ES2314665T3

ES2314665T3 - Deteccion de drogas del grupo metanfetamina.

Info

Publication number: ES2314665T3
Application number: ES05748983T
Authority: ES
Inventors: Ahmed Mohammed Taki Jehanli
Original assignee: Cozart Bioscience Ltd
Current assignee: Concateno UK Ltd
Priority date: 2004-06-14
Filing date: 2005-06-10
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2025-06-10
Also published as: WO2005121793A3; WO2005121793A2; CN1977166B; EP1756575B1; GB2404022B; EP1756575A2; AU2005252868B2; DE602005010579D1; US7888040B2; GB2404022A; ATE412179T1; GB2404022A9; GB2404022A8; GB0413225D0; CN1977166A; US20080286816A1; HK1097320A1; AU2005252868A1

Abstract

Un procedimiento para detectar si una muestra líquida contiene una o más drogas del grupo metanfetamina que comprende: (a) poner en contacto dicha muestra con (i) un conjugado de pseudoefedrina/portador en el que la pseudoefedrina esté asociada por medio de su grupo hidroxilo al portador y (ii) un anticuerpo que sea capaz de enlazarse tanto con una o más drogas del grupo metanfetamina como con dicho conjugado; y (b) determinar si el enlace de dicho anticuerpo a dicho conjugado se ve reducido por la presencia de dicha muestra, siendo indicativa una reducción en el enlace de que la muestra contiene una droga del grupo metanfetamina.

Description

Detección de drogas del grupo metanfetamina.

La invención versa acerca de la detección de metanfetamina y de drogas de diseño de tipo éxtasis en muestras de prueba, como las derivadas de matrices biológicas, composiciones ambientales y superficies. En particular, la invención versa acerca de procedimientos y reactivos para su uso en el laboratorio y para realizar pruebas en el punto de atención e in situ de tales drogas.

Antecedentes de la invención

La metanfetamina es un potente estimulante adictivo del sistema nervioso central, al igual que del sistema nervioso periférico. Es similar en acción a la anfetamina, pero es más potente. Ambas drogas son derivados de la feniletilamina (véase la Figura 1), igual que las drogas de diseño de tipo metanfetamina, incluyendo el éxtasis (3,4-metilenodioximetanfetamina, MDMA), la (+/-)-N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-butanamina (MBDB) y la (+/-)-3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA), y otras. Debido a su potente efecto estimulante, se abusa mucho de estas drogas.

Tales drogas se detectan normalmente en la orina, la sangre, el sudor, el fluido oral y el cabello. Para este fin hay disponibles distintos tipos de pruebas inmunológicas. Las pruebas utilizan generalmente anticuerpos (policlonales y monoclonales) a la anfetamina y a la metanfetamina producidos vacunando animales con derivados de la droga asociados a una proteína portadora (por ejemplo, albúmina de suero bovino) por medio de un grupo funcional ligado al grupo fenil de la droga, en particular la posición para. La prueba inmunológica utilizará entonces estos anticuerpos y los mismos derivados de la droga vinculados a una marca, que puede ser, por ejemplo, una proteína, una enzima, una marca radiactiva o una marca de fluoresceína. Son numerosas las publicaciones de la técnica anterior en esta especialidad que abordan tanto la producción de anticuerpos como los derivados marcados de las drogas, y hay disponibles pruebas inmunológicas comerciales afines, como los sistemas de Abbott y Roche (EP 0371253, EP 0279213, EP 1167976, US 4329281, US 4041076, US 4067774, US 3996344, US 4016146 y WO 02057739). Otras formas de hacer anticuerpos específicos utilizan derivados de drogas ligados a una proteína portadora por medio de un extremo alquil-alifático (utilizando 4-aminobutil anfetamina y 4-aminobutil metanfetamina) (EP 0359063 y Analytical Biochemistry, 1999, volumen 274, páginas 118-124). La prueba inmunológica se realiza usando este anticuerpo y el mismo derivado ligado a una marca. También se tiene noticia de pruebas específicas para las drogas de tipo éxtasis. La patente US 2003207469, asignada a Microgenics Corporation, describe el uso de un análogo de la droga del éxtasis, un derivado de 2-amino-metilenodioxifenil, para su asociación con una proteína portadora para la vacunación y para la producción de un análogo marcado.

Es deseable que las pruebas inmunológicas para las drogas de tipo metanfetamina y éxtasis muestren especificidad para las drogas ilícitas. Esto es importante, puesto que se emplean muchos análogos de la feniletilamina en medicamentos que se compran sin receta, como los anticongestivos (jarabe para la tos). La lista es extensa, e incluye las efedrinas, las pseudoefedrinas, la fenilpropanolamina y la fenileferina. Algunas de las marcas populares son Sudafed®, Contact®, el inhalador Vicks® y las tabletas Primatine®. Además, los compuestos como la tiramina (4-hidroxi-feniletilamina) (véase la Figura 1) pueden estar presentes de forma natural en muestras biológicas sometidas a pruebas en busca de anfetaminas/metanfetaminas. Para que sean útiles, sería deseable que las pruebas inmunológicas tuviesen menos de un 0,4% de reactividad cruzada con la tiramina (EP 0371253). Las pruebas inmunológicas conocidas en la actualidad que utilizan derivados del éxtasis tienen la limitación de no ser capaces de detectar la metanfetamina, especialmente a los niveles reducidos que pueden existir en los fluidos biológicos distintos de la orina (por ejemplo, el fluido oral). Las pruebas inmunológicas basadas en el empleo de anticuerpos a los derivados de las drogas ligados a una proteína portadora mediante el anillo fenílico sufren de falta de especificidad para la metanfetamina y están sujetas a la interferencia de los fármacos lícitos mencionados anteriormente. La prueba de Abbott requiere un tratamiento previo de la muestra para eliminar o reducir una indeseable reactividad cruzada. Las muestras se tratan con periodato de sodio para eliminar la reactividad cruzada con fármacos como las efedrinas, la pseudoefedrina y la fenilpropanolamina, al igual que con la tiramina (EP 0371253). Se enumeran más de cuarenta medicinas que causan resultados falsos positivos en las pruebas de orina para la detección de metanfetamina (www.erowid.org/).

La falta de especificidad de las pruebas inmunológicas de anfetamina/metanfetamina se ha convertido en causa de inquietud (Journal of Analytical Toxicology, 2003, volumen 27, páginas 265-269, y las referencias contenidas en el artículo). Un estudio reciente (Journal of Forensic Science, 2004, volumen 49, páginas 160-164) que evaluaba los kits de prueba disponibles comercialmente en lo relativo a la interferencia por parte de la efedrina, la pseudoefedrina y la fenilpropanolamina mostró un nivel inaceptable de interferencia y concluyó que los fabricantes minusvaloran el nivel de reactividad cruzada indeseable manifestado por sus kits.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona ahora pruebas inmunológicas que son sumamente específicas para la detección, en muestras biológicas, de la metanfetamina y de otras drogas del grupo metanfetamina objeto de abuso, como el éxtasis, sin interferencia significativa de otros derivados de la feniletilamina, que dependen del empleo de un derivado de la pseudoefedrina, más particularmente de la pseudoefedrina asociada a un portador mediante su grupo hidroxilo. Sorprendentemente, el inventor descubrió que tal conjugado en el que la pseudoefedrina va ligada a una proteína portadora como la albúmina de suero bovino (BSA) reaccionaba enérgicamente con anticuerpos monoclonales a la metanfetamina. Además, y de forma totalmente inesperada, se descubrió que el enlace de un anticuerpo tal a la pseudoefedrina inmovilizada de BSA era inhibido en competición por la metanfetamina y el éxtasis en los fluidos biológicos, pero no de forma significativa por las (+/-)-pseudoefedrinas, (+/-)-efedrinas y varios otros análogos de la feniletilamina que comúnmente se reconoce que son interferentes potenciales en la detección de la metanfetamina, incluyendo la tiramina, incluso en concentraciones relativamente muy elevadas. Esta observación provee el fundamento de nuevos tipos de pruebas inmunológicas de competición muy específicas para la detección de la metanfetamina, el éxtasis y otras drogas pertenecientes al grupo metanfetamina de las que se abusa.

En consecuencia, la invención proporciona un procedimiento para detectar si una muestra líquida contiene una o más drogas del grupo metanfetamina, especialmente al menos la metanfetamina, el éxtasis, la MBDB y la MDEA, y lo más deseable es que detecte al menos la metanfetamina, el éxtasis y la MBDB en aproximadamente \geq 15 a 30 ng/ml, comprendiendo:

(a): la puesta en contacto de dicha muestra con (i) un conjugado de pseudoefedrina/portador en el que la pseudoefedrina esté asociada al portador por medio de su grupo hidroxilo y (ii) un anticuerpo que sea capaz de unirse tanto a una o a más drogas del grupo metanfetamina como a dicho conjugado; y

(b): la determinación de si la unión de dicho anticuerpo a dicho conjugado se ve reducida por la presencia de dicha muestra, siendo indicativa una reducción en la unión de que la muestra contiene una droga del grupo metanfetamina.

Típicamente, el anticuerpo empleado será un anticuerpo anti-metanfetamina que se una también a otras drogas del grupo metanfetamina que se reconozcan como sustancias objeto de abuso, incluyendo el éxtasis y las drogas de diseño MBDB y MDEA, de tipo éxtasis. Éste puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-metanfetamina obtenido vacunando ratones con el conjugado IgG de metanfetamina-bovina, como el distribuido por East Coast Biological, EE. UU. (Nº de catálogo DU300) y empleado en los ejemplos. Sin embargo, será perfectamente evidente que pueden emplearse otros anticuerpos, tal como se expone más adelante.

Se entenderá que la expresión "droga del grupo metanfetamina" incluye a la propia metanfetamina y a otras drogas que se clasifican con la metanfetamina como estimulantes adictivos a base de derivados de la feniletilamina, incluyendo el éxtasis y otras drogas de diseño de tipo éxtasis, incluyendo la MBDB y la MDEA, que pueden ser sustancias objeto de abuso. Puede obtenerse información adicional sobre tales drogas, por ejemplo, en Annals of Clinical Biochemistry (1995) volumen 32, páginas 123-153. Comparada con la anfetamina, la metanfetamina tiene un grupo amino primario sustituido por un grupo amino secundario y esta es también una característica de las drogas del grupo metanfetamina objeto de abuso, tal como se han enumerado anteriormente y tal como se muestran en la Figura 1. Por lo tanto, se entenderá que la expresión "droga del grupo metanfetamina" excluye la anfetamina, la 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA) y la beta-feniletilamina. También se entenderá que excluye las efedrinas, las pseudoefedrinas, la fenilpropanolamina, la fentermina y la tiramina, las estructuras de las cuales se dan también en la Figura 1. Esta lista no es exhaustiva, sino meramente ilustrativa de los análogos de la feniletilamina que pueden distinguirse, mediante los procedimientos de prueba de la invención, de la metanfetamina y de otras drogas afines objeto de abuso que se desea detectar y que pueden clasificarse como "droga del grupo metanfetamina".

Más en particular, tal prueba es capaz de detectar tanto la metanfetamina, como el éxtasis (MDMA), la MBDB y la MDEA, pero mostrando menos de un 0,4% de reactividad cruzada con ya sea la (+)- o (-)-efedrina, o con la (+)- o (-)-pseudoefedrina, la fenilpropanolamina, la fentermina, la tiramina, la anfetamina, la MDA y la beta-fenilamina, a una concentración de hasta 10.000 ng/ml en la muestra. La reactividad cruzada con las efedrinas, las pseudoefedrinas, la fenilpropanolamina, la fentermina y la tiramina puede ser menor que 0,1% a la misma concentración. De aquí que sea muy bajo el riesgo de falsos positivos que resulten de cualquier cantidad de efedrina, pseudoefedrina, fenilpropanolamina, fentermina o tiramina que haya en una muestra biológica, como una muestra de orina o una muestra oral.

Un procedimiento de prueba de la invención puede, por ejemplo, adoptar el formato de una prueba convencional de competición ELISA, en la que el anticuerpo o el conjugado de pseudoefedrina/portador se inmovilizan en un soporte sólido. Alternativamente, tal prueba puede adoptar la forma de una prueba de inmunocromatografía de flujo lateral que utilice una tira de prueba porosa. En este caso, el reactivo inmovilizado para la detección del analito puede ser nuevamente un anticuerpo inmovilizado o un conjugado inmovilizado de pseudoefedrina/portador.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1: Estructuras químicas de compuestos ilustrativos de drogas del grupo metanfetamina y de otros compuestos que son interferentes potenciales en las pruebas de detección de tales compuestos en los procedimientos de la técnica anterior.

Figura 2: Perfil de titración del anticuerpo monoclonal anti-metanfetamina en función de la pseudoefedrina BSA inmovilizada.

Figura 3: Curvas normalizadas típicas obtenidas mediante prueba ELISA de competición conforme a la invención para la metanfetamina y el éxtasis.

Figura 4: Perfil de titración de la peroxidasa de rábano picante -pseudoefedrina en función del anticuerpo inmovilizado anti-metanfetamina.

Figura 5: Diagrama que ilustra una tira de prueba de flujo lateral para su empleo en la realización de una prueba de inmunocromatografía de flujo lateral conforme a la invención en la que (1) es una tira porosa de una hoja de nitrocelulosa laminada sobre un soporte de respaldo, (2) es la zona de detección del analito que presenta pseudoefedrina BSA inmovilizada, (3) es la zona de control que presenta el anticuerpo inmovilizado para capturar el anticuerpo marcado, (4) es un tampón para la liberación de la marca que libera el anticuerpo marcado en el líquido aspirado dentro de este tampón procedente del tampón receptor (5) y (6) es un tampón de absorción.

Descripción detallada de la invención Conjugados de pseudoefedrina

Los conjugados de pseudoefedrina adecuados para el uso en la realización de pruebas conforme a la invención son cualquier conjugado tal en el que la pseudoefedrina está asociada por medio de su grupo hidroxilo a un portador tal que sea capaz de enlazar anticuerpos a una o más drogas del grupo metanfetamina. De forma deseable, el conjugado de pseudoefedrina que enlace el anticuerpo anti-metanfetamina (como, por ejemplo, el anticuerpo anti-metanfetamina suministrado por East Coast Biological, EE. UU.) será también capaz de enlazar el éxtasis y otras drogas de tipo éxtasis, incluidas la MBDB y la MDEA. Como ya se ha observado antes, este anticuerpo ejemplifica los anticuerpos anti-metanfetamina adecuados obtenibles usando un conjugado de metanfetamina-proteína como inmunógeno. La pseudoefedrina puede ser (+)-pseudoefedrina o (-)-pseudoefedrina, o una mezcla de éstas.

En una realización, el portador puede ser una proteína. Puede usarse cualquier proteína portadora, incluyendo, por ejemplo, aparte de la BSA, la ovoalbúmina, las gamma globulinas (IgG) y la tiroglobulina. Una proteína portadora adecuada puede ser una enzima, por ejemplo la peroxidasa de rábano picante. En este caso, el portador puede también servir de marca detectable en una prueba de la invención. En otra realización, el portador puede ser un homopolímero o un heteropolímero que contenga cadenas laterales de aminoácidos como la polilisina, la poliornitina o la poli-(glutamina, lisina).

El conjugado de pseudoefedrina puede también marcarse directa o indirectamente con una marca detectable que no esté en el portador. En este caso, la marca puede unirse a cualquier porción del conjugado, con lo que se retiene la capacidad de enlazar anticuerpos adecuados, por ejemplo una proteína portadora. Las marcas adecuadas incluyen, por ejemplo, los radioisótopos como el ^{125}I, el ^{32}P o el ^{35}S, las marcas micronizadas como el oro, las marcas fluorescentes como la fluoresceína, y la biotina.

El portador puede estar asociado a la pseudoefedrina directamente usando un reactivo de entrecruzamiento o mediante un separador. Para asociar grupos hidroxilo a grupos amino se conocen muchos reactivos de entrecruzamiento (para una reseña, véase "Bioconjugate Techniques", de G. T. Hermanson, 1996, Academic Press). En los ejemplos, se dan tres enfoques tales para entrecruzar una pseudoefedrina a una proteína portadora que emplean dimetil aminopiridina/disuccinimidilo carbonato, formaldehído y sulfona de vinilo. Sin embargo, son igualmente adecuados otros procedimientos. Los separadores adecuados incluyen los separadores de ácido aminocapróico, los separadores de aminohexano y los separadores de etilamina. El separador puede estar asociado al portador mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, cuando el portador es una proteína, el separador puede estar asociado a una cadena lateral amino o a la mitad de carbohidrato de la proteína portadora.

Anticuerpos

Como se ha indicado anteriormente, un anticuerpo adecuado para su uso en un procedimiento de la invención será capaz de enlazarse específicamente a un conjugado de pseudoefedrina, como se ha descrito anteriormente, en el que la pseudoefedrina es conjugada covalentemente a un portador por medio de su grupo hidroxilo y también será capaz de enlazarse específicamente a una o más drogas del grupo metanfetamina. Preferiblemente, el anticuerpo empleado será capaz de enlazarse específicamente tanto con la metanfetamina, como con el éxtasis (MDMA), la MBDB y la MDEA. Lo más deseable es que tales enlaces sean de tal naturaleza que, al menos tanto la metanfetamina como la MDMA y la MBDB sean susceptibles de detección de aproximadamente \geq 15 hasta 30 ng/ml, por ejemplo de aproximadamente \geq 15 hasta 25 ng/ml en una prueba ELISA de competición.

"Enlazarse específicamente" significa que el anticuerpo se enlaza con más fuerza o preferentemente a una o más drogas del grupo metanfetamina en una prueba de competición de la invención, pero muestra poca o ninguna reactividad cruzada, por ejemplo menos de 0,4% de reactividad cruzada, ya sea con (+)-efedrina, (-)-efedrina, (+)-pseudoefedrina, (-)-pseudoefedrina, fenilpropanolamina, fentermina, tiramina, anfetamina, MDA o beta-feniletilamina, por ejemplo en una concentración de hasta 10.000 ng/ml. De forma deseable, el anticuerpo exhibirá menos de un 0,1% de reactividad cruzada con efedrinas, pseudoefedrinas, fenilpropanolamina, fentermina y tiramina a la misma concentración, por ejemplo, como se determina con una prueba ELISA de competición, como se ilustra en los ejemplos.

Como ya se ha indicado anteriormente, un anticuerpo adecuado puede ser, por ejemplo, un conocido anticuerpo anti-metanfetamina disponible comercialmente, por ejemplo el anticuerpo anti-metanfetamina monoclonal al que se ha aludido anteriormente y en los ejemplos. Sin embargo, se apreciará que anticuerpos adecuados, ya sean policlonales o monoclonales, pueden ser producidos mediante técnicas conocidas, por ejemplo usando conjugados de metanfetamina-proteína.

Se prevé que puedan generarse anticuerpos adecuados usando un conjugado de pseudoefedrina como inmunógeno, como se ha descrito previamente, en el que la pseudoefedrina esté asociada a un portador mediante su grupo hidroxilo. Se postula que tal asociación de la pseudoefedrina a, por ejemplo, la BSA cause un cambio en la configuración del compuesto de tal modo que los anticuerpos puedan reconocer esta estructura con una afinidad mucho más alta que la pseudoefedrina libre.

Un anticuerpo para su uso en un procedimiento de la invención puede ser marcado directa o indirectamente, por ejemplo por medio de anticuerpos secundarios marcados. Las marcas adecuadas para este fin son cualquier marca empleada convencionalmente en pruebas inmunológicas, incluyendo marcas radiactivas, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas tales como la peroxidasa de rábano picante y la biotina.

El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se entenderá que se extiende a los fragmentos del anticuerpo, por ejemplo a los fragmentos Fab, Fab' y Fv, que retienen la capacidad de enlace del anticuerpo y que podrían ser utilizados en un procedimiento de la invención.

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Pruebas de competición

La presente invención utiliza conjugados y anticuerpos de pseudoefedrina tal como se ha descrito anteriormente en pruebas inmunológicas de competición para la detección de una o más drogas del grupo metanfetamina. Se apreciará que las drogas detectadas se determinarán por la especificidad del anticuerpo empleado, pero, como se ha indicado anteriormente, será deseable que incluyan la metanfetamina, el éxtasis, la MBDB y la MDEA. Especialmente preferida es una prueba que detecte la metanfetamina y que proporcione una elevada reactividad cruzada para el éxtasis y la MBDB, por ejemplo una reactividad cruzada superior al 50% a 15 hasta 25 ng/ml, como sea determinable en una prueba ELISA de competición.

Un procedimiento de la invención puede adoptar cualquier formato para efectuar una prueba inmunológica de competición. En enlace droga-anticuerpo puede ocurrir en disolución seguida por la separación de la marca enlazada compleja. Uno de entre el anticuerpo capaz de enlazarse con la droga que ha de detectarse y el conjugado de pseudoefedrina puede enlazarse a un soporte sólido, por ejemplo, un soporte sólido que comprenda nitrocelulosa o plástico, por ejemplo, la superficie de un depósito de plástico, o cuentas sólidas, por ejemplo cuentas de plástico o de vidrio. Así, un procedimiento de la invención puede ajustarse a un formato convencional ELISA de competición. Un soporte sólido adecuado para este propósito puede tener la forma de pocillos de una placa de microtitración o cuentas sólidas. Alternativamente, uno de entre el anticuerpo para enlazarse con la droga o el conjugado de pseudoefedrina puede inmovilizarse en una tira o lámina porosa de prueba adecuada para la inmunocromatografía de flujo lateral, por ejemplo una tira o lámina de prueba que comprenda nitrocelulosa. Tal tira o lámina de prueba puede, por ejemplo, tener la forma de nitrocelulosa enlazada en un soporte de respaldo, por ejemplo una lámina de plástico. Tal tira o lámina de prueba puede ser una tarjeta de nitrocelulosa.

Las muestras adecuadas de prueba estarán en forma líquida para permitir la interacción con el anticuerpo. Una muestra puede ser una muestra fluida derivada de un sujeto al que se somete a prueba, por ejemplo una muestra consistente en orina, sangre, sudor, fluido oral (saliva) o cabello, o derivada de los mismos. La muestra puede ser una muestra biológica diluida. Particularmente preferido, por ejemplo, es el uso de fluido oral diluido en tampón, por ejemplo, fluido oral diluido en Tampón de Dilución de Fluido Oral de Cozart (producto de Cozart Bioscience CR-BUFF). Una muestra adecuada puede derivarse de una fuente o frotis ambiental, por ejemplo un frotis puesto en contacto con fluido oral de la boca o con una superficie de la que se sospecha que pueda tener contaminación por drogas. La muestra puede obtenerse disolviendo un polvo que ha de testearse para comprobar la presencia de una droga del grupo metanfetamina en una solución tampón. Las referencias a las que se puede aludir en cuanto a la preparación de muestras incluyen "Drug Monitoring in Nonconventional Biological Fluids and Matrices" en Clinical Pharmacokinetics 1996, volumen 30, páginas 211-228 y "Testing for Drugs of Abuse in Hair" en Forensic Science Review 1997, volumen 9, páginas 23-25.

Las pruebas ELISA de competición y de inmunocromatografía de flujo lateral conforme a la invención se exponen ahora más plenamente a continuación.

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ELISA de competición

En una realización, tal procedimiento puede llevarse a cabo recubriendo una superficie adecuada, por ejemplo pocillos de microtitración, con un conjugado adecuado de pseudoefedrina en el que la pseudoefedrina esté asociada a la BSA por medio de su grupo hidroxilo. En este caso, un anticuerpo marcado apropiado, típicamente un anticuerpo anti-metanfetamina, entrará en contacto con el conjugado junto con la muestra de la prueba. El anticuerpo puede estar marcado directamente (por ejemplo, puede emplearse un anticuerpo anti-metanfetamina marcado con peroxidasa de rábano picante) o indirectamente (por ejemplo, mediante el enlace de anticuerpos secundarios marcados). Alternativamente, la superficie se recubrirá con un anticuerpo adecuado y un conjugado detectable puesto en contacto con la superficie junto con la muestra de prueba. En este caso, el portador del conjugado puede también ser, o comprender, una marca detectable; por ejemplo, el portador puede ser una enzima detectable, como la peroxidasa de rábano picante.

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Procedimientos de flujo lateral

Las pruebas de inmunocromatografía de flujo lateral conforme a la invención pueden llevarse a cabo usando cualquier forma conocida de dispositivos de flujo lateral o dependiendo del enlace de anticuerpos para la detección de analitos en competición. Tales pruebas pueden efectuarse usando la metodología descrita en la patente GB 2339615, de Cozart Bioscience Limited, en la Solicitud Internacional correspondiente publicada WO 00/04831 y en el Journal of Forensic Science 2001, volumen 46, páginas 1214-1220.

Una característica común de los dispositivos de flujo lateral para la detección de analitos es la provisión de una tira o lámina de prueba que comprende un material seco poroso como la nitrocelulosa por el que puede pasar una muestra líquida para que alcance una o más zonas diferenciadas de detección de analitos. Cada zona tal presenta un reactivo específico de enlace inmovilizado. Para el fin de una prueba de inmunocromatografía de flujo lateral conforme a la invención, se proporcionará al menos una zona tal de detección de analitos que presente ya sea un conjugado adecuado de pseudoefedrina o un anticuerpo capaz de enlazarse con tal conjugado y una o más drogas del grupo metanfetamina, como se ha expuesto anteriormente. Tal tira o lámina de prueba también tendrá, unida a sí misma, o formando parte integral de la misma, una zona para la liberación de la marca que es capaz de liberar dentro del líquido aspirado dentro de esa zona ya sea el anticuerpo marcado, si dicha al menos una zona de detección de analitos presenta el conjugado inmovilizado, o el conjugado detectable si dicha al menos una zona de detección de analitos presenta el anticuerpo inmovilizado. Tales tiras de prueba adecuadas para efectuar procedimientos de flujo lateral para la detección de drogas en el ámbito de la invención constituyen un aspecto adicional de la invención.

Así, la invención proporciona también una tira o lámina de prueba para efectuar pruebas de inmunocromatografía de flujo lateral que tiene las siguientes características:

(i): una tira o lámina que comprende un material poroso seco, preferiblemente nitrocelulosa, teniendo inmovilizado sobre ella, en una zona de detección de analitos, un conjugado adecuado de pseudoefedrina, como se ha descrito anteriormente, o un anticuerpo adecuado, como se ha descrito anteriormente; y

(ii): unida a dicha tira o lámina que proporciona dicha zona de detección de analitos, o formando parte integral de la misma, una zona para la liberación de la marca que es capaz de liberar dentro del líquido aspirado dentro de esa zona ya sea dicho anticuerpo en forma marcada, si dicha zona de detección de analitos presenta el conjugado inmovilizado de pseudoefedrina, o, si dicha zona de detección de analitos presenta el anticuerpo inmovilizado, el conjugado detectable de pseudoefedrina. Tal conjugado detectable de pseudoefedrina puede ser, por ejemplo, un conjugado de pseudoefedrina-proteína marcado con oro o partículas de látex coloreado.

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Los ejemplos detallan pruebas de inmunocromatografía de flujo lateral conforme a la invención que emplean un conjugado inmovilizado de pseudoefedrina/portador. Sin embargo, también se contempla que puedan emplearse varios anticuerpos inmovilizados diferentes que tengan especificidades diferentes para diferentes drogas del grupo metanfetamina en zonas separadas de detección de analitos. Además de al menos una zona de detección de analitos para la detección de una o más drogas del grupo metanfetamina, una tira o lámina de prueba para la realización de pruebas de flujo lateral conforme a la invención también puede tener una o más zonas adicionales de detección de analitos para la detección de una o más drogas adicionales o de clases o grupos de drogas.

Se apreciará que en un dispositivo de flujo lateral, la zona de liberación de la marca será proximal a la zona o zonas de detección de analitos, teniendo en cuenta la dirección del flujo líquido. Puede tener la forma de un tampón unido a una tira o lámina que proporcione la zona o zonas de detección de analitos. También son perfectamente conocidos procedimientos para proporcionar en tal tira o lámina una zona integral para la liberación de la marca. Por ejemplo, una región de una tira de nitrocelulosa puede estar satinada, por ejemplo mediante la deposición de una disolución acuosa de azúcar o celulosa, y la zona así satinada puesta en contacto con el reactivo marcado (véase, por ejemplo, la Patente Europea Nº 0291194 y las Patentes Europeas afines 0560410 y 0560411).

Una tira o lámina de prueba para su empleo en un procedimiento de flujo lateral de la invención puede comprender además un miembro o tampón para la recepción de muestras proximal a la zona de liberación de marcas. Tal miembro o tampón para la recepción de muestras puede estar hecho de cualquier material embebedor capaz de absorber líquido rápidamente.

Típicamente, tal tira o lámina de prueba tendrá, más allá de la zona o zonas de detección de analitos, en la dirección del flujo líquido deseado a lo largo de la tira, o sea, distal con respecto a la zona o zonas de detección de analitos, una zona adicional de detección que presente un reactivo inmovilizado de enlace específico para proporcionar una zona de control. La zona de control sirve para indicar que el líquido de la muestra ha atravesado la zona o zonas previas de detección de analitos bajo condiciones adecuadas para la detección del analito. Por ejemplo, cuando la zona de liberación de marca proporciona anticuerpo marcado, la zona de control puede presentar un anticuerpo inmovilizado que sea capaz de enlazarse con el anticuerpo marcado.

Distal con respecto a las zonas de detección en la dirección del flujo líquido deseado, una tira o lámina de prueba de la invención puede comprender además un tampón absorbente para desechos (tampón final o de absorción).

La invención también se extiende a dispositivos de flujo lateral que incorporan una tira o lámina de prueba para realizar un procedimiento de la invención, por ejemplo un dispositivo portátil de análisis, como se describe en el documento WO 00/04381, de Cozart Bioscience Limited.

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Kits

En otro aspecto adicional, la invención también proporciona kits para efectuar un procedimiento de la invención en competiciones que comprende un conjugado adecuado de pseudoefedrina, tal como se describe en este documento, y un anticuerpo capaz de enlazarse tanto con dicho conjugado como con una o más drogas del grupo metanfetamina, por ejemplo un anticuerpo anti-metanfetamina que también se enlace con drogas de tipo éxtasis, incluyendo el éxtasis, la MBDB y la MDEA. O bien el conjugado de pseudoefedrina o bien el anticuerpo puede estar marcado directamente con una marca detectable. En el caso del conjugado de pseudoefedrina, como ya se ha indicado más arriba, puede ser posible que la parte portadora del conjugado haga de marca detectable. Alternativamente, pueden proporcionarse medios para marcar indirectamente ya sea el conjugado o el anticuerpo que se enlaza con la droga, por ejemplo un anticuerpo secundario marcado. O bien el conjugado o bien el anticuerpo puede inmovilizarse en un soporte sólido. Por ejemplo, el kit puede comprender ya sea el conjugado o el anticuerpo inmovilizado en una tira de prueba, como se ha descrito más arriba, para efectuar la inmunocromatografía de flujo lateral. Tal tira de prueba puede insertarse en un habitáculo que tenga una ventana o ventanas que den a la zona o zonas de detección del analito, o junto con tal habitáculo.

Un kit de la invención puede comprender otros componentes. Por ejemplo, cuando la muestra de prueba haya de recogerse de su sujeto sometido a la prueba, el kit puede comprender además un medio para la recogida de fluido, por ejemplo un dispositivo o frotis para la recogida de fluido oral, un recipiente tal como un recipiente adecuado para la recogida de sangre u orina, y/o una pipeta. Un kit para su empleo en un procedimiento basado en la prueba ELISA puede además comprender componentes seleccionados de una disolución de lavado y un substrato enzimático, por ejemplo la tetrametilbencidina (TMB) si se emplea la marca de peroxidasa de rábano picante. Un kit para su uso en un procedimiento de flujo lateral puede incluir un dispositivo portátil de análisis en el que, como se ha descrito más arriba, puede haber un habitáculo para la detección de la marca enlazada en la zona o zonas de detección y un visualizador digital de los resultados. Los ejemplos ilustran la invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1a

Preparación de pseudoefedrina BSA que usa dimetil aminopiridina/disuccinimidilo carbonato

Se disolvieron 10 mg de (+)-pseudo-efedrina ((+)-(\Psi)-efedrina-HCl, producto número E-2750, Sigma Co., Poole, Inglaterra) u 8,0 mg de (-)-pseudoefedrina (producto Sigma-Aldrich Nº 287644) en 0,4 ml de dimetilformamida (DMF). Se añadieron gota a gota 88 mg de disuccinimidilo carbonato en 0,4 ml de DMF a la solución de efedrina. A la mezcla anterior se añadió muy lentamente, y gota a gota, dimetil aminopiridina (42 mg) en 0,4 ml de acetona. La solución fue removida durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Se disolvió BSA (60 mg) en 6 ml de 0,1 M de bicarbonato sódico. Se añadió lentamente la droga activada a la solución de BSA. Se siguió removiendo la solución a temperatura ambiente durante la noche. Entonces se dializó el conjugado proteínico de la droga durante tres días contra tampón fosfato salino, pH 7,3, que contenía un 0,05% de azida de sodio con varios cambios del tampón. Finalmente, la concentración de proteínas se determinó mediante la prueba de proteínas de Lowry, y el conjugado se almacenó a -20ºC.

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Ejemplo 1b

Preparación de BSA-ácido aminocapróico-pseudoefedrina

En muchos casos de pruebas inmunológicas para la localización de haptenos, puede lograrse mejor enlace de los anticuerpos aumentando la distancia entre la molécula de hapteno y la molécula portadora a la que está ligada. Se preparó BSA con un separador ligado como sigue: Disolver BSA (200) mg en 4 ml de 0,05 M MES/tampón NaOH, pH 5,0. Añadir ácido aminocapróico (ACA) (200 mg). Una vez que esté completamente disuelto el ACA, añadir 100 mg de N-hidroxisuccinimida en dimetil formamida (0,3 ml). Se inició entonces la conjugación del ACA con la BSA mediante la adición de 120 mg del agente reticulante soluble en agua carbodiimida EDAC en 0,2 ml de agua. La mezcla se removió durante 4 horas a temperatura ambiente; luego se añadieron 40 mg adicionales de EDAC en 0,1 ml de agua y la remoción continuó durante la noche a temperatura ambiente. El conjugado de BSA-ACA se separó del ACA libre mediante filtración en gel en una columna Sephadex^{RTM} G-50 mediana usando tampón fosfato salino, pH 7,3 para la elución. El pico de proteínas se agrupó y dializó contra 0,15 M NaCl durante 5 días cambiando el tampón todos los días. Por último, la concentración del conjugado se determinó mediante la prueba de proteínas de Lowry, y la proteína se diluyó a 10 mg/ml en 0,15 M NaCl y fue almacenada a -20ºC.

Después se preparó BSA-ACA-pseudoefedrina usando un procedimiento idéntico al descrito más arriba para la preparación de BSA-pseudoefedrina, pero usando BSA-ACA en lugar de BSA.

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Ejemplo 2 Preparación de BSA-pseudoefedrina usando formaldehído

Se disolvió albúmina de suero bovino (25 mg) en 2,5 ml de 0,1 M MES/tampón NaOH, pH 5,0. Se añadieron
4,0 mg de (+)-pseudoefedrina-HCl o 3,2 mg de (-)-pseudoefedrina en 0,2 ml de agua. Mientras se removía, se añadieron lentamente 0,5 ml de formaldehido al 37%. La solución fue removida durante la noche a temperatura ambiente. El conjugado de droga-BSA se purificó mediante filtración en gel en una columna Sephadex^{RTM} G50 M usando tampón fosfato salino, pH 7,3 como tampón para la elución. El pico de proteínas se agrupó, y la concentración del conjugado se determinó mediante la prueba de proteínas de Lowry.

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Ejemplo 3 Preparación de BSA-pseudoefedrina usando el procedimiento de la sulfona de vinilo

Se conjugó (+) o (-)-pseudoefedrina con albúmina de suero bovino usando sulfona de vinilo como se describe en Journal of Immunological Methods, 1995, 181:187-200.

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Ejemplo 4 Preparación de pseudoefedrina marcada con peroxidasa de rábano picante

Se disolvió peroxidasa de rábano picante (HRP, 22 mg) en 1 ml de tampón fosfato salino, pH 7,3. Se añadieron lentamente 0,1 ml de 0,088 M de periodato sódico. La solución se removió durante 20 minutos. La oxidación fue terminada mediante la adición de 0,1 ml de 1 M de glicol de etileno. La enzima oxidada fue purificada mediante filtración en gel usando una columna Sephadex G-50 M y 2 mM de tampón fosfato disodio/ácido cítrico, pH 5,0 como tampón eluyente. El pico de enzimas oxidadas se agrupó. Entonces se añadió 1 M de tampón de carbonato/bicarbonato sódico, de pH 10,0, a la solución enzimática hasta una concentración final de 0,1 M. Luego se añadieron 2 mg de diamina de etileno-HCl (ED) en 0,1 ml de agua, y se permitió que la unión prosiguiese durante 4 horas a temperatura ambiente. Se añadieron 0,5 ml de borohidruro de sodio (5 mg/ml) para estabilizar el enlace entre la diamina de etileno y la enzima. Se purificó entonces la HRP-ED mediante filtración en gel en una columna Sephadex G-50 M usando 0,15 M de NaCl como tampón eluyente.

Se activó la HRP-ED mediante sulfona de vinilo, y se unió a la pseudoefedrina como se ha descrito más arriba para la BSA-sulfona de vinilo-pseudoefedrina.

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Ejemplo 5 Prueba inmunosorbente ligada a enzimas (ELISA) para la detección de metanfetamina Evaluación del conjugado de BSA-pseudoefedrina

Se evaluó el conjugado usando ELISA. Se recubrieron placas de 96 pocillos para microtitración (Costar) con BSA-pseudoefedrina (5:g/ml en 0,05 M de tampón carbonato/bicarbonato sódico, pH 9,6, 100:1/depósito) durante la noche a temperatura ambiente. A continuación los pocillos se lavaron 3 veces con tampón fosfato salino, pH 7,3, que contenía un 0,05% de Tween^{RTM}-20 (tampón de lavado) y se mantuvieron en el mismo tampón durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron a los pocillos (100:1/depósito) disoluciones dobles de anticuerpo anti-metanfetamina monoclonal (East Coast Biological, EE. UU.) en tampón de lavado que contenía 10 mg/ml de BSA (tampón de prueba), y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los pocillos se lavaron 3 veces con tampón de lavado, y se añadió a los pocillos anticuerpo IgG de cabra antirratón marcado con peroxidasa de rábano picante (producto número A-4416, Sigma Co., Poole, Inglaterra) (disolución 1/2000 en tampón de prueba, 100:1/depósito) y la incubación continuó 30 minutos más. Los pocillos se lavaron como antes, y el enlace se reveló mediante la adición a los pocillos (100:1/depósito) del sustrato enzimático tetrametilbencidina (TMB). Después de 30 minutos de incubación, se detuvo el desarrollo del color mediante la adición de 1 M de ácido sulfúrico (100:1/depósito). La intensidad del color se midió a 450 nm. La Figura 2 muestra el perfil de titración del anticuerpo anti-metanfetamina monoclonal contra una placa recubierta de BSA-pseudoefedrina.

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Inhibición ELISA en competición (CELIA)

Luego se preparó una prueba ELISA de competición para evaluar la reactividad cruzada de drogas diversas con la metanfetamina. La prueba inmunológica se realizó como se ha señalado más arriba con las siguientes variaciones: después de recubrir y de mantener los pocillos de microtitración con BSA-pseudoefedrina, se coincubó anticuerpo anti-metanfetamina (1,5:g/ml en el tampón de prueba, 100:1/depósito) con concentraciones variables de las drogas en el tampón de prueba (25:1/depósito), y la prueba se realizó como se ha señalado más arriba. Se determinó la reactividad cruzada usando curvas normalizadas construidas con (+)-metanfetamina o éxtasis (MDMA) a 0, 15, 50 y 500 ng/mL. La Figura 3 muestra curvas normalizadas típicas. La Tabla 1 enumera la reactividad cruzada obtenida con varios compuestos. Es muy evidente la falta de reactividad de esta prueba con los dos isómeros de la efedrina y la pseudoefedrina (< 0,1%). Las drogas de diseño MDMA y MBDB, de tipo éxtasis, fueron detectadas perfectamente con esta prueba. La anfetamina, la tiramina y la fenilpropanolamina mostraron una reactividad cruzada muy baja en esta prueba (anfetamina < 0,4%; tiramina y fenilpropanolamina < 0,1%).

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TABLA 1

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Estos resultados demuestran que tal prueba inmunológica enzimática tiene suficiente sensibilidad como para ser usada para testear todo tipo de matrices biológicas para descubrir la presencia de drogas de tipo metilanfetamina, por ejemplo en orina, sangre, sudor, cabello y fluido oral.

Ejemplo 6 Evaluación del conjugado de peroxidasa de rábano picante-pseudoefedrina mediante prueba inmunológica enzimática

Se recubrieron placas de microtitración de 96 pocillos durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo anti-metanfetamina monoclonal (East Coast Biologicals, EE. UU.) a 5:g/ml, 100:1/depósito, en 50 mM de tampón carbonato/bicarbonato sódico, pH 9,6. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado y se mantuvo en el mismo tampón durante 30 minutos. Se añadieron disoluciones triples en el tampón de prueba del conjugado enzima-droga (100:1/depósito). Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó 3 veces y se añadió la solución de sustrato como se ha descrito antes. La Figura 4 muestra el perfil de titración obtenido con este conjugado. El conjugado retuvo tanto la actividad enzimática como la capacidad de enlazarse con el anticuerpo anti-metanfetamina inmovilizado, permitiendo su uso en la prueba inmunológica enzimática para la detección de drogas en las competiciones.

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Ejemplo 7 Prueba de inmunocromatografía de flujo lateral en el punto de atención para la detección de metanfetamina/éxtasis

Las pruebas de tira de flujo lateral para detectar metanfetamina/éxtasis se desarrollaron usando la metodología descrita en la patente GB 2339615 y en el Journal of Forensic Science, 2001, 46:1214-1220. La Figura 5 muestra un formato final de tira que incluye una tira consistente en una plancha de nitrocelulosa laminada en un soporte de respaldo (1). Mediante pulverización, usando técnicas de inyección de tinta o de contacto directo, se inmovilizaron en la tira anticuerpo IgG oveja antirratón a 0,5 mg/ml y BSA-pseudoefedrina a 1 mg/ml, ambos en tampón fosfato salino, pH 7,3 conteniendo 0,05% de azida de sodio, como dos líneas (presentando la zona de detección del analito conjugado inmovilizado (2) y la zona de control que presentaba el anticuerpo inmovilizado (3)). En contacto con la nitrocelulosa en el extremo más cercano a la línea con droga-conjugado, se laminó un tampón (4) de fibra de vidrio que contenía anticuerpo anti-metanfetamina seco de ratón marcado con oro en tampón y detergente. Un tampón (5) para la recepción de muestras se laminó en contacto con el tampón de oro. En el extremo distal se colocó un tampón de absorción (6). La tira se montó en una cubierta de plástico.

La prueba se inició con la adición de fluido oral diluido en tampón diluyente de saliva (Tampón de Dilución de Fluido Oral de Cozart, producto de Cozart Bioscience CR-BUFF) en el tampón de muestra. El líquido se desplazó por la tira hidratando el anticuerpo marcado con oro. Entonces se movieron por la tira de nitrocelulosa la muestra y el anticuerpo marcado con oro, permitiendo que el anticuerpo marcado con oro se enlazara con el conjugado inmovilizado pseudoefedrina/portador formando una línea marrón rojiza. El anticuerpo IgG inmovilizado de oveja antirratón (línea de control) capturó el exceso de anticuerpo marcado con oro. Si la muestra contenía metanfetamina o drogas afines de reacción cruzada, el anticuerpo marcado con oro se enlazaba a esta droga, resultando en la reducción de la intensidad o la ausencia de la línea de droga.

El resultado de la prueba se interpretó tras la finalización (3-5 minutos) usando un lector Cozart Rapiscan, que presenta el resultado como negativo o positivo con respecto a un valor lineal preestablecido de intensidad (límite). El límite se estableció de modo que las muestras que contuviesen \geq 15 ng/ml de (+)-metanfetamina se interpretaran como positivas. Tal prueba puede diseñarse también para que tenga una interpretación visual donde, para un valor límite dado de concentración una muestra negativa correspondiese a una línea y una muestra positiva correspondiese a la ausencia de línea para la droga. La reactividad cruzada de la tira de prueba se determinó recogiendo la saliva producida por expectoración en voluntarios que no habían consumido drogas. La saliva fue enriquecida con una variedad de drogas, diluida con tampón diluyente de saliva y testeada usando tiras idénticas. La Tabla 2 muestra los resultados. Ninguno de los compuestos del tipo efedrina dio resultados positivos con las concentraciones probadas. Además de la metanfetamina, la prueba detectó drogas afines, como el éxtasis y la MBDB, pero no drogas del tipo anfetamina. También cabe señalar que no se requirió ningún tratamiento previo de las muestras para eliminar la indeseable reactividad cruzada con compuestos del tipo efedrina.

TABLA 2 Reactividad cruzada de compuestos en la prueba de flujo lateral para la detección de metanfetamina/éxtasis. Todos los compuestos se testearon a 10.000 ng/ml a no ser que se indique lo contrario

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Claims

1. Un procedimiento para detectar si una muestra líquida contiene una o más drogas del grupo metanfetamina que comprende:

(a): poner en contacto dicha muestra con (i) un conjugado de pseudoefedrina/portador en el que la pseudoefedrina esté asociada por medio de su grupo hidroxilo al portador y (ii) un anticuerpo que sea capaz de enlazarse tanto con una o más drogas del grupo metanfetamina como con dicho conjugado; y

(b): determinar si el enlace de dicho anticuerpo a dicho conjugado se ve reducido por la presencia de dicha muestra, siendo indicativa una reducción en el enlace de que la muestra contiene una droga del grupo metanfetamina.

2. Un procedimiento conforme a la reivindicación 1 en el que dicho anticuerpo es capaz de enlazarse específicamente al grupo de drogas que comprenden la metanfetamina, el éxtasis (3,4-metilenodioximetanfetamina, MDMA), la (+/-)-N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-butanamina (MBDB) y la (+/-)-3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA).

3. Un procedimiento, como se reivindica en la reivindicación 2, en el que al menos la metanfetamina, el éxtasis (3,4-metilenodioximetanfetamina, MDMA) y la (+/-)-N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-butanamina (MBDB) son susceptibles de detección de \geq 15 hasta 30 ng/ml.

4. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho anticuerpo tiene menos de 0,4% de reactividad cruzada con todas la (+)- efedrina, la (-)-efedrina, la (+)-pseudoefedrina, la (-)-pseudoefedrina, la fenilpropanolamina, la fentermina, la tiramina, la anfetamina, la beta-feniletilamina y la MDA a una concentración de 10.000 ng/ml.

5. Un procedimiento, como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo tiene menos de un 0,1% de reactividad cruzada con todas la (+)-efedrina, la (-)-efedrina, la (+)-pseudoefedrina, la (-)-pseudoefedrina, la fenilpropanolamina, la fentermina y la tiramina a una concentración de 10.000 ng/ml.

6. Un procedimiento conforme a cualquier de las reivindicaciones precedentes en el que dicho portador es una proteína.

7. Un procedimiento conforme a la reivindicación 6 en el que dicha proteína se selecciona de entre la albúmina de suero bovino, la peroxidasa de rábano picante, la ovoalbúmina, una gamma globulina y la tiroglobulina.

8. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho portador es un homopolímero o un heteropolímero de aminoácidos.

9. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho anticuerpo está marcado directa o indirectamente.

10. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho conjugado de pseudoefedrina está marcado directa o indirectamente, o en el que el portador de dicho conjugado también sirva de marca detectable.

11. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho conjugado es un conjugado obtenido uniendo pseudoefedrina mediante su grupo hidroxilo a dicho portador usando dimetil aminopiridina/disuccinimidilo carbonato, formaldehído o sulfona de vinilo.

12. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la pseudoefedrina está unida a dicho portador mediante una molécula separadora.

13. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que uno de entre dicho anticuerpo y dicho conjugado de pseudoefedrina/portador esté inmovilizado en un soporte sólido.

14. Un procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está conforme con el formato ELISA de competición.

15. Un procedimiento, como se reivindica en la reivindicación 13, que es una prueba de inmunocromatografía de flujo lateral.

16. Un procedimiento, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha muestra consiste en orina, sangre, sudor, fluido oral o cabello, o se deriva de los mismos.

17. Un procedimiento, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha muestra es una muestra obtenida disolviendo un polvo que ha de ser testeado en una disolución tampón.

18. Una tira o lámina de prueba para su empleo en un dispositivo analítico de flujo lateral para realizar una prueba de inmunocromatografía de flujo lateral conforme a la reivindicación 15, teniendo dicha tira de prueba las siguientes características:

(i): una tira o una lámina que comprende un material poroso seco que tenga inmovilizado sobre ella, en una zona de detección de analitos, el conjugado pseudoefedrina/portador o el anticuerpo, como se define en la reivindicación 1 y

(ii): unida a dicha tira o lámina que proporciona dicha zona de detección de analitos, o formando parte integral de la misma, una zona para la liberación de la marca separada que es capaz de liberar dentro del líquido aspirado dentro de esa zona ya sea dicho anticuerpo en forma marcada, si dicha zona de detección de analitos presenta el conjugado inmovilizado de pseudoefedrina, o, si dicha zona de detección de analitos presenta el anticuerpo inmovilizado, el conjugado detectable de pseudoefedrina, como se define en la reivindicación 10.

19. Una tira o lámina de prueba conforme a la reivindicación 18 en la que dicho material poroso seco es la nitrocelulosa.

20. Una tira o lámina de prueba conforme a la reivindicación 18 o la reivindicación 19 en la que dicho conjugado de pseudoefedrina/portador está inmovilizado en una zona de detección de analitos.

21. Una tira o lámina de prueba conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 que comprenda además una zona de control que esté ubicada de forma distal con respecto a dicha zona de detección de analitos en la dirección del flujo líquido deseado.

22. Una tira o lámina de prueba conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 que comprende además un miembro o tampón para la recepción de muestras que es proximal a dicha zona de liberación de marcas teniendo en cuenta la dirección del flujo líquido.

23. Una tira o lámina de prueba conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 que comprende además un tampón absorbente para desechos distal a dicha zona de detección de analitos en la dirección del flujo líquido deseado.

24. Una tira o lámina de prueba conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23 insertada en un habitáculo.

25. Un dispositivo de flujo lateral que incorpora una tira o lámina de prueba conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24.

26. Un kit para realizar un procedimiento conforme a la reivindicación 1 que comprende el conjugado de pseudoefedrina/portador y el anticuerpo, como se definen en la reivindicación 1.

27. Un kit, como se reivindica en la reivindicación 26, en el que dicho anticuerpo está marcado directamente o en el que se proporciona un anticuerpo secundario marcado para marcar dicho anticuerpo.

28. Un kit, como se reivindica en la reivindicación 26, en el que dicho conjugado es un conjugado detectable, como se define en la reivindicación 10.

29. Un kit, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dicho anticuerpo o dicho conjugado está inmovilizado en un soporte sólido.

30. Un kit, como se reivindica en la reivindicación 29, que comprende una tira o lámina de prueba conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23.