ES2313776T3 - Alergenos recombinantes mutantes. - Google Patents
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Abstract
Un alérgeno mutante recombinante artificial derivado de un alérgeno natural, comprendiendo dicho alérgeno natural, al menos una zona de restos de aminoácidos, que están conectados coherentemente a lo largo de al menos 400 ºA 2 de la superficie de la estructura tridimensional de la molécula de alérgeno, que tienen una accesibilidad al disolvente de al menos 20% y que están conservados como se define por ser idénticos en más del 70% de las secuencias de secuencias homólogas dentro del mismo orden taxonómico del cual dicho alérgeno de origen natural es originario, comprendiendo dicha zona al menos un epitopo de célula B, donde 1) dicho mutante comprende al menos una sustitución de un resto de aminoácido conservado localizado en al menos una de las citadas zonas, teniendo dicho resto de aminoácido conservado una accesibilidad al disolvente de al menos un 20%, por un resto de aminoácido, que no se encuentra en la misma posición en la secuencia de aminoácidos de ninguna proteína homóloga conocida en el orden taxonómico del cual el alérgeno de origen natural es originario, 2) dicho alérgeno mutante tiene esencialmente la misma estructura terciaria de la cadena principal de carbonos alfa que dicho alérgeno natural, y 3) la unión de IgE especifica al alérgeno mutante está disminuida en comparación con la unión a dicho alérgeno natural.
Description
Alérgenos recombinantes mutantes.
La presente invención se refiere a nuevos
alérgenos recombinantes, que son mutantes artificiales derivados
de alérgenos naturales. Además, la invención se refiere a un método
para preparar tales alérgenos recombinantes así como composiciones
farmacéuticas, incluyendo vacunas, que comprenden los alérgenos
recombinantes. En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a métodos para generar respuestas inmunes en un sujeto, a
la vacunación o al tratamiento de un sujeto así como a los procesos
para preparar las composiciones de la invención.
Los individuos con predisposición genética se
sensibilizan (alérgicos) a los antígenos procedentes de diversas
fuentes ambientales, a cuyos alérgenos están expuestos. La reacción
alérgica ocurre cuando un individuo sensibilizado previamente se
expone nuevamente al mismo alérgeno o a un homólogo. Las respuestas
alérgicas van desde la fiebre del heno, la rinoconductivitis, la
rinitis y el asma, hasta la anafilaxis sistémica y la muerte como
respuesta a p. ej., la picadura de una abeja o un avispón u otros
insectos. La reacción es inmediata y puede ser causada por diversos
alérgenos atópicos como los compuestos procedentes de hierbas,
árboles, malas hierbas, insectos, alimentos, fármacos, productos
químicos y perfumes.
Sin embargo, estas respuestas no ocurren cuando
un individuo se expone a un alérgeno por primera vez. La respuesta
adaptativa inicial requiere tiempo y normalmente no causa ningún
síntoma. Pero cuando se han producido los anticuerpos y las células
T capaces de reaccionar con el alérgeno, cualquier exposición
posterior puede provocar los síntomas. Así, las respuestas
alérgicas demuestran que la propia respuesta inmune puede causar
estados patológicos importantes, que pueden poner en riesgo la
vida.
Los anticuerpos involucrados en la alergia
atópica pertenecen principalmente a las inmunoglobulinas de la
clase IgE. La IgE se une a los receptores de superficie específicos
de las células cebadas y basófilos. Después de la formación del
complejo entre el alérgeno especifico con la IgE unida a las células
cebadas, la unión del receptor a la superficie de la célula tiene
como resultado la señalización mediante los receptores y la
respuesta fisiológica de la células diana. La desgranulación tiene
como resultado la liberación entre otros de la histamina, la
heparina, un factor quimiotáctico para los leucocitos eosinófilos,
los leucotrienos C4, D4 y E4, que causan la constricción
prolongada de las células del músculo liso de los bronquios. Los
efectos resultantes pueden ser de naturaleza local o sistémica.
Las reacciones de hipersensibilidad mediadas por
anticuerpos pueden dividirse en cuatro clases denominadas de tipo
I, tipo II, tipo III y tipo IV. La reacción alérgica de tipo I es la
reacción de hipersensibilidad inmediata clásica que ocurre en los
segundos o minutos posteriores a la exposición a un antígeno. Estos
síntomas están mediados por la IgE específica para un alérgeno.
Comúnmente las reacciones alérgicas se observan
como una respuesta a los alérgenos proteicos presentes en p. ej.
los pólenes, los ácaros del polvo domestico, el pelo y la caspa
animal, los venenos y los productos alimenticios.
Para reducir o eliminar las reacciones
alérgicas, se utilizan habitualmente las vacunas para la alergia
controladas cuidadosamente y de administración repetida. La
vacunación contra la alergia se realiza tradicionalmente por
administración parenteral, intranasal o sublingual, en dosis que se
van incrementando durante un periodo de tiempo bastante largo, y
que tiene como resultado la desensibilización del paciente. No se
conoce el mecanismo inmunológico exacto, pero se piensa que pueden
ser especialmente importantes las diferencias inducidas en el
fenotipo de las células T específicas para un alérgeno.
Los análisis cristalográficos con rayos X de los
complejos Fab-antígeno han incrementado la
comprensión de los epitopos de unión a anticuerpos. Según este tipo
de análisis los epitopos de unión a anticuerpos pueden definirse
como una sección de la superficie del antígeno que comprende átomos
de entre 15-25 restos de aminoácidos, que se
encuentran a una distancia tal de los átomos del anticuerpo que
permite la interacción directa. La afinidad de la interacción
antígeno anticuerpo no se puede predecir solamente de la entalpía
debida a las interacciones de van de Waals, los enlaces del
hidrógeno o los enlaces iónicos. La entropía asociada a la
expulsión casi completa de las moléculas de agua del punto de
contacto representa una contribución energética similar en
magnitud. Esto significa que el acoplamiento perfecto entre los
contornos de las moléculas que interaccionan es un factor principal
subyacente en las interacciones de gran afinidad antígeno
anticuerpo.
El concepto de vacunación se basa en dos
características fundamentales del sistema inmune, especificidad y
memoria. La vacunación sensibilizará el sistema inmune del receptor,
y tras exposiciones repetidas a proteínas similares, el sistema
inmune estará en situación de responder más rigurosamente a la
provocación, por ejemplo, de una infección microbiana. Las vacunas
son mezclas de proteínas destinadas a ser utilizadas en la
vacunación con el propósito de generar en el receptor una respuesta
inmune protectora. La protección comprenderá solo los componentes
presentes en la vacuna y los antígenos homólogos.
Comparado con otros tipos de vacunaciones, la
vacunación contra la alergia se complica por la existencia de una
respuesta inmune progresiva en los pacientes alérgicos. Esta
respuesta inmune se caracteriza por la presencia de la IgE
específica para alérgeno, mediadora en la producción de los síntomas
alérgicos tras la exposición a los alérgenos. Por eso, la
vacunación contra la alergia usando alérgenos de origen natural
tiene un riesgo inherente de efectos secundarios siendo la mayor
consecuencia el riesgo de la vida del paciente.
Los enfoques para evitar este problema pueden
dividirse en tres categorías. En la práctica se combinan a menudo
medidas de más de una categoría. La primera categoría de medidas
incluye la administración de varias dosis pequeñas durante un
tiempo prolongado, para alcanzar una dosis acumulada sustancial. La
segunda categoría de medidas incluye la modificación física de los
alérgenos mediante la incorporación de los alérgenos en sustancias
gelificantes tales como el hidróxido de aluminio. La formulación del
hidróxido de aluminio tiene un efecto potenciador y un efecto
depósito de liberación ralentizada del alérgeno que reduce la
concentración en el tejido de los componentes alérgenos activos. La
tercera categoría de medidas incluye la modificación química de los
alérgenos con el fin de reducir la alergenicidad, p. ej., la unión
a IgE.
El mecanismo detallado que hay detrás de la
vacunación eficaz contra la alergia sigue siendo discutible. Sin
embargo, si hay acuerdo en que las células T juegan un papel clave
en la regulación total de la respuesta inmune. Según el consenso
admitido, la relación entre los dos fenotipos extremos de las
células T, Th1 y Th2, determina el estado alérgico de un
individuo. Frente a la estimulación con un alérgeno las células Th1
secretan interleuquinas predominando el
interferón-\gamma que conducen a una inmunidad
protectora y a un individuo sano. Por otro lado las células Th2
secretan predominantemente interleuquinas 4 y 5 que conducen a la
síntesis de IgE y a la eosinofilia y a un individuo alérgico. Los
estudios in vitro han indicado la posibilidad de alterar
las respuestas de las células T especificas para un alérgeno,
mediante el estímulo con péptidos derivados de un alérgeno que
contienen los epitopos relevantes de las células T. Los enfoques
actuales de las nuevas vacunas contra la alergia se dirigen en gran
parte hacia las células T, siendo el objetivo silenciar las células
T (inducción de anergia) o modificar la respuesta, del fenotipo Th2
al fenotipo Th1.
En el documento WO 97/30150 (ref. 1), se
reivindica una población de moléculas proteicas que tienen una
distribución de mutaciones específicas en la secuencia de
aminoácidos con respecto a una proteína original. Según la
descripción parece que la invención se refiere a la producción de
análogos modificados con respecto a la proteína original, pero que
son absorbidos, digeridos y presentados a las células T de la misma
manera que las proteínas originales (alérgenos de origen natural).
De este modo se obtiene una respuesta modificada de la célula T. Se
preparan bibliotecas de proteínas modificadas utilizando la técnica
denominada PM (Parsimonious Mutagenesis).
En el documento WO 92/02621 (ref. 2), se
describen moléculas de ADN recombinantes que comprenden un ADN que
codifica un polipéptido que tiene al menos un epitopo de un alérgeno
de los árboles del orden Fagales, el alérgeno se selecciona
entre Alg g 1, Cor a 1, y Bet v 1. Las
moléculas recombinantes que se describen en esta invención tienen
todas una secuencia de aminoácidos o parte de una secuencia de
aminoácidos que corresponde a la secuencia del alérgeno de origen
natural.
El documento WO 90/11293 (ref. 3) se refiere
entre otros a péptidos alergénicos aislados del polen de la
ambrosía común y a péptidos modificados del polen de la ambrosía
común. Los péptidos allí descritos tienen una secuencia de
aminoácidos correspondiente bien a la secuencia de los alérgenos de
origen natural o bien a sus isoformas naturales.
Ha habido varios enfoques en cuanto a la
modificación química de los alérgenos. Entre los enfoques de
principios de los años setenta se incluyen el acoplamiento químico
de los alérgenos a polímeros, y la reticulación química de los
alérgenos usando formaldehído, etc., produciendo los denominados
"alergoides". El principio fundamental de estos enfoques era
la destrucción aleatoria de los epitopos de unión a IgE por el
acoplamiento del ligando químico, reduciendo por ello la unión con
IgE aunque manteniendo la inmunogenicidad por el peso molecular
aumentado de los complejos. Las desventajas inherentes a la
producción de "alergoides" están relacionadas con las
dificultades de control del proceso de reticulación química y las
dificultades de análisis y producción en serie de los complejos de
alto peso molecular resultantes. Los "alergoides" se usan en
clínica actualmente y debido a la destrucción aleatoria de los
epitopos de unión a IgE, se pueden administrar en dosis más altas
que con las vacunas convencionales, pero no se han mejorado los
parámetros de seguridad y eficacia de las vacunas
convencionales.
Los enfoques mas recientes de la modificación
química de los alérgenos tienen como objetivo la ruptura total de
la estructura terciaria del alérgeno, eliminado así la unión con la
IgE, asumiendo que la diana terapéutica fundamental es la célula T
específica para un alérgeno. Estas vacunas contienen péptidos
sintéticos derivados de la secuencia del alérgeno que representan
los epitopos mínimos de las células T, los péptidos más largos que
representan los epitopos ligados de células T, secuencias de
alérgenos más largas derivadas de péptidos sintéticos que
representan regiones de epitopos inmunodominantes las células T, o
moléculas de alérgeno escindidas en dos mitades por la técnica de
recombinación. Otro enfoque basado en este principio fundamental ha
sido la propuesta de la utilización de isoformas recombinantes con
la unión a IgE reducida. En los últimos años ha quedado claro que
los alérgenos naturales son heterogéneos, conteniendo isoalérgenos y
variantes que tienen hasta el 25% aproximadamente de los
aminoácidos sustituidos. Se ha encontrado que algunos de los
alérgenos recombinantes son menos eficaces en su unión a IgE
debido posiblemente a una desnaturalización irreversible y por lo
tanto a una ruptura total de la estructura terciaria.
Se han llevado a cabo algunos intentos de
reducir la alergenicidad por mutagénesis in vitro utilizando
varios alérgenos que incluyen Der f 2 (Takai et al, ref. 4),
Der p 2 (Smith et al, ref. 5), un alérgeno de 39 kDa de
Dermatophagoides farinae (Aki et al, ref. 6),
fosfolipasa A2 de veneno de abeja (Förster et al, ref. 7),
Ara h 1 (Burks et al, ref. 8), Ara h 2 (Stanley et al,
ref.9), Bet v 1 (Ferreira et al, ref. 10 y 11), profilina de
abedul (Wiedemann et al, ref.12), y Ory s 1 (Álvarez et
al, ref.13).
El principio fundamental de estos enfoques se
dirige de nuevo hacia las células T específicas para un alérgeno
mientras que al mismo tiempo se reduce el riesgo de los efectos
secundarios mediados por IgE, al reducir o eliminar la unión a IgE
por la ruptura de la estructura terciaria de los alérgenos mutantes
recombinantes. El principio fundamental de estos enfoques no
incluye el concepto de epitopos de unión a IgE dominantes y no
incluye el concepto del inicio de una nueva respuesta inmune
protectora que implique también a las células B y a la producción
de anticuerpos.
El artículo de Ferreira et al (ref. 11)
describe la utilización de una mutagénesis con el propósito de
reducir la unión a IgE. Aunque en este artículo se menciona la
estructura tridimensional de Bet v 1, los autores no
utilizan la estructura para predecir los restos de aminoácidos
expuestos en la superficie para la mutación, la mitad de los cuales
tiene un nivel bajo de exposición al disolvente. Utilizan más bien
un método desarrollado para predecir los restos funcionales de las
proteínas, que es diferente del concepto de la identificación
basado en la estructura de las áreas de superficie conservadas,
aquí descrito. Aunque los autores discuten la conservación de la
estructura terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha,
este concepto no es una parte de la estrategia terapéutica sino que
se incluye simplemente para valorar la unión a IgE in vitro.
Además la evidencia presentada no es adecuada, puesto que la
normalización del espectro CD impide la evaluación de la
desnaturalización de una parte de la muestra, lo que es un problema
habitual. La estrategia terapéutica descrita pretende inducir
tolerancia en las células T específicas para un alérgeno y no
menciona el inicio de una nueva respuesta inmune.
El artículo de Wiedemann et al. (re.12)
describe el uso de una mutagénesis y de una síntesis de péptidos
con el propósito de la caracterización del epitopo de un anticuerpo
monoclonal. Los autores tienen conocimiento de la estructura
terciaria del antígeno y utilizan este conocimiento para seleccionar
un aminoácido expuesto en la superficie para la mutación. Se puede
decir que el algoritmo utilizado es opuesto al descrito por los
inventores de la presente invención, ya que se selecciona un
aminoácido que difiere de las secuencias homólogas. El estudio
demuestra que la sustitución un aminoácido expuesto en la
superficie, tiene la capacidad de modificar las características de
la unión a un anticuerpo monoclonal, lo cual no es sorprendente
teniendo en cuenta que es del dominio público. Los experimentos
descritos no están diseñados para valorar la modulación en la unión
a anticuerpos policlonales como puede ser el suero con IgE de
pacientes alérgicos. En uno de los experimentos se aplica suero con
IgE y aunque este experimento no es adecuado para hacer una
valoración cuantitativa, la unión a IgE no parece verse afectada
por las mutaciones efectuadas.
El artículo de Smith et al. (ref. 5)
describe el uso de la mutagénesis para el mapeo de un epitopo de un
anticuerpo monoclonal y la reducción de la unión a IgE. Los autores
no conocen la estructura terciaria y no intentan valorar la
conservación de la estructura terciaria de la cadena principal de
carbonos \alpha. El algoritmo utilizado no asegura que los
aminoácidos seleccionados para la mutación se encuentren realmente
expuestos en la superficie molecular. Solamente uno de los mutantes
descritos lleva una reducción substancial de la unión a IgE. Este
mutante es deficiente en su unión a todos los anticuerpos ensayados
lo que indica que la estructura terciaria esta alterada. Los
autores no definen una estrategia terapéutica y no se menciona el
inicio de una nueva respuesta inmune.
El artículo de Colombo et al. (ref. 14)
describe el estudio de un epitopo de unión a IgE utilizando una
mutagénesis y una síntesis de péptidos. Los autores utilizan una
estructura modelo tridimensional diseñada por ordenador que se basa
en la estructura cristalina de una proteína homologa para ilustrar
la presencia del epitopo en la superficie molecular. La presencia
adicional de un epitopo en un alérgeno diferente que muestra una
estructura primaria homologa está dirigida a utilizar péptidos
sintéticos que representan el epitopo. La estrategia terapéutica se
basa en un tratamiento que utiliza este péptido sintético que
representa un epitopo de unión a IgE monovalente. No se mencionan
ni las áreas de superficie conservadas entre alérgenos homólogos ni
el concepto terapéutico del inicio de una nueva respuesta inmune
protectora.
El artículo de Spangfort et al. (ref. 15)
describe la estructura tridimensional y las zonas conservadas de
superficie expuestas del alérgeno mayoritario del abedul. El
artículo no menciona los principales epitopos de unión a IgE ni la
mutagénesis, ni las aplicaciones terapéuticas a las que está
dirigido.
En ninguno de los estudios descritos
anteriormente la unión a IgE disminuye por la sustitución de los
aminoácidos expuestos en la superficie que conservan la estructura
terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha. El principio
fundamental de los enfoques mencionados anteriormente no incluye el
concepto de epitopos de unión a IgE dominantes y no incluye el
concepto del inicio de una nueva respuesta inmune protectora.
La Figura 1 muestra los oligonucleótidos
cebadores específicos para el mutante numero 1, Bet v 1. Los
oligonucleótidos mutados están subrayados.
La Figura 2 muestra dos cebadores de aplicación
general (denominados "all- sense" y "all
non-sense") (denominados "todo sentido" y
"todo antisentido"), que fueron sintetizados y utilizados para
todos los mutantes.
La Figura 3 muestra el conjunto de todas las
mutaciones de Bet v 1.
La Figura 4 muestra la inhibición de la unión
del alérgeno recombinante Bet v 1 biotilinado al suero con
IgE procedente de un grupo de pacientes alérgicos por el alérgeno
Bet v 1 no biotilinado y por el mutante de Bet v 1
Glu45Ser.
La figura 5 muestra la inhibición de la unión
del alérgeno recombinante Bet v 1 biotilinado al suero con
IgE procedente de un grupo de pacientes alérgicos por el gen Bet v 1
no biotilinado y por el mutante de Bet v 1 Asn28Thr+
Lys32Gln.
Lys32Gln.
La Figura 6 muestra la inhibición de la unión
del alérgeno recombinante Bet v 1 biotilinado al suero con
IgE procedente de un grupo de pacientes alérgicos por el gen Bet v 1
no biotilinado y por el mutante de Bet v 1 Pro108Gly.
La Figura 7 muestra la inhibición de la unión
del alérgeno recombinante Bet v 1 biotilinado al suero con
IgE procedente de un grupo de pacientes alérgicos por el gen Bet v 1
no biotilinado y por el mutante de Bet v 1 Glu60Ser.
La Figura 8 muestra el espectro CD del alérgeno
recombinante y de un mutante triple (mutaciones en las tres zonas),
registrados a concentraciones casi iguales.
La Figura 9 muestra la inhibición de la unión
del alérgeno recombinante Bet v 1 biotilinado al suero con
IgE procedente de un grupo de pacientes alérgicos por el gen Bet v 1
no biotilinado y por el mutante triple de Bet v 1.
La Figura 10 muestra la accesibilidad al
disolvente de los restos del antígeno 5 alineados individualmente y
el alineamiento de las secuencias de antígeno 5 de Vespula
(panel izquierdo). En el panel derecho de la Figura 10 se muestra
la superficie molecular del antígeno 5 con las áreas conservadas
entre el antígeno 5:s de Vespula.
La Figura 11 muestra la secuencia del cebador
correspondiente al extremo amino terminal de Ves v 5 derivada
de la hebra sentido. La secuencia del cebador curso arriba
(upstream) se deriva de la hebra antisentido.
La Figura 12 muestra dos cebadores de aplicación
general (denominados "all- sense" y "all
non-sense") (denominados "todo sentido" y
"todo antisentido"), que fueron sintetizados y utilizados para
todos los mutantes.
La Figura 13 muestra el conjunto de todas las
mutaciones de Ves v 5.
La Figura 14 muestra la inhibición de la unión
del recombinante Ves v 5 biotilinado al suero con IgE
procedente de un grupo de pacientes alérgicos por el gen Ves
v 5 no biotilinado y por el mutante de Ves v 5
Lys72Ala.
La presente invención se basa en un principio
fundamental único. Según este enfoque el mecanismo de una vacunación
eficaz contra la alergia no es una alteración de la respuesta
inmune de tipo Th2 en curso, sino más bien un inicio paralelo de
una nueva respuesta inmune de tipo Th1 que implica el reconocimiento
de la estructura terciaria de un epitopo por las células B y la
formación de un anticuerpo. Este modelo se apoya en la observación
de que los niveles específicos de IgE no se ven afectados por un
tratamiento de vacunación eficaz, y en que un tratamiento eficaz
va a menudo acompañado de un aumento substancial de IgG4
específica para un alérgeno. Además, los estudios de biopsias
nasales previas y posteriores a la estimulación con el alérgeno no
muestran una disminución de las células T con fenotipo del tipo
Th2, sino que se observa más bien un incremento de las células T
del tipo Th1. Cuando la vacuna (o las composiciones farmacéuticas)
se administra a través de otra ruta distinta del medio aéreo, se
plantea la hipótesis de que se desarrolle una nueva respuesta inmune
del tipo Th1 en un ubicación separada físicamente de la respuesta
Th2 en curso, permitiendo por lo tanto que existan las dos
respuestas inmunes en paralelo.
Otro aspecto importante del principio
fundamental de la presente invención es la afirmación de la
existencia de epitopos de unión a IgE dominantes. Se propone que
estos epitopos de unión a IgE dominantes están constituidos por
zonas de la superficie coherentes dependientes de la estructura
terciaria, suficientemente grandes como para acomodar la unión de
un anticuerpo y conservadas entre los isoalérgenos, las variantes,
y/o los alérgenos homólogos de las especies relacionadas. La
existencia de una reacción cruzada de IgE capaz de unirse a epitopos
similares de alérgenos homólogos está sustentada en la observación
clínica de que los pacientes alérgicos reaccionan a menudo ante
varias especies estrechamente relacionadas, p. ej., aliso, abedul y
avellano, especies de hierba múltiples, o varias especies de
ácaros del polvo doméstico del género Dermatophagoides. Está
sustentada además en los experimentos de laboratorio que demuestran
la reacción cruzada entre los alérgenos homólogos de las especies
relacionadas y la capacidad de un alérgeno de inhibir la unión de
IgE con alérgenos homólogos. (Ipsen et al. 1992, ref. 16).
Es bien conocida que la exposición y las respuestas inmunes están
relacionadas de una manera proporcional a la dosis. Basándose en
la combinación de estas observaciones, se propone que las áreas de
superficie conservadas están expuestas al sistema inmune en mayor
dosis que las zonas de superficie no conservadas dando como
resultado la generación de anticuerpos de mayores afinidades, de ahí
el término "epitopos de unión a IgE dominantes".
Según este principio fundamental es esencial que
el alérgeno tenga una estructura terciaria de la cadena principal
de carbonos \alpha que sea esencialmente la misma que la del
alérgeno de origen natural, asegurando así la conservación de la
topología de superficie de las áreas que rodean las zonas
conservadas que representan las dianas para la mutagénesis
destinada a disminuir la unión a IgE. Al cumplir estos criterios el
alérgeno tiene el potencial de ser administrado en dosis
relativamente altas, mejorando su eficacia al generar una respuesta
inmune sin comprometer la seguridad.
La presente invención se refiere a la
introducción de sustituciones de aminoácidos artificiales en
posiciones definidas críticas que mantienen la estructura terciaria
de la cadena principal de carbonos \alpha del alérgeno.
La invención proporciona un alérgeno
recombinante, que es un mutante artificial derivado de un alérgeno
de origen natural, en el cual al menos un resto de un aminoácido
conservado, expuesto en la superficie de un epitopo de una célula
B, se sustituye por otro resto que no se encuentra en la misma
posición en la secuencia de aminoácidos de ninguna proteína
homóloga conocida en el orden taxonómico del que se origina el
alérgeno de origen natural, teniendo dicho alérgeno mutante
esencialmente la misma estructura terciaria de la cadena principal
de carbonos \alpha que dicho alérgeno de origen natural, y
habiéndose reducido la unión especifica a IgE del alérgeno mutante
si se compara con la unión a dicho alérgeno de origen natural.
La invención proporciona un alérgeno mutante
recombinante artificial derivado de un alérgeno de origen natural,
dicho alérgeno de origen natural comprende al menos una zona de
restos de aminoácidos que están conectados coherentemente en al
menos 400 \ring{A}^{2} de la superficie de la estructura
tridimensional de la molécula del alérgeno, que tienen una
accesibilidad al disolvente de al menos un 20% y que están
conservados, como se define, por ser idénticos en mas del 70% de
las secuencias en secuencias homólogas dentro del mismo orden
taxonómico del que se origina el alérgeno de origen natural, dicha
zona comprende al menos un epitopo de una célula T, donde
1) dicho mutante comprende al menos una
sustitución de un resto de un aminoácido conservado localizado en
al menos una de dichas zonas y teniendo dicho resto de aminoácido
conservado una accesibilidad al disolvente de al menos un 20%, por
un resto de aminoácido, que no se encuentra en la misma posición en
la secuencia de aminoácidos de ninguna de las proteínas homólogas
del orden taxonómico del que se origina el alérgeno de origen
natural,
2) dicho alérgeno mutante tiene esencialmente la
misma estructura terciaria de la cadena principal de carbonos
\alpha que el alérgeno de origen natural, y
3) la unión de IgE especifica al alérgeno
mutante esta disminuida si se compara con la unión del alérgeno de
origen natural.
Dicho alérgeno recombinante se puede
conseguir:
a) identificando el resto de aminoácido en el
alérgeno de origen natural que está conservado con una identidad
superior al 70% en todas las proteínas homólogas conocidas dentro
del orden taxonómico del que se origina el alérgeno de origen
natural;
b) definiendo al menos una zona de restos de
aminoácidos conservados que estén conectados coherentemente en mas
de 400 \ring{A}^{2} de la superficie de la estructura
tridimensional de la molécula de alérgeno, definida por tener una
accesibilidad al disolvente de al menos un 20%, y comprendiendo al
menos una de dichas zonas un epitopo de una célula B, y
c) sustituyendo al menos un resto de aminoácido
en al menos una de dichas zonas, por otro aminoácido no conservado
en la posición concreta, mientras que se conserva esencialmente la
estructura terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha de
la molécula del alérgeno.
La unión especifica de IgE al alérgeno mutante
se reduce hasta por lo menos en un 5%, preferiblemente en al menos
un 10%, en comparación con los isoalérgenos de origen natural o las
proteínas recombinantes similares, según un inmunoensayo con
sueros de pacientes alérgicos sensibles a la IgE de un origen
especifico o mezclas de los
mismos.
mismos.
Los alérgenos recombinantes según la invención
pueden derivarse adecuadamente a partir de los alérgenos por
inhalación procedentes p. ej. de arboles, césped, hierbas, hongos,
ácaros del polvo doméstico, cucarachas, y pelo animal y caspa. Los
alérgenos mas importantes procedentes de polen de árboles, césped,
hierbas son aquellos originarios de los siguientes ordenes
taxonómicos, de Fagales, Oleales, y Pinales que
incluyen p. ej., abedul (Betula), aliso (Alnus),
avellano (Corylus), carpe (Carpinus), y olivo
(Olea), del orden de los Poales que incluyen p. ej.,
los céspedes del género, Lolium, Phelum, Poa, Cynodon,
Dactilys, y Secale, del orden de los Asterales y
Urticales que incluyen p. ej., las hierbas del género
Ambrosia y Artemisia. Los alérgenos por inhalación de
hongos importantes son p. ej., aquellos que proceden del género
Alternaria y Cladosporium. Otros alérgenos por
inhalación importantes son aquellos que proceden de los ácaros del
polvo domestico del género Dermatophagoides, aquellos que
proceden de las cucarachas y aquellos que proceden de mamíferos
como el gato, perro y caballo. Además, los alérgenos recombinantes
según la invención pueden derivarse de alérgenos del veneno
incluyendo los procedentes de insectos que pican o muerden como
aquellos que proceden del orden taxonómico de los Hymenoptera
que incluyen las abejas (superfamilia Apidae), las avispas
(superfamilia Vespides) y las hormigas (superfamilia
Formicoidae).
Los componentes específicos del alérgeno
incluyen p. ej. Bet v 1 (B. verrucosa, abedul), Aln
g 1 (Alnus glutinosa, aliso), Cor a 1 (Corylus
avelana, avellano) y Car b 1 (Carpinus betulus, carpe)
del orden Fagales. Otros son Cry j 1 (Pinales),
Amb a 1 y 2, Art v 1 (Asterales), Par j
1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e
1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol l 1,
Lol p 1 y 5, Pas n 1, Phl p 1 y 5, Poa
p 1, 2 y 5, Sec c 1 y 5, y Sor h 1 (distintos
pólenes de césped), Alt a 1 y Cla h 1 (hongos), Der
f 1 y 2, Der p 1 y 2 (ácaros del polvo doméstico, D.
farinae y D. pteronyssinus, respectivamente), Bla
g 1 y 2, Per a 1 (cucarachas, Blatella germanica
y Periplaneta americana, respectivamente), Fel d 1
(gato), Can f 1 (perro), Eq c 1 2 y 3 caballo),
Apis m 1 y 2 (abeja de la miel), Ves g 1, 2, 3 y 4
(hormiga roja).
En una realización, el alérgeno recombinante
deriva de Bet v 1. Algunos ejemplos de las sustituciones son
Thr10Pro, Asp25Gly, (Asn28Thr + Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser,
Lys55Asn, Thr77Ala, Pro108Gly y (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser,
Pro108Gly). Como se puede ver, los alérgenos recombinantes pueden
tener una o más sustituciones.
En otra realización, los alérgenos recombinantes
se derivan de un alérgeno del veneno procedente del orden
taxonómico de Vespidae, Apidae y Formicoidae.
En otra realización adicional, el alérgeno
recombinante se deriva de Ves v 5. Algunos ejemplos de
sustituciones son Lys72Ala y Tyr96ala. Como se puede ver los
alérgenos recombinantes pueden tener una o más sustituciones.
La presente invención también proporciona un
método de preparación de un alérgeno recombinante como se define en
la presente memoria, que comprende
a) identificar los restos de aminoácidos en un
alérgeno de origen natural que se conservan con una identidad
superior al 70% en todas las proteínas homólogas conocidas dentro
del orden taxonómico del que procede el alérgeno de origen
natural.
b) definir al menos una zona de restos de
aminoácidos conectados coherentemente en al menos 400
\ring{A}^{2} de la superficie de la estructura tridimensional
de la molécula de alérgeno caracterizada por tener una accesibilidad
al disolvente de al menos un 20%, comprendiendo al menos una de
dichas zonas un epitopo de una célula B, y
c) sustituir al menos un resto de aminoácido en
al menos una de dichas zonas, por otro aminoácido no conservado en
la posición concreta mientras que se conserva esencialmente la
estructura terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha de
la molécula del alérgeno.
Con este método se obtienen los mejores
resultados clasificando los restos de aminoácidos de al menos una
de dichas zonas con respecto a la accesibilidad al disolvente y
sustituyendo uno o más aminoácidos de entre los de mayor
accesibilidad al disolvente.
Generalmente, según el método de la invención,
la sustitución de uno a mas restos de aminoácidos en dicho epitopo
de la célula B o en al menos una de dichas zonas se lleva a cabo
por mutagénesis dirigida.
La conservación de la estructura terciaria de la
cadena principal de carbonos \alpha se determina mejor obteniendo
estructuras idénticas por cristalografía de rayos X o NMR previa o
posterior a la mutagénesis. En ausencia de datos estructurales que
describan el espectro CD indistinguible del mutante o de datos
inmunoquímicos, p. ej., la reactividad frente un anticuerpo, se
puede interpretar la conservación de la estructura terciaria de la
cadena principal de carbonos \alpha probable, si se compara con
los datos obtenidos por el análisis de una molécula determinada
estructuralmente.
Además, la presente invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende un alérgeno recombinante
como se define en la presente invención con un vehículo y/o un
excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un
aditivo.
Tales composiciones farmacéuticas pueden estar
en forma de una vacuna contra las reacciones alérgicas provocadas
por un alérgeno de origen natural en pacientes que padecen
alergia.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para generar una respuesta inmune en un sujeto,
cuyo método comprende administrar al sujeto al menos un alérgeno
recombinante tal y como se define en la presente memoria, o una
composición farmacéutica que comprenda por lo menos un alérgeno
recombinante como se define en la presente memoria.
La composición farmacéutica de la invención
puede prepararse por un proceso que comprende mezclar por lo menos
un alérgeno recombinante como se define en la presente memoria, con
substancias farmacéuticamente aceptables y/o excipientes.
En otra aplicación particular, la presente
invención se refiere a la vacunación o al tratamiento de un sujeto,
cuyo tratamiento de vacunación comprende administrar al sujeto al
menos un alérgeno recombinante como se define en la presente
memoria o una composición farmacéutica como se define en la presente
memoria.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se obtienen por el procedimiento definido anteriormente.
En otra aplicación, los alérgenos recombinantes
de la invención son aptos para su uso en un método para el
tratamiento, la prevención o el alivio de las reacciones alérgicas,
comprendiendo dicho método la administración a un sujeto de un
alérgeno recombinante o una composición farmacéutica como se define
en la presente memoria.
Las moléculas para las que la estructura
terciaria ha sido determinada (p. ej. por cristalografía de rayos
x, o por microscopía electrónica de NMR), el mutante que lleva el o
los aminoácidos sustituidos deberá cumplir preferiblemente con los
siguientes criterios:
1. La estructura terciaria total de la cadena
principal de carbonos \alpha deberá ser conservada. Conservada se
define como una desviación cuadrática media de las coordenadas
atómicas al comparar estructuras inferiores a 2A.
Esto es importante por dos razones: a) Se sabe
que la superficie total del alérgeno natural constituye un
solapamiento continuo de potenciales epitopos de unión a
anticuerpos. La mayoría de la superficie de la molécula no se ve
afectada por la sustitución o sustituciones, y por lo tanto mantiene
sus propiedades de unión a anticuerpos, lo cual es importante para
la generación de las nuevas especificidades a anticuerpos
protectoras que se dirigen a epitopos presentes también en el
alérgeno natural. b) La estabilidad, referida tanto a la vida en
almacenamiento como al inyectarse en fluidos corporales.
2. El/los aminoácido(s) que van a ser
sustituidos deberían estar localizados en la superficie, y ser por
lo tanto accesibles para la unión con el anticuerpo. Los
aminoácidos localizados en la superficie se definen como
aminoácidos de la estructura tridimensional teniendo una
accesibilidad al disolvente (agua) de al menos un 20%,
preferiblemente entre un 20-80%, mas preferiblemente
entre un 30-80%. La accesibilidad al disolvente se
define como el área de la molécula accesible para una esfera con un
radio comparable al de una molécula de disolvente (agua, r = 1,4
\ring{A}).
3. El/los aminoácido(s) conservados
deberían estar localizados en las zonas conservadas mayores de 400
\ring{A}^{2}. Las zonas conservadas se definen como áreas de
superficie conectadas coherentemente con restos de aminoácidos
conservados expuestos a la superficie y la cadena principal. Los
restos de aminoácidos conservados se definen por el alineamiento
de la secuencia de todas las secuencias de aminoácidos conocidas
(deducidas) de las proteínas homólogas dentro del orden taxonómico.
Se consideran conservadas las posiciones de aminoácidos que tienen
restos aminoácidos idénticos en más del 90% de las secuencias. Se
espera que las zonas conservadas contengan los epitopos a los que
se dirige la IgE de la mayoría de los pacientes.
4. Dentro de las zonas conservadas los
aminoácidos para la mutagénesis deberían ser seleccionados
preferentemente entre los más accesibles al disolvente (agua)
localizados preferiblemente cerca del centro de la zona
conservada.
Preferentemente, un resto de un aminoácido polar
se sustituye por otro resto polar, y un resto de aminoácido no
polar se sustituye por otro resto no polar.
La preparación de vacunas es generalmente bien
conocida en la técnica. Las vacunas se preparan típicamente como
inyectables bien como soluciones líquidas o en suspensiones. Tales
vacunas pueden estar también emulsionadas o formuladas de manera
que permitan su administración nasal. El componente inmunogénico en
cuestión (el alérgeno recombinante definido en la presente memoria)
puede mezclarse adecuadamente con excipientes aceptables
farmacéuticamente y compatibles además con el ingrediente activo.
Algunos ejemplos de excipientes adecuados son el agua, la solución
salina, la dextrosa, el glicerol, el etanol y similares así como sus
combinaciones. La vacuna puede contener además otras substancias
como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes
tamponadores o aditivos que potencien la eficacia de la vacuna.
Las vacunas se administran frecuentemente en su
mayoría mediante inyecciones parenterales, subcutáneas o
intramusculares. Entre las formulaciones adecuadas para la
administración por otras vías se incluyen las formulaciones para
uso oral y los supositorios. Las vacunas para la administración oral
pueden formularse adecuadamente con los excipientes utilizados
normalmente para tales formulaciones, p. ej., grados farmacéuticos
de maltitol, de lactosa, de celulosa, de estearato de magnesio, de
sacarina sódica, de celulosa, de carbonato magnésico y similares.
La composición se puede formular como soluciones, emulsiones,
tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación
retardada, aerosoles, polvos o granulados.
Las vacunas se administran de modo que sean
compatibles con las formulaciones de dosificación y en cantidades
tales que sean efectivas terapéuticamente e inmunogénicas. La
cantidad de componente activo contenido en la vacuna depende del
sujeto que se va a tratar, p. ej., de la capacidad del sistema
inmune de un sujeto para responder al tratamiento, de la ruta de
administración y de la edad y del peso del sujeto. Los intervalos
adecuados de dosificación pueden variar en un rango comprendido
entre 0,0001 \mug a 1000 \mug.
Como se mencionó anteriormente, se puede obtener
un mayor efecto añadiendo aditivos a la formulación. Ejemplos de
tales aditivos son el hidróxido de aluminio y fosfato (alúmina) en
una solución salina en tampón fosfato de de entre un 0,05 a un 0,1
por ciento, polímeros sintéticos de azucares utilizados en una
solución al 0,24. Una mezcla de células bacterianas como C.
Parvum, endotoxinas o componentes lipopolisacáridos de
bacterias gram negativas, una emulsión en vehículos oleosos
fisiológicamente aceptables tales como el monooleato de manida
(Arlacel A) o también puede emplearse una emulsión con una solución
al 20 por ciento de perfluoro carbono (p. ej.
Fluosol-DA) utilizada como un sustituto de bloque.
También pueden usarse otros aditivos como los aditivos de Freund
completos o incompletos así como los aditivos Qui1A y RIBI.
A menudo serán necesarias administraciones
múltiples de vacunas para asegurar el efecto. Frecuentemente, la
vacuna se administra como una administración inicial seguida de
inoculaciones consecutivas u otras administraciones. El número de
vacunaciones se encontrará típicamente en el rango comprendido entre
1 a 50, normalmente sin exceder de las 35 vacunaciones. Normalmente
la vacunación se efectuará desde quincenalmente hasta
bimensualmente durante un periodo de 3 meses a 5 años. Esto esta
contemplado para proporcionar el nivel deseado de profilaxis o
efecto terapéutico.
El alérgeno recombinante puede ser utilizado
como una preparación farmacéutica, que es adecuada para proporcionar
una cierta protección contra las respuestas alérgicas durante el
periodo del año en que tienen lugar los síntomas (profilaxis).
Normalmente, el tratamiento tendrá que repetirse cada año para
mantener el efecto protector. Las preparaciones formuladas para
aplicaciones nasales son especialmente adecuadas con este fin.
La presente invención se describe con mayor
detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El alérgeno mayoritario del aliso Bet v 1
muestra una identidad del 90% aproximadamente en la secuencia de
aminoácidos con los alérgenos mayoritarios de los pólenes de los
árboles taxonómicamente relacionados., p. ej. Fagales (por ejemplo
avellano y carpe) y los pacientes alérgicos al polen del aliso
muestran a menudo síntomas clínicos de reacción alérgica cruzada
hacia estas proteínas homólogas del Bet v 1.
El Bet v 1 muestra también una identidad de
entre un 50-60% en la secuencia con las proteínas
alérgicas presentes en ciertas frutas (por ejemplo la manzana y la
cereza) y verduras (por ejemplo el apio y la zanahoria) y hay
evidencia clínica de la reacción alérgica cruzada entre el Bet v 1
y estas proteínas relacionadas con la alimentación.
Además, el Bet v 1 comparte una identidad en la
secuencia significativa (20-40%) con un grupo de
proteínas vegetales denominadas proteínas relacionadas con la
patogénesis (PR-10), sin embargo no se han descrito
reacciones alérgicas cruzadas hacia estas proteínas
PR-10.
Los modelos moleculares sugieren que las
estructuras de los Fagales y de los alérgenos alimentarios y
de las proteínas PR-10 son prácticamente idénticas a
la estructura del Bet v 1.
La base estructural de la reacción alérgica
cruzada del Bet v 1 se ha descrito en (Gajhede et al 1996,
ref. 17) en donde tres zonas de la superficie molecular de Bet v 1
pudieron ser identificadas siendo comunes a los alérgenos
mayoritarios conocidos del polen de los árboles. Por lo tanto,
cualquier IgE que reconozca estas zonas en el Bet v 1 podría tener
una reacción cruzada y unirse a otros alérgenos mayoritarios del
polen de los Fagales y dar origen a los síntomas alérgicos. La
identificación de estas zonas comunes se llevo a cabo después del
alineamiento de todas las secuencias de aminoácidos conocidas de los
alérgenos mayoritarios del polen de los árboles, en combinación con
un análisis de la superficie molecular del Bet v 1 revelada por la
estructura terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha
descrito en la ref. 17. Además, las zonas fueron definidas para que
tuvieran un tamaño mínimo determinado (>400 \ring{A}^{2})
basado en el área cubierta por un anticuerpo al unirse.
Los restos de aminoácidos para la mutagénesis
dirigida se seleccionaron entre los restos presentes en las áreas
especificas del Bet v 1 y en las zonas comunes ya que se
espera que las modificaciones de éstos se espera que afecten a la
unión del suero con IgE de la mayoría de los pacientes que muestran
una reacción alérgica clínica cruzada hacia el polen de los
arboles.
La orientación relativa y el porcentaje de
exposición al disolvente de cada resto de aminoácido dentro de cada
zona respectiva se calculó basándose en sus coordenadas atómicas.
Los restos que tienen un grado de exposición al solvente bajo
(>20%) no se consideraron relevantes para la mutagénesis debido a
la posible ruptura de la estructura o a la falta de interacción
del anticuerpo. El resto de los restos se clasificaron según el
grado de exposición al disolvente.
Las secuencias homólogas a la secuencia problema
(Bet v 1 Nª 2801, WHO IUIS Subcomité de Nomenclatura de
Alérgenos) se obtuvieron de las bases de datos de secuencias GenBank
y EMBL por una búsqueda BLAST (Altschul et al., ref.18). Se
tuvieron en consideración todas las secuencias de BLAST que
mostraron probabilidades inferiores a 0,1 y se construyó un
listado conteniendo una lista de secuencias homólogas no
redundantes. Estas fueron alineadas por CLUSTAL W (HIggins et.
Al., ref. 19) y se calculó el porcentaje de identidad para cada
posición en la secuencia considerando la lista completa o solamente
las especies relacionadas taxonómicamente. Un total de 122
secuencias fueron homólogas a Bet v 1 Nº 2801 de las cuales
57 secuencias eran originarias de especies relacionadas
taxonómicamente.
Se preparó ARN de polen de Betula
verrucosa (Allergon, Suecia) por extracción con fenol y
precipitación con LiCl. Se realizó una cromatografía de afinidad
en columnas de celulosa con oligo-(dT) en proceso discontinuo
(batch-wise) en tubos Eppendorph, y se sintetizó el
cADN de doble hebra utilizando un Kit comercial (Amersham). El ADN
que codifica el Bet v 1 se amplificó por PCR y se clonó. En
resumen, se realizó una PCR utilizando cADN como molde y cebadores
diseñados para hibridar con la secuencia del cADN en las posiciones
correspondientes al extremo amino terminal del Bet v 1 y a
la región 3' no traducida respectivamente. Los cebadores se
extendieron en los extremos 5' para acomodarse a los sitios de
restricción (NcoI y Hind III) para la clonación
direccional en pkk233-2.
El gen que codifica el Bet v 1fue
posteriormente subclonado en el vector de fusión pMALc de la
proteína de unión a la maltosa. (New England Biolabs). El gen fue
amplificado por PCR y subclonado en un marco de lectura con
malE para generar los operones de fusión de la proteína de
Bet v 1- proteína de unión a la maltosa (MBP), en los cuales
MBP y Bet v 1 fueron separados por una proteasa del factor Xa
posicionada en el sitio de escisión para restablecer la secuencia
del extremo amino terminal auténtica del Bet v 1 en el
clonado, como se describe en la ref. 15. En resumen, la PCR se llevo
a cabo utilizando pKK233-3 con el Bet v 1
insertado como molde y los cebadores correspondientes al amino y al
carbono teminales de la proteína, respectivamente. El cebador
proximal del promotor se extendió en el extremo 5' para acomodar 4
codones que codifican un sitio de escisión de la proteasa del
factor Xa en el marco de lectura. Ambos cebadores fueron además
extendidos en los extremos 5' para acomodar los sitios de
restricción (KpnI) para el clonado. Los genes que codifican
el Bet v 1 fueron subclonados utilizando 20 ciclos de PCR
para reducir la frecuencia de los artefactos de la PCR.
La mutagénesis in vitro se llevo a cabo
por PCR utilizando el pMAL-c recombinante con el
Bet v 1 insertado como molde. Cada gen Bet v 1
mutante fue generado por 3 reacciones de PCR utilizando 4
cebadores.
Se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos
específicos para la mutación acomodando cada mutación, una para
cada hebra de ADN, ver las Figs. 1 y 2. Utilizando el/los
nucleótido/s mutados como punto de inicio, ambos cebadores fueron
extendidos 7 nucleótidos en el extremo 5' y 15 nucleótidos en el
extremo 3'. Los nucleótidos extendidos eran idénticos en la
secuencia a los del gen de Bet v 1 en la misma región.
Además se sintetizaron dos cebadores de
aplicación general (denominados "all- sense" y "all
non-sense" en la Figura 2) (denominados "todo
sentido" y "todo antisentido" en la Figura 2) y se
utilizaron para todos los mutantes. Estos cebadores tenían una
longitud de 15 nucleótidos y se corresponden en secuencia con las
regiones del vector pMAL-c aproximadamente 1
kilobase curso arriba (upstream) y curso abajo (downstream) del
Bet v 1. La secuencia del cebador curso arriba (upstream)
deriva de la hebra sentido y la secuencia del cebador curso abajo
(downstream) deriva de la hebra antisentido, ver Fig. 2.
Se llevaron a cabo dos reacciones de PCR
independientes, básicamente según los procedimientos estándar
(Saiki et al 1988, ref. 20) con la excepción de que se
realizaron solo 20 ciclos de temperatura para reducir la frecuencia
de los artefactos de la PCR. Cada reacción de PCR utilizó
pMAL-c con el Bet v 1 insertado como molde y
una mutación específica y un cebador de aplicación general en
combinaciones significativas.
La introducción de las sustituciones de los
cuatro aminoácidos (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) en el
Mutante Triple se efectuó como se describe anteriormente en un
proceso en varias etapas. Se introdujo en primer lugar la mutación
Glu45Ser, después la mutación Pro108Gly y por último las mutaciones
Asn23Thr y Lys32Gln utilizando pMAL-c con el Bet
v 1 No.2801, el Bet v 1 (Glu45Ser), el
Bet v 1 (Glu45Ser, Pro108Gly) insertados como moldes,
respectivamente.
Los productos de la PCR fueron purificados por
electroforesis en gel de agarosa y electro-elución
seguida de precipitación con etanol. Se efectuó una tercera
reacción de PCR utilizando los productos combinados de PCR de las
primeras dos reacciones de PCR como molde y ambos cebadores de
aplicación general. Se utilizaron de nuevo 20 ciclos de PCR
estándar. El producto de PCR fue purificado por electroforesis en
gel de agarosa y electro-elución seguida de
precipitación con etanol, escindido con las enzimas de restricción
(BsiWI/EcoRI), y ligado direccionalmente en
pMAL-c con el Bet v 1 insertado restringido
con las mismas enzimas.
La Figura 3 muestra una visión general de todas
las 9 mutaciones del Bet v 1 que son las siguientes.
Thr10Pro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln,
Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser
(non-patch)(fuera de la zona), Thr77Ala y Pro108Gly.
Se preparo un mutante adicional con cuatro mutaciones (Asn28Thr,
Lys32Gln, GLu45Ser, Pro108Gly). De estos, se seleccionaron cinco
para otros ensayos: Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser,
Pro108Gly y el Mutante Triple Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser,
Pro108Gly.
La determinación de la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica el Bet v 1 se efectúo antes y después
de la subclonación y después de la mutagénesis in vitro,
respectivamente.
Los plásmidos de los ADN de un cultivo
bacteriano de 10 ml cultivado hasta la saturación durante la noche
en un medio LB complementado con 0,1 g/l de ampicilina fueron
purificados en columnas de Qiagen-tip y secuenciados
utilizando el kit de secuenciación de ADN Sequenase versión 2.0
(USB) siguiendo las recomendaciones de los proveedores.
El Bet v 1 recombinante (Bet v 1
No 2801 y mutantes) se sobre-expresó en
Escherichia coli DH 5a fusionada con la proteína de unión a
la maltosa y purificada como se describe en la ref. 15. Brevemente,
las células de E. coli recombinantes se cultivaron a 37ºC a
una densidad óptica de 1,0 a 436 nm, después de lo cual se indujo
la expresión de la proteína de fusión Bet v 1 por adición de
IPTG. Las células se cosecharon por centrifugación tres horas
después de la inducción, fueron suspendidas de nuevo en un tampón
de lisis y se rompieron por sonicación. Después de la sonicación y
una centrifugación adicional, la proteína de fusión recombinante
fue aislada por cromatografía de afinidad en amilosa y escindida
mas tarde por incubación con el Factor Xa (ref. 15). Después de la
escisión con F Xa, el Bet v 1 recombinante se aisló por
filtración en gel y si se consideró necesario, se sometió a otra
rutina de cromatografía de afinidad en amilosa para eliminar las
trazas de proteína de unión a la maltosa.
El Bet v 1 purificado se concentró por
ultrafiltración a aproximadamente 5 mg/ml y se conservo a 4ºC. La
producción final del Bet v 1 recombinante purificado fue de
entre 2-5 mg por litro de cultivo de células de
E. coli.
Las preparaciones del Bet v 1
recombinante purificado aparecían como bandas sencillas después de
una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS con tinción de
plata, con un peso molecular aparente de 17,5 kDa. La secuenciación
del extremo N terminal mostraba las secuencias esperadas derivadas
de las secuencias de nucleótidos de cADN y el análisis cuantitativo
de los aminoácidos mostraba las composiciones de aminoácidos
esperadas.
Hemos mostrado previamente (ref.15) que el
Bet v 1 recombinante No 2801 es indistinguible
inmunológicamente del Bet v 1 de origen natural.
Los siete mutantes Bet v 1 se produjeron
como proteínas recombinantes del Bet v 1 y se purificaron
como se ha descrito anteriormente y se determino su reactividad
frente a los anticuerpos policlonales de conejo producidos contra
el Bet v 1 aislado a partir de polen de abedul. Cuando se
analizaron por inmunoelectroforesis (inmunoelectroforesis en
cono) en condiciones nativas, los anticuerpos de conejo pudieron
precipitar todos los mutantes, indicando que los mutantes habían
conservado la estructura terciaria de la cadena principal de
carbonos \alpha.
Estos resultados sugirieron que las
sustituciones artificiales introducidas en la superficie molecular
del Bet v 1 pueden disminuir una respuesta frente a un
anticuerpo policlonal, producido contra el Bet v 1 de origen
natural sin distorsión de la estructura terciaria general de la
cadena principal de carbonos \alpha del alérgeno. Para analizar
el efecto en la respuesta a IgE policlonal humana, fueron
seleccionados para posteriores análisis los siguientes mutantes
Glu45Ser, Pro108Gly, Asn28Thr+Lys32Gln y Glu60Ser.
El ácido glutámico en posición 45 muestra un
alto grado de exposición al disolvente (40%) y se localiza en una
zona de la superficie molecular común para los alérgenos de
Fagales (zona I). Se encontró un resto de serina que ocupa
la posición 45 en algunas de las proteínas PR-10
homólogas del Bet v 1 abogando por que el ácido glutámico
pueda ser reemplazado por una serina sin distorsión de la estructura
terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha. Además como
ninguna de las secuencias de alérgenos de Fagales conocidas
tiene una serina en la posición 45, la sustitución de ácido
glutámico con serina da lugar a una molécula de Bet v 1
artificial.
El análisis se llevo a cabo como se describe en
Spangfort et al 1966a. Se encontró que el mutante Bet v
1 Glu45Ser recombinante era capaz de inducir la proliferación en
las líneas de células T de tres pacientes diferentes alérgicos al
polen del abedul con índices de estimulación similares para los
recombinantes y para los de origen natural.
Se cultivaron cristales del Bet v 1
Glu45Ser recombinante por difusión de vapor a 25ºC, básicamente
como se describe en (Spangfort et al 1996b, ref. 21). Se
mezcló el Bet v 1 Glu45Ser a una concentración de 5 mg/ml
con un volumen igual de sulfato de amonio 2,0 M, citrato de sodio
0,1 M, 1% de dioxano (v/v), a un pH 6,0 y se equilibró contra un
volumen100x de sulfato de amonio 2,0 M, citrato de sodio 0,1 M, 1%
de dioxano (v/v), a un pH 6,0. Después de 24 horas de equilibrio,
se indujo el crecimiento del cristal por aplicación de la técnica
de de siembra de cristales descrita en la ref. 21, utilizando
cristales de la cepa salvaje del Bet v 1 recombinante como
origen de las semillas. Después de 2 meses aproximadamente se
recolectaron los cristales y se analizaron usando rayos X generados
por un ánodo rotatorio Rigaku como se describe en la ref. 21 y la
estructura se resolvió por sustitución molecular.
El efecto estructural de la mutación se afrontó
por crecimiento tridimensional de cristales de proteína del Bet
v 1 Glu45Ser difractando a una resolución de 3,0 \ring{A}
cuando se analizan por rayos X generados por un ánodo rotatorio. La
sustitución de ácido glutámico por serina en la posición 45 se
verificó mediante la estructura del mapa de densidad electrónica
que mostró también que la estructura terciaria de la cadena
principal de carbonos \alpha está conservada.
Las propiedades de unión del mutante Bet v 1
Glu45Ser se compararon con las del Bet v 1 recombinante en
un ensayo de inhibición en fase fluida utilizando un conjunto de
sueros con IgE derivados de pacientes alérgicos al abedul.
El Bet v 1 nº 2801 fue biotilinado en una
proporción molar de 1:5 (Bet v 1 nº 2801:biotina). El ensayo
de inhibición se efectúo de la siguiente forma: una muestra de suero
(25 \mul) se incubó con una fase sólida anti IgE, se lavó, se
suspendió de nuevo y se incubó con una mezcla del Bet v 1 nº
2801 biotilinado (2,4 nM) y un mutante dado (0-28,6
nM). Se estimó la cantidad de Bet v 1 biotilinado unido a la
fase sólida a partir del RLU medido después de la incubación con
éster de acridina marcado con estreptavidina. El grado de
inhibición se calculó como la proporción entre la/s RLU obtenidas
utilizando un tampón y el mutante como inhibidor.
La figura 4 muestra la inhibición de la unión
del Bet v 1 recombinante biotilinado a los sueros con IgE de
un grupo de pacientes alérgicos, por el Bet v 1 no
biotilinado y por el mutante Bet v 1 Glu45Ser.
Hay una clara diferencia entre la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas necesarias para alcanzar el 50%
de inhibición de la unión a suero con IgE presente en el conjunto de
sueros. El Bet v 1 recombinante alcanza el 50% de inhibición
a 6,5 ng aproximadamente mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Bet v 1 Glu45Ser es de 12 ng
aproximadamente. Esto muestra que la mutación puntual introducida
en el mutante Bet v 1 Glu45Ser disminuye la afinidad para el
suero con IgE específico en un factor de 2 aproximadamente. El
nivel máximo de inhibición alcanzado por el mutante Bet v 1
Glu45Ser es claramente inferior en comparación con el de Bet
v 1 recombinante. Esto puede indicar que después de la
sustitución con Glu45Ser, algunos de los IgE específicos presentes
en el conjunto de los sueros son incapaces de reconocer al mutante
Bet v 1 Glu45Ser.
El aspartato (ácido aspártico) y la lisina en
las posiciones 28 y 32 respectivamente, muestran un alto grado de
exposición al disolvente (35% y 50% respectivamente) y están
localizados en una zona común de la superficie molecular de los
alérgenos de Fagales (zona II). En la estructura, el
aspartato 28 y la lisina 32 están localizados cerca el uno de otro
en la superficie molecular y muy probablemente interaccionan
mediante enlaces de hidrógeno. Se encontraron restos de treonina y
glutamato (ácido glutámico) ocupando las posiciones 28 y 32
respectivamente en algunas de las proteínas PR-10
homólogas del Bet v 1 abogando porque el aspartato (ácido
aspártico) y la lisina puedan se reemplazadas con treonina y
glutamato (ácido glutámico), respectivamente sin distorsión de la
estructura terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha.
Además como ninguna de las secuencias de isoalérgenos de origen
natural tiene treonina ni glutamato en las posiciones 28 y 32,
respectivamente, las sustituciones dan lugar a una molécula de
Bet v 1
artificial.
artificial.
Las propiedades de la unión a IgE del mutante
Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln se compararon con las del Bet
v 1 recombinante en un ensayo de inhibición en fase fluida
utilizando un conjunto de sueros con IgE derivados de pacientes
alérgicos al abedul.
La figura 5 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotilinado a sueros con IgE de un
grupo de pacientes alérgicos, por el Bet v 1 no biotilinado y
por el mutante Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.
Hay una clara diferencia entre la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas necesarias para alcanzar el 50%
de inhibición de la unión a los sueros con IgE presentes en el
conjunto de sueros. El Bet v 1 recombinante alcanza el 50%
de inhibición a 6,5 ng aproximadamente mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln es
de 12 ng aproximadamente. Esto muestra que las mutaciones puntuales
introducidas en el mutante Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln
disminuyen la afinidad para IgE de sueros específicos en un factor
de 2 aproximadamente.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln es claramente inferior
comparando con el de Bet v 1 recombinante. Esto puede indicar
que después de la sustitución con Asn28Thr+Lys32Gln, algunos de los
IgE específicos presentes en el conjunto de sueros son incapaces de
reconocer al mutante Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.
La prolina en posición 108 muestra un grado alto
de exposición al solvente (60%) y está localizada en una zona común
de la superficie molecular de los alérgenos de Fagales (zona
III). Se encontró un resto de glicina que ocupa la posición 108 en
algunas de las proteínas PR-10 homólogas de Bet
v 1 abogando por que la prolina pueda ser reemplazada por una
glicina sin distorsión de la estructura terciaria de la cadena
principal de carbonos \alpha. Además, como ninguna de las
secuencias de isoalérgenos de origen natural conocidas tiene una
glicina en la posición 108, la sustitución de prolina con glicina da
lugar a una molécula de Bet v 1 artificial.
Las propiedades de la unión del mutante Bet v 1
Pro108Gly se compararon con las de Bet v 1 recombinante en
un ensayo de inhibición en fase fluida utilizando el conjunto de
sueros con IgE derivados de pacientes alérgicos al abedul descrito
anteriormente.
La figura 6 muestra la inhibición de la unión
del Bet v 1 recombinante biotilinado a sueros con IgE de un
grupo de pacientes alérgicos, por Bet v 1 no biotilinado y
por el mutante Bet v 1 Pro108Gly.
Hay una clara diferencia entre la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas necesarias para alcanzar el 50%
de inhibición de la unión a sueros con IgE presente en el conjunto
de sueros. El Bet v 1 recombinante alcanza el 50% de
inhibición a 6,5 ng aproximadamente mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Bet v 1 Pro108Gly es de 15
ng. Esto muestra que la mutación puntual única introducida en el
mutante Bet v 1 Pro108Gly disminuye la afinidad para IgE de
sueros específicos en un factor de 2 aproximadamente.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Bet v 1 Pro108Gly es algo inferior en comparación
con el de Bet v 1 recombinante. Esto puede indicar que
después de la sustitución con Pro108Gly, algunos de los IgE
específicos presentes en el conjunto de sueros son incapaces de
reconocer al mutante Bet v 1 Pro108Gly.
El ácido glutámico en la posición 60 muestra un
alto grado de exposición al disolvente (60%) sin embargo, no está
localizado en la superficie molecular de la zona común para los
alérgenos de Fagales. Se encontró un resto de serina que
ocupa la posición 60 en algunas de las proteínas
PR-10 homólogas de Bet v 1 abogando porque
la serina pueda ser reemplazada por una glicina sin distorsión de
la estructura terciaria de la cadena principal de carbonos
\alpha. Además como ninguna de las secuencias de isoalérgenos de
origen natural conocidas tiene una serina en la posición 60, la
sustitución de ácido glutámico con serina da lugar a una molécula de
Bet v 1 artificial.
Las propiedades de la unión del mutante Bet v 1
Glu60Ser se compararon con las del Bet v 1 recombinante en
un ensayo de inhibición en fase fluida utilizando un conjunto de
sueros con IgE derivado de pacientes alérgicos al abedul.
La figura 7 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotilinado a sueros con IgE de un
grupo de pacientes alérgicos, por Bet v 1 no biotilinado y
por el mutante Bet v 1 Glu60Ser. En contraste con los
mutantes Glu45Ser, Pro108Gly y Asn28Thr+Lys32Gln, las sustitución de
el ácido glutámico 60 por la serina, no muestra ningún efecto
significativo en las propiedades de unión a IgE. Esto indica que
las sustituciones fuera de las zonas comunes de Fagales
definidas, tienen solo un efecto marginal en la unión a un suero
con IgE específico apoyando este concepto el que las áreas de
superficie molecular conservadas de los alérgenos albergan los
epitopos de IgE dominantes.
En el Mutante Triple, las mutaciones puntuales
(Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln y Pro108Gly) introducidas en las tres
zonas diferentes comunes a los Fagales, descritas
anteriormente, son introducidas simultáneamente creando un mutante
artificial que lleva cuatro sustituciones de aminoácidos.
La integridad estructural del Mutante Triple
purificado se analizó por espectrometría de dicroísmo circular
(CD). La figura 8 muestra el espectro CD del recombinante y del
Mutante Triple, registrado a concentraciones cercanas a la
igualdad. El solapamiento en las amplitudes máximas y las
posiciones en el espectro CD de las dos proteínas recombinantes
muestra que las dos preparaciones contienen cantidades iguales de
estructuras secundarias sugiriendo firmemente que la estructura
terciaria de la cadena principal de carbonos \alpha no está
afectada por las sustituciones de aminoácidos introducidas.
Las propiedades de la unión del Mutante Triple
Bet v 1 se compararon con las de Bet v 1 recombinante en un
ensayo de inhibición en fase fluida utilizando un conjunto de sueros
con IgE derivado de pacientes alérgicos al abedul descrito
anteriormente.
La figura 9 muestra la inhibición de la unión
del Bet v 1 recombinante biotilinado a sueros con IgE de un
grupo de pacientes alérgicos, por Bet v 1 no biotilinado y
por el Mutante Triple Bet v 1. En contraste con los mutantes
sencillos descritos anteriormente, la curva de inhibición del
Mutante Triple ya no es paralela en relación con el recombinante.
Esto muestra que las sustituciones introducidas en el Mutante Triple
han cambiado las propiedades de unión a IgE y el perfil del epitopo
comparado con el recombinante. La falta de paralelismo hace difícil
cuantificar la disminución de la afinidad del mutante triple por
el suero con IgE específico.
El recombinante Bet v 1 alcanza el 50% de
inhibición a aproximadamente 6 ng mientras que la concentración
correspondiente para el Mutante Triple Bet v 1 es de 30 ng,
es decir una disminución en la afinidad en un factor de 5. Sin
embargo, para alcanzar el 80% de inhibición los valores
correspondientes son de 20 ng y 400 ng respectivamente, es decir
una disminución por 5.
El análisis se llevó a cabo como se describe en
la ref. 5. Se encontró que el Mutante Triple Bet v 1 podía
inducir la proliferación de las líneas celulares T de tres pacientes
diferentes alérgicos al polen de abedul con índices de estimulación
similares hacia los recombinantes y los de origen natural. Esto
sugiere que el Mutante Triple puede iniciar la respuesta inmune
necesaria para la producción de anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El antígeno 5 es una de las tres proteínas
venenosas de los véspidos, que son alérgenos conocidos en el hombre.
Los véspidos incluyen los avispones, véspulas (yellow
jackets) y avispas (wasps). Los otros dos alérgenos de
los véspidos conocidos son la fosfolipasa A_{1} y la
hialuronidasa. El antígeno 5 de Vespula vulgaris (Ves
v 5) ha sido clonado y expresado como proteína recombinante en
el sistema de levaduras (Montsalve et al. 1999, ref.22). La
estructura de cristal tridimensional del Ves v 5 recombinante
ha sido determinada recientemente a una resolución de 1,8
\ring{A} (en preparación). Las principales características de la
estructura consisten en cuatro hebras \beta y cuatro hélices
\alpha dispuestas en tres capas superpuestas que dan lugar a un
"sándwich
\alpha-\beta-\alpha". La
identidad de la secuencia entre los alérgenos homólogos del
Antígeno 5 de las diferentes especies de Vespula es
aproximadamente del 90%, sugiriendo la presencia de áreas de
superficie molecular conservadas y epitopos de células B.
La presencia e identificación de zonas comunes
se efectúo después del alineamiento de todas las secuencias de
aminoácidos conocidas del antígeno 5 de Vespula, como se
describió previamente para los alérgenos de polen de arboles, en
combinación con un análisis de la superficie molecular del Antígeno
5, revelada por la estructura tridimensional de Ves v 5. La Figura
10 muestra la accesibilidad al disolvente de los restos del
antígeno 5 y el alineamiento de las 5 secuencias del antígeno de
Vespula (panel izquierdo). En el panel de la derecha de la
figura 10 se muestra la superficie molecular del antígeno 5 con las
áreas conservadas entre el antígeno 5:s de Vespula en
color.
Los restos de aminoácidos para la mutagénesis
dirigida se seleccionaron entre los restos presentes en las zonas
comunes de Vespula ya que se espera que las modificaciones de
los mismos afecten a la unión del suero con IgE de la mayoría de
los pacientes que muestran una reacción alérgica clínica cruzada al
polen de Vespula.
La orientación relativa y el porcentaje de
exposición al disolvente de cada resto de aminoácido dentro de cada
zona respectiva, se calculó en base a sus coordenadas atómicas. Los
restos que tienen un grado de exposición al solvente bajo no se
consideraron adecuados para la mutagénesis debido a la posible
ruptura de la estructura o la falta de interacción el anticuerpo.
El resto de los restos se clasificaron según su grado de exposición
al disolvente.
El RNA total fue aislado de las glándulas ácidas
del veneno de Vespula vulgaris como se describe en
(Fang et al. 1988, ref. 23).
La síntesis de la primera hebra de cADN, la
amplificación por PCR y la clonación del gen Ves v 5 se
efectuó como se describe en (Lu et al. 1993, ref.24)
El gen que codifica Ves v 5 fue
posteriormente subclonado en el vector pPICZ\alphaA (Invitrogen)
para la expresión de Ves v 5 secretada en Pichia
pastoris. El gen fue amplificado por PCR y subclonado en un
marco de lectura con la secuencia que codifica la señal de secreción
del factor-\alpha de Saccharomyces
cervisiae. En esta construcción el
factor-\alpha fue escindido, in vivo, por
el sistema de la proteasa Kex2 de Pichia pastoris
durante la secreción de la proteína.
En resumen, la PCR se llevo a cabo utilizando
Ves v 5 como molde y los cebadores correspondientes a
los extremos amino y carbono terminal de la proteína,
respectivamente. Los cebadores se extendieron en el extremo 5' para
acomodar los sitios de restricción para la clonación, EcoRI y XbaI,
respectivamente. Los nucleótidos que codifican el sitio de escisión
Kex2 en esta construcción se posicionaron 18 nucleótidos curso
arriba (upstream) del extremo amino terminal de la proteína, dando
como resultado la expresión de Ves v 5 con seis
aminoácidos adicionales,
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe,
en el extremo amino terminal.
Los vectores pPICZ\alphaA con el gen
Ves v 5 insertado fueron linealizados por restricción
con Sac I e insertados dentro del sitio AOX1 del genoma de
Pichia pastoris. La inserción se efectúo por
recombinación homologa en las células KM71 de Pichia
pastoris siguiendo las recomendaciones de Invitrogen.
La mutagénesis in vitro se efectúo por
PCR utilizando pPICZ\alphaA recombinante con Ves v 5
insertada como molde. Cada gen Ves v 5 mutante fue
generado por 3 reacciones PCR utilizando 4 cebadores.
Se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos
específicos para la mutación acomodando cada mutación, una para
cada hebra de ADN, ver las Figs. 11 y 12. Utilizando el/los
nucleótido/s mutados como punto de inicio ambos cebadores fueron
extendidos 6-7 nucleótidos en el extremo 5' y
12-13 nucleótidos en el extremo 3'. Los nucleótidos
extendidos eran idénticos en su secuencia a los del gen de
Ves v 5 en la misma región.
Además se sintetizaron dos cebadores de
aplicación general (denominados "all- sense" y "all
non-sense" en la Figura 2) (denominados "todo
sentido" y " todo antisentido" en la Figura 2) utilizados
para todos los mutantes. Para asegurar la expresión de los mutantes
del Ves v 5 con el extremo amino terminal autentico,
un cebador correspondiente al extremo amino terminal de la proteína
fue extendido en el extremo 5' terminal con un sitio Xho I.
Mediante la inserción de los genes mutantes de Ves v
5 en el vector pPICZ\alphaA, el sitio de escisión de la proteasa
Kex2 fue regenerado directamente curso arriba (upstream) hasta el
extremo amino terminal de Ves v 5. El segundo cebador se
correspondía en su secuencia con una región del vector pPICZ\alpha
posicionado aproximadamente 300 pb curso abajo (downstream) del gen
Ves v 5. La secuencia del cebador correspondiente al extremo
amino terminal de Ves v 5 se deriva de la hebra sentido y la
secuencia del cebador curso abajo (downstream) se deriva de la
hebra antisentido, ver
Figura 11.
Figura 11.
Se llevaron a cabo dos reacciones de PCR
independientes, básicamente según los procedimientos estándar
(Saiki et al 1988, ref. 20) con la excepción de que se
realizaron solo 20 ciclos de temperatura para reducir la frecuencia
de los artefactos de la PCR. Cada reacción de PCR utilizó
pPICZ\alpha con Ves v 5 insertado como molde y un
cebador específico para la mutación y un cebador de aplicación
general en combinaciones significativas.
Los productos de la PCR fueron purificados
utilizando "Concert, Rapid, PCR Purification System" (Life
Technologies). Se efectuó una tercera reacción de PCR utilizando
los productos combinados de PCR de las dos primeras reacciones de
PCR como moldes, y ambos cebadores de aplicación general. Se
utilizaron de nuevo 20 ciclos de PCR estándar. El producto de PCR
fue purificado con el "Concert, Rapid, PCR Puridication
System" (Life Technologies), fue escindido con las enzimas de
restricción (XhoI/XbaI), y ligado direccionalmente en el
vector pPICZ\alpha restringido con las mismas enzimas. La figura
13 muestra una visión general de todas las mutaciones de Ves v
5.
Los vectores pPICZ\alpha con los genes
mutantes Ves v 5 insertados fueron linealizados por
restricción con Sac I e insertados en el sitio AOXI en el genoma de
Pichia Pastoris. Las inserciones se efectuaron por
recombinación homologa en las células KM71 de Pichia
Pastoris siguiendo las recomendaciones de Invitrogen.
La determinación de la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica Ves v 5 se efectúo antes y después de
la subclonación y después de la mutagénesis in vitro,
respectivamente.
Los plásmidos de los ADN de un cultivo
bacteriano de 10 ml cultivado hasta la saturación durante la noche
en un medio LB complementado con 0,1 g/l de ampicilina fueron
purificados en 20 columnas de Qiagen-tip y
secuenciados utilizando el kit de secuenciación de ADN Sequenase
versión 2.0 (USB) siguiendo las recomendaciones de los
proveedores.
Se cultivaron células de levaduras recombinantes
de la cepa KM71 Pichia pastoris en botellas de 500 ml
conteniendo 100 ml de tampón fosfato a ph 6,0 conteniendo una base
de nitrógeno para levaduras, biotina, glicerol e histidina a 30ºC
con agitación orbital a 225 rpm hasta A_{600} nm de
4-6. Las células se recolectaron por centrifugación
y se suspendieron otra vez en 10 ml de un medio tamponado similar
conteniendo metanol en lugar de glicerol. Se continuó la incubación
a 30ºC durante 7 días con una adición diaria de 0,05 ml de
metanol.
Las células se recolectaron por centrifugación y
el cultivo fluido recogido se concentró por ultrafiltración.
Después de una diálisis contra 50 mM de un tampón de acetato de
amonio, ph4,6, se aplicó la muestra a una columna de intercambio
catiónico SE-53 FPLC (Pharmacia) equilibrada en el
mismo tampón. La columna se eluyó con 0-1,0 M
NaCL, 50 mM de gradiente lineal de acetato de amonio. El máximo del
Ves v 5 recombinante que eluye aproximadamente a 0,4 M de NaCl se
recogió y se dializó contra ácido acético 0,02 N. Después de la
concentración a 10 mg/ml aproximadamente, el Ves v 5 purificado se
almacenó a 4ºC.
Se cultivaron cristales de Ves v 5
recombinante según la técnica de difusión de vapor a 25ºC. Para la
cristalización se mezclaron 5 \mul de Ves v 5 de 5 mg/ml con 5
\mum de 18% de PEG 6000, 0,1 M de citrato de sodio, a ph 6,0 y
equilibrado frente a 1 ml de 18% de PEG 6000, 0,1 M de citrato de
sodio, a ph 6,0.
Se recogió el dato de difracción de rayos X a
100K de los cristales de Ves v 5 nativa después de
la incorporación de derivados de átomos pesados y se utilizó para
resolver la estructura tridimensional de Ves v 5, ver
la Figura 10 (manuscrito en preparación)
Los dos mutantes Ves v 5 se
produjeron como proteínas recombinantes de Ves v 5 y
se determinó su reactividad frente a los anticuerpos policlonales
de conejo producidos por su reactividad contra Ves v
5. Cuando se analizaron por inmunoelectroforesis
(inmunoelectroforesis en cono, o Rocket Line) en condiciones
nativas, los anticuerpos de conejo pudieron precipitar todos los
Ves p 5 recombinantes así como ambos mutantes, indicando que
los mutantes habían conservado la estructura terciaria de la cadena
principal de carbonos \alpha.
Las propiedades de la unión a IgE de los
mutantes Ves v 5 se compararon con el Ves
v 5 recombinante en un ensayo de inhibición de IgE en fase
fluida utilizando suero con IgE derivado de un grupo de pacientes
alérgicos al veneno de véspidos.
El ensayo de inhibición se efectuó como se ha
descrito anteriormente utilizando Ves v 5 recombinante
biotilinado, en lugar de Bet v 1.
La lisina en posición 72 muestra un alto grado
de exposición al disolvente (70%) y está localizada en una zona de
la superficie molecular común para el antígeno 5 de Vespula.
La orientación relativa y el alto grado de exposición al disolvente
abogó porque la lisina 72 pueda ser reemplazada por un resto de
alanina sin distorsión de la estructura terciaria de la cadena
principal de carbonos \alpha. Además, como ninguna de las
secuencias de isoalérgenos de origen natural conocidas tiene una
alanina en la posición 72, la sustitución de la lisina con alanina
da lugar a una molécula de Ves v 5 artificial.
Las propiedades de la unión a IgE del mutante
Ves v 5 Lys72Ala se compararon con las de Ves
v 5 recombinante en un ensayo de inhibición en fase fluida
utilizando un conjunto de sueros con IgE derivado de pacientes
alérgicos al abedul.
La figura 14 muestra la inhibición de la unión
del Ves v 5 recombinante biotilinado a sueros con IgE
de un grupo de pacientes alérgicos, por el Ves v 5 no
biotilinado y por el mutante Ves v 5 Lys72Ala.
Hay una clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas necesarias para alcanzar el 50%
de inhibición de la unión a los sueros con IgE presente en el
conjunto de sueros. El Ves v 5 recombinante alcanza
el 50% de inhibición a 6 ng aproximadamente, mientras que la
concentración correspondiente para el mutante Ves v
5 Lys72Ala es de 40 ng. Esto muestra que la mutación puntual única
introducida en el mutante Ves v 5 Lys72Ala disminuye
la afinidad para IgE de sueros específicos en un factor de 6
aproximadamente.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Ves v 5 Lys72Ala es significativamente
inferior comparado con el del Ves v 5 recombinante.
Esto puede indicar que después de la sustitución Lys72Ala, algunos
de los IgE específicos presentes en el conjunto de sueros, son
incapaces de reconocer al mutante Ves v 5
Lys72Ala.
La tirosina en posición 96 muestra un alto grado
de exposición al disolvente (65%) y esta localizada en una zona de
la superficie molecular común para el antígeno 5 de Vespula.
La orientación relativa y el alto grado de exposición al disolvente
abogan porque la tirosina 96 pueda ser reemplazada por un resto de
alanina sin distorsión de la estructura tridimensional. Además,
como ninguna de las secuencias de isoalérgenos de origen natural
conocidas tiene una alanina en la posición 96, la sustitución de la
tirosina con alanina da lugar a una molécula de Ves v
5
artificial.
artificial.
Las propiedades de la unión a IgE del mutante
Ves v 5 Tyr96Ala se compararon con las del Ves
v 5 recombinante, en un ensayo de inhibición en fase fluida
utilizando un conjunto de sueros con IgE derivado de pacientes
alérgicos al abedul descrito anteriormente.
La figura 14 muestra la inhibición de la unión
del Ves v 5 recombinante biotilinado a sueros con IgE
de un grupo de pacientes alérgicos, por Ves v 5 no
biotilinado y por el mutante Ves v 5 Tyr96Ala.
Hay una clara diferencia entre la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas necesarias para alcanzar el 50%
de inhibición de la unión a sueros con IgE presente en el conjunto
de sueros. El Ves v 5 recombinante alcanza el 50% de
inhibición a 6 ng aproximadamente, mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Ves v 5 Tyr96Ala es
de 40 ng.
Esto muestra que la mutación puntual única
introducida en el mutante Ves v 5 Tyr96Ala disminuye
la afinidad para sueros con IgE específicos en un factor de 6
aproximadamente.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Ves v 5 Tyr96Ala es significativamente
inferior comparado con el del Ves v 5 recombinante.
Esto puede indicar que después de la sustitución Tyr96Ala, algunos
de los IgE específicos presentes en el conjunto de sueros son
incapaces de reconocer al mutante Ves v 5
Tyr96Ala.
1. WO 97/30150 (Pangenetics B.V., Molecules for
the induction of immunological tolerance)
2. WO 92/02621 (Biomay Biotechnik Produktions -
und Handelsgesellschaft mbH, Allergens of Alder pollen and
applications thereof)
3. WO 90/11293 (Immunologic Pharmaceutical
Corporation, The University of North Carolina at Chapel Hill,
Allergenic proteins from ragweed and uses thereof)
4. Takai T, Yokota T, Yasue
M, Nishiyama C, Yuuki T, Mori A,
Okudaira H, Okumura Y: "Engineering of the major
house dust mite allergen Der f 2 for
allergen-specific immunotherapy". Nat
Biotechnol 15, 754-758 (1997).
5. Smith AM, Chapman MD:
"Localization of antigenic sites on Der p 2 using
oligonucleotide-directed mutagenesis targeted to
predicted surface residues". Clin Exp Allergy 27,
593-599 (1997).
6. Aki T, Ono K, Hidaka Y,
Shimonishi Y, Jyo T, Wada t, Yamashita
M, Shigeta S, Murooka Y, Oka S: "Structure
of IgE epitopes on a new 39-kD allergen molecule
from the dust mite, Dermatophagoides farinae". Int Arch
Allergy Immunol 103, 357-364 (1994).
7. Förster E, Dudler T,
Gmachl M, Aberer W, Urbanek R, Suter M:
"Natural and recombinant enzymatically active or inactive bee
venom phospholipase A2 has the same potency to release histamine
from basophils in patients with Hymenoptera allergy". J
Allergy Clin Immunol 95, 1229-1235
(1995).
8. Burks AW, Shin D,
Cockrell G, Stanley JS, Helm RM, Bannon
GA: "Mapping and mutational analysis of the
IgE-binding epitopes on Ara h 1, a legume vicilin
protein and a major allergen in peanut hypersensitivity". Eur
J Biochem 245, 334-339 (1997).
9. Stanley JS, King N,
Burks AW, Huang SK, Sampson H, Cockrell
G, Helm RM, West CM, Bannon GA:
"Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE
binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2". Arch
Biochem Biophys 342, 244-253 (1997).
10. Ferreira F, Rohlfs A,
Hoffmann-Sommergruber K, Schenk S,
Ebner C, Briza P, Jilek A, Kraft D,
Breitenbach M, Scheiner O: "Modulation of IgE-
binding properties of tree pollen allergens by
site-directed mutagenesis". Adv Exp Med
Biol 409, 127-135 (1996).
11. Ferreira F, Ebner C,
Kramer B, Casari G, Briza P, Kungl AJ,
Grimm R Jah-Schmid B,
Breiteneder H, Kraft D, Breitenbach M,
Rheinberger H-J, Scheiner O,
"Modulation of IgE reactivity of allergens by
site-directed mutagenesis: Potential use of
hypeallergenic variants for immunotherapy", FASEB Journal for
Experimental Biology Vol. 12, No. 2, February 1998,
231-242 (1998).
12. Wiedemann P, Giehl K,
Almo SC, Fedorov AA, Girvin M,
Steinberger P, Rüdiger M, Ortner M,
Sippl M, Dolecek C, Kraft D, Jockusch
B, Valenta R: "Molecular and structural analysis of
continuous birch profilin epitope defined by monoclonal
antibody". J Biol Chem 271, 29915-29921
(1996).
13. Alvarez AM, Fukuhara E,
Nakase M, Adachi T, Aoki N, Nakamura R,
Matsuda T: "Four rice seed cDNA clones belonging to the
alpha-amylase/trypsin inhibitor gene family encode
potential rice allergens". Biosci Biotechnol Biochem 59,
1304-1308 (1995).
14. Colombo P, Kennedy D,
Ramsdale T, Costa MA, Djro G, Izzo V,
Slavadori S, Guerrini R, Cocchiara R,
Mirisola MG, Wood S, Geraci D, Journal of
Immunology Vol. 160, No. 6, 15 March 1998,
2780-2875.
15. Spangfort MD, Ipsen H,
Sparholt SH, Aasmul-Olsen S,
Larsen MR, Mørtz E, Roepstorff P, Larsen
JN: "Characterization of Purified Recombiant Bet v 1 with
Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with
Maltose-Binding Protein". Prot Exp
Purification 8, 365-373 (1996a).
16. Ipsen H, Wihl
J-A, Petersen BN, Løwenstein H:
"Specificity mapping of patients IgE response towards the tree
pollen major allergens Aln g I, Bet v I and Cor a I." Clin.
Exp. Alergy 22, 391-9, (1992).
17. Gajhede M, Osmark P,
Poulsen FM, Ipsen H, Larsen JN, Joost
van Neerven RJ, Schou C, Løwnstein H, y
Spangfort MD: "X-ray and NMR structure of
Bet v 1, the origin of birch pollen allergy". Nature
structural biology 3, 1040-1045
(1996).
18. Altschul SF, Gish W,
Miller W, Myers EW, y Lipman DJ: "Basic local
alignment search tool". J. Mol. Biol. 215,
403-410 (1990).
19. Higgins D, Thompson J,
Gibson T, Thompson JD, Higgins DG, y
Gibson TJ: "CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix
choice". Nucleic Acid Res. 22, 4373-4680
(1994).
20. Saiki RK, Gelfand DH,
Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn
GTm Mullis KB, Erlich HA: "Primer-directed
enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA
polymerase". Science 239, 487-491
(1998).
21. Spangfort MD, Larsen JN,
Gajhede M: "Crystallization and Preliminary
X-ray Investigation at 2.0 \ring{A} Resolution of
Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing
IgE-Mediated Allergy". PROTEINS, Struc Func
Genet 26, 358-360 (1996b).
22. Monsalve RI, Lu G, y
King TP: "Recombinant venom allergen, antigen 5 of
yellowjacket (Vespula vulgaris) and paper wasp (Polistes
annularis) by expression in bacteria or yeast" (1999)
Submitted.
23. Fabg KSF, Vitale M,
Fehlener P and King TP: "cDNA cloning and primary
structure of a white-faced hornet venom allergen,
antigen 5". Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 85, 895
(1988).
24. Lu G, Villalba M,
Coscia MR, Hoffman DR y King TP: "Sequence
Analysis and Antigenic Cross-reactivity of a Venom
Allergen, Antigen 5, from Hornets, Wasps, and Yellow Jackets".
Journal of Immunology 150, 2823-1830
(1993).
<110> ALK Abello A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos alérgenos recombinantes
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> P199800379 WO PCTDK9900136
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<140> PCTDK9900136
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<141>
1999-03-16
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<150> DK 0364/98
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<151>
1998-03-16
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<160> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Thr10Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Asn28Thr +
Lys32Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Glu45Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Lys55Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Thr77Ala
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Glu60Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> BRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Asp25Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Asn47Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Pro108Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Bet v 1 Modificada, Modificación Asn28Thr,
Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Ves v 5 Modificada, Modificación Lys72Ala
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Ves v 5 Modificada, Modificación Tyr96Ala
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
Claims (34)
1. Un alérgeno mutante recombinante artificial
derivado de un alérgeno natural, comprendiendo dicho alérgeno
natural, al menos una zona de restos de aminoácidos, que están
conectados coherentemente a lo largo de al menos 400
\ring{A}^{2} de la superficie de la estructura tridimensional de
la molécula de alérgeno, que tienen una accesibilidad al disolvente
de al menos 20% y que están conservados como se define por ser
idénticos en más del 70% de las secuencias de secuencias homólogas
dentro del mismo orden taxonómico del cual dicho alérgeno de origen
natural es originario, comprendiendo dicha zona al menos un epitopo
de célula B, donde
1) dicho mutante comprende al menos una
sustitución de un resto de aminoácido conservado localizado en al
menos una de las citadas zonas, teniendo dicho resto de aminoácido
conservado una accesibilidad al disolvente de al menos un 20%, por
un resto de aminoácido, que no se encuentra en la misma posición en
la secuencia de aminoácidos de ninguna proteína homologa conocida
en el orden taxonómico del cual el alérgeno de origen natural es
originario,
2) dicho alérgeno mutante tiene esencialmente la
misma estructura terciaria de la cadena principal de carbonos
\alpha que dicho alérgeno natural, y
3) la unión de IgE especifica al alérgeno
mutante está disminuida en comparación con la unión a dicho alérgeno
natural.
2. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 1, donde el alérgeno de origen natural es un alérgeno
por inhalación.
3. Alérgeno recombinante según la recombinación
2, donde el alérgeno de origen natural es un alérgeno del
polen.
4. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 3, donde el alérgeno de origen natural es un alérgeno
del polen originario del orden taxonómico de los Fagales, Oleales o
Pinales.
5. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 4, donde el alérgeno natural es Bet v 1.
6. Alérgeno recombinante según la reivindicación
5, donde la/las sustituciones son Asp25Gly, (Asn28Thr +
Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Thr77Ala, Pro108Gly, o (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly).
Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Thr77Ala, Pro108Gly, o (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly).
7. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 3, donde el alérgeno de origen natural es un alérgeno
del polen originario del orden taxonómico de los Poales.
8. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 3, donde el alérgeno de origen natural es un alérgeno
originario del orden taxonómico de los Asterales o Urticales.
9. Alérgeno recombinante según la
reivindicaciones 1 o 2, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno de los ácaros del polvo domestico.
10. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 9, donde el alérgeno de origen natural es originario
del género taxonómico de los Dermatophagoides.
11. Alérgeno recombinante según las
reivindicaciones 1 o 2, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno de la cucaracha.
12. Alérgeno recombinante según las
reivindicaciones 1 o 2, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno animal.
13. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 12, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno del gato, perro o caballo.
14. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 1, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno de un veneno.
15. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 14, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno de un veneno originario del orden taxonómico de los
Hymenoptera.
16. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 15, donde el alérgeno de origen natural es un
alérgeno de un veneno originario del orden taxonómico de los
Vespidae, Apidae o Formicoidae.
17. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 16, donde dicho alérgeno de origen natural es Ves v
5.
18. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 17, donde la sustitución es Lys72Ala o Tyr96Ala.
19. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-18, donde la unión de IgE
específica al alérgeno mutante está disminuida en al menos un 5%,
preferiblemente en al menos un 10%.
20. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-19, donde al comparar las
estructuras terciarias de la cadena principal de carbonos \alpha
del mutante y de las moléculas del alérgeno de origen natural, la
desviación cuadrática media de las coordenadas atómicas es inferior
a 2 \ring{A}.
21. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-20, donde al menos una de las
citadas zonas comprende átomos de 15-25 restos de
aminoácidos.
22. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-21, donde los restos de
aminoácidos de al menos una de las citadas zonas están ordenados
según la accesibilidad al disolvente, y están sustituidos uno o más
de los aminoácidos de entre los que tienen mayor accesibilidad al
disolvente.
23. Alérgeno recombinante según la
reivindicación 22, donde están sustituidos uno o más restos de
aminoácidos de al menos una de las citadas zonas que tienen una
accesibilidad al disolvente de 20-80%.
24. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-23, donde están sustituidos
1-5 restos de aminoácidos por cada 400
\ring{A}^{2} en al menos una de las citadas zonas.
25. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-24 donde al menos está
sustituido un resto de aminoácido en dicho epitopo de célula B.
26. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-25, donde la sustitución de
uno o más restos de aminoácidos en dicho epitopo de célula B o en
al menos una de las citadas zonas se lleva a cabo por mutagénesis
dirigida.
27. Un método para preparar un alérgeno
recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
1-26 que comprende las etapas de;
a) identificar los restos de aminoácidos de un
alérgeno de origen natural que están conservados con una identidad
superior al 70% en todas las proteínas homólogas conocidas dentro
del orden taxonómico del que dicho alérgeno de origen natural es
originario;
b) definir al menos una zona de restos de
aminoácidos conservados que estén coherentemente conectados en al
menos 400 \ring{A}^{2} de la superficie de la estructura
tridimensional de la molécula de alérgeno, comprendiendo al menos
una de las citadas zonas por lo menos un epitopo de célula B; y
c) sustituir al menos un resto de aminoácido
expuesto en la superficie, definido por tener una accesibilidad al
disolvente de al menos un 20%, en al menos una de las citadas zonas
por otro aminoácido, que no se encuentra en la misma posición en la
secuencia de aminoácidos de ninguna de las proteínas homólogas
conocidas dentro del orden taxonómico del cual es originario el
alérgeno de origen natural, mientras que se conserva esencialmente
la estructura terciaria general de la cadena principal de carbonos
\alpha de la molécula de alérgeno para obtener un alérgeno
mutante, donde la unión de IgE especifica al alérgeno mutante está
disminuida en comparación con la unión a dicho alérgeno de origen
natural.
28. Un método según la reivindicación 27, donde
los restos de aminoácidos de al menos una de las citadas zonas
están ordenados según la accesibilidad al disolvente, y están
sustituidos uno o más aminoácidos de entre aquellos que tienen
mayor accesibilidad al disolvente.
29. Un método según las reivindicaciones 27 o
28, donde la sustitución de uno o más restos de aminoácidos en
dicho epitopo de célula B o en al menos una de las citadas zonas se
lleva a cabo por mutagénesis dirigida.
30. Alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-26 para su utilización como
producto farmacéutico.
31. Composición farmacéutica que comprende un
alérgeno recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
1-26, que se combina opcionalmente con un vehículo
y/o un excipiente aceptable farmacéuticamente y opcionalmente con
un coadyuvante.
32. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 31, en forma de una vacuna para el tratamiento o la
prevención de reacciones alérgicas producidas por un alérgeno de
origen natural.
33. Proceso para la preparación de una
composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones
31-32, que comprende mezclar al menos un alérgeno
recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
1-26 con substancias farmacéuticamente aceptables
y/o con excipientes.
34. Uso de un alérgeno recombinante como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1-26
para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de las reacciones alérgicas.
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Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2406621A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Novozymes A/S | Protein variants having modified immunogenicity |
| IT1318692B1 (it) * | 2000-09-12 | 2003-08-27 | Consiglio Nazionale Ricerche | Varianti di proteine allergeniche di phleum pratense. |
| IT1318690B1 (it) * | 2000-09-12 | 2003-08-27 | Consiglio Nazionale Ricerche | Varianti dell'allergene maggiore par j 2 di parietaria judaica. |
| DK1340085T3 (da) * | 2000-10-17 | 2008-12-01 | Besst Test Aps | Assay til direkte detektion af en biologisk celle i en legemsvæskepröve |
| KR100919914B1 (ko) * | 2000-11-16 | 2009-10-06 | 알크-아벨로 에이/에스 | 신규한 돌연변이체 알레르겐 |
| DK1219300T3 (da) * | 2000-12-28 | 2007-03-05 | Biomay Prod & Handel | Behandling af allergi |
| JP2005508134A (ja) * | 2001-03-02 | 2005-03-31 | ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ | 天然アレルゲンの免疫原性を保持する、アレルゲン性が低下した組み換えハイブリッドアレルゲン構築体 |
| CA2462651A1 (en) * | 2001-10-05 | 2003-04-17 | Novozymes A/S | Kit for predicting binding of a specific antibody to a potential immunogen and method of screening |
| PL206709B1 (pl) * | 2002-02-27 | 2010-09-30 | Merck Patent Gmbh | Sposób wytwarzania i sposób obniżania aktywności IgE głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rBet v 1, główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rBet v 1uzyskiwany takim sposobem i jego zastosowanie jako leku oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki główny alergen |
| EP1504089A2 (en) * | 2002-05-16 | 2005-02-09 | Alk Abell A/S | Allergen mutants |
| US7384635B2 (en) * | 2002-11-01 | 2008-06-10 | Alk-Abello A/S | Protein variants of naturally occurring allergens |
| WO2004047793A1 (en) | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Alk-Abelló A/S | Pharmaceutical allergen product |
| US8012505B2 (en) | 2003-02-28 | 2011-09-06 | Alk-Abello A/S | Dosage form having a saccharide matrix |
| AU2004216559B2 (en) | 2003-02-28 | 2010-05-27 | Alk-Abello A/S | Dosage form having a saccharide matrix |
| BRPI0417264A (pt) | 2003-12-19 | 2007-03-06 | Alk Abello As | processos para a preparação de uma batelada de um ingrediente farmacêutico ativo, um recipiente compreendendo criogránulos de um produto alérgeno, e um criogránulo de um produto alérgeno |
| EP1933867A1 (en) | 2005-10-04 | 2008-06-25 | Alk-Abello A/S | Solid vaccine formulation |
| ITMI20052517A1 (it) * | 2005-12-29 | 2007-06-30 | Lofarma Spa | Varianbtio ipoallergeniche dell'allergene maggiore bet v 1 di polline di betula verrucosa |
| JP2009534029A (ja) * | 2006-04-20 | 2009-09-24 | ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール | 組換え乳酸桿菌およびその使用 |
| AU2008216669B2 (en) * | 2007-02-15 | 2013-12-12 | Mannkind Corporation | A method for enhancing T cell response |
| WO2008116936A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Alk-Abelló A/S | Use of an adjuvanted allergy vaccine formulation for parenteral administration |
| EP2028188A1 (en) * | 2007-08-21 | 2009-02-25 | Biomay AG | Hypoallergenic molecules |
| DE202008006598U1 (de) | 2008-04-11 | 2008-10-02 | Alk-Abelló A/S | Allergie-Impfstoff-Formulierung zur mucosalen Verabreichung |
| EP2442828B1 (en) | 2009-06-19 | 2016-08-03 | Alk-Abelló S.A. | Novel manner of administrating allergen in allergen specific immunotherapy |
| CN102584966A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-07-18 | 广州医学院第二附属医院 | 一种重组花生过敏原与突变体及其制备方法和应用 |
| CN102603879A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-07-25 | 广州医学院第二附属医院 | 一种重组大豆过敏原与突变体及其制备方法和应用 |
| CN102690340A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-09-26 | 广州医学院第二附属医院 | 一种重组巴西坚果过敏原与突变体及其制备方法和应用 |
| CN102617719A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-08-01 | 广州医学院第二附属医院 | 一种重组大米过敏原与突变体及其制备方法和应用 |
| CN102617715A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-08-01 | 广州医学院第二附属医院 | 一种重组真菌主要过敏原与突变体及其制备方法和应用 |
| CN102675439A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-09-19 | 广州医学院第二附属医院 | 一种重组黑麦草花粉过敏原与突变体的制备方法和应用 |
| EP2952200A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-09 | Alk-Abelló A/S | Allergen for prophylactic treatment of allergy |
| JP2023502943A (ja) * | 2019-11-13 | 2023-01-26 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | エアロアレルゲン関連アレルギーと炎症とを治療するナノエマルジョン組成物 |
| CN111187606B (zh) * | 2020-02-25 | 2022-06-14 | 江苏海洋大学 | 一种用于海水基可循环清洁压裂液的表面活性剂及其制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| IT1318692B1 (it) * | 2000-09-12 | 2003-08-27 | Consiglio Nazionale Ricerche | Varianti di proteine allergeniche di phleum pratense. |
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