ES2314114T3 - Preparaciones de celulasa que contienen agente reductor y procedimiento para procesar fibras. - Google Patents

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Abstract

Una preparación de celulasa que comprende un agente reductor y una proteína que consta de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, 4, ó 6.

Description

Preparaciones de celulasa que contienen agente reductor y procedimiento para procesar fibras.
Campo técnico
La presente invención se refiere a una preparación de celulasa que contiene un agente reductor por el cual se mejora la actividad endoglucanasa, y un procedimiento para tratar una tela usando la preparación de celulasa.
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Técnica antecedente
La celulasa tiene tres tipos de actividades enzimáticas: una actividad celobiohidrolasa que hidroliza regiones cristalinas sólidas de la celulosa desde el extremo no reducido de un modo exo para generar celobiosa; una actividad endoglucanasa que hidroliza regiones amorfas de la celulosa del modo endo para transformar moléculas de celulosa en moléculas de bajo peso molecular y para generar diversos tipos de celooligosacáridos; y una actividad \beta-glucosidasa que descompone la celobiosa o celooligosacáridos en glucosa. De estas actividades enzimáticas, se sabe que es ventajosa la celulasa que tiene una elevada actividad endoglucanasa cuando se trata una tela.
Para conferir propiedades deseadas a telas que contienen celulosa, la tela tiene que tratarse de forma convencional con celulasa. Por ejemplo, en la industria textil, el tratamiento con celulasa se realiza para mejorar el tacto y el aspecto de la tela que contiene celulosa, o para conferir un aspecto "lavado a la piedra" a la tela que contiene celulosa coloreada, proporcionando de este modo a la tela variaciones localizadas de color (Patente EP Nº 307.564).
En dicho procesamiento textil, se usa principalmente celulasa derivada de hongos que carcomen la madera tales como Trichoderma o Humicola. Dicha celulasa se usó en forma de una mezcla que comprende múltiples componentes de celulasa obtenidos del procesamiento de un filtrado de cultivo de microorganismos que tienen actividad celulolítica. Sin embargo, para conseguir una mayor economía, entre las preparaciones de celulasa obtenidas por aislamiento de componentes de celulasa, solamente la endoglucanasa, que actúa principalmente en el tratamiento de telas, y que está genéticamente potenciada, se ha usado recientemente.
Los ejemplos de dicha endoglucanasa con elevada actividad incluyen: EGV [Publicación Internacional no Examinada (Kohyo) Nº 5-509223] y NCE4 (documento WO98/03640) derivadas de Humicola insolens, que actúan en gran medida sobre telas de algodón; RCE I, RCE II, y RCE III derivadas de Rhizopus oryzae, que actúan en gran medida sobre telas de lyocell; MCE I y MCE II derivadas de Mucor circinelloides; y PCE I derivada de Phycomyces nitens (documento WO00/24879).
Para mejorar los efectos de la celulasa, también se ha intentado el uso combinado de aditivos. Por ejemplo, la Publicación Internacional no Examinada (Kohyo) Nº 5-507615 describe que un polímero soluble en agua tal como polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), y poliacrilamida potencia los efectos de la celulasa derivada de Humicola insolens y mejora su actividad para retirar la pelusa de telas coloreadas. Además, se sabe que la actividad CMCasa en la solución de cultivo de Trichoderma viride se mejora por la adición de Tween 20 (Ooshima, H. y col., Biotechnology and Bioengineering 28: 1727-1734, 1986). Además, se sabe que la actividad para retirar la pelusa de RCE I derivada de Rhizopus oryzae se mejora en presencia de un tensioactivo no iónico (documento WO02/38754).
El documento US 5 225 102 describe composiciones para estabilidad aumentada en blanqueado en seco oxidante. Se menciona en la columna 3, línea 60 a las celulasas como una enzima capaz de hidrolizar sustratos. Para este propósito se propone encapsular las enzimas. Se sugirió que también se encapsularan agentes reductores que se considera que protegen las enzimas. Se menciona el sulfito sódico como agente reductor que puede estar presente en una cantidad del 0,1 al 60% en peso. El documento JP 10 001870 A describe una composición de agente suavizante sólida para suavizar las prendas. La composición incluye una sustancia de arcilla suavizante tal como kaolín y/o celulasa y -además de una sustancia adicional- uno o más tipos de compuestos seleccionados entre urea y sus derivados, tiourea, sales p-tolueno sulfúricas, sales inorgánicas solubles en agua y poliéteres. El documento US 4 404 115 describe composiciones de limpieza líquidas acuosas que contienen enzimas. La enzima puede ser una celulolítica que esté presente junto con un pentaborato de metal alcalino, un sulfito de metal alcalino y un poliol. El pentaborato de metal alcalino parece ser la característica esencial en vista de la estabilización de la enzima.
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Descripción de la invención
Las celulasas usadas para los propósitos descritos anteriormente son todas caras. Por lo tanto, para conseguir una aplicación a nivel industrial, los presentes inventores consideraron que se desea una mejora adicional de la actividad endoglucanasa, de modo que los efectos anteriores de la celulasa puedan ejercerse de forma más eficaz. Además, cuando se realiza un intento por obtener los efectos de una mejora de la actividad endoglucanasa, el uso de aditivos caros aumenta los costes del tratamiento de procesamiento textil. Por lo tanto, cuando se seleccionan los aditivos, los presentes inventores consideraron que es necesario mostrar los efectos de la mejora de la actividad añadiendo una baja concentración de los aditivos, y que los aditivos deben estar fácilmente disponibles y ser económicos.
Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar una preparación de celulasa que tenga la actividad endoglucanasa mejorada, que pueda usarse en el tratamiento de telas para el propósito de mejorar las telas que contienen celulosa de modo que la retirada de la pelusa pueda realizarse de forma eficaz y económica.
Los presentes inventores han realizado estudios intensivos y, como resultado, descubrieron que un agente reductor tal como tiosulfato sódico o similares potencian los efectos de endoglucanasas derivadas de Zygomycetes tales como RCE I, MCE I, PCE I, y similares a índices mucho mayores que endoglucanasas conocidas derivadas de Trichoderma y Humicola, y se completó la presente invención.
La presente invención se refiere a: Una preparación de celulasa que comprende un agente reductor y una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, 4, ó 6.
(5) La preparación de celulasa descrita anteriormente contiene del 0,01 al 50% en peso del agente reductor en la preparación de celulasa; preferiblemente el agente reductor es tiosulfato sódico, sulfito sódico, o tiourea; la preparación de celulasa preferiblemente es un gránulo que no tiene capacidad de pulverización o un líquido estabilizado; un asunto adicional de la invención es un procedimiento para tratar tela que contiene celulosa, que comprende la etapa de tratar la tela con la preparación de celulasa descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para mejorar una propiedad de la tela. La mejora de una propiedad de la tela puede ser el aclarado del color, retirada de la pelusa, la adición del aspecto y textura tipo lavado a la piedra, una mejora en el tacto y el aspecto, suavizado de la tela. El procedimiento descrito anteriormente incluye el tratamiento de la tela con la preparación de celulasa remojando o aclarando la tela; un procedimiento de destintado de papel residual, comprende la etapa de tratar el papel residual con la preparación de celulasa descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con un agente de destintado; y un procedimiento para mejorar el refino de pulpa de papel, comprende la etapa de tratar la pulpa de papel con la preparación de celulasa descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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Mejor modo de realizar la invención
La presente invención se explicará en detalle a partir de ahora.
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[1] Preparación de celulasa
La preparación de celulasa de la presente memoria descriptiva comprende uno o más agentes reductores y al menos uno de:
(1a) una endoglucanasa derivada de Zygomycetes;
(1b) una proteína en la que está delecionado un dominio de unión a celulosa en la endoglucanasa derivada de Zygomycetes (1a) [a partir de ahora mencionada a veces como "endoglucanasa CBD delecionada"];
(1c) una proteína modificada de la endoglucanasa derivada de Zygomycetes (1a) o la endoglucanasa CBD delecionada (1b) [a partir de ahora mencionada a veces simplemente como "proteína modificada"]; o
(1d) una proteína homóloga de la endoglucanasa derivada de Zygomycetes (1a) o la endoglucanasa CBD delecionada (1b) [a partir de ahora mencionada simplemente como "proteína homóloga"].
El término "endoglucanasa" como se usa en este documento significa endo-1,4-\beta-glucanasa (EC 3.2.1.4), que tiene la actividad de hidrolizar el enlace \beta-1,4-glucopiranosilo de \beta-1,4-glucano.
El término "actividad endoglucanasa" como se usa en este documento significa actividad CMCasa. El término "actividad CMCasa" como se usa en este documento significa actividad hidrolizante de carboximetilcelulosa (CMC; Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.). Cuando se incuba una solución que contiene una proteína (enzima) a ensayar y CMC durante un periodo predeterminado y se mide la cantidad de azúcar reductor liberada, la cantidad de enzima que produce el azúcar reductor correspondiente a 1 \mumol de glucosa por minuto se define como 1 unidad de la actividad CMCasa.
La actividad endoglucanasa puede medirse, por ejemplo, por el siguiente procedimiento. Es decir, se añaden 0,5 ml de una solución que contiene una proteína a ensayar a 0,5 ml de solución de CMC al 2% disuelta en 50 mmol/l de tampón acetato-acetato sódico (pH 6,0), y la mezcla se incuba a 50ºC durante 30 minutos. Se mide la concentración de azúcar reductor generado en la mezcla de reacción por el procedimiento de ácido 3,5-dinitrosalicílico (procedimiento DNS). Más particularmente, después de la incubación durante 30 minutos, se añaden 3,0 ml de un reactivo DNS a 1,0 ml de la mezcla de reacción, el conjunto se incuba en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y se diluye con 8,0 ml de agua destilada, y se mide la absorbancia a 540 nm. Se traza una curva de calibrado usando soluciones de glucosa preparadas por dilución por etapas, y se determina la cantidad de azúcar reductor generada en la mezcla de reacción enzimática según la de glucosa convertida. La actividad se calcula definiendo la cantidad de enzima que produce el azúcar reductor correspondiente a 1 \mumol de glucosa por minuto, como 1 unidad.
El reactivo DNS puede prepararse de acuerdo con las descripciones de referencias tales como Sakuzo Hukui, "Seikagaku Jikken-hou 1, Kangen-Tou no Teiryo-hou (Laboratory Manual for Biological Chemistry, Vol. 1, Assay of Reducing Sugar)", pág. 19-20, Japan Scientific Societies Press, o por el siguiente procedimiento. A 300 ml de una solución acuosa al 4,5% de hidrato sódico, se añaden 880 ml de una solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico al 1% y 255 g de sal de Rochelle (Solución A). A 22 ml de una solución acuosa al 10% de hidrato sódico, se añaden 10 g de fenol cristalino, y después se añade agua de modo que se disuelva y se ajusta el volumen a 100 ml (Solución B). Después, se disuelven 6,9 g de hidrogenocarbonato sódico en 69 ml de Solución B, y se vierte Solución A en la misma. El conjunto se mezcla con agitación para disolver la sal de Rochelle, se deja reposar durante 2 días, y después se filtra.
En cuanto a la endoglucanasa derivada de Zygomycetes que puede usarse en la presente invención, puede mencionarse RCE I (SEC ID Nº 1), MCE I (SEC ID Nº 4), o PCE I (SEC ID Nº 6) descritas en el documento WO00/24879.
Rhizopus oryzae CP96001, de la que deriva la RCE I mencionada anteriormente, se depositó de forma nacional en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 21 de abril de 1997, y se transfirió a un depósito internacional el 24 de septiembre de 1999. El número de depósito internacional (un número en paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-6889 [FERM P-16201].
Mucor circinelloides CP99001, de la que deriva la MCE I mencionada anteriormente, se depositó de forma nacional en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 2 de julio de 1999, y se transfirió a un depósito internacional el 24 de septiembre de 1999. El número de depósito internacional (un número en paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-6890 [FERM P-17446].
Phycomyces nitens CP99002, de la que deriva la PCE I mencionada anteriormente, se depositó de forma nacional en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 2 de julio de 1999, y se transfirió a un depósito internacional el 24 de septiembre de 1999. El número de depósito internacional (un número en paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-6891 [FERM P-17447].
Las proteínas que pueden usarse en la preparación de celulasa de la presente invención incluyen RCE I, MCE I, y PCE I.
El término "proteína modificada" como se usa en este documento significa una proteína que muestra la actividad endoglucanasa y que consta de una secuencia de aminoácidos en la que uno o más (por ejemplo, de uno a varias decenas, más particularmente, de 1 a 50, preferiblemente de 1 a 30, más preferiblemente de 1 a 9) aminoácidos están delecionados, sustituidos, insertados, o añadidos en la secuencia de aminoácidos de RCE I, MCE I, o PCE I, o una cualquiera de las endoglucanasas CBD delecionadas de las mismas.
El término "proteína homóloga" como se usa en este documento significa una proteína que muestra actividad endoglucanasa y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido (secuencia de bases) complementario a un polinucleótido (secuencia de bases) que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido (secuencia de bases) que codifica la secuencia de aminoácidos de RCE I, MCE I, o PCE I, o una cualquiera de las endoglucanasas CBD delecionadas de las mismas. El término "polinucleótido" como se usa en este documento incluye ADN y ARN, y es preferible ADN.
El término "condiciones rigurosas" como se usa en este documento significa condiciones en las que una sonda que comprende una secuencia de bases que codifica una secuencia parcial o de longitud completa de
(a) la secuencia de aminoácidos de RCE I, MCE I, o PCE I;
(b) la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las endoglucanasas CBD delecionadas de las mismas; o
(c) una cualquiera de las proteínas modificadas de las mismas hibrida con un polinucleótido que codifica una proteína homóloga, y la sonda no hibrida con el gen de la endoglucanasa NCE 4 (SEC ID Nº 7) descrito en el documento WO98/03640 y el gen de la endoglucanasa SCE 3 (SEC ID Nº 8) descrito en el documento WO98/54322. A este respecto, debe observarse que la cantidad de cada gen o polinucleótido usada en este documento es equivalente a la cantidad de cada uno del gen NCE 4, el gen SCE 3, y el polinucleótido que codifica una proteína
homóloga.
Más particularmente, significa condiciones en las que, por ejemplo, usando como sonda una secuencia de ADN de longitud completa marcada que codifica la secuencia de aminoácidos de RCE I, se realiza pre-hibridación a 42ºC durante 1 hora de acuerdo con el protocolo adjunto al sistema de marcaje de ARN/ADN directo y detección ECL (Amersham), después la sonda anterior se añade a la misma seguido de hibridación a 42ºC durante 15 horas, y después de ello, el producto resultante se lava dos veces con 0,5 x SSC (1 x SSC; 15 mmol/l de citrato trisódico, 150 mmol/l de cloruro sódico) que contiene SDS al 0,4% y 6 mol/l de urea a 42ºC durante 20 minutos, y finalmente seguido de lavado del producto dos veces con 5 x SSC a temperatura ambiente durante 10 minutos.
El "polinucleótido (secuencia de bases) que codifica la secuencia de aminoácidos de RCE I, MCE I, o PCE I" mencionado anteriormente incluye un polinucleótido en que está optimizado el uso de codones y/o una secuencia de reconocimiento de intrones de acuerdo con el tipo de célula huésped usada para la transformación, tal como el gen de endoglucanasa RCE I de codones optimizados (SEC ID Nº 9) descrito en el documento WO00/24879.
En cuanto a la proteína modificada u homóloga, puede mencionarse, por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente una homología del 80% o más, más preferiblemente una homología del 90% o más, adicionalmente más preferiblemente una homología del 95% o más, mucho más preferiblemente una homología del 98% o más, con la de RCE I, MCE I, o PCE I, o una cualquiera de las endoglucanasas CBD delecionadas de las mismas. A este respecto, los valores anteriores de homología pueden ser valores calculados usando un programa conocido para búsqueda de homología, preferiblemente valores calculados usando FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988); http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.htm1] de acuerdo con parámetros por defecto.
El "agente reductor", que está contenido en la preparación de celulasa de la presente invención, significa una sustancia que tiene actividad para reducir una molécula aceptando electrones de la molécula, oxidándose ella misma de este modo. Se sabe que dichos agentes reductores muestran actividad para reducir y retirar el cloro restante o similares en agua corriente. En cuanto al agente reductor usado en la presente invención, es preferible un agente reductor inorgánico, y no puede usarse una sustancia que inhiba la actividad enzimática. Ejemplos de los mismos incluyen ácido sulfuroso, ácido disulfuroso, y ácido tiosulfúrico, y sales de los mismos, y tiourea. Los agentes reductores pueden usarse solos o en una combinación de los mismos.
La preparación de celulasa de la presente invención puede comprender componentes que están contenidos convencionalmente en preparaciones de celulasa tales como excipientes y/o conservantes. La forma de la preparación de celulasa puede ser sólida o líquida. Ejemplos de formas incluyen formulación en polvo, particulada, en gránulo, en gránulo no pulverizante y líquida.
El gránulo no pulverizante (preferiblemente un gránulo que no tiene capacidad de pulverización) que es una forma de preparación de celulasa, puede producirse de acuerdo con el procedimiento de granulación en seco común. Es decir, se mezcla enzima celulasa en polvo con una o más sustancias seleccionadas entre el grupo que comprende sales inorgánicas tales como sulfato sódico o cloruro sódico que son neutras y no tienen efecto sobre la actividad endoglucanasa; minerales tales como bentonita o montmorilonita que no tienen efecto sobre la actividad endoglucanasa; sustancias orgánicas neutras tales como almidón o celulosa en polvo; y tensioactivos. Por lo tanto, los polvos o la suspensión finamente suspendida de uno o más agentes reductores que mejora los efectos de endoglucanasa se añaden a la mezcla, y después el producto obtenido se mezcla completamente o se amasa.
Dependiendo de la situación, opcionalmente se añade un polímero sintético tal como polietilenglicol o un polímero natural tal como almidón, que se une a sólidos, a la mezcla y se amasa adicionalmente. Por lo tanto, la granulación se realiza por moldeo por extrusión, usando, por ejemplo, un sedimentador de disco, y el material moldeado obtenido después se convierte en una forma esférica usando un marumerizer seguido de secado, de modo que pueden producirse gránulos no pulverizantes. Naturalmente, también es posible revestir la superficie de los gránulos con un polímero o similares para controlar la filtración de oxígeno o agua. En este caso, pueden añadirse uno o más agentes reductores que mejoran el efecto de endoglucanasa a la preparación de celulasa a una proporción del 0,01 al 50% en peso, preferiblemente del 0,1 al 20% en peso, más preferiblemente del 0,1 al 10% en peso.
Además, la preparación líquida (preferiblemente líquido estabilizado) puede prepararse mezclando un estabilizador de endoglucanasa tal como un polímero sintético o natural con una solución de enzima celulasa y, si es necesario, añadiendo sales inorgánicas y/o un conservante sintético. En este caso, puede añadirse uno o más agentes reductores que mejoren el efecto de la endoglucanasa. Similar al caso del gránulo no pulverizante, puede añadirse uno o más agentes reductores que mejoren el efecto de la endoglucanasa a la preparación de celulasa a una proporción del 0,01 al 50% en peso, preferiblemente del 0,1 al 20% en peso, más preferiblemente del 0,1 al 10% en peso.
[2] Procedimiento para tratar telas
El procedimiento para tratar telas de acuerdo con la presente invención comprende la etapa de:
tratar la tela que contiene celulosa con la preparación de celulasa mencionada anteriormente.
Las siguientes propiedades de la tela que contiene celulosa pueden mejorarse por el presente procedimiento de tratamiento:
(1) Aclarado del color de tela que contiene celulosa coloreada;
(2) Retirada de la pelusa (reducción del índice de formación de pelusas, y reducción de la pelusa);
(3) Provisión de variación localizada de color a tela que contiene celulosa coloreada, es decir, provisión de un aspecto y textura tipo lavado a la piedra a tela que contiene celulosa coloreada, típicamente vaqueros;
(4) Mejora del tacto y el aspecto de la tela reduciendo el peso; y
(5) Suavizado de la tela (reducción de la rigidez).
Más particularmente, el procedimiento para tratar telas de acuerdo con la presente invención puede realizarse añadiendo la preparación de celulasa de la presente invención en agua en que se remoja o remojará la tela, por ejemplo, durante el remojado o aclarado de la tela.
Las condiciones tales como temperatura de contacto o la cantidad de endoglucanasa pueden determinarse apropiadamente de acuerdo con otras condiciones diversas. Por ejemplo, cuando se reduce el índice de formación de pelusa o se reducen la pelusa de la tela que contiene celulosa, la tela puede tratarse a una temperatura de aproximadamente 30 a 60ºC, usando 0,2 \mug/ml o más de agentes reductores y endoglucanasas en una concentración proteica de 0,001 a 20 mg/l. Puede añadirse uno o más agentes reductores, teniendo en consideración los efectos económicos, siempre que la cantidad del mismo sea de 0,2 \mug/ml o más y el agente reductor no inhiba la actividad enzimática. Preferiblemente puede usarse de 0,2 a 500 \mug/ml, más preferiblemente de 0,3 a 150 \mug/ml del mismo.
Cuando se proporciona una variación localizada de color a la tela que contiene celulosa coloreada, la tela puede tratarse a una temperatura de aproximadamente 40 a 60ºC, usando 0,2 \mug/ml o más de agentes reductores y endoglucanasas en una concentración proteica de 0,01 a 100 mg/l. Puede añadirse uno o más agentes reductores, teniendo en consideración los efectos económicos, siempre que la cantidad del mismo sea de 0,2 \mug/ml o más y el agente reductor no inhiba la actividad enzimática. Preferiblemente puede usarse de 0,2 a 500 \mug/ml, más preferiblemente de 0,3 a 150 \mug/ml del mismo.
En un procesamiento para reducir el peso para mejorar el tacto y el aspecto de la tela que contiene celulosa, la tela puede tratarse a una temperatura de aproximadamente 30 a 60ºC, usando 0,2 \mug/ml o más de agentes reductores y endoglucanasas en una concentración proteica de 0,001 a 100 mg/l. Puede añadirse uno o más agentes reductores, teniendo en consideración los efectos económicos, siempre que la cantidad del mismo sea de 0,2 \mug/ml o más y el agente reductor no inhiba la actividad enzimática. Preferiblemente puede usarse de 0,2 a 500 \mug/ml, más preferiblemente de 0,3 a 150 \mug/ml del mismo.
La concentración proteica de cada tipo de endoglucanasa puede calcularse, por ejemplo, por análisis de HPLC usando una columna TSKgel TMS-250 (4,6 mm D.I. x 7,5 cm) (TOSOH Corporation). El análisis de HPLC implica cargar acetonitrilo en TFA (ácido trifluoroacético) al 0,05% con un gradiente de concentración lineal del 0% al 80% a un caudal de 1,0 ml/min para eluir cada tipo de endoglucanasa, y calculando la concentración proteica a partir del área del pico a UV 280 nm. Por ejemplo, una NCE4 purificada, cuya concentración proteica se determina previamente por un Protein Assay Kit (BioRad Laboratories), se somete al análisis de HPLC del mismo modo que anteriormente, de modo que puede usarse como patrón. La NCE4 purificada puede obtenerse, por ejemplo, cultivando Humicola insolens MN200-1 y purificándola del cultivo, de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO98/03640. Como patrón para la determinación de la concentración proteica en el Protein Assay Kit, por ejemplo, puede usarse Patrón de Albúmina (albúmina de suero bovino, fracción V; PIERCE).
[3] Procedimiento para destintar papel residual
El procedimiento para destintar papel residual de acuerdo con la presente invención comprende la etapa de:
tratar el papel residual con la preparación de celulasa mencionada anteriormente junto con un agente de destintado.
Más particularmente, el presente procedimiento puede realizarse tratando papel residual con la preparación de celulasa de la presente invención junto con un agente de destintado, en una etapa de destintado en un procedimiento para producir papel reciclado a partir de papel residual. El presente procedimiento posibilita destintar papel residual, y por tanto puede mejorarse la blancura del papel residual. El papel residual que puede tratarse por el presente procedimiento incluye todos los tipos de papel residual común, por ejemplo, periódicos usados, papel de revistas usadas, y papel usado impreso de bajo a medio grado que comprende pulpa mecánica y pulpa química; papel sin madera usado que comprende pulpa química; y papel residual impreso de los mismos tal como papel de revestimiento. El agente de destintado significa un agente habitualmente usado en el destintado de papel residual. Los ejemplos de agente de destintado incluyen cloruro sódico, bases tales como carbonato sódico, silicato sódico, peróxido de hidrógeno, fosfatos, tensioactivos aniónicos o no iónicos, eliminadores tales como ácido oleico, y agentes auxiliares tales como un estabilizador del pH, un agente quelante, o un agente dispersante.
[4] Procedimiento para mejorar el refino de pulpa de papel
El procedimiento para mejorar el refino de pulpa de papel de acuerdo con la presente invención comprende la etapa de:
tratar el pulpa de papel con la preparación de celulasa mencionada anteriormente.
Más particularmente, el presente procedimiento puede realizarse tratando pulpa de papel con la preparación de celulasa de la presente invención. Los ejemplos de pulpa de papel que pueden tratarse por el presente procedimiento incluyen pulpa de papel residual, pulpa de cartón reciclado, pulpa kraft, pulpa de sulfito, pulpa de tratamiento termomecánico, y otra pulpa de elevado rendimiento.
Ejemplos
La presente invención se ilustrará ahora adicionalmente por, aunque de ningún modo de forma limitante, los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1 Comparación entre proporciones de mejora de actividades de retirada de la pelusa de diversos tipos de celulasas por la adición de agente reductor
El cultivo de Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, y Phycomyces nitens, y la purificación de las endoglucanasas RCE I, MCE I, y PCE I a partir de los cultivos se realizaron por el procedimiento descrito en el documento WO00/24879.
El cultivo de Humicola insolens MN200-1 y la purificación de la endoglucanasa NCE4 a partir del cultivo se realizaron por el procedimiento descrito en el documento WO98/03640. La cepa se depositó de forma nacional en el Internacional Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 15 de julio de 1996, y se transfirió a un depósito internacional el 13 de junio de 1997. El número de depósito internacional (un número en paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-5977 [FERM P-15736].
El cultivo de Trichoderma viride MC300-1 se realizó por el procedimiento descrito en el documento WO98/54332. La cepa se depositó de forma nacional en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón) el 9 de septiembre de 1996, y se transfirió a un depósito internacional el 11 de agosto de 1997. El número de depósito internacional (un número en paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-6047 [FERM P-15842].
El tratamiento de retirada de la pelusa de una tela de tricotado de algodón con pelusa formada en una lavadora grande (una tela de 6 cm x 8 cm de Cotton Smooth Knit Nº 3900, Nitto Boseki Co., Ltd. teñida de marrón por tinción reactiva en Tsuyatomo-Senko) se realizó usando cada uno de los sobrenadantes de cultivo obtenidos en las siguientes condiciones:
Condiciones de Ensayo
Máquina de ensayo: Launder Meter L-20 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón)
Temperatura: 58ºC (solamente el sobrenadante de cultivo de Trichoderma viride); 40ºC (todas las demás soluciones enzimáticas)
Tiempo: 120 minutos
Cantidad de solución de reacción: 100 ml
pH de reacción: pH 4,5 (5 mmol/l de tampón acetato) (solamente el sobrenadante de cultivo de Trichoderma viride; pH 7,0 (5 mmol/l de tampón fosfato) (todas las demás soluciones enzimáticas). Todos los tampones se prepararon usando agua corriente.
Tipo y cantidad de agente reductor: 1,2 \mug/ml de tiosulfato sódico pentahidrato (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.)
A cada una de las soluciones de tratamiento, se añadieron cuatro bolas de goma de aproximadamente 16 g junto con cada solución enzimática.
La cantidad de solución enzimática necesaria para retirar aproximadamente el 50% de la pelusa formada en base a evaluación visual se determinó en cada uno de los dos casos de adición y no adición del agente reductor. Por lo tanto, se obtuvo un valor dividiendo la cantidad de la solución enzimática necesaria para retirar aproximadamente el 50% de la pelusa cuando no se añade el agente reductor por la cantidad cuando se añade el agente reductor, y el valor obtenido se definió como una proporción de mejora de la actividad de retirada de la pelusa por la adición del agente reductor. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
1 
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A partir de los resultados de la Tabla 1, se halla que la actividad de retirada de la pelusa de RCE I, MCE I, y PCE I, que son endoglucanasas derivadas de Zygomycetes, se mejora por la adición del agente reductor a un nivel mucho mayor que los sobrenadantes de cultivo (es decir, celulasa) derivados de Humicola insolens y Trichoderma viride.
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Ejemplo 2 Mejora del efecto de la actividad de retirada de la pelusa de RCE I expresada en Humicola por la adición de diversos agentes reductores
La endoglucanasa RCE I se expresó en Humicola insolens de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos D3 y D4 del documento WO00/24879. El tratamiento de retirada de la pelusa de una tela de tricotado de algodón con pelusa formada en una lavadora grande (una tela de 6 cm x 8 cm de Cotton Smooth Knit Nº 3900, Nitto Boseki Co., Ltd. teñida de marrón por tinción reactiva en Tsuyatomo-Senko) se realizó usando el sobrenadante de cultivo obtenido en las siguientes condiciones:
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Condiciones de Ensayo
Máquina de ensayo: Launder Meter L-20 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón)
Temperatura: 40ºC
Tiempo: 120 minutos
Cantidad de solución de reacción: 100 ml
pH de reacción: pH 7,0 (5 mmol/l de tampón fosfato; preparado usando agua corriente)
Cantidad de agente reductor: 1,2 \mug/ml
Tipo de agente reductor: tiosulfato sódico pentahidrato (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.); sulfito sódico (anhídrido) (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.); y tiourea (Kanto Kagaku, Co., Ltd.).
A cada una de las soluciones de tratamiento, se añadieron cuatro bolas de goma de aproximadamente 16 g junto con la solución enzimática.
La cantidad de la solución enzimática necesaria para retirar aproximadamente el 50% de la pelusa formada en base a evaluación visual se determinó en cada uno de los dos casos de adición y no adición de los diversos agentes reductores. Por lo tanto, se obtuvo un valor dividiendo la cantidad de la solución enzimática necesaria para retirar aproximadamente el 50% de la pelusa cuando no se añade el agente reductor por la cantidad cuando se añade cada uno de los diversos agentes reductores, y el valor obtenido se definió como una proporción de mejora de la actividad de retirada de la pelusa por la adición de cada uno de los diversos agentes reductores. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
2 
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A partir de los resultados de la Tabla 2, se halla que la actividad de retirada de la pelusa del sobrenadante de cultivo obtenido expresando y secretando RCE I en Humicola insolens se mejoraba por cualquiera de los anteriores agentes reductores.
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Ejemplo 3 Efecto de mejora de la actividad de retirada de la pelusa de RCE I expresada en Humicola por la adición de agente reductor con diversas concentraciones
La endoglucanasa RCE I se expresó en Humicola insolens de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos D3 y D4 del documento WO00/24879. El tratamiento de retirada de la pelusa de una tela de tricotado de algodón con pelusa formada en una lavadora grande (una tela de 6 cm x 8 cm de Cotton Smooth Knit Nº 3900, Nitto Boseki Co., Ltd. teñida de marrón por tinción reactiva en Tsuyatomo-Senko) se realizó usando el sobrenadante de cultivo obtenido en las siguientes condiciones:
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Condiciones de Ensayo
Máquina de ensayo: Launder Meter L-20 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón)
Temperatura: 40ºC
Tiempo: 120 minutos
Cantidad de solución de reacción: 100 ml
pH de reacción: pH 7,0 (5 mmol/l de tampón fosfato; preparado usando agua corriente)
Tipo de agente reductor: tiosulfato sódico pentahidrato (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.)
Cantidad de agente reductor: de 0,15 a 150 \mug/ml
A cada una de las soluciones de tratamiento, se añadieron cuatro bolas de goma de aproximadamente 16 g junto con la solución enzimática.
La cantidad de la solución enzimática necesaria para retirar aproximadamente el 50% de la pelusa formada en base a evaluación visual se determinó en cada uno de los casos de adición de diversas concentraciones del agente reductor. Por lo tanto, se obtuvo un valor dividiendo la cantidad de la solución enzimática necesaria para retirar aproximadamente el 50% de la pelusa cuando no se añade el agente reductor por la cantidad cuando se añade cada una de las diversas concentraciones del agente reductor, y el valor obtenido se definió como una proporción de mejora de la actividad de retirada de la pelusa por la adición de cada una de las diversas concentraciones del agente reductor. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
3
A partir de los resultados de la Tabla 3, se halla que la actividad de retirada de la pelusa del sobrenadante de cultivo obtenido expresando y secretando RCE I en Humicola insolens se mejoró por la adición del agente reductor que tiene un amplio intervalo de concentración de 0,3 \mug/ml a 150 \mug/ml o más.
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Ejemplo 4 Producción de preparación de celulasa RCE I que comprende agente reductor
Después de mezclar las siguientes materias prima mezclando las proporciones descritas en la Tabla 4, se añadió una cantidad apropiada de agua a las mismos, y se amasó la mezcla. El producto obtenido se sometió a un sedimentador de disco para el moldeo, y el producto obtenido por moldeo por inyección se convirtió en una forma de partícula usando un marumerizer (Fuji Paudal Co., Ltd.) seguido de secado y tamizado del producto para obtener un producto granulado.
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TABLA 4
4 
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El producto en polvo de celulasa RCE I se preparó concentrando el sobrenadante de cultivo de RCE I expresado en Humicola insolens usando ultrafiltración, de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos D3 y D4 del documento WO00/24879, seguido de secado por pulverización.
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Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona una preparación de celulasa que tiene una actividad endoglucanasa derivada de Zygomycetes drásticamente mejorada añadiendo un agente reductor en la preparación. Cuando la preparación de celulasa se usa en el tratamiento de telas (tal como la reducción de la pelusa de tela que contiene celulosa, la mejora del tacto y el aspecto, el aclarado del color, variación localizada de color, o suavizado), el destintado de papel residual, o el procesamiento para mejorar el refino de pulpa de papel, cada uno de los anteriores tratamientos puede realizarse con una cantidad menor de enzima, reduciendo de este modo de forma significativa los costes.
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Texto libre de la lista de secuencias
Las características de "Secuencia Artificial" se describen en el identificador numérico <223> en la Lista de Secuencias. Más particularmente, la secuencia de bases de la SEC ID Nº 9 es una secuencia de codones optimizados correspondiente a la proteína RCE I (SEC ID Nº 1).
<110> MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.
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<120> Preparaciones de celulasa que contienen agente reductor y procedimiento para tratar telas
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<130> MEJ-682
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<150> JP 2001-384037
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<151> 18-12-2001
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<160> 9
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 338
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<212> PRT
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<213> Rhizopus oryzae CP96001
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (-23) .. (-1)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (1) .. (315)
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<400> 1
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5
6
7 
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<210> 2
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<211> 366
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<212> PRT
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<213> Rhizopus oryzae CP96001
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (-23) .. (-1)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (1) .. (343)
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<400> 2
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8
9 
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<210> 3
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<211> 360
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<212> PRT
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<213> Rhizopus oryzae CP96001
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (-23) .. (-1)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (1) .. (337)
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<400> 3
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11
12 
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<210> 4
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<211> 338
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<212> PRT
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<213> Mucor circinelloides CP99001
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (-22) .. (-1)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (1) .. (316)
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<400> 4
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13
14 
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<210> 5
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<211> 387
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<212> PRT
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<213> Mucor circinelloides CP99001
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (-22) .. (-1)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (1) .. (365)
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<400> 5
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15
16 
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<210> 6
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<211> 346
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<212> PRT
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<213> Phycomyces nitens CP99002
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (-19) .. (-1)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (1) .. (327)
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<400> 6
17
18 
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<210> 7
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<211> 1257
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<212> ADN
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<213> Humicola insolens 
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<220>
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<221> intrón
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<222> (453) .. (509)
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<400> 7
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19 
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<210> 8
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<211> 1720
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<212> ADN
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<213> Trichoderma viride 
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<220>
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<221> intrón
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<222> (500) .. (682)
\newpage
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<400> 8
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20 
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<210> 9
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<211> 1043
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de codones optimizados correspondiente a la proteína RCE I (SEC ID Nº 1)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (16) .. (1032)
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (16) .. (84)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (85) .. (1029)
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<400> 9
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21
23

Claims (13)

1. Una preparación de celulasa que comprende un agente reductor y una proteína que consta de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, 4, ó 6.
2. La preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene del 0,01 al 50% en peso del agente reductor en la preparación de celulasa.
3. La preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente reductor es tiosulfato sódico, sulfito sódico, o tiourea.
4. La preparación de celulasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un gránulo o líquido estabilizado.
5. Un procedimiento para tratar telas que contienen celulosa, que comprende la etapa de tratar la tela con la preparación de celulasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para mejorar una propiedad de la tela.
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la mejora de la propiedad de la tela es el aclarado del color.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la mejora de la propiedad de la tela es la retirada de la pelusa.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la mejora de la propiedad de la tela es la adición de un aspecto y textura tipo lavado a la piedra.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la mejora de la propiedad de la tela es la mejora del tacto y el aspecto.
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la mejora de la propiedad de la tela es el suavizado de la tela.
11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que el tratamiento de la tela con la preparación de celulasa se realiza remojando o aclarando la tela.
12. Un procedimiento para destintar papel residual, que comprende la etapa de tratar el papel residual con la preparación de celulasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con un agente de destintado.
13. Un procedimiento para mejorar el refino de pulpa de papel, que comprende la etapa de tratar la pulpa de papel con la preparación de celulasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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