracijom kao beli čvrsti ostatak.

Sirov čvrsti ostatak je rastvoren u dihlrometanu (ca. 150 ml) i dobijeni rastvor je ispran vodom (40 ml), osušen pomoću anhidrovanog magnezijum sulfata , profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom na oko 40 ml. Dobijena je gusta suspenzija bele čvrste supstance. Pet-etar (30-40 °C) (56 ml) je dodat i suspenzija je mešana petnaest minuta na laboratorijkoj temperaturi . Proizvod je sakupljen filtracijom i ispiran na filteru do snežno-belog upotrebom pet-etra (30-40°C) (40 to 60 ml) pre sušenja na vazđuhu na sobnoj temperaturi dajući p-DHTBZ (10.1 g, 67%) kao bele čvrste supstance. TLC analiza (silika gel, etil acetat) je pokazala samo jednu komponentu.

3B. Pobijanje i frakciona kristalizacija oli kamforsulfonske kiseline racemskog P-DHTBZ

Proizvod iz Primera 3A i 1 ekvivalent (S)- (+)-Kamfor-10-sulfonske kiseline su rastvoreni uz zagrevanje u minimalnoj količini metanola. Dobijeni rastvor je ostavljen da se ohladi i zatim pažljivo razblažen etrom do završetka stvaranja čvrstog taloga. Dobijena bela kristalna čvrsta supstanca je prikupljena filtracijom i isprana etrom pre sušenja.

So kamforsulfonske kiseline (10 g) je rastvorena us meši vrućeg apsolutnog etanola (170 ml) i metanoli (30 ml). Dobijeni rastvor je mešan i ostavljenda se ohladi. Posle dva sata formirani talog je sakupljen filtracijom, kao bela kristalna čvrsta supstanca(2.9 g). Uzorak kristalnog materijala je promućkan u levku za odvajanje sa viškom zasićenog vodenog rastvora natrijum karbonata i dihlorometana. Organska faza je odvojena, osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profiltrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je sprašen pomoću pet.retar.(30-40°C) i organski rastvor je koncentrovan još jednom. Analiza soli hiralnom HPLC izvršena je na Chirex (S) - VAL i (R) -NEA 250 x 4.6 mm koloni, i heksan: etanol (98: 2) eluent pri brzuini protoka od 1 ml/minuti pokazala je daje izolovan p-DHTBZ obogaćen jednim enantiomerom (e. e. ca. 80%).

Obogaćena so kamforsulfonske kiseline (14 g) je rastvorena u vrućem apsolutnom etanolu (140 ml) i dodat je propan-2-ol (420 ml). Dobijeni rastvor jepromešan i talog je počeo da se formira u toku jednog minuta. Smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i mešana jedan sat. Dobijeni talog je pirkupljen filtracijom,ispran etrom i osušen dajući belu kristalnu supstancu (12 g).

Kristalni materijal je promućkan u levku za odvjanje sa viškom zasićenog vodenog rastvora natrijum karbonata i dihlorometanom.. Organske faze su odvojene, osušene iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profiltrirane koncentrovane pod sniženim prtiskom. Ostatak je sprašen dodatkom pet.-etra (30-40°C) i organski rastvor je još jednom koncentrovan dajući (posle sušenja u vakuumu.) (-f-)-P-DHTBZ (6.6 g, ORD +107. 8°). Izlovani enantiomer ima e. e. >97%.

3C. Pobijanje izomera B

Rastvor fosfor pentahlorida (4.5 g, 21.6 mmol, 1. 05 ekv) u dihlormetanu (55 ml) je kontinualno dodat u toku deset minuta u mešani, ohlađen (kupatilo led-voda) rastvor proizvoa iz Primera 3B (6.6 g, 20.6 mmol) u dihlormetanu (90 ml). Po završetku dodavanja, dobijeni žuti rastvor je mešan još deset minuta pre nego stoje sipan u snažno mešanu smešu natrijum karbonata (15 g) u vodi (90 ml) i smrvljenog leda (90 g). Smeša je mešana još 10 minuta i prebačena u levak za odvajanje.

Kada su faze odvojene, braon dihlormetanski sloj je uklonje, osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dajući sirovi intermeđijer alkena kao braon ulje (ca. 6.7 g). TLC analiza (silika gel, etil acetat) pokazuje da u sirovom proizodu nije zaostao (+)-p-DHTBZ.

Sirovom alkenu je dodat (u atmosferi suvog azota) u anhidrovan tetrahidrofuran (40 ml) i dodat je rastvor borana u THF -u (1 M rastvor, 2.5 ekv, 52 ml) uz mešanje tokom pentaset minuta. Reakciona smeša je zatim mešana na sobnoj temperaturi dva sata. TLC analiza (silika gel, etil acetat) je pokazala da u reakcionoj smeši nije zaosto intermedijerni alken.

Rastvor natrijum hiđroksida (3.7 g) u ovdi (10 ml) je oddat u mešanu reakcionu smeš, nakon čega je dodat vodeni rastvor vodonik peroksida(50%, ca. 7 ml) i nastala dvo-fazna smeša je mešana na refluksu jedan sat. TLC analiza organske faze u tom momentu (silika gel, etil acetat) pokazuje prisustvo proizvoda sa Rf kao što je očekivano za Izomer B. Karakteristična nepolarna komponenta je takođe primećena.

Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature pa je zatim prebačena u levakza odvjanje. Gornji organski sloj je uklonjen i koncentrovanpod sniženim pritiskom da bi seupario veći deo THF-a. Ostatku je dodat etar (stabilizovan (BHT), 75 ml), ispran vodom (40 ml), osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, proflltriran i koncentrovan pod sniženimpritiskom dajući bledo žuto ulje (8. 1 g).

Žuto ulje je prečišćeno na hromatografskoj koloni (silika gel, etil acetat: heksan (80: 20), sa povećanjem do 100% etil acetata) i željne frakcije sa kolone su sakupljene, kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom dajući bledo ulje koje je tretirano etrom (stabilizovano, 18 ml) i koncentrovano pod sniženim pritiskom dajući tako Izomer B kaoo bledo žutu čvrstu penu (2.2 g).

Hiralna HPLC pod uslovima datim u Primeru 3B potvrdila je daje Izomer B đobijen u cnantiomemom višku (e. e. ) većem od 97%.

Optička rotacija je merena na Bellingham Staniey ADP220 polarimetru i izmeren je [eto] od+123. 5°.

3D. Dobijanje mezilatne soli Izomera B

Metansulfonatna so Izomera B je dobijena rastvaranjem smeše 1 ekvivalenta Izomera B iz Primera 3C i 1 ekvivalenta metan sulfonske kiseline u minimalnoj količini etanola i zatimje dodat dietiletar. Dobijeni beli talog je sakupljen filtracijom i osušen u vakuumu dajući mezilatnu so u prinosu od oko 85% i čistoće ( HPLC-om) od oko 96%.

PRIMER 4

Skrining na aktivnost vezivanja VMAT- 2 pomoću probe vezivanja f3H]

Dihidrotetarbenazina

Dihiđrotetrabenazin je veom snažan i selektivan inhibitor VMAT-2, i vezuje se visokim afinitetom (opsega nM) za njegov vezikulami transporter. [<3>H] Dihidro- tetrabenazin je više godina uspešno korišćen kao radioligand za obeležavanje VMAT-2 u mozgu ljudi, goveda i gldara. (e. g. Scherman et al. J. Neurocheni. 50,1131-1136 (] 988); Near etal. Mol. Pharmacol. 30,252-257 (1986); Kilboum et al. Eur. J. Pharmacol. 278,249-252 (1995); and Zucker et al. Life Sci. 69,2311 - 2317 (2001)).

Četiri izpmera dihidrotetrabenazina, izomeri A, B, C i D su testirani na svoju sposobnost da inhibiraju VMAT-2 transporter prema probi opisanoj u daljem tekstu.

Postupci i materijali

Pripremljene su membrane prednjeg mozga odraslog pacova (vrsteWistar)u suštini kao stoje opisao Chazot et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 45,605-610. Vezikulame membrane striatuma su pripremljene u suštini kao Što je opisano Roland et al. (2000), JPET293, 329-335. 10 pg membrana je inkubirano na 25°C sa [<J>H] dihidrotetrabenazinom (18-20 nM) u 50mM HEPES pH 8.0 (test pufer), tokom 60 minuta, i vezani radioligand je sakupljen przom filtracijom pod vakuumom na GF/B staklenim filterima. Nespecifično vezivanje je određeno u paralelnim uzorcima uprisustvu 2 uM neobelbeženog tetrabenazina. Radioaktivnost je merena na tečnom scintilacionom p-brojaču. Pun opseg koncentracija (log i polu-Jog jedinice) četiri test jedinjenja (Izomeri A, B, C i D) su testirane (opseg: 10""-1 O^M) u triplikatu. Test jedinjenja i tetrabenazin su rastvoreni u DMSO u koncentraciji od 10 mM, i od ovog osnovnog rastvora pripremljena su razblaženja u puferu. Izvedena su trri nezavisna eksperimenta za svako jedinjenje. Podaci su analizirani i kriva fitovana pomoću GraphPad Prism 3.2 paketa.

Rezultati

Inicijalno,pirpremljen je preparat membrane (Chazot et al., 1993) o prednjeg mozga odraslog pacova P2 i analizirane kao što jeopisano u originalnom protokolu. Ovo je dalo veoma nizak nivo specifične aktivnosti vezivanja.

Pripremljen je preparat vezikula striatuma odraslog pacova, što je dalo značajan nivo stabilnih specifičnih mesta vezivanja [<3>H] Dihiđrotetrabenazin (5-6 pmol/mg proteinu). Ovo se može dobro porediti sa objavljenim podacima (Roland et al., 2000), ovaj preparat je zatim okrišćen za sve sledeće analize (probe).

Podaci su dati kao srednja vrednosti SD za tri nezavisna eksperimenta. Vrednosti za Kjsu određene na osnovu objavljenih striatalnih vrednosti Kokod pacova od 1.2 nM (Roland et al., 2000).

Ukupan farmakološki profil ukupnih Kj vrednosti je Izomer C > Izomer B > Izomer D » Izomer A.

Dalje, i Izomer B i Izomer A daju plitke krive kompeticije, koje su najbolje fitovane zatwo- site bindingmodel.

Izomer A pokazuje visoki afinitet (Ki= 59 nM) i nizak afinitet za mesto (Ki< 5.9 uM afinitet), svako doprinosi do oko 50% ukupnih mesta. Ovo može đa ukaže na to da Izomer A može da razlikuje različita stratialna mesta vezivanja VMAT-2.

PRIMER 5

VMAT funkcionalan analiza

A. VMAT2 Funkcionalan analiza

Stratialne sinaptičke vezikule pacova su pripremljene kao što je opisano u Primeru 3. Tako, preparat striatalne membrane P2 pacova (Chazot et al., 1993) je resuspendovan i homogenizovan u ledeno-hladnoj destilovanoj vodi. Osmolamost je odnovljena dodatkom 25 mM HEPES i 100 mM kalijum tartrata (pH 7.5,4C). Preparat je zatim centrifugiran 20 minuta na 20,000 x g (4 °C). Dobijena S3 frakcija je uklonjena, dodat je magnezijum sulfat (do krajnje koncentracije od 1 mM, pH 7.5, 4 °C), i smeša je centrifugirana na 100,000 x g, 45 minuta. Krajnja P4 frakcija sadrži sinaptičke vezikule za analizu.

Alikvot od 100 u.1 (oko 2.5 ug proteina) sinaptičkih vezikula je prethodno inkubirano sa rastućim koncentracijama test jedinjenja C i B (sveže pripremljenih kao osnovni( stock)rastvor od IO"<2>M u DMSO) tokom 30 minuta (opseg koncetracija 10"<9>M - IO"4 M), i zatim još 3 minuta u osnovnom puferu (25 mM HEPES, 100 mM kalijum tartrat, 1. 7 mM askorbinska kiselina, 0.05 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 2 mM ATP-Mg<2+>, pH 7.5), u prisustvu [<J>H] dopamina (30 nM lajanja koncentracija) na 30 °C. Reakcija je prekinuta dodatkom ledeno-hladnog pufera pH 7.5, koji sadrži 2 mM MgSC-4 uemsto 2 mM ATP-Mg<2+>, i brzom flitracijom kroz VVhatman -ove filtere natopljene 0.5% polietileneiminom. Filteri su isprani tri puta sa hladnim puferom pomoću Brandel Harvester. Radioaktivnost "uhvaćena" na filterima je izbrojana pomoću tečnog scintilacionog brojača i nespecifično vezivanje je određeno merenjem apsorpcija vezikulanog [<3>H] dopamina na 4 °C. Postupak je zasnovan na onom koji je opisan u Ugarte YV et al. (2003)Eur. J. Pharmacol. 472,165-171. Selektivna apsorpcija VMAT-2 je definisana pomoću 10 uM tetrabenazina.

Jedinjenje C (prividni pICso= 18 ± 2 nM) i jedinjenje B (prividni pIC5o= 30 ± 3 nM) inhibiraju apsorpciju [<3>H] dopamina u stratialnim vezikuiama pacova preko VMAT- 2 transportera sa funkciondriim sfinitetima (profil C > B) slično njiihovim odgovarajućim afinitetima vezivanja određenim pomoću analize vezivanja [<3>H] Dihidrotetrabenazina.

B. VMAT1 fukvionalna analiza

Postoje ograničena prirodna tkiva koja poseduju sam VMAT1, izolovan od VMAT2. Međutim, tetrabenazin pokazuje najmanje 2Q0Tputa veći afinitet za VMAT2 u poređenju sa VMAT1, i ova diksriminacija se može upotrebni za blokiranje uticaja VMAT2 -a i funkcionalnoj analizi (Erickson et al. (1996) PNAS (USA) 93,5166-5171). Adrenalne ćelije hromafina su izolovane od mladih odraslih SD pacova kao što je opisano u Moshharov et al. (2003)JNeurosci.23,5835-5845. tako, adrenalne žlezde su iseckane u ledeno hladnom PBS, kapsula i korteks žlezda su uklonjene i preostale medule su iseckane. Posle višestukog ispiranja sa PBS-om, tkivo je inkubirano sa rastvorom kolagenaze IA bez Ca<2+>(250 U/ml) tokom 30 minuta na 30 °C uz pažljivo mešanje. Digerirano tkivo je isprano tri puta i disocirane ćelije su centriguirane na 3000 rpm pri čemu se formiraju pelete, koje su resuspendovane u PBS-u. Vazikulane frakcije su izolovane na isti način onom koji je opisan za pripremanje preparata mozga.

100 ul (oko 2.5 pg proteina) sinaptičkih vezikula j e preinkubirano sa rastućim koncentracijama test jedinjenja (pripremljenih kao što je prethodno opisano za analizu vezivanja) tokom 30 minuta (opseg koncentracija IO"<9>M -10"<4>M). Analiza je izvršena za 3 minuta na 30 °C u osnovnom buferu (25 mM HEPES, 100 mM kalijum tartrat, 1.7 mM askorbinske kiseline, 0.05 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 2 mM ATP-Mg<2+>, pH 7.5), uprisustvu [<3>H] dopamina (30 nM krajnja koncetracija). Apsorpcija [<3>H] dopamina je merena u prisustvu 1 OuM tetrabenazina (selektivno blokira VMAT2 na ovoj koncentraciji). Nespecifi;na apsorpcija je određena merenjem apsorpcije vezikularnog [<3>H] dopamina na 4 °C. Reakcija je zatim prekinuta dodatkom ledeno hladnog pufera pH 7.5, koji sadrži 2 mM MgSCMumesto 2 mM ATP-Mg<2+>, i brzom flitracijom kroz Whatman -ove filtere natopljene 0.5% polietileneiminom. Filteri su isprani tri puta sa hladnim puferom pomoću Brandcl Harvester. Radioaktivnost "uhvaćena" na filterima je izbrojana pomoću tečnog scintilacionog brojača

U prisustvu 10 uM Tetrabenazina, i jedinjenje B i jedinjenje C slabo inhibiraju apsorpciju [<3>H] dopamina , vrednosti IC50su veće od 10"<5>M za oba jedinjenja. Ovo ukazuje na to da oba jedinjenja imaju mali (slab) afinitet za VMAT-1. Dalje, podaci pokazuju da oba jedinjenja imaju najmanje 2-reda veličine selektivnosti za VMAT-2 u odnosu na VMAT-1.

PRIMER 6

Is<p>tivania vezivanja receptor i transporter proteina

Četiri izomera dihiđrotetrabenazin, izomeri A, B, C i D su podvrgnuti analizi testiranja njihove sposobnosti da se vežu za receptore i transporter proteine opisane u daljem tekstu. Rezlutati su dati u Tabeli 6

(a) Adrenergički o2A Receptor:

Referenca: S. Uhlcn etal.J. Pharmacol. Exp. Ther.,271: 1558-1565 (1994)

Izvor: Humani rekombinantni insekt Sf9 ćelije

Ligand: 1 nM [<3>H] MK-912

Nosač: l%DMSO

Vreme/temperatura inkubacije: 60 minuta@ 25 °C

Inkubacijom pufer: 75mM Tris-HCI, pH 7.4,12. 5mM MgC12, 2mM EDTA Nspecifični ligand: 10uMWB-4101

Kd : 0.6 nM

Bmax : 4.G pmola/mg proteina

Specifično vezivanje: 95%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti:<>>50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

(b) Adrenergički a2B Receptor:

Referenca: S. Uhlen et al.,Eur. J. Pharmacol,33 (1) : 93-1-1 (1998)

Izvor: Humane rekombinantne CHO-K1 ćelije

Ligand: 2.5 nM [3H] Rauwolscine

Nosač : 1 % DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 60 minuta@ 25 °C

Inkubacioni pufer: 50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 12. 5mM MgC12, pH 7.4, 0.2%

BSAna25°C

Nespecifični ligand: lOpMPrazosin

Kj: 2.1 nM

Bmax: 2. 1 pmole/mg protein

Specifično vezivanje: 90%

Metod kvantitacije: vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti:<>>50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

(c)Dopamine Dl Receptor:

Reference: Dearry et al.,Nature,347: 72-76, (1990)

Izvor: Humane rekombinantne CHO ćelije

Ligand: 1.4 nM [3H] SCH-23390 Vehicle: 1 % DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 2sata @ 37 °C

Inkubacioni pufer: 5 0 mM Triš-HCl, pH 7.4,150 nM NaCl, 1.4 nM askorbinska

kiselina, 0.001% BSA

Nespecifični ligand: 10 uM (+) -butaklamol

Ka: 1.4 nM

Bmax : 0.63 pmole/mg protein

Specifično vezivanje: 90%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

(d)DopaminD21,Receptor:

Referenca: Bunzo et al., Nature, 336: 783-787 (1988)

Izvor: Humane rekombinantne CHO ćelije

Ligand: 0.16 nM [3H] Spiperone

Nosač: l%DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 2 sata@ 25 °C

Inkubacioni pufer: 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 150 nM NaCl, 1.4 nM askorbinska

kiselina, 0.001% BSA

Nespecifični ligand: 10 pM Haloperidol

Kd: 0.08 nM

Bmax : 0.48 pmole/mg protein

Specifično vezivanje: 85%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili irihibicije

(e)Dopamin D3Receptor:

Referenca: Sokoloffet aL,Nature, 347:146-151, (1990)

Izvor: Human recombinant CHO cells

Ligand: 0.7 nM [3H] Spiperone

Nosač : 1% DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 2sata@ 37 °C

Inkubacioni pufer: 50 mM Tris-HCI, pH 7.4,150 nM NaCl, 1.4 nM askorbinska

kiselina, 0.001% BSA

Nespecifični ligand: 25 aM S (*)-Sulpiride

K4: 0. 36 nM

BnBM : 1.1 pmol/mg proteina

Specifično vezivanje: 85%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili inhibicije (f)Imidazolin I2(Centralni) Receptor:

Referenca: Brovvn et al.,Brit. J. Pharmacol, 99:803-809, (1990)

Izvor: cerebralni korteksJVistarpacova

Ligand: 2 nM [3H] Idazoksan

Nosač: l%DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 30 minuta® 25°C

Inkubacioni pufer: 50 mM Tris-HCI, 0.5 mM EDTA, pH 7.4 na 25 °C Nespecifični ligand: 1 uM Iđazoxan

Kd: 4nM

BnvK: 0.14 pmola/mg proteina Specifično vezivanje: 85%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

(g)Sigma <tiReceptor:

Referenca: Ganapathy et al.,Pharmacol. Exp. Ther.,289: 251 -260, (1999) Izvor : Humane jurkat ćelije

Ligand: 8 nM [3H] Haloperidol

Nosač: l%DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 4 sata@ 25 °C

Inkubacioni pufer: 5 mM K2HPO4/KH2PO4 pufer pH 7.5

Nespecifični ligand: 10 uM Haloperidol

K4: 5.8 nM

Bno«: 0. 71 pmola/mg proteina

Specifično vezivanje: 80%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili inliibicije

(h) Sigma02Receptor:

Referenca: Hashimoto et al.,Eur. J. Pharmacol.,236: 159-163, (1993) Izvor: MozakWistar pacova

Ligand: 3 nM [3H] Ifenprodil

Nosač: l%DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 60 rninta@ 37 °C

Inkubacioni pufer: 50 mM Tris-HCI, pH 7.4

Nespecifični ligand: 10 uM Ifenprodil

K4:4.8 nM

Bm«: 1. 3 pmole/mg protein

Specifično vezivanje: 85%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

(i)Serotonin Transporter(SERT):

Referenca: Gu et al.,J. Biol Chem.,269 (10): 7124-7130, (1994)

Izvor: Human recombinant HEK-293 cells

Ligand: 0.15 nM [1251] RTI-55

Nosač: l%DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 3 sati @ 4 °C

Inkubacioni pufer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris HC1, luM Leupeptin, 10 uM

PMSF, pH 7.4

Nespecifični ligand: 10 pM Imipramin

Kj: 0. 17 nM

Bm,: 0.41 pmola/mg proteina

Specifično vezivanje: 95%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti: > 50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

(j) Dopamine Transporter(DAT):

Referenca: Giros etal, Trends Pharmacol. Sci.,14,43-49 (1993)

Gu et al.,J. Biol. Chem.,269 (10): 7124-7130 (1994)

Izvor: Humane rekombinantne CHO ćelije

Ligand: 0. 15 nM [,2SIJ RTI-55

Noisač: l%DMSO

Vreme/temp. inkubacije: 3sata@ 4 °C

Inkubacioni pufer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris HC1, 1 uM Leupeptin, 10, uM

PMSF, pH 7.4

Nespecifični ligand: 10 uM Nomifensin

Ka: 0. 58 nM

BmsK"• 0.047 pmola/mg proteina

Specifično vezivanje: 90%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum tačnosti:<>>50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

PRIMER 7

Ispitivanje enzimske akitvnosti

Izomeri B i C su testirani na svoju sposobnost da inhibiraju enzime uključene u procesiranju monoarnina u CNS-u, taČnije Katehol O-metil transferazu (COMT), Monoamin Oksidazu A i Monoamin Oksidazu B. Metode analize koje su ovde upotrebljen su opisane u daljem tekstu, a rezultati su dati u Tabeli 7.

( a ) InhibiclJa kateholO-metil traosferaze ( COMT)

Izvor: Svinjska jetra

Supstrat: 3 mM katehol + S-adenozil-L- [<3>H] metionin

Nosač: 1% DMSO

Pred-inkubaciono vreme/temp.: nema

Vreme inkubacije: 60 minuta @37 °C

Inkubacioni pufer: 100 mM kalijum fosfat, 10 mM MgCl2,3 mM DTT koji sadrži 12

jednica/ml adenozin đeaminaze, pH 7.4

Metod kvantitacije: Kvantitacija [<3>H] guiakola

Kriterijum tačnosti: >50% maksimalne stimulacije ili irihibicije

( bi inhibiciiaMonoamin OksiđazeMAO-A

Izvor: Humani rekombinant

Supstrat: 50 pM kmuramin

Vebicle: l%DMSO

Pred-inkubaciono vreme/temp. 15 minuta @ 37 °C

Vreme inkubacije: 60 minuta @ 37 °C

Inkubacioni pufer: 100mMKH2PC>4,pH7.4

Metod kvantitacije Spekttofluorimetrijska kvatitacija 4-hidroksihinolina Kriterijum tačnosti: >50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

( clInhibiciia Monoamin Oksiđaze MAO- B

Izvor Humani rekombinant

Supstrat: 50pM kmuramin

Nosač: 1%DMS0

Pred-inkubaciono vreme/temp.: 15 minuta@37 °C

Vreme inkubacije: 60 minuta @ 3 7 °C

Inkubacioni pufer: 100 mM KH2PO4, pH 7.4

Metod kvantitacije: Spektrofluoirmetrijska kvatitacija 4-mcfroksftmolina Kriterijum tačnosti: >50% maksimalne stimulacije ili inhibicije

PRIMER 8

Celijska ispitivanja

Sposobnost izomera B i C da inhibiraju apsorpciju serotonina (5-Mdroksitriptamina) humanim embrionskim ćelijama bubrega je merena pod sledećim uslovima:

Cilj: Humane HEK-293 ćelije

Nosač: 0.4 % DMSO

Inkubaciono vreme/temp: 10 minuta @ 25 °C

Inkubacioni pufer 5mM Tris-HCI, 7.5 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5.4 mM

KC1,1.2 mM CaCl2,1.2 mM MgS04, 5 mM glukoza, 1 mM

askorbinska kiselina, pH 7.1

Metod kvantitacije: kvantitacija apsorpcije [<3>H] serotonina

Kriterijum tačnosti: > 50% inhibicija apsorpcije [<3>H] serotonina u odnosu na

odgovor fluksetina.

Rezultati

Jedinjenje B se<p>okazalo kao antagonist i proizvodi 56 % inhibicije apsorpcije serotonina pri koncentraciji od 10 uM. Jedinjenje B ima IC50od 7.53uM.

Jedinjenje C se takođe pokazalo kao antagonist i prozvodi 86 % inhibicije apsorpcije serotonina prikoncentraciji od 10 uM. Jedinjenje B ima IC50od 1.29 pM.

PRIMER 9

5- HT uvir analiza vezivanja

Sposobnost Jedinjenja B i Jedinjenja C da se veže za 5-HTjd/ibreceptore je testirana pomoću analize (probe) koja je zasnovana na onoj koju je opisao Millan, MJet al.(2002)Pharmacol. Biochem. Behav.71,589-598. [N-metil 3H] GR-125743 je upotrebljen kao rađioliogand za 5-HTiDi 5-HTlBreceptore. Membrane prednjeg mozga P2odraslog SD pacova (Chazot et al., 1993) su koriSćene u ovoj probi (analizi). Upotrebljen je pufer 50 mM Tris-HCI, pH 7.7 na sobnoj temperaturi koji sadrži 4 mM kalcijum hlorid, 0.1% askorbinska kiselina and 10 uM pargilin. 5-HT (10 uM) je upotrebljen da definiše ne-specifično vezivanje. Inkubacija sa 1 nM [<3>H] GR-125743 je trajala 1 sat na sobnoj temperaturi, i reakcija je prekinuta brzom fitlracijom pomoću Brandel Harvester kroz GF/B filterr koji su prethodno natopljeni sa 0. 1 % polietileneiminom, nakon tri ispirinanja sa ledeno hladnim puferom (kojem je dodat 0.1% BSA). Opseg doza koji je upotrebljen je 10'<10>- lO^M. Dobijene krive su analizirane pomoćuGraphPad Prism 4 package.Oba jedinjenja B i C pokazuju slabu zamenu za [<3>H] [N-metil] GR- 125743 vezivanje za membrane prednjeg mozga (IC50vrednosti >\ 0AM), što ukazuje na to da B i C imaju mali afinitet za 5-HTid/breceptore.

PRIMER 10

Određivanje intestinalne permeabilnosti izomera A. B. C i D Dihiđrotetrabenazin pomoću

analize apsorpcije Caco- 2

Analiza apsorpcije Caco-2 je dobro utvrđen sistem zain vitroprocenuin vivointestinalne apsorpcije lekova-viđeti Meunier et al.,Cell Biology and Toxicology,11:187-194, Wilset al, CellBiology and Toxicology,10: 393-397, anđ Greset al, Pharm Sci,15 (5): 726-732.

Analiza se oslanja na sposobnosti Caco-2 ćelija da diferenciraju u enterocite kada se gaje na a mikropornom filteru tokom perioda od oko 21 dan. Tokom perioda gajenja, ćelije Caco-2 pođležu spontanim morfološkim i biohernijskim promenama, koje proizvode polarizovan monosloj sa dobro đefinisanirn četkastim pokrovom na apikalnoj površini, kao i čvrsti ćelijski spoj. Shodno tome, ove ćelije se mogu upotrebni kaoin vitromodel za analizu permeabilnosti (propustljivosti) leka.

Apsorpcija duž monosloja Caco-2 može se meriti u dva smera: apikalno-do-bazolateralnog ili bazolatelarnog-do-apikalnog, dodavanjem jedinjenja u apikalnu ili bazolateralnu komom, respektivno. U različitim bremenskim tačkama, sakupljeni su uzorci od komore za prijem za analizu brzine apsoropcije kao što je mereno očiglednim koeficijentom permeabilnosti( Papp)duž monosloja.

Vrednosti Papp reflektira kombinaciju testirane permeabilnosti proizvoda kroz transćelijske (kroz ćelijske mebrane) Lparaćelijske (duž čvrstog spoja između ćelija) putanje. Relativan doprinos ovih putanja zavisi od pKa, Koeficijenta raspodele (log D), molekulsnog radijusa, i promene testiranog proivoda na datom pH. Vrednosti Papp mogu se upotrebiti za kategorizaciju jedinjenja na osnovu njihove permeabilnosti kroz monoslojeve Caco-2.

Očigledni koeficijenti permeabilnosti (Papp) četiri izomera A, B, C i D dihidrotetrabenazina pri 50 uM određeni su pomoću Caco-2 model apsorpcije i kategorizovani su u odnosu na referentna jedinjenja niske, srednje i visoke permeabilnosti. Upotrebljenis u radioaktivno obeleženi referentni standardi manitol (niska), salicilna kiselina (srednja) i testosteron (visoka) za utvrđivanje kategorizacije permeabilnosti. Vrednosti Papp za svaki testirani proizvod dihidrotetrabenazina su procenjene merenjem koncentracije u komorama donora i prijema posle 1 sata. Apsorpcija je određena na pH 7.4 duž ćelijskog monosloja u apikalno-do-bazolateralnom smeru. Caco-2 ćelije su pripremljene za procenu vrednosti Papp-a i gajene su 26 dana na Transwell insertima u pločama sa 12-ležišta. Celovitost monosloja je proverenapre i posle analize apsorpcije prema metodma transepitelialne električne otpornosti (Ohm-cm<2>) iLucifer Yellow.

Materijali i postupci

Osnovni( stock)rastvori manitola, salicilne kiseline i testosterona su pripremljeni u metanolu na 50 mM. Na dan izvođenja analize referentni standardi su razblaženi u Hank'ovom uravnoteženom rastvoru soli (HBSS), pH 7.4 do krajnje koncentracije od 50uM. Radioaktivno-obeleženi 14C-manitol,<3>H-testosteron i 14C-salicilna kiselina su zatim dodati u svoje odgovarajuće neobeležene medijume tako da imaju krajnju specifičnu aktivnost od 0.35- 0.65 pCi/rnL. Uzorci izomera dihidrotetrabenazina su pripremljeni u koncentracijama od 50 mM u DMSO. Svaki osnovni rastvor je dalje razblažen u HBSS puferu (pH 7.4) do krajnje radne koncentracije od 50 uM.

Suspenzija Caco-2 ćelija je pripremljena na sledeći način. Jedna ampula sa Caco-2 imcijalnim ćelijama ID No. Caco-29-080299 od prolaznog broja 29 (American Type Culture Collection (VA, USA) je odmrznut i stavljen u sredinu za razvoj kulture u sud od 150 cm<2>koji sadrži međijum za gajenje Caco-2. Na preseku, sredina za razvoj kulture je uklonjena i ćelije su isprane sa 5 ml PBS-a. Ćelije su odvojene nakon dodavanja i inkubacije sa 0.25 % tripsm-EDTA (2.0 ml po sudu) oko 10 minuta na 37 °C. Odvajanje ćelija je praćeno pod mikroskopom i zaustavljeno dodatkom 1-0 mL sredine za razvoj kulture Caco-2 ćelija. Vijabilitet i koncentracija su određene pomoću testa tripan plavo. Nakon što je određena gustina i vijabilitet ćelija, Caco-2 ćelije su razblažene u sredini pogodnoj za razvoj kulture do krajnje rane koncentracije od 2.0 x 105 ćelija/ml. Sredina za razvoj Caco-2 sadrži Dulbecco's Mođified Eagle Medium, 10% fetalni goveđi serum, 100 uM ne-esencijalne amino kiseline, 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina.

Costar polikarbonat membrane (veli;ina pora 0. 4 um) su pre-ekvilibrisane sa sredinom za razvoj Caco-2 tokom 1 sata na 37 °C u inkubatoru savodenim jacketedinkubatorom sa 5% CO2. Sadržaj apikalne komore je uklonjen i zamenjen sa 500 ul suspenzije Caco-2 ćelija (200 000 ćelija/ml). Ćelije su dalje održavane u sredini za razvoj kulture toko 26 dana na 37 °C u vodenom jacketed inkubatoru sa 5% CO2.

Pre analize, svi monoslojevi su dva puta isprani sa HBSS i meren je njihov transepitelialni električni otpor (TEER) pomoćuMillicell- ERS meter.Vrednosti TEER -a dobijene u odsustvu ćelija su oduzete kao pozadinski signal. Samo monoslojevi sa vrednostima za TEER preko 150 Ohm-cm<2>su upotrebljeni za eksperiment analize apsorpcije.

Svi eksperimenti apsorpcije su izvedeni u triplikatu na pH 7.4Brzina apsorpcije za svaki referentni standard i dihiđrotetrabenazin test prozvod us određeni u apikalnom-do-bazolateralnom smeru. Alikvoti (100 ul) svakog radnog rastvora (referentni standari i test proizvodi od 50<p>M) su ostavljeni sa strane na početku analize za određivanje početne koncentracije (Q>).

Eksperimenti za određivanje apsorpcije su započeti zamenom sadržaja komore donora sa 500 ulHanks Balanceđ Salt Solutionkoji sadrži test proizvode ili referentna jedinjenja. Ćelije su vraćene u CO2inkubator za analizu aprocije. Uzroci odlOOpl su sakupljeni iz komore za prijem i komore donora posle 1 sata i upotrebljeni su određivanje procenta regeneracije. Radioaktivno-obeleženi referentni standardi, manitola, salicilne kiseline i testosterona su upotrebljeni kao kontrole i za komparativnu kategorizaciju test proizvoda dihidrotetrabenazina.

Na kraju eksperimenta apsorpcije, integritet svakog ćelijsko monosloja je određen praćenjem (monitoringom) propuštanjem Lucifer YeIlow sa apikalno-do-bazolateralne sirane. Svi rastvori su uklonjeni iz apikalni i bazolateralnih komora. Bazolateralne komore su napunjenje sa 1.5 ml svežeg HBSS, dok su apikalne komore napunjene sa 0. 5 mi rastvora 120 pg/ml Lucifer Yellow. Ćelije su vraćene u inkubator na 1 sat, nakon čega su prikupljeni uzorci od 100 ul i kvatitaivno određeni spektrofotometrijski pomoćuSpectraMcu 340PC- plate readerna 428 nm.

20ul svakog radioaktivno-obeleženog uzorka je dodato u 10 ml scintilacionog koktela (ScintiSafe 30%) i izbrojani 5 minuta sa tečnim scintilacionim analizatorom (1900CA Tri-Carb).

Inkubirane Caco-2 ćelije su analizirane na prisustvo dihidrotetrabenazina pomoću metode tečne homatografije-tandem/masene spektometrije (LC-MS/MS).

Koeficijenti permabilnosti Papp su izračunati pomoću jednačine Papp = dQ/dt x l/A x I/Co(cm/sec) gde je dQ/dt brzina difuzije jedinjenja (ug/sec ili integral površina pod krivom/sec), A je ukupna površina ćelijske membrane (cm<2>) i Cojepočetna koncentracija (g/mL ili integral površine ispod krive /sec).

Apikalne -do-bazolateralne vrednosti Papp različitih test proizvoda dihidrotetrabenazina su poređeni sa Papp vrednostima određenim za referentne standarde. Rezlutati su prijazani u Tabeli 8. Jedinjenja C, D i A dMđrotetrabenazina imaju vrednosti za Papp: 21.14x10<*6>, 24.87 x IO"<6>i 25.52 x 10"<*>cm/sec, koje se mogu porediti sa referentnim testosteron standardom.

Jedinjenje B ima vređnost za Papp od 11.98 x 10"<6>cm/sec, koja je slična refenrentnom standardu salicilne kiseline.

Jedinjenja C, D i A imaju vrednosti za Papp bliske vrednostima za testosteron, ukazujući na to da ova jedinjenja ima visoku permeabilnosi u caco-2 modelu dok Jedinjenje B ima vrednosti za Papp između vrednosti za salicilnu kiselinu i testosteron, ukazujući na to da ima srednju permeabilnost u Caco-2 modelu. Ovi rezultati ukazuju na to da bi četiri izomera dihidrotetrabenazina trebalo da budu visoko apsorbovani kroz intestinalni epitelin

vivo.

PRIMER 11

Poređenie sedativnih karakteristika Tetrabenazina i izomera B i C Dihidrotetrabenazina

Ispitivanje je izvedeno na pacovima da bi se odredilo da li izomeri dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska imaju sedativne karakteristike. Efekti izomera na spontantu lokomotornu kativnost kod pacova su upoređeni sa efektima koje poizvodi tetrabenazin i haloperidol prema postupcima datim u dalejm tekstu.

Postupci

Za ispitivanja upotrebljeni su mužjaciSprague- Dawleypacova, (Charles River

Laboratories, Saint-Germain/L'Arbresle, France), težine 200-250 g na početku ispitivanja. Pacovi su čuvani u kavezima, 2 ili 3 jedinke po kavezu, u kavezima Makrolon type III, u sredini podešenoj na sledeće spoljašnje uslove: temperatura: 20 2 °C, vlažnost: minimum 45 %, promene u vazduhu: > 12 na sat, biološki časovnik odi2 h/12 h [uključen u 7: 00 a.m.. Pacovi su ostavljeni da aklimatizuju na uslove najmanje pet dana pre početka sa ispitivanjima. Pacovi su imali neograničen pristup hrani (Dietex, Vignv, France, ref. 811002) i vodi (voda iz česme u flaši ci za vodu).

Rastvori svakog test jedinjenja u kukuruznom ulj su sveže pripremljeni na dan eksperimenta. Haloperidol je pripremljen u hidroksietilcelulozi, 0.5% u dejonizovanoj vodi. Kao jedna doza adnunistriranje ili nosač ih test jedinjenja (0.3,1,3 i 10 mg/kg, 2mL/kg i. p.). Referentno jedinjenje haloperidol (1 mg/kg) je adnunistrirano i. p.

(2mL/kg).

Životinje su stavaljne u kaveze od pleksiglasa pod video nadzor u sobi sa osvetljenem malog inteziteta (maksimalno 50 Iux). Četrdeset pet minuta i 3 sata posle administracije, određena je Iokomotorna aktivnost tokom periosa od 20 minuta pomoću analizatora video imidža (Videotrack, View Point, France). Lokomotoma aktinost je zabeležena u referentnoj grupi (haloperidol) 1 sat posle administracije.Meren je broj i dužin trajanja ambulatornih pokreta i dužina trajanja neaktivnosti. Na kraju merenja lokomotome aktivnosti (45 minuta i 3 sata), zabeleženo je otvaranje i zatvaranje očnih kapaka u kavezu od pleksiglasa:

Zatvaranje očnih kapaka:

0 : (norma!) širom otvorene oči

1 : neznatna klonulost očnih kapaka

2 : ptoza, očni kapci su polu-spušteni

3 : očni kapci su potpuno zatvoreni

Budnost:

1 :veoma mala budnost,obamriost, koma, odgovor slab ili nije prisutan

2: mala budnost, donekle prisutna obamrlost,«tromost», neznama pomeranja glave i tela

3: donekle mala budnost, neznatna obamrlost, donekle ekspolartivni pokreti sa periodima nepokretljivosti

4 : normalna budnost, oprez, eksplorativni pokreti /spora ukočenost

5 : donekle visoka budnost, blago uzbuđenje, napetost, nagli pokreti ili ukočenost

6: vrlo visoka budnost, hiper budnost, iznenadni napadi ili trčanja ili pokreti (kretanja) tela

Broje i trajanje (u sekundama) ambulatormh (velikih) pokreta i dužina trajanja perioda neaktivnosti (sekunde) određene su tokom dva 20 rninutna perioda (45 minuta i 3 sata posle administracije) pomoću analizatora video imidža (Videotrack, ViewPoint, Lyon, France). Praćenje imidža je izvedeno pomoću video kamere postavljene izand kaveza od pleksiglasa, snimajući sve lokomotorne aktivnosti. Snimljeni imidži su su digitalizovani i zamena centra teže tačaka digitalnih imidža je praćena i analizirana prema sleđećem postupku: brzina zamene centra teže tačke je merena i dve vrednosti praga su podešene tako da definišu tip pokreta: prag 1 (velika brzina) i prag 2 (mala brzina). Kada se životinja pokreće i brzina zamene centra teže tačke je iznad praga 1, pokret se smatra kao ambulatorni pokret. Kada životinja ostane neaktivna, brzuina je ispod praga 2, pokret se mstra kao neaktivnost.

Rezultati su izraženikao srednje vrednosti ± SEMs 12 mđividualnih vrednosti. Statistčke analize su izvedene pomoću ANO VA (jednomerna) i Dunnett'ov t-test i sa ne-parametaskim testom Kruskal-WaIlis-a, pa zatim Mann & Whitney U-testom određivanje umirenja. Vrednost za p < 0. 05 je uzeta kao oznaka tačnosti. Rezltati pokazuju da t tetrabenazin proizvodi sedativni efekat koji zavisi od doze, 45 minuta i 3 sata posle administracije dok Izomer B i Izomer C ne pokazuju sedativne efekte u bilo kom momentu, mada izomer C pokazuje neznatan i neznačajan hiperlokomotorni efekat 3 sata posle administracije.

PRIMER 12

Farmaceutske kompozicije

( i ) Formulacija tableta - I

Kompozicija tableta koja sadrži dihiđrotetrabenazin predmetnog pronalaska pripremljen je mešanjem 50mg dihidrotetrabenazina sa 197mg laktoze (BP) kao razblaživačem, i 3mg magnezijum stearata kao mazivo i komprimovana na pozntati način u tabletu.

( ii ) Formulacija tableta- II

Kompozicija tableta koja sadrži dihiđrotetrabenazin predmetnog pronalaska je priremljena mešanjem jedinjenja (25 mg) sa gvožđe oksidom, laktozom, magnezijum stearatom, škrobom i talkom i komprimovana na poznati način u tabletu.

( iii ) Capsule Formulation

Formulacija kapsule je pripremljena mešanjem 100 mg dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska sa lOOmg lactoze i dobijenom smešom su napunjene standardne neprovidne tvrde želatinske kapsule.

Claims (29)

1. 3, llb-cfc-diWđrotetrabenazin.

2. 3, 11 b-cis-diMaVotetrabenazin prema zahtevu 1, naznačen time, što je u (+)-izomernom obliku.

3. Kompozicija koja sadrži 3,1 lb-c&-diUđrotetrabenazin prema zahtevu 1, naznačena time, što u suštini ne sadrži 3,11 b-rar/is-dUhidrotetrabeiiazin.

4. Kompozicija prema zahtevu 3, naznačena time, što je 3,1 1b- cis-dmidrotetrabenazin, (+) izomer.

5. 3, 1 lb-cw-diWđrotetrabenazin prema zahetvu 1, naznačen time, što 2S,3S,1 lbR izomer ima formulu (Ia):

6. 3,1 lb-c&-d^hidrotetrabenazin prema zahtevu 1, naznačen rime, što 2R,3R, 1 lbS izomer ima formulu (lb)

7. 3,1 lb-cw-dilndottetiabenazin prema zahtevu 1, naznačen time, što 2S, 3S, 1 lbR izomer ima formulu (Ic) :

8. 3,11 b-ris-diMdrotetrabenazin prema zahtevu 1, naznačen time, što 2S,3R,1 lbS izomer ima formulu (Id) :

9. 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazin prema zhatevu 1,, naznačen time, što izomer A ima: a) sledeće spektroskopske karakteristike: b) sledeće hrornatografske karakteristike: i c) levogiru optičku aktivnost

10. 3,1 lb-ds-dihidortetrabenazin izomer prema zahtevu 1 u obliku izomera B koji ima: a) sledeće spektroskopske karakteristike: b) sledeće hromatografške karakteristike: i c) desnogiru optičku aktivnost.

11. 3,1 lb-cis-đmidrotetrabenazin izomer prema zahtevu 1 u obliku izomera C koji ima: a) sledeće spektroskopske karakteristike: b) sledeće hrornatografske karakteristike: i c) đesnogiru optičku aktivnost.

12. 3,1 lb-cis-diMdrotetrabenazin prema zahtevu 1 u obliku izomera D koji ima: a) sledeće spektroskopske karakteristike: b) sledeće hrornatografske karakteristike: c) levogiru optičku aktivnost

13. 3,1 lb-cij-dihidrotetrabenazin kao što je definisan u jednom od pretrhodnih zahteva, naznačen time, što je u obliku slobodne baze.

14. 3,1 lb-đw-dihidrotetrabenazin kao što je definisan u jednom od zahteva 1 do 12, naznačen time, što je u obliku adicione soli kiseline.

15. 3,1 lb-c«-dMdrotetrabenazin prema zahtevu 22, naznačen time, što je so, metansulfonatna so.

16. 3,11 b-cw-dihidrotetrabenazin kao što je definisan u jednom od prethodnih zahteva za upotrebu u medicini ili za lečenje.

17. 3,1 lb-c«-dibidrotetrabenazin kao što je definisan prema jednom od prethodnih zahteva za upotrebu u lečenju hiperkinetičkih poremećaja ili za lečenje depresije.

18. 3,1 Ib-cK-dihidrotetrabenazin za upotrebu kao što je definisano u zahtevu 17, gđe je Mperkinetički poremeća: Huntington-ova bolest, hemibalizam, senilna horea, tikovi, tardivna diskinezija ili Tourett-ov sindrom.

19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži 3,1 lb-m-dihiđrotetrabenazin kao što je definisan prema jednom od zahteva 1 do 15 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

20. Upotreba 3,1 lb-cw-dMdrotetrabenazinkao što je definisan u jednom od zahteva I do 15 za proizvodnju leka za lečenje hiperkinetičkih poremećaja ili za lečnje depresije.

21. Upotreba prema zahtevu 20, gđe je lek za lečenje Huntington'ove bolesti, hemibalizma, senilne horeje, tikova, tarđivne diskinezije i Tourette'ovog sindroma.

22. Proces za dobijanje dihidrotetrabenazina kao što je defiriisano u jednom od zahteva

5,6,9 i 10 naznačen time, što obuhvata reakciju jedinjenja formule (II) sa reagensom ili reagensima pogodnim za hiđrataciju 2,3-dvostruke veze u jedinjenju formule (II) i zatim je potrebno odvojiti i izolovati željeni izomerni oblik3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazina.

23. Proces za dobijanje 3,1 lb-ov-dimdrotetrabenazina kao što je definisan prema jednom od zahteva 7,8,11 i 12, naznačen time, što obuhvata izlaganje jedinjenja formule (IH) uslovima otvaranja prstena 2,3-epoksidne grupe ujedinjenje formule (IH), i dalje zahteva odvajanje i izolovanje željenog izomernog oblika 3,1 lb-cw-diMdrotetrabenazina.

24. Proces za dobijanje jedinjenja formule (III) kao što je definisano u zahtevu 23, naznačen time, što obuhvata reakciju jedinjenja alkena formule (II) kao što je definisano u zehtevu 22 sa reagensom za oksidaciju koji je pogodan za formiranje epoksidne grupe.

25. Proces prema zahtevu 24, naznačen time, što je reagens za oskidaciju, peroksi kiselina.

26. Proces za dobijanje jedinjenja formule (U) kao što je definisano u zathevu 22, naznačen time, što obuhvata dehidrataciju 3,1 lb-/ra^-diMdortetrabenazina sa regensom za dehidrataciju kao što je fosfor halid ih fosfor oksihalid.

27. Jedinjenje formule (II):

28. Jedinjenje formule (III):

29. Estar Mosher'ove kiseline jedinjenja kao Sto je definisano u jednom od zahteva 1 do 15.