ES2273438T3 - Citoquina denominada lerk-6. - Google Patents

Abstract

Una secuencia de DNA aislada seleccionada del grupo que consiste en: a) DNA que codifica un polipéptido que se une a la tirosina quinasa receptora hek/elk y que comprende los aminoácidos 1 a 184 del Nº ID SEC: 10; b) DNA humano que es el complemento de DNA humano que se hibrida bajo condiciones altamente restrictivas al DNA de (a), en donde el DNA humano que es el complemento codifica un polipéptido que se une a hek/elk; c) DNA que, debido a la degeneración del código genético, codifica un poli- péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el DNA de (a) o (b).

Description

Citoquina denominada LERK-6.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos de citoquina denominados LERK-6 que se unen al receptor hek o elk, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, a procedimientos para la producción de polipéptidos de LERK-6 recombinantes y a composiciones farmacéuticas que contienen tales polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Las proteínas conocidas como las tirosina quinasas receptoras tienen una actividad de quinasa intrínseca que se activa al unirse a ligandos. Esta clase de proteínas se caracteriza por motivos estructurales conservados dentro de los dominios catalíticos (Hanks y otros, Science, 242:42, 1988) y pueden subdividirse en familias basándose en las características estructurales de las regiones N-terminales del dominio catalítico.

Boyd y otros (J. Biol. Chem., 267:3262, 1992) purificaron una glicoproteína de la superficie celular que exhibía actividad de tirosina quinasa. La secuencia de aminoácidos identificaba a esta proteína como un miembro de la familia eph/elk y la proteína se denominó así hek (quinasa similar a eph/elk humana). Un anticuerpo monoclonal inmunorreactivo con hek se usó para estudiar la expresión de hek sobre un número de tipos de células humanas (Boyd y otros, anteriormente). El antígeno para hek se detectó en la línea celular de pre-leucemia de células B humana LK63 (la línea celular empleada como el inmunógeno contra el que se producía el anticuerpo) y la línea celular de leucemia de células T humana, JM. La línea celular de linfoma B de Raji mostraba una débil expresión del antígeno de hek y las restantes líneas celulares probadas (líneas celulares tanto normales como tumorales, entre las que estaban líneas celulares hemopoyéticas que incluían líneas celulares pre-B y T) eran consecuentemente negativas. De los especímenes de biopsias de tejidos normales y tumorales que también se probaban con respecto a la expresión del antígeno de hek, ninguno de los tejidos normales era positivo y solo una proporción muy baja de los tumores hemopoyéticos era positiva.

La expresión de transcritos de hek en las líneas celulares LK63 y JM descritas anteriormente, así como la línea celular de leucemia de células T humana HSB-2, se ha demostrado mediante análisis de transferencia Northern (Wicks y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para un clon de cDNA de hek aislado se presentan en Wicks y otros, anteriormente.

La proteína de la superficie celular denominada elk es otro miembro de la familia de proteínas receptora de tirosina quinasas relacionadas con eph. Un clon parcial de elk se descubrió en primer lugar en la biblioteca de expresión de cDNA de cerebro de rata que se rastreaba con respecto a proteínas que expresaban actividad de tirosina quinasa (Letwin y otros, Oncogene 3:621, 1988). Más tarde, una secuencia compuesta que abarcaba toda la región de codificación de elk se derivó de clones parciales aislados de una biblioteca de cDNA de cerebro de rata y una biblioteca de cerebro cerebelar de rata usando el clon parcial como una sonda (Lhotak y otros, Mol. Cell. Biol. 11:2496,
1991).

Las proteínas hek y elk están estrechamente relacionadas con un número de otras tirosina quinasas receptoras, incluyendo los homólogos de hek (Sajjadi y otros. New Biol. 3:769, 1991); eek (Chan y otros, Oncogene 6:1057, 1991); erk (Chan y otros, anteriormente), eck (Lindberg y otros, Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E. B., Cell Regulation 2:523, 1991) y eph (Hirai y otros, Science 238:1717, 1987). Las proteínas de esta subfamilia están relacionadas no solo en sus dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios extracelulares, que son de 41 a 68% idénticos. De forma interesante, las distribuciones en los tejidos de estos varios receptores son diversas. Por ejemplo, se ha presentado que la expresión de mRNA de elk está limitada a los testículos y el cerebro (Lhotak y otros, anteriormente), mientras que eck se encuentra no solo en estos dos mismos tejidos sino también en pulmón, intestino, riñón, bazo, ovario y piel. Además, la mayoría de los receptores relacionados con eph se expresan principalmente en el cerebro. Debido a la homología de los receptores en la familia eph, un ligando dado para un receptor específico también puede unirse a otros receptores.

Los ligandos que se han identificado para las tirosina quinasas receptoras son un grupo diverso de proteínas que afectan al crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de células que expresan los receptores. Se han aislado ligandos para hek y elk, según se analiza con más detalle posteriormente.

WO 96/10911 se refiere a polipéptidos de citoquina murinos de LERK-6 que se unen al receptor hek o elk y ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos.

La identificación de ligandos adicionales para hek y elk que puede existir resultaría útil para investigar la naturaleza de procesos celulares regulados por la señalización a través de estos receptores. Si se desea una potenciación o una inhibición de una señal biológica particular mediada a través de estos receptores, es ventajoso identificar cada una de las proteínas que representan un papel en la transducción de tales señales. Por otra parte, se sabe que ciertas proteínas pueden unirse a receptores sin iniciar la transducción de la señal, incluyendo proteína antagonista de receptor de interleuquina-1 (Eisenberg y otros, Nature 343:341, 1990; Hannum y otros, Nature 343:336, 1990 y Carter y otros, Nature 344:633, 1990). La identificación de proteínas adicionales que se unen a hek o elk también es deseable para determinar si tales proteínas funcionan como antagonistas.

Sumario de la invención

La presente invención trata de LERK-6 de mamífero como una proteína aislada u homogénea. Además, la invención se dirige a DNAs aislados que codifican LERK-6 de mamífero y a vectores de expresión que comprenden un cDNA que codifica LERK-6 de mamífero. Dentro del alcance de esta invención están células huésped que se han transfectado o transformado con vectores de expresión que comprenden un cDNA que codifica LERK-6, y procedimientos para producir LERK-6 cultivando tales células huésped bajo condiciones que conducen a la expresión de LERK-6.

Además, LERK-6 puede unirse a una matriz en fase sólida o usarse para purificar por afinidad o separar células que expresan hek o elk sobre su superficie celular. La invención abarca separar células que tienen el receptor de hek o elk sobre la superficie de las mismas y una mezcla de células en solución, comprendiendo poner en contacto las células en la mezcla con una superficie de contacto que tiene una molécula de LERK-6 sobre la misma, y separar la superficie de contacto y la solución.

Descripción detallada de la invención

Para comparación, un cDNA que codifica LERK-6 murino se ha aislado y se describe en el Nº ID SEC: 1. Un exón del LERK-6 humano se ha aislado y se describe en el Nº ID SEC: 7. DNA que codifica un LERK-6 humano de longitud completa se ha aislado y se describe en el Nº ID SEC: 9. Este descubrimiento de un cDNA que codifica LERK-6 permite la construcción de vectores de expresión que comprenden cDNAs que codifican LERK-6; células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; LERK-6 biológicamente activo como proteínas homogéneas; y anticuerpos inmunorreactivos con LERK-6.

El LERK-6 puede ser útil en la potenciación, la estimulación, la proliferación o el crecimiento de células que expresan el receptor hek o elk. Puesto que el receptor hek o elk se encuentra en el tejido del cerebro y los testículos, es posible el tratamiento de una variedad de estados asociados con el daño tisular de los mismos. Por otra parte, el complejo de ligando y receptor puede estar implicado en el crecimiento, el desarrollo y/o el mantenimiento neural. Aunque no se limita a estos, usos particulares del LERK-6 se describen posteriormente.

Según se usa aquí, el término "LERK-6" se refiere a un género de polipéptidos que se unen y se complejan independientemente con receptor hek o elk encontrado en células T y células cerebrales. El término "LERK-6" abarca polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación, proteínas que son codificadas por ácidos nucleicos que contienen la secuencia de ácido nucleico del Nº ID SEC: 7 y polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 10. Además, LERK-6 abarca polipéptidos que tienen un alto grado de similitud o un alto grado de identidad con la secuencia de aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación, la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 8 y los aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 10, y cuyos polipéptidos son biológicamente activos y se unen al receptor hek o elk. Además, el término "LERK-6 murino" se refiere a productos génicos biológicamente activos del DNA del Nº ID SEC: 1 y el término "LERK-6 humano" se refiere a productos génicos biológicamente activos del DNA del Nº ID SEC: 9. También son abarcadas por el término "LERK-6" proteínas conectadas a GPI (que incluyen una región extracelular y una región hidrófoba C-terminal) y proteínas solubles o truncadas que comprenden principalmente la porción que se une al receptor de la proteína, retienen actividad biológica y son capaces de secretarse. Ejemplos específicos de tales proteínas solubles son los que comprenden la secuencia de aminoácidos 1 (Ala)-145 (Asn) del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación y los que comprenden la secuencia de aminoácidos 1-145 del Nº ID SEC: 10.

El término "hek/elk" significa hek o elk o tanto hek como elk. Por ejemplo, el término "anticuerpos anti-hek/elk" se refiere a anticuerpos contra hek o elk. El término "células que expresan hek/elk" se refiere a células que expresan el receptor hek o el receptor elk, o células que expresan los receptores tanto hek como elk.

El término "biológicamente activo", según se refiere a LERK-6, significa que el LERK-6 es capaz de unirse a hek/elk.

"Aislado" significa que el LERK-6 está libre de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo como un producto de purificación de un cultivo de células huésped recombinantes o como un extracto purificado.

Una "variante de LERK-6", según se menciona aquí, significa un polipéptido substancialmente homólogo a LERK-6 natural, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de LERK-6 natural (humano, murino u otras especies de mamífero) debido a una o más deleciones, inserciones o substituciones. La secuencia de aminoácidos de la variante preferiblemente es al menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos de LERK-6 natural, lo más preferiblemente al menos 90% idéntica. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de secuencias usando el programa informático GAP, versión 6.0, descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, según se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos terminales. Las variantes pueden comprender secuencias substituidas conservativamente, significando que un residuo de aminoácido dado se reemplaza por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Ejemplos de substituciones conservativas incluyen la substitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o substituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp o Gln y Asn. Otras de tales substituciones conservativas, por ejemplo substituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobia similares, son bien conocidas. Las variantes o los alelos de LERK-6 presentes en la naturaleza también son abarcados por la invención. Ejemplos de tales variantes son proteínas que resultan de episodios de reparación de mRNA alternos o de segmentación proteolítica de la proteína LERK-6, en donde la propiedad de unión de LERK-6 se retiene. La reparación alterna de mRNA puede dar una proteína LERK-6 truncada pero biológicamente activa, tal como una forma de la proteína soluble presente en la naturaleza, por ejemplo. Variaciones atribuibles a proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C durante la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína LERK-6 (generalmente de 1-5 aminoácidos terminales).

Se predice que LERK-6 está anclado en la superficie celular a través de conexión de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Los anclajes a la membrana de GPI, incluyendo la estructura química y el procesamiento de los mismos, se describen en Ferguson, M. y Williams, A., Ann. Rev. Biochem., 57:285, 1988 (incorporado aquí mediante referencia). Cuando se expresan inicialmente, ciertas proteínas comprenden un dominio hidrófobo C-terminal que contienen señales para el anclaje de GPI. Un sitio de segmentación está situado aguas arriba, a menudo aproximadamente 10-12 aminoácidos aguas arriba del extremo N del dominio hidrófobo. El procesamiento postraduccional incluye la segmentación de la proteína en este sitio de segmentación. Un anclaje de GPI se liga al aminoácido C-terminal de la proteína madura procesada recientemente expuesto. Así, cuando se expresan proteínas LERK-6 en células que reconocen señales de anclaje de GPI en el dominio hidrófobo, la secuencia de aminoácidos de longitud completa del Nº ID SEC: 2, que se proporciona para comparación, y el Nº ID SEC: 10 representa formas precursoras de las proteínas.

Basándose en secuencias de consenso derivadas de otras proteínas ancladas a GPI, la región hidrófoba en LERK-6 de la presente invención probablemente está entre e incluye los aminoácidos 170 (Leu) y 184 (Ser) del Nº ID SEC: 10. Para comparación, se proporciona la región probablemente hidrófoba en el Nº ID SEC: 2, que está entre e incluye los aminoácidos 170 (Leu) y 184 (Ser). Entre el dominio hidrófobo y el dominio que se une al receptor, hay una región espaciadora de aproximadamente 22 a 25 aminoácidos de longitud. La región espaciadora se extiende desde aproximadamente el aminoácido 145 (Asn), 146 (Glu) o 147 (Thr) hasta aproximadamente el aminoácido 169 (His) del Nº ID SEC: 10. Para comparación, se proporciona la región espaciadora del Nº ID SEC: 2, que también se extiende desde aproximadamente los aminoácidos 145 (Asn), 146 (Glu) o 147 (Thr) hasta aproximadamente el aminoácido 164 (His).

El Ejemplo 3 describe la construcción de una nueva proteína de fusión hek:Fc que puede utilizarse en el rastreo de LERK-6. Otras regiones Fc de anticuerpo pueden substituir a la región Fc de IgG1 humana descrita en el Ejemplo. Otras regiones Fc adecuadas son aquellas que pueden unirse con alta afinidad a proteína A o proteína G e incluyen la región Fc de IgG1 humana o fragmentos de la región Fc de IgG1 humana o murina, por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la región de bisagra de modo que se formarán enlaces disulfuro intercatenarios. La proteína de fusión hek:Fc ofrece la ventaja de purificarse fácilmente. Además, los enlaces disulfuro se forman entre las regiones Fc de dos cadenas de la proteína de fusión separadas, creando dímeros.

Según se describe anteriormente, un aspecto de la invención son los polipéptidos LERK-6 solubles. Los polipéptidos LERK-6 solubles comprenden la totalidad o parte del dominio extracelular de un LERK-6 natural pero carecen de la señal de GPI que provocaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Polipéptidos de LERK-6 solubles comprenden ventajosamente el péptido de señal natural (o un heterólogo) cuando se sintetizan inicialmente para promover la secreción, pero el péptido de señal se segmenta durante la secreción de LERK-6 desde la célula. Los polipéptidos LERK-6 solubles abarcados por la invención retienen la capacidad para unirse al receptor hek o elk. En efecto, el LERK-6 soluble también puede incluir parte de la señal de GPI o parte del dominio citoplásmico u otras secuencias, con tal de que la proteína LERK-6 soluble pueda secretarse.

El LERK-6 soluble puede identificarse (y distinguirse de sus homólogos unidos a la membrana no solubles) separando células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo mediante centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) con respecto a la presencia de la proteína deseada. La presencia de LERK-6 en el medio indica que la proteína se secretaba de las células y así es una forma soluble de la proteína deseada.

Las formas solubles de LERK-6 poseen muchas ventajas sobre la proteína LERK-6 unida natural. La purificación de las proteínas a partir de células huésped recombinantes es factible, ya que las proteínas solubles se secretan de las células. Por otra parte, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.

Ejemplos de polipéptidos LERK-6 solubles incluyen los que comprenden una porción substancial del dominio extracelular de una proteína LERK-6 natural. Un ejemplo de una proteína LERK-6 murina comprende los aminoácidos 1-145 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación y los aminoácidos 1-145 del Nº ID SEC: 10. Además, proteínas LERK-6 solubles truncadas que comprenden menos de todo el dominio extracelular se incluyen en la invención. Cuando se expresa inicialmente dentro de una célula huésped, el LERK-6 soluble puede comprender adicionalmente uno de los péptidos de señal heterólogos descritos posteriormente que es funcional dentro de las células huésped empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido de señal natural. En una modalidad de la invención, LERK-6 soluble puede expresarse como una proteína de fusión que comprende (desde el extremo N al C) el péptido de señal de factor \alpha de levadura, un péptido FLAG® descrito posteriormente y en la Patente de EE.UU. Nº 5.011.912 y LERK-6 soluble que consiste en los aminoácidos 1-134 del Nº ID SEC: 10 o, para comparación, los aminoácidos 1-134 del Nº ID SEC: 2 en lugar de los aminoácidos 1-134 del Nº ID SEC: 10. Esta proteína de fusión recombinante se expresa en y se secreta de células de levadura. El péptido FLAG® facilita la purificación de la proteína y subsiguientemente puede segmentarse del LERK-6 soluble usando enteroquinasa mucosal bovina. Secuencias de DNA aisladas que codifican proteínas LERK-6 solubles son abarcadas por la invención.

LERK-6 truncado, incluyendo polipéptidos solubles, puede prepararse mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Una secuencia de DNA deseada puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas de por sí. También pueden producirse fragmentos de DNA mediante digestión con endonucleasas de restricción y una secuencia de DNA clonada de longitud completa, y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Conectores que contienen un sitio o sitios de segmentación con endonucleasas de restricción pueden emplearse para insertar el fragmento de DNA deseado en un vector de expresión, o el fragmento puede digerirse en sitios de segmentación presentes naturalmente en el mismo. El procedimiento bien conocido de la reacción en cadena de la polimerasa también puede emplearse para amplificar una secuencia de DNA que codifica un fragmento proteínico deseado. Como una alternativa adicional, pueden emplearse técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de parada en un punto deseado, por ejemplo inmediatamente aguas abajo del codón para el último aminoácido del dominio que se une al receptor.

Según se indica anteriormente, la invención proporciona polipéptidos LERK-6 aislados u homogéneos, tanto recombinantes como no recombinantes. Variantes y derivados de proteínas LERK-6 naturales que retienen la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad para unirse a hek/elk) pueden obtenerse mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos LERK-6 naturales. Alteraciones de la secuencia de aminoácidos natural pueden efectuarse mediante cualquiera de un número de métodos convencionales. Pueden introducirse mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, substitución o deleción de aminoácidos deseada.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específicos para el sitio dirigidos a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en el que codones predeterminados pueden alterarse mediante substitución, deleción o inserción. Métodos ejemplares para producir las alteraciones indicadas anteriormente son descritos por Walder y otros (Gene 42:133, 1986); Bauer y otros (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith y otros (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel y otros (Methods in Enzymol 154:367, 1987) y las Patentes de EE.UU. Nº 4.518.584 y 4.737.462.

El LERK-6 puede modificarse para crear derivados de LERK-6 formando conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Derivados covalentes de LERK-6 pueden prepararse conectando los restos químicos a grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácidos LERK-6 o en el extremo N o el extremo C de un polipéptido LERK-6 o el dominio extracelular del mismo. Otros derivados de LERK-6 dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de LERK-6 o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia polipeptídica de señal o líder (por ejemplo el líder del factor \alpha de Saccharomyces) en el extremo C de un polipéptido LERK-6. El péptido de señal o líder dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis hasta un sitio dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.

Fusiones de polipéptidos LERK-6 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación y la identificación de LERK-6. Tales polipéptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénicos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.011.912 y en Hopp y otros, Bio/Technology 6:1204, 1988.

La invención incluye además polipéptidos LERK-6 con o sin glicosilación de patrón natural asociada. LERK-6 expresado en sistemas de expresión de levadura o mamífero (por ejemplo, células COS-7) puede ser similar a o diferente de un polipéptido LERK-6 natural en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos LERK-6 en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas.

Constructos de DNA equivalentes que codifican diversas adiciones o substituciones de residuos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias terminales o internos no necesarios para la actividad biológica o la unión son abarcados por la invención. Por ejemplo, sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de LERK-6 pueden modificarse para impedir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en sistemas de expresión de mamíferos y levaduras. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. La proteína LERK-6 murina que se proporciona para comparación y LERK-6 humana comprenden tres de tales tripletes, en los aminoácidos 13-15, 145-147 y 159-161 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación y el Nº ID SEC: 10, respectivamente. Substituciones, adiciones o deleciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes darán como resultado la prevención del empalme de los residuos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn. La alteración de un solo nucleótido, elegido de modo que Asn se reemplace por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.071.972 y EP 276.846.

En otro ejemplo, secuencias que codifican residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse para hacer que los residuos de Cys sufran deleción o se reemplacen por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes de disulfuro intramoleculares incorrectos durante la renaturalización. Otros equivalentes se preparan mediante la modificación de residuos de aminoácido dibásicos adyacentes para potenciar la expresión en sistemas de levadura en los que está presente actividad de proteasa KEX2. EP 212.914 describe el uso de mutagénesis específica para el sitio para inactivar sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 se inactivan sometiendo a deleción, añadiendo o substituyendo residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la presencia de estos residuos básicos adyacentes. Los apareamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la segmentación con KEX2 y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un sistema conservativo y preferido para inactivar sitios KEX2. El LERK-6 murino que se proporciona para comparación y el LERK-6 humano contienen un sitio de procesamiento de proteasa KEX2 en los aminoácidos 81-82 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación y el Nº ID SEC: 10, respectivamente.

Secuencias de ácido nucleico dentro del alcance de la invención incluyen secuencias de DNA y RNA humanos que se hibridan a las secuencias de nucleótidos de LERK-6 descritas aquí bajo condiciones de restricción moderada o intensa, y que codifican LERK-6 biológicamente activo. Las condiciones de restricción moderada, según se define por Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), incluyen el uso de una solución de prelavado de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC, 5 X SSC, durante la noche. Las condiciones de restricción intensa incluyen temperaturas de hibridación y lavado superiores. El experto reconocerá que la temperatura y la concentración salina de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la molécula de ácido nucleico.

Debido a la degeneración conocida del código genético en la que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de DNA puede variar desde la mostrada en el Nº ID SEC: 1 que se proporciona para comparación, el Nº ID SEC: 7 que se proporciona para comparación y el Nº ID SEC: 9 y todavía codifica una proteína LERK-6 que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación, el Nº ID SEC: 8 que se proporciona para comparación o el Nº ID SEC: 10, respectivamente. Tales secuencias de DNA variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que se producen durante la amplificación por PCR) o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia natural.

La invención proporciona secuencias de DNA aisladas equivalentes que codifican LERK-6 biológicamente activo, seleccionadas de: (a) cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en el Nº ID SEC: 9; (b) DNA humano capaz de hibridación a un DNA de (a) bajo condiciones moderadamente restrictivas y que codifica LERK-6 biológicamente activo; y (c) DNA que está degenerado como resultado del código genético hasta un DNA definido en (a) o (b) y que codifica LERK-6 biológicamente activo. Proteínas LERK-6 codificadas por tales secuencias equivalentes de DNA son abarcadas por la invención. Para comparación, se proporciona cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 7.

DNAs que son equivalentes a la secuencia de DNA del Nº ID SEC: 1 que se proporciona para comparación y el Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación o el Nº ID SEC: 9 se hibridarán bajo condiciones moderadamente e intensamente restrictivas a secuencias de DNA que codifican polipéptidos que comprenden los aminoácidos 1-148 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación, el Nº ID SEC: 8 que se proporciona para comparación o los aminoácidos 1-148 del Nº ID SEC: 10. Ejemplos de proteínas LERK-6 codificadas con tal DNA incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de LERK-6 (solubles o conectados por GPI) y proteínas LERK-6 que comprenden un sitio o sitios de N-glicosilación inactivados, un sitio o sitios de procesamiento de proteasa KEX2 inactivados o una substitución o substituciones de aminoácidos conservativas, según se describe anteriormente. Las proteínas LERK-6 codificadas por DNA derivadas de otras especies de mamíferos, en donde el DNA se hibridará al cDNA del Nº ID SEC: 1, el Nº ID SEC: 7 o el Nº ID SEC: 9 también se proporcionan para comparación.

Variantes que poseen la actividad requerida para unirse a receptor hek/elk pueden identificarse mediante cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica de LERK-6 puede determinarse, por ejemplo, mediante competición con respecto a la unión al dominio de unión a ligandos del receptor hek/elk (es decir, ensayos de unión competitiva).

Un tipo de un ensayo de unión competitiva para un polipéptido LERK-6 usa un LERK-6 soluble radiomarcado y células que expresan hek/elk intactas. En lugar de células intactas, proteínas de fusión hek/elk:Fc (tales como una proteína de fusión hek:Fc o elk:Fc) solubles unidas a una fase sólida a través de la interacción de una Proteína A, Proteína G o un anticuerpo con las porciones hek, elk o Fc de la molécula podrían substituirse por la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza receptores hek o elk solubles radiomarcados, tales como proteínas de fusión hek:Fc o elk:Fc, y células intactas que expresan LERK-6.

Los ensayos de unión competitiva pueden realizarse siguiendo una metodología convencional. Por ejemplo, puede usarse LERK-6 radiomarcado para competir con un homólogo de LERK-6 putativo para ensayar con respecto a la actividad de unión frente a hek/elk unido a la superficie. Pueden obtenerse resultados cualitativos mediante ensayos competitivos de unión a placas autorradiográficas o pueden utilizarse representaciones de Scatchard para generar resultados cuantitativos.

Alternativamente, proteínas que se unen a hek/elk, tales como LERK-6 y anticuerpos anti-hek/elk, pueden unirse a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un substrato similar adecuado para identificar, separar o purificar células que expresan hek/elk sobre su superficie. La unión de una proteína que se une a hek/elk a una superficie de contacto en fase sólida puede efectuarse mediante cualquier medio, por ejemplo, construyendo una proteína de fusión LERK-6:Fc y uniendo esta a la fase sólida a través de la interacción de Proteína A o Proteína G. Varios otros medios para fijar proteínas a una fase sólida son bien conocidos en la especialidad y son adecuados para usar en la presente invención. Por ejemplo, microesferas magnéticas pueden revestirse con LERK-6 y mantenerse en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Suspensiones de mezclas de células que contienen células que expresan hek/elk se ponen en contacto con la fase sólida que tiene polipéptido LERK-6 sobre la misma. Las células que tienen hek/elk sobre su superficie se unen al LERK-6 fijado y las células no unidas se separan por lavado a continuación. Este método de unión por afinidad es útil para purificar, rastrear o separar tales células que expresan hek/elk de la solución. Métodos para liberar células seleccionadas positivamente de la fase sólida son conocidos en la especialidad y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas preferiblemente no son tóxicas y no son perjudiciales para las células y preferiblemente se dirigen a segmentar el socio de unión a la superficie celular. En el caso de interacciones hek/elk:LERK-6, la enzima preferiblemente segmentaría el receptor hek/elk, librando de ese modo la suspensión celular resultante del material de LERK-6 "extraño". La población de células purificadas, especialmente si se obtienen de tejido fetal, puede usarse a continuación para repoblar tejidos maduros (adultos). Por ejemplo, tales células neurales purificadas pueden administrarse a un paciente que tiene un trastorno neurodegenerativo, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Lou Gehrig, etc.

Alternativamente, mezclas de células que se sospecha que contienen células hek/elk^{+} pueden incubarse en primer lugar con LERK-6 biotinilado. Los períodos de incubación son típicamente al menos de una hora de duración para asegurar una unión suficiente a hek/elk. La mezcla resultante se hace pasar a continuación a través de una columna rellena con cuentas revestidas con avidina, con lo que la alta afinidad de la biotina para la avidina proporciona la unión de la célula a las cuentas. El uso de cuentas revestidas con avidina se conoce en la especialidad. Véase Berenson, y otros, J Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realizan usando métodos convencionales.

Según se describe anteriormente, puede usarse LERK-6 para separar células que expresan hek/elk. En un método alternativo, LERK-6 o un dominio extracelular o un fragmento del mismo puede conjugarse a un resto detectable tal como ^{125}I para detectar células que expresan hek/elk. El radiomarcaje con ^{125}I puede realizarse mediante cualquiera de varias metodologías estándar que dan una molécula de ^{125}I-LERK-6 funcional marcada hasta una alta actividad específica. O podría usarse un anticuerpo yodado o biotinilado contra la región hek/elk o la región Fc de la molécula. Puede usarse otro resto detectable, tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que han de probarse con respecto a la expresión de hek/elk pueden ponerse en contacto con LERK-6 marcado. Después de la incubación, LERK-6 marcado no unido se retira y la unión se mide usando el resto detectable.

Las características de unión de LERK-6 (incluyendo variantes) también pueden determinarse usando la hek/elk soluble conjugada (por ejemplo, ^{125}I-hek/elk:Fc) en ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. En este caso, sin embargo, células intactas que expresan hek/elk unida a un substrato sólido se usan para medir la extensión hasta la que una muestra que contiene una variante de LERK-6 putativa compite con respecto a la unión a LERK-6 con una hek/elk soluble conjugada.

Otros medios para ensayar con respecto a LERK-6 incluyen el uso de anticuerpos anti-LERK-6, líneas celulares que proliferan en respuesta a LERK-6 o líneas celulares recombinantes que expresan hek/elk y proliferativas en presencia de LERK-6.

Las proteínas LERK-6 descritas aquí también pueden emplearse para medir la actividad biológica de proteínas elk o hek en términos de su afinidad de unión para LERK-6. Como un ejemplo, puede usarse LERK-6 para determinar si la actividad biológica se retiene después de la modificación de una proteína elk o hek (por ejemplo, modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La actividad biológica de una proteína elk o hek puede determinarse así antes de que se use en un estudio de investigación, o posiblemente en la clínica, por ejemplo.

Las proteínas LERK-6 encuentran uso como reactivos que pueden emplearse por los que efectúan estudios de "garantía de calidad", por ejemplo, para verificar la vida útil y la estabilidad de proteína elk bajo diferentes condiciones. Como ilustración, puede emplearse LERK-6 en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína elk que se ha almacenado a diferentes temperaturas o producido en diferentes tipos celulares. La afinidad de unión de la proteína elk modificada para LERK-6 se compara con la de una proteína elk no modificada para detectar cualquier influencia adversa de las modificaciones sobre la actividad biológica de elk. Asimismo, la actividad biológica de una proteína hek puede determinarse usando LERK-6.

Los polipéptidos LERK-6 también encuentran uso como portadores para agentes de aporte unidos a los mismos para células que soportan el receptor de la superficie celular elk o hek. La expresión de antígeno para hek se ha presentado para ciertas líneas celulares leucémicas, incluyendo la línea celular de leucemia de células T humana denominada JM y la línea celular de pre-leucemia de células B humana denominada LK63 (Boyd y otros, J. Biol. Chem. 267:3262, 1992 y Wicks y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las proteínas LERK-6 pueden usarse así para aportar agentes diagnósticos o terapéuticos a estas células (o a otros tipos de células que se encuentra que expresan hek sobre la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Un ejemplo de tal uso es exponer una línea celular leucémica hek^{+} o elk^{+} a un conjugado de agente terapéutico/LERK-6 para determinar si el agente exhibe citotoxicidad para las células leucémicas. Un número de diferentes agentes terapéuticos empalmados a LERK-6 puede incluirse en un ensayo para detectar y comparar el efecto citotóxico de los agentes sobre las células leucémicas. Los conjugados de LERK-6/agente diagnóstico pueden emplearse para detectar la presencia de células hek^{+} in vitro o in vivo.

Agentes diagnósticos y terapéuticos que pueden empalmarse a un polipéptido LERK-6 incluyen, pero no se limitan a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, eligiéndose el agente particular de acuerdo con la aplicación pretendida. Ejemplos de fármacos incluyen los usados para tratar diversas formas de cáncer, por ejemplo, mostazas nitrogenadas tales como mostaza nitrogenada de L-fenilalanina, o ciclofosfamida, agentes de intercalación tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo, alcaloides de la vinca tales como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina y derivados de los mismos. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa y fragmentos (por ejemplo, cadenas simples) de las mismas. Radionúclidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Radionúclidos adecuados para uso terapéutico incluyen, pero no se limitan a, ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.

Tales agentes pueden empalmarse al LERK-6 mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. LERK-6, que es una proteína, comprende grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácido que pueden hacerse reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la proteína o el agente pueden derivarse para generar o empalmarse a un grupo funcional reactivo deseado. La derivación puede implicar el empalme de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para empalmar diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conoce un número de técnicas para radiomarcar proteínas. Los metales de radionúclidos pueden empalmarse a LERK-6 usando un agente quelante bifuncional adecuado, por ejemplo.

Se preparan así conjugados que comprenden LERK-6 y un agente diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente conectados covalentemente). Los conjugados se administran o se emplean de otro modo en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

Otro uso del LERK-6 de la presente invención es como una herramienta de investigación para estudiar el papel que LERK-6, junto con elk o hek, puede representar en el crecimiento o la diferenciación de células que tienen el receptor elk o hek. Los polipéptidos LERK-6 de la presente invención también pueden emplearse en ensayos in vitro para la detección de elk o LERK-6 o las interacciones de los mismos. Asimismo, LERK-6 encuentra uso en ensayos para hek o la interacción de LERK-6 con hek.

Según se trata anteriormente, cuando se analizaban diversos tejidos de rata con respecto a mRNA de elk, se detectaban transcritos solo en el cerebro y los testículos (Lhotak y otros, anteriormente). Se cree que la unión de LERK-6 a receptores relacionados con eph sobre tejido neural ejerce un efecto neuroprotector o neurotrófico.

LERK-6 encuentra uso como un reactivo de cultivo tisular. Una proteína LERK-6 puede añadirse a neuronas cultivadas in vitro para potenciar la viabilidad o prolongar la duración de las neuronas cultivadas, facilitando así estudios de investigación y el posible tratamiento clínico de tejido neural.

Puede preverse un método para tratar trastornos de tejido neural, que implica poner en contacto el tejido neural con LERK-6. Tales trastornos incluyen lesión o enfermedades neurológicas, crónicas o agudas. Una proteína LERK-6 puede administrarse a un mamífero para tratar tal lesión o enfermedad. En una modalidad de la invención, se emplea LERK-6 para tratar estados neurodegenerativos caracterizados o mediados, al menos en parte, por el mecanismo de muerte neural conocido como exocitotoxicidad. Además, puede administrarse LERK-6 a un mamífero para ejercer un efecto trófico sobre el tejido neural. En un paciente que sufre pérdida de o daño a neuronas debido a lesión o enfermedad, el LERK-6 puede potenciar la viabilidad de aquellas neuronas que han sobrevivido.

Los polipéptidos LERK-6 de la invención pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El LERK-6 puede combinarse en una mezcla, como el único material activo o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenes), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o portadores. Portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co. Además, tales composiciones pueden contener LERK-6 complejado con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporado en compuestos polímeros tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o incorporado en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, "fantasmas" de eritrocitos, o esferoblastos. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de depuración in vivo de LERK-6. LERK-6 también puede conjugarse a anticuerpos contra receptores específicos de tejidos, ligandos o antígenos, o acoplarse a ligandos de receptores específicos de tejidos. Cuando se encuentra hek/elk sobre células neoplásticas, el LERK-6 puede conjugarse a una toxina con lo que LERK-6 se usa para aportar la toxina al sitio específico, o puede usarse para sensibilizar tales células neoplásticas a agentes antineoplásticos administrados subsiguientemente.

LERK-6 puede administrarse tópicamente, parenteralmente o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. Estas composiciones contendrán típicamente una cantidad eficaz del LERK-6, sola o en combinación con una cantidad eficaz de cualquier otro material activo. Tales dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso pretendido, el peso corporal y la edad del paciente y la ruta de administración. Dosis preliminares pueden determinarse de acuerdo con pruebas en animales, y el aumento a escala de las dosificaciones para la administración a seres humanos puede realizarse de acuerdo con prácticas aceptadas en la especialidad.

Los polipéptidos LERK-6 pueden existir como oligómeros, tales como dímeros o trímeros conectados covalentemente o conectados no covalentemente. Los oligómeros pueden estar conectados por enlaces disulfuro formados entre residuos de cisteína de diferentes polipéptidos LERK-6. En una modalidad de la invención, se crea un dímero de LERK-6 fusionando LERK-6 a las regiones Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG1) de una manera que no interfiere con la unión de LERK-6 al dominio de unión a ligandos de hek/elk. El polipéptido de Fc preferiblemente se fusiona al extremo C de un LERK-6 soluble (que comprende solo la unión al receptor). La preparación general de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi y otros (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn y otros (Nature 344:677, 1990). Una fusión génica que codifica la proteína de fusión LERK-6:Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión LERK-6:Fc se dejan ensamblar de forma muy similar en las moléculas de anticuerpo, con lo que se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre polipéptidos de Fc, dando LERK-6 divalente. Si se elaboran proteínas de fusión con cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de LERK-6 con tantas como cuatro regiones extracelulares de LERK-6. Alternativamente, pueden conectarse dos dominios de LERK-6 soluble con un conector peptídico.

Células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos LERK-6 incluyen procariotas, levadura o células eucarióticas superiores. Vectores de clonación y expresión apropiados para usar con huéspedes celulares de bacterias, hongos, levaduras y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels y otros, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). También podrían emplearse sistemas de traducción libres de células para producir polipéptidos LERK-6 usando RNAs derivados de constructos de DNA descritos aquí.

Los procariotas incluyen organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Células huésped procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas otras especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un polipéptido LERK-6 puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met N-terminal puede segmentarse del polipéptido LERK-6 recombinante expresado.

Los polipéptidos LERK-6 pueden expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de levadura a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación desde un plásmido de levadura 2\mu, una secuencia que se replica autónomamente (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968 y Holland y otros, Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer y otros, Gene, 107:285-195 (1991) y van den Berg y otros, Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Otra alternativa es el promotor de ADH2 reprimible con glucosa descrito por Russell y otros (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y otros (Nature 300:724, 1982). Pueden construirse vectores lanzadera replicables tanto en levaduras como en E. coli insertando secuencias de DNA de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos anteriormente.

La secuencia líder de factor \alpha de levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido LERK-6. La secuencia líder de factor \alpha a menudo se inserta entre la secuencia promotora y la secuencia génica estructural. Véanse, por ejemplo, Kurjan y otros, Cell 30:933, 1982; y Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330; la Patente de EE.UU. 4.546.082 y EP 324.274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes a partir de huéspedes de levadura son conocidas por los expertos en la especialidad. Una secuencia líder puede modificarse cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Protocolos de transformación de levadura son conocidos por los expertos en la especialidad. Uno de tales protocolos es descrito por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y otros selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste en 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de casaminoácido, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células huésped de levadura transformadas mediante vectores que contienen secuencia promotora de ADH2 pueden hacerse crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste en 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementados con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor de ADH2 se produce cuando la glucosa se agota del medio.

Sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto también podrían emplearse para expresar polipéptidos LERK-6 recombinantes. Sistemas baculovirales para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen de mamífero. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y otros, Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV-1/EBNA-1 derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) según se describe por McMahan y otros (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Secuencias de control transcripcional y traduccional para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden cortarse de genomas virales. Secuencias promotoras y secuencias potenciadoras comúnmente usadas se derivan de poliomavirus, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Secuencias de DNA derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, sitios de origen, promotor temprano y tardío, potenciador, de reparación y poliadenilación de SV40 pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped de mamífero. Promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen de replicación viral (Fiers y otros, Nature 273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio Bgl I situada en el sitio de origen de replicación viral de SV40.

Vectores de expresión ejemplares para usar en células huésped de mamífero pueden construirse según se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para una expresión de alto nivel estable en cDNAs de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse substancialmente según se describe por Cosman y otros (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y otros, Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. Vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se describen en EP-A-0367566 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, incorporada mediante referencia aquí. Los vectores pueden derivarse de retrovirus. En lugar de la secuencia de señal natural, y además de una metionina iniciadora, puede añadirse una secuencia de señal heteróloga, tal como la secuencia de señal para IL-7 descrita en la Patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia de señal para el receptor de IL-2 descrita en Cosman y otros, Nature 312:768 (1984); el péptido de señal de IL-4 descrito en EP 367.566; el péptido de señal del receptor de IL-1 tipo I descrito en la Patente de EE.UU. 4.968.607 y el péptido de señal del receptor de IL-1 tipo II descrito en EP 460.846.

LERK-6 como una proteína aislada, purificada u homogénea de acuerdo con la invención puede producirse mediante sistemas de expresión recombinantes como los descritos anteriormente o purificarse a partir de células presentes en la naturaleza. LERK-6 puede purificarse hasta una homogeneidad substancial, según se indica por una sola banda de proteína durante el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE).

Un procedimiento para producir LERK-6 comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica LERK-6 bajo condiciones suficientes para promover la expresión de LERK-6. LERK-6 se recupera a continuación del medio de cultivo o los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como se sabe por el experto, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si la proteína recombinante se secreta o no en el medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede concentrarse en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un substrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren grupos sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes) para purificar adicionalmente LERK-6. Alguna o la totalidad de las etapas de purificación precedentes, en diversas combinaciones, son bien conocidas y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante substancialmente homogénea.

Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión a ligandos de receptores hek/elk para purificar por afinidad polipéptidos LERK-6 expresados. Los polipéptidos LERK-6 pueden retirarse de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución de alto contenido de sal, y a continuación dializarse en un tampón de contenido de sal inferior para el uso, o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que se une a LERK-6. El Ejemplo 5 describe un procedimiento para emplear LERK-6 de la invención para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra LERK-6.

Proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano puede aislarse mediante ruptura inicial de las células huésped, centrifugación, extracción de nódulos celulares si hay un polipéptido insoluble o del fluido sobrenadante si hay un polipéptido soluble, seguido por una o más etapas de concentración, desalado, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaños. Finalmente, puede emplearse RP-HPLC para etapas de purificación finales. Las células microbianas pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo someter a ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular.

Células huésped de levadura transformadas se emplean preferiblemente para expresar LERK-6 como un polipéptido secretado para simplificar la purificación. Un polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células huésped de levadura puede purificarse mediante métodos análogos a los descritos por Urdal y otros (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y otros describen dos etapas de HPLC en fase inversa secuenciales para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de LERK-6 incluyen oligonucleótidos antisentido o de sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (RNA o DNA) capaz de unirse a secuencias de mRNA de LERK-6 (sentido) o DNA de LERK-6 (antisentido) diana. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de cDNA de LERK-6. Tal fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o de sentido, basándose en una secuencia de cDNA que codifica una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol y otros (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o de sentido a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de la secuencia diana mediante uno de varios medios, incluyendo degradación potenciada de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o traducción o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden usarse así para bloquear la expresión de proteínas LERK-6. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen cadenas principales de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otras conexiones de azúcar, tales como las descritas en WO91/06629) y en donde tales conexiones de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con conexiones de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para poder unirse a secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que están conectados covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10448, y otros restos que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico diana, tales como poli(L-lisina). Además, agentes de intercalación, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos pueden empalmarse a oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o de sentido para la secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos antisentido o de sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante cualquier método de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de DNA mediada por CaPO_{4}^{-}, electroporación o usando vectores de transferencia génica tales como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido se introducen preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante la inserción del oligonucleótido antisentido o de sentido en un vector retroviral adecuado, poniendo a continuación en contacto la célula con el vector de retrovirus que contiene la secuencia insertada, in vivo o ex vivo. Vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, los derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la Solicitud PCT US 90/02656).

Los oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula que se une a un ligando, según se describe en WO 91/04753. Moléculas que se unen a ligandos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula que se une a un ligando no interfiere substancialmente con la capacidad de la molécula que se une a un ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, según se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido de sentido o antisentido-lípido se disocia preferiblemente dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Además de lo anterior, los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar modalidades particulares y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo comparativo 1

Clonación de cDNA de LERK-6 Murino

Este ejemplo describe un procedimiento para aislar una secuencia de DNA que codifica LERK-6 murino de la invención. Se obtuvo una biblioteca de cDNA embrionario murino de 11,5 días disponible comercialmente de Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California. La biblioteca se cultivó en placas de acuerdo con los procedimientos detallados en el manual proporcionado por Clonetech y se rastreó usando las sondas radiomarcadas con ^{32}P. Las sondas se generaron cada una usando técnicas estándar. Generalmente, se realizaron amplificaciones por reacción en cadena de la polimerasa (Mullis y Faloona, Meth. Enzymol. 155:335-350, 1987) usando dos grupos de cebadores. El primer grupo,

1

se usó para generar fragmentos de DNA de doble hebra amplificados a partir del DNA de LERK-3. LERK-3 es la materia de las solicitudes de patente en tramitación junto con la presente Nº de Serie 08/109.745, 08/114.426, 08/161.132 y 08/240.124, presentadas el 9 de mayo de 1994. La sonda procedente de LERK-3 comprendía los nucleótidos 260 a 481 del Nº ID SEC: 1 de la solicitud en tramitación junto con la presente Nº de Serie 08/240.124, presentada el 9 de mayo de 1994. El segundo grupo de cebadores,

2

se usó para generar fragmentos de DNA de doble hebra amplificados a partir del DNA de LERK-4. LERK-4 también es la materia de las solicitudes de patente en tramitación junto con la presente Nº de Serie 08/109.745, 08/114.426, 08/161.132 y 08/240.124, presentadas el 9 de mayo de 1994. La sonda procedente de LERK-3 comprendía los nucleótidos 110 a 467 del Nº ID SEC: 3 de la solicitud en tramitación junto con la presente Nº de Serie 08/240.124, presentada el 9 de mayo de 1994. Los fragmentos se radiomarcaron con ^{32}P y se usaron como sondas para rastrear una biblioteca embrionaria murina.

El rastreo con las sondas se efectuó mediante procedimientos convencionales y se identificaron clones de hibridación. Las condiciones de hibridación consistían en 42ºC y 50% de Starks lavado hasta 0,1 X SSC a 63ºC. Se determinó la secuencia de nucleótidos del inserto de cDNA de un clon individual aislado de la biblioteca embrionaria murina, denominado clon \lambda13. Una secuencia de cDNA substancialmente completa de la región de codificación del cDNA del clon \lambda13, y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma, se presentan en los Nº ID SEC: 1 y Nº ID SEC: 2, respectivamente. El marco de lectura abierto dentro de esta secuencia codifica una proteína de 148 aminoácidos. Puesto que los extremos N de las proteínas de la familia LERK no son homólogos, se cree que el primer aminoácido del Nº ID SEC: 1 (Ala) está situado en o muy cerca del extremo N natural. Además, debido a que el LERK-6 de esta invención es homólogo con otras moléculas de LERK biológicamente activas, existe una probabilidad significativa de que el cDNA del Nº ID SEC: 1 codifique una proteína biológicamente activa. La secreción de tal proteína activa es posible a través de los procedimientos descritos anteriormente con respecto a la adición de una metionina iniciadora adecuada y una secuencia de señal adecuada, tal como aquella para IL-7 murina. La secuencia de aminoácidos de LERK-6 es 58% homóloga con la de una citoquina denominada LERK-3.

Un lisado celular que contiene DNA del clon \lambda13 (el cDNA de LERK-6 en \lambdagt10) se depositó en the American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU. de A. el 15 de julio de 1994 y se le asignó el número de registro ATCC 75829. El depósito se realizó bajo los términos del Tratado de Budapest.

Ejemplo 2 Clonación de LERK-6 Humano

Este ejemplo describe la clonación de ácidos nucleicos que codifican LERK-6 humano. La secuencia de LERK-6 humano es de un clon genómico aislado sondeando una biblioteca genómica humana con una sonda de cDNA de LERK-6 murino que codifica los aminoácidos 30-173. Los filtros que contienen calvas se hibridaron a sonda marcada con ^{32}P a 55ºC durante 24 h, se lavaron hasta 0,5 x SSC a 55ºC y se expusieron a película de rayos X (Kodak, XAR-5). Una secuencia de ácidos nucleicos contenida en tal clon se muestra posteriormente, también en el Nº ID SEC: 7, y los aminoácidos codificados por la misma se muestran en el Nº ID SEC: 8:

3

En comparación con LERK-6 murino, el LERK-6 humano posee un 98,077 por ciento de similitud y un 93,269 por ciento de identidad.

Un DNA de LERK-6 humano completo se aisló sondeando una biblioteca de DNA genómico humano (Stratagene, La Jolla, CA) con la secuencia de ácido nucleico mostrada en el Nº ID SEC: 7. Los filtros que contenían calvas se hibridaron a la sonda marcada con ^{32}P a 55ºC durante 24 h, se lavaron hasta 0,5 x SSC a 55ºC y se expusieron a película de rayos X. Se aislaron dos clones diferentes usando esta técnica. A continuación, el mismo procedimiento de aislamiento se repitió usando la biblioteca de DNA genómico humano procedente de una preparación diferente (Stratagene, La Jolla, CA). Este procedimiento daba como resultado el aislamiento de un tercer clon que tenía una secuencia de nucleótidos diferente. Los tres clones aislados se mapearon por restricción y a continuación se subclonaron en plásmido Bluescript y se sometieron a secuenciación. Usando la secuencia de LERK-6 murino como una plantilla, se identificaron los intrones y exones de los clones. La secuencia de DNA que codifica LERK-6 humano de longitud completa, según se determina comparando las regiones de codificación del LERK-6 murino, se identifica en el Nº ID SEC: 9 y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de DNA de longitud completa se identifica en el Nº ID SEC: 10.

Los plásmidos que incluyen el DNA de LERK-6 clonado se depositaron en the American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU. de A., el _______ de agosto de 1997 y se les asignó el número de registro ATCC ________. Los depósitos se realizaron bajo los términos del Tratado de Budapest.

Ejemplo 3 Preparación de Proteína de Fusión elk:Fc Soluble

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión elk:Fc soluble. Esta proteína de fusión puede emplearse en los ensayos de unión del Ejemplo 5, para determinar las características de unión de LERK-6.

Una secuencia de DNA y de aminoácidos codificada para cDNA de elk de rata se presenta en Lhotak y otros (Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991), incorporado por la presente mediante referencia. La proteína elk de rata tiene un dominio extracelular de 538 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 25 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 419 aminoácidos.

El fragmento de cDNA de elk de rata se fusionó al extremo 5' de cDNA que codifica la porción Fc de un anticuerpo de IgG1 humana. El cDNA de elk de rata puede obtenerse de T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto). Un sitio de segmentación de endonucleasa de restricción Asp718 se introdujo aguas arriba de la región de codificación de elk. Se aisló un fragmento Asp718-BgIII de cDNA de elk de rata (que comprende el dominio extracelular entero, la región de transmembrana y una pequeña porción del dominio citoplásmico).

DNA que codifica una cadena polipeptídica simple que comprende la región Fc de un anticuerpo para IgG1 humana se clonó en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT SK®, que está disponible comercialmente de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Este vector plasmídico es replicable en E. coli y contiene un segmento policonector que incluye 21 sitios de restricción únicos. La secuencia de nucleótidos del DNA clonado, junto con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de Fc codificada por la misma, se describen en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporada por la presente mediante referencia. Se ha introducido un sitio BglII único y abarca los codones para los aminoácidos tres y cuatro del polipéptido de Fc. El polipéptido de Fc codificado se extiende desde la región de bisagra N-terminal hasta el extremo C natural, es decir, es una región Fc de anticuerpo esencialmente de longitud completa.

El fragmento de cDNA de elk Asp718-BglII anteriormente descrito se clonó en el vector pBLUESCRIPT SK® que contiene el cDNA de Fc, de modo que el cDNA de elk está situados aguas arriba del cDNA de Fc. DNA de una sola hebra derivado de la fusión génica resultante se mutagenizó mediante los métodos descritos en Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) y Kunkel y otros (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) para fusionar perfectamente el dominio extracelular entero de elk a la secuencia de Fc. El DNA mutagenizado se sometió a secuenciación para confirmar que se habían retirado los nucleótidos apropiados (es decir, que se sometían a deleción el DNA de la región de transmembrana y el dominio citoplásmico parcial) y que las secuencias de elk y Fc estaban en el mismo marco de lectura.

La proteína de fusión elk:Fc se sintetiza preferiblemente en células huésped de mamífero, tales como células CV1-EBNA o COS-7. La fusión génica elk:Fc se cortó y se insertó en un vector de expresión de mamífero denominado HAV-EO (Dower y otros, J. Immunol. 142:4314, 1989). Células huésped de mamífero se transfectaron con el vector de expresión recombinante resultante y se cultivaron para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secretó en el medio de cultivo a través del péptido de señal de elk. La proteína de fusión de elk:Fc se purificó mediante cromatografía de afinidad, usando una columna de proteína A-Sepharose.

Ejemplo 4 Preparación de Proteína de Fusión hek:Fc Soluble

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión hek:Fc soluble. Esta proteína de fusión puede emplearse en los ensayos de unión del Ejemplo 5, para determinar las características de unión de LERK-6.

Un DNA y la secuencia de aminoácidos codificada para cDNA de hek humano se presentan en Wicks y otros (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Esta proteína hek comprende (del extremo N al C) un dominio extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico.

Dos fragmentos de DNA, uno que codifica un fragmento N-terminal del dominio extracelular de hek y el otro que codifica un fragmento C-terminal del dominio extracelular de hek, se aislaron mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) realizadas bajo condiciones estándar, usando cebadores oligonucleotídicos basados en la secuencia de nucleótidos de hek publicada por Wicks y otros, anteriormente. La plantilla para la PCR era cDNA preparado a partir de mRNA aislado de una línea celular leucémica de células T humana denominada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1). Los productos de PCR que contenían el extremo 5' del DNA de hek se digirieron con SpeI y HindIII para aislar un fragmento de DNA que se extiende desde el extremo 5' de la secuencia de hek humano maduro (es decir, que carece de DNA que codifica la secuencia de señal) hasta un sitio HindIII encontrado en el gen hek. Los productos de PCR que contienen el extremo 3' del DNA del dominio extracelular de hek se digirieron con HindIII y ClaI para aislar un fragmento que se extiende desde el sitio HindIII interno hasta un sitio ClaI justo aguas abajo del extremo 3' de la secuencia que codifica el dominio extracelular de hek. El sitio ClaI es un sitio de clonación múltiple (mcs) introducido justo aguas abajo del dominio extracelular.

Se aisló DNA que codifica una muteína de la región Fc de un anticuerpo para IgG1 humana. Este DNA de muteína de Fc y el polipéptido codificado por el mismo se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/097.827, titulada "Nueva Citoquina que es un Ligando para OX40", presentada el 23 de julio de 1993. Este DNA de muteína se derivó de un DNA que codifica el polipéptido de Fc natural mediante mutagénesis dirigida al sitio efectuada esencialmente según se describe por Deng y Nickoloff, Anal. Biochem. 200:81 (1992). La secuencia de aminoácidos del polipéptido de la muteína de Fc es idéntica a la del polipéptido de Fc natural descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. Esta Fc de muteína exhibe afinidad reducida para receptores de inmunoglobulina.

Un vector recombinante que contiene el DNA de muteína de Fc se segmentó con ClaI y NotI, que segmentan el vector en una región policonectora inmediatamente aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del inserto de DNA de la muteína de Fc. Se aisló el fragmento que codifica la muteína de Fc deseado.

El polipéptido de Fc de muteína se extiende desde la región de bisagra N-terminal hasta el extremo C natural, es decir, es una región Fc de anticuerpo esencialmente de longitud completa. También pueden emplearse fragmentos de regiones Fc, por ejemplo los que están truncados en el extremo C-terminal. Los fragmentos contienen preferiblemente múltiples residuos de cisteína (al menos los residuos de cisteína de la región de bisagra) para permitir que se formen enlaces disulfuro intercatenarios entre las porciones del polipéptido de Fc de dos proteínas de fusión hek:Fc separadas, creando dímeros.

Un vector de expresión de mamífero denominado SMAG4 se segmentó con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una secuencia que codifica el péptido de señal de interleuqina 7 murina (descrita en la Patente de EE.UU. 4.965.195) insertada en el vector de alta expresión de mamífero pDC201 (descrito en Sims y otros, Science 241:585, 1988 y en la solicitud PCT WO 89/03884), que también es capaz de replicación en E. coli. SpeI segmenta el vector inmediatamente aguas abajo de la secuencia que codifica el péptido de señal de IL-7. NotI segmenta aproximadamente 155 pb aguas abajo del sitio SpeI en un sitio de clonación múltiple del vector. Se aisló el fragmento SpeI/NotI grande que contiene las secuencias vectoriales y el DNA que codifica el péptido de señal de IL-7.

Se efectuó una ligación cuatridireccional para insertar los dos fragmentos de DNA que codifican hek y el fragmento de DNA que codifica muteína de Fc descritos anteriormente en el vector de expresión SMAG4 segmentado con SpeI/NotI. Células de E. coli se transfectaron con la mezcla de ligación y el vector recombinante deseado se aisló de las mismas. El vector aislado codifica una proteína de fusión que comprende (desde el extremo N al C) el péptido de señal de IL-7 murina, el dominio extracelular de hek, cuatro aminoácidos codificados por los mcs introducidos y la muteína de Fc.

El vector de expresión se cotransfectó a continuación con el plásmido pSV3.NEO en células CV1/EBNA. La línea celular CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñón de mono como la descrita en McMahan y otros (EMBO J., 10:2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa antígeno T de SV40, que no es producido por las células huésped. Este vector pSV3.NEO es similar a pSV3 (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), pero contiene adicionalmente un gen de resistencia a neomicina. Las células transformadas se cultivaron para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secreta al medio de cultivo a través del péptido de señal de IL-7 murina. La proteína de fusión puede purificarse sobre una columna de proteína A-Sepharose, eluirse y usarse para rastrear células con respecto a la capacidad para unirse a la proteína hek:Fc o la proteína elk:Fc.

Ejemplo 5 Estudio de Unión

La capacidad de LERK-6 para unirse a elk o hek puede determinarse usando el siguiente ensayo. Se preparan células que expresan LERK-6 sobre la superficie celular. DNA de LERK-6 se amplifica mediante PCR. Los cebadores empleados en la PCR se seleccionan para definir los extremos de la región de codificación del DNA de LERK-6, y también incluyen un sitio de restricción Xho I en el extremo 5' y un sitio Not I en el extremo 3' del DNA amplificado. El cebador 5' incluía adicionalmente una secuencia Kozak de consenso aguas arriba del codón de iniciación.

Los productos de reacción se digieren con Xho I y Not I y se insertan en el vector de expresión segmentado con
Sal I (que es compatible con Xho I) y Not I. El vector de expresión puede ser pDC410, que es un vector de expresión de mamífero que también se replica en E. coli. pDC410 es similar a pDC406 (McMahan y otros, EMBO J. 10:2821, 1991). El sitio de clonación múltiple (mcs) de pDC410 difiere del pDC406 en que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada marco de lectura). Un promotor de polimerasa T7 aguas abajo del mcs facilita la secuenciación de DNA insertado en el mcs. Además, el origen de replicación de EBV se reemplaza por DNA que codifica el antígeno T grande de SV40 (conducido a partir de un promotor de SV40) en pDC410.

Células CV1-EBNA-1 en platos de 10 cm^{2} se transfectan con el vector de expresión recombinante que contiene DNA de LERK-6. La línea celular CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresa constitutivamente antígeno 1 nuclear de EBV conducido a partir del potenciador/promotor inmediato-temprano de CMV. CV1-EBNA-1 se deriva de la línea celular de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70), según se describe por McMahan y otros (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las células transfectadas se cultivan durante 24 horas y las células de cada plato se reparten a continuación en una placa de 24 pocillos. Después de cultivar 48 horas adicionales, se efectúa un ensayo de unión mediante el siguiente procedimiento. Las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/pocillo) se lavan con BM-NFDM, que es un medio de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM, pH 7,2) al que se han añadido 50 mg/ml de leche en polvo desnatada. Las células se incuban a continuación durante 1 hora a 37ºC con diversas concentraciones de la proteína de fusión elk:Fc preparada en el Ejemplo 2 o la proteína de fusión hek:Fc preparada en el Ejemplo 3. A continuación, las células se lavan y se incuban con una concentración saturante constante de una ^{125}I-anti-(IgG humana) de ratón en medio de unión, con agitación suave durante 1 hora a 37ºC. Después de un lavado intensivo, las células se liberan a través de tripsinización.

La anti-(IgG humana) de ratón empleada anteriormente se dirige contra la región Fc de IgG humana y puede obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se radioyoda usando el método de cloramina T estándar. El anticuerpo se unirá a la porción Fc de cualquier proteína de fusión elk:Fc o hek:Fc que se haya unido a las células. En todos los ensayos, la unión no específica de ^{125}I-anticuerpo se ensaya en ausencia de elk:Fc (o hek:Fc), así como en presencia de elk:Fc (o hek:Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo anti-(IgG humana) de ratón no marcado.

El ^{125}I-anticuerpo unido a células se cuantifica en un contador Packard Autogamma. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) se generan en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) desarrollado en ordenador Microvax.

Ejemplo comparativo 6

Anticuerpos Monoclonales para LERK-6

Este ejemplo ilustra un método para preparar anticuerpos monoclonales para LERK-6. LERK-6 purificado, un fragmento del mismo tal como el dominio extracelular, péptido sintético o células que expresan LERK-6 pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales contra LERK-6 usando técnicas convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la Patente de EE.UU. 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con LERK-6 como un inmunógeno emulsificado en adyuvante completo de Freund e inyectado en cantidades que varían de 10-100 \mug subcutáneamente o intraperitonealmente. De diez a doce días más tarde, los animales inmunizados se refuerzan con LERK-6 adicional emulsificado en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se refuerzan periódicamente más tarde con un esquema de inmunización de semanal a bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero mediante sangrado retroorbital o escisión en la punta de la cola para probar con respecto a anticuerpos para LERK-6 mediante ensayo de transferencia por gotas, ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción con Enzimas Ligadas) o inhibición de la unión a hek o elk.

Después de la detección de una concentración de anticuerpo apropiada, se les proporciona a los animales positivos una inyección intravenosa final de LERK-6 en solución salina. De tres a cuatro días más tarde, los animales son sacrificados, las células del bazo se recogen y las células del bazo se fusionan a una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NSI o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se cultivan en placa en múltiples placas de microvaloración en un medio selectivo para HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Las células de hibridoma se rastrean mediante ELISA con respecto a la reactividad contra LERK-6 purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y otros, Immunochem. 8:871, 1971 y la Patente de EE.UU. 4.703.004. Una técnica de rastreo preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann y otros, (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones BALB/c singeneicos para producir ascitis que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LERK-6-L. Alternativamente, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vitro en matraces o botellas giratorias mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden purificarse mediante precipitación con sulfato amónico, seguida por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también puede usarse cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, como también cromatografía de afinidad basada en la unión a LERK-6.

Ejemplo 7 Generación de Ratones Transgénicos que Sobreexpresan LERK-6

Este ejemplo describe un procedimiento para generar ratones transgénicos que sobreexpresan LERK-6. Los ratones transgénicos que sobreexpresan LERK-6 pueden estudiarse para determinar los efectos biológicos de la sobreexpresión. Pronúcleos de ratón (B16/J) se microinyectan con DNA de LERK-6 de acuerdo con el método descrito por Gordon y otros, Science 214:1244-1246, (1981). En general, los huevos de ratón fertilizados que tienen pronúcleos visibles se ponen en primer lugar en una cámara de inyección y se mantienen en su lugar con una pequeña pipeta. Se usa una pipeta de inyección para inyectar el gen que codifica el LERK-6 (por ejemplo, el clon Nº 6C) en los productos del huevo. Los huevos inyectados se (i) transfieren al oviducto de una hembra pseudopreñada 0,5 días después del coito; (ii) se cultivan in vitro hasta el estadio de dos células (durante la noche) y se transfieren al oviducto de una hembra pseudopreñada 0,5 días después del coito; o (iii) se cultivan in vitro hasta la fase de blastocisto y se transfieren al útero de una hembra pseudopreñada 2,5 días después del coito. Preferiblemente, puede usarse cualquiera de las dos primeras opciones ya que evitan el cultivo in vitro prolongado y, preferiblemente, aproximadamente 20-30 huevos microinyectados deben transferirse para evitar camadas pequeñas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citoquina Denominada LERK-6

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Immunex Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 51 University Street

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: WA

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(E)

PAÍS: EE. UU. DE A.

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(F)

ZIP: 98101

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(v)

FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC Compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/Windows 95

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Word para Windows, Versión 7.0a

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT - -pendiente de concesión- -

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 27 de agosto de 1998

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Henry, Janis C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.347

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2826

\hskip2.8cm

245-35829/RJP

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (206) 587-0430

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFÁX: (206) 233-0644

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 555 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: LERK-6

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..52

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 184 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 2:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATATTTACT GCCCGCACTA CAACAGCT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGAAGGCG CTGTAGCGCT GGAAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTCAAGC ACTGGCCAGA ACTCTCTCTG GAGT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 314 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..313

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 642 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..642

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido de Señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1-90

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 214 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

10

Claims (13)

1. Una secuencia de DNA aislada seleccionada del grupo que consiste en:

a)

DNA que codifica un polipéptido que se une a la tirosina quinasa receptora hek/elk y que comprende los aminoácidos 1 a 184 del Nº ID SEC: 10;

b)

DNA humano que es el complemento de DNA humano que se hibrida bajo condiciones altamente restrictivas al DNA de (a), en donde el DNA humano que es el complemento codifica un polipéptido que se une a hek/elk;

c)

DNA que, debido a la degeneración del código genético, codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el DNA de (a) o (b).

2. Una secuencia de DNA aislada que comprende los nucleótidos 88 a 642 del Nº ID SEC: 9.

3. Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 184 del Nº ID SEC: 10.

4. Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 145 del Nº ID SEC: 10.

5. Un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

6. Una célula huésped transfectada o transformada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un procedimiento para producir un polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6 bajo condiciones que promueven la expresión.

8. Un mamífero no humano transgénico, la totalidad de cuyo germen y células somáticas contienen una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 introducida en dicho animal.

9. Un método para separar células que tienen el receptor hek/elk sobre la superficie de las mismas de una mezcla de células en suspensión, que comprende poner en contacto las células en la mezcla con una superficie de contacto que tiene un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 sobre la misma, y separar la superficie de contacto y la suspensión.

10. Un método para aportar una molécula deseada a una célula in vitro que tiene hek/elk sobre su superficie, que comprende poner en contacto el hek/elk con una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 y la molécula deseada.

11. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 y una molécula deseada, para usar en el aporte de la molécula deseada a una célula que tiene hek/elk sobre su superficie.

12. Uso de una proteína que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 y una molécula deseada, en la fabricación de una proteína de fusión para el aporte de la molécula deseada a una célula que tiene hek/elk sobre su superficie.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4.