ES2317955T3 - Alergenos mutantes. - Google Patents
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Abstract
Un alérgeno recombinante que es un mutante de un alérgeno que surge de manera natural, donde el alérgeno mutante tiene al menos cuatro mutaciones, las cuales reducen la capacidad de unión a IgE específico del alérgeno mutado en comparación con la capacidad de unión a IgE de dicho alérgeno que surge de manera natural, donde cada mutación es una sustitución de un resto de aminoácido expuesto en la superficie con otro resto de aminoácido, que no ocurre en la misma posición en la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína homóloga conocida dentro de las especies taxonómicas de las cuales se origina dicho alérgeno que surge de manera natural, caracterizado porque al menos cuatro mutaciones (mutaciones primarias) están mutuamente espaciadas por al menos 15 angstron y donde dichas mutaciones primarias están espaciadas de manera tal que al menos una región de superficie circular con un área de 800 angstron 2 no comprende mutación.
Description
Alérgenos mutantes.
La presente invención se refiere a alérgenos
recombinantes novedosos, que son mutantes de alérgenos que surgen
de manera natural. La invención también se refiere a una composición
que comprende una mezcla de los alérgenos mutantes recombinantes
novedosos. Además, la invención se refiere a un método de
preparación de tales alérgenos mutantes recombinantes, así como a
composiciones farmacéuticas, incluyéndose vacunas, que comprenden
los alérgenos mutantes recombinantes. La presente invención se
refiere a métodos de generación de respuestas inmunes en un sujeto,
vacunación o tratamiento de un sujeto, así como a procesos para la
preparación de las composiciones de la invención.
Los individuos genéticamente predispuestos
llegan a ser sensibilizados (alérgicos) a los antígenos que se
originan de una variedad de fuentes ambientales, a los alérgenos de
los cuales se exponen los individuos. La reacción alérgica surge
cuando un individuo previamente sensibilizado es reexpuesto al mismo
o a un alérgeno homólogo. Las respuestas alérgicas varían de fiebre
del heno, rinoconductivitis, rinitis y asma a la anafilaxis
sistémica y muerte en respuesta a, por ejemplo, picadura de abejas o
avispones o picaduras de insectos. La reacción es inmediata y puede
ser ocasionada por una variedad de alérgenos atópicos tales como
compuestos que se originan de hierbas, árboles, malas hierbas,
insectos, comida, fármacos, sustancias químicas y perfumes.
Sin embargo, las respuestas no surgen cuando un
individuo es expuesto a un alérgeno por primera vez. La respuesta
adaptable inicial toma su tiempo y normalmente no ocasiona ningún
síntoma. Pero cuando los anticuerpos y las células T capaces de
reaccionar con el alérgeno han sido producidos, cualquier exposición
posterior puede provocar los síntomas. Así, las respuestas
alérgicas demuestran que la respuesta inmune por sí misma, puede
ocasionar estados patológicos significativos, que pueden amenazar la
vida.
Los anticuerpos implicados en la alergia atópica
principalmente pertenecen a las inmonuglobulinas de la clase IgE.
La IgE se une a receptores específicos sobre la superficie de
mastocitos y basófilos. Después de la formación de complejos de un
alérgeno específico con IgE unido a mastocitos, el entrecruzamiento
del receptor en la superficie celular da como resultado la
señalización a través de los receptores y la respuesta fisiológica
de las células diana. La degranulación da como resultado la
liberación de i.a. histamina, heparina, un factor quimiotáctico
para leucocitos eosinofílicos, leucotrienos C4, D4 y E4, que causan
constricción prolongada de las células del músculo liso bronquial.
Los efectos resultantes pueden ser de naturaleza sistémica o
local.
Las reacciones de hipersensibilidad mediadas por
anticuerpo, pueden estar divididas en cuatro clases, llamadas tipo
I, tipo II, tipo III y tipo IV. Las reacciones alérgicas de tipo I
son la reacción de hipersensibilidad inmediata clásica, que surge
en segundos o minutos tras la exposición al antígeno. Estos síntomas
son mediados por IgE específico al alérgeno.
Comúnmente, las reacciones alérgicas son
observadas como una respuesta a alérgenos de proteína presentes, por
ejemplo, en pólenes, ácaros de polvo casero, pelo de animal y caspa,
venenos y productos de comida.
Con el fin de reducir o eliminar las reacciones
alérgicas, comúnmente se utiliza la administración cuidadosamente
controlada y repetida de vacunas para alergia. La vacunación para
alergia es tradicionalmente realizada por la administración
parenteral, intranasal o sublingual en dosis incrementadas durante
un período muy largo de tiempo, y da como resultado la
desensibilización del paciente. El mecanismo inmunológico exacto no
es conocido, pero las diferencias inducidas en el fenotipo de las
células T específicas al alérgeno se piensa que es de particular
importancia.
El concepto de vacunación está basado en dos
características fundamentales del sistema inmunitario, llamadas
especificidad y memoria. La vacunación cebará el sistema inmune del
receptor y en la exposición repetida a proteínas similares el
sistema inmunitario estará en una posición para responder más
rigurosamente a la estimulación de, por ejemplo, una infección
microbiana. Las vacunas son mezclas de proteínas propuestas para ser
utilizadas en la vacunación para el propósito de generar tal
respuesta inmune protectora en el receptor. La protección
comprenderá solamente componentes presentes en la vacuna y antígenos
homólogos.
Comparada con otros tipos de vacunación, la
vacunación para alergia es complicada por la existencia de una
respuesta inmune actual en los pacientes alérgicos. Esta respuesta
inmune está caracterizada por la presencia de IgE específico al
alérgeno que media la liberación de síntomas alérgicos en la
exposición a los alérgenos. Así, la vacunación para alergia
utilizando alérgenos de fuentes naturales tiene un riesgo inherente
de efectos secundarios que son en la consecuencia extrema
amenazantes de la vida del paciente.
\newpage
Los enfoques para evitar este problema pueden
estar divididos en tres categorías. En las medidas prácticas, de
más de una categoría, normalmente están combinadas las medidas para
más de una categoría. La primera categoría de medidas incluye la
administración de varias dosis pequeñas durante un período de tiempo
prolongado para alcanzar una dosis sustancial acumulada. La segunda
categoría de medidas incluye la modificación física de los
alérgenos mediante la incorporación de los alérgenos en sustancias
de gel tal como hidróxido de aluminio. La formulación de hidróxido
de aluminio tiene un efecto adyuvante y un efecto de depósito de
lenta liberación de alérgeno que reduce la concentración en el
tejido de los componentes de alérgenos activos. La tercera categoría
de mediciones incluye la modificación química de los alérgenos con
el propósito de reducir la alergenicidad, es decir la unión a
IgE.
El mecanismo detallado tras la exitosa
vacunación para alergia exitosa, se mantiene controvertido. Sin
embargo, se esta de acuerdo que las células T desempeñan una
función clave en la regulación total de las respuestas inmunes. De
acuerdo con el consenso actual, la relación entre dos extremos de
los fenotipos de células T, Th1 y Th2, determinan el estado
alérgico de un individuo. En la estimulación con alérgeno, las
células Th1 secretan interleucina dominadas por
interferón-\gamma que conduce a la inmunidad
protectora y el individuo es sano. Por otra parte, las células Th2
predominantemente secretan interleucina 4 y 5, conduciendo a la
síntesis de IgE y eosinofilia y el individuo es alérgico. Los
estudios in vitro han indicado la posibilidad de alterar las
respuestas de las células T específicas de alérgeno mediante la
estimulación con péptidos derivados de alérgeno que contienen
epítopos de células T relevantes. Los enfoques actuales para nuevas
vacunas para alergia, por tanto están ampliamente basados en la
dirección de las células T, el objetivo es inactivar las células T
(inducción de alergia) o desplazar la respuesta del fenotipo Th2 al
fenotipo Th1.
Los análisis cristalográficos de rayos X de
complejos del antígeno F_{ab} ha incrementado el entendimiento de
epítopos del unión al anticuerpo. De acuerdo con este tipo de
análisis, los epítopos de unión al anticuerpo pueden ser definidos
como una sección de la superficie del antígeno que comprende átomos
de 15-25 restos de aminoácido, que están dentro de
una distancia de los átomos del anticuerpo que permiten la
interacción directa. La afinidad de la interacción
antígeno-anticuerpo no puede ser predicha a partir
de la entalpía contribuida por las interacciones de van der Waals,
las uniones de hidrógeno, las uniones iónicas, solos. La entropía
asociada con la expulsión casi completa de las moléculas de agua de
la interfase representa una contribución de energía similar en
tamaño. Esto significa que el ajuste perfecto entre los contornos de
las moléculas que interaccionan es un factor principal implícito de
las altas interacciones de afinidad del
antígeno-anticuerpo.
En WO 97/30150 (ref. 1), se reivindica una
población de moléculas de proteína, moléculas de proteína que tienen
una distribución de mutaciones específicas en la secuencia de
aminoácidos comparada con una proteína de origen. A partir de la
descripción, parece que la invención está relacionada con la
producción de análogos que son modificados, en comparación con la
proteína de origen, pero que son tomados, digeridos y presentados a
las células T de la misma manera que la proteína de origen
(alérgenos que surgen de manera natural). De esta manera, se
obtiene una respuesta de las células T modificada. Las bibliotecas
de proteínas modificadas son preparadas utilizando una técnica
denotada PM (Mutagénesis Parsimoniosa).
En WO 92/02621 (ref. 2), se describen moléculas
de ADN recombinantes, moléculas que comprenden un ADN que codifica
un polipéptido que tiene al lo menos un epítopo de un alérgeno de
árboles del orden Fagales, el alérgeno que es seleccionado
de Aln g 1, Cor a 1 y Bet v 1. Todas las moléculas
recombinantes descritas en la presente memoria, tienen una
secuencia de aminoácidos o parte de una secuencia de aminoácidos que
corresponde a la secuencia de un alérgeno que surge de manera
natural.
WO 90/11293 (ref. 3) se refiere i.a. a
péptidos alergénicos aislados de polen de ambrosia y a péptidos de
polen de ambrosia modificados. Los péptidos descritos en la misma,
tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente ya sea a la
secuencia del alérgeno que surge de manera natural o a isoformas que
surgen de manera natural del mismo.
Se han tomado varios enfoques se han tomado para
la modificación química de alérgenos. Los enfoques de principio de
los setentas incluyen asociación química de alérgenos a polímeros, y
la reticulación química de alérgenos utilizando formaldehído, etc.,
produciendo los llamados "alergoides". La exposición razonada
detrás de estos enfoques fue la destrucción aleatoria de los
epítopos de unión a IgE mediante la unión del ligando químico para
reducir de esta manera la unión a IgE, mientras que se conserva la
inmunogenicidad por el peso molecular incrementado de los
complejos. Las desventajas inherentes de la producción de
"alergoides" están relacionadas a las dificultades para
controlar el proceso de la reticulación química y las dificultades
en el análisis y la estandarización de los complejos de alto peso
molecular resultantes. Los "alergoides" están actualmente en
uso clínico y debido a la destrucción aleatoria de los epítopos de
unión a IgE se pueden administrar dosis más altas en comparación
con las vacunas convencionales, pero los parámetros de seguridad y
de eficacia no están mejorados a través del uso de vacunas
convencionales.
Enfoques más recientes para la modificación
química de alérgenos se dirigen a una interrupción total de la
estructura terciaria del alérgeno, eliminando de esta manera la
unión a IgE asumiendo que el objetivo terapéutico esencial es la
célula T específica al alérgeno. Tales vacunas contienen péptidos
sintéticos derivados de la secuencia de alérgeno que representan
epítopos unidos de células T mínimos, péptidos más largos que
representan epítopos unidos de células T, péptidos sintéticos
derivados de la secuencia de alérgeno más larga que representan
regiones de epítopos de células T inmunodominantes, o moléculas de
alérgeno cortadas en dos mitades mediante técnica recombinante.
Otro enfoque basado en esta exposición razonada ha sido la propuesta
del uso de isoformas recombinantes de "baja unión a IgE". En
años recientes ha llegado a ser claro que los alérgenos naturales
son heterogéneos que contienen isoalergenos y variantes que tienen
hasta aproximadamente 25% de sus aminoácidos sustituidos. Se ha
encontrado que algunos isoalergenos recombinantes son menos
eficientes en la unión a IgE posiblemente debido a la
desnaturalización irreversible y por lo tanto la interrupción total
de la estructura terciaria.
Se han realizado intentos para reducir la
alergenicidad mediante mutagénesis dirigida al sitio in vitro
utilizando varios alérgenos, incluyendo Der f 2 (Takai y
colaboradores, ref. 4), Der p 2 (Smith y colaboradores, ref.
5), un alérgeno de Dermatophagoides farinae de 39 kDa (Aki y
colaboradores, ref. 6) fosfolipasa A2 de veneno de abeja (Förster y
colaboradores, ref. 7), Ara h 1 (Burks y colaboradores, ref. 8),
Ara h 2 (Stanley y colaboradores, ref. 9), Bet v 1 (Ferreira
y colaboradores, ref. 10 y 11) profilina de abedul (Wiedemann y
colaboradores, ref. 12) y Ory s 1 (Álvarez y colaboradores,
ref. 13).
La exposición razonada detrás de estos
procedimientos, nuevamente, es dirigirse a las células T específicas
del alérgeno, mientras que al mismo tiempo se reduce el riesgo de
efectos secundarios mediados por IgE mediante la reducción o
eliminación de la unión a IgE por la interrupción de la estructura
terciaria del alérgeno mutante recombinante. La exposición razonada
detrás de estos procedimientos no incluye el concepto de epítopos de
unión a IgE dominantes y no incluye el concepto de iniciar una
nueva respuesta inmune protectora que también implica células B y la
generación de anticuerpo.
El articulo por Ferreira y colaboradores (ref.
11) describe el uso de la mutagénesis dirigida al sitio con el
propósito de reducir la unión a IgE. Aunque la estructura
tridimensional del Bet v 1 es mencionada en el articulo, los
autores no usan la estructura para la predicción de los restos de
aminoácido expuestos al disolvente para mutación, la mitad de los
cuales tienen un bajo grado de exposición al disolvente. Más bien
ellos utilizan un método desarrollado para la predicción de restos
funcionales en proteínas diferentes del concepto de identificación
basado en la estructura de áreas de superficie conservadas aquí
descritas. Aunque los autores discuten la conservación de la
estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono, este concepto no es una parte de
la estrategia terapéutica sino simplemente se incluye para estimar
la unión de IgE in vitro. Además, la evidencia presentada no
es adecuada, puesto que la normalización de los espectros de CD
previene la evaluación de la desnaturalización de una proporción de
la muestra, que es un problema común. La estrategia terapéutica
descrita se dirige a la inducción de tolerancia en las células T
específicas del alérgeno y la iniciación de una nueva respuesta
inmune no es mencionada.
El artículo por Wiedemann y colaboradores (ref.
12) describe el uso de la mutagénesis dirigida al sitio y la
síntesis de péptido con el propósito de la caracterización del
epítopo de anticuerpo monoclonal. Los autores tienen conocimiento
de la estructura terciaria del antígeno y ellos utilizan este
conocimiento para seleccionar un aminoácido expuesto en la
superficie para la mutación. El algoritmo utilizado se puede decir
que es opuesto al descrito por los presentes inventores, puesto que
un aminoácido que difiere de las secuencias homólogas es
seleccionado. El estudio demuestra que la sustitución de un
aminoácido expuesto en la superficie tiene la capacidad de
modificar las características de unión de un anticuerpo monoclonal,
que no es sorprendente considerando el conocimiento común. Los
experimentos descritos no están diseñados para estimar la modulación
de la unión de anticuerpos monoclonales tal como IgE de suero de
pacientes alérgicos. Uno de los experimentos contenidos, aplican la
IgE de suero y aunque este experimento no es adecuado para la
estimación cuantitativa, la unión de IgE no se observa que está
afectada por las mutaciones realizadas.
El articulo por Smith y colaboradores (ref. 5)
describe el uso de la mutagénesis dirigida al sitio para el
propósito de cartografiar de epítopo de anticuerpo monoclonal y
reducir la unión a IgE. Los autores no tienen conocimiento de la
estructura terciaria y no hacen intento de estimar la conservación
de la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono. El algoritmo utilizado no asegura
que los aminoácidos seleccionados para la mutación están realmente
expuestos a la superficie molecular. Solamente uno de los mutantes
descritos conduce a una reducción sustancial en la unión a IgE.
Este mutante es deficiente en la unión de todos los anticuerpos
probados, indicando que la estructura terciaria está interrumpida.
Los autores no definen una estrategia terapéutica y no se menciona
el inicio de una nueva respuesta inmune.
El articulo por Colombo y colaboradores (ref.
14) describe el estudio de un epítopo de unión a IgE mediante el
uso de la mutagénesis dirigida al sitio y la síntesis de péptido.
Los autores utilizan una estructura de modelo de ordenador
tridimensional basada en la estructura del cristal de una proteína
homologa para ilustrar la presencia del epítopo en la superficie
molecular. La presencia adicional de una epítopo en un alérgeno
diferente que muestra homologia de estructura primaria es dirigida
utilizando los péptidos sintéticos que representan el epítopo. La
estrategia terapéutica está basada en el tratamiento, utilizando
este péptido sintético que representa un epítopo de unión a IgE
monovalente. Las áreas de superficie conservadas entre los alérgenos
homólogos así como el concepto terapéutico de iniciación de una
nueva respuesta inmune protectora no son mencionados.
El articulo por Spangfort y colaboradores (ref.
15) describe la estructura tridimensional y los parches de
superficie conservados expuestos del alérgeno principal de abedul.
El artículo no menciona los mayores epítopos de unión a IgE, ni la
mutagénesis dirigida al sitio, ni está dirigido a la aplicación
terapéutica.
En ninguno de los estudios descritos
anteriormente se reduce la unión a IgE mediante la sustitución de
los aminoácidos expuestos en la superficie, mientras que se
conserva la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono. La exposición razonada detrás de
los enfoques mencionados anteriormente no incluye el concepto de
epítopos de unión a IgE dominantes y no incluye el concepto
terapéutico de iniciar una nueva respuesta inmune protectora.
WO 99/47680 describe la introducción de
sustituciones de aminoácido artificiales en posiciones críticas
definidas, mientras se mantiene la estructura terciaria del
esqueleto del \alpha-carbono del alérgeno. En
particular, WO 99/47680 describe un alérgeno recombinante, que es
un mutante que surge de manera no natural derivado de un alérgeno
que surge de manera natural, donde al lo menos un resto de
aminoácido conservado, expuesto en la superficie de un epítopo de
célula B es sustituido por otro resto que no surge en la misma
posición en la secuencia de aminoácidos de ninguna proteína
homologa conocida dentro del orden taxonómico del cual se origina
el alérgeno que surge de manera natural, dicho alérgeno mutante que
tiene esencialmente la misma estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono como dicho alérgeno que surge de
manera natural, y la unión a IgE especifica al alérgeno mutado que
está reducida en comparación con la unión al alérgeno que surge de
manera natural.
El alérgeno recombinante descrito en WO 99/47680
se obtiene por a) identificación de los restos de aminoácido en un
alérgeno que surge de manera natural que están conservados con más
del 70% de identidad en todas las proteínas homólogas conocidas
dentro del orden taxonómico del cual se origina dicho alérgeno que
surge de manera natural, b) definición de al menos un parche de
restos de aminoácido conservados que están coherentemente
conectados en al menos 400 \ring{A}^{2} de la superficie de la
molécula de alérgeno tridimensional como se define al tener una
accesibilidad al disolvente de al menos 20%, el al menos un parche
que comprende al menos un epítopo de célula B, y c) sustitución de
al menos un resto de aminoácido en el al menos un parche por otro
aminoácido que no es conservativo en la posición particular,
mientras que esencialmente se conserva la estructura terciaria del
esqueleto del \alpha-carbono total de la molécula
de alérgeno.
La Figura 1 muestra cebadores de
oligonucleótidos específicos del mutante utilizados para el mutante
número 1 Bet v 1. Los nucleótidos mutados están
subrayados.
La Figura 2 muestra dos cebadores generalmente
aplicables (llamados "todos sentido" y "todos no
sentidos"), que se sintetizaron y utilizaron para todos los
mutantes.
La Figura 3 muestra el ADN y la secuencia de
aminoácidos del alérgeno Bet v 1 que surge de manera natural así
como un número de mutaciones de Bet v 1.
La Figura 4 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado
y por el mutante Bet v 1 Glu45Ser.
La Figura 5 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado
y por el mutante Asn28Thr+Lys32Gln de Bet v 1.
La Figura 6 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a IgE de suero de una agrupación de
pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado y por el mutante
Bet v 1 Pro108Gly.
La Figura 7 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a IgE de suero de una agrupación de
pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado y por el mutante Bet
v 1 Glu60Ser.
La Figura 8 muestra los espectros CD del
recombinante y el mutante de Triple parche, registrado a
concentraciones casi iguales.
La Figura 9 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado
y por el mutante de Triple parche de Bet v 1.
La Figura 10 muestra la accesibilidad al
disolvente de los restos del antígeno 5 individualmente alineados y
la alineación de las secuencias del antígeno 5 de Vespula
(panel izquierdo). En el panel derecho de la Figura 10 se muestra la
superficie molecular del antígeno 5 con áreas conservadas entre el
antígeno 5:s de Vespula.
La Figura 11 muestra la secuencia del cebador
correspondiente al amino terminal del Ves v 5 derivado de la
hebra sentido. La secuencia del cebador corriente abajo deriva de la
hebra de no sentido.
La Figura 12 muestra dos cebadores generalmente
aplicables (llamados "todo sentido" y "todo no sentido"),
que se sintetizaron y utilizaron para todos los mutantes.
La Figura 13 muestra el ADN y la secuencia de
aminoácidos del alérgeno Ves v 5 que surge de manera natural
así como dos mutaciones de Ves v 5.
\newpage
La Figura 14 muestra la inhibición de la unión
de Ves v 5 recombinante biotinilado a IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Ves v 5 no biotinilado y por
el mutante Ves v 5 Lys72Ala.
La Figura 15 muestra un modelo teórico de la
reacción entre un alérgeno y los mastocitos por la reticulación de
IgE.
La Figura 16 muestra el ADN y la secuencia de
aminoácidos del alérgeno Der p 2 que surge de manera
natural.
La Figura 17 muestra esquemáticamente los
cebadores utilizados para crear las mutaciones. (I) muestra los
cebadores sentido y antisentido. (II) muestra la proteína
recombinante final que alberga las mutaciones en las posiciones
indicadas.
La Figura 18 muestra una ilustración de la
construcción de los mutantes Bet v 1 y un listado de los
cebadores utilizados. Los mutantes contienen de cinco a nueve
aminoácidos.
La Figura 19 muestra mutaciones puntuales
introducidas en la superficie de Bet v 1 (2628) y Bet v
1 (2637). En el mutante Bet v 1 (2628), cinco mutaciones
primarias se introdujeron en una mitad del Bet v 1 dejando la
otra mitad no alterada. En el mutante Bet v 1 (2637), cinco
mutaciones primarias y tres mutaciones secundarias se introdujeron
en la otra mitad, dejando la primera mitad no alterada.
La Figura 20 muestra los espectros de dicroísmo
circular (CD) de Bet v 1.2801 recombinante (tipo silvestre) y
el mutante Bet v 1 (2637) registrados a concentraciones casi
idénticas.
La Figura 21 muestra la inhibición de la unión
de Bet v 1.2801 recombinante biotinilado (tipo silvestre) a
IgE de suero de una agrupación de pacientes alérgicos por Bet v
1.2801 no biotinilado y por Bet v 1 (2628), Bet v
1 (2637) y una mezcla 1:1 de Bet v 1 (2628) y Bet v
1 (2637).
La Figura 22 muestra la liberación de histamina
en células de basófilos humanos de Bet v 1.2801 (tipo
silvestre), Bet v 1 (2628) y Bet v 1 (2637).
La Figura 23 muestra la liberación de histamina
en células de basófilos humanos de Bet v 1.2801 (tipo
silvestre), Bet v 1 (2628) y Bet v I (2637).
La Figura 24 muestra mutaciones puntuales en la
superficie de Bet v 1 (2744).
La Figura 25 muestra mutaciones puntuales en la
superficie de Bet v 1 (2753).
La Figura 26 muestra mutaciones puntuales en la
superficie de Bet v 1 (2744) y Bet v 1 (2753).
La Figura 27 muestra los espectros de dicroísmo
circular (CD) de Bet v 1.2801 (tipo silvestre) y Bet v 1
(2744), registrados a concentraciones casi iguales.
La Figura 28 muestra la liberación de histamina
en células de basófilos humanos de Bet v 1.2801 (tipo
silvestre), y el mutante Bet v 1 (2744).
La Figura 29 muestra la liberación de histamina
en células de basófilos humanos de Bet v 1.2801 (tipo
silvestre), y el mutante Bet v 1 (2744).
La Figura 30 muestra mutaciones puntuales en la
superficie del Bet v 1 (2733).
La Figura 31 muestra los cebadores utilizados
para la mutagénesis dirigida al sitio Der p 2.
La Figura 32 muestra una alineación de secuencia
del Der p 2 con otro grupo 2 de alérgenos de ácaros de polvo
casero.
La Figura 33 muestra los contornos de superficie
del Der p 2 desde cuatro diferentes ángulos.
La Figura 34 muestra los contornos de superficie
de un mutante de Der p 2 desde cuatro ángulos diferentes.
Las Figuras 35A y B muestran una alineación de
secuencia del Der p 1 con otro grupo 1 de alérgenos de ácaros
de polvo casero.
La Figura 36 muestra los contornos de superficie
del Der p 1 desde cuatro ángulos diferentes.
La Figura 37 muestra los contornos de superficie
de un mutante de Der p 1 desde cuatro ángulos diferentes.
Las Figuras 38A-D muestran una
alineación de secuencia del Ph1 p 5 con otro grupo 5 de
alérgenos de hierba.
Las Figuras 39A y B muestran los contornos de
superficie del Ph1 p 5 Modelo A y Modelo B, respectivamente, desde
cuatro ángulos diferentes.
Las Figuras 40A y B muestran los contornos de
superficie de un mutante de Ph1 p 5 Modelo A y Modelo B,
respectivamente, desde cuatro ángulos diferentes.
La Figura 41 muestra la proliferación de
Linfocitos de Sangre Periférica expresados como el Índice de
Estimulación (SI) para varias preparaciones de Bet v 1.
Las Figuras 42-44 muestran el
perfil de citocina de las células T estimuladas con varias
preparaciones de Bet v. La Figura 42 muestra un paciente con
un perfil Th0, la Figura 43 un perfil Th1 y la Figura 44 un perfil
Th2.
La invención actual está basada en una
exposición razonada única. De acuerdo con esta exposición razonada
el exitoso mecanismo de vacunación para alergia no es una alteración
de la respuesta inmune del tipo Th2 actual, sino más bien una
iniciación paralela de una nueva respuesta inmune que implica el
reconocimiento del epítopo terciario por las células B y la
formación de anticuerpo. Se cree que esta nueva respuesta inmune es
parcialmente una respuesta inmune de tipo Th1. Este modelo es
sustentado por la observación de que los niveles de IgE específica
no están afectados por el tratamiento de vacunación exitoso, y que
el tratamiento exitoso frecuentemente está acompañado por una
elevación sustancial en IgG4 específica del alérgeno. Además, los
estudios de biopsias nasales antes y después de la estimulación con
alérgeno no muestran una reducción en las células T con el fenotipo
de tipo Th2, sino más bien se observa un incremento en las células T
de tipo Th1. Cuando la vacuna (o composiciones farmacéuticas) es
administrada a través de otra ruta diferente de las vías aéreas, se
formula la hipótesis, de que la nueva respuesta inmune evoluciona
en una nueva ubicación físicamente separada de la respuesta de Th2
actual permitiendo de esta manera que las dos respuestas existan en
paralelo.
Otro aspecto importante del sistema inmunológico
es la afirmación de la existencia de los llamados epítopos
dominantes de unión a IgE. Se propone que estos epítopos dominantes
de unión a IgE están constituidos por las áreas de superficie
coherentes dependientes de la estructura terciaria bastante grandes
para acomodar la unión del anticuerpo y conservados entre los
isoalergenos, variantes y/o alérgenos homólogos de especies
relacionadas. La existencia de IgE de reacción cruzada capaz de unir
epítopos similares en alérgenos homólogos es sustentada por la
observación clínica de que los pacientes alérgicos frecuentemente
reaccionan a varias especies estrechamente relacionadas, por
ejemplo, aliso, abedul y avellano, múltiples especies de hierbas, o
varias especies de ácaros de polvo casero del género
Dermatophagoides. Además es sustentada por experimentos de
laboratorio que demuestran la reacción cruzada de IgE entre los
alérgenos homólogos de especies relacionadas y la capacidad de un
alérgeno para inhibir la unión de IgE a los alérgenos homólogos
(Ipsen y colaboradores, 1992, ref. 16). Es bien conocido que la
exposición y las respuestas inmunes están relacionadas en un modo
dependiente de la dosis. Basada en la combinación de estas
observaciones se formula la hipótesis de que las áreas de
superficie observadas son expuestas al sistema inmune en dosis más
altas que las áreas de superficie no conservadas que dan como
resultado la generación de anticuerpos IgE con afinidades más altas,
de aquí el término "epítopos dominantes de unión a IgE".
De acuerdo con esta exposición razonada, es
esencial que el alérgeno tenga una estructura terciaria del
esqueleto del \alpha-carbono que esencialmente es
la misma con respecto a la del alérgeno natural, asegurando de esta
manera la conservación de la topología de superficie de áreas que
circundan parches conservados que representan objetivos para la
mutagénesis dirigida a reducir la unión a IgE. Al satisfacer estos
criterios, el alérgeno tiene el potencial para ser administrado en
dosis relativamente más altas mejorando su eficacia en la generación
de una respuesta inmune protectora sin comprometer la seguridad.
Además, la invención está basada en el
descubrimiento de que los síntomas alérgicos son activados por la
reacción cruzada del alérgeno con dos Ig específicas unidas a la
superficie de células efectoras, es decir mastocitos y basófilos,
vía el receptor de IgE de alta afinidad, FceRI. Para ilustración,
los solicitantes se refieren a la Fig. 15, que representa un modelo
teórico de un alérgeno con epítopos de unión a IgE. La inducción de
la liberación mediadora de los mastocitos y de aquí los síntomas
alérgicos, es efectuada por la reacción cruzada mediada por el
alérgeno de la IgE unida a la superficie del mastocito, ver Fig.
15A. En la situación mostrada en la Figura 15B, dos de los epítopos
han sido mutados para reducir su capacidad de unión a IgE, y así se
evita la reacción cruzada mediada por el alérgeno. En esta relación
se debe notar que los alérgenos normalmente comprenden más de tres
epítopos de células B. Sin embargo, de la situación teórica
representada en la Fig. 15, se puede asumir que a más epítopos, que
se han mutado para eliminar o reducir su capacidad de unión a IgE,
menor es el riesgo de la reacción cruzada mediada por el alérgeno y
los síntomas alérgicos resultantes.
Sin embargo, para un alérgeno mutado que es
capaz de elevar la nueva respuesta inmune, incluyendo la respuesta
de IgE, el alérgeno debe comprender al menos un epítopo intacto.
Preferiblemente, el epítopo intacto es un epítopo dominante, puesto
que tal alérgeno mutado proporcionará una protección mejorada cuando
se utiliza para la vacunación.
En conclusión, la idea inventiva de la presente
invención está basada en el reconocimiento de que un alérgeno
mutado que tiene mutaciones de reducción de unión a IgE en epítopos
de células B múltiples, y al menos un epítopo intacto, por una
parte reduciría la reacción cruzada mediada por el alérgeno y por
otra parte permitiría la elevación de una respuesta de IgG con una
capacidad de unión competitiva con aquella de IgE. Así, dicho
alérgeno mutado constituiría un alérgeno altamente ventajoso en que
sería fuertemente reducido el riesgo de reacciones
anafilácticas.
También, la presente invención está basada en el
reconocimiento de que una vacuna que comprende una mezcla de tales
diferentes alérgenos mutados, donde idealmente muchos o todos los
epítopos están representados como intactos, sería igualmente
eficiente en su capacidad para inducir protección contra síntomas
alérgicos como el alérgeno que surge de manera natural del cual se
derivan los alérgenos mutados.
La presente invención se refiere a la
introducción de sustituciones de aminoácidos artificiales en un
número de posiciones críticas definidas, es decir, epítopos de unión
a IgE, con el objeto de reducir la capacidad de unión a IgE
específica de cada epítopo mutado.
La invención proporciona la reivindicación
1.
Sin que sea enlazada por la teoría, se cree que
los epítopos de célula B pueden ser distribuidos sobre casi la
superficie completa del alérgeno. Además, hay evidencia experimental
de que al menos algunos epítopos constituyen una parte de una
agrupación de epítopos que comprenden un gran número de epítopos
superpuestos. Por lo tanto, la base teórica para la presente
invención, es que cualquier aminoácido expuesto a la superficie
constituye un sitio potencial de mutación, que puede dar por
resultado una capacidad reducida para unir IgE específica.
Por consiguiente, las mutaciones primarias son
definidas por su ubicación con respecto otras, es decir están
separadas, para asegurar que sean mutaciones en agrupaciones
separadas de epítopos.
La presente invención también proporciona una
composición que comprende dos o más variantes de alérgenos mutantes
recombinantes según la reivindicación 1, donde cada variante es
definido por tener al menos una mutación principal, que está
ausente en al menos una de las otras variantes, donde para cada
variante no está presente mutación secundaria dentro de un radio de
15 \ring{A} de cada mutación primaria ausente. La composición
preferiblemente comprende 2-12, más preferiblemente
3-10, más preferiblemente 4-8 y lo
más preferiblemente 5-7 variantes.
La presente invención también proporciona un
método de preparación del alérgeno recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado en
a) identificar un número de restos de aminoácido
en un alérgeno que surge de manera natural, que tiene una
accesibilidad al disolvente de al menos 20%;
b) seleccionar al menos cuatro de los restos de
aminoácido identificados de una manera tal, que cada aminoácido
seleccionado está espaciado de otro aminoácido seleccionado por al
menos 15\ring{A}, y que los aminoácidos seleccionados son
colocados de una manera tal, que al menos una región de superficie
circular con un área de 800 \ring{A}^{2} no comprende el
aminoácido seleccionado; y
c) efectuar para cada uno de los aminoácidos
seleccionados una mutación primaria, que reduce la capacidad de
unión a IgE específica del alérgeno mutado, en comparación con la
capacidad de unión de dicho alérgeno que surge de manera natural,
donde cada mutación primaria es una sustitución de un resto de
aminoácido seleccionado con otro aminoácido, que no surge en la
misma posición en la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína
homologa conocida dentro de las especies taxonómicas de las cuales
se origina el alérgeno que surge de manera natural.
En un aspecto alternativo, la invención se
refiere a un método para preparar un alérgeno recombinante según la
invención, caracterizado porque el alérgeno es producido a partir de
una secuencia de ADN obtenida por la reorganización de ADN
(reproducción molecular), del ADN que codifica el alérgeno que surge
de manera natural correspondiente.
Además, la invención se refiere a un alérgeno
recombinante según la reivindicación 1 para el uso como una
sustancia farmacéutica.
También, la invención se refiere al uso del
alérgeno recombinante según la reivindicación 1, para preparar una
sustancia farmacéutica para prevenir y/o tratar alergia.
Además, la invención se refiere a la composición
según la reivindicación 37 para el uso como una sustancia
farmacéutica.
También, la invención se refiere al uso de una
composición de conformidad con la reivindicación 39, para preparar
una sustancia farmacéutica para prevenir y/o tratar alergia.
Además, la invención se refiere a una
composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un alérgeno
recombinante según la reivindicación 1, o una composición según la
reivindicación 39, opcionalmente en combinación con un portador y/o
excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un
adyuvante. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención
puede estar en la forma de una vacuna contra reacciones alérgicas
producidas por un alérgeno que surge de manera natural en pacientes
que padecen alergia.
También, la invención se refiere a un método
para generar una respuesta inmune en un sujeto que comprende
administrar al sujeto un alérgeno recombinante de conformidad con la
reivindicación 1, una composición según la reivindicación 39 o una
composición farmacéutica según las reivindicaciones
43-44 o 48.
Además, la invención se refiere a la vacunación
o tratamiento de un sujeto que comprende administrar al sujeto un
alérgeno recombinante según la reivindicación 1, una composición
según la reivindicación 39 o una composición farmacéutica según las
reivindicaciones 43-43 o 48.
También, la invención se refiere a un proceso
para preparar una composición farmacéutica según la reivindicación
43 o 44, que comprende mezclar un alérgeno recombinante según la
reivindicación 1, o una composición según la reivindicación 39 con
sustancias y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Además, la invención se refiere a una
composición farmacéutica obtenible por el proceso según la
reivindicación 45.
También la invención se refiere a un método para
el tratamiento, prevención o alivio de reacciones alérgicas en un
sujeto, que comprende administrar a un sujeto un alérgeno
recombinante según la reivindicación 1, una composición según la
reivindicación 39 o una composición farmacéutica según las
reivindicaciones 43-44 o 48.
Además, la invención se refiere a una secuencia
de ADN que codifica un alérgeno de acuerdo con la invención, un
derivado de la misma, una secuencia parcial de la misma, una
secuencia degenerada de la misma o una secuencia, que hibrida con
la misma bajo condiciones severas, donde dicho derivado, secuencia
parcial, secuencia degenerada o secuencia de hibridación codifica
un péptido que tiene al menos un epítopo de células B.
También, la invención se refiere a un vector de
expresión que comprende el ADN de acuerdo con la invención.
Además, la invención se refiere a una célula
huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con la
invención.
Adicionalmente, la invención se refiere a un
método para producir un alérgeno mutante recombinante que comprende
la etapa de cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la
invención.
Finalmente, la invención se refiere a un
alérgeno recombinante de acuerdo con la invención o codificado por
la secuencia de ADN de acuerdo con la invención, que comprende al
menos un epítopo de células T capaz de estimular un clon de células
T o línea de células T específicas para el alérgeno que surge de
manera natural. Los mutantes de acuerdo con la invención
preferiblemente deben ser capaces de estimular las líneas de células
T específicas del alérgeno en una manera/grado similar como es
medido por el Índice de estimulación de células T.
En una realización preferida de la invención,
las mutaciones primarias están espaciadas 20 \ring{A},
preferiblemente 25 \ring{A} y lo más preferiblemente 30
\ring{A}.
Se cree que un alérgeno comprende un número de
regiones de unión potenciales para IgE's específicas, donde cada
región tiene aproximadamente un tamaño de 800 \ring{A}^{2}, cada
región de superficie comprende un gran número de epítopos
superpuestos. Así, un alérgeno tiene un número de mutaciones
primarias potenciales del área de superficie dividida entre 800
\ring{A}^{2}.
Preferiblemente, el alérgeno recombinante de
acuerdo con la invención comprende de 5 a 20, preferiblemente de 6
a 15, más preferiblemente de 7 a 12 y lo más preferiblemente de 8 a
10 mutaciones primarias.
En una realización preferida de la invención, la
región de superficie que no comprende mutación tiene un área de 700
\ring{A}^{2}, preferiblemente 600 \ring{A}^{2}, más
preferiblemente 500 \ring{A}^{2} y lo más preferiblemente 400
\ring{A}^{2}.
En una realización preferida de la invención, el
alérgeno recombinante comprende un número de mutaciones secundarias,
que cada una reduce la capacidad de unión a IgE especifico del
alérgeno mutado, en comparación con la capacidad de unión del
alérgeno que surge de manera natural, donde cada mutación secundaria
es una sustitución de un resto de aminoácido expuesto en la
superficie con otro resto, que no surge en la misma posición en la
secuencia de aminoácidos de cualquier proteína homologa conocida
dentro de las especies taxonómicas de la cuales se origina el
alérgeno que surge de manera natural, donde las mutaciones
secundarias están colocadas fuera de dicha región circular.
Las mutaciones secundarias pueden estar ubicadas
cercanas a una mutación primaria, es decir una mutación secundaria
puede ser también una mutación adicional para el mismo epítopo, que
está mutado por la mutación primaria.
En una realización preferida de la invención, al
menos uno de los aminoácidos expuestos en la superficie a ser
sustituido en el alérgeno que surge de manera natural, tiene una
accesibilidad al disolvente de por encima de 20%, preferiblemente
arriba de 30%, más preferiblemente arriba de 40% y lo más
preferiblemente por encima de 50%.
En otra realización preferida de la invención,
al menos uno de los aminoácidos expuestos en la superficie, a ser
sustituido en el alérgeno que surge de manera natural, es conservado
con más de 70%, preferiblemente 80% y lo más preferiblemente 90% de
identidad en todas las proteínas homólogas conocidas dentro de las
especies de las cuales se origina el alérgeno que surge de manera
natural.
Preferiblemente el alérgeno recombinante de
acuerdo con la invención, esencialmente tiene la misma estructura
terciaria del esqueleto del \alpha-carbono como
dicho alérgeno que surge de manera natural.
Cuando se comparan las estructuras terciarias
del esqueleto del \alpha-carbono del mutante y las
moléculas del alérgeno que surge de manera natural, la desviación
promedio de la raíz cuadrada media de las coordenadas atómicas está
preferiblemente por debajo de 2\ring{A}.
En una realización preferida del alérgeno
recombinante de la invención, cada resto de aminoácido que es
incorporado en el alérgeno mutante no surge en la misma posición en
la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína homologa conocida
dentro del género taxonómico, preferiblemente la subfamilia, más
preferiblemente la familia, más preferiblemente la superfamilia,
más preferiblemente la legión, más preferiblemente el suborden y lo
más preferiblemente el orden del cual se origina el alérgeno que
surge de manera natural.
En una realización preferida de la invención, el
alérgeno mutante recombinante de acuerdo con la invención es un
alérgeno que surge de manera no natural.
La unión a IgE específico del alérgeno mutado,
es preferiblemente reducido por al menos 5%, preferiblemente al
menos 10% en comparación a los isoalergenos que surgen de manera
natural o proteínas recombinantes similares en un inmunoensayo con
suero de pacientes alérgicos reactivos a una fuente de IgE
especifico o agrupaciones de los mismos.
Otra manera de estimar la unión a IgE reducido y
la capacidad reducida de mediar la reacción cruzada del mutante, es
la capacidad del mutante para iniciar la Liberación de Histamina
(HR). La liberación de Histamina se puede medir en varios ensayos
de liberación de Histamina. La liberación de Histamina reducida de
los mutantes se origina de la afinidad reducida hacia la IgE
específica unida a la superficie de la célula así como su capacidad
reducida para facilitar la reacción cruzada. HR está preferiblemente
reducida en 5-100%, más preferiblemente
25-100%, más preferiblemente 50-100%
y lo más preferiblemente 75-100% para los mutantes
de la invención en comparación a los alérgenos que surgen de manera
natural.
Típicamente, la región de superficie circular
con un área de 800 \ring{A}^{2}, que no comprende mutación,
comprende átomos de 15-25 restos de aminoácidos.
Un alérgeno recombinante preferido de acuerdo
con la invención, está caracterizado porque los restos de
aminoácidos expuestos en la superficie son clasificados con
respecto a la accesibilidad al disolvente y que uno o más
aminoácidos entre los más accesibles al disolvente están
sustituidos.
Un alérgeno recombinante preferido adicional de
acuerdo con la invención, está caracterizado porque los restos de
aminoácido expuestos en la superficie son clasificados con respecto
al grado de conservación en todas las proteínas homólogas conocidas
dentro de las especies de las cuales se origina el alérgeno que
surge de manera natural, y que uno o más aminoácidos entre los más
conservados están sustituidos.
Preferiblemente, el alérgeno recombinante de
acuerdo con la invención comprende de 1 a 4 mutaciones secundarias
por mutación primaria.
Una realización preferida de la invención está
caracterizada porque una o más de las sustituciones es llevada a
cabo mediante la mutagénesis dirigida al sitio.
Otra realización preferida de la invención está
caracterizada porque una o más de las sustituciones es llevada a
cabo por mutagénesis aleatoria.
Una realización preferida adicional de la
invención está caracterizada porque una o más de las sustituciones
es llevada a cabo por reorganización de ADN.
Los alérgenos recombinantes de acuerdo con la
invención, adecuadamente pueden ser un mutante de un alérgeno de
inhalación que se origina i.a. de árboles, hierbas, céspedes,
hongos, ácaros de polvo casero, cucarachas y pelo de animal y
caspa. Los alérgenos de polen importantes de árboles, hierbas y
céspedes, son tales que se originan de los órdenes taxonómicos de
Fagales, Oleales y Pinales incluyéndose i.a. abedul
(Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus),
carpe (Carpinus) y olivo (Olea), el orden de
Poales incluyéndose i.a. hierbas de los géneros Lolium,
Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis y Secale, los órdenes de
Asterales y Urticales incluyéndose i.a. céspedes de
los géneros Ambrosia y Artemisia. Los alérgenos de
inhalación importantes de hongos son i. a. tales que se originan de
los géneros Alternaria y Ciadosporium. Otros
alérgenos de inhalación importantes son aquellos de ácaros de polvo
casero del género Dermatophagoides, aquellos de cucarachas y
aquellos de mamíferos tales como gato, perro y caballo. Además, los
alérgenos recombinantes de acuerdo con la invención, pueden ser
mutantes de alérgenos de veneno, incluyéndose los que se originan
de la picadura o mordedura de insectos tales como aquellos del orden
taxonómico de Hymenoptera incluyéndose abejas (superfamilia
Apidae), avispas (superfamilia Vespidea) y hormigas (superfamilia
Formicoidae).
Los componentes de alérgenos específicos
incluyen, por ejemplo, Bet v 1 (B. verrucosa, abedul), Aln
g 1 (Alnus glutinosa, aliso), Cor a 1 (Corylus avelana,
avellano) y Car b 1 (Carpinus betulus, carpe) del orden de
Fagales. Otros son Cry j 1 (Pinales), Amb a 1 y 2, Art v 1
(Asterales), Par j 1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Cyn d
1, Dac g 1, Fes p 1, Hol 1, Lol p 1 y 5, Pas n I, Ph1 p 1 y
5, Poa p 1, 2 y 5, Sec c 1 y 5, y Sor h 1 (varios pólenes de
hierbas), Alt a 1 y Cla h 1 (hongos), Der f 1 y 2, Der p 1
y 2 (ácaros de polvo casero, D. farinae y D.
Pteronyssinus, respectivamente), Lep d 1 y 2 (destructor
Lepidoglyphus, acaro de almacenamiento), Bla g 1 y 2,
Per a 1 (cucarachas, Blatella germánica y Periplaneta
americana, respectivamente), Fel d 1 (gato), Can f 1
(perro), Equ c1, 2 y 3 (caballo), Apis m 1 y 2 (abejas
mieliferas), Ves v1, 2 y 5, Pol a 1, 2 y 5 (todas las
avispas) y Sol i 1, 2, 3 y 4 (hormiga roja).
En una realización, el alérgeno recombinante es
un mutante de Bet v 1. Los aminoácidos potencialmente
adecuados para sustitución, comprenden los aminoácidos V2, D72, E87,
K-129, E-60, N-47,
K-65, P-108, N-159,
D-93, K-123, K-32,
D-125, R-145, D-109,
E-127, Q-36, E-131,
L-152, E-6, E-96,
D-156, P-63, H-76,
E-8, K-134, E-45,
T-10, V-12, K-20,
S-155, H-126, P-50,
N-78, K-119, V-2,
L-24, E-42, N-4,
A-153, I-44, E-138,
G-61, A-130, R-70,
N-28, P-35, S-149,
K-103, Y-150, H-154,
N-43, A-106, K-115,
P-14, Y-5, K-137,
E-141, E-87 y E-73.
Una o más de las sustituciones primarias o secundarias pueden ser
seleccionadas del grupo que consiste de V2F, V2L, V2I, V2M, Y5V,
T10P, T10A, K20N, D25E, N28T, K32Q, Q36A, Q36K, E42S, E45S, N47S,
K55N, K65N, D72H, D72Q, D72N, T77A, N78K, E87G, E96L, K97S, K103V,
P108G, D109N, K123I, D125Y, K129N, K134E, R145S, S149R, S149T, D156H
y +160N, donde + significa que un aminoácido adicional es
incorporado.
Ejemplos de mutantes de Bet v 1 de
acuerdo con la presente invención, son como sigue (los paréntesis,
cuando son utilizados, indican mutaciones primarias y
secundarias):
Mutante A:
- \quad
- (Asn28Thr, Lys32Gln), (Asn78Lys, Lys103Val), Argl45Glu, (Aspl56His, +160Asn).
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante B:
- \quad
- Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lysl23Ile, Lysl34Glu, Aspl56His.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2595 (Ejemplo 2):
- \quad
- N28T, K32Q, E45S, P108G
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2628 (Ejemplo 4):
- \quad
- Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lysl34Glu.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2637 (Ejemplo 4):
- \quad
- Alal6Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leul52Lys, Alal53Gly, Serl55Pro).
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2724:
- \quad
- N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H, +160N.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2733 (Ejemplo 4):
- \quad
- (Tyr5Val,Lys34Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Argl45Glu, (Aspl56His,+160Asn)
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2744:
- \quad
- (Tyr5Val, Lysl34Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lysl23lle, (Aspl56His, +160Asn).
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2753 (Ejemplo 4):
- \quad
- (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Aspl09Asn), (Aspl25Tyr, Glul27Ser), Argl45Glu.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2744 + 2595:
- \quad
- Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2744 + 2628:
- \quad
- Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H, +160N.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2744 + 2595 + 2628:
- \quad
- Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, E45s, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, todos los mutantes anteriores que
comprenden una o más de las siguientes sustituciones: V2F, V2L, V2I,
V2M, T10A, K20N, Q36A o Q36K, D72H, D72Q, D72N, E87G, K129N y S149R
o S149T.
En otra realización, el alérgeno recombinante
deriva de un alérgeno de veneno del orden taxonómico de Vespidae,
Apidae y Formicoidae.
En una realización adicional, el alérgeno
recombinante deriva de Ves v 5. Los aminoácidos
potencialmente adecuados para sustitución comprenden los
aminoácidos K-16, K-185,
K-11, K-44, K-210,
R-63, K-13, F-6,
K-149, K-128,
E-184, K-112, F-157,
E-3, K-29, N-203,
N-34, K-78, K-151,
L-15, L-158, Y-102,
W-186, K-134, D-87,
K-52, T-67, T-125,
K-150, Y-40, Q-48,
L-65, K-81, Q-101,
Q-208, K-144, N-8,
N-70, H-104, Q-45,
K-137, K-159,
E-205, N-82, A-111,
D-131, K-24, V-36,
N-7, M-138, T-209,
V-84, K-172, V-19,
D-56, P-73, G-33,
T-106, N-170, L-28,
T-43, Q-114, C-10,
K-60, N-31, K-47,
E-5, D-145, V-38,
A-127, D-156, E-204,
P-71, G-26, Y-129,
D-141, F-201, R-68,
N-200, D-49, S-153,
K-35, S-39, Y-25,
V-37, G-18, W-85 e
I-182. Una o más de las sustituciones primarias y
secundarias pueden ser seleccionadas del grupo que consiste de K29A,
T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M y N203G.
En una realización adicional, el alérgeno
recombinante deriva de Der p 2. Los aminoácidos potencialmente
adecuados para sustitución comprende los aminoácidos
R-128, D-129, H-11,
H-30, S-1, K-77,
Y-75, R-31, K-82,
K-6, K-96, K-48,
K-55, K-89, Q-85,
W-92, I-97, H-22,
V-65, S-24, H-74,
K-126, L-61, P-26,
N-93, D-64, I-28,
K-14, K-100, E-62,
I-127, E-102, E-25,
P-66, L-17, G-60,
P-95, E-53, V-81,
K-51, N-103, Q-2,
N-46, E-42, T-91,
D-87, N-10, M-111,
C-8, H-124, I-68,
P-79, K-109 y R-128,
D-129, H-11, H-30,
S-1, K-77, Y-75,
R-31, K-82, K-6,
K-96, K-48, K-55,
K-89, Q-85, W-92,
I-97, H-22, V-65,
S-24, H-74, K-126,
L-61, P-26, N-93,
D-64, I-28, K-14,
K-100, E-62, I-127,
E-102, E-25, P-66,
L-17, G-60, P-95,
E-53, V-81, K-51,
N-103, Q-2, N-46,
E-42, T-91, D-87,
N-10, M-111, C-8,
H-124, I-68, P-79,
K-109, K-15. Una o más de las
sustituciones primarias y secundarias pueden ser seleccionadas del
grupo que consiste de K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N,
K77N, K82N, K100N y R128Q.
Ejemplos de mutantes de Bet v 1 de
acuerdo con la presente invención, son como sigue:
Mutante A:
- \quad
- K6A, K15E, H30N, E62S.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante B:
- \quad
- K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante C:
- \quad
- K6A, N10s, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N y R128Q.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de vacunas es generalmente bien
conocida en el estado de la técnica. Las vacunas típicamente son
preparadas como formas inyectables, ya sea como soluciones o
suspensiones líquidas. Tal vacuna también puede ser emulsificada o
formulada para permitir la administración nasal así como la
administración oral, incluyéndose la administración bucal y
sublingual. El componente inmunogénico en cuestión (el alérgeno
recombinante como se define en la presente memoria) puede estar
adecuadamente mezclado con excipientes que son farmacéuticamente
aceptables y además compatibles con el ingrediente activo. Ejemplos
de excipientes adecuados son agua, solución salina, dextrosa,
glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos.
Adicionalmente, la vacuna puede contener otras sustancias tales
como agentes humectantes, agentes emulsificantes, agentes
reguladores del pH o adyuvantes que mejoran la efectividad de la
vacuna.
Las vacunas son más frecuentemente administradas
parenteralmente por inyección subcutánea o intramuscular. Las
formulaciones que son adecuadas para la administración por otra ruta
incluyen las formulaciones orales y supositorios.
Las vacunas para administración oral
adecuadamente pueden ser formuladas con excipientes normalmente
empleados para tales formulaciones, por ejemplo, grados
farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio,
sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. La
composición puede ser formulada como soluciones, suspensiones,
emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de
liberación sostenida, aerosoles, polvos o granulados.
Las vacunas son administradas en una manera tal
para ser compatibles con la formulación de dosificación y en tal
cantidad que será terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La
cantidad del componente activo contenida dentro de la vacuna
depende del sujeto a ser tratado, i.a. la capacidad del sistema
inmune del sujeto a responder al tratamiento, la ruta de
administración y la edad y el peso del sujeto. Los rangos de
dosificación adecuados pueden variar dentro del rango de
aproximadamente 0.0001 \mug a 1000 \mug.
Como se mencionó anteriormente, un efecto
incrementado puede ser obtenido al adicionar adyuvantes a la
formulación. Ejemplos de tales adyuvantes son hidróxido de aluminio
y fosfato (alum) o fosfato de calcio como una solución al 0.05 a
0.1 por ciento en solución salina regulada con fosfato, polímeros
sintéticos de azúcares o glicólido poliláctido (PLG) utilizado como
solución al 0.25 por ciento.
La mezcla con células bacterianas tal como C.
parvum, endotoxinas o componentes de lipopolisacárido de
bacterias gram negativas, la emulsión en vehículos de aceite
fisiológicamente aceptables tal como monooleato de manida (Aracel
A) o emulsión con 20 por ciento de un perfluorocarbono (por ejemplo
Fluosol-DA) utilizado como un sustituto de bloqueo,
también pueden ser empleadas. También se pueden utilizar emulsiones
oleosas, tal como MF-59. También se pueden utilizar
otros adyuvantes tales como los adyuvantes completos e incompletos
de Freund así como saponinas, tales como QuilA,
Qs-21 e ISCOM, y RIBI.
Más frecuentemente, las administraciones
múltiples de la vacuna serán necesarias para asegurar un efecto.
Frecuentemente, la vacuna es administrada como una administración
inicial seguida por inoculaciones posteriores u otras
administraciones. El número de vacunaciones típicamente estará en el
rango de 1 a 50, usualmente no excediendo 35 vacunaciones. La
vacunación normalmente será realizada de cada dos semanas a cada dos
meses durante un periodo de 3 meses a 5 años. Esto es contemplado
para dar el nivel deseado de efecto profiláctico o terapéutico.
El alérgeno recombinante se puede utilizar como
una preparación farmacéutica, que es adecuada para proporcionar una
cierta protección contra respuestas alérgicas durante el período del
año donde surgen los síntomas (profilaxis). Normalmente, el
tratamiento tendrá que ser repetido cada año para mantener el efecto
protector. Las preparaciones formuladas para aplicación nasal, oral
y sublingual son particularmente adecuadas para este propósito.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se mencionó anteriormente, la presente
invención también se refiere a un método de preparación del alérgeno
mutante recombinante de la invención, ver la reivindicación 50.
Los aminoácidos expuestos a la superficie
adecuados para la sustitución, de acuerdo con la presente invención,
pueden ser identificados en la base de la información de su
accesibilidad al disolvente (agua), que expresa el grado de
exposición a la superficie. Una realización preferida del método de
la invención se caracteriza por clasificar los restos de aminoácido
identificados con respecto a la accesibilidad al disolvente y
sustituir uno o más aminoácidos entre los más accesibles al
disolvente.
Un segundo parámetro, que puede contribuir a la
identificación de los aminoácidos expuestos a la superficie,
adecuados para la sustitución, de acuerdo con la presente invención,
es el grado en el cual un aminoácido está conservado en todas las
proteínas homólogas conocidas dentro de las especies de las cuales
se origina el alérgeno que surge de manera natural.
Alternativamente, el grado en el cual en todas las proteínas
homólogas conocidas dentro del género taxonómico, subfamilia,
familia, superfamilia, suborden, legión u orden del cual se origina
el alérgeno que surge de manera natural se utiliza como un segundo
parámetro.
Por consiguiente, una realización preferida del
método de la invención, está caracterizada por seleccionar restos
de aminoácido identificados, que están conservados con más de 70%,
preferiblemente más de 80% y lo más preferiblemente 90% de
identidad en todas las proteínas homólogas conocidas dentro de las
especies de las cuales se origina el alérgeno que surge de manera
natural.
Además, una realización particularmente
preferida del método de la invención está caracterizada por
clasificar los restos de aminoácido identificados con respecto al
grado de conservación, en todas las proteínas homólogas conocidas
dentro de la especie de la cual se origina el alérgeno que surge de
manera natural y sustituir uno o más aminoácidos entre los más
conservados.
Una realización preferida adicional del método
de la invención, comprende seleccionar los aminoácidos identificados
para formar un alérgeno mutante, que esencialmente tiene la misma
estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono que el alérgeno que surge de manera
natural.
Otra realización preferida del método de la
invención está caracterizada porque la sustitución de los restos de
aminoácido se lleva a cabo mediante la mutagénesis dirigida al
sitio.
Una realización alternativa preferida del método
de la invención está caracterizada porque la sustitución de los
restos de aminoácido es llevada a cabo mediante la reorganización de
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las moléculas, para las cuales la
estructura terciaria ha sido determinada (por ejemplo mediante
cristalografía con rayos X o microscopía electrónica con NMR), el
mutante que lleva el(los) aminoácido(s)
sustituido(s) preferiblemente debe cumplir los siguientes
criterios:
1. La estructura terciaria del esqueleto
principal del \alpha-carbono total de la molécula
está preferiblemente conservada. Conservado se define como una
desviación promedio de raíz cuadrada media de las coordenadas
atómicas comparando las estructuras por debajo de 2\ring{A}. Esto
es importante por dos razones: (a) Se anticipa que la superficie
completa del alérgeno natural constituye un medio continuo
superpuesto de epítopos potenciales de unión al anticuerpo. La
mayor parte de la superficie de la molécula no está afectada por
la(s) sustitución(es), y así conserva sus propiedades
de inducción de unión al anticuerpo, que es importante para la
generación de nuevas especificidades protectoras del anticuerpo que
son dirigidas a epítopos presentes también en el alérgeno natural,
(b) Estabilidad, relacionada tanto con la vida de almacenamiento
como en la inyección en los fluidos del cuerpo.
2. Los aminoácidos a ser sustituidos
preferiblemente están ubicados en la superficie, y así accesibles
para la unión al anticuerpo. Los aminoácidos ubicados en la
superficie en la estructura tridimensional normalmente tienen una
accesibilidad al disolvente (agua) de al menos 20%, adecuadamente
20-80%, más adecuadamente 30-80%.
La accesibilidad al disolvente está definida como el área de la
molécula accesible a una esfera con un radio comparable a una
molécula de disolvente (agua, r = 1.4 \ring{A}).
3. Cada uno de los aminoácidos sustituidos
preferiblemente está ubicado en parches conservados que tienen un
área más grande que 400 \ring{A}^{2}. Los parches conservados
están definidos como áreas coherentemente conectadas de restos de
aminoácido conservados expuestos a la superficie y el esqueleto. Los
restos de aminoácido conservados son definidos por la alineación de
secuencia de todas las secuencias de aminoácidos conocidas
(deducidas) de proteínas homólogas dentro de la misma especie
taxonómica, género, subfamilia, familia, superfamilia, legión,
suborden u orden. Las posiciones de los aminoácidos que tienen
restos de aminoácido idénticos en más de 70% de las secuencias se
consideran conservados. Los parches conservados se espera que
contengan epítopos a los cuales se dirige la IgE de la mayoría de
los pacientes.
La conservación de la estructura terciaria del
esqueleto de \alpha-carbono se determina mejor al
obtener estructuras idénticas mediante cristalografía con rayos x o
NMR antes o después de la mutagénesis. En la ausencia de datos
estructurales que describen los espectros de CD indistinguibles del
mutante o datos inmunoquímicos, por ejemplo, reactividad al
anticuerpo, pueden presentar conservación de la probable estructura
terciaria del esqueleto del \alpha-carbono, si es
comparada con los datos obtenidos por análisis de una molécula
estructuralmente determinada.
4. Dentro de los aminoácidos de parches
conservados para la mutagénesis, preferiblemente deben ser
seleccionados entre los más accesibles al disolvente (agua),
ubicados preferiblemente cerca del centro del parche conservado.
5. Preferiblemente, un resto de aminoácido polar
es sustituido por otro resto polar, y un resto de aminoácido no
polar es sustituido por otro resto no polar.
Con un objeto de mantener esencialmente la
estructura tridimensional del alérgeno, el aminoácido a ser
incorporado puede ser seleccionado en la base de una comparación
con una proteína, que es un homólogo estructural al alérgeno, por
ejemplo una proteína, que pertenece al mismo orden taxonómico al
alérgeno, y que no tiene ninguna reactividad cruzada con el
alérgeno.
En una realización preferida, la secuencia de
ADN de la invención, es un derivado de la secuencia de ADN que
codifica el alérgeno que surge de manera natural.
Preferiblemente, el derivado de ADN es obtenido
mediante la mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria del ADN que
codifica el alérgeno que surge de manera natural.
En una primera realización particularmente
preferida, la secuencia de ADN es un derivado de la secuencia
mostrada en la Fig. 3, donde la secuencia de ADN está mutada para
codificar un alérgeno que tiene por lo menos cuatro mutaciones
seleccionadas del grupo que consiste de K-129,
E-60, N-47, K-65,
P-108, N-159, D-93,
K-123, K-32, D-125,
R-145, D-109,
E-127, Q-36, E-131,
L-152, E-6, E-96,
D-156, P-63, H-76,
E-8, K-134, E-45,
T-10, V-12, K-20,
S-155, H-126, P-50,
N-78, K-119, V-2,
L-24, E-42, N-4,
A-153, I-44, E-138,
G-61, A-130, R-70,
N-28, P-35, S-149,
K-103, Y-150, H-154,
N-43, A-106, K-115,
P-14, Y-5, K-137,
E-141, E-87 ,
E-73.
En una segunda realización particularmente
preferida, la secuencia de ADN es un derivado de la secuencia
mostrada en la Fig. 13, donde la secuencia de ADN está mutada para
codificar un alérgeno que tiene al menos cuatro mutaciones
seleccionada del grupo que consiste de K-16,
K-185, K-11, K-44,
K-210, R-63, K-13,
F-6, K-149, K-128,
E-184, K-112, F-157,
E-3, K-29, N-203,
N-34, K-78, K-151,
L-15, L-158, Y-102,
W-186, K-134, D-87,
K-52, T-67, T-125,
K-150, Y-40, Q-48,
L-65, K-81, Q-101,
Q-208, K-144, N-8,
N-70, H-104, Q-45,
K-137, K-159,
E-205, N-82, A-111,
D-131, K-24, V-36,
N-7, M-138, T-209,
V-84, K-172, V-19,
D-56,P-73, G-33,
T-106, N-170, L-28,
T-43, Q-114, C-10,
K-60, N-31, K-47,
E-5, D-145, V-38,
A-127, D-156, E-204,
P-71, G-26, Y-129,
D-141, F-201, R-68,
N-200, D-49, S-153,
K-35, S-39, Y-25,
V-37, G-18, W-85 e
I-182.
En una tercera realización particularmente
preferida, la secuencia de ADN es un derivado de la secuencia
mostrada en la Fig. 16, donde la secuencia de ADN está mutada para
codificar un alérgeno que tiene al menos cuatro mutaciones
seleccionadas del grupo que consiste de R-128,
D-129, H-11, H-30,
S-1, K-77, Y-75,
R-31, K-82, K-6,
K-96, K-48, K-55,
K-89, Q-85, W-92,
I-97, H-22, V-65,
S-24, H-74, K-126,
L-61, P-26, N-93,
D-64, I-28, K-14,
K-100, E-62, I-127,
E-102, E-25, P-66,
L-17, G-60, P-95,
E-53, V-81,K-51,
N-103, Q-2, N-46,
E-42, T-91, D-87,
N-10, M-111, C-8,
H-124, I-68, P-79,
K-109 y R-128,
D-129, H-11, H-30,
S-1, K-77, Y-75,
R-31, K-82, K-6,
K-96, K-48, K-55,
K-89, Q-85, W-92,
I-97, H-22, V-65,
S-24, H-74, K-126,
L-61, P-26, N-93,
D-64, I-28, K-14,
K-100, E-62, I-127,
E-102, E-25, P-66,
L-17, G-60, P-95,
E-53, V-81, K-51,
N-103, Q-2, N-46,
E-42, T-91, D-87,
N-10, M-111, C-8,
H-124, I-68, P-79,
K-109, K-15.
\vskip1.000000\baselineskip
El alérgeno mutante recombinante de acuerdo con
la presente invención se puede producir utilizando una secuencia de
ADN obtenida mediante la reorganización de ADN (reproducción
molecular), del ADN en forma natural correspondiente. La
reorganización de ADN se puede llevar a cabo de acuerdo con los
procedimientos descritos en el articulo por Punnonen y
colaboradores (ref. 25) así como los procedimientos descritos en los
artículos mencionados en el mismo, que están todos incluidos en la
presente memoria por esta referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, los alérgenos mutantes recombinantes de
acuerdo con la invención, tienen posibilidades y ventajas de
diagnóstico. Las vacunas para alergia de la técnica anterior están
basadas en extractos de la fuente de alérgeno que surge de manera
natural, y así representan una amplia variedad de isoformas. El
individuo alérgico inicialmente ha sido sensibilizado y tiene IgE a
una o algunas de las isoformas presentes. Algunas de las isoformas
pueden ser relevantes con respecto a las reacciones alérgicas del
individuo alérgico debido a la homología y la reactividad cruzada
posterior con la isoforma a la cual el individuo es alérgico,
mientras que otras isoformas pueden ser irrelevantes ya que no
albergan ninguno de los epítopos de unión a IgE al cual el
individuo alérgico tiene IgE específica. Debido a esta
heterogeneidad de las especificidades de la población de IgE, por
lo tanto algunas formas pueden ser seguras para administrar, es
decir, no dan como resultado una respuesta alérgica vía IgE,
mientras que otras isoformas pueden ser perjudiciales ocasionando
efectos secundarios indeseables.
Así, los mutantes de la invención y las
composiciones de la invención propuestas para ser administradas
terapéuticamente, también se pueden utilizar para el ensayo de
diagnóstico in vivo o in vitro para inspeccionar la
relevancia, seguridad o efecto de un tratamiento con tales mutantes
o composiciones. Las muestras de diagnóstico a ser aplicadas
incluyen muestras del cuerpo, tal como sueros. Así, la invención
también se refiere a un ensayo de diagnóstico para estimar la
relevancia, seguridad o efecto de la terapia de un sujeto utilizando
un alérgeno mutante recombinante de acuerdo con la invención o una
composición de acuerdo con la invención, donde una muestra que
contiene es mezclada con dicho mutante o dicha composición y
estimada para el nivel de reactividad entre dicha IgE en la muestra
y dicho mutante. La estimación del nivel de reactividad entre la IgE
en la muestra y el mutante puede ser llevada a cabo utilizando
cualquier inmunoensayo conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con la presente invención, la
expresión "reducir la capacidad de unión a IgE especifico
comparada con la capacidad de unión a IgE del alérgeno que surge de
manera natural" significa que la reducción se mide de una manera
estadísticamente significativa (p<0.05) en al menos un
inmunoensayo que utiliza suero de un sujeto alérgico al alérgeno
que surge de manera natural. Preferiblemente, la capacidad de unión
a IgE está reducida al menos 5%, más preferiblemente al menos
10%.
La expresión "aminoácido expuesto en la
superficie" significa que el resto de aminoácido está ubicado en
la superficie de la estructura tridimensional de una manera tal,
que cuando el alérgeno está en solución al menos una parte de al
menos un átomo del resto de aminoácido está accesible para el
contacto con el disolvente circundante. Preferiblemente el resto de
aminoácido en la estructura tridimensional tiene una accesibilidad
al disolvente (agua) de al menos 20%, adecuadamente al menos 30%,
más adecuadamente al menos 40% y lo más preferiblemente al menos
50%.
La expresión "accesibilidad al disolvente"
se define como el área de la molécula accesible a una esfera con un
radio comparable con una molécula del disolvente (agua, r = 1.4
\ring{A}).
Las expresiones "expuesto a la superficie"
y "expuesto al disolvente" se utilizan de manera
intercambiable.
La expresión "la especie taxonómica de la cual
se origina el alérgeno que surge de manera natural" significa la
especie en el sistema taxonómico.
Además, la expresión "dicho alérgeno mutante
que tiene esencialmente la misma estructura terciaria del esqueleto
del \alpha-carbono como el alérgeno que surge de
manera natural" significa que cuando se comparan las estructuras,
la desviación promedio de raíz cuadrada media de las coordenadas
atómicas está por debajo de 2\ring{A}.
En relación con la presente invención, la
expresión "sustitución" significa la deleción, sustitución o
adición de un aminoácido en comparación a la secuencia de
aminoácidos del alérgeno que surge de manera natural.
La presente invención es además ilustrada por
los siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 1 describe la preparación de
alérgenos mutantes recombinantes con una y tres mutaciones
primarias. Los alérgenos mutantes recombinantes de acuerdo con la
invención, es decir, alérgenos que comprenden al menos cuatro
mutaciones primarias, pueden ser preparados utilizando los mismos
procedimientos.
El alérgeno principal de polen de abedul Bet
v I muestra aproximadamente 90% de identidad de secuencia de
aminoácidos con los alérgenos principales de pólenes de árboles
taxonómicamente relacionados, es decir Fagales (por ejemplo
avellano y carpe) y los pacientes alérgicos al polen de abedul
frecuentemente muestran síntomas clínicos de reactividad cruzada
alérgica hacia estas proteínas homólogas de Bet v 1.
Bet v 1 también muestra aproximadamente
50-60% de identidad de secuencia con las proteínas
alérgicas presentes en ciertos frutas (por ejemplo manzana y
cereza) y vegetales (por ejemplo apio y zanahoria) y existe
evidencia clínica para la reactividad cruzada alérgica entre Bet
v 1 y estas proteínas relacionadas con la comida.
Además, Bet v 1 comparte significativa
identidad de secuencia (20-40%) con un grupo de
proteínas de plantas llamadas proteínas relacionadas con +
patogénesis (PR-10), sin embargo no existen
descripciones de reactividad cruzada alérgica hacia estas proteínas
PR-10.
La modelación molecular sugiere que las
estructuras de los alérgenos de Fagales y de comida y las
proteínas PR-10 están cercanas a ser idénticas con
la estructura de Bet v 1.
La base estructural para la reactividad cruzada
de Bet v 1 alérgica se describió en (Gajhede y colaboradores
1996, ref. 17), donde se pudo identificar que tres parches en la
superficie molecular de Bet v 1 se podrían identificar a ser
comunes para los alérgenos principales de polen de árbol conocidos.
Así, cualquier IgE que reconoce estos parches en Bet v 1
seria capaz de reaccionar cruzadamente y enlazar a otros alérgenos
principales de polen de Fagales y dar origen a síntomas
alérgicos. La identificación de estos parches comunes se realizó
después de la alineación de todas las secuencias de aminoácidos
conocidas de los mayores alérgenos de polen de árbol en combinación
con un análisis de la superficie molecular de Bet v 1
revelada por la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono descrita en la ref. 17. Además, se
definió que los parches tienen un cierto tamaño mínimo (>400
\ring{A}^{2}) basado en el área cubierta por un anticuerpo en la
unión.
Los restos de aminoácido para la mutagénesis
dirigida al sitio se seleccionaron de entre los restos presentes en
las áreas específicas de Bet v 1 y los parches comunes,
puesto que las modificaciones de estos se espera que afecten la
unión de IgE de suero de la mayoría de los pacientes que muestran
reactividad cruzada alérgica clínica al polen de árbol.
La orientación relativa y el porcentaje de la
exposición al disolvente de cada resto de aminoácido dentro del
parche respectivo, se calculó en base a sus coordenadas atómicas.
Los restos que tienen un bajo grado de exposición al disolvente
(<20%) no se consideraron relevantes para la mutagénesis debido a
la posible interrupción de la estructura o la falta de interacción
con el anticuerpo. Los restos restantes se clasificaron de acuerdo
con su grado de exposición al disolvente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias homólogas a la secuencia
interrogante (Bet v 1 No. 2801, WHO IUIS Subcomité de
Nomenclatura en Alérgenos) se obtuvieron de bases de datos de
secuencias de GenBank y EMBL mediante una búsqueda BLAST (Altschul
y colaboradores, ref. 18). Todas las secuencias con probabilidades
descritas de BLAST menores que 0.1 se tomaron en consideración y se
construyó una lista que contiene una lista no redundante de
secuencias homólogas. Estas se alinearon por CLUSTAL W (Higgins y
colaboradores, ref. 19) y el porcentaje de identidad se calculó
para cada posición en la secuencia considerando la lista completa o
solamente las especies taxonómicamente relacionadas. Un total de
122 secuencias fueron homólogas a Bet v 1 No. 2801 de las
cuales 57 secuencias se originan de especies taxonómicamente
relacionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó ARN del polen de Betula
verrucosa (Allergon, Sweden) mediante la extracción con fenol y
la precipitación con LiCl. Se realizó la cromatografía de afinidad
en Oligo(dt)-celulosa por lotes en tubos
Eppendorph, y se sintetizó el ADNc de doble hebra utilizando un kit
disponible comercialmente (Amersham). El ADN que codifica Bet v
1 se amplificó por PCR y se clonó. En resumen, la PCR se realizó
utilizando ADNc como patrón, y los cebadores designados para
comparar la secuencia de ADNc en las posiciones correspondientes al
amino terminal de Bet v 1 y la región 3' no traducida,
respectivamente. Los cebadores se extendieron en los extremos 5'
para acomodar los sitios de restricción (NcoI y HindIII) para la
clonación direccional en pKK233-2.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica Bet v I se subclonó
posteriormente en el vector de fusión de proteína de unión a maltosa
pMAL-c (New England Biolabs). El gen se amplificó
por PCR y se subclonó en la estructura con malE para generar
proteína de unión a maltosa (MBP)-operones de fusión
de proteína Bet v 1 en los que MBP y Bet v 1 se
separaron por un sitio de segmentación de proteasa de factor X_{a}
posicionado para restaurar la secuencia amino terminal auténtica de
Bet v 1 en la segmentación, como se describe en la ref. 15.
En resumen, la PCR se realizó utilizando pKK233-3
con Bet v 1 insertado como patrón y los cebadores
correspondientes al extremo amino- y
carboxi-terminal de la proteína, respectivamente. El
cebador próximo al promotor se extendió en el extremo 5' para
acomodar 4 codones que codifican un sitio de segmentación de
proteasa de factor X_{a} en la estructura. Ambos cebadores fueron
además extendidos en los extremos 5' para acomodar los sitios de
restricción (KpnI) para clonación. Los genes que codifican
Bet v 1 se subclonaron utilizando 20 ciclos de PCR para
reducir la frecuencia de los artefactos de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis in vitro se realizó
mediante PCR utilizando pMAL-c recombinante con
Bet v 1 insertado como patrón. Cada gen Bet v I
mutante se generó mediante 3 reacciones de PCR utilizando 4
cebadores.
Dos cebadores de oligonucleótidos específicos de
mutación se sintetizaron para acomodar cada mutación, uno para cada
hebra de ADN, ver las Figs 1 y 2. Utilizando el(los)
nucleótido(s) mutado(s) como punto de partida, ambos
cebadores se extendieron 7 nucleótidos en el extremo 5' y 15
nucleótidos en el extremo 3'. Los nucleótidos de extensión fueron
idénticos en secuencia al gen Bet v 1 en la región
actual.
Dos cebadores generalmente aplicables (llamados
"todo sentido" y "todo no sentido" en la Figura 2) se
sintetizaron adicionalmente y se utilizaron para todos los
mutantes. Estos cebadores eran de 15 nucleótidos de longitud y
corresponden en secuencia a las regiones del vector
pMAL-c aproximadamente 1 kilobase corriente arriba y
corriente abajo del Bet v 1. La secuencia del cebador
corriente arriba deriva de la hebra de sentido y la secuencia del
cebador corriente abajo deriva de la hebra de no sentido, ver la
Fig. 2.
\newpage
Se realizaron dos reacciones de PCR
independientes esencialmente de acuerdo con los procedimientos
clásicos (Saiki y colaboradores 1988, ref. 20) con la excepción de
que solamente 20 ciclos de temperatura se realizaron con el fin de
reducir la frecuencia de los artefactos de PCR. Cada reacción de PCR
utilizó pMAL-c con Bet v 1 insertado como
patrón y una mutación específica y un cebador generalmente aplicable
en combinaciones significativas.
La introducción de las cuatro sustituciones de
aminoácido (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) en el mutante
de triple parche se realizó tal como se describió anteriormente en
un proceso de paso a paso. Primero, la mutación de Glu45Ser luego
la mutación de Pro108Gly y por último las mutaciones Asn28Thr,
Lys32Gln se introdujeron utilizando pMAL-c con
Bet v 1 No. 2801 insertado, Bet v 1 (Glu45Ser) Bet
v 1 (Glu45Ser, Pro108Gly) como patrones, respectivamente.
Los productos de PCR se purificaron mediante la
electroforesis en gel de agarosa y la electroelución seguido por la
precipitación con etanol. Se realizó una tercera reacción de PCR
utilizando los productos de PCR combinados de las primeras dos
reacciones de PCR como patrón y ambos cebadores generalmente
aplicables. Nuevamente se utilizaron 20 ciclos de PCR estándar. El
producto de PCR se purificó mediante la electroforesis en gel de
agarosa y la electroelución seguido por la precipitación con etanol,
se cortó con enzimas de restricción (BsíWI/EcoRI), y se ligó
direccionalmente en pMAL-c con Bet v 1
insertado, restringido con las mismas enzimas.
La Figura 3 muestra una revisión de todas las 9
mutaciones de Bet v 1, que son como sigue.
Thr10Pro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln,
Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser (sin parche), Thr77Ala y
Pro108Gly. También se preparó un mutante adicional con cuatro
mutaciones (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly). De estos, se
seleccionaron cinco mutantes para la prueba adicional: Asn28Thr +
Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, Pro108Gly y el mutante de Triple
parche Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica Bet v 1 se realizó antes y después de la
subclonación, y después de la mutagénesis in vitro,
respectivamente.
Los ADN de plásmido de 10 ml de cultivo
bacteriano cultivados a saturación durante la noche en medio LB,
complementado con 0.1 g/1 de ampicilina, se purificaron en columnas
Qiagen-tip 20 y se secuenciaron utilizando el kit de
secuenciación de ADN Sequenase versión 2.0 (USB) siguiendo las
recomendaciones de los proveedores.
\vskip1.000000\baselineskip
Bet v 1 recombinante (Bet v 1 No.
2801 y mutantes) se sobreexpresaron en DH 5a de Escherichia
coli fusionado a la proteína de unión a maltosa y se
purificaron como se describe en la ref. 15. Brevemente, las células
de E. coli recombinantes se cultivaron a 37ºC a una densidad
óptica de 1.0 a 436 nm, después de lo cual la expresión de la
proteína de fusión Bet v 1 se indujo mediante la adición de
IPTG. Las células se cosecharon por centrifugación 3 horas después
de la inducción, se resuspendieron en tampón de lisis y se
rompieron por sonicación. Después de la sonicación y la
centrifugación adicional, la proteína de fusión recombinante se
aisló mediante cromatografia de afinidad de amilosa y posteriormente
se segmentó mediante la incubación con el Factor Xa (ref. 15).
Después de la segmentación con F Xa, Bet v 1 recombinante se
aisló mediante la filtración en gel y si fuera necesario, se
sometió a otro ciclo de cromatografía de afinidad de amilosa con el
fin de retirar las pequeñas cantidades de proteína de unión a
maltosa.
Bet v 1 recombinante purificado se
concentró mediante ultrafiltración a aproximadamente 5 mg/ml y se
almacenó a 4ºC. Los rendimientos finales de las preparaciones dé
Bet v 1 recombinante purificado fueron entre
2-5 mg por litro de cultivo de células de E.
coli.
Las preparaciones de Bet v 1 recombinante
purificado aparecieron como bandas individuales después de la
electroforesis de SDS-poliacrilamida manchado con
plata con un peso molecular aparente de 17.5 Kda. La secuenciación
N-terminal mostró las secuencias esperadas como se
derivan de las secuencias de nucleótidos de ADNc y el análisis de
aminoácido cuantitativo mostró las composiciones de aminoácidos
esperadas.
Los solicitantes han mostrado previamente (ref.
15) que Bet v 1 No. 2801 recombinante es indistinguible
inmunoquímicamente de Bet v 1 que surge de manera
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siete mutantes Bet v 1 se produjeron como
proteínas Bet v 1 recombinantes y se purificaron como es
descrito en la anterior y se probó su reactividad hacía los
anticuerpos de conejo policlonales resaltados contra Bet v 1
aislado del polen de abedul. Cuando se analiza por
inmunoelectroforesis (inmunoelectroforesis de línea de cohete) bajo
condiciones nativas, los anticuerpos de conejo fueron capaces de
precipitar todos los mutantes, indicando que los mutantes han
conservado la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Con el fin de analizar el efecto en la respuesta
a IgE policlonal humano, los mutantes Glu45Ser, Pro108Gly,
Asn28Thr+Lys32Gln y Glu60Ser fueron seleccionados para el análisis
adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido glutámico en la posición 45 muestra un
alto grado de exposición al disolvente (40%) y está ubicado en un
parche de superficie molecular común para los alérgenos de
Fagales (parche I). Un resto de serina se encontró que ocupa
la posición 45 en algunas de las proteínas PR-10
homólogas a Bet v 1 argumentando que el ácido glutámico se
puede reemplazar por serina sin distorsión de la estructura
terciaria del esqueleto del \alpha-carbono.
Además, como ninguna de las secuencias del alérgeno de
Fagales conocidas tienen serina en la posición 45, la
sustitución del ácido glutámico con serina da origen a una molécula
Bet v 1 que surge de manera no natural.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis se llevó a cabo como se describe en
Spangfort y colaboradores 1996a. Se encontró que el mutante Bet v
1 Glu45Ser recombinante fue capaz de inducir la proliferación en
las líneas de células T de tres diferentes pacientes alérgicos al
polen de abedul con índices de estimulación similares al
recombinante y al que surge de manera natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Cristales de Glu45Ser Bet v 1
recombinante se desarrollaron mediante la difusión de vapor a 25ºC,
esencialmente como se describe en (Spangfort y colaboradores 1996b,
ref. 21). Glu45Ser Bet v 1, a una concentración de 5 mg/ml,
se mezcló con un volumen igual de sulfato de amonio 2.0 M, citrato
de sodio 0.1 M, dioxano al 1% (v/v), pH 6.0 y se equilibró contra
lOOx volumen de sulfato de amonio 2.0 M, citrato de sodio 0.1 M,
dioxano al 1% (v/v), pH 6.0. Después de 24 horas de equilibrio, el
crecimiento del cristal se indujo al aplicar la técnica de sembrado
descrita en la ref. 21, utilizando cristales de Bet v 1 de
tipo silvestre recombinante como una fuente de semillas.
Después de aproximadamente 2 meses, los
cristales se cosecharon y se analizaron utilizando rayos X,
generados de un ánodo de rotación Rigaku como se describe en la ref.
21 y la estructura se resolvió utilizando el reemplazo
molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto estructural de la mutación fue
dirigido al desarrollar cristales de proteína Bet v 1
Glu45Ser tridimensionales que difractan a la resolución 3.0
\ring{A} cuando son analizados por rayos X generados de un ánodo
de rotación. La sustitución del ácido glutámico a serina en la
posición 45 fue verificada mediante el mapa de densidad de
electrones de la estructura Bet v 1 Glu45Ser, que también
mostró que está preservada la estructura terciaria del esqueleto
principal del \alpha-carbono.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante Bet v
1 Glu45Ser se compararon con Bet v 1 recombinante en un
ensayo de inhibición de IgE en fase fluida utilizando una agrupación
de IgE de suero, derivado de pacientes alérgicos al abedul.
Bet v 1 no. 2801 recombinante se
biotiniló a una relación molar de 1:5 (Bet v 1 no. 2801:
biotina). El ensayo de inhibición se realizó como sigue: una
muestra de suero (25 ul), se incubó con anti IgE en fase sólida, se
lavó, se resuspendió y además se incubó con una mezcla de Bet v
1 no. 2801 biotinilado (3.4 nM) y un mutante dado
(0-28.6 nM). La cantidad de Bet v 1 no. 2801
biotinilado, unido a la fase sólida se estimó del RLU medido
después de la incubación con estreptavidina marcada con éster de
acridinio. El grado de inhibición se calculó como la relación entre
los RLU's obtenidos utilizando tampón y mutante como inhibidor.
La Figura 4 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado al IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotilinado
y por el mutante Bet v 1 Glu45Ser.
Hay una clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas, necesarias para alcanzar 50%
de inhibición de la unión al IgE de suero presente en la agrupación
de suero. Bet v 1 recombinante alcanza 50% de inhibición a
aproximadamente 6.5 ng, mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Bet v 1 Glu45Ser es de
aproximadamente 12 ng. Esto muestra que la mutación puntual
introducida en el mutante Bet v 1 Glu45Ser disminuye la
afinidad para el IgE de suero especifico por un factor de
aproximadamente 2. El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Bet v 1 Glu45Ser es claramente menor comparado con
el Bet v 1 recombinante. Esto puede indicar que después de la
sustitución de Glu45Ser, algunas de las IgE específicas presentes en
la agrupación de suero son incapaces de reconocer el mutante Bet v 1
Glu45Ser.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Aspartato y lisina en las posiciones 28 y 32,
respectivamente, muestran un alto grado de exposición al disolvente
(35% y 50%, respectivamente) y están ubicados en un parche de
superficie molecular común para los alérgenos Fagales
(parche II). En la estructura, el aspartato 28 y la lisina 32 están
ubicados cercanos entre sí en la superficie molecular y muy
probablemente interactúan vía las uniones de hidrógeno. Se encontró
que una treonina y un resto de glutamato que ocupan las posiciones
28 y 32, respectivamente, en algunas de las proteínas
Pr-10 homólogas a Bet v 1 argumentando que el
aspartato y la lisina pueden ser reemplazados con treonina y
glutamato, respectivamente, sin distorsión de la estructura
terciaria del esqueleto del \alpha-carbono.
Además, como ninguna de las secuencias de isoalergeno que surgen de
manera natural tienen treonina y glutamato en las posiciones 28 y
32, respectivamente, las sustituciones dan origen a una molécula de
Bet v 1 que surge de manera no natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante
Asn28Thr+Lys32Gln se compararon con Bet v 1 recombinante en
un ensayo de inhibición de IgE en fase fluida utilizando la
agrupación del IgE de suero derivado de pacientes alérgicos al
abedul, anteriormente descritos.
La Figura 5 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado al IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado
y por el mutante Asn28Thr+Lys32Gln de Bet v 1.
Hay una clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas, necesarias para alcanzar 50%
de inhibición de la unión a la IgE de suero presente en la
agrupación de suero. Bet v 1 recombinante alcanza 50% de
inhibición en aproximadamente 6.5 mg, mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Asn28Thr+Lys32Gln de Bet v 1
es de aproximadamente 12 ng. Esto muestra que las mutaciones
puntuales introducidas en el mutante Asn28Thr+Lys32Gln de Bet v
1 disminuye la afinidad para IgE de suero especifico por un
factor de aproximadamente 2.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Asn28Thr+Lys32Gln de Bet v 1 es claramente menor en
comparación con Bet v 1 recombinante. Esto puede indicar que
después de las sustituciones de Asn28Thr+Lys32Gln, algunas de las
IgE específicas presentes en la agrupación de suero son incapaces de
reconocer el mutante Asn28Thr+
Lys32Gln de Bet v 1.
Lys32Gln de Bet v 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La prolina en posición 108 muestra un alto grado
de exposición al disolvente (60%) y está ubicada en un parche de
superficie molecular común para los alérgenos de Fagales
(parche III). Se encontró que un resto de glicina ocupa la posición
108 en algunas de las proteínas PR-10 homólogas a
Bet v 1 argumentando que la prolina puede ser reemplazada con
glicina sin distorsión de la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono. Además, como ninguna de las
secuencias de isoalergeno que surgen de manera natural tienen
glicina en la posición 108, la substitución de prolina con glicina
da origen a una molécula Bet v 1 que surge de manera no
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante
Bet v 1 Pro108Gly se compararon con Bet v 1
recombinante en un ensayo de inhibición de IgE en fase fluida
utilizando la agrupación de IgE de suero derivado de pacientes
alérgicos al abedul descritos anteriormente.
La Figura 6 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a la IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado
y por el mutante Bet v 1 Pro108Gly.
Existe una clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas, necesarias para alcanzar 50%
de inhibición de la unión a la IgE de suero presente en la
agrupación de suero. Bet v 1 recombinante alcanza el 50% de
inhibición a aproximadamente 6.5 ng mientras que la concentración
correspondiente para Bet v 1 Pro108Gly es 15 ng. Esto
muestra que la mutación puntual individual introducida en Bet v 1
Pro108Gly diminuye la afinidad para la IgE de suero específica por
un factor de aproximadamente 2.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Bet v 1 Pro108Gly es un poco menor en comparación
con Bet v 1 recombinante. Esto puede indicar que después de
la sustitución de Pro108Gly, algunas de las IgE específicas
presentes en la agrupación de suero son incapaces de reconocer el
mutante Bet v 1 Pro108Gly.
\newpage
El ácido glutámico en posición 60 muestra un
alto grado de exposición al disolvente (60%) sin embargo, no está
ubicado en un parche de superficie molecular común para los
alérgenos de Fagales. Se encontró que un resto de serina
ocupa la posición 60 en algunas de las proteínas
Pr-10 homólogas a Bet v 1 argumentando que
el ácido glutámico puede ser reemplazado con serina sin distorsión
de la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono. Además, como ninguna de las
secuencias de isoalergeno que surgen de manera natural tienen
serina en la posición 60, la sustitución de ácido glutámico con
serina da origen a una molécula Bet v I que surge de manera
no natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante
Bet v 1 Glu60Ser se compararon con Bet v 1
recombinante en un ensayo de inhibición de IgE en fase fluida
utilizando la agrupación de IgE de suero derivada de pacientes
alérgicos al abedul, descritos anteriormente.
La Figura 7 muestra la inhibición de la unión
del Bet v 1 recombinante biotinilado a la IgE de suero de
una agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no
biotilinado y por el mutante Bet v 1 Glu60Ser. En contraste
a los mutantes Glu45Ser, Pro108Gly y Asn28Thr+Lys32Gln, la
sustitución de ácido glutámico 60 a serina, no muestra ningún
efecto significativo en las propiedades de unión a IgE. Esto indica
que las sustituciones fuera de los parches comunes de
Fagales definidos, solamente tienen un efecto marginal en la
unión a IgE de suero especifico que sustenta el concepto de que las
áreas de superficie molecular del alérgeno conservadas albergan los
epítopos dominantes de unión a IgE.
\vskip1.000000\baselineskip
En el mutante de Triple parche, las mutaciones
puntuales (Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln y Pro108Gly} introducidas en
los tres diferentes parches de Fagales comunes, descritos
anteriormente, se introdujeron simultáneamente al crear un mutante
artificial que lleva cuatro sustituciones de aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
La integridad estructural del mutante de Triple
parche purificado se analizó mediante la espectroscopia de
dicroísmo circular (CD). La Figura 8 muestra los espectros de CD del
recombinante y el mutante de Triple parche, registrados a
concentraciones casi iguales. La superposición en las amplitudes
pico y las posiciones en los espectros de CD de las dos proteínas
recombinantes muestran que las dos preparaciones contienen
cantidades iguales de estructuras secundarias sugiriendo
fuertemente que la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono no es afectada por las
sustituciones de aminoácido introducidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante de
Triple parche de Bet v 1 se compararon con Bet v 1
recombinante en un ensayo de inhibición de IgE en fase fluida
utilizando la agrupación de IgE de suero derivada de pacientes
alérgicos al abedul descritos anteriormente.
La Figura 9 muestra la inhibición de la unión de
Bet v 1 recombinante biotinilado a la IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1 no biotinilado
y por el mutante de Triple parche de Bet v 1. En contraste a
los mutantes individuales descritos anteriormente, la curva de
inhibición del mutante de Triple parche no es por más tiempo
paralela con relación al recombinante. Esto muestra que las
sustituciones introducidas en el mutante de Triple parche han
cambiado las propiedades de unión a IgE y el perfil del epítopo en
comparación con el recombinante. La falta de paralelismo hace
difícil cuantificar la disminución de la afinidad del mutante de
Triple parche para la IgE de suero específica.
Bet v 1 recombinante alcanza 50% de
inhibición a aproximadamente 6 ng, mientras que la concentración
correspondiente para el mutante de Triple parche de Bet v 1
es de 30 ng, es decir, una disminución en la afinidad por un factor
de 5. Sin embargo, con el fin de alcanzar 80% de inhibición, los
valores correspondientes son 20 ng y 400 ng, respectivamente, es
decir, una disminución por un factor de 20.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis se llevó a cabo como se describió en
la ref. 15. Se encontró que el mutante de Triple parche de Bet v
1 recombinante fue capaz de inducir proliferación en las líneas
de células T de tres diferentes pacientes alérgicos al polen de
abedul, con Índices de estimulación similares al recombinante y al
que surge de manera natural. Esto sugiere que el mutante de Triple
parche puede iniciar la respuesta inmune celular necesaria para la
producción de anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El ejemplo 2 describe la preparación de
alérgenos mutantes recombinantes con una mutación primaria. Los
alérgenos mutantes recombinantes de acuerdo con la invención, es
decir, alérgenos que comprenden al menos cuatro mutaciones
primarias, pueden ser preparados utilizando los mismos
procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
El antígeno 5 es una de las tres proteínas de
veneno de véspido, que son alérgenos conocidos en el hombre. Los
véspidos incluyen avispones, avispas con pintas amarillas y avispas.
Los otros dos alérgenos conocidos de veneno de véspido son
fosfolipasa a_{1} e hialuronidasa. El antígeno 5 de Vespula
vulgaris (Ves v 5) ha sido clonado y expresado como proteína
recombinante en el sistema de levadura (Monsalve y colaboradores
1999, ref. 22). La estructura de cristal tridimensional del Ves v 5
recombinante recientemente se ha determinado en la resolución de
1.8 \ring{A} (en preparación). Las características principales de
la estructura consisten de cuatro \beta-hebras y
cuatro \alpha-hélices dispuestas en tres capas
apiladas que dan origen a un "sándwich
\alpha\beta\alpha". La identidad de la secuencia entre los
alérgenos homólogos al Antígeno 5 de diferentes especies de
Vespula es aproximadamente 90% sugiriendo la presencia de
áreas de superficie moleculares conservadas y epítopos de células
B.
La presencia e identificación de parches comunes
se realizó después de la alineación de todas las secuencias de
aminoácidos conocidas, como se describe previamente para los
alérgenos de polen de árbol, de los alérgenos del antígeno 5 de
Vespula en combinación con un análisis de la superficie
molecular del Antígeno 5 revelado por la estructura tridimensional
de Ves v 5. La Figura 10 muestra la accesibilidad al disolvente de
los restos de antígeno 5 individualmente alineados y la alineación
de las secuencias del antígeno 5 de Vespula (panel
izquierdo). En el panel derecho de la figura 10 se muestra la
superficie molecular del antígeno 5 con áreas conservadas entre el
antígeno 5:s de Vespula coloreado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los restos de aminoácidos para la mutagénesis
dirigida al sitio fueron seleccionados entre los restos presentes
en los parches comunes para Vespula, puesto que la
modificación de estos se espera que afecte la unión de IgE de suero
de la mayoría de pacientes que muestran reactividad cruzada alérgica
clínica a Vespula.
La orientación relativa y el porcentaje de
exposición al disolvente de cada resto de aminoácido, dentro del
parche respectivo, se calculó en base a sus coordenadas atómicas.
Los restos que tienen un bajo grado de exposición al disolvente no
se consideraron adecuados para la mutagénesis debido a la posible
interrupción de la estructura o la falta de interacción al
anticuerpo. Los restos restantes se clasificaron de acuerdo con su
grado de exposición al disolvente.
\vskip1.000000\baselineskip
RNA total se aisló de glándulas de ácido de
veneno de véspidos Vespula vulgaris como se describe en (Fang
y colaboradores. 1988, ref. 23).
La síntesis de la primera hebra de ADNc, la
amplificación de PCR y la clonación del gen Ves v 5 se
realizaron como se describió en (Lu y colaboradores. 1993, ref.
24).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica Ves v 5 posteriormente se
subclonó en el vector pPICZ\alphaA (Invitrogen) para la expresión
secretada de Ves v 5 en Pichia pastoris. El gen se
amplificó por PCR y se subclonó en estructura con la secuencia de
codificación para la señal de secreción del factor \alpha de
Saccharomyces cerevisiae. En esta construcción el factor
\alpha es segmentado, in vivo, por el sistema de proteasa
Kex2 de Pichia pastoris durante la secreción de la
proteína.
En resumen, la PCR se realizó utilizando Ves
v 5 como patrón y cebadores correspondientes al extremo amino y
carboxi-terminal de la proteína, respectivamente.
Los cebadores se extendieron en el extremo 5' para acomodar los
sitios de restricción para clonación, EcoRI y XbaI, respectivamente.
Los nucleótidos que codifican el sitio de segmentación Kex2
estuvieron en esta construcción posicionados 18 nucleótidos
corriente arriba al extremo amino terminal de la proteína, que da
por resultado la expresión del Ves v 5 con seis aminoácidos
adicionales,
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe,
en el extremo amino terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores pPICZ\alphaA con el gen Ves v
5 insertado, fueron linealizados por la restricción Sac I e
insertados en el sitio AOX1 en el genoma de Pichia pastoris.
La inserción se realizó mediante la recombinación homologa en
células KM71 de Pichia pastoris siguiendo las recomendaciones
de Invitrogen.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis in vitro se realizó por
PCR utilizando pPICZ\alphaA recombinante con Ves v 5
insertado como patrón. Cada gen Ves v 5 mutante se generó
mediante 3 reacciones de PCR utilizando 4 cebadores.
Se sintetizaron dos cebadores de oligonucleótido
específicos de mutación acomodando cada mutación, una para cada
hebra de ADN, véanse las Figuras 11 y 12. Utilizando el(los)
nucleótido(s) mutado(s) como punto de partida ambos
cebadores se extendieron 6-7 nucleótidos en el
extremo 5' y 12-13 nucleótidos en el extremo 3'. Los
nucleótidos de extensión fueron idénticos en secuencia al gen
Ves v 5 en la región actual.
Dos cebadores generalmente aplicables (llamados
"todo sentido" y "todo no sentido" en la Figura 12) se
sintetizaron adicionalmente y se utilizaron para todos los
mutantes. Para asegurar la expresión de los mutantes de Ves v 5 con
extremo amino terminal auténtico, un cebador correspondiente al
extremo amino terminal de la proteína se extendió en el extremo 5'
con un sitio Xho I. En la inserción de los genes mutantes de Ves v 5
en el vector pPICZ\alphatA, el sitio de segmentación de proteasa
Kex2 se regeneró directamente corriente arriba al amino terminal de
Ves v 5. El segundo cebador fue correspondiente en secuencia
a una región del vector pPICZ\alphaA posicionado aproximadamente
300 bp corriente arriba del gen Ves v 5. La secuencia del cebador
correspondiente al extremo amino terminal de Ves v 5 deriva de la
hebra de sentido y la secuencia del cebador corriente abajo es
derivada de la hebra de no sentido, véase la Figura 11.
Se realizaron dos reacciones de PCR
independientes esencialmente de acuerdo con los procedimientos
clásicos (Saiki y colaboradores 1988) con la excepción de que
únicamente se realizaron 20 ciclos de temperatura con el fin de
reducir la frecuencia de los artefactos de PCR. Cada reacción de PCR
utilizó pPICZ\alphaA con Ves v 5 insertado como patrón y una
mutación específica y un cebador generalmente aplicable en
combinaciones significativas.
Los productos de PCR se purificaron al utilizar
"Concert, Rapid PCR Purification System" (Life Technologies).
Se realizó una tercera reacción de PCR utilizando los productos de
PCR combinados de las primeras dos reacciones de PCR como patrón y
ambos cebadores generalmente aplicables. Nuevamente, se utilizaron
20 ciclos de PCR clásica. El producto de PCR se purificó con
"Concert, Rapid PCR Purification System" (Life Technologies),
se cortó con enzimas de restricción (XhoI/XbaI), y se ligó
direccionalmente en el vector pPICZ\alphaA restringido con las
mismas enzimas. La Figura 13 muestra una revisión de todas las
mutaciones de Ves v 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores pPICZ\alphaA con los genes
mutantes de Ves v 5 insertados, se linealizaron mediante la
restricción Sac I y se insertaron en el sitio AOX1 en el genoma de
Pichia pastoris. Las inserciones se realizaron mediante la
recombinación homologa en células KM71 de Pichia pastoris
siguiendo las recomendaciones de Invitrogen.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica Ves v 5 se realizó antes y después de la
subclonación y después de la mutagénesis in vitro,
respectivamente.
Los ADN de Plásmido de 10 ml de cultivo
bacteriano cultivado a saturación durante la noche en medio LB
complementado con 0.1 g/1 de ampicilina, se purificaron en columnas
de Qiagen-tip 20 y se secuenciaron utilizando el kit
de secuenciación de ADN Sequenase versión 2.0 (USB) siguiendo las
recomendaciones de los proveedores.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de levadura recombinante de la cepa
KM71 de Pichia pastoris se cultivaron en botellas de 500 ml
que contienen 100 ml de tampón fosfato de pH 6.0, que contiene base
de nitrógeno de levadura, biotina, glicerol e histidina a 30ºC con
agitación orbital a 225 rpm hasta A_{600} nm de
4-6. Las células se recolectaron por centrifugación
y se resuspendieron en 10 ml de medio tampón similar que contiene
metanol en lugar de glicerol. La incubación se continuó a 30ºC
durante 7 días con la adición diaria de 0.05 ml de metanol.
Las células se cosecharon por centrifugación y
el fluido de cultivo recolectado se concentró por ultrafiltración.
Después de la diálisis frente a un tampón de acetato de amonio 50
mM, pH 4.6, la muestra se aplicó a una columna de intercambio
catiónico SE-53 FPLC (Farmacia) equilibrada en la
misma solución tampón. La columna se eluyó con un gradiente lineal
de NaCl 0-1.0 M, acetato de amonio 50 mM. El pico de
Ves v 5 recombinante que eluye a NaCl de aproximadamente 0.4
M, se recolectó y se dializó frente a ácido acético 0.02 N. Después
de la concentración a aproximadamente 10 mg/ml, el Ves v 5
purificado se almacenó a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cristales de Ves v 5 se desarrollaron
mediante la técnica de difusión de vapor a 25ºC. Para la
cristalización, 5 \mul de 5 mg/ml de Ves v 5 se mezclaron
con 5 \mul de PEG 6000 al 18%, citrato de sodio 0.1 M, pH 6.0 y se
equilibró frente a 1 ml de PEG 6000 al 18%, citrato de sodio 0.1 M,
pH 6.0.
Los datos de difracción de rayos X se
recolectaron a 100 K de cristales de Ves v 5 nativos y después de la
incorporación de los derivados de átomo pesado, y se utilizaron para
resolver la estructura tridimensional del Ves v 5, véase la Figura
10 (original en preparación).
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos mutantes Ves v 5 se produjeron como
proteínas Ves v 5 recombinantes y se probó su reactividad hacia los
anticuerpos policlonales de conejo resaltados contra Ves v 5
recombinante. Cuando se analizaron mediante la inmunoelectroforesis
de cohete bajo condiciones nativas, los anticuerpos de conejo fueron
capaces de precipitar el Ves v 5 recombinante así como a ambos
mutantes, indicando que los mutantes han conservado la estructura
terciaria del esqueleto del \alpha-carbono.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE de los mutantes
Ves v 5 se compararon con Ves v 5 recombinante de un
ensayo de inhibición de IgE en fase fluida utilizando una agrupación
de IgE de suero derivada de pacientes alérgicos al veneno de
véspido.
El ensayo de inhibición se realizó como se
describió anteriormente, utilizando Ves v 5 recombinante
biotinilado en lugar de Bet v 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La lisina en posición 72 muestra un alto grado
de exposición al disolvente (70%) y está ubicada en un parche de
superficie molecular común para el antígeno 5 de Véspula. La
orientación relativa y el alto grado de exposición al disolvente
argumentan que la lisina 72 se puede reemplazar por un resto de
alanina sin distorsión de la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono. Además, como ninguna de las
secuencias de isoalergeno que surgen de manera natural tienen
alanina en la posición 72, la sustitución de lisina con alanina da
origen a una molécula Ves v 5 que surge de manera no
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante Ves v
5 Lys72Ala se compararon con Ves v 5 recombinante en un ensayo de
inhibición de IgE en fase fluida utilizando la agrupación de IgE de
suero derivada de pacientes alérgicos al abedul, descritos
anteriormente.
La Figura 14 muestra la inhibición de la unión
del Ves v 5 recombinante biotinilado a la IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por el Ves v 5 no biotinilado y
por el mutante Ves v 5 Lys72Ala.
Haya clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas, necesarias para alcanzar 50%
de inhibición de la unión a la IgE de suero presente en la
agrupación de suero. El Ves v 5 recombinante alcanza 50% de
inhibición a aproximadamente 6 ng, mientras que la concentración
correspondiente para el mutante Ves v 5 Lys72Ala es 40 ng. Esto
muestra que la mutación puntual individual introducida en el mutante
Ves v 5 Lys72Ala disminuye la afinidad para la IgE de suero
especifico en factor de aproximadamente 6. El nivel de inhibición
máximo alcanzado por el mutante Ves v 5 Lys72Ala es
significativamente menor en comparación con Ves v 5 recombinante.
Esto puede indicar que tras la sustitución de Lys72Ala, alguna IgE
específica presente en la agrupación de suero es incapaz de
reconocer al mutante Ves v 5 Lys72Ala.
\vskip1.000000\baselineskip
La tirosina en la posición 96 muestra, un alto
grado de exposición al disolvente (65%) y está ubicada en un parche
de superficie molecular común para el antígeno 5 de Vespula. La
orientación relativa y el alto grado de exposición al disolvente
argumentan que la tirosina 96 puede ser reemplazada por un resto de
alanina sin distorsión de la estructura tridimensional. Además,
como ninguna de las secuencias de isoalergeno que surgen de manera
natural tienen alanina en la posición 96, la sustitución de tirosina
con alanina da origen a una molécula Ves v 5 que surge de manera no
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.970000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del mutante Ves v
5 Tyr96Ala se compararon con Ves v 5 recombinante en un ensayo de
inhibición de IgE en fase fluida utilizando la agrupación de IgE de
suero derivada de pacientes alérgicos al abedul, descritos
anteriormente.
La Figura 14 muestra la inhibición de la unión
de Ves v 5 recombinante biotinilado al IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Ves v 5 no biotinilado y por
el mutante Ves v 5 Tyr96Ala.
Hay una clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectiva necesaria para alcanzar 50% de
inhibición de la unión a la IgE de suero presente en la agrupación
de suero. El Ves v 5 recombinante alcanza 50% de inhibición a
aproximadamente 6 ng, mientras que la concentración correspondiente
para el mutante Ves v 5 Tyr96Ala es 40 ng.
Esto muestra que la mutación puntual individual
introducida en el mutante Ves v 5 Tyr96Ala disminuye la
afinidad para el IgE de suero especifico por un factor de
aproximadamente 6.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por el
mutante Ves v 5 Tyr96Ala es significativamente menor en
comparación con Ves v 5 recombinante. Esto puede indicar que
después de la sustitución de Tyr96Ala, alguna IgE específica
presente en la agrupación de suero es incapaz de reconocer el
mutante Ves v 5 Tyr96Ala.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros de accesibilidad al disolvente y
el grado de conservación se utilizaron para identificar y
seleccionar aminoácidos expuestos a la superficie, adecuados para la
sustitución por los alérgenos Bet v 1, Der p 2 y Ves v
5.
\vskip1.000000\baselineskip
La accesibilidad al disolvente se calculó
utilizando el software InsightII, versión 97.0 (MSI) y un radio de
sonda de 1.4\ring{A} (Connolly surface).
Las cavidades internas se excluyeron del
análisis al rellenar con sondas utilizando el software PASS
(Putative Active Sites with Spheres). Las sondas en la superficie se
separaron posteriormente de manera manual.
\vskip1.000000\baselineskip
Bet v 1:
La estructura 3-D está basada en
el número de acceso Z80104 (Ibvl.pdb).
Otras 38 secuencias de Bet v 1 incluidas en el
análisis de restos conservados comprenden los números de acceso:
P15494=X15877=Z80106, Z80101, AJ002107, Z72429,
AJ002108, Z80105, Z80100, Z80103, AJ001555, Z80102, AJ002110,
Z72436, P43183=X77271, Z72430, AJ002106, P43178=X77267,
P43179=X77268, P43177=X77266,
Z72438, P43180=X77269, AJ001551, P43185=77273, AJ001557, Z72434, AJ001556, Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431, P45431=X77200, P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435, Z72439, Z72437, S47249.
Z72438, P43180=X77269, AJ001551, P43185=77273, AJ001557, Z72434, AJ001556, Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431, P45431=X77200, P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435, Z72439, Z72437, S47249.
\vskip1.000000\baselineskip
Der p 2:
La estructura 3-D está basada en
el número de acceso P49278 (la9v.pdb).
Otras 6 secuencias de Der p 2 incluidas en el
análisis de restos conservados comprenden las siguientes
sustituciones:
ALK-G: V40L, T47S, M111L, D114N.
ALK-101: M76V.
ALK-102: V40L, T47S.
ALK-104: T47S, M111I, D114N.
ALK-113: T47S.
ALK-120: V40L, T47S, D114N.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ves v 5:
La estructura 3-D está basada en
el número de acceso Q05110 (pdb coordenadas no publicadas)
Otra secuencia de Ves v 5 en el análisis de
restos conservados contiene una sustitución de aminoácido:
M202K.
\vskip1.000000\baselineskip
Bet v 1
59 aminoácidos altamente expuestos al
disolvente:
K-129, E-60,
N-47, K-65, P-108,
N-159, D-93, K-123,
K-32, D-125, R-145,
D-109, T-77, E-127,
Q-36, E-131, L-152,
E-6, E-96, D-156,
P-63, H-76, E-8,
K-134, E-45, T-10,
V-12, K-20, L-62,
S-155, H-126, P-50,
N-78, K-119, V-2,
L-24, E-42, N-4,
A-153, I-44, E-138,
G-61, A-130, R-70,
N-28, P-35, S-149,
K-103, Y-150, H-154,
N-43, A-106, K-115,
P-14, Y-5, K-137,
E-141, E-87,
E-73.
\vskip1.000000\baselineskip
57 aminoácidos altamente expuestos al disolvente
y conservados (>70%):
K-129, E-60,
N-47, K-65, P-108,
N-169, D-93, K-123,
K-32, D-125, R-145,
D-109, E-127, Q-36,
E-131, L-152, E-6,
E-96, D-156, P-63,
H-76, E-8, K-134,
E-45, T-10, V-12,
K-20, S-155, H-126,
P-50, N-78, K-119,
V-2, L-24, E-42,
N-4, A-153, I-44,
E-138, G-61, A-130,
R-70, N-28, P-35,
S-149, K-103, Y-150,
H-154, N-43, A-106,
K-115, P-14, Y-5,
K-137, E-141, E-87,
E-73.
\vskip1.000000\baselineskip
23 mutaciones realizadas:
Y5V, T10P, D25E, N28T, K32Q, E42S, E45S, N47S,
K55N, K65N, T77A, N78K, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I,
D125Y, K134E, R145E, D156H, +160N.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1 muestra un listado en orden
descendente de la exposición al disolvente de los aminoácidos de Bet
v 1. La columna 1 enumera el número de aminoácido empezando desde el
extremo amino-terminal, la columna 2 enumera el
aminoácido en abreviación de una letra, la columna 3 enumera el
Índice de exposición al disolvente normalizado, la columna 4 enumera
el porcentaje de secuencias conocidas que tienen el aminoácido de
interés en esta posición.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Der p 2
55 aminoácidos altamente expuestos al
disolvente:
R-128, D-129,
H-11, H-30, S-1,
K-77, Y-75, R-31,
K-82, K-6, K-96,
K-48, K-55, K-89,
Q-85, W-92, I-97,
H-22, V-65, S-24,
H-74, K-126, L-61,
P-26, N-93,
D-64,I-28, K-14,
K-100,E-62, I-127,
E-102, E-25, P-66,
D-114, L-17, G-60,
P-95, E-53, V-81,
K-51, N-103, Q-2,
N-46, 4-42,
T-91,D-87, N-10,
M-111,C-8, H-124,
I-68, P-79, K-109,
K-15.
\vskip1.000000\baselineskip
54 aminoácidos altamente expuestos al disolvente
y conservados (>70%)
R-128, D-129,
H-11, H-30,, S-1,
K-77, Y-75, R-31,
K-82, K-6, K-96,
K-48, K-55, K-89,
Q-85, W-92, I-97,
H-22, V-65, S-24,
H-74, K-126, L-61,
P-26, N-93, D-64,
I-28, K-14, K-100,
E-62, I-127, E-102,
E-25, P-66, L-17,
G-60, P-95, E-53,
V-81, K-51, N-103,
Q-2, N-46, E-42,
T-91, D-87, N-10,
M-111, C-8, H-124,
I-68, P-79, K-109,
K-15.
\vskip1.000000\baselineskip
6 mutaciones realizadas:
K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La Tabla 2 muestra un listado en orden
descendente de la exposición al disolvente de los aminoácidos de Der
p 2. La Columna 1 enumera el número de aminoácido empezando desde el
extremo amino-terminal, la columna 2 enumera el
aminoácido en abreviación de una letra, la columna 3 enumera el
Índice de exposición al disolvente normalizado, la columna 4 enumera
el porcentaje de secuencias conocidas que tienen el aminoácido de
interés en esta posición.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ves v 5
89 aminoácidos altamente expuestos al
disolvente:
K-16, K-185,
K-11, K-44, K-210,
R-63, K-13, F-6,
K-149, K-128, E-184,
K-112, K-202, F-157,
E-3, K-29, N-203,
N-34, K-78, K-151,
L-15, L-158, Y-102,
W-186, K-134, D-87,
K-52, T-67, T-125,
K-150, Y-40, Q-48,
L-65, K-81, Q-101,
Q-208, K-144, N-8,
N-70, H-104, Q-45,
K-137, K-159, E-205,
N-82, A-111, D-131,
K-24, V-36, N-7,
M-138, Y-209, V-84,
K-172, V-19, D-56,
P-73, G-33, T-106,
N-170, L-28, T-43,
Q-114, C-10, K-60,
N-31, K-47, E-5,
D-145, V-38, A-127,
D-156, E-204, P-71,
G-26, Y-129, D-141,
F-201, R-68, N-200,
D-49, S-153, K-35,
S-39, Y-25, V-37,
G-18, W-85,
I-182.
\vskip1.000000\baselineskip
88 aminoácidos altamente expuestos al disolvente
y conservados (>70%):
K-16, K-185,
K-11, K-44, K-210,
R-63, K-13, F-6,
K-149, K-128, E-184,
K-112, F-157, E-3,
K-29, N-203, N-34,
K-78, K-151, L-15,
L-158, Y-102, W-186,
K-134, D-87, K-52,
T-67, T-125, K-150,
Y-40, Q-48, L-65,
K-81, Q-101, Q-208,
K-144, N-8, N-70,
H-104, Q-45, K-137,
K-159, E-205, N-82,
A-111, D-131, K-24,
V-36, N-7, M-138,
T-209, V-84, K-172,
V-19, D-56, P-73,
G-33, T-106, N-170,
L-28, T-43, Q-114,
C-10, K-60, N-31,
K-47, E-5, D-145,
V-38, A-127, D-156,
E-204, P-71, G-26,
Y-129, D-141, F-201,
R-68, N-200, D-49,
S-153, K-35, S-39,
Y-25, V-37, G-18,
W-85, I-182.
\vskip1.000000\baselineskip
9 mutaciones realizadas:
K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A,
K202M, N203G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La Tabla 3 muestra un listado en orden
descendente de la exposición al disolvente de los aminoácidos de Ves
v 5. La columna 1 enumera el número de aminoácido que empieza desde
el extremo amino- terminal, la columna 2 enumera el aminoácido en
abreviación de una letra, la columna 3 enumera el Índice de
exposición al disolvente normalizado, la columna 4 enumera el por
ciento de secuencias conocidas que tienen el aminoácido de interés
en esta posición.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la preparación y
caracterización de alérgenos de Bet v 1 mutante recombinante de
acuerdo con la invención, es decir, alérgenos con actividad de unión
a IgE disminuida que comprende al menos cuatro mutaciones
primarias.
\vskip1.000000\baselineskip
La accesibilidad al disolvente de los restos de
aminoácido de Bet v 1 se muestra en el Ejemplo 3, tabla 1. La tasa
de conservación de aminoácido está basada en la alineación de
secuencia realizada en el ExPaSy Molecular Biology Server
(http://www.expasy.ch/) utilizando el algoritmo ClustalW en una
búsqueda BLAST, donde la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre
Bet v 1.2801 es utilizada como la secuencia de entrada. La
alineación incluye 67 secuencias de alérgenos (39 secuencias Bet
v 1, 11 secuencias Car b 1, 6 secuencias Cor a 1, y 13
secuencias Aln g 1) de las especies dentro del orden Fagales
(Bet v I:Betula verrucosa; Car b 1: Carpinus betulus;
Cor a 1: Corylus avellana; Aln g 1: alnus glutinosa).
Con respecto a los alérgenos de Bet v 1 recombinantes mutados,
mostrados en los ejemplos, los restos diana para la sustitución se
basaron en \geq95% de identidad del aminoácido.
Como se describe en el Ejemplo 1, los restos de
aminoácido con un alto grado de exposición al disolvente y un alto
grado de conservación entre los alérgenos de polen de especies
relacionadas, se seleccionaron para la mutagénesis dirigida al
sitio. Los restos que tienen un bajo grado de exposición al
disolvente (<20%) no se consideraron relevantes para la
mutagénesis debido a la posible interrupción de la estructura
terciaria o la falta de interacción del
anticuerpo.
anticuerpo.
Todos los restos introducidos estuvieron
presentes en posiciones correspondientes en isoformas de un grupo
de proteínas de plantas llamadas proteínas relacionadas con
patogénesis (PR-10). La modelación molecular sugiere
que las estructuras terciarias de alérgenos de Fagales y
proteínas PR-10 están cercanas a ser idénticas. Bet
v 1 comparte la identidad de secuencias significativa
(20-40%) con las proteínas PR-10.
Sin embargo no hay descripciones de reactividad cruzada alérgica
hacia estas proteínas PR-10. Así, el intercambio de
un aminoácido altamente conservado y expuesto al disolvente de Bet
v 1 con un aminoácido en la posición correspondiente en una
proteína PR-10, da como resultado una proteína de
Bet v 1 mutada con una estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono no alterada pero con afinidad de
unión a IgE disminuida.
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis in vitro se realizó por
PCR utilizando pMAL-c recombinante con Bet v 1
insertado como patrón. La preparación de alérgenos mutantes
recombinantes que comprenden de cinco a nueve mutaciones primarias
incluyeron dos etapas de PCR; etapa I y II. Primero, cada mutación
individual (o varias mutaciones si están ubicadas cercanas junto a
la secuencia de ADN) se introdujo en la secuencias de ADN
secuenciales de Bet v 1.2801 o derivados de Bet v
1.2801 utilizando cebadores de oligonucleótido específicos de
mutación de sentido y antisentido, que acomodan cada
mutación(s) junto con los cebadores de oligonucleótido de
sentido y antisentido que acomodan las mutaciones vecinas ya sea
corriente arriba o corriente abajo o el extremo
N-terminal/C-terminal de Bet v 1
respectivamente como se ilustra esquemáticamente en la Figura 17
(I). En segundo lugar, los productos de PCR de la reacción I de PCR
se purificaron, se mezclaron y se utilizaron como patrones para una
reacción de PCR adicional (II) con cebadores de oligonucléotido que
acomodan los extremos N-terminal y
C-terminal de Bet v 1 como se ilustra
esquemáticamente en la Figura 17 (II). Los productos de PCR se
purificaron mediante la electroforesis en gel de agarosa y la
purificación en gel de PCR (Life Techhnologies) seguido por la
precipitación con etanol, se cortaron con enzimas de restricción
(SacI/EcoRI) o (Sac/XbaI), y se ligaron
direccionalmente en pMAL-c restringido con las
mismas enzimas.
La Figura 18 muestra cebadores de
oligonucleótidos sintetizados y, esquemáticamente, las ilustraciones
para la construcción de mutantes de Bet v 1 con cinco a nueve
mutaciones primarias. Los aminoácidos mutados, preferiblemente se
seleccionaron del grupo que consiste en aminoácidos caracterizados
por ser altamente expuestos al disolvente y conservados como se
describe en el Ejemplo 3. Los mutantes de Bet v 1 son las siguientes
mutaciones primarias y secundarias expuestas entre paréntesis:
\vskip1.000000\baselineskip
- Mutante Bet v 1 (2628):
- Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lysl34Glu.
- Mutante Bet v 1 (2637):
- Ala16Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro).
- Mutante Bet v 1 (2733):
- (Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln) Glu45Ser, Lys55Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn)
- Mutante Bet v 1 (2744):
- (Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123Ile, (Asp156His, +160Asn).
- Mutante Bet v 1 (2753):
- (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, (Glu127Ser), Arg145Glu.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica Bet v 1 se realizó antes y después de la
subclonación, y después de la mutagénesis in vitro,
respectivamente.
Los ADN's de plásmido de 10 ml de cultivo
bacteriano cultivado a saturación durante la noche en medio LB
complementado con 0.1 g/l de ampicilina, se purificaron en columnas
Qiagen-tip 20 y se secuenciaron utilizando el kit de
secuenciación de ciclo terminador de tinte de reacción Ready y un
Secuenciador de Fluorescencia AB PRISM 377, ambos de (Perkin Elmer),
siguiendo las recomendaciones de los proveedores.
\vskip1.000000\baselineskip
Bet v 1 recombinante (Bet v 1.2801 y mutantes)
se sobreexpresaron en DH 5\alpha de Escherichia coli
fusionada a la proteína de unión a maltosa y se purificaron como se
describe en la ref. 15. En resumen, las células de E. coli
recombinantes se cultivaron a 37ºC a una densidad óptica de 0.8 a
600 nm, después de lo cual la expresión de la proteína de fusión
Bet v 1 se indujo mediante la adición de IPTG. Las células se
cosecharon por centrifugación 3 horas después de la inducción, se
resuspendieron en tampón de lisis y se rompieron por sonicación.
Después de la sonicación y centrifugación adicional, la proteína de
fusión recombinante se aisló mediante la cromatografía de afinidad
de amilosa y posteriormente se segmentó por incubación con el
factor Xa (ref. 15). Después de la segmentación de F Xa, el Bet v 1
recombinante se aisló por filtración en gel y se sometió a otro
ciclo de cromatografía de afinidad de amilosa con el fin de separar
las pequeñas cantidades de proteína de unión a maltosa.
El Bet v 1 recombinante purificado se concentró
por ultrafiltración a aproximadamente 5 mg/ml y se almacenó a 4ºC.
Los rendimientos finales de las preparaciones de Bet v 1
recombinante purificado fueron entre 2-5 mg por
litro de cultivo de células de E. coli.
Las preparaciones de Bet v 1 recombinante
purificado aparecieron como bandas individuales después de la
electroforesis en SDS-polietilamida manchada con
plata con un peso molecular aparente de 17.5 kDa.
Los solicitantes previamente han mostrado (ref.
15) que el Bet v 1 No. 2801 recombinante es inmunoquímicamente
indistinguible del Bet v 1 que surge de manera natural.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 19 muestra mutaciones puntuales
introducidas en la superficie molecular del Bet v 1 (2628) y Bet v
1 (2637). En el mutante Bet v 1 (2628) se introdujeron cinco
mutaciones primarias en una mitad del Bet v 1 dejando la otra mitad
no alterada. En el mutante Bet v 1 (2637) se introdujeron cinco
mutaciones primarias y tres mutaciones secundarias en la otra mitad
dejando la primera mitad no alterada. De esta manera, las mutaciones
en el mutante Bet v 1 (2628) y el mutante Bet v 1 (2637) afectan a
diferentes mitades de la superficie de Bet v 1, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Cristales de Bet v 1 (2628) recombinante se
desarrollaron mediante la difusión de vapor a 25ºC, esencialmente
como se describe en (Spangfort y colaboradores 1996b, ref. 21). Bet
v 1 (2628), a una concentración de 5 mg/ml, se mezcló con un
volumen igual de sulfato de amonio 2.2 M, citrato de sodio 0.1 M,
dioxano al 1% (v/v), pH 6.3 y se equilibró frente a un volumen de
sulfato de amonio 100X 2.2 M, citrato de sodio 0.1 M, dioxano al 1%
(v/v), pH 6.3. Después de 24 horas de equilibrio, el crecimiento del
cristal se indujo al aplicar la técnica de sembrado descrita en la
ref. 21, utilizando los cristales de Bet v 1 de tipo silvestre
recombinante como una fuente de semillas.
Después de aproximadamente 4 meses, los
cristales se cosecharon y se analizaron utilizando rayos X generados
de un ánodo de rotación Rigaku, descrito en la ref. 21 y la
estructura se resolvió utilizando el reemplazo molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto estructural de las mutaciones se
dirigió creciendo los cristales de proteína Bet v 1 (2628)
tridimensionales que difractan a una resolución de 2.0 \ring{A},
cuando se analizan por rayos X generados de un ánodo de rotación.
Las sustituciones Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu
se verificaron por el mapa de densidad de electrones de la
estructura Bet v 1 (2628), que también mostró que está preservada la
estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono en conjunto.
\vskip1.000000\baselineskip
La integridad estructural del mutante Bet v 1
(2637) purificado se analizó mediante la espectroscopia de dicroísmo
circular (CD). La Figura 20 muestra los espectros de CD de Bet v
1.2801 (tipo silvestre) recombinante y el mutante Bet v 1 (2637)
registrado a concentraciones casi iguales. La superposición en las
amplitudes y posiciones pico en los espectros de CD de las dos
proteínas recombinantes muestra que las dos preparaciones contienen
cantidades iguales de estructuras secundarias que sugieren
intensamente que la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono no está afectada por las
sustituciones de aminoácidos introducidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión a IgE del Bet v 1
(2628) y Bet v 1 (2637) así como una mezcla 1:1 de Bet v 1 (2628)
Bet v 1 (2637) se compararon con Bet v 1.2801 de tipo silvestre
recombinante en un ensayo de inhibición de IgE en fase fluida
utilizando una agrupación de IgE de suero derivada de pacientes
alérgicos al abedul.
Como se describe en el Ejemplo 1, el Bet v
1.2801 recombinante fue biotilinado a una relación molar de 1:5
(Bet v 1 no. 2801: biotina). El ensayo de inhibición se realizó como
sigue: una muestra de suero (25 \mul) se incubó con anti IgE en
fase sólida, se lavó, se resuspendió y además se incubó con una
mezcla de Bet v 1.2801 biotinilado y un mutante dado o mezcla 1:1
de los dos mutantes. La cantidad de Bet v 1.2801 biotinilado unido
a la fase sólida se estimó a partir del RLU medido después de la
incubación con estreptavidina marcada con éster de acridinio. El
grado de inhibición se calculó como la relación entre los RLU's
obtenidos utilizando tampón y el mutante como inhibidor.
La Figura 21 muestra la inhibición de la unión
de Bet v 1.2801 recombinante biotinilado al IgE de suero de una
agrupación de pacientes alérgicos por Bet v 1.2801 no biotinilado y
por Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637) y una mezcla 1:1 de Bet v 1
(2628) y Bet v 1 (2637).
Hay una clara diferencia en la cantidad de
proteínas recombinantes respectivas necesarias para alcanzar 50% de
inhibición de la unión a la IgE de suero presente en la agrupación
de suero. El Bet v 1.2801 recombinante alcanza 50% de inhibición en
aproximadamente 5 ng, mientras que la concentración correspondiente
para el mutante Bet v 1 (2628) es de aproximadamente
15-20 ng. Esto muestra que la mutación puntual
introducida en el mutante Bet vi (2628) disminuye la afinidad para
la IgE de suero específica en un factor de aproximadamente
3-4.
El nivel máximo de inhibición alcanzado por la
proteína mutante Bet v 1 (2628) es claramente menor en comparación
con Bet v 1.2801 recombinante. Esto puede indicar que algunas de las
IgE específicas presentes en la agrupación de suero son incapaces
de reconocer la proteína mutante Bet v 1 (2628) debido a las
mutaciones puntuales introducidas.
Bet v 1 (2637) alcanza 50% de inhibición a
aproximadamente 400-500 ng mostrando que la mutación
puntual introducida en el mutante Bet v 1 (2637) disminuye la
afinidad para la IgE de suero específica por 80 a 100 veces en
comparación con Bet v 1.2801. La gran diferencia en la unión de IgE
está además sustentada por una clara diferencia en la inclinación
de la curva de inhibición obtenida con la proteína mutante Bet v 1
(2637) en comparación con la curva de inhibición para Bet v 1.2801.
La diferente inclinación proporciona evidencia de que la reducción
en la unión de IgE es debida a un patrón de epítopo claramente
diferente del mutante comparado con Bet v 1.2801.
Además de los ensayos de inhibición con
alérgenos modificados individuales, una mezcla 1:1 de Bet v 1 (2628)
y Bet v 1 (2637) que tiene las mismas concentraciones molares de
Bet v 1 como cada una de las muestras con Bet v 1 (2628) o Bet v 1
(2637), respectivamente, se probó y mostró total capacidad (100%)
para inhibir la unión a IgE a rBet v 1.2801. La capacidad para
inhibir totalmente la unión a IgE es una indicación clara de que
todos los epítopos reactivos presentes en Bet v 1.2801 estuvieron
presentes en la mezcla de alérgenos 1:1. Además, la sustentación
llega de la inclinación comparable de las dos curvas de inhibición
para Bet v 1.2801 y la mezcla de alérgenos. La reducida reactividad
al IgE de la muestra de alérgenos mezclada es demostrada por la
necesidad de una concentración cuatro veces más alta de la mezcla de
alérgenos, cuando se compara con Bet v 1.2801 para obtener 50% de
inhibición de la unión a IgE.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis se llevó a cabo como se describe en
la ref. 15. Las proteínas mutantes Bet v 1 (2628) y Bet v 1 (2637)
fueron ambas capaces de inducir la proliferación de las líneas de
células T de pacientes alérgicos al polen de abedul con índices de
estimulación similares al recombinante y al que surge de manera
natural. Esto sugiere que ambas proteínas mutantes Bet v 1 (2628) y
Bet v 1 (2637) cada una puede iniciar la respuesta inmune celular
necesaria para la producción de anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
La liberación de histamina de leucocitos de
basófilos se realizó como sigue. Sangre heparinizada (20 ml) se
retiró de cada paciente del polen de abedul, se almacenó a
temperatura ambiente y se utilizó dentro de 24 horas. Veinticinco
microlitros de sangre total heparinizada se aplicó a los pocillos de
microtítulo recubiertos con fibra de vidrio (Reference Laboratory,
Copenhagen, Denmark) y se incubaron con 25 microlitros de alérgeno
o anti-IgE durante 1 hora a 37ºC. Después las placas
se enjuagaron y se separaron las sustancias de interferencia.
Finalmente, la histamina unida a las microfibras se midió de forma
espectrofotofluorométrica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de liberación de histamina se muestran
en la Figura 22 y la Figura 23. Se ha probado la potencia de las
proteínas mutantes Bet v 1 (2628) y Bet v 1 (2637) para inducir
liberación de histamina en los basófilos humanos de dos pacientes
alérgicos al polen de abedul. En ambos casos la curva de liberación
de los alérgenos mutados para inducir la liberación de histamina
está claramente desplazada a la derecha en comparación con la curva
de liberación de Bet v 1.2801. El desplazamiento indica que la
potencia de Bet v 1 (2628) y Bet v 1 (2637) está reducida de 3 a 10
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Bet v 1 (2744) y Bet v 1 (2753) se construyeron
del mismo modo para el uso como una vacuna de alérgeno mezclada. En
estos alérgenos mutados las mutaciones puntuales se distribuyeron de
una forma arreglada de toda superficie como se muestra en la Figura
24 y la Figura 25 y nuevamente se designaron para afectar a
diferentes áreas de superficie en las dos moléculas,
respectivamente, como se muestra en la Figura 26. Sin embargo, estos
alérgenos modificados también podrían ser utilizados
individualmente como vacunas de alérgeno individual.
\vskip1.000000\baselineskip
La integridad estructural del mutante Bet v 1
(2744) purificado se analizó mediante la espectroscopia de dicroísmo
circular (CD). La Figura 27 muestra los espectros de CD del Bet v
1.2801 recombinante (tipo silvestre) y el mutante Bet v 1 (2744),
registrados a concentraciones casi iguales. La superposición en las
amplitudes y posiciones pico en los espectros de CD de las dos
proteínas recombinantes muestra que las dos preparaciones contienen
cantidades iguales de estructuras secundarias que sugieren
intensamente que la estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono no está afectada por las
sustituciones de aminoácidos introducidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de liberación de histamina de cinco
experimentos con leucocitos de basófilos de cinco pacientes
alérgicos al polen de abedul diferentes se muestra en la Figura 28 y
las Figuras 29A-D. Se ha probado la potencia de la
proteína mutante Bet v 1 (2744) para inducir liberación de histamina
en el basófilo humano. Las curvas de liberación de los alérgenos
mutados están claramente desplazadas a la derecha en comparación con
la curva de liberación de Bet v 1.2801, indicando que la potencia
del Bet v 1 (2744) para liberar histamina está reducida 3 a 5
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha construido un mutante Bet v 1 (2733) con
nueve mutaciones primarias y se ha expresado de forma recombinante.
La distribución de las mutaciones por puntos en Bet v
1(2733) deja varias áreas de superficie que constituyen
>400 \ring{A}^{2} no alterada. La Figura 30 muestra
mutaciones puntuales introducidas en la superficie molecular del Bet
v 1 (2733).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la clonación del gen que
codifica Der p 2 de Dermatophagoides pteronyssinus y la
construcción de mutantes con afinidad de unión a IgE reducida.
Los productos amplificados de PCR de la síntesis
de ADNc de primera hebra del RNA total de Dermatophagoides
pteronyssinus se obtuvo de Dr. Wendy-Anne Smith
y Dr. Wayne Thomas (TVW Telethon Institute for Child Health
Research, 100 Roerts Rd, Subiaco, Western Australia 6008). Durante
la amplificación de la biblioteca de ADNc de la primera hebra, Der
p 2 ha sido selectivamente amplificado utilizando cebadores
específicos de Der p 2. Los fragmentos de PCR se clonaron
posteriormente en el sitio BamHI de pUC19 (New England BioLabs). La
secuenciación de ADN de Der p 2 se realizó utilizando el cebador de
sentido especifico de vector
(5'-GGCGATTAAGTTGGGTAACGC
CAGGG-3') y el cebador antisentido (5'-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3').
CAGGG-3') y el cebador antisentido (5'-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3').
Se identificó un total de siete isoformas de Der
p 2 únicas llamadas Alk-101,
ALK-102, Alk-103,
Alk-104, ALK-113,
ALK-114 y ALK-120. EL clon llamado
ALK-114 fue seleccionado como punto de partida para
la generación de mutantes de IgE de baja afinidad, debido a su alta
identidad de secuencia con la estructura de NMR de Der p 2 con el
número de acceso de base de datos 1A9V. Comparado con
ALK-114, las otras 6 isoformas que surgen de manera
natural comprenden las siguientes sustituciones:
ALK-101: M76V.
ALK-102: V40L, T47S.
ALK-103: M111L, D114N.
ALK-104: T47S, M111I, D114N.
ALK-113: T47S.
ALK-120: V40L, T47S, D114N.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica Der p 2
(ALK-114) fue posteriormente insertado en el vector
pGAPZ\alpha-A (Invitrogen) para la expresión
secretada de Der p 2 en la levadura, Pichia pastoris. El gen
se amplificó utilizando el cebador de sentido OB27
(5'-GGAATTCCTCGAGAAAAGAGATCAAGTCGATGTCAAAGAT-TGTGCC-3')
y el cebador antisentido OB28
(5'-CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC-3')
correspondiente al extremo amino- y al extremo
carboxi-terminal del polipéptido Der p 2,
respectivamente. Los cebadores se extendieron en el extremo 5' para
acomodar los sitios de restricción XhoI y Xba I, respectivamente.
El sitio de restricción XhoI fusiona el primer codón de Der p 2 en
estructura con la secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio
de segmentación KEX2 (LYS-ARG) de
pGAPZ\alpha-A. Se realizó un ciclo individual de
amplificación de PCR en un volumen de 100 microlitros (\mul): 0.1
mg de ADN ALK-114 patrón, tampón de polimerasa 1 X
Expand (disponible de Boehringer Mannheim), 0.2 milimolar (mM) cada
uno de los cuatro dNTPs, 0.3 micromolar (\muM) cada uno de los
cebadores de sentido y antisentido y 2.5 Unidades de polimerasa
Expand (disponible de Boehringer Mannheim). El ADN se amplificó
siguiendo 25 ciclos de: 95ºC durante 15 segundos, 45ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguido por un ciclo de 72ºC
durante 7 minutos. El fragmento de PCR ALK-114 de
475 pares bases resultante se purificó utilizando un procedimiento
de purificación de giro QIAquick (disponible de Qiagen). El
fragmento de ADN purificado luego se digirió con XhoI y XbaI, se
purificó en gel y se ligó en pGAPZ\alpha-A
similarmente digerido. La reacción de ligación se transformó en la
cepa de DH5\alpha de E. coli, que da por resultado el
plásmido pCBo06.
La secuencia de nucleótidos del Der p 2 se
confirmó mediante la secuenciación de ADN antes y después de la
clonación y después de la mutagénesis in vitro (ver
abajo).
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID NO 1 corresponde a la secuencia de
ácido nucleico de Der p 2 (ALK-114):
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID NO 2 corresponde a la secuencia de
aminoácidos deducida de Der p 2 (ALK-114):
\vskip1.000000\baselineskip
El vector, pCBo06 se linealizó utilizando la
enzima de restricción Avr II y se transformó en la cepa de P.
pastoris competente, X-33, como se describe en
el manual de Invitrogen. Se seleccionaron las células recombinantes
resistentes a 100 microgramos por mililitro (\mug/ml) de Zeocina,
y la colonia se purificó en placas de YPD frescas que contienen 100
\mug/ml de Zeocin.
\vskip1.000000\baselineskip
250 ml de medio YPD (extracto de levadura al 1%,
peptona al 2%, glucosa al 2%) que contiene 100 \mug/ml de Zeocina
se inocularon con un cultivo durante la noche de células de levadura
recombinante que expresan Der p 2. El cultivo se cultivó a 30ºC
durante 72 horas para obtener la expresión de Der p 2 óptima. Las
células se cosecharon por centrifugación y el sobrenadante de
cultivo resultante se saturó con sulfato de amonio al 50%. Después
de la centrifugación a 3000x g durante 30 minutos, el sobrenadante
se saturó con sulfato de amonio al 80%. Después de la
centrifugación, el sedimento se resuspendió en NH_{4}HCO_{3} 150
milimolar (mM) y se fraccionó en una columna de filtración de gel
Superdex 75, se equilibró con el mismo tampón de pH. El Der p 2 se
eluyó con un pico principal correspondiente a su peso molecular
esperado. La elución de Der p 2 se inspeccionó tanto por la
electroforesis de SDS-page seguido por tinción con
plata y mediante el análisis de inmunotransferencia utilizando
anticuerpos policlonales específicos de Der p 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de restos de aminoácido para la
mutagénesis se basó en la identificación de restos que están
altamente expuestos al disolvente y altamente conservados entre los
alérgenos de Ácaros de Polvo Casero (Der p 2/f 2 y Eur m 2) y
ácaros de almacenamiento (Tyr p 2, Lep d 2, Gly d 2). Los restos de
aminoácido altamente expuestos al disolvente se identificaron
visualmente por el análisis de la superficie molecular de la
estructura de NMR del Der p 2 (#1.9, lA9V.pdb). Se seleccionaron
doce restos de aminoácido para la mutagénesis: K6A, N10S, K15E,
S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N y R128Q.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de alérgenos mutantes
recombinantes con mutaciones primarias individuales y combinaciones
múltiples de las mismas, se describen a continuación.
\newpage
Los plásmidos de expresión que codifican los
mutantes Der p 2 se produjeron utilizando pCBo06 como patrón de
ADN. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando cebadores de
sentido y de antisentido que incorporan las mutaciones
especificadas. Los pares de cebadores utilizados en las reacciones
de PCR para generar las mutaciones especificadas, están enumeradas
en la Figura 31. Las mutaciones se nombran en negritas y los sitios
de restricción utilizados en la etapa de clonación posterior se
subrayan en la figura. Para la construcción de mutantes K6A, K15E,
H30N, H74N Y K82N, se realizaron reacciones de PCR esencialmente
como se describe en la sección "Clonación de Der p 2 en
pGAPZ\alpha-A". Los fragmentos de PCR
purificados se digirieron con los sitios de enzima de restricción
designados (véase la Figura 31), se purificaron en gel, se ligaron
en pCBo06 similarmente digerido y se transformaron en DH5\alpha de
E. coli.
La mutación E62S se generó utilizando una
metodología de mutagénesis de PCR alternativa descrita para la
generación de mutantes Bet v 1 en el Ejemplo 1. Se sintetizaron dos
cebadores de oligonucleótido especifico de mutación que cubren las
mutaciones especificadas (OB47 y OB48, listados en la Figura 31).
Dos cebadores adicionales utilizados para la etapa de amplificación
secundaria fueron OB27 y OB28 como se describe en la sección:
"Inserción de Der p 2 en pGAPZ\alpha-A".
Los alérgenos mutantes producidos son
caracterizados utilizando los mismos métodos como se describe en el
ejemplo 4, por ejemplo, la espectroscopia de dicroísmo circular
(CD), cristalización, mediciones de las propiedades de unión a IgE,
liberación de histamina, capacidad de estimulación de la
proliferación de células T, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, la aplicación del concepto de
la invención actual en los alérgenos de ácaros de polvo casero es
ejemplificada por un alérgeno, Der p 2. La manipulación de otros
alérgenos de ácaros de polvo casero puede ser realizada por
procedimientos equivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID NO. 3 muestra la secuencia de
nucleótidos y de aminoácidos deducida del clon Der p
2-ALK-G, que es una isoforma de tipo
silvestre.
La SEQ ID No. 3: Secuencia de nucleótidos y de
aminoácidos deducida de Der p
2-ALK-G
La Figura 32 muestra una alineación de secuencia
realizada en el Expasy Molecular Biology Server
(http://www.expasy.ch/) utilizando el algoritmo de ClustalW en una búsqueda BLAST utilizando la secuencia de aminoácidos de Der p 2-ALK-G mostrada en la SEQ ID NO. 3 como la secuencia de entrada. La alineación incluye secuencias de especies de ácaros de polvo casero, es decir Der p 2, Der f 2 y Eur m 2. En la Fig. 32, los restos de aminoácido idénticos a los aminoácidos en la misma posición en la secuencia de proteína Der p 2-ALK-G son resaltados utilizando letras negras en fondo gris. Los aminoácidos no idénticos son impresos en negro en un fondo blanco.
(http://www.expasy.ch/) utilizando el algoritmo de ClustalW en una búsqueda BLAST utilizando la secuencia de aminoácidos de Der p 2-ALK-G mostrada en la SEQ ID NO. 3 como la secuencia de entrada. La alineación incluye secuencias de especies de ácaros de polvo casero, es decir Der p 2, Der f 2 y Eur m 2. En la Fig. 32, los restos de aminoácido idénticos a los aminoácidos en la misma posición en la secuencia de proteína Der p 2-ALK-G son resaltados utilizando letras negras en fondo gris. Los aminoácidos no idénticos son impresos en negro en un fondo blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácido que representan los
alérgenos del grupo 2 de ácaros de polvo casero tienen una similitud
mayor que 85% y algo de la superficie molecular es conservada (zonas
de color gris), véase la Fig. 33.
La Fig. 33 muestra contornos de superficie
visualizados desde 4 ángulos diferentes cuando se superpone la
secuencia de proteína de Der p
2-ALK-G sobre la estructura de NMR
de PDB:1A9V publicada, número de estructura de 1 a 10 contenido en
el archivo PDB.
El aminoácido conservado y altamente expuesto al
disolvente espacialmente distribuido sobre la superficie total
dentro de las distancias en el rango de 25-30
\ring{A} son seleccionados para la mutación. En las secciones
siguientes, se da la siguiente información: Una lista de aminoácidos
considerada que es apropiada para la mutación (A), una lista de los
mutantes designados (B) y las secuencias de ADN que representan los
mutantes designados (C). La Fig. 34 muestra contornos de superficie
del mutante número 1 como un ejemplo. El color gris indica restos
de aminoácidos conservados. El color negro indica restos de
aminoácidos seleccionados para la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- K15, S24, H30, R31, K48, E62, H74, K77, K82, K100, R128
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 1:
- \quad
- K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2:
- \quad
- K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 3:
- \quad
- K15E, S24N, H30G, K48A, K77N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4:
- \quad
- K15E, S24N, H30G, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5:
- \quad
- K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6:
- \quad
- S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 7:
- \quad
- K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 8:
- \quad
- K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 9:
- \quad
- K15E, S24N, R31S, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 10:
- \quad
- K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 11:
- \quad
- K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 12:
- \quad
- S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6:
\newpage
Mutante 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 9:
\newpage
Mutante 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 12:
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo la aplicación del concepto de la
invención actual en alérgenos de acaro de polvo casero es
ejemplificado por un alérgeno, Der p 1. La manipulación de otros
alérgenos de acaro de polvo casero se puede realizar por
procedimientos equivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID NO. 4 muestra la secuencia de
nucleótidos y de aminoácidos deducida del clon Der p
1-ALK, que es una isoforma de tipo silvestre.
SED ID NO. 4: Secuencia de nucleótidos y
aminoácidos deducida de Der p 1-ALK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 35 muestra una alineación de secuencia
realizada en el ExPaSy Molecular Biology Server
(http://wwv.expasy.ch/) utilizando el algoritmo ClustalW en una búsqueda BLAST utilizando la secuencia de aminoácidos de Der p 1-ALK mostrada en la SEQ ID NO. 4 como la secuencia de entrada. La alineación incluye secuencias de especies de acaro de polvo casero, es decir, Der p 1, Der f 1 y Eur m 1. En la Fig. 35, los restos de aminoácido idénticos a los aminoácidos en la misma posición en la secuencia de proteína de Der p 1-ALK son resaltados utilizando letras negras en fondo gris. Los aminoácidos no idénticos son impresos en negro en un fondo blanco.
(http://wwv.expasy.ch/) utilizando el algoritmo ClustalW en una búsqueda BLAST utilizando la secuencia de aminoácidos de Der p 1-ALK mostrada en la SEQ ID NO. 4 como la secuencia de entrada. La alineación incluye secuencias de especies de acaro de polvo casero, es decir, Der p 1, Der f 1 y Eur m 1. En la Fig. 35, los restos de aminoácido idénticos a los aminoácidos en la misma posición en la secuencia de proteína de Der p 1-ALK son resaltados utilizando letras negras en fondo gris. Los aminoácidos no idénticos son impresos en negro en un fondo blanco.
\newpage
Las secuencias de aminoácidos que representan
los alérgenos del grupo 1 de ácaros de polvo casero son similares a
un cierto grado y algo de la superficie molecular está conservada
(zonas de color gris), véase la Fig. 36. La Fig. 36 muestra los
contornos de superficie visualizados desde 4 ángulos diferentes
cuando se superpone la secuencia de proteína de Der p
1-ALK sobre un modelo de estructura molecular de Der
p 1.
Los aminoácidos conservados y altamente
expuestos al disolvente, espacialmente distribuidos sobre la
superficie total dentro, de las distancias en el rango de
25-30\ring{A}, son seleccionados para la mutación.
En las secciones siguientes, la siguiente información es dada: una
lista de aminoácidos considerada que es apropiada para la mutación
(A), una lista de los mutantes designados (B) y las secuencias de
ADN que representan los mutantes designados (C). La Fig. 37 muestra
los contornos de superficie del mutante número 11 como un ejemplo.
El color gris indica los restos de aminoácido conservados. El color
negro indica los restos de aminoácido seleccionados para
mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- E13, P24, R20, Y50, S67, R78, R99, Q109, R128, R156, R161, P167, W192.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 1:
- \quad
- P24T, Y50V, R78E, R99Q, R156Q, R161E, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2:
- \quad
- P24T, Y50V, R78Q, R99E, R156E, R161Q, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 3:
- \quad
- R20E, Y50V, R78Q, R99Q, R156E, R161E, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4:
- \quad
- R20Q, Y50V, R78E, R99E, R156Q, R161Q, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5
- \quad
- P24T, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161Q, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6:
- \quad
- R20E, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161E, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 7:
- \quad
- R20Q, Y50V, S67N, R99Q, R156E, R161E, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 8:
- \quad
- E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 9:
- \quad
- E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T
\newpage
Mutante 10:
- \quad
- E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T, W192F
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 11:
- \quad
- E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T, W192F
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4:
\newpage
Mutante 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6:
\newpage
Mutante 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 8:
\newpage
Mutante 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 10:
\newpage
Mutante 11:
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo la aplicación del concepto de la
invención actual en los alérgenos de polen de hierba está
ejemplificada por un alérgeno, Ph1 p 5. La manipulación de otros
alérgenos de polen de hierba se puede realizar por procedimientos
equivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID NO. 5 muestra la secuencia de
nucleótidos y de aminoácidos deducida del clon Ph1 p 5.0103, que es
una isoforma de tipo silvestre.
SEQ ID NO. 5: Secuencia de nucleótidos y de
aminoácidos deducida del Phl p 5.0103.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 38 muestra una alineación de secuencia
realizada en el ExPaSy Molecular Biology Server
(http://www.expasy.ch/) utilizando el algoritmo ClustalW en una búsqueda BLAST utilizando la secuencia de aminoácidos Ph1 p 5.0103 mostrada en la SEQ ID No. 5 como la secuencia de entrada. La alineación incluye secuencias de alérgenos del grupo 5 de las especies de hierbas, es decir, Ph1 p 5, Poa p 5, Hol p 5, Hol 1 5, Pha a 5, Hor v 9 y Hor v 5. En la Fig. 38 los restos de aminoácido idénticos a los aminoácidos de la misma posición en la secuencia de la proteína de Ph1 p 5.0103 son resaltados utilizando letras negras en fondo gris. Los aminoácidos no idénticos son impresos en negro en un fondo blanco.
(http://www.expasy.ch/) utilizando el algoritmo ClustalW en una búsqueda BLAST utilizando la secuencia de aminoácidos Ph1 p 5.0103 mostrada en la SEQ ID No. 5 como la secuencia de entrada. La alineación incluye secuencias de alérgenos del grupo 5 de las especies de hierbas, es decir, Ph1 p 5, Poa p 5, Hol p 5, Hol 1 5, Pha a 5, Hor v 9 y Hor v 5. En la Fig. 38 los restos de aminoácido idénticos a los aminoácidos de la misma posición en la secuencia de la proteína de Ph1 p 5.0103 son resaltados utilizando letras negras en fondo gris. Los aminoácidos no idénticos son impresos en negro en un fondo blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácidos que representan a
los alérgenos del grupo 5 del polen de hierba son similares a un
cierto grado y algo de la superficie molecular está conservada
(zonas de color gris), ver la Fig. 39. La Fig. 39 muestra contornos
de superficie visualizados desde 4 ángulos diferentes cuando se
superpone la secuencia de proteína Ph1 p 5.0103 sobre un modelo de
estructura molecular de Ph1 p 5. El modelo de estructura comprende
la molécula en dos mitades, Modelo A (aminoácidos
34-142} mostrado en la Fig. 39A, y el Modelo B
(aminoácidos 149-259) mostrado en la Fig. 39B.
Los aminoácidos altamente expuestos al
disolvente, espacialmente distribuidos sobre la superficie total
dentro de las distancias en el rango de
25-30\ring{A} son seleccionados para la mutación.
En las secciones siguientes, se da la siguiente información: Una
lista de aminoácidos considerados que son apropiados para la
mutación (A), una lista de los mutantes designados (B) y las
secuencias de ADN que representan los mutantes designados (C). La
Fig. 40 A y B muestra los contornos de superficie del mutante número
1 Modelo A y Modelo B, respectivamente, como un ejemplo. El color
gris indica restos de aminoácidos conservados. El color negro indica
restos de aminoácidos seleccionados para mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- I45, R66, E133, R136, I137, D186, F188, K211, P214, Q222, P232, L243, Q254
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 1:
- \quad
- I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2:
- \quad
- R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 3:
- \quad
- I45K, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4:
- \quad
- I45K, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5:
- \quad
- I45K, E133S, D186H, Q222K, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6:
- \quad
- I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 7:
- \quad
- I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 8:
- \quad
- I45K, E133S, F188I, K211N, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 9:
- \quad
- R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 10:
- \quad
- R66N, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254Q
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 11:
- \quad
- I45K, E133S, D186H, P214G, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 12:
- \quad
- I45K, E133S, D186H, K211N, L243E, Q254K
\newpage
Mutante 13:
- \quad
- I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 14:
- \quad
- I45K, E133S, K211N, P232G, L243E, Q254K
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 2:
\newpage
Mutante 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 7:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 8:
\newpage
Mutante 9:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 10:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 11:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 12:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 13:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 14:
\vskip1.000000\baselineskip
Investigar una respuesta de las células T in
vitro a los alérgenos mutados en términos de proliferación y
producción de citocina.
\vskip1.000000\baselineskip
PBL (Linfocitos de Sangre Periféricos) de
pacientes alérgicos se utilizaron en la siguiente investigación.
Ocho líneas de células T específicas de bet v 1
se establecieron a partir de PBL con bet v 1 naturalmente purificado
con el fin de sostener la variedad de isoformas de bet v 1, las
células T son presentadas, como es descrito en un protocolo
previamente publicado (26).
Diez PBL y ocho líneas de células T se
estimularon con extracto de abedul (Bet v), Bet v 1 naturalmente
purificado (nBet v 1), Bet v 1 recombinante (rBet v 1o wt; 27) y
cuatro formas diferentes mutadas de rBet v 1 (descritas en otra
parte): 2595, 2628, 2637, 2744, 2773. Después se encontró que el
mutante 2637 que está parcialmente desdoblado y no será
discutido.
En resumen: En una placa de 96 pocillos de fondo
redondo se añadió PBL en 2 x 10^{5} por cavidad. Las diferentes
muestras de abedul se añadieron en tres diferentes concentraciones
por cuadruplicado y se dejaron cultivar durante 6 días. En el DIA 6,
la mitad del volumen de las células (100 \mul) de cada pocillo con
la concentración más alta de abedul se cosecharon para la producción
de citocina.
Timidina marcada radioactiva se añadió a los
pocillos. Al siguiente día (DIA 7) las células se cosecharon en un
filtro. Se añadió fluido de centelleo al filtro y se midió la
radioactividad en un contador de centelleo.
Del mismo modo en una placa de 96 pocillos de
fondo redondo se añadieron células T en 3x10^{4} células T por
pocillo y se estimularon con PBL autólogo irradiado (1x10^{5}
células/pocillo) y 3 diferentes concentraciones de las diferentes
muestras de abedul. Después de 1 día, las células de cada pocillo
con la concentración más alta de abedul se cosecharon para la
producción de citocina. Se añadió timidina marcada radioactiva a los
pocillos. En el DIA 2, las células se cosecharon sobre un filtro y
se contaron como se describe por PBL.
Los sobrenadantes de los cuadruplicados se
acumularon y las citocinas se midieron utilizando un kit de CBA
(arreglo de cuentas de citocina) de Becton Dickinson.
\vskip1.000000\baselineskip
Diez cultivos de PBL mostraron estimulación
específica al abedul. En general, la proliferación del PBL a las
diferentes muestras de abedul fue similar, aunque se podrían
observar variaciones. En 3 PBL, nBet v 1 estimuló la proliferación
mejor que rBet v 1 y los mutantes. Las muestras de abedul mutantes
estimularon el PBL de forma casi idéntica a rBet v 1 (Fig. 41). La
Fig. 41 muestra el Índice de Estimulación para las preparaciones de
Bet v 1 mencionadas anteriormente. El Índice de Estimulación (SI) se
calcula como la proliferación (cpm: cuentas por minuto) de la
muestra estimulada (más alta concentración) dividida con la
proliferación (cpm) del medio de control. PPD designa el derivado
de proteína purificada de mucobacterium tuberculosis, que sirve como
un control positivo.
La producción de citocinas fue dominada por
IFN-gamma y se incrementó proporcionalmente con la
proliferación de PBL. Nada de signos de un desplazamiento de
Thl/Th2 fueron evidentes (Fig. 42-44). La Figura 42
muestra un paciente con un perfil ThO, la Figura 43 un perfil Th1 y
la Figura 44 un perfil Th2. La producción de citocina está medida
en pg/ml indicada como las barras y la relación entre
IL-5/IFN-gamma es la línea de
guiones inferior (eje Y a la derecha). La proliferación está medida
en cpm observada en el eje Y a la derecha como una línea continua
medida en cpm. El medio y MBP (proteína de unión a maltosa) están
incluidos como controles de fondo.
Ocho líneas de células T se establecieron en
nBET v 1 y todas, excepto una, proliferaron igualmente bien a todas
las muestras de abedul. Cuatro líneas de células T estuvieron
secretando citocina tipo Th0 basadas en la relación de
IL-5 e IFN-gamma (Th2 > 5, 5 >
Th0 >0.2, 0.2 > Th1). Tres líneas de células T estuvieron
secretando citocinas Th1 y una línea de células T estuvo secretando
citocinas Th2. La relación de
IL-5/IFN-gamma no estaba afectada
por las diferentes muestras de abedul.
\newpage
Todos los cultivos de PBL y 7/8 líneas de
células T que mostraron estimulación específica a nBet v 1 también
respondieron al rBet v 1 y a los mutantes. Estos datos sugieren que
para la estimulación de las células T, una sola isoforma de Bet v 1
o estos 4 mutantes pueden sustituir la mezcla de isoformas
individuales encontradas en las preparaciones de alérgenos
naturales. Así, las vacunas basadas en alérgenos recombinantes o
estos 4 mutantes se dirigirán a la población de células T
específicas de Bet v 1 existente.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta sección el término "anticuerpos de
bloqueo" se define como anticuerpos, diferentes a los anticuerpos
IgE humanos, que son capaces de unirse a un antígeno y prevenir la
unión de los anticuerpos IgE humanos a ese antígeno.
La capacidad de la proteína de tipo silvestre de
Bet v 1 2227 recombinante (rBet v 1) y las proteínas mutantes Bet v
1 2595, 2628, 2744 y 2773 para inducir los anticuerpos IgG
específicos de Bet v 1 y los anticuerpos de bloqueo se probó en
experimentos de inmunización en ratones.
Los ratones BALB/cA (8 en cada grupo) se
inmunizaron mediante inyecciones intraperitoneales con proteína de
tipo silvestre Bet v1 2227 o las cuatro proteínas mutantes. Los
ratones se Inmunizaron cuatro veces con un intervalo de dosis de 14
días. Las diferentes proteínas se conjugaron a 1,25 mg/ml de
Alhydrogel, (gel de Hidróxido de Aluminio, 1,3% pH
8.0-8.4, Superfos Biosector). Los ratones se
inmunizaron con ya sea 1 ug de proteína/dosis o 10 ug de
proteína/dosis. Las muestras de sangre se retiraron mediante el
sangrado orbital en el día 0, 14, 35, 21, 49 y 63.
Los niveles de anticuerpo IgG específico se
analizaron mediante ELISA directa utilizando placas microtítulo
recubiertas de rBet v 1 y anticuerpos IgG antiratón de conejo
biotinilado (Jackson) como el anticuerpo de detección. La
inmunización con la proteína de tipo silvestre Bet v1 2227
recombinante o las cuatro proteínas mutantes, indujo una fuerte
respuesta de IgG específica de rBet v 1. Este descubrimiento
demuestra que las cuatro proteínas mutadas son capaces de inducir
anticuerpos que son altamente reactivos cruzadamente a la proteína
de tipo silvestre Bet v 1 2227.
Para estimar la inducción de los anticuerpos de
bloqueo, se incubaron muestras de suero de pacientes alérgicos al
polen de abedul con cuentas paramagnéticas recubiertas con un
anticuerpo monoclonal IgE antihumano de ratón. Después de la
incubación, las cuentas se lavaron y se resuspendieron en solución
tampón o muestras diluidas (1:100) de suero de ratón, de ratones no
inmunizados (control) o ratones inmunizados como se describió
anteriormente. Luego se adicionó r Bet v 1 biotinilado a esta
mezcla de las cuentas y los anticuerpos de suero de ratón. Después
de la incubación, las cuentas se lavaron y se detectó el rBet v 1
biotinilado unido utilizando estreptavidina marcada con acridinio.
La incubación de las cuentas con suero de ratones no inmunizados no
cambió la unión del r Bet v 1 a las cuentas. En contraste, la
incubación de las cuentas con suero de ratones inmunizados con la
proteína de tipo silvestre Bet v1 2227 recombinante o las cuatro
proteínas mutantes, redujo significativamente la unión del r Bet v
1 a las cuentas, demostrando la presencia de anticuerpos de bloqueo
específicos de Bet v 1 en las muestras de suero. Así, en el DIA 63
una o más muestras de suero de todos los grupos de inmunización de
alta dosis (10 ug/dosis) fueron capaces de reducir la unión del r
Bet a las cuentas con más de 80%. Estos descubrimientos demuestran
que las cuatro proteínas mutadas son capaces de inducir anticuerpos
que pueden actuar como anticuerpos de bloqueo específicos de Bet v
1.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (67)
1. Un alérgeno recombinante que es un mutante de
un alérgeno que surge de manera natural, donde el alérgeno mutante
tiene al menos cuatro mutaciones, las cuales reducen la capacidad de
unión a IgE específico del alérgeno mutado en comparación con la
capacidad de unión a IgE de dicho alérgeno que surge de manera
natural, donde cada mutación es una sustitución de un resto de
aminoácido expuesto en la superficie con otro resto de aminoácido,
que no ocurre en la misma posición en la secuencia de aminoácidos de
cualquier proteína homóloga conocida dentro de las especies
taxonómicas de las cuales se origina dicho alérgeno que surge de
manera natural, caracterizado porque al menos cuatro
mutaciones (mutaciones primarias) están mutuamente espaciadas por al
menos 15 \ring{A} y donde dichas mutaciones primarias están
espaciadas de manera tal que al menos una región de superficie
circular con un área de 800 \ring{A}^{2} no comprende
mutación.
2. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 1, donde las mutaciones primarias están espaciadas 20
\ring{A}.
3. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 1 o 2 que comprende un número de mutaciones
secundarias, las cuales reducen la capacidad de unión a IgE
específico del alérgeno mutado en comparación con la capacidad de
unión de dicho alérgeno que surge de manera natural, donde cada
mutación secundaria es una sustitución de un resto de aminoácido
expuesto en la superficie con otro aminoácido, que no ocurre en la
misma posición en la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína
homóloga conocida dentro de las especies taxonómicas de las que se
origina dicho alérgeno que surge de manera natural, donde las
mutaciones secundarias están espaciadas fuera de dicha región
circular.
4. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, donde al menos uno de los
aminoácidos expuestos en la superficie a ser sustituido en el
alérgeno que surge de manera natural tiene una accesibilidad al
disolvente por encima de 20%.
5. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, donde al menos uno de los
aminoácidos expuestos en la superficie a ser sustituido en el
alérgeno que surge de manera natural está conservado con más del 70%
de identidad en todas las proteínas homólogas conocidas dentro de
las especies de las cuales dicho alérgeno que surge de manera
natural se origina.
6. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, que esencialmente tiene la
misma estructura terciaria del esqueleto del
\alpha-carbono que dicho alérgeno que surge de
manera natural.
7. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-6, donde al cada resto de
aminoácido a ser incorporado en el alérgeno mutante no ocurre en la
misma posición en la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína
homóloga conocida dentro del género taxonómico, tal como la
subfamilia, la superfamilia, la legión, el suborden o el orden del
que dicho alérgeno que surge de manera natural se origina.
8. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-7, caracterizado
porque la unión de IgE específico al alérgeno mutado está reducida
en al menos 5%.
9. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 6, caracterizado porque cuando se comparan las
estructuras terciarias del esqueleto del
\alpha-carbono de las moléculas del alérgeno
mutante y de la que surge de manera natural, desviación promedio de
la raíz cuadrada media de las coordenadas atómicas está por debajo
de 2\ring{A}.
10. Un alérgeno recombinante según las
reivindicaciones 1-9, caracterizado porque
dicha región de superficie circular comprende átomos de
15-25 restos de aminoácido.
11. Un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-10,
caracterizado porque los restos de aminoácido expuestos en la
superficie están clasificados con respecto a la accesibilidad al
disolvente, y que uno o más aminoácidos entre los más accesibles al
disolvente están sustituidos.
12. Un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-11,
caracterizado porque los restos de aminoácido expuestos en la
superficie están clasificados con respecto al grado de conversación
en todas las proteínas homólogas conocidas dentro de las especies de
las cuales dicho alérgeno que surge de manera natural se origina, y
que uno o más aminoácidos entre los más conservados están
sustituidos.
13. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-12 que comprende de 5 a 20
mutaciones.
14. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-12 que comprende de 7 a 12
mutaciones primarias.
15. Un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-14
caracterizado porque el alérgeno recombinante comprende de 1
a 4 mutaciones secundarias por mutación primaria.
\newpage
16. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-15, caracterizado
porque una o más de las sustituciones es llevada a cabo por
mutagénesis dirigida al sitio.
17. Un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-16,
caracterizado porque una o más de las sustituciones está
llevada a cabo fuera por reordenamiento del ADN.
18. Un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-17,
caracterizado porque es un mutante de un alérgeno de
inhalación.
19. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 18, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de polen.
20. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 19 caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de polen que se origina del orden taxonómico de Fagales,
Oleales o Pinales.
21. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 20, caracterizado porque es un mutante de Bet
v 1.
22. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 21, caracterizado porque una o más de las
sustituciones es seleccionada del grupo que consiste en V2, D72,
E87, K-129, E-60,
N-47, K-65, P-108,
N-159, D-93, K-123,
K-32, D-125, R-145,
D-109, E-127, Q-36,
E-131, L-152, E-6,
E-96, D-156, P-63,
H-76, E-8, K-134,
E-45, T-10, V-12,
K-20, S-155, H-126,
P-50, N-78, K-119,
V-2, L-24, E-42,
N-4, A-153, I-44,
E-138, G-61 , A-130,
R-70, N-28, P-35,
S-149, K-103, Y-150,
H-154, N-43, A-106,
K-115, P-14, Y-5,
K-137, E-141, E-87 y
E-73.
23. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 19, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de polen que se origina del orden taxonómico de Poales.
24. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 19, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de polen que se origina del orden taxonómico de Asterales o
Urticales.
25. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 18, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de ácaro del polvo casero.
26. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 25, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de ácaro que se origina de Dermatophagoides.
27. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 26, caracterizado porque es un mutante de Der
p 2.
28. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 27, caracterizado porque una o más de las
sustituciones es seleccionada del grupo que consiste en
R-128, D-129, H-11,
H-30, S-1, K-77,
Y-75, R-31, K-82,
K-6, K-96, K-48,
K-55, K-89, Q-85,
W-92, I-97, H-22,
V-65, S-24, H-74,
K-126, L-61, P-26,
N-93, D-64, I-28,
K-14, K-100, E-62,
I-127, E-102, E-25,
P-66, L-17, G-60,
P-95, E-53, V-81,
K-51, N-103, Q-2,
N-46, E-42, T-91,
D-87, N-10, M-111,
C-8, H-124, I-68,
P-79, K-109 y R-128,
D-129, H-11, H-30,
S-1, K-77, Y-75,
R-31, K-82, K-6,
K-96, K-48, K-55,
K-89, Q-85, W-92,
I-97, H-22, V-65,
S-24, H-74, K-126,
L-61, P-26, N-93,
D-64, I-28, K-14,
K-100, E-62, I-127,
E-102, E-25, P-66,
L-17, G-60, P-95,
E-53, V-81, K-51,
N-103, Q-2, N-46,
E-42, T-91, D-87,
N-10, M-111, C-8,
H-124, I-68, P-79,
K-109 y K-15.
29. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 18, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de cucaracha.
30. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 18, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de animal.
31. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 30, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno animal que se origina de gato, perro o caballo.
32. Un alérgeno recombinante según las
reivindicaciones 1-17, caracterizado porque
es un mutante de un alérgeno de veneno.
33. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 32, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de veneno que se origina del orden taxonómico de
Hymenoptera.
34. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 33, caracterizado porque es un mutante de un
alérgeno de veneno que se origina del orden taxonómico de Vespidae,
Apidae y Formicoidae.
35. Un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 32-34,
caracterizado porque es un mutante de Ves v 5.
\newpage
36. Un alérgeno recombinante según la
reivindicación 35, caracterizado porque una o más de las
sustituciones es seleccionada del grupo que consiste en
K-16, K-185, K-11,
K-44, K-210, R-63,
K-13, F-6, K-149,
K-128, E-184, K-112,
F-157, E-3, K-29,
N-203, N-34, K-78,
K-151, L-15, L-158,
Y-102, W-186, K-134,
D-87, K-52, T-67,
T-125, K-150, Y-40,
Q-48, L-65, K-81,
Q-101, Q-208, K-144,
N-8, N-70, H-104,
Q-45, K-137, K-159,
E-205, N-82, A-111,
D-131, K-24, -V-36,
N-7, M-138, T-209,
V-84, K-172, V-19,
D-56, P-73, G-33,
T-106, N-170, L-28,
T-43, Q-114, C-10,
K-60, N-31, K-47,
E-5, D-145, V-38,
A-127, D-156, E-204,
P-71, G-26, Y-129,
D-141, F-201, R-68,
N-200, D-49, S-153,
K-35, S-39, Y-25,
V-37, G-18, W-85 y
I-182.
37. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-36 para uso como un
fármaco.
38. Uso de un alérgeno recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 1-36 para
preparar un fármaco para prevenir y/o tratar la alergia.
39. Una composición que comprende dos o más
variantes de alérgeno mutante recombinante según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-36, donde cada variante está
definida por tener al menos una mutación primaria, que está ausente
en al menos una de las otras variantes, donde para cada variante no
está presente una mutación secundaria dentro de un radio de
15\ring{A} desde cada mutación primaria ausente.
40. Una composición según la reivindicación 39
que comprende 2-12 variantes.
41. Una composición según la reivindicación 39 o
40 para uso como un fármaco.
42. Uso de una composición según la
reivindicación 39 o 40 para preparar un fármaco para prevenir y/o
tratar la alergia.
43. Una composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende un alérgeno recombinante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-36 o una
composición según la reivindicación 39 o 40, en combinación con un
vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
44. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 43, caracterizada porque está en forma de una
vacuna contra reacciones alérgicas obtenida por un alérgeno que
surge de manera natural en pacientes que padecen de alergia.
45. Uso de un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-36 o una
composición según la reivindicación 39 o 40 para la fabricación de
un medicamento para generar una respuesta inmune en un
individuo.
46. Uso de un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-36 o una
composición según la reivindicación 35 o 40 para la fabricación de
un medicamento para vacunación o tratamiento de un individuo.
47. Un proceso para preparar una composición
farmacéutica según la reivindicación 43 o 44 que comprende mezclar
un alérgeno recombinante según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-36 o una composición según la
reivindicación 39 o 40 con sustancias y/o excipientes
farmacéuticamente aceptables.
48. Una composición farmacéutica que se obtiene
por el proceso según la reivindicación 47.
49. Uso de un alérgeno recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-36 o una
composición según la reivindicación 39 o 40 para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento, prevención o alivio de
reacciones alérgicas en un individuo.
50. Un método para preparar un alérgeno
recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-36, caracterizado por
a) identificar un número de restos de
aminoácidos en un alérgeno que surge de manera natural, que tienen
una accesibilidad al disolvente de al menos 20%;
b) seleccionar al menos cuatro de los restos de
aminoácidos de manera tal que cada aminoácido seleccionado esté
espaciado uno de otro aminoácido seleccionado en al menos 15
\ring{A}, y que los aminoácidos seleccionados estén colocados de
tal manera que al menos una región de superficie circular con un
área de 800 \ring{A} no comprenda el aminoácido seleccionado;
y
c) efectuar para cada uno de los aminoácidos
seleccionados una mutación primaria, que reduce la capacidad de
unión a IgE selectivo del alérgeno mutado en comparación con la
capacidad de unión de dicho alérgeno que surge de manera
natural.
donde cada mutación primaria es una sustitución
de un resto de aminoácido seleccionado con otro aminoácido, que no
ocurre en la misma posición en la secuencia de aminoácidos de
cualquier proteína homóloga conocida dentro de las especies
taxonómicas de las cuales se origina el alérgeno que surge de manera
natural.
51. Un método según la reivindicación 50,
caracterizado por clasificar dichos restos de aminoácido
identificados con respecto a la accesibilidad al disolvente y
sustituir uno o más aminoácidos entre los más accesibles al
disolvente.
disolvente.
52. Un método según la reivindicación 50 o 51,
caracterizado por seleccionar restos de aminoácido
identificados, que están conservados en más del 70% de identidad en
todas las proteínas homólogas conocidas dentro de las especies de
las cuales dicho alérgeno que surge de manera natural se
origina.
53. Un método según la reivindicación 52,
caracterizado por clasificar dichos restos de aminoácido
identificados con respecto al grado de conversación en todas las
proteínas homólogas conocidas dentro de las especies de las cuales
dicho alérgeno que surge de manera natural se origina y sustituir
uno o más aminoácidos entre los más conservados.
54. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 50-53 que comprende seleccionar los
aminoácidos identificados con el fin de formar un alérgeno mutante,
que esencialmente tiene la misma estructura terciaria del esqueleto
del \alpha-carbono que dicho alérgeno que surge de
manera natural.
55. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 50-54 caracterizado porque
la sustitución de restos de aminoácido es llevada a cabo por
mutagénesis dirigida al sitio.
56. Un método para preparar un alérgeno
recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-36, caracterizado porque el alérgeno es
producido a partir de una secuencia de ADN obtenida por
reordenamiento de ADN (reproducción molecular) del ADN que codifica
el correspondiente alérgeno que surge de manera natural.
57. Una secuencia de ADN que codifica un
alérgeno recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
1-36, un derivado de la misma, una secuencia parcial
de la misma, una secuencia degenerada de la misma o una secuencia,
que se hibrida a esta bajo condiciones estrictas, donde dicho
derivado, secuencia parcial, secuencia degenerada o secuencia
hibridante codifica un péptido que tiene al menos un epítopo de
célula B.
58. Una secuencia de ADN según la reivindicación
57, que es un derivado de la secuencia de ADN que codifica el
alérgeno que surge de manera natural.
59. Una secuencia de ADN según la reivindicación
58, donde el derivado es obtenido por mutagénesis dirigida al sitio
del ADN que codifica el alérgeno que surge de manera natural.
60. Una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 57-59, donde la secuencia es un
derivado de la secuanilla mostrada en la Fig. 3, donde la secuencia
de ADN está mutada para codificar un alérgeno que tiene al menos
cuatro mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en
V-2, D-72, E-87,
K-129, E-60, N-47,
K-65, P-108, N-159,
D-93, K-123, K-32,
D-125, R-145, D-109,
E-127, Q-36, E-131,
L-152, E-6, E-96,
D-156, P-63, H-76,
E-8, K-134, E-45,
T-10, V-12, K-20,
S-155, H-126, P-50,
N-78, K-119, V-2,
L-24, E-42, N-4,
A-153, I-44, E-138,
G-61, A-130, R-70,
N-28, P-35, S-149,
K-103, Y-150, H-154,
N-43, A-106, K-115,
P-14, Y-5, K-137,
E-141, E-87 y
E-73.
61. Una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 57-59, donde la secuencia es un
derivado de la secuanilla mostrada en la Fig. 13, donde la secuencia
de ADN está mutada para codificar un alérgeno que tiene al menos
cuatro mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en
K-16, K-185, K-11,
K-44, K-210, R-63,
K-13, F-6, K-149,
K-128, E-184, K-112,
F-157, E-3, K-29,
N-203, N-34, K-78,
K-151, L-15, L-158,
Y-102, W-186, K-134,
D-87, K-52, T-67,
T-125, K-150, Y-40,
Q-48, L-65, K-81,
Q-101, Q-208, K-144,
N-8, 14-70, H-104,
Q-45, K-137, K-159,
E-205, N-82, A-111,
D-131, K-24, V-36,
N-7, M-138, T-209,
V-84, K-172, V-19,
D-56, P-73, G-33,
T-106, N-170, L-28,
T-43, Q-114, C-10,
K-60, N-31, K-47,
E-5, D-145, V-38,
A-127, D-156, E-204,
P-71, G-26, Y-129,
D-141, F-201, R-68,
N-200, D-49, S-153,
K-35, S-39, Y-25,
V-37, G-18, W-85 y
I-182.
62. Una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 57-59, donde la secuencia es un
derivado de la secuanilla mostrada en la Fig. 16, donde la secuencia
de ADN está mutada para codificar un alérgeno que tiene al menos
cuatro mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en
R-128, D-129, H-11,
H-30, S-1, K-77,
Y-75, R-31, K-82,
K-6, K-96, K-48,
K-55, K-89, Q-85,
W-92, I-97, H-22,
V-65, S-24, H-74,
K-126, L-61, P-26,
N-93, D-64, I-28,
K-14, K-100, E-62,
I-127, E-102, E-25,
P-66, L-17, G-60,
P-95, E-53, V-81,
K-51, N-103, Q-2,
N-46, E-42, T-91,
D-87, N-10, M-111,
C-8, H-124, I-68,
P-79, K-109 et
R-128, D-129, H-11,
H-30, S-1, K-77,
Y-75, R-31, K-82,
K-6, K-96, K-48,
K-55, K-89, Q-85,
W-92, 1-97, H-22,
V-65, S-24, H-74,
K-126, L-61, P-26,
N-93, D-64, I-2.8,
K-14, K-100, E-62,
I-127, E-102, E-25,
P-66, L-17, G-60,
P-95, E-53, V-81,
K-51, N-103, Q-2,
N-46, E-42, T-91,
D-87, N-10, M-111,
C-8, H-124, I-68,
P-79, K-109 y
K-15.
63. Un vector de expresión que comprende el ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 57-62.
64. Una célula hospedadora que comprende el
vector de expresión de la reivindicación 63.
65. Un método para producir un alégeno mutante
recombinante que comprende la etapa de cultivar la célula
hospedadora según la reivindicación 64.
\newpage
66. Un alérgeno recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 1-36 o codificado por la
secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones
57-62 que comprende al menos un epítopo de célula T
capaz de estimular un clon de célula T o línea de célula T
específica para el alérgeno que surge de manera natural.
67. Un ensayo de diagnóstico para evaluar la
relevancia, seguridad o resultado de la terapia de un individuo que
usa un alérgeno mutante recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 1-36 o una composición según la
reivindicación 39 o 40, donde una muestra que contiene IgE del
individuo es mezclada con dicho mutante o dicha composición y
evaluada para el nivel de reactividad entre la IgE en dicha muestra
y dicho mutante.
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