ES2315302T3 - Ensayo de capilaridad y procedimientos relacionados. - Google Patents

Ensayo de capilaridad y procedimientos relacionados. Download PDF

Info

Publication number
ES2315302T3
ES2315302T3 ES01965979T ES01965979T ES2315302T3 ES 2315302 T3 ES2315302 T3 ES 2315302T3 ES 01965979 T ES01965979 T ES 01965979T ES 01965979 T ES01965979 T ES 01965979T ES 2315302 T3 ES2315302 T3 ES 2315302T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
channel
sample
binding
union
target analyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01965979T
Other languages
English (en)
Inventor
Mack J. Fulwyler
Joe W. Gray
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California Berkeley, University of California San Diego UCSD filed Critical University of California Berkeley
Application granted granted Critical
Publication of ES2315302T3 publication Critical patent/ES2315302T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00479—Means for mixing reactants or products in the reaction vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00511—Walls of reactor vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00513—Essentially linear supports
    • B01J2219/0052—Essentially linear supports in the shape of elongated tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00628—Ionic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00657—One-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838—Capillaries
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/117497—Automated chemical analysis with a continuously flowing sample or carrier stream

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Un método para detectar la presencia de un primer analito diana en una muestra, comprendiendo dicho método: (a) Proporcionar: un sustrato; un canal en una superficie de dicho sustrato; un elemento de cobertura que se superpone y sella dicho canal, teniendo dicho elemento de cobertura una primera superficie de cara a la luz del canal; y una primera pareja de unión para dicho primer analito diana fijado a dicha primera superficie; (b) transportar dicha muestra a través de dicho canal a dicha primera pareja de unión de tal forma que el primer analito diana presente en dicha muestra se une a dicha primera pareja de unión; (c) transportar dicha muestra más allá de dicha primera pareja de unión; y (d) detectar la presencia de cualquier primer analito diana unido a dicha primera pareja de unión, donde dicho elemento de cobertura se desprende de dicho canal para permitir la detección de la presencia de cualquier primer analito diana unido a dicho primer elemento de unión.

Description

Ensayo de capilaridad y procedimientos relacionados.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Campo de la invención
Esta invención se refiere al campo del diagnóstico. En particular, esta invención proporciona dispositivos y métodos que permiten una detección y/o cuantificación rápida de múltiples analitos.
Antecedentes de la invención
Los tumores evolucionan por medio de la acumulación continua de cambios genéticos y epigenéticos que permiten que escapen de los controles celulares y ambientales normales. Estas anomalías pueden implicar genes que afecten al control del ciclo celular, apoptosis, angiogénesis, adhesión, señalización transmembrana, reparación del ADN y estabilidad genómica. Ya se han descubierto varios genes que contribuyen a este proceso. Sin embargo, el análisis a gran escala de la expresión génica y del número de copias de genes sugiere que el número de dichos genes puede ser grande, quizás extraordinariamente grande, y todavía no se han descubierto muchos genes importantes relacionados con el cáncer. La identificación de cambios recurrentes en el número de copias de genes, la organización, secuencia o expresión es una estrategia común para la identificación de genes que desempeñan un papel en el cáncer. Las técnicas de análisis de matrices a gran escala para la evaluación del número de copias genómicas, el nivel de expresión y los polimorfismos de la secuencia de ADN actualmente están acelerando la velocidad a la que pueden analizarse los tumores. Estas mismas tecnologías son prometedoras como plataformas de diagnóstico que pueden emplearse para evaluar cambios específicos en tumores individuales, permitiendo de este modo la selección de estrategias terapéuticas que sean óptimas para estos tumores.
La hibridación genómica comparativa basada en matrices (CGH) permite cambios en el número de copias de secuencias de ADN relativas a mapear en matrices de sondas clonadas. En la CGH de matrices, los ADN geonómicos totales de muestras de tumores y de referencia se marcan de forma independiente con diferentes fluorocromos o haptenos y se cohibridan con preparaciones cromosómicas normales junto con un exceso de ADN de Cot-1 sin marcar para inhibir la hibridación de secuencias repetidas marcadas. Las ventajas principales de la CGH son que mapea cambios en el número de copias a lo largo de todo un genoma complejo sobre un genoma de referencia normal de tal modo que las anomalías pueden relacionarse fácilmente con mapas físicos, genes y secuencias de ADN genómico existentes. Además, la CGH de matrices permite la evaluación cuantitativa de la dosificación de secuencia de ADN desde una copia por genoma de ensayo hasta cientos de copias por genoma. El trabajo inicial implicaba CGH en matrices compuestas por dianas que abarcaban > 100 kb de secuencia genómica, tales como BAC. Más recientemente, se ha demostrado CGH en matrices de ADNc. Las matrices de ADNc son atractivas para la CGH puesto que están cada vez más disponibles y llevan un número muy grande de clones. Además, la misma matriz puede usarse para evaluar la expresión y el número de copias.
También pueden detectarse polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) eficazmente mediante hibridación de representaciones del genoma amplificadas por PCR marcadas con fluorescencia con matrices compuestas por oligonucleótidos. En una matriz pueden estar presentes los dos alelos de cada uno de varios miles de marcadores de SNP y dianas con desacoplamientos de una sola base. La rigurosidad de la reacción de hibridación se ajusta de tal modo que la hibridación disminuye si existe un desacoplamiento de una sola base entre la sonda y el sustrato oligonucleotídico. Por lo tanto, su distintivo de hibridación puede determinar la presencia o ausencia de un alelo en la mezcla de hibridación. Esta técnica es rápida y se aumenta bien a escala para evaluaciones en todo el genoma de ligamientos o LOH (pérdida de homogeneidad).
Se han realizado enormes progresos en los últimos años en el desarrollo y la caracterización de secuencias de ADN de clones de ADNc de ser humano, ratón y otros organismos modelo. En humanos, estos datos se han ensamblado informáticamente en más de 8000 genes y 83.000 agrupamientos. Los clones de ADNc asociados con estas secuencias están disponibles públicamente. Estos clones y sus secuencias asociadas forman la base para una potente estrategia de micromatrices para el análisis a gran escala de la expresión génica. En esta estrategia, se hibridan muestras de ARNm marcadas con matrices de clones de ADNc u oligonucleótidos procedentes de las secuencias asociadas. Las matrices pueden estar sobre sustratos de silicio o sustratos de membrana. Las sondas marcadas pueden marcarse radiactivamente o con reactivos fluorescentes, de tal modo que las señales de hibridación resultantes pueden detectarse usando autorradiografía, formación de fosfoimágenes o formación de imágenes de fluorescencia.
Se han realizado matrices de ADNc y oligonucleótidos usando robots para desplazar ADN desde bandejas de microtitulación hasta sustratos de silicio o hasta membranas de nylon. Esta estrategia es flexible y está especialmente bien adaptada a la producción de matrices a medida, pero también se ha aplicado a la generación de matrices a gran escala que llevan 40.000 clones diferentes. Una alternativa es sintetizar matrices de oligonucleótidos directamente sobre sustratos de silicio usando estrategias fotolitográficas. Estas técnicas funcionan por proyección de luz a través de una máscara fotolitográfica sobre el sustrato de síntesis. Se han generado matrices de un solo oligonucleótido sobre sustratos de silicio con elementos que representan más de 40.000 genes/EST.
Los documentos WO 99/42809, WO 98/43739, EP-A-0 969 083 y US-A-5 952 173 describen métodos para detectar la presencia de una diana en una muestra usando dispositivos que comprenden un canal que tiene fijado sobre el mismo una pareja de unión para dicha diana.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las estrategias de matrices convencionales descritas anteriormente, aunque son potentes, están limitadas por la forma ineficaz en la que se usa la sonda y por los largos periodos de hibridación que se requieren. Estas limitaciones surgen de la necesidad para distribuir moléculas de sonda sobre una gran superficie durante la hibridación. Como resultado, la mayor parte de las moléculas de sonda están lejos de las dianas con las que podrían hibridar y se resiente la sensibilidad. Esto reduce la velocidad a la que se produce la hibridación y hace que la mayor parte de las moléculas de sonda nunca alcancen las dianas con las que podrían unirse, un fenómeno que se vuelve cada vez más limitante para oligonucleótidos largos con velocidades de difusión lentas. Este problema puede reducirse mediante el uso de cantidades relativamente grandes de sonda, mezcla vigorosa y el uso de reactivos de rellenado de espacio tales como sulfato de dextrano en las mezclas de hibridación. Sin embargo, todavía es necesaria una mejora sustancial para permitir el uso práctico del ADN o ARN recuperado a partir de pequeñas cantidades de material (por ejemplo, recogido por microdisección) y para aumentar la velocidad de hibridación.
Resumen de la invención
La invención proporciona un método de detección de la presencia de un primer analito diana en una muestra. El método emplea un canal que tiene fijado en el mismo una primera pareja de unión para el primer analito diana como se define en las reivindicaciones. La pareja de unión es preferiblemente un anticuerpo, una proteína de unión o un ácido nucleico. El método implica transportar la muestra a través del canal hasta la primera pareja de unión, de tal modo que el primer analito diana presente en la muestra se une la primera pareja de unión. Un primer bolo o burbuja de un fluido que es inmiscible con la muestra precede a la muestra durante el transporte y un segundo bolo o burbuja de un fluido que es inmiscible con la muestra sigue a la muestra durante el transporte. Después, la muestra se transporta más allá de la primera pareja de unión y se detecta la presencia de cualquier analito diana unido a la primera pareja de unión.
El método emplea un canal formado en una superficie de un sustrato y un elemento de cobertura recubre y sella el canal y tiene una primera superficie de cara hacia la luz del canal. El elemento de cobertura está unido al sustrato de forma que puede retirarse. En una variación particularmente preferida de esta realización, el canal tiene una superficie luminal hidrófoba. En este caso, la primera superficie del elemento de cobertura es preferiblemente hidrófila. Como está presente un elemento de cobertura, la primera pareja de unión se fija a la primera superficie del elemento de cobertura.
En una realización preferida, los fluidos inmiscibles que preceden y siguen a la muestra son burbujas de gas. En una realización particularmente preferida, se forma una película de fluido de aproximadamente 1 \mum o menos de grosor que contiene el primer analito diana entre una burbuja de gas después de la muestra y una superficie luminal del canal o elemento de cobertura.
Para mejorar la mezcla del analito diana y la presentación a las parejas de unión, la muestra puede dividirse en al menos dos segmentos que están separados por un bolo o burbuja de un fluido que es inmiscible con la muestra.
Si se desea, una solución de tampón puede seguir al bolo o burbuja de fluido inmiscible que sigue a la muestra. Al igual que la muestra, la solución de tampón puede dividirse en al menos dos segmentos que están separados por un bolo o burbuja de un fluido que es inmiscible con la solución de tampón.
El uso de bolos o burbujas de fluido inmiscible en los métodos de la invención mejora la eficacia de la unión analito diana-pareja de unión y, por lo tanto, aumenta la velocidad a la que pueden realizarse los ensayos. En realizaciones preferidas, la muestra se transporta a través del canal a una velocidad de al menos aproximadamente 1 mm/segundo. Puede emplearse cualquier método de transporte de fluidos, pero preferiblemente el fluido se transporta por fuerza electroforética.
La invención también proporciona un dispositivo que incluye un sustrato; un canal en una superficie del sustrato; un elemento de cobertura que recubre y sella el canal, donde el elemento de cobertura tiene una primera superficie de cara hacia la luz del canal; y una primera pareja de unión para el primer analito diana fijado en la primera superficie donde dicho elemento de cobertura está unido de forma retirable a dicho sustrato. La invención proporciona además un método de detección de la presencia de un primer analito diana en una muestra, que emplea dicho dispositivo. El método implica transportar la muestra a través del canal hasta la primera pareja de unión, de tal modo que el primer analito diana presente en la muestra se une a la primera pareja de unión, transportar la muestra más allá de la primera pareja de unión y detectar la presencia de cualquier primer analito diana unido a la primera pareja de unión.
Otro dispositivo descrito en este documento incluye un canal definido por una pared de canal, un miembro que se proyecta hacia la luz del canal y una primera pareja de unión para el primer analito diana fijado al miembro. Preferiblemente, el canal es un tubo capilar y el miembro es una fibra insertada en el tubo capilar.
En realizaciones preferidas, los dispositivos de la invención incluyen un electrodo al que puede aplicarse una tensión para inducir el transporte del primer analito diana hacia o lejos de la primera pareja de unión. Preferiblemente, una capa de infiltración recubre el electrodo y la primera pareja de unión está unido a la capa de infiltración.
Los dispositivos y métodos de la invención están particularmente bien adaptados para realizar ensayos de múltiples analitos, en cuyo caso el canal tiene una pluralidad de diferentes parejas de unión fijados en el mismo a diferentes localizaciones, como se define en las reivindicaciones.
Otro aspecto descrito en este documento es un método de producción de una matriz de parejas de unión que implica introducir un bolo de una primera pareja de unión en un canal, introducir un bolo o burbuja de un fluido inmiscible en el canal después de la primera pareja de unión, e introducir un bolo de una segunda pareja de unión en el canal después del fluido inmiscible. Preferiblemente, el canal es un tubo de carga con una superficie luminal hidrófoba y cada bolo de pareja de unión está encapsulado en aceite. Este método implica además insertar el tubo de carga en un tubo de ensayo; transferir el primer y la segunda parejas de unión, separados por el bolo o burbuja de fluido inmiscible, al interior del tubo de ensayo; fijar el primer y el segundo parejas de unión a una superficie luminal del tubo de ensayo a diferentes localizaciones; y retirar el tubo de carga del tubo de ensayo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra un método de unión de diferentes parejas de unión en diferentes localizaciones en un tubo de ensayo de acuerdo con la invención.
La Figura 2 ilustra un método de administración de diferentes parejas de unión a diferentes localizaciones en un tubo de ensayo que minimice la "transmisión" de una pareja de unión al siguiente.
La Figura 3 es una ilustración esquemática de un dispositivo de la invención en el que las parejas de unión están unidos, a través de una capa de infiltración, a un electrodo central que se proyecta hacia la luz de un canal.
La Figura 4 muestra la mezcla que se produce en una muestra transportada a través de un canal, cuando la muestra está precedida y seguida por un bolo o burbuja de un fluido inmiscible.
La Figura 5 ilustra una realización de la invención en la que la presentación del analito diana a parejas de unión fijados en un canal se potencia por la formación de una película delgada de solución de muestra que contiene el analito diana entre un bolo o burbuja de fluido inmiscible que sigue a la muestra.
La Figura 6 muestra una realización de la invención en la que un bolo de solución de muestra se divide en segmentos por bolos o burbujas de fluido inmiscible, al igual que un bolo de solución de tampón que sigue a la solución de muestra.
La Figura 7 ilustra la detección de fluorescencia de analitos diana marcados unidos a parejas de unión afines en un tubo capilar.
La Figura 8 es una ilustración esquemática de un dispositivo de acuerdo con la invención en el que parejas de unión de ácido nucleico se fijan en un elemento de cobertura plano, que está unido a un sustrato que incluye un canal. Este dispositivo se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 9 es una ilustración de una versión modificada del dispositivo de la Figura S, que incluye electrodos colocados bajo los elementos de unión a ácido nucleico para proporcionar una potenciación electroforética de la hibridación. Este dispositivo se describe en el Ejemplo 2.
Descripción detallada I. Métodos y Dispositivos para una Detección Eficaz de Múltiples Analitos
Esta invención proporciona nuevos métodos y dispositivos para la detección y/o cuantificación rápida de uno o más analitos diana en una muestra como se define en las reivindicaciones. La invención incluye un canal en el que se fija uno o más parejas de unión. La pareja o parejas de unión son específicos para un analito que se va a detectar. Diferentes parejas de unión pueden localizarse en diferentes localizaciones en el canal, de tal modo que la unión del analito diana correspondiente puede detectarse y/o cuantificarse en cada localización de pareja de unión.
II. Definiciones
Un "analito diana" es cualquier molécula o moléculas que se van a detectar y/o cuantificar en una muestra. Los analitos diana preferidos incluyen biomoléculas tales como ácidos nucleicos, anticuerpos, proteínas, azúcares y similares.
Las expresiones "pareja de unión" o "miembro de un par de unión" se refieren a moléculas que se unen específicamente a otras moléculas para formar un complejo de unión tal como anticuerpo-antígeno, lectina-carbohidrato, ácido nucleico-ácido nucleico, biotina-avidina, etc. En realizaciones particularmente preferidas, la unión está predominantemente mediada por interacciones no covalentes (por ejemplo, iónicas, hidrófobas, etc.). Las expresiones "pareja de unión" y "miembro de un par de unión" se aplican a moléculas individuales, así como a un conjunto de múltiples copias de dichas moléculas, por ejemplo, fijadas en una localización diferente de una superficie. Por lo tanto, como se usa en este documento, la expresión "diferentes parejas de unión" incluye conjuntos de diferentes parejas de unión, donde cada conjunto incluye múltiples copias de un tipo de pareja de unión que difiere de las parejas de unión presentes en todos los demás conjuntos de parejas de unión.
El término "anticuerpo", como se usa en este documento, incluye diversas formas de anticuerpos modificados o alterados, tales como una inmunoglobulina intacta, un fragmento Fv que contiene sólo las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, un fragmento Fv unido por un puente disulfuro (Brinkmann et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 547-551), un fragmento Fab o (Fab)'2 que contiene las regiones variables y partes de las regiones constantes, un anticuerpo monocatenario y similares (Bird et al. (1988) Science 242: 424-426; Huston et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). El anticuerpo puede ser de origen animal (especialmente de ratón o rata) o humano o puede ser quimérico (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855) o humanizado (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525 y publicación de solicitud de Patente del Reino Unido Nº 8707252).
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma indistinta en este documento para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos aminoacídicos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que contienen sólo aminoácidos naturales. La expresión "proteína de unión" se refiere a cualquier pareja de unión proteico distinto de un anticuerpo, como se ha definido anteriormente.
Las expresiones "ácido nucleico", "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en este documento se refieren a al menos dos nucleótidos unidos entre sí covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención es preferiblemente monocatenario o bicatenario y contendrá generalmente enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se indica a continuación, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden tener estructuras alternativas, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925) y referencias en este documento; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; y Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419), fosforotioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 1437; y Patente de Estados Unidos Nº 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 2321, enlaces O-metilfosforamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), y estructuras y enlaces de ácidos péptido nucleicos (véase Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los de estructuras positivas (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097; estructuras no iónicas (Patente de Estados Unidos Nº 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13: 1597; capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research," Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34: 17; Tetralzedron Lett. 37: 743 (1996)) y estructuras sin ribosa, incluyendo las descritas en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.235.033 y 5.034.506 y los capítulos 6 y 7 de ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook. También se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos (véase Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev., páginas 169-176). Se describen varios análogos de ácidos nucleicos en Rawls, C & E News June 2, 1997 página 35. Estas modificaciones de la estructura de ribosa-fosfato pueden realizarse para facilitar la adición de restos adicionales tales como marcadores o para aumentar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos.
La expresión "se une específicamente" como se usa en este documento, cuando se refiere a un analito diana (por ejemplo, proteína, ácido nucleico, anticuerpo, etc.), se refiere a una reacción de unión que detecta la presencia del analito diana en una población heterogénea de moléculas (por ejemplo, proteínas y otros agentes biológicos). Por lo tanto, en las condiciones designadas (por ejemplo, condiciones de inmunoensayo en el caso de un anticuerpo o condiciones de hibridación rigurosa en el caso de un ácido nucleico), la pareja de unión especificado se une a su analito diana particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra.
Las expresiones "que hibrida específicamente con", "hibridación específica" e "hibrida selectivamente con", como se usan en este documento, se refieren a la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula de ácido nucleico de forma preferente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que una sonda hibridará de forma preferente con su subsecuencia diana y, en un grado menor o nada en absoluto con otras secuencias. La hibridación rigurosa y las condiciones de lavado de hibridación rigurosa en el contexto de la hibridación de ácidos nucleicos son dependientes de la secuencia y son diferentes en diferentes parámetros ambientales. Se encuentra una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte 1, capítulo 2, Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, NY ("Tijssen"). Generalmente, se seleccionan una hibridación y condiciones de lavado altamente rigurosas para que sean inferiores en aproximadamente 5ºC al punto de fusión térmica (T_{m}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{m} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda con la que corresponde perfectamente. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para que sean iguales a la T_{m} de una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios en una matriz o en un filtro en una transferencia de Southern o Northern es una temperatura de 42ºC usando soluciones de hibridación convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY), llevándose a cabo la hibridación durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con SSC 0,2x a 65ºC durante 15 minutos (véase, por ejemplo, Sambrook, mencionado anteriormente) para una descripción del tampón SSC). Con frecuencia, un lavado de alta rigurosidad está precedido por un lavado de baja rigurosidad para eliminar señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de un lavado de rigurosidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es SSC 1x a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de baja rigurosidad para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es SSC 4x a 6x a 40ºC durante 15 minutos.
El término "canal" se refiere a una trayectoria que dirige el flujo de fluido en una dirección particular. El canal puede formarse como un surco o zanja que tiene un fondo y lados, o como un "tubo" completamente encerrado. En algunas realizaciones, el canal ni siquiera necesita tener "lados". Por ejemplo, un polímero hidrófobo puede aplicarse en una superficie plana y de este modo confinar y/o dirigir el flujo de fluido en esa superficie en un dominio estrecho (por ejemplo, hidrófilo). El canal, incluye preferiblemente al menos una superficie a la que puede fijarse una pareja de unión.
El término "microcanal" se usa en este documento para un canal que tiene una dimensión característica de aproximadamente 100 \mum o menos.
La expresión "dimensión característica" se usa en este documento para denotar la dimensión que determina el número de Reynolds (Re) como se conoce en la técnica. Para un canal cilíndrico, es el diámetro de la sección transversal. Para un canal rectangular, la dimensión característica depende principalmente de la menor entre la anchura y la profundidad. Para un canal en forma de V, depende de la anchura de la parte superior de la "V", y así sucesivamente. El cálculo de Re y, por lo tanto, las dimensiones características para canales de diversas morfologías puede encontrarse en textos convencionales sobre mecánica de fluidos (por ejemplo, Granger (1995) Fluid Mechanics, Dover, N.Y.; Meyer (1982) Introduction to Mathematical Fluid Dynamics, Dover, N.Y.).
La expresión "tubo capilar" se refiere a un tubo de un diámetro de sección transversal pequeño. Los tubos capilares de extremos abiertos de material hidrófilo, cuando se ponen en contacto con agua, típicamente captan el agua por acción capilar. Los tubos capilares pueden fabricarse de varios materiales incluyendo, pero sin limitación, vidrio, plástico, cuarzo, cerámica y diversos silicatos.
Un "tubo de electroforesis capilar" se refiere a un "tubo capilar" diseñado para y/o usado típicamente o destinado a usarse en un dispositivo de electroforesis capilar.
El término "inmiscible" se refiere a la ausencia de una mezcla sustancial entre dos fluidos diferentes. Por lo tanto, un primer fluido es inmiscible en un segundo cuando los dos fluidos se mantienen en fases fluidas separadas en las condiciones usadas.
Como se usa en este documento con respecto a las parejas de unión, la expresión "localización diferente" significa que cada pareja de unión está físicamente separado de cualquier otra pareja de unión, de tal modo que una señal (por ejemplo, una señal fluorescente) de una molécula marcada unida a una pareja de unión puede atribuirse exclusivamente a la unión a esa pareja de unión.
Como se usa en este documento, la expresión "fuerza electroforética" es la fuerza por la que los iones en un medio fluido se transportan hacia un electrodo con carga opuesta en respuesta a un gradiente de tensión.
La expresión "fuerza electroosmótica" se refiere a esa fuerza por la que las cargas en una pared de canal generan una envoltura de contraiones en el fluido adyacente que mueve la columna de fluido y los solutos contenidos en la misma a lo largo del canal en respuesta a un gradiente de tensión.
El término "matriz" se refiere a un grupo de elementos en el que cada elemento puede identificarse de forma única. Por ejemplo, el término puede referirse a un sustrato que lleva una organización de elementos, de tal modo que cada elemento tiene una localización física en la superficie del sustrato que es diferente de la localización de cualquier otro elemento. En dicha matriz, cada elemento puede identificarse simplemente en virtud de su localización. Las matrices típicas de este tipo incluyen elementos organizados de forma lineal o en una matriz bidimensional.
III. Componentes del Dispositivo A. Canal 1. Tipos y Dimensiones de Canales
El dispositivo de la invención incluye un canal. En la invención puede usarse prácticamente cualquier tipo de canal. Los tipos de canales apropiados incluyen, pero sin limitación, tubos, surcos, canales formados por barreras opuestas y similares. Un tubo preferido es un tubo capilar, tal como un tubo capilar adecuado para uso en electroforesis capilar. En un dispositivo preferido, el canal es un surco formado en la superficie de un sustrato y el dispositivo incluye un elemento de cobertura que recubre y sella el canal. El elemento de cobertura está unido al sustrato de manera que puede separarse de éste. En un dispositivo alternativo descrito en este documento, el canal es un tubo capilar y un miembro al que se fijan uno o más parejas de unión se proyecta hacia la luz del canal. El miembro puede ser una fibra insertada en el tubo capilar.
El canal puede tener prácticamente cualquier tipo de sección transversal, por ejemplo, circular, cuadrada, rectangular, triangular, en forma de V, en forma de U, hexagonal, octagonal, irregular y similares. El canal puede tener cualquier configuración conveniente incluyendo, pero sin limitación, lineal, curvada, serpentina (por ejemplo, un porción lineal unida por una curva o bucle a otra porción lineal, que a su vez se une por una curva o bucle a una tercera rama lineal). En una realización preferida, el canal define una trayectoria de serpentina, preferiblemente una que incluye porciones lineales alineadas de tal modo que los ejes largos de las porciones lineales son paralelos. Dicho canal se denomina en este documento canal "plegado". Los canales plegados de la invención pueden incluir tantas porciones lineales como se desee. La longitud de cada porción lineal puede variar, dependiendo de la aplicación.
Cualquier material de canal es adecuado para la práctica de esta invención siempre que el material sea esencialmente estable frente a las soluciones que pasan a su través. Los materiales preferidos son capaces de unirse, o de derivatizarse para unirse, a la pareja de unión o a un enlazador con la pareja de unión. Además, en una realización preferida, el material se selecciona y/o se modifica de tal modo que no se une sustancialmente al analito diana. Los materiales preferidos tampoco se unen, ni interaccionan de otro modo con otros componentes (por ejemplo, marcadores), cuya unión tendería a aumentar la señal de "fondo" en los métodos de ensayo de la invención. Las mismas consideraciones se aplican a un elemento de cobertura o miembro que se proyecta hacia la luz del canal si está presente. Se prefieren particularmente elementos de cobertura de vidrio o cuarzo para uso en los dispositivos de la invención.
En una realización preferida, la superficie luminal del canal o una porción de la misma es suficientemente hidrófoba para reducir la tendencia de una solución acuosa que pasa a través del canal a dejar atrás una película residual. En una realización particularmente preferida, el canal incluye una superficie luminal hidrófila a la que se unen uno o más parejas de unión y una superficie luminal hidrófoba a la que no se unen parejas de unión. Esta realización se prefiere cuando la muestra se transporta usando un flujo segmentado, como se describe con mayor detalle a continuación. En una variación de esta realización, el dispositivo tiene un canal con una superficie luminal hidrófoba y un elemento de cobertura que recubre y sella el canal. Una superficie del elemento de cobertura de cara a la luz del canal es preferiblemente hidrófila y uno o más parejas de unión se fijan a esta superficie hidrófila. De forma similar, en un dispositivo descrito en este documento que incluye un miembro que se proyecta hacia la luz del canal, una superficie del miembro es hidrófila y uno o más parejas de unión se fijan a la misma.
Los materiales del canal/elemento de cobertura/miembro de proyección particularmente preferidos incluyen, pero sin limitación, vidrio, silicio, cuarzo u otros minerales, plástico(s), cerámicas, metales, papel, metaloides, materiales semiconductores, cementos y similares. Además, pueden usarse sustancias que forman geles tales como proteínas (por ejemplo, gelatinas), lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas. Pueden emplearse una amplia diversidad de polímeros orgánicos e inorgánicos, tanto naturales como sintéticos, como materiales de canal. Los polímeros ilustrativos incluyen polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), rayón, nylon, poli(butirato de vinilo), difluoruro de polivinilideno (PVDF), polidimetilsiloxano (PDMS), siliconas, poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa y similares.
Los materiales de canal poliméricos pueden ser rígidos, semirrígidos o no rígidos, opacos, semiopacos o transparentes dependiendo del uso para el que se deseen. Por ejemplo, los dispositivos que incluyen un elemento de detección óptica o visual se fabrican generalmente, al menos en parte, a partir de materiales transparentes para permitir o al menos facilitar esa detección. Como alternativa, pueden incorporarse ventanas transparentes de, por ejemplo, vidrio o cuarzo en el dispositivo. Además, los materiales poliméricos pueden tener estructuras lineales o ramificadas y pueden ser reticulados o no reticulados. Los ejemplos de materiales poliméricos particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), poliuretano, poli(cloruro de vinilo) (VPC), poliestireno, polisulfona, policarbonato y similares.
Los materiales conductores o semiconductores incluyen preferiblemente una capa aislante sobre la superficie luminal del canal. Esto es particularmente importante cuando el dispositivo incorpora elementos eléctricos (por ejemplo, sistemas de dirección de fluidos eléctricos, detectores eléctricos y similares).
El dispositivo incluye un elemento de cobertura que sella un canal y los materiales del elemento de cobertura y del canal deben seleccionarse para proporcionar un precinto suficientemente hermético para impedir la pérdida de fluido durante el uso. Una o más parejas de unión se unen a una superficie del elemento de cobertura que está de cara al canal. Después de realizar un ensayo, cualquier analito unidos a la pareja o parejas de unión puede detectarse por medio de la retirada del elemento de cobertura y la colocación del elemento de cobertura en un detector. En este caso, el elemento de cobertura está diseñado preferiblemente para facilitar la detección de analitos. Por ejemplo, si el analito está marcado con un marcador de absorción de luz, tal como, por ejemplo, un marcador fluorescente, el elemento de cobertura se fabrica preferiblemente de un material que proporcione una baja señal del fondo en el sistema de detección. Por lo tanto, cuando se usan marcadores fluorescentes, se emplea un material que tiene un bajo nivel de autofluorescencia, por ejemplo, vidrio, en el elemento de cobertura. Se aplican consideraciones similares al miembro de proyección en dispositivos en los que la pareja o parejas de unión se fijan a un miembro, tal como una fibra, que se proyecta hacia la luz del canal.
Las dimensiones del canal son preferiblemente tan pequeñas como sea posible, lo cual es coherente con la facilidad de manipulación y la estabilidad mecánica, para reducir la cantidad de muestra necesaria para un ensayo y para reducir las distancias que debe recorrer un analito para alcanzar una pareja de unión fijado en el canal. El intervalo preferido de las dimensiones características de los canales es de entre aproximadamente 0,5 \mum y aproximadamente 100 mm. Los canales particularmente preferidos varían de una dimensión característica de aproximadamente 1 \mum a aproximadamente 5 mm. Más preferiblemente, el canal es un microcanal, por ejemplo, con una dimensión característica entre aproximadamente 5 \mum y aproximadamente 100 \mum. Un intervalo de dimensiones características más preferido está entre aproximadamente 5 \mum y 50 \mum. La longitud del canal dependerá del tipo de canal, configuración, dimensión característica y localización y número de parejas de unión. Los canales preferidos son de menos de aproximadamente 500 cm, más preferiblemente de aproximadamente 1 \mum a aproximadamente 300 cm, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 100 cm.
El canal puede ser un componente de un artículo de mayor tamaño. Por lo tanto, el canal puede ensamblarse con uno o más de otros canales para proporcionar una multiplicidad de canales mediante los que pueden realizarse al mismo tiempo varios ensayos diferentes. El canal también puede ser un componente de un instrumento que incluye funciones de manipulación de líquidos y/o detección y/o procesamiento de muestra/aplicación apropiadas. Si se desea, el canal o canales de acuerdo con la invención pueden fabricarse como parte de una unidad reutilizable o desechable que puede "conectarse" convenientemente en un instrumento para ejecutar los ensayos de esta invención.
Se entenderá que el canal o canales pueden proporcionarse sobre cualquiera de una amplia diversidad de artículos incluyendo, pero sin limitación, una placa de microtitulación (por ejemplo, de PVC, polipropileno o poliestireno), un tubo de ensayo (de vidrio o plástico), una varilla (por ejemplo, de vidrio, PVC, polipropileno, poliestireno, látex y similares), un tubo de microcentrífuga o una perla de vidrio, sílice, plástico, metálica o polimérica. En realizaciones particularmente preferidas, se proporcionan uno o más canales como un canal capilar sobre un portaobjetos de vidrio o silicio, como un tubo capilar (por ejemplo, un tubo de electroforesis capilar), o fabricado como un elemento de un "circuito integrado" que tiene a bordo elementos de circuito para el control de la aplicación de muestra, flujo de líquido y/o detección de la señal.
2. Fabricación de Canales
Se conocen bien por los especialistas en la técnica métodos de fabricación de los canales de esta invención. Por ejemplo, cuando el canal está formado por uno o más tubos capilares, los capilares pueden adquirirse de proveedores comerciales (por ejemplo, Polymicron Technologies, Tucson, AZ) o extraerse o extruirse mediante máquinas "de extracción" capilar convencionales.
Cuando los canales se fabrican en una superficie, pueden formarse usando técnicas convencionales, por ejemplo, pueden elaborarse a máquina, moldearse, tallarse, grabarse, laminarse, extruirse o depositarse, etc.
En una realización preferida, el canal o los canales se fabrican usando procesos de micromecanizado (por ejemplo, fotolitografía) bien conocidos en la industria electrónica de estado sólido. Con frecuencia se construyen microdispositivos, por ejemplo, microcanales, a partir de de sustratos de material semiconductor tales como silicio cristalino, ampliamente disponibles en forma de una oblea semiconductora usada para producir circuitos integrados, o de vidrio. La fabricación de microdispositivos a partir de un sustrato de oblea semiconductora puede beneficiarse de la gran experiencia en técnicas de grabado tanto superficial como masivo desarrolladas por la industria de procesamiento de semiconductores para la producción de circuitos integrados (IC).
El grabado superficial, usado en la producción de IC para definir patrones superficiales delgados en una oblea semiconductora, puede modificarse para permitir el grabado sacrificial de corte sesgado de capas delgadas de materiales semiconductores para generar elementos movibles. El grabado masivo, usado típicamente en la producción de IC cuando se forman zanjas profundas en una oblea usando procesos de grabado anisotrópico, puede usarse para confeccionar con exactitud bordes o zanjas en microdispositivos. Tanto el grabado superficial como el grabado masivo de obleas puede realizarse con "procesamiento en húmedo" usando agentes químicos tales como hidróxido de potasio en solución para eliminar el material no enmascarado de una oblea. Para la construcción de microdispositivos, también es posible emplear técnicas de procesamiento en húmedo anisotrópico que se basan en las diferentes orientaciones cristalográficas de los materiales o usar interruptores de grabado electroquímicos para definir diversos elementos de canal.
El "procesamiento de grabado en seco" es otra técnica que permite una gran flexibilidad en el diseño de microdispositivos. Esta técnica de procesamiento es particularmente adecuada para el grabado anisotrópico de estructuras finas. El procesamiento de grabado en seco incluye muchas técnicas de grabado en fase gaseosa o de plasma que varían desde procesos de pulverización iónica altamente anisotrópicos que bombardean una oblea con átomos de alta energía o iones para desplazar átomos de la oblea hacia la fase de vapor (por ejemplo, molienda de haz de iones), hasta técnicas de plasma de baja energía algo isotrópicas que dirigen una corriente de plasma que contiene iones químicamente reactivos contra una oblea para inducir la formación de productos de reacción volátiles.
El intermedio entre técnicas de pulverización iónica de alta energía y técnicas de plasma de baja energía es un proceso de grabado en seco particularmente útil conocido como grabado por iones reactivos. El grabado por iones reactivo implica dirigir una corriente de plasma que contiene iones contra una oblea semiconductora u otra oblea para la pulverización iónica y el grabado de plasma simultáneo. El grabado por iones reactivos conserva algunas de las ventajas de la anisotropía asociadas con la pulverización iónica, al tiempo que aún proporciona iones de plasma reactivos para la formación de productos de reacción en fase de vapor en respuesta al contacto de los iones de plasma reactivos con la oblea. En la práctica, la velocidad de eliminación de material de la oblea está enormemente aumentada con respecto a las técnicas de pulverización iónica o a las técnicas de plasma de baja energía consideradas individualmente. El grabado por iones reactivos, por lo tanto, tiene el potencial de ser un proceso de grabado superior para la construcción de microdispositivos, pudiendo mantenerse velocidades de grabado anisotrópico relativamente altas. Las técnicas de micromecanizado descritas anteriormente, así como muchas otras, son bien conocidas por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Choudhury (1997) The Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication, Soc. Photo-Optical Instru. Engineer, Bard & Faulkner (1997) Fundamentals of Microfabrication). Además, pueden encontrarse ejemplos del uso de técnicas de micromecanizado sobre chips de vidrio de silicio o borosilicato en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.194.133, 5.132.012, 4.908.112 y 4.891.120.
En una realización, el canal se micromecaniza en una oblea de silicio (100) usando técnicas de fotolitografía convencionales para diseñar los canales y los orificios de conexión. Se usa pirocatecol de etilendiamina (EDP) para un grabado de dos etapas y una placa de recubrimiento Pyrex 7740 puede unirse anódicamente a la cara del silicio para proporcionar un sistema líquido cerrado. En este caso, pueden realizarse conexiones líquidas en la parte posterior del silicio.
En otras realizaciones, el canal puede construirse por depósito de material sobre un sustrato para formar paredes de canales (por ejemplo, usando pulverización iónica u otra tecnología de deposición) o el canal puede colarse/moldearse en un material. Los canales colados/moldeados se fabrican fácilmente a partir de una amplia diversidad de materiales incluyendo, pero sin limitación, diversos metales, plásticos o vidrios. En ciertas realizaciones preferidas, el canal o canales se moldean en diversos elastómeros (por ejemplo, polietileno clorosulfonadoalquilado (Acsium®), elastómeros de poliolefina (por ejemplo, Engage®), polietileno clorosulfonado (por ejemplo, Hypalon®), perfluoroelastómero (por ejemplo, Kalrez®), neopreno-policloropreno, terpolímeros de etileno-propileno-dieno (EPDM), polietileno clorado (por ejemplo, Tyrin®), diversos polímeros de siloxano (por ejemplo, polidimetilsiloxano), etc.).
Pueden producirse canales microscópicos en PDMS mediante un método que se basa en la oxidación de PDMS en plasma de oxígeno. (Véase Anal. Chem. 70: 4974 (1998)). El PDMS oxidado sella irreversiblemente a otros materiales usados en sistemas de microfluidos tales como vidrio, óxido de silicio y poliestireno oxidado.
B. Parejas de Unión
Una o más parejas de unión que se unen específicamente a un analito diana que se va a detectar se fijan en el canal o canales de la invención como se define en las reivindicaciones. La pareja o parejas de unión usados en esta invención se seleccionan en base a los analitos diana que se van a identificar/cuantificar. Por lo tanto, por ejemplo, cuando el analito diana es un ácido nucleico, la pareja de unión es preferiblemente un ácido nucleico o una proteína de unión a ácidos nucleicos. Cuando el analito diana es una proteína, la pareja de unión es preferiblemente un receptor, un ligando o un anticuerpo que se une específicamente a esta proteína. Cuando el analito diana es un azúcar o una glicoproteína, la pareja de unión es preferiblemente una lectina, y así sucesivamente. Un dispositivo de la invención puede incluir varios tipos diferentes de parejas de unión, por ejemplo, múltiples ácidos nucleicos de diferente secuencia y/o ácidos nucleicos combinados con proteínas en el mismo dispositivo. Esto último facilitaría, por ejemplo, el control simultáneo de la expresión génica a nivel del ARNm y las proteínas. Los especialistas en la técnica pueden imaginar otras combinaciones de diferentes tipos de parejas de unión y están dentro del alcance de la invención. Los especialistas en la técnica conocen bien métodos de síntesis o aislamiento de dichas parejas de unión.
1. Preparación de Parejas de Unión a. Ácidos Nucleicos
Pueden producirse ácidos nucleicos para el uso como parejas de unión en esta invención o aislarse de acuerdo con cualquiera de varios métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. En una realización, el ácido nucleico puede ser un ácido nucleico natural aislado (por ejemplo, ADN genómico, ADNc, ARNm, etc.). Se conocen bien por los especialistas en la técnica métodos de aislamiento de ácidos nucleicos naturales (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
También pueden amplificarse ácidos nucleicos útiles en la invención a partir de una muestra de ácido nucleico. Se han descrito varias técnicas de amplificación, pero la usada más ampliamente es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188, así como en Saiki (1985) Science 230: 1350. La PCR supone hibridar dos cebadores a secuencias sustancialmente complementarias que flanquean una secuencia diana en un ácido nucleico. Una serie repetida de etapas de reacción que implica desnaturalización de la plantilla, hibridación de cebadores y extensión de los cebadores hibridados mediante una ADN polimerasa da como resultado la acumulación geométrica de la secuencia diana, cuyos extremos se definen por los extremos 5' de los cebadores. Como la desnaturalización se lleva a cabo típicamente a temperaturas que desnaturalizan a la mayoría de las ADN polimerasas (por ejemplo, aproximadamente 93ºC-95ºC), típicamente se usa una polimerasa termoestable, tal como las procedentes de Thermus thermophilus, Thermus aquaticus (Taq) o Thermus flavus para la extensión para evitar la necesidad de añadir más polimerasa para cada ciclo de extensión.
En una realización preferida, el ácido nucleico se genera de novo, por ejemplo a través de síntesis química. En una variación preferida de esta realización, se sintetizan químicamente ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos) de acuerdo con el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, por ejemplo, usando un sintetizador automático como se describe en Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168. La purificación de oligonucleótidos, cuando es necesaria, se realiza típicamente por electroforesis en gel de acrilamida nativo o mediante HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson y Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137-149. La secuencia de los oligonucleótidos sintéticos puede verificarse usando el método de degradación química de Maxam y Gilbert (1980) en Grossman y Moldave (eds.) Academic Press, New York, Meth. Enzymol. 65: 499-560.
b. Anticuerpos/Fragmentos de Anticuerpo
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo para usar como parejas de unión pueden producirse por varios métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory y Asai (1993) Methods in Cell Biology Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Academia Press, Inc. N.Y.). En una realización, se producen anticuerpos por inmunización de un animal (por ejemplo, un conejo) con un inmunógeno que contiene el epítopo que se va a detectar. Pueden usarse varios inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos. Las proteínas recombinantes son los inmunógenos preferidos para la producción de los anticuerpos monoclonales o policlonales correspondientes. También pueden usarse proteínas de origen natural en forma pura o impura. También son adecuados péptidos sintéticos y pueden prepararse usando la química de síntesis de péptidos convencional (véase, por ejemplo, Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; páginas 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 y Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III).
Los especialistas en la técnica conocen métodos de producción de anticuerpos policlonales. En resumen, un inmunógeno se mezcla con un adyuvante y se inmuniza un animal. La respuesta inmune del animal a la preparación de inmunógeno se controla extrayendo sangre para ensayo y determinando el título de reactividad contra el inmunógeno. Cuando se obtienen títulos de anticuerpo apropiadamente elevados contra el inmunógeno, se recoge sangre del animal y se prepara un antisuero. Si se desea, el antisuero puede fraccionarse adicionalmente para enriquecerse en anticuerpos que tengan la reactividad deseada (véase Harlow & Lane, anteriormente).
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas con las que estarán familiarizados los especialistas en la técnica. En resumen, se inmortalizan células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente por fusión con una célula de mieloma (véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 5111-519). Los métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con Virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de células inmortalizadas individualizas se exploran para determinar la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno y los rendimientos de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células pueden mejorarse por diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como alternativa, pueden aislarse secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo por exploración de una genoteca de ADN de células B humanas de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse et al. (1989) Science, 246:1275-1281. Dichas secuencias pueden expresarse después de forma recombinante.
También pueden producirse/seleccionarse fragmentos de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monocatenarios (scFv u otros) usando tecnología de presentación en fagos. La capacidad para expresar fragmentos de anticuerpo en la superficie de virus que infectan bacterias (bacteriófagos o fagos) hace que sea posible aislar un fragmento de anticuerpo de unión individual a partir de una biblioteca de más de 10^{10} clones que no se unen. Para expresar fragmentos de anticuerpo en la superficie de fagos (presentación en fagos), un gen de fragmento de anticuerpos se inserta en el gen que codifica una proteína de superficie de fago (pIII) y la proteína de fusión fragmento de anticuerpo-pIII se presenta en la superficie del fago (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137).
Como los fragmentos de anticuerpo en la superficie del fago son funcionales, pueden separarse los fagos que llevan fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los fagos que no se unen por cromatografía de afinidad de antígeno (McCafferty et al. (1990) Nature, 348:552-554). Dependiendo de la afinidad del fragmento de anticuerpo, se obtienen factores de enriquecimiento de 20 veces a un millón de veces para una sola vuelta de selección por afinidad. Mediante la infección de bacterias con el fago eluido, sin embargo, puede cultivarse más fago y someterse a otra vuelta de selección. De este modo, un enriquecimiento de 100 veces en una vuelta puede convertirse en un millón de veces en dos vueltas de selección (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554). Por lo tanto, incluso cuando los enriquecimientos son reducidos (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597), múltiples vueltas de selección por afinidad pueden conducir al aislamiento del fago poco común. Como la selección de la biblioteca de anticuerpos de fagos sobre antígenos tiene como resultado el enriquecimiento, la mayoría de los clones se unen a antígeno después de tan sólo tres o cuatro vueltas de selección. Por lo tanto, sólo necesitan analizarse un número relativamente pequeño de clones (varios cientos) para la unión a antígenos.
Pueden producirse anticuerpos humanos sin inmunización previa por presentación de repertorios de genes V muy grandes y diversos en fagos (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597). En una realización, se aíslan repertorios de V_{H} y V_{L} naturales presentes en linfocitos de sangre periférica humana a partir de donantes no inmunizados mediante PCR. Los repertorios de genes V se cortan y empalman entre sí aleatoriamente usando PCR para generar un repertorio de genes scFv que después se clonan en un vector de fago para generar una biblioteca de 30 millones de anticuerpos de fagos (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks et al. (1993). Bio/Technology.10: 779-783; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Clackson et al. (1991) Mature. 352: 624-628). También es posible aislar anticuerpos contra antígenos de la superficie celular por selección directamente en células intactas. Los fragmentos de anticuerpo son muy específicos para el antígeno usado para la selección y tienen afinidades en el intervalo de 1 \muM a 100 nM (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734). Bibliotecas de anticuerpos de fagos de mayor tamaño dan como resultado el aislamiento de más anticuerpos de mayor afinidad de unión a una mayor proporción de antígenos.
c. Proteínas de Unión
En una realización, la pareja de unión puede ser una proteína de unión. Las proteínas de unión adecuadas incluyen, pero sin limitación, receptores (por ejemplo, receptores de la superficie celular), ligandos de receptores (por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, etc.), factores de transcripción y otras proteínas de unión a ácidos nucleicos, así como miembros de pares de unión tales como biotina-avidina.
Las proteínas de unión útiles en la invención pueden aislarse a partir de fuentes naturales, generarse por mutación a partir de proteínas aisladas o sintetizarse de novo. Se conocen bien por los especialistas en la técnica medios de aislamiento de proteínas naturales. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de purificación de proteínas convencionales incluyendo precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes, (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academia Press, Inc. N.Y.). Cuando la proteína se une a una diana de forma reversible, las columnas de afinidad que llevan la diana pueden usarse para purificar por afinidad la proteína. Como alternativa, la proteína puede expresarse de forma recombinante con un marcador HIS y purificarse usando cromatografía de Ni^{2}+/NTA.
En otra realización, la proteína de unión puede sintetizarse químicamente usando técnicas químicas de síntesis de péptidos convencionales. Cuando las subsecuencias deseadas son relativamente cortas, la molécula puede sintetizarse como un solo polipéptido contiguo. Cuando se desean moléculas de mayor tamaño, pueden sintetizarse subsecuencias por separado (en una o más unidades) y después fusionarse por condensación del extremo amino de una molécula con el extremo carboxilo de la otra molécula formando de este modo un enlace peptídico. Esto se logra típicamente usando la misma química (por ejemplo, Fmoc, Tboc) usada para acoplar aminoácidos individuales en sintetizadores de péptidos comerciales.
La síntesis en fase sólida en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia es el método preferido para la síntesis química de los polipéptidos de esta invención. Se describen técnicas para síntesis en fase sólida por Barany y Merrifield (1962) Solid-Phase Peptide Synthesis: páginas 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156, y Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III.
En una realización preferida, la proteína de unión también puede producirse usando metodología de ADN recombinante. En general, esto implicar generar una secuencia de ADN que codifica la proteína de unión, colocar la secuencia de ADN en un casete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar la proteína en un hospedador, aislar la proteína expresada y, si es necesario, renaturalizar la proteína.
El ADN que codifica proteínas de unión a subsecuencias de esta invención puede prepararse por cualquier método adecuado como se ha descrito anteriormente incluyendo, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas o síntesis química directa por métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método de fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett. 22: 1859-1862; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066.
El ADN que codifica la proteína o proteínas de unión deseadas puede expresarse en una diversidad de células hospedadoras incluyendo E. coli, otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares de mieloma. La secuencia de ADN que codifica la proteína de unión se une operativamente a las secuencias de control de expresión apropiadas para cada hospedador para producir una construcción de expresión. Para E. coli, los ejemplos de secuencias de control de la expresión apropiadas incluyen un promotor tal como los promotores de T7, trp o lambda, un sitio de unión al ribosoma y preferiblemente una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucariotas, dichas secuencias de control pueden incluir un promotor, un potenciador procedente, por ejemplo, de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc., una secuencia de poliadenilación, y pueden incluir secuencias donadoras y aceptoras del corte y empalme.
El vector de expresión puede transferirse a la célula hospedadora seleccionada por métodos bien conocidos tales como transformación con cloruro de calcio para E. coli y tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para células de mamífero. Las células transformadas con el vector de expresión pueden seleccionarse por resistencia a antibióticos conferida por genes contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg.
Una vez expresadas, las proteínas de unión recombinantes pueden purificarse usando técnicas convencionales, como se ha descrito anteriormente.
d. Azúcares y Carbohidratos
Otras parejas de unión adecuados para el uso en la invención incluyen azúcares y carbohidratos. Los azúcares y carbohidratos se pueden aislar a partir de fuentes naturales, se pueden sintetizar enzimáticamente o se pueden sintetizar químicamente. Se pueden producir estructuras de oligosacáridos específicas usando glicosiltransferasas que producen estas estructuras in vivo. Estas enzimas se pueden usar como catalizadores regio- y estereoselectivos para la síntesis in vitro de oligosacáridos (Ichikawa et al. (1992) Anal. Biochem. 202: 215-238). Se puede usar sialiltransferasa en combinación con glicosiltransferasas adicionales. Por ejemplo, se puede usar una combinación de sialiltransferasa y galactosiltransferasas. Se conocen varios métodos para usar glicosiltransferasas para sintetizar estructuras de oligosacáridos deseadas. Se describen métodos ejemplares, por ejemplo, en el documento WO 96/32491, Ito et al. (1993) Pure Appl. Chem. 68:753, y Patente de Estados Unidos Nº 5.352.670, 5.374.541 y 5.545.553. Las enzimas y los sustratos se pueden combinar en una mezcla de reacción inicial o, como alternativa, las enzimas y los reactivos para un segundo ciclo de glicosiltransferasa se pueden añadir a la mezcla de reacción cuando el primer ciclo de glicosiltransferasa se aproxima al final. Al realizar dos ciclos de glicosiltransferasa de forma secuencial en un único recipiente, los rendimientos globales se mejoran con respecto a los procedimientos en los que se aísla una especie intermedia.
Se describen métodos de síntesis química por Zhang et al. (1999) J. Am. Chem. Soc., 121(4): 734-753. En resumen, en esta estrategia se crea un conjunto de bloques de construcción basados en azúcares cargándose previamente cada bloque con diferentes grupos protectores. Los bloques de construcción se clasifican por reactividad de cada grupo protector. Después, un programa informático determina exactamente los bloques de construcción que se tienen que añadir a la reacción de tal forma que la secuencia de reacciones desde la más rápida a la más lenta produzca el compuesto deseado.
2. Parejas de Unión
La pareja o parejas de unión se fijan en el canal o los canales de la invención como se define en las reivindicaciones para ser capaces de unirse al analito o los analitos diana correspondientes. Preferiblemente, el enlace entre la pareja de unión y el sustrato es estable químicamente en las condiciones de ensayo y es suficientemente hidrófilo para ser altamente soluble en soluciones acuosas. Además, el enlace preferiblemente no debe producir una unión no específica significativa del analito o los analitos diana al sustrato. En la técnica se conocen muchos métodos para inmovilizar moléculas a una diversidad de sustratos. Por ejemplo, la pareja de unión se puede enlazar covalentemente o unir no covalentemente por la formación de enlaces específicos o no específicos.
Si se desea la formación de enlaces covalentes entre un compuesto y la superficie, la superficie será habitualmente polifuncional o podrá polifuncionalizarse. Los grupos funcionales que pueden estar presentes sobre la superficie del sustrato y usarse para el enlace pueden incluir ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y similares. La manera de enlazar covalentemente una amplia diversidad de compuestos a diversas superficies se conoce bien y se ilustra ampliamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Ichiro Chibata (1978) Immobilized Enzymes, Halsted Press, Nueva York, y Cuatrecasas, (1970) J. Biol. Chem. 245:3059.
Además de la formación de enlaces covalentes, se pueden usar diversos métodos para la formación de enlaces no covalentes con una pareja de unión. La unión no covalente es típicamente, pero no necesariamente, la absorción no específica de un compuesto en la superficie. Típicamente, la superficie se bloquea con un segundo compuesto para prevenir la unión no específica de componentes de ensayo marcados. Como alternativa, la superficie se diseña de tal modo que se une de forma no específica a un componente pero no se une de forma significativa a otro. Por ejemplo, una superficie que lleva una lectina tal como concanavalina A se unirá a un compuesto que contiene carbohidrato pero no a una proteína no glicosilada. En las Patentes de Estados Unidos Nº 4.447.576 y 4.254.082 se revisan diversos sustratos para el uso en la unión no covalente de componentes de ensayo.
Cuando la pareja de unión es un ácido nucleico o un polipéptido, la molécula se puede sintetizar químicamente in situ, si se desea. La síntesis in situ de ácidos nucleicos o proteínas implica típicamente métodos de síntesis química convencionales en los que los grupos protectores habituales se sustituyen por grupos protectores fotolábiles (por ejemplo, el grupo dimetoxitritilo (DMT) usado en la síntesis de ácidos nucleicos). La irradiación de la superficie del sustrato en localizaciones discretas tiene como resultado el acoplamiento selectivo del monómero (por ejemplo nucleótido o aminoácido) al ácido nucleico o los ácidos nucleicos o al polipéptido o polipéptidos en crecimiento en el sitio irradiado. Los especialistas en la técnica conocen bien métodos de síntesis de polímeros dirigida por luz (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.143.854; las Publicaciones PCT Nº WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 93/09668; y Fodor et al. (1991) Science, 251, 767-77).
En realizaciones preferidas, la pareja de unión se inmoviliza mediante el uso de un enlazador (por ejemplo, un enlazador homo- o heterobifuncional). Se conocen bien los enlazadores adecuados para unirse a parejas de unión biológicos. Por ejemplo, un ácido nucleico o una molécula de proteína se puede enlazar mediante cualquiera de una diversidad de enlazadores incluyendo, pero sin limitación, un enlazador peptídico, un enlazador de cadena carbonada lineal o ramificada, o mediante un enlazador de carbono heterocíclico. Se han usado ampliamente reactivos de reticulación heterobifuncionales tales como ésteres activos de N-etilmaleimida (véase, por ejemplo, Lerner et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 3403-3407 y Kitagawa et al. (1973) J. Biochem., 79: 233-236, y Birch y Lennox (1995) Capítulo 4 en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, N.Y.).
En una realización preferida, la pareja de unión se inmoviliza utilizando una interacción de biotina/avidina. En esta realización, puede ponerse biotina o avidina con un grupo protector fotolábil en el canal. La irradiación del canal en una localización distinta ocasiona el acoplamiento de la biotina o avidina al canal en esa localización. Después, una pareja de unión que lleva un grupo avidina o biotina, respectivamente, se pone en contacto con el canal, forma un complejo de biotina-avidina y de este modo se localiza en el sitio irradiado. Para fijar múltiples parejas de unión diferentes en diferentes localizaciones, este proceso se puede repetir en cada localización de pareja de unión.
Sigrist et al. (1992) Bio/Technology, 10: 1026-1028 describe otra estrategia de unión fotoquímica adecuada. En esta estrategia, la interacción de ligandos con superficies orgánicas o inorgánicas está mediada por polímeros fotoactivables con trifluorometil-aril-diazirinas que generan carbeno que sirven como moléculas enlazadoras. La activación con luz de funciones aril-diazirino a 350 nm produce carbenos altamente reactivos, y el acoplamiento covalente se consigue por la inserción simultánea de carbeno tanto en el ligando como en la superficie inerte. Por lo tanto, no se requieren grupos funcionales reactivos en el ligando o el material de soporte.
Las parejas de unión se pueden fijar a cualquier localización dentro del canal que entre en contacto con la muestra durante un ensayo de acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones. Un dispositivo de la invención incluye un elemento de cobertura que cubre y sella el canal. En este caso, una pareja de unión se une a la superficie del elemento de cobertura de cara a la luz del canal. Como se ha analizado anteriormente, en realizaciones preferidas, las parejas de unión se fijan a una superficie de la luz del canal o elemento de cobertura que tiene un carácter hidrófilo. En otros dispositivos descritos en este documento, las parejas de unión se fijan a un miembro, tal como una fibra, que sobresale en el interior de la luz del canal. Preferiblemente, las parejas de unión se fijan a una superficie hidrófila de la fibra.
Aunque los dispositivos de la invención no necesitan incluir más de un tipo de pareja de unión, típicamente en el canal se fija una pluralidad de parejas de unión diferentes (es decir, sobre la superficie del canal y/o sobre la superficie del elemento de cobertura o del miembro de protección, si está presente) de tal forma que cada tipo diferente de pareja de unión ocupa una localización diferente. Los dispositivos ilustrativos de la invención contienen entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10^{6} tipos diferentes de parejas de unión; por ejemplo, se pueden producir fácilmente dispositivos que tienen aproximadamente 10^{2}, aproximadamente 10^{3}, aproximadamente 10^{4} y aproximadamente 10^{5} parejas de unión. Tales dispositivos permiten el ensayo simultáneo de múltiples analitos diana.
Las dimensiones de, y la separación entre, las parejas de unión deben permitir la detección de señales distintas del analito o analitos diana unidos a cada pareja de unión. En una realización en la que las parejas de unión están unidos a una superficie de la luz del canal, el canal tiene un diámetro interno de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 mm, preferiblemente de aproximadamente 2 mm, y las parejas de unión ocupan una región que tiene una longitud (a lo largo del eje del canal) de aproximadamente 100 \mum a aproximadamente 5 mm, preferiblemente de aproximadamente 1 mm, aunque los especialistas en la técnica reconocen que son posibles otras longitudes y distancias de un centro a otro. El centro de cada localización de pareja de unión es de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 mm, preferiblemente de aproximadamente 2 mm, desde el centro de cada localización de pareja de unión adyacente. Para parejas de unión unidos a un elemento de cobertura, la distancia de un centro a otro entre cada localización de pareja de unión es preferiblemente de aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 5 mm, más preferiblemente de aproximadamente 1 mm o menor, incluso más preferiblemente de aproximadamente 100 \mum o menor y mucho más preferiblemente de aproximadamente 50 \mum o menor.
Como se emplea un elemento de cobertura retirable, la pareja o los parejas de unión se fijan al elemento de cobertura. En variaciones preferidas de esta realización, una pluralidad de diferentes parejas de unión se fijan al elemento de cobertura en localizaciones distintas de cara a la luz del canal para formar una matriz de parejas de unión, por ejemplo, una matriz lineal para un solo canal lineal o una matriz bidimensional para un canal con forma de serpentina (plegado) o para una pluralidad de canales paralelos.
Están disponibles varios métodos para fijar parejas de unión a la superficie de la luz de un canal. Por ejemplo, las soluciones de parejas de unión se pueden aspirar al interior de un canal separadas por un bolo o una burbuja de un fluido que es inmiscible con las soluciones de parejas de unión. Más convenientemente, se aspira una primera solución de pareja de unión al interior del canal, seguida de una cantidad de aire, seguida de la siguiente solución de pareja de unión, y así sucesivamente, para producir una serie de parejas de unión separados por burbujas de aire. Cuando las parejas de unión se transportan a lo largo del canal, algo de cada solución de pareja de unión se puede "traspasar" de una pareja de unión a uno o más de las siguientes parejas de unión, lo cual lleva a una contaminación cruzada de las parejas de unión. En esta realización, el canal se forma preferiblemente a partir de un material que minimiza este fenómeno. Se puede estimar la cantidad de traspaso, por ejemplo, de acuerdo con el método de Snyder y Adler (1976) Anal. Chem. 48: 1022-1027. En resumen, la dispersión de pareja de unión debida al traspaso en un tubo se puede calcular del siguiente modo:
q = 0,50\piL_{t}d_{t}^{2}(u\eta/\gamma)^{2/3}V_{s}
donde q representa el retraso del centro de la distribución de pareja de unión en el segmento de la solución de pareja de unión y también equivale a la varianza (\delta^{2}) de la distribución de concentraciones después de la dispersión (es decir, después de que haya finalizado el flujo). Por lo tanto, q es un número adimensional que representa el número de segmentos de desplazamiento del centro de la distribución de concentraciones de parejas de unión original (es decir, antes del flujo). Las demás variables de la ecuación son L_{t}, que es la longitud del tubo a través del cual se transporta el segmento de pareja de unión; dt, que es el diámetro de la luz del tubo; u que es la velocidad de transporte del segmento a través del tubo, \eta que es la viscosidad de la solución de pareja de unión; \gamma, que es la tensión superficial entre la solución y el tubo; y V_{s}, que es el volumen del segmento de la solución de pareja de unión. Al estimar el traspaso, el especialista en la técnica puede determinar si la contaminación cruzada de las parejas de unión está dentro de límites aceptables para la aplicación deseada. Esto será así para canales relativamente cortos y/o que tienen un número limitado de parejas de unión fijados.
En una realización, después de la carga en el canal, las parejas de unión se fijan a una superficie de la luz del canal en localizaciones distintas. La unión de parejas de unión se consigue de forma conveniente usando química foto- o termo-iniciada. En esta realización, las parejas de unión y/o la superficie de la luz del canal llevan restos de bloqueo que se pueden foto- o termo-activar para enlazar las parejas de unión a la superficie de la luz.
Se puede emplear una estrategia desarrollada por Technicon Instruments Corporation para proporcionar la mezcla en línea de parejas de unión y reactivos de reticulación (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.853.336, expedida el 1 de agosto de 1989 a Saros et al.). Como se aplica a la presente invención, y se ilustra en la Figura 1, la pareja de unión (101) se aspira al interior del tubo de carga (103), seguido de un pequeño bolo o burbuja de fluido inmiscible (102) y después de un bolo de reactivo de reticulación (104). El tubo de carga (103) después se inserta en un tubo de ensayo (105) de mayor diámetro y la pareja de unión, el fluido inmiscible y el reactivo de reticulación se transfieren al tubo de ensayo. La selección de los tamaños de tubo dependerá de la aplicación. En una realización preferida, las parejas de unión se cargan usando un tubo de carga de Teflon® con un diámetro interno de 1,8 mm y un tubo de ensayo de cuarzo con un diámetro interno de 1 mm. La burbuja o el bolo de fluido inmiscible es demasiado pequeño para abarcar el mayor diámetro del tubo de ensayo, por lo que se permite la mezcla entre la pareja de unión y el reactivo de reticulación. Si se requieren múltiples reactivos, se pueden proporcionar en un bolo de reactivo o de forma separada mediante bolos o burbujas pequeñas de fluido inmiscible (véase, por ejemplo, la Figura 1, que muestra el segundo reactivo de reticulación 106).
En la Figura 2 se muestra una realización alternativa que disminuye el traspaso entre una pareja de unión y el siguiente. Esta técnica emplea un tubo de carga (203) con una superficie de la luz hidrófoba (por ejemplo, de Teflon®) y se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.635.680 (expedida el 18 de enero de 1972 a Peoples et al.); 3.479.141 (expedida el 18 de noviembre de 1969 a Smythe et al.); y 4.253.846 (expedida el 3 marzo de 1981 a Smythe et al.). Cada bolo de pareja de unión (201) está encapsulado en aceite, lo que se consigue de forma conveniente añadiendo un volumen pequeño de aceite hidrófobo de baja densidad, preferiblemente un aceite de fluorocarbono, a la superficie de la solución de pareja de unión antes de la introducción en el tubo de carga. El aceite debe se inmiscible con la solución de pareja de unión y debe permanecer sobre la superficie de la solución. La aspiración de un bolo de la solución de pareja de unión a través de la capa de aceite da como resultado la encapsulación del bolo de pareja de unión en aceite. La extracción del tubo de carga de una solución de pareja de unión recubierta con aceite y la transferencia a la siguiente solución de pareja de unión recubierta con aceite da como resultado típicamente la captación de un volumen de aire. Este proceso se puede repetir, si se desea, para producir una serie de segmentos de pareja de unión (201) que están separados de la pared del tubo de carga (203) por una capa de aceite y entre sí por una burbuja de aire (202).
Después, el tubo de carga (203) se inserta en un tubo de ensayo (204), por ejemplo, un tubo capilar de vidrio o cuarzo, en el que se depositarán las parejas de unión. Las parejas de unión, separados por bolos o burbujas de fluido inmiscible, se transfieren al tubo de ensayo, típicamente por presión positiva o negativa (ejercida, por ejemplo, por una bomba tal como una bomba peristáltica). El aceite generalmente se adhiere al tubo de carga hidrófobo y/o se mueve al extremo del tubo que se inserta en el tubo de ensayo, recogiéndose en ese lugar y, en algunos casos, desplazándose entre la superficie externa del tubo de carga y la superficie interna adyacente del tubo de ensayo. Si se desea, se pueden incluir uno o más surcos poco profundos en la superficie externa del tubo de carga para promover el movimiento del aceite alejándose del tubo de ensayo. Durante esta transferencia, el tubo de carga se puede mover a lo largo del tubo de ensayo, habitualmente alejándose de la pareja de unión depositado en último lugar (es decir, en la dirección de extracción del tubo de ensayo), para depositar la siguiente pareja de unión con un traspaso mínimo. Después del depósito de todos las parejas de unión, el tubo de carga se extrae del tubo de ensayo. En esta realización, la superficie de la luz del tubo de ensayo se puede funcionalizar de tal forma que las parejas de unión se unan a la superficie en contacto. Como alternativa, se puede emplear foto- o termo-activación, como se ha descrito anteriormente.
El exceso de pareja de unión no enlazado se puede retirar por lavado y, si se desea, se puede realizar la fijación.
Las parejas de unión se pueden fijar a un elemento de cobertura usando técnicas convencionales para fabricar matrices bidimensionales, incluyendo, por ejemplo, aplicación puntual robótica, impresión por chorro de tinta y técnicas fotolitográficas. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.807.522 (expedida el 15 de septiembre de 1998 a Brown y Shalon) describe un dispositivo que facilita la fabricación en masa de micromatrices caracterizadas por un gran número de regiones de ensayo micro-dimensionadas separadas por una distancia de 50-200 micrómetros o menos y una cantidad bien definida de analito (típicamente en el intervalo picomolar) asociada a cada región de la matriz. Una estrategia alternativa a la aplicación puntual robótica usa una matriz de agujas o dispensadores capilares sumergidos en los pocillos, por ejemplo, los 96 pocillos de una placa de microtitulación, para transferir una serie de muestras a un sustrato.
Las parejas de unión se pueden fijar a un elemento de proyección, tal como una fibra, usando cualquiera de una amplia diversidad de métodos adecuados conocidos por el especialista en la técnica.
C. Electrodo(s)
Un dispositivo de la invención puede incluir opcionalmente uno o más electrodos. En realizaciones preferidas, el electrodo o los electrodos se colocan en el dispositivo de tal forma que una tensión aplicada al electrodo o los electrodos puede inducir el transporte electroforético y/o electroosmótico de un analito diana con respecto a una pareja de unión. Los dispositivos preferidos se emplean el transporte electroforético. El uso de electrodos para dirigir el transporte de fluido en dispositivos de microfluidos se conoce bien y se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.632.957 (expedida el 27 de mayo de 1997 a Heller et al.) (que describe el transporte electroforético) y 6.046.056 (expedida el 4 de abril de 2000 a Parce et al.) (que describe el transporte electroosmótico) y en Freemantle (1999) Science/Technology (1999) 77:27-36 y Gilles et al. (1999) Nature Biotechnology 17:365-370. En dispositivos de la invención, los electrodos se pueden colocar en los extremos de uno o más canales. La aplicación de un campo eléctrico a lo largo de la longitud del canal induce el flujo de cationes hacia el electrodo negativo y viceversa. Más típicamente, un electrodo está debajo de una o más parejas de unión de tal forma que una tensión aplicada al electrodo hace que el analito diana se mueva hacia y se concentre en las proximidades de la pareja de unión para facilitar la unión. Se puede inducir el alejamiento de los componentes cargados no unidos presentes en la muestra de la localización de la pareja de unión invirtiendo la polaridad de carga en el electrodo. Por lo tanto, el analito diana se puede mover de una pareja de unión o grupo de parejas de unión a otro por modulación secuencial de tensiones aplicadas a múltiples electrodos.
Un electrodo para dirigir el transporte de fluido se coloca de forma conveniente sobre una superficie del dispositivo de cara a la luz del canal. El electrodo se coloca preferiblemente sobre el elemento de cobertura. Como se muestra en la Figura 3, en dispositivos descritos en este documento que emplean un miembro que sobresale al interior de la luz del canal, el miembro de proyección puede estar hecho de un metal u otro material conductor, permitiendo que el miembro de proyección sirva como un electrodo (304). El electrodo (304) está recubierto con una capa de infiltración (305), a la que se unen las parejas de unión (301). En una variación de esto, el electrodo está rodeado por un tubo semipermeable (306), que a su vez se inserta en la luz del canal. El segundo electrodo (307) se localiza en el espacio anular entre el tubo semipermeable interno (306) y la pared del canal (308). Durante el uso, el tubo interno contiene la muestra (303) y cualquier solución necesaria de tampón, lavado o reactivo, preferiblemente separadas por bolos o burbujas de fluido inmiscible (302). El espacio anular entre el tubo semipermeable interno (306) y la pared del canal (308) contiene un fluido conductor. El tubo semipermeable no es permeable a los analitos diana, pero permite el paso de iones y moléculas menores.
El dispositivo incluye habitualmente un cable, por ejemplo, un alambre de platino, cromo u oro, conectado al electrodo. En realizaciones multielectrodo, los sistemas se pueden diseñar para modular las tensiones en cada electrodo independientemente o en grupos de electrodos simultáneamente. Además, los sistemas se pueden diseñar de forma sencilla para permitir la circularización y/o la modulación secuencial de las tensiones en electrodos individuales o grupos de electrodos. La modulación secuencial de las tensiones en electrodos colocados a lo largo de la longitud del canal se prefiere particularmente para inducir el flujo del analito diana a lo largo del canal.
Una capa de infiltración preferiblemente se superpone al electrodo para separar los componentes de la muestra del entorno electroquímico riguroso próximo al electrodo. La capa de infiltración generalmente cubre toda la superficie del electrodo y tiene un grosor apropiado para el dispositivo, que varía típicamente, por ejemplo, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 \mum, prefiriéndose de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 50 \mum. La capa de infiltración puede estar formada por cualquier material adecuado tal como un polímero, un material cerámico, sol-gel, un material compuesto estratificado, arcilla y gas de porosidad controlada. Preferiblemente, el material usado para la capa de infiltración tiene una porosidad que excluye moléculas de analito diana, pero que permite el paso de iones y moléculas menores. En un dispositivo preferido diseñado para el flujo segmentado, la capa de infiltración preferiblemente es hidrófila.
La pareja de unión se puede unir directamente a la capa de infiltración o el dispositivo puede incluir una capa de unión superpuesta a la capa de infiltración. En este caso, la capa de unión es un material que está adaptado para proporcionar una superficie conveniente para la unión de la pareja o las parejas de unión deseados. Cuando la pareja de unión es un ácido nucleico, el dispositivo puede incluir, por ejemplo, una capa de infiltración de agarosa. Si se incluye avidina en esta capa, se puede unir una pareja de unión de ácido nucleico biotinilado a esta capa. Si el dispositivo contiene múltiples tipos diferentes de parejas de unión, un electrodo se puede colocar en cada localización de pareja de unión diferente o un electrodo puede estar debajo de varias localizaciones de pareja de unión diferentes.
En una realización alternativa, los métodos electroquímicos se pueden combinar con tensioactivos con actividad redox, tal como se describe por Gallardo et al. (1999) 283:57, para controlar de forma activa los movimientos y las posiciones de los líquidos acuosos y orgánicos en escalas de milímetros e inferiores. Las especies de tensioactivos generadas en un electrodo y consumidas en otro se pueden usar para manipular la magnitud y la dirección de los gradientes espaciales en tensión superficial y guiar líquidos a través de redes fluidas.
IV. Dispositivo de Ensayo Integrado
Los sistemas de análisis químico del estado de la técnica para uso en producción química, análisis ambiental, diagnóstico médico y análisis básico de laboratorio preferiblemente pueden automatizarse completamente. Tales sistemas de análisis total (TAS) (Fillipini et al. (1991) J. Biotechnol. 18: 153; Garn et al (1989) Biotechnol. Bioeng. 34: 423; Tshulena (1988) Phys. Scr. T23: 293; Edmonds (1985) Trends Anal. Chem. 4: 220; Stinshoff et al. (1985) Anal. Chem. 57:114R; Guibault (1983) Anal. Chem Symp. Ser. 17: 637; Widmer (1983) Trends Anal. Chem. 2: 8) realizan automáticamente funciones que varían desde la introducción de la muestra en el sistema, transporte de la muestra a través del sistema, preparación de la muestra, separación, purificación y detección, incluyendo la adquisición y evaluación de los datos.
Recientemente se han reducido tecnologías de preparación de muestras satisfactoriamente hasta formatos miniaturizados. Por lo tanto, por ejemplo, la cromatografía de gases (Widmer et al. (1984) Int. J. Environ. Anal. Chem. 18: 1), la cromatografía líquida de alta presión (Muller et al. (1991) J. High Resolut. Chromatogr. 14: 174; Manz et al. (1990) Sensors & Actuators B1: 249; Novotny et al., eds. (1985) Microcolumn Separations: Columns, Instrumentation and Ancillary Techniques J. Chromatogr. Library, Vol. 30; Kucera, ed. (1984) MicroColumn High Performance Liquid Chromatography, Elsevier, Amsterdam; Scott, ed. (1984) Small Bore Liquid Chromatography Columns: Their Properties and Uses, Wiley, N.Y.; Jorgenson et al. (1983) J. Chromatogr. 255: 335; Knox et al. (1979) J. Chromatogr. 186:405; Tsuda et al. (1978) Anal. Chem. 50:632) y la electroforesis capilar (Manz et al. (1992) J Chromatogr. 593: 253; Olefirowicz et al. (1990) Anal. Chem. 62: 1872; Second Int'l Symp. High-Perf. Capillary Electrophoresis (1990) J. Chromatogr. 516; Ghowsi et al. (1990) Anal. Chem. 62:2714) se han disminuido hasta formatos miniaturizados.
De forma similar, en otra realización, esta invención proporciona un dispositivo de ensayo integrado (por ejemplo, un TAS) para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana. El dispositivo de ensayo comprende el canal o los canales con pareja o parejas de unión unidos como se ha descrito anteriormente. Además, los dispositivos de ensayo integrados preferidos también incluyen uno o más de los siguientes: uno o más pocillos de aplicación de muestra y/o puertos de inyección, uno o más depósitos para proporcionar tampones y/o fluidos de lavado, uno o más electrodos que dirigen el transporte de fluido, un detector, un elemento de calentamiento o enfriamiento para controlar la temperatura de ensayo, un controlador informático (por ejemplo, para controlar la aplicación de la muestra, cambio de flujo de depósito, transporte de fluido, detección de señales y similares).
En una realización particularmente preferida, el dispositivo de ensayo integrado contiene el canal o los canales en un módulo "retirable" que se puede insertar y retirar de forma sencilla del equipo auxiliar. Cuando el canal usado en el dispositivo es un tubo (por ejemplo, un tubo de electroforesis capilar), un dispositivo de electroforesis capilar convencional contiene gran parte de las tuberías auxiliares, componentes de manejo y suministro de muestra y uno o más controladores informáticos para un dispositivo de ensayo "integrado" de acuerdo con la presente invención.
V. Realización de Ensayos
En general, los ensayos se realizan introduciendo la muestra en el canal que tiene una o más parejas de unión fijados. La muestra se transporta a través del canal hasta la primera pareja de unión. La muestra entra en contacto con la primera pareja de unión en condiciones que permiten que la pareja de unión se una específicamente a cualquier analito diana correspondiente que pueda estar presente en la muestra. Después, la muestra se transporta más allá de la primera pareja de unión y se detecta la presencia de analito diana unido a la primera pareja de unión.
En una realización preferida, el canal incluye una segunda pareja de unión fijado en una localización distinta de la de la primera pareja de unión. Después del contacto con la primera pareja de unión, la muestra se transporta a través del canal a la segunda pareja de unión. La segunda pareja de unión es habitualmente, pero no necesariamente, una pareja de unión de un tipo diferente a la primera pareja de unión, por ejemplo, las parejas de unión pueden ser dos ácidos nucleicos de secuencia diferente. La muestra entra en contacto con la segunda pareja de unión en condiciones que permiten la unión específica del segundo analito diana, después de lo cual la muestra se transporta más allá de la segunda pareja de unión. Se detecta la presencia del segundo analito diana unido a la segunda pareja de unión y, preferiblemente, la unión a la primera y segunda parejas de unión se detecta en una sola etapa. En realizaciones preferidas, el ensayo emplea un canal que tiene una pluralidad de parejas de unión diferentes fijados, como se ha descrito anteriormente, lo cual facilita la realización de ensayos multianalito.
A. Preparación de la Muestra
Prácticamente cualquier muestra se puede analizar usando los dispositivos y métodos de esta ventaja. Sin embargo, en una realización preferida, la muestra es una muestra biológica. La expresión "muestra biológica", como se usa en este documento, se refiere a una muestra obtenida a partir de un organismo o de componentes (por ejemplo, células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido o fluido biológico. Frecuentemente, la muestra será una "muestra clínica", que es una muestra obtenida a partir de un paciente. Tales muestras incluyen, pero sin limitación, esputo, líquido cefalorraquídeo, sangre, fracciones sanguíneas (por ejemplo, suero, plasma), células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos), tejido o muestras de biopsia con aguja fina, orina, líquido peritoneal y fluido pleural o células de los mismos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas con fines histológicos.
Las muestras biológicas (por ejemplo, suero) se pueden analizar directamente o se pueden someter a cierta preparación antes del uso en los ensayos de esta invención. Tal preparación puede incluir, pero sin limitación, suspensión/dilución de la muestra en agua o un tampón apropiado o retirada de restos celulares, por ejemplo, mediante centrifugación, o selección de fracciones particulares de la muestra antes del análisis. Las muestras de ácido nucleico, por ejemplo, se aíslan típicamente antes del ensayo y, en algunas realizaciones, se someten a procedimientos tales como transcripción inversa y/o amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR) para aumentar la concentración de todos los ácidos nucleicos de la muestra (por ejemplo, usando cebadores aleatorios) o de tipos específicos de ácidos nucleicos (por ejemplo, usando polinucleótido-timidilato para amplificar el ARN mensajero o cebadores específicos de genes para amplificar secuencias génicas específicas.
Preferiblemente, las muestras biológicas se procesan de tal forma que el analito o los analitos diana de interés se marcan con un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados para uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen biotina para tinción con un conjugado de estreptavidina marcado, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads^{TM}), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína verde fluorescente y similares, véase, por ejemplo Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos), radiomarcadores (por ejemplo, ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas comúnmente en ELISA) y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal (por ejemplo, partículas de oro en el intervalo de tamaños de 40-80 nm de diámetro dispersan luz verde con alta eficacia) o perlas de vidrio o plástico coloreadas (por ejemplo, de poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Las Patentes que describen el uso de tales marcadores incluyen las Patentes de Estados Unidos Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241.
Los cromógenos adecuados que se pueden emplear en la invención incluyen los que absorben luz en un intervalo característico de longitudes de onda de tal forma que se puede observar un color o, como alternativa, que emiten luz cuando se irradian con radiación de una longitud de onda o intervalo de longitudes de onda particular, por ejemplo, moléculas fluorescentes. Preferiblemente, el marcador es un marcador que absorbe luz. Se prefieren particularmente los marcadores fluorescentes porque proporcionan señales muy intensas con poco efecto de fondo. Los marcadores fluorescentes también son ópticamente detectables con alta resolución y sensibilidad por un procedimiento de exploración rápido. Los marcadores fluorescentes ofrecen la ventaja adicional de que la irradiación de un marcador fluorescente con luz puede producir una pluralidad de emisiones. Por lo tanto, un único marcador puede proporcionar una pluralidad de acontecimientos medibles.
De forma deseable, los marcadores fluorescentes deben absorber luz por encima de aproximadamente 300 nm, preferiblemente por encima de aproximadamente 350 nm y más preferiblemente por encima de aproximadamente 400 nm, emitiendo habitualmente a longitudes de onda superiores a aproximadamente 10 nm por encima de la longitud de onda de la luz absorbida. Se debe señalar que las características de absorción y emisión del colorante unido pueden diferir de las del colorante no unido. Por lo tanto, cuando se hace referencia a los diversos intervalos de longitudes de onda y características de los colorantes, se pretende indicar los colorantes como se emplean y no el colorante que no está conjugado y caracterizado en un disolvente arbitrario.
Se reconocerá que los marcadores fluorescentes no se tienen que limitar a moléculas orgánicas de especies únicas, sino que incluyen moléculas inorgánicas, mezclas multi-moleculares de moléculas orgánicas y/o inorgánicas, cristales, heteropolímeros y similares. Por lo tanto, por ejemplo, nanocristales de núcleo-envuelta CdSe-CdS incluidos en una envuelta de sílice se pueden derivatizar de forma sencilla para el acoplamiento con una molécula biológica (Bruchez et al. (1998) Science, 281: 2013-2016). De forma similar, se han acoplado covalentemente puntos cuánticos altamente fluorescentes (seleniuro de cadmio con grupos terminales de sulfuro de cinc) a biomoléculas para el uso en la detección biológica ultrasensible (Warren y Nie (1998) Science, 281: 2016-2018).
También se puede proporcionar una señal detectable por marcadores quimioluminiscentes y bioluminiscentes. Las fuentes quimioluminiscentes incluyen un compuesto que se excita electrónicamente por una reacción química y después puede emitir luz que sirve como la señal detectable o dona energía a un aceptor fluorescente. Como alternativa, se pueden usar luciferinas junto con luciferasa o lucigeninas para proporcionar bioluminiscencia.
Se proporcionan marcadores de spin por moléculas indicadoras con un spin de electrón desapareado que se puede detectar por espectroscopia de resonancia de spin electrónica (ESR). Los marcadores de spin ilustrativos incluyen radicales libres orgánicos, complejos de metales de transición, particularmente vanadio, cobre, hierro y manganeso, y similares. Los marcadores de spin ilustrativos incluyen radicales libres de nitróxido.
El analito o los analitos diana se pueden marcar antes, durante o después de que la muestra se ponga en contacto con la pareja de unión fijado al canal. Los denominados "marcadores directos" son marcadores detectables que están unidos directamente a o incorporados en el analito diana antes de la unión con la pareja de unión afín. Los "marcadores indirectos" se unen a un componente capaz de unirse al analito diana o a un miembro de un par de unión, cuyo otro miembro está unido al analito diana. En el marcaje indirecto, el componente marcado se puede unir al analito diana antes, durante o después de que la muestra que contiene el analito diana se ponga en contacto con la pareja de unión. Por lo tanto, por ejemplo, el analito diana se puede biotinilar y después unir la pareja de unión afín. Después de la unión, un fluoróforo conjugado con avidina se puede unir al analito diana que lleva biotina, proporcionando un marcador que se detecta de forma sencilla. Esta realización se prefiere particularmente para marcar ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se pueden marcar directamente por una transcripción in vitro o una reacción de amplificación. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden incorporar UTP y CTP marcados con fluoresceína en el ARN producido en una transcripción in vitro. Para una revisión detallada de métodos de marcaje de ácidos nucleicos y de detección de ácidos nucleicos hibridados marcados véase Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)).
Los marcadores se pueden unir al analito diana directamente o a través de un resto enlazador. En general, el sitio de la unión del marcador o enlazador-marcador no está limitado a ninguna posición específica. Por ejemplo, en un marcaje de ácidos nucleicos, un marcador se puede unir a un nucleósido, nucleótido o análogo de los mismos en cualquier posición que no interfiera con la detección o hibridación, cuando se desee. Por ejemplo, determinados reactivos Label-On de Clontech (Palo Alto, CA) permiten el marcaje intercalado a lo largo de la estructura principal de fosfato de un oligonucleótido y el marcaje terminal en los extremos 3' y 5'. Los marcadores se pueden unir en posiciones sobre el anillo ribosa o la ribosa se puede modificar e incluso eliminar si se desea. Los restos de base de los reactivos marcadores útiles pueden incluir los que son naturales o están modificados de un modo que no interfiere con su uso pretendido. Las bases modificadas incluyen, pero sin limitación, 7-desaza A y G, 7-desaza-8-aza A y G y otros restos heterocíclicos.
B. Suministro de la Muestra
La muestra se puede introducir en los dispositivos de la invención de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, por lo tanto, la muestra se puede introducir en el canal a través de un orificio de inyección tal como los usados en sistemas de cromatografía líquida de alta presión. En otra realización, la muestra se puede aplicar en un pocillo de muestra que se comunica con el canal. En otra realización más, la muestra se puede bombear al interior del canal. Los medios para introducir muestras en canales se conocen bien y son convencionales en las técnicas de electroforesis capilar y cromatografía.
C. Transporte de Fluido
Se pueden introducir muestras y/o fluidos de vehículo/tampón/lavado y/o desplazarse a través del canal de acuerdo con métodos convencionales. Por ejemplo, se puede introducir fluido y se puede desplazar a través del canal mediante un suministro por simple gravedad desde un "depósito". Como alternativa, los fluidos se pueden desplazar a través del canal por presión de gas o por presión de fluido producida por cualquiera de una diversidad de bombas adecuadas (por ejemplo, bombas peristálticas, bombas dosificadoras, etc.), presión sobre una cámara/diafragma deformable, etc. El fluido también se puede conducir a través del canal por métodos electroforéticos y/o electroosmóticos que se conocen bien y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.632.957 (citado anteriormente) y 6.046.056 (citado anteriormente).
El transporte de fluido puede ser continuo o discontinuo. Si se emplea transporte continuo, la velocidad del fluido se ajusta típicamente para garantizar que la muestra permanece en contacto con cada pareja de unión durante un tiempo suficiente para que cualquier se una analito diana afín. Si se desea, el ensayo puede emplear flujo discontinuo, donde la muestra se desplaza hasta que entra en contacto con una pareja de unión y se mantiene en esta posición durante un tiempo suficiente para la unión. En una realización, la muestra se desplaza hasta que entra en contacto con una pareja de unión y después se desplaza ligeramente hacia adelante y ligeramente hacia atrás (o viceversa) para mejorar la mezclado y poner más analito diana en contacto con la pareja de unión. El movimiento "hacia adelante y hacia atrás" se puede repetir si se desea para mejorar adicionalmente la mezcla.
Los métodos electroforéticos y/o electroosmóticos emplean típicamente electrodos que se pueden cargar de forma positiva, negativa o neutra para inducir el movimiento y/o la concentración de analitos diana en las proximidades de una o más parejas de unión y/o un flujo de fluido masivo a través del canal. En una realización preferida, el canal incluye una pluralidad de electrodos dispuestos en diferentes localizaciones de parejas de unión a lo largo de la longitud del canal y se aplica una tensión a cada electrodo de forma secuencial. Por ejemplo, si los analitos diana son ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, se puede aplicar un potencial de CC positivo a cada electrodo sucesivo, para inducir que los analitos diana se desplacen hacia adelante y se concentren cerca de cada pareja de unión sucesivo. El potencial positivo se puede mantener durante un tiempo suficiente para permitir que un analito diana apropiado se una a la pareja de unión. Después, se puede invertir la polaridad en el electrodo para repeler el analito diana no unido, alejándose éste de la pareja de unión y dirigiéndose hacia el siguiente elemento diana.
En una realización preferida, la polaridad de carga en el electrodo se invierte varias veces para mezclar el analito diana cerca del electrodo, con lo que se mejora la difusión del analito diana con respecto a la pareja de unión, aumentando la velocidad de acumulación de analito diana unido específicamente a la pareja de unión. La inversión de la polaridad de carga se puede realizar opcionalmente con potencial creciente para aumentar la rigurosidad del ensayo (rigurosidad electrónica). El proceso se puede realizar hasta que se alcance una rigurosidad deseada. La rigurosidad se puede controlar, por ejemplo, incluyendo un control interno en el sistema de ensayo, es decir, el ensayo se puede realizar usando uno o más analitos de control positivos y/o negativos para la pareja o las parejas de unión fijados en el canal. Los parámetros tales como la magnitud y la duración del pulso de tensión, así como el número y la sincronización de los pulsos, se pueden variar para conseguir la rigurosidad deseada. Gilles et al., (1999) Nature Biotechnology 17: 365-370, describen el uso de la rigurosidad electrónica en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos para retirar la señal atribuible a sondas de control "desacopladas" a niveles de fondo.
La velocidad del transporte del fluido dependerá de la configuración del dispositivo y de la cinética de la interacción de unión que se está ensayando. Como generalmente se prefieren ensayos más rápidos, los parámetros de diseño del dispositivo y el ensayo se seleccionan habitualmente para permitir un transporte de fluido relativamente rápido. Se pueden emplear velocidades de fluido mayores, si se desea, usando transporte segmentado para mejorar la mezcla y para acelerar la difusión de analitos diana a parejas de unión.
D. Transporte Segmentado
El uso de transporte de fluido segmentado en dispositivos de ensayo de fluidos se conoce bien y se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.853.336 (expedida el 1 de agosto de 1989 a Saros et al.). Se establecen segmentos de líquido sucesivos en un conducto que están separados entre sí por un fluido inmiscible. Esta técnica se ha usando en sistemas que permiten la mezcla en línea retardada de diferentes componentes de una mezcla de análisis, tales como muestras con reactivos o diluyentes. Antes de la presente invención se usaba transporte de fluido segmentado para promover la mezcla y la interacción de componentes de fluido en un conducto. En los métodos de esta invención, por el contrario, esta técnica se usa para mejorar la mezcla convectiva de analito diana en una muestra que se desplaza a través de un canal y la presentación del analito diana a parejas de unión fijados a un sustrato.
La Figura 4 muestra una realización en la que la muestra (403) se transporta a través del canal (401) hasta una primera pareja de unión, precediendo a la muestra durante el transporte un bolo o una burbuja de un fluido (402) que es inmiscible con la muestra. Otro bolo o burbuja de fluido inmiscible (402) sigue a la muestra durante el transporte. El fluido o los fluidos inmiscibles pueden ser iguales o diferentes y preferiblemente son suficientemente inmiscibles como para que la muestra se mantenga sustancialmente como una fase separada durante el transporte. Los fluidos inmiscibles pueden ser cualquier fluido que no contenga componentes reactivos con el canal o los componentes del canal con los que los fluidos inmiscibles se ponen en contacto durante el ensayo o con los analitos diana, parejas de unión o cualquier otro reactivo de ensayo (por ejemplo, marcadores). Los ejemplos de fluidos inmiscibles adecuados para el uso en la invención incluyen aceite de silicio y gases inmiscibles, no reactivos. Se prefieren los gases, empleándose más convenientemente burbujas de aire.
Si el ensayo requiere la exposición de los elementos de unión a más de solamente la solución de muestra, por ejemplo, tampones, soluciones de lavado, soluciones de reactivo marcador, etc., cada solución se puede separar de cualquier otra solución por un bolo o una burbuja de fluido inmiscible.
En realizaciones preferidas, la muestra es una solución acuosa, y la superficie de la luz del canal es hidrófoba, con la excepción de una o más partes del canal en las que están fijados una o más parejas de unión. En una realización particularmente preferida, el ensayo emplea el dispositivo de la invención que tiene un elemento de cobertura con una superficie luminal hidrófila y un canal con una superficie luminal hidrófoba. Durante el transporte, hay poco traspaso de la solución de muestra acuosa entre segmentos de líquido aislados por fluido inmiscible. Sin embargo, una pequeña cantidad de solución de muestra se adhiere a la superficie o las superficies hidrófilas que llevan pareja de unión. La parte no unida de esta solución de muestra de traspaso se "recoge" por el siguiente segmento de líquido, por ejemplo, uno que contenga tampón, y se presenta a parejas de unión posteriores. Una ventaja importante del flujo segmentado es que los contenidos del segmento se agitan, como se muestra en la Figura 4, aumentando la cantidad de analito diana presentado a cada pareja de unión.
Una realización preferida aprovecha la existencia de una película superficial delgada de solución de muestra entre bolos o burbujas de fluido inmiscible y la superficie hidrófila del canal/elemento de cobertura para mejorar la unión del analito diana. En el campo de Análisis de Flujo Continuo para el que se desarrolló el flujo segmentado en primer lugar (Skeggs (1957) American Journal of Clinical Pathology 28: 311-322), la presencia de la película superficial entre la burbuja y la pared del canal se consideró una causa de traspaso indeseable desde un segmento de líquido al siguiente segmento de líquido. Sin embargo, la presente invención puede aprovechar este traspaso para proporcionar una presentación en "película delgada" de los analitos diana a parejas de unión. Cuando los segmentos de líquido y bolos o burbujas pasan al lado, la película superficial queda atrapada entre el bolo/la burbuja y la superficie hidrófila y después se desplaza desde un segmento de líquido al siguiente segmento de líquido. El grosor de la película formada entre el bolo/burbuja y la superficie hidrófila se define por la siguiente ecuación:
d_{f} = 0,5\pid_{t}(u\eta/\gamma)^{2/3}
donde d_{f} = grosor de la película; d_{t} = diámetro de tubo; u = velocidad de flujo; \eta = viscosidad; \gamma = tensión superficial. Véase Snyder y Adler (1976) Anal. Chem. 48: 1018-22; Snyder y Adler (1976) Anal. Chem. 48: 1023-27.
La Figura 5 ilustra la situación en la que la película capturada entre el bolo o la burbuja (502) y la superficie hidrófila del canal (504) queda atrapada por y se mezcla con el siguiente segmento de líquido (503). (También se muestran los parejas de unión 501.) Como es evidente a partir de la anterior ecuación, el grosor de la película superficial se puede manipular por la tensión superficial, la viscosidad de la solución de muestra y por la velocidad de flujo. Con el control disponible, la solución de muestra se puede presentar a una o más parejas de unión en una película suficientemente delgada, del orden de 1 \mum, para que la difusión de analito diana a la superficie hidrófila sea rápida.
La Figura 6 ilustra el uso de múltiples bolos o burbujas de fluido inmiscibles (602) para aumentar la proporción de la muestra (603) presentada como una película delgada y para aumentar el intercambio de solución masiva en el bolo de muestra con la película delgada entre el bolo/burbuja y la superficie luminal. La solución de muestra (603) se divide en varios segmentos separados por pequeños bolos/burbujas (602). Cuando el flujo segmentado se desplaza hacia abajo por el canal, el analito diana en la película que se adhiere a la superficie hidrófila que no ha hibridado con una pareja de unión, se transporta desde el segmento de muestra en cabeza al siguiente segmento, mezclándose con el mismo. Esta transferencia y mezcla vuelven a producirse entre cada segmento de muestra adyacente, mezclando de forma eficaz los segmentos y dejando expuestos los elementos diana a la nueva solución de muestra en una película delgada. La transferencia de solución de muestra desde un segmento de líquido al siguiente da como resultado una dilución lenta del analito diana cuando la columna de segmentos de solución de muestra se desplaza hacia abajo por el tubo. Sin embargo, la solución de tampón (601) que sigue a la muestra (603) puede capturar analito diana no unido y volver a presentarlo a los parejas de unión. Preferiblemente, la solución de tampón (601) se divide en varios segmentos separados por un bolo o una burbuja de fluido inmiscible (602), como se muestra en la Figura 6.
La presentación en película delgada del analito diana hace posible realizar el ensayo con velocidades de flujo relativamente altas. Un especialista en la técnica puede determinar de forma sencilla la velocidad de flujo adecuada calculando la cantidad de tiempo requerida para que un analito diana se difunda y se una a su pareja de unión afín. Por ejemplo, la velocidad de flujo para un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos se puede calcular del siguiente modo. Si el analito diana es un oligonucleótido de 15 pb, tiene una longitud de 15*0,34 nm/pb, un diámetro de 2,6 nm y un volumen de 15*0,34 nn*(1,3 mn)^{2}*\pi = 27,1 nm^{3}. Una esfera de volumen igual tiene un radio de
R = (3/(4\pi)*V)^{1/3} = 1,86 nm y el coeficiente de difusión lateral de una esfera (D) es 6\gamma\eta\pi.
D = kT/(6\pi\etaR)
(\eta agua, 20ºC) = 0,01 Poise (poise = g/cm s)
D = 1,38* 10^{-16} erg/K*293 K/6*\pi*0,01 g/(cm s)*1,86*10^{-7} cm = 1,15*10^{-6} cm^{2}/s
y la distancia difundida es:
d = (2Dt)^{1/2}
y
t = d^{2}/2D
Por lo tanto, para que un oligómero de 15 unidades difunda 1 \mu:
t=0,005 s.
En consecuencia, una vez que se ha formado una película de 1 \mum de grosor de solución de muestra entre una burbuja y una superficie, un oligómero de 15 unidades necesitará solamente 5 ms para difundir hasta la superficie y estar dentro del alcance de hibridación de las secuencias diana.
Dado un tiempo de difusión de 5 ms, una muestra de 1 mm de longitud se podría desplazar a una velocidad de 1 mm/0,005 s o 200 mm/s. Dejando 100 tiempos de difusión para que se produzca la hibridación se proporciona una velocidad de flujo de 2 mm/s. Por lo tanto, el flujo segmentado a través de un canal presentará de forma eficaz analitos diana a las parejas de unión en un canal de 10.000 parejas de unión en aproximadamente 1-2 horas. Por supuesto, cuando el tiempo de ensayo no supone un problema, los ensayos de la invención se pueden realizar a velocidades de flujo inferiores, por ejemplo de aproximadamente 10 mm/s, de aproximadamente 1 mm/s, de aproximadamente 0,1 mm/s, de aproximadamente 0,01 mm/s y de aproximadamente 0,001 mm/s.
E. Transporte Electroforético Segmentado
En algunas realizaciones, el transporte de fluido se combina con transporte electroforético. El uso de segmentación permite un control preciso sobre la colocación de la muestra o el segmento de muestra con respecto a la pareja o las parejas de unión y el electrodo o los electrodos correspondientes. Por lo tanto, el transporte de fluido se puede coordinar de tal forma que un electrodo que sirve como una localización de pareja de unión se carga de forma apropiada (es decir, positivamente o negativamente, dependiendo de la carga del analito diana) cuando la muestra o el segmento de muestra se coloca sobre ese elemento de unión. Ajustando el tamaño del bolo o la burbuja de fluido inmiscible de tal forma que abarque varios electrodos, el campo eléctrico se limita al segmento diana de interés evitando que se produzca una corriente eléctrica y electrólisis cuando no es útil. En esta realización se pueden emplear uno o más sensores (por ejemplo, sensores ópticos) para seguir el avance de la muestra y para encender los electrodos cuando sea apropiado.
F. Otros Métodos Para Mejorar la Mezcla de Analito Diana
Adicionalmente al método que se ha descrito anteriormente, la mezcla y la presentación del analito diana, u otros componentes de ensayo, a parejas de unión se puede mejorar incluyendo partículas en los fluidos pertinentes. Una realización preferida incluye partículas en la muestra y/o en una solución de tampón transportada a través del canal detrás de la muestra. Las partículas no deben ser reactivas con los componentes de ensayo y del dispositivo con los que las partículas se pondrán en contacto durante el uso. Las partículas se pueden formar a partir de cualquiera de los materiales que se han descrito anteriormente en relación con los materiales del canal, así como de otros materiales conocidos por los especialistas en la técnica. Se prefieren partículas poliméricas y están disponibles en una diversidad de formas y tamaños. Las partículas se deben dimensionar para mejorar la mezcla. En realizaciones que emplean flujo segmentado, las partículas no deben ser tan grandes como para alterar los bolos o las burbujas de fluido inmiscible. En una realización preferida, el canal tiene una forma semicircular, un diámetro interno de aproximadamente 100 \mum, y se incluyen partículas que tienen de aproximadamente 5 \mum a aproximadamente 20 \mum, preferiblemente de aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 15 \mum, en la solución de muestra para mejorar la mezcla.
La mezcla también se puede mejorar por un diseño de canal apropiado. Por ejemplo, el canal puede incluir una o más irregularidades u obstáculos al flujo, tales como, por ejemplo, protuberancias, que inducen turbulencias. En dispositivos diseñados para el flujo segmentado, el tamaño y la forma de tales irregularidades u obstáculos debe permitir que los bolos o las burbujas de fluido inmiscible pasen intactos. En un canal semicircular que tiene un diámetro interno de aproximadamente 100 \mum, por ejemplo, el canal puede incluir una o más protuberancias que se extienden desde aproximadamente 15 \mum a aproximadamente 25 \mum, siendo preferiblemente de aproximadamente 20 \mum desde la pared del canal. Si se desea, tales irregularidades se pueden separar una distancia establecida delante de las localizaciones de parejas de unión para proporcionar mezcla específicamente donde se necesite.
G. Condiciones de Unión
Una vez en el canal, la muestra se mantiene en condiciones que promueven la unión específica entre la muestra y la pareja de unión. Los especialistas en la técnica conocen bien las condiciones compatibles con la unión específica entre una pareja de unión y un analito diana dado. Por ejemplo, los tampones adecuados para promover la unión entre un anticuerpo y una proteína diana se conocen bien en la técnica de los inmunoensayos (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168; Asai (1993) Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York; Stites y Terr (1991) Basic and Clinical Immunology 7ª Edición).
Los especialistas en la técnica también conocen condiciones similares en las que los ácidos nucleicos hibridan específicamente entre sí (véase, por ejemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier, N.Y.).
La hibridación de ácidos nucleicos implica simplemente poner en contacto ácidos nucleicos monocatenarios en condiciones en las que ácidos nucleicos complementarios pueden formar dúplex híbridos estables por apareamiento de bases complementarias. Los ácidos nucleicos que no forman dúplex híbridos se eliminan después por lavado dejando los ácidos nucleicos hibridados que se tienen que detectar, típicamente mediante la detección de un marcador detectable unido. Generalmente se reconoce que los ácidos nucleicos se desnaturalizan aumentando la temperatura o disminuyendo la concentración salina del tampón que contiene los ácidos nucleicos, añadiendo agentes químicos o elevando el pH. En condiciones de baja rigurosidad (por ejemplo, temperatura baja y/o alta concentración de sal), se formarán dúplex híbridos (por ejemplo, ADN:ADN, ARN:ARN o ARN:ADN) aunque las secuencias hibridadas no sean perfectamente complementarias. Por lo tanto, la especificidad de la hibridación disminuye al reducirse la rigurosidad. Por el contrario, al aumentar la rigurosidad (por ejemplo, mayor temperatura o una menor concentración de sal) una hibridación satisfactoria requiere menos desacoplamientos.
Un especialista en la técnica entenderá que se pueden seleccionar condiciones de hibridación para proporcionar cualquier grado de rigurosidad. En una realización preferida, la hibridación se realiza con rigurosidad baja para garantizar la hibridación y después se realizan lavados posteriores con mayor rigurosidad para eliminar los dúplex híbridos desacoplados. Se pueden realizar lavados sucesivos a una rigurosidad cada vez mayor (por ejemplo, bajando hasta SSPE 0,25X a 37ºC-70ºC) hasta que se obtenga un nivel deseado de especificidad de hibridación. La rigurosidad también se puede aumentar por adición de agentes tales como formamida. Finalmente, se puede emplear rigurosidad electrónica como se ha descrito anteriormente para conseguir la rigurosidad deseada. La especificidad de hibridación se puede evaluar comparando la hibridación de los ácidos nucleicos del analito diana con hibridación de ácidos nucleicos de control que se pueden incluir en la mezcla de hibridación.
En general, hay una compensación entre la especificidad de hibridación (rigurosidad) y la intensidad de la señal. Por lo tanto, en una realización preferida, el lavado se realiza a la mayor rigurosidad que produce resultados uniformes y que proporciona una intensidad de señal superior a aproximadamente el 10% de la intensidad de fondo. Esta rigurosidad se puede determinar empíricamente lavando los ácidos nucleicos de analito diana hibridados con soluciones de rigurosidad sucesivamente mayor y detectando la unión después de cada lavado. Los análisis de los conjuntos de datos producidos de este modo mostrarán una rigurosidad de lavado por encima de la cual el patrón de hibridación no se altera de forma apreciable y que proporciona una señal adecuada para el ensayo.
En una realización preferida, la señal de fondo disminuye mediante el uso de un reactivo de bloqueo (por ejemplo, ARNt, ADN de esperma, ADN de Cot-1, etc.) durante la hibridación para disminuir la unión no específica. El uso de agentes de bloqueo en hibridación se conoce bien por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, capítulo 8 en P. Tijssen, citado anteriormente).
Las condiciones de hibridación óptimas también son una función de la sensibilidad de la detección del marcador (por ejemplo, fluorescencia) para diferentes combinaciones de tipo de sustrato, fluorocromo, bandas de excitación y de emisión, tamaño de punto y similares. Se pueden usar superficies de bajo fondo de fluorescencia (véase, por ejemplo, Chu (1992) Electrophoresis 13: 105-114). La sensibilidad para la detección de puntos de parejas de unión de diversos diámetros sobre las superficies candidatas se puede determinar fácilmente mediante, por ejemplo, aplicación puntual de una serie de diluciones de fragmentos de ADN marcados en el extremo con fluorescencia. Estos puntos se representan después usando microscopía de fluorescencia convencional. De este modo, se pueden determinar la sensibilidad, linealidad y el intervalo dinámico que se pueden conseguir de las diversas combinaciones de fluorocromo y superficies sólidas (por ejemplo, vidrio, sílice condensada, etc.). También se pueden analizar diluciones seriadas de pares de fluorocromos en proporciones relativas conocidas. Esto determina la precisión con la que las mediciones de proporción de fluorescencia reflejan las proporciones de fluorocromo reales a lo largo del intervalo dinámico permitido por los detectores y la fluorescencia del sustrato sobre el que se ha fijado la pareja de unión.
H. Detección
Se puede usar prácticamente cualquier método de detección de analito de acuerdo con los métodos de esta invención. Los métodos para detectar analitos diana se conocen bien por los especialistas en la técnica. Cuando el analito diana está marcado, el analito se detecta detectando el marcador. Como alternativa, la unión del analito diana se puede detectar detectando una propiedad física del analito diana. Preferiblemente el método de detección empleado es uno que permite la cuantificación de la unión del analito diana.
Como la identidad de los analitos diana se puede determinar por la localización o localizaciones de la pareja o las parejas de unión a los que se unen, no es necesario usar marcadores diferentes para identificar analitos diferentes. Los analitos diana se pueden marcar directa o indirectamente. El marcaje indirecto incluye más típicamente el uso de componentes marcados capaces de unirse al analito diana, por ejemplo, un anticuerpo marcado. El componente marcado puede ser un miembro de un par de unión, estando unido el otro miembro al analito diana, por ejemplo, biotina-avidina. Cuando se emplea marcaje indirecto, la unión entre el componente marcado y el analito diana puede producirse antes, durante o después de la unión del analito diana a la pareja de unión fijado en el canal. El marcador puede ser detectable a lo largo del procedimiento de ensayo o puede ser detectable como resultado de la interacción con un sistema de detección que se suministra en un bolo de fluido que sigue a la muestra y cualquier solución de tampón o lavado.
Los especialistas en la técnica conocen bien métodos para detectar analitos diana. Cuando el analito diana está marcado (por ejemplo, con un marcador radiactivo, fluorescente, magnético o de masa), el analito se detecta detectando el marcador. Preferiblemente, el analito o los analitos diana presentes en la muestra se marcan con un marcador que absorbe luz, tal como un marcador fluorescente.
Los marcadores fluorescentes se detectan de forma conveniente usando un lector convencional que incluye una fuente de luz de excitación y un detector de fluorescencia. Un lector convencional puede incluir, por ejemplo, una lámpara de arco de mercurio y una cámara CCD para recoger datos de intensidad de fluorescencia (véase, por ejemplo, Pinkel et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211). Típicamente se emplean múltiples filtros para recoger datos de intensidad parar diferentes fluoróforos. Cuando el canal es un tubo, tal como un tubo capilar, la detección de fluorescencia se puede realizar pasando el canal (701) a través de un lector, como se muestra en la Figura 7, donde la fuente de luz (702) proporciona luz de excitación y la señal de fluorescencia resultante se detecta mediante un detector (703). Están disponibles sistemas adecuados para analizar señales de fluorescencia en micromatrices bidimensionales, y éstas se pueden usar para detectar y cuantificar la unión a una matriz bidimensional de parejas de unión aplicados puntualmente sobre un elemento de cobertura de la invención.
Dependiendo del método de detección, un detector o componente de un sistema de detección se puede incorporar en un dispositivo de la invención. Como alternativa, la superficie del dispositivo que lleva las parejas de unión unidos al analito diana se pueden retirar del canal para facilitar la detección. Por ejemplo, si las parejas de unión se fijan al elemento de cobertura, el elemento de cobertura se puede desprender del canal y la señal se puede detectar usando cualquier sistema de detección adecuado para detectar la unión a micromatrices, por ejemplo, micromatrices de ADN.
Aunque se pueden usar ensayos de la invención para detectar múltiples analitos diana sin la necesidad de múltiples marcadores, para algunas aplicaciones pueden ser deseables múltiples marcadores. Por ejemplo, los ensayos de la invención se pueden usar para ensayos comparativos en los que la muestra incluye analitos diana obtenidos a partir de dos o más fuentes diferentes. Los analitos diana de cada fuente se marcan con un marcador diferente. Los diferentes marcadores se deben poder distinguir fácilmente. Por ejemplo, un analito diana obtenido de una fuente podría tener un marcador fluorescente verde y un analito diana obtenido de otra fuente podría tener un marcador fluorescente rojo. La etapa de detección distingue los sitios que unen el marcador rojo de los que unen el marcador verde. De este modo, la unión de analitos diana marcados de forma diferente a una única pareja de unión se puede analizar de manera independiente.
Los analitos diana marcados de forma diferente se pueden mezclar para formar una muestra que se introduce en el canal como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los analitos diana de una fuente se pueden introducir en el canal como una primera muestra, seguido de la introducción de los analitos diana de cualquier otra fuente como muestras separadas. Después de la unión a parejas de unión fijados al canal, se detectan las señales de los analitos diana marcados unidos a cada pareja de unión. Las intensidades de cualquier señal producida por cada marcador diferente en cada localización de pareja de unión se comparan como una indicación de las cantidades relativas de cada tipo de analito diana en las fuentes originales.
I. Control de Hibridación/Expresión Genómica Comparativa
En una realización preferida, se usa un dispositivo de acuerdo con la invención en un ensayo de Hibridación Genómica Comparativa (CGH) o de control de expresión. La CGH es una estrategia usada para detectar la presencia e identificar la localización cromosómica de secuencias de nucleótidos amplificadas o delecionadas. (Véase, Kallioniemi et al., Science 258: 818-821 (1992); documento WO 93/18186). En la implementación tradicional de la CGH, se aísla ADN genómico de células de referencia normales, así como de células de ensayo (por ejemplo, células tumorales). Los dos ácidos nucleicos (ADN) se marcan con marcadores diferentes y después se hibridan in situ con cromosomas en metafase de una célula de referencia. Las secuencias repetidas tanto en los ADN de referencia como en los de ensayo se pueden retirar o se puede disminuir su capacidad de hibridación por algún medio tal como un ácido nucleico de bloqueo no marcado (por ejemplo, Cot-1). Las regiones cromosómicas de las células de ensayo que tienen un numero de copias aumentado o disminuido se pueden identificar rápidamente detectando regiones en las que está alterada la proporción de señales de los dos ADN. Por ejemplo, las regiones que han disminuido el número de copias en las células de ensayo mostrarán una señal relativamente inferior del ADN de ensayo que la referencia en comparación con otras regiones del genoma. Las regiones que han aumentado en número de copias en las células de ensayo mostrarán una señal relativamente superior del ADN de ensayo.
En una realización, la presente invención proporciona un ensayo de tipo CGH en el que el dispositivo de la presente invención sustituye al cromosoma en metafase usado para la diana de hibridación en la CGH tradicional. En vez de esto, las parejas de unión fijados en el canal son secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas de regiones diferentes del genoma. El propio dispositivo se convierte en una especie de "cromosoma de vidrio" en el que la hibridación de un ácido nucleico con una pareja de unión particular es informacionalmente equivalente a la hibridación de ese ácido nucleico con la región en un cromosoma en metafase del que procede la pareja de unión. Además, se pueden emplear parejas de unión de ácido nucleico no contenidos normalmente en el genoma, por ejemplo, ácidos nucleicos virales.
Más particularmente, en un ensayo de tipo CGH, se puede utilizar un dispositivo de la invención en métodos para comparar cuantitativamente el número de copias de al menos dos secuencias de ácido nucleico en una primera colección de ácidos nucleicos con respecto al número de copias de esas mismas secuencias en una segunda colección. Las parejas de unión para estos ácidos nucleicos pueden ser cualquier tipo de ácido nucleico, por ejemplo, ADN genómico, ADNc, ADN amplificado, ADN sintético o ARN (particularmente ARNm), como pueden ser las colecciones de ácidos nucleicos. En realizaciones preferidas, las colecciones de ácidos nucleicos son ADN genómico o representaciones del mismo (por ejemplo, secuencias amplificadas), y la comparación del numero de copias proporciona información sobre variaciones en el numero de copias (es decir, amplificaciones y/o deleciones) entre las dos colecciones de ácidos nucleicos. En otras realizaciones preferidas, las colecciones de ácidos nucleicos son ARNm o representaciones del mismo (por ejemplo, ADNc o secuencias amplificadas), y la comparación del numero de copias proporciona información sobre diferencias en los niveles de expresión de genes particulares entre las dos colecciones de ácidos nucleicos. Se pueden realizar tipos similares de ensayos comparativos uniendo colecciones de proteínas de diferentes fuentes a anticuerpos fijados al canal u otras proteínas de unión. Estas realizaciones son útiles en estudios de control de la expresión.
Si están presentes secuencias repetidas en la mezcla de hibridación formada cuando la colección o las colecciones de ácidos nucleicos se ponen en contacto con las parejas de unión de ácido nucleico fijados al canal, se pueden incluir ácidos nucleicos de bloqueo no marcados (por ejemplo, ADN de Cot-1) en la mezcla de hibridación. El bloqueo de la hibridación de secuencias repetidas permite la detección de la denominada variación del número de copias de "secuencia única". Los ácidos nucleicos de bloqueo se pueden mezclar con las colecciones de ácidos nucleicos antes de la introducción en el canal. Como alternativa, una solución de ácidos nucleicos de bloqueo puede preceder a un bolo o burbuja de fluido inmiscible que precede a la muestra.
En una realización típica, una colección de ácidos nucleicos se prepara a partir de una célula, población celular o tejido de ensayo en estudio; y la segunda colección de ácidos nucleicos se prepara a partir de una célula, población celular o tejido de referencia. Las células de referencia pueden ser células normales no enfermas o pueden proceder de una muestra de tejido enfermo que sirve como patrón para otros aspectos de la enfermedad. Por ejemplo, si los ácidos nucleicos de referencia son ADN genómico aislado a partir de células normales, entonces se conoce el numero de copias de cada secuencia en ese ADN genómico con respecto a los demás (por ejemplo, dos copias de cada secuencia autonómica y una o dos copias de cada secuencia de cromosoma sexual dependiendo del sexo). La comparación de esto con ácidos nucleicos de ensayo permite la detección de variaciones de lo normal. Como alternativa, los ácidos nucleicos de referencia se pueden preparar a partir de ADN genómico de un tumor primario que puede mostrar variaciones del numero de copias sustanciales y los ácidos nucleicos de ensayo se pueden preparar a partir de ADN genómico de células metastásicas de ese tumor, de tal forma que la comparación muestra las diferencias entre el tumor primario y su metástasis. Además, las dos colecciones de ácidos nucleicos se pueden preparar a partir de células normales. Por ejemplo, la comparación de poblaciones de ARNm entre células normales de diferentes tejidos permite la detección de la expresión génica diferencial, que es una característica crítica de diferenciación tisular. Por lo tanto, los términos "ensayo" y "referencia" se usan por conveniencia para distinguir las dos colecciones de ácidos nucleicos; ningún término tiene por objeto implicar nada con respecto a las características de los ácidos nucleicos.
VI. Kits para Detección de Analito Múltiple
En este documento también se describen kits para seleccionar, identificar la presencia o ausencia y/o cuantificar uno o más analitos en una muestra. Un kit incluye un canal de la invención que incluye una o más parejas de unión fijados en el mismo como se ha descrito anteriormente. El canal se diseña preferiblemente para permitir una incorporación simple y rápida en un dispositivo de ensayo integrado, por ejemplo, un dispositivo que incluye uno o más de los siguientes: uno o más pocillos de aplicación de muestra y/o uno o más orificios de inyección, uno o más depósitos para proporcionar tampones y/o fluidos de lavado, uno o más electrodos que dirigen el transporte de fluido, un detector y un controlador informático. El kit puede incluir adicionalmente tampones apropiados y otras soluciones y patrones para el uso en los métodos de ensayo descritos en este documento.
Además, un kit puede incluir materiales de instrucciones que contienen directrices (es decir, protocolos) para la puesta en práctica de los métodos de esta invención. Aunque los materiales de instrucción son típicamente materiales escritos o impresos, no se limitan a los mismos. Esta invención considera cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Estos medios incluyen, pero sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM) y similares. Estos medios pueden incluir direcciones de sitios de Internet que proporcionan tales materiales de instrucciones.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.
Ejemplo 1 Sistema de Hibridación en Matriz Basada en Capilares
En la Figura 8 se ilustra un sistema de hibridación en matriz basada en canales capilares. El sustrato de canal (802) está compuesto por material de PDMS (polidimetilsiloxano) moldeado, que se puede moldear con detalle preciso y que proporciona una superficie que se sella fácilmente contra el elemento de cobertura plano (placa de cobertura) (803). El canal (804) tiene una sección transversal semicircular. Para minimizar la cantidad de analito diana requerido para el análisis y para minimizar las distancias a través de las que tienen que difundir los analitos diana para alcanzar a las parejas de unión, el canal tiene un diámetro interno de 100 \mum y una longitud total de 1 m. El canal está plegado 100 veces, la distancia entre el centro de un segmento de canal y el centro de una secuencia de canal adyacente es de 400 \mum y el sustrato de canal es de 4 cm X 10 cm.
La placa de cobertura es vidrio. Las parejas de unión de ácido nucleico (801) se imprimen sobre la placa de cobertura usando un robot Arrayer usado convencionalmente para la producción de micromatrices de ADN bidimensionales convencionales. La distancia de un centro a otro entre parejas de unión adyacentes en la misma fila es de aproximadamente 100 \mum (las filas van a lo largo del eje longitudinal de cada segmento de canal cuando la placa de cobertura se sella sobre el canal. La distancia de un centro a otro entre parejas de unión adyacentes en la misma columna es de aproximadamente 400 \mum (las columnas son perpendiculares a las filas). Esta estrategia tiene la ventaja de que las instalaciones existentes pueden implementar la estrategia de análisis en matriz capilar usando el equipo de matriz existente. La placa de cobertura se puede retirar de forma sencilla para el análisis de fluorescencia y el canal de flujo se puede reutilizar múltiples veces.
Para la CGH de matriz se realiza un ensayo de hibridación de CGH en matriz capilar como se ha descrito previamente. En resumen, el ADN genómico de una fuente de ensayo se marca por desplazamiento de mella con fluoresceína dCTP y el ADN genómico de referencia se marca por desplazamiento de mella con rojo Texas dCTP. Los ADN marcados se mezclan con el exceso de ADN de Cot-1 no marcado y se precipitan con etanol. El ADN precipitado se resuspende en formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, SSC 2X, dodecil sulfato sódico (SDS) al 2% y 100 mg de ARNt. El ADN se desnaturaliza a 70ºC y se transporta a través del canal capilar a 37ºC. Después de la hibridación se retira la placa de cobertura y se lava en formamida al 50%, SSC 2X, pH 7, a 45ºC y una vez en tampón fosfato sódico 0,1 M con NP40 al 0,1%, pH 8, a temperatura ambiente. Las proporciones de fluorescencia verde/roja se miden usando un sistema láser de exploración confocal ACAS 570.
Ejemplo 2 Sistema de Hibridación Electroforético de Matriz Basada en Capilares
Haciendo referencia a la Figura 9, un dispositivo que tiene la configuración básica descrita en el Ejemplo 1 tiene parejas de unión de ácido nucleico (901) impresos en una matriz bidimensional sobre una placa de cobertura de vidrio (902) sobre la parte superior de electrodos de titanio-platino (903). Los electrodos (903) están debajo de una columna de diferentes localizaciones de parejas de unión en la matriz bidimensional. Cada columna de diferentes localizaciones de pareja de unión tiene un eje longitudinal que es generalmente perpendicular al eje longitudinal de cada segmento recto del canal (904). Para proteger a los ácidos nucleicos de los productos de electrólisis formados en los electrodos, la superficie de la placa de cobertura, incluyendo las tiras conductoras, se recubre con una capa de infiltración que comprende una mezcla de glioxal agarosa al 2% y 1 mg/ml de estreptavidina. Las parejas de unión de ácido nucleico se sintetizan con una biotina unida en un extremo. Una vez que las parejas de unión se han depositado sobre la capa de infiltración, la unión de avidina/biotina se fija a los ácidos nucleicos, formando elementos de parejas de unión.
Durante el uso se aplica un potencial de CC positivo a tiras de electrodo sucesivas a lo largo del canal para atraer ácidos nucleicos diana cargados negativamente a cada pareja de unión sucesivo a lo largo del capilar, presentando los ácidos nucleicos diana a cada pareja de unión de ácido nucleico para la hibridación. Después se invierte la polaridad para repeler el material no hibridado, que se desplaza después hacia la siguiente pareja de unión en respuesta al potencial de CC positivo en su electrodo asociado. Preferiblemente, el potencial se invierte varias veces en cada electrodo para "mezclar" la sonda y para definir una "rigurosidad" eléctrica de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet WO 9942809 A [0007]
\bullet US 5545553 A [0078]
\bullet WO 9843739 A [0007]
\bullet US 4447576 A [0082]
\bullet EP 0969083 A [0007]
\bullet US 4254082 A [0082]
\bullet US 5952173 A [0007]
\bullet US 5143854 A [0083]
\bullet GB 8707252 A [0024]
\bullet WO 9015070 A [0083]
\bullet US 5644048 A [0026]
\bullet WO 9210092 A [0083]
\bullet US 5386023 A [0026]
\bullet WO 9309668 A [0083]
\bullet US 5637684 A [0026]
\bullet US 4853336 A [0093] [0127]
\bullet US 5602240 A [0026]
\bullet US 3635680 A, Peoples [0094]
\bullet US 5216141 A [0026]
\bullet US 3479141 A, Smythe [0094]
\bullet US 4469863 A [0026]
\bullet US 4253846 A, Smythe [0094]
\bullet US 5235033 A [0026]
\bullet US 5807522 A, Brown and Shalon [0097]
\bullet US 5034506 A [0026]
\bullet US 5632957 A, Heller [0099] [0122]
\bullet US 5194133 A [0055]
\bullet US 6046056 A, Paree [0099] [0122]
\bullet US 5132012 A [0055]
\bullet US 3817837 A [0113]
\bullet US 4908112 A [0055]
\bullet US 3850752 A [0113]
\bullet US 4891120 A [0055]
\bullet US 3939350 A [0113]
\bullet US 4683202 A [0061]
\bullet US 3996345 A [0113]
\bullet US 4683195 A [0061]
\bullet US 4277437 A [0113]
\bullet US 4800159 A [0061]
\bullet US 4275149 A [0113]
\bullet US 4965188 A [0061]
\bullet US 4366241 A [0113] [0139]
\bullet US 4458066 A [0074]
\bullet US 4376110 A [0139]
\bullet WO 9632491 A [0078]
\bullet US 4517288 A [0139]
\bullet US 5352670 A [0078]
\bullet US 4837168 A [0139]
\bullet US 5374541 A [0078]
\bullet WO 9318186 A [0153]
Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción
\bulletBRINKMANN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 547.551 [0024]
\bulletBIRD et al. Science, 1988, vol. 242, 424-426 [0024]
\bulletHUSTON et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 5879-5883 [0024]
\bulletMORRISON et al. Proc Nat. Acad. Sci USA, 1984, vol. 81, 6851-8855 [0024]
\bulletJONES et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0024]
\bulletBEAUCAGE et al. Tetrahedron, 1993, vol. 49 (10), 1925 [0026]
\bulletLETSINGER. J. Org. Chem, 1970, vol. 35, 3800 [0026]
\bulletSPRINZL et al. Eur. J. Biochem, 1977, vol. 81, 579 [0026]
\bulletLETSINGER et al. Nucl. Acids Res., 1986, vol. 14, 3487 [0026]
\bulletSAWAI et al. Chem. Lett, 1984, 805 [0026]
\bulletLETSINGER et al. J. Am. Chem. Soc, 1988, vol. 110, 4470 [0026] [0026]
\bulletPAUWELS et al. Chemica Scripta, 1986, vol. 26, 1419 [0026]
\bulletMAG et al. Nucleic Acids Res, 1991, vol. 19, 1437 [0028]
\bulletBRIU et al. J. Am. Chem. Soc, 1989, vol. 111, 2321 [0026]
\bulletECKSTEIN. Oligonucleotidee and Analogues: A Practical Approach. Oxford University Press [0026]
\bulletEGHOLM. J. Am. Chem. Soc, 1992, vol. 114, 1895 [0026]
\bulletMEIER et al. Chem. Int. Ed. Engl., 1992, vol. 31, 1008 [0026]
\bulletNIELSEN. Nature, 1993, vol. 365, 566 [0026]
\bulletCARLSSON et al. Nature, 1996, vol. 380, 207 [0026]
\bulletDENPCY et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, 6097 [0026]
\bulletANGEW. Chem. Intl. Ed. English, 1991, vol. 30, 423 [0026]
\bulletLETSINGER et al. Nucleoside & Nucleotide, 1994, vol. 13, 1597 [0026]
\bullet Carbohydrate Modifications in Antisense Research. ASC Symposium Series, 580 [0026] [0026]
\bulletMESMAEKER et al. Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 1994, vol. 4, 395 [0026]
\bulletJEFFS et al. J. Biomolecular NMR, 1994, vol. 34, 17 [0026]
\bulletTetralzedron Lett., 1996, vol. 37, 743 [0026]
\bulletJENKINS et al. Chem. Soc. Rev., 1995, 169-176 [0026]
\bullet Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I. TIJSSEN; TIJSSEN. Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays. Elsevier, 1993 [0028]
\bulletSAMBROOK. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989, vol. 1-3 [0028]
\bulletGRANGER. Fluid Mechanics, 1995 [0031]
\bulletMEYER. Introduction to Mathematical Fluid Dynamics, 1982 [0031]
\bullet The Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication. CHOUDHURY. Soc. Photo-Optical Instru. Engineer. 1997 [0055]
\bulletBARD; FAULKNER. Fundamentals of Microfabrication, 1997 [0055]
\bulletAnal. Chem, 1988, vol. 70, 4974 [0058]
\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning -A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, vol. 1-3 [0060]
\bulletSAIKI. Science, 1985, vol. 230, 1350 [0061]
\bulletBEAUCAGE; CARUTHERS. Tetrahedron Letts., 1981, vol. 22 (20), 1859-1862 [0062]
\bulletNEEDHAM-VANDEVANTER et al. Nucleic Acids Res, 1984, vol. 12, 6159-6168 [0062]
\bulletPEARSON; REGNIER. J. Chrom., 1983, vol. 255, 137-149 [0062]
\bullet Grossman and Moldave. Meth. Enzymol. Academic Press, 1980, vol. 65, 499-560 [0062]
\bulletHARLOW; LANE. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0063]
\bullet Methods in Cell Biology. ASAI. Antibodies in Cell Biology. Academic Press, 1993, vol. 37 [0063]
\bulletBARANY; MERRIFIELD. Solid-Phase PeptideSynthesis, 3-284 [0063]
\bulletPeptides: Analysis, Synthesis, Biology, vol. 2 [0063]
\bulletMERRIFIELD et al. Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. J. Am. Chem. Soc, 1963, vol. 85, 2149-2156 [0063] [0072]
\bulletSTEWART et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chem. Co, 1984 [0063]
\bulletKOHLER; MiLSTEIN. Eur. J. Immunol, 1976, vol. 6, 511-519 [0065]
\bulletHUSE et al. Science, 1989, vol. 246, 1275-1281 [0065]
\bulletMCCAFFERTY et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0066] [0067] [0067]
\bulletHOOGENBOOM et al. Nucleic Acids Res, 1991, vol. 19, 4133-4137 [0066]
\bulletMARKS et al. J. Mol. Biol, 1991, vol. 222, 581-597 [0067] [0068] [0068] [0068]
\bulletMARKS et al. Bio/Technology, 1993, vol. 10, 779-783 [0068]
\bulletGRIFFITHS et al. EMBO J, 1993, vol. 12, 725-734 [0068] [0068]
\bulletCLACKSON et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0068]
\bullet R. SCOPES. Protein Purification. Springer-Verlag, 1982 [0070]
\bullet Methods in Enzymology. DEUTSCHER. Guide to Protein Purification. Academic Press, 1990, vol. 182 [0070]
\bulletBARANY; MERRIFIELD. Solid-Phase Peptide Synthesis;, 3.284 [0072]
\bulletThe Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, vol, 2 [0072]
\bulletSTEWART et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chem. Co, 1984 [0072]
\bulletNARANG et al. Meth. Enzymol., 1979, vol. 68, 90-99 [0074]
\bulletBROWN et al. Meth. Enzymol., 1979, vol. 68, 109-151 [0074]
\bulletBEAUCAGE et al. Tetra. Left, 1981, vol. 22, 1859-1862 [0074]
\bulletICHIKAWA et al. Anal. Biochem, 1992, vol. 202, 215-238 [0078]
\bulletITO et al. Pure Appl. Chem., 1993, vol. 65,753 [0078]
\bulletZHANG et al. J. Am. Chem. Soc, 1999, vol. 121 (4), 734-753 [0079]
\bulletICHIRO CHIBATA. Immobilized Enzymes. Halsted Press, 1978 [0081]
\bulletCUATRECASAS. J. Biol. Chem, 1970, vol. 245, 3059 [0081]
\bulletFODOR et al. Science, 1991, vol. 251, 767-77 [0083]
\bulletLERNER et al. Proc. Nat. Acad Sci. USA, 1981, vol. 78, 3403-3407 [0084]
\bulletKITAGAWA et al. J. Biochem, 1976, vol. 79, 233-236 [0084]
\bulletBIRCH; LENNOX. Monoclonal Antibodies: Principies and Applications. Wiley-Liss, 1995 [0084]
\bulletSIGRIST et al. Bio/technology, 1992, vol. 10,1026-1028 [0086]
\bulletSNYDER; ADLER. Anal. Chem, 1976, vol. 48, 1022-1027 [0091]
\bulletFREEMANTLE. Science/Technology, 1999, vol. 77, 27-36 [0099]
\bulletGILLES et al. Nature Biotechnology, 1999, vol. 17, 365-370 [0099] [0125]
\bulletFILLIPINI et al. J. Biotechnol., 1991, vol. 18, 153 [0105]
\bulletGARN et al. Biotechnol. Bioeng., 1989, vol. 34, 423 [0105]
\bulletTSHULENA. Phys. Scr., 1988, vol. T23, 293 [0105]
\bulletEDMONDS. Trends Anal. Chem, 1985, vol. 4, 220 [0105]
\bulletSTINSHOFF et al. Anal. Chem, 1985, vol. 57, 114R [0105]
\bulletGUIBAULT. Anal. Chem Symp. Ser.., 1983, vol. 17, 637 [0105]
\bulletWIDMER. Trends Anal. Chem, 1983, vol. 2, 8 [0105]
\bulletWIDMER et al. Int. J. Environ. Anal. Chem, 1984, vol. 18, 1 [0106]
\bulletMULLER et al. J. High Resolut. Chromatogr., 1991, vol. 14, 174 [0106]
\bulletMANZ et al. Sensors & Actuators, 1990, vol. B1, 249 [0106]
\bullet Microcolumn Separations: Columns, Instrumentation and Ancillary Techniques J. Chromatogr. Library. 1985, vol. 30 [0106]
\bullet MicroColumn High Performance Liquid Chromatography. Elsevier, 1984 [0106]
\bullet Small Bore Liquid Chromatography Columns: Their Properties and Uses. Wiley, 1984 [0106]
\bulletJORGENSON et al. J. Chromatogr., 1983, vol. 255, 335 [0106]
\bulletKNOX et al. J. Chromatogr., 1979, vol 186, 405 [0106]
\bulletTSUDA et al. Anal. Chem, 1978, vol. 50, 632 [0106]
\bulletMANZ et al. J Chromatogr., 1992, vol. 593, 253 [0106]
\bulletOLEFIROWICZ et al. Anal. Chem, 1990, vol. 62, 1872 [0106]
\bullet Second Int'l Symp. High-Pert. Capillary Electrophoresis. J. Chromatogr., 516 [0106]
\bulletGHOWSI et al. Anal. Chem, 1990, vol. 62, 2714 [0106]
\bulletBRUCHEZ et al. Science, 1998, vol. 281, 2013-2016 [0116]
\bulletWARREN; NIE. Science, 1998, vol. 281, 2016-2018 [0116]
\bullet Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Hybridization With Nucleic Acid Probes. Elsevier, 1993, vol. 24 [0119]
\bulletSKEGGS. American Journal of Clinical Pathology, 1957, vol. 28, 311-322 [0131]
\bulletSNYDER; ADLER. Anal. Chem, 1976, vol. 48, 1018-22 [0131]
\bulletSNYDER; ADLER. Anal. Chem, 1976, vol. 48, 1023-27 [0131]
\bullet Methods in Cell Biology. ASAI. Antibodies in Cell Biology. Academic Press, Inc, 1993, vol. 37 [0139]
\bulletSTITES; TERR. Basic and Clinical Immunology. 1991 [0139]
\bullet Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. TIJSSEN. Hybridization With Nucleic Acid Probes. Elsevier, 1993, vol. 24 [0140]
\bulletCHU. Electrophoresis, 1992, vol. 13, 105-114 [0145]
\bulletPINKEL et al. Nature Genetics, 1998, vol. 20, 207-211 [0149]
\bulletKALLIONIEMI et al. Science, 1992, vol. 258, 818-821 [0153]

Claims (30)

  1. \global\parskip0.970000\baselineskip
    1. Un método para detectar la presencia de un primer analito diana en una muestra, comprendiendo dicho método:
    (a) Proporcionar:
    un sustrato;
    un canal en una superficie de dicho sustrato;
    un elemento de cobertura que se superpone y sella dicho canal, teniendo dicho elemento de cobertura una primera superficie de cara a la luz del canal; y
    una primera pareja de unión para dicho primer analito diana fijado a dicha primera superficie;
    (b) transportar dicha muestra a través de dicho canal a dicha primera pareja de unión de tal forma que el primer analito diana presente en dicha muestra se une a dicha primera pareja de unión;
    (c) transportar dicha muestra más allá de dicha primera pareja de unión; y
    (d) detectar la presencia de cualquier primer analito diana unido a dicha primera pareja de unión, donde dicho elemento de cobertura se desprende de dicho canal para permitir la detección de la presencia de cualquier primer analito diana unido a dicho primer elemento de unión.
    \vskip1.000000\baselineskip
  2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa (b) un primer bolo o burbuja de un fluido que es inmiscible con dicha muestra precede a dicha muestra durante el transporte y un segundo bolo o burbuja de un fluido que es inmiscible con dicha muestra sigue a dicha muestra durante el transporte.
  3. 3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho canal se moldea en un material polimérico.
  4. 4. El método de la reivindicación 3, en el que dicho material polimérico es un polidimetilsiloxano.
  5. 5. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que:
    (a) dicho canal tiene una superficie luminal hidrófoba; o
    (b) dicho canal tiene un diámetro transversal de aproximadamente 100 \mum o menor; o
    (c) dicho elemento de cobertura está unido de forma extraíble a dicho sustrato; o
    (d) dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura es hidrófila.
    \vskip1.000000\baselineskip
  6. 6. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente detectar la presencia de un segundo analito diana en una muestra, en el que
    una segunda pareja de unión para un segundo analito diana se fija a dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura en una localización diferente de la de dicha primera pareja de unión;
    dicha muestra se transporta adicionalmente a través de dicho canal hasta dicha segunda pareja de unión en condiciones en las que el segundo analito diana presente en dicha muestra se une a dicha segunda pareja de unión;
    dicha muestra se transporta más allá de dichas primera y segunda parejas de unión; y
    se detecta la presencia de cualquier segundo analito diana unido a dicha segunda pareja de unión.
    \vskip1.000000\baselineskip
  7. 7. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente detectar la presencia de un segundo analito diana en una muestra, en el que:
    dicho canal tiene fijado en el mismo una segunda pareja de unión para dicho segundo analito diana, donde dicha segunda pareja de unión se fija en una localización distinta de la de dicha primera pareja de unión;
    dicha muestra se transporta adicionalmente a través de dicho canal a dicha segunda pareja de unión en condiciones en las que el segundo analito diana presente en dicha muestra se une a dicha segunda pareja de unión y en el que dicho primer bolo o burbuja precede a dicha muestra durante el transporte a dicha segunda pareja de unión y dicho segundo bolo o burbuja sigue a dicha muestra durante el transporte a dicha segunda pareja de unión;
    dicha muestra se transporta más allá de dichas primera y segunda parejas de unión; y
    \global\parskip1.000000\baselineskip
    se detecta la presencia de cualquier segundo analito diana unido a dicha segunda pareja de unión.
  8. 8. El método de la reivindicación 7, en el que dicha segunda pareja de unión se fija a dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura o se fija a la superficie del canal.
  9. 9. El método de la reivindicación 2, en el que dichos fluidos inmiscibles son burbujas de gas.
  10. 10. El método de la reivindicación 9, en el que se forma una película de fluido que contiene dicho primer analito diana entre una burbuja de gas y una superficie luminal de dicho canal, teniendo dicha película aproximadamente 1 \mum o menos de espesor.
  11. 11. El método de la reivindicación 2, en el que dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura es hidrófila y en el que dichos fluidos inmiscibles son burbujas de gas y se forma una película de fluido que contiene dicho primer analito diana entre una burbuja de gas y dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura, teniendo dicha película aproximadamente 1 \mum o menos de grosor.
  12. 12. El método de la reivindicación 2, en el que:
    (a) dicha muestra se divide en al menos dos segmentos, separándose dichos segmentos por un bolo o una burbuja de un fluido que es inmiscible con dicha muestra; o
    (b) una solución tampón sigue a dicho segundo bolo o burbuja de fluido de inmiscible.
    \vskip1.000000\baselineskip
  13. 13. El método de la reivindicación 12(b), en el que dicha solución tampón se divide en al menos dos segmentos, separándose dichos segmentos por un bolo o una burbuja de un fluido que es inmiscible con dicha solución
    tampón.
  14. 14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que al menos 100 parejas de unión diferentes se fijan en localizaciones distintas a la superficie de canal o a dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura.
  15. 15. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que
    (a) dicha muestra se transporta a través de dicho canal a una velocidad de al menos aproximadamente 1 mm/se-
    gundo; o
    (b) se transporta fluido en respuesta a una diferencia de presión; o
    (c) dicho fluido se transporta por fuerza electroforética.
    (d) dicha pareja de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una proteína de unión y un ácido nucleico; o
    (e) dicho primer analito diana está marcado.
    \vskip1.000000\baselineskip
  16. 16. El método de la reivindicación 15(e) en el que el marcador es un marcador que absorbe luz.
  17. 17. El método de la reivindicación 2, en el que:
    analitos diana obtenidos de al menos dos fuentes diferentes están presentes en dicha muestra o se transportan a través de dicho canal en una pluralidad de muestras separadas, en el que los analitos diana de cada fuente están marcados con un marcador diferente;
    dicho canal tiene fijada en el mismo una pluralidad de diferentes parejas de unión en localizaciones distintas;
    dicha detección comprende detectar las señales de analitos diana marcados unidos a cada pareja de unión diferente en dicho canal; y
    dicho método comprende adicionalmente comparar las intensidades de cualquier señal producida por cada marcador diferente en cada localización de pareja de unión diferente.
    \vskip1.000000\baselineskip
  18. 18. El método de la reivindicación 17, en el que dicha pluralidad de parejas de unión se fijan a dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura o se fijan a la superficie de canal.
    \global\parskip0.950000\baselineskip
  19. 19. El método de la reivindicación 1, en el que:
    analitos diana obtenidos de al menos dos fuentes diferentes están presentes en dicha muestra o se transportan a través de dicho canal en una pluralidad de muestras separadas, en el que los analitos diana de cada fuente están marcados con un marcador diferente;
    una pluralidad de diferentes parejas de unión se fijan en localizaciones distintas de dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura;
    dicha detección comprende detectar las señales de analitos diana marcados unidos a cada pareja de unión diferente; y
    dicho método comprende adicionalmente comparar las intensidades de cualquier señal producida por cada marcador diferente en cada pareja de unión diferente.
    \vskip1.000000\baselineskip
  20. 20. Un dispositivo para detectar la presencia de un primer analito diana en una muestra, comprendiendo dicho dispositivo:
    un sustrato;
    un canal en una superficie de dicho sustrato;
    un elemento de cobertura que se superpone y sella dicho canal, teniendo dicho elemento de cobertura una primera superficie de cara a la luz del canal; y
    una primera pareja de unión para dicho primer analito diana fijado a dicha primera superficie, en el que dicho elemento de cobertura está unido de forma extraíble a dicho sustrato.
    \vskip1.000000\baselineskip
  21. 21. El dispositivo de la reivindicación 20, en el que dicho canal se moldea en un material polimérico.
  22. 22. El dispositivo de la reivindicación 21, en el que dicho material polimérico es un polidimetilsiloxano.
  23. 23. El dispositivo de la reivindicación 20, en el que:
    (a) dicho canal tiene una superficie luminal hidrófoba; o
    (b) dicho canal tiene un diámetro de corte transversal inferior a aproximadamente 100 \mum o menos; o
    (c) dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura es hidrófila; o
    (d) una segunda pareja de unión para un segundo analito diana se fija a dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura en una localización distinta de la de dicha primera pareja de unión; o
    (e) dicha pareja de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una proteína de unión y un ácido nucleico; o
    (f) dicho canal define un tramo en serpentina.
    \vskip1.000000\baselineskip
  24. 24. El dispositivo de la reivindicación 23(d), en el que al menos aproximadamente 100 parejas de unión diferentes se fijan en localizaciones diferentes de dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura.
  25. 25. El dispositivo de la reivindicación 23(d), en el que una pluralidad de parejas de unión de diferentes se fijan en localizaciones diferentes de dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura, formando una matriz bidimensional de parejas de unión diferentes.
  26. 26. El dispositivo de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente un electrodo por el que se puede aplicar un voltaje al electrodo para inducir el transporte de dicho primer analito diana hacia o alejándose de dicha primera pareja de unión.
  27. 27. El dispositivo de las reivindicación 26, en el que dicho electrodo se une a dicha primera superficie de dicho elemento de cobertura, una capa de impregnación se superpone a dicho electrodo y dicha primera pareja de unión se une a dicha capa de infiltración.
  28. 28. El dispositivo de la reivindicación 26, que comprende adicionalmente una pluralidad de electrodos unidos a dicho elemento de cobertura por los que se puede aplicar un voltaje a cada electrodo para inducir el transporte de un analito diana hacia o alejándose de una pareja de unión.
    \global\parskip1.000000\baselineskip
  29. 29. El dispositivo de la reivindicación 28, en el que cada electrodo está por debajo de más de una localización de pareja de unión diferente.
  30. 30. El dispositivo de la reivindicación 29, en el que cada electrodo está por debajo de una fila de diferentes localizaciones de pareja de unión en dicha matriz bidimensional y en el que cada fila tiene un eje longitudinal que es generalmente perpendicular a la dirección de flujo de fluido a través de dicho canal, por lo que la aplicación sucesiva de una tensión a electrodos adyacentes es capaz de inducir el flujo electroforético a través de dicho canal.
ES01965979T 2000-08-31 2001-08-17 Ensayo de capilaridad y procedimientos relacionados. Expired - Lifetime ES2315302T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US652873 2000-08-31
US09/652,873 US6610499B1 (en) 2000-08-31 2000-08-31 Capillary array and related methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2315302T3 true ES2315302T3 (es) 2009-04-01

Family

ID=24618546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01965979T Expired - Lifetime ES2315302T3 (es) 2000-08-31 2001-08-17 Ensayo de capilaridad y procedimientos relacionados.

Country Status (6)

Country Link
US (5) US6610499B1 (es)
EP (1) EP1313552B1 (es)
AU (1) AU2001286525A1 (es)
DE (1) DE60136194D1 (es)
ES (1) ES2315302T3 (es)
WO (1) WO2002018949A2 (es)

Families Citing this family (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610499B1 (en) * 2000-08-31 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Capillary array and related methods
US6913697B2 (en) 2001-02-14 2005-07-05 Science & Technology Corporation @ Unm Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes
JP4148778B2 (ja) 2001-03-09 2008-09-10 バイオミクロ システムズ インコーポレイティッド アレイとのミクロ流体的インターフェース機器
US20030129626A1 (en) * 2001-09-24 2003-07-10 Nielsen Kirsten Vang Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
US20050139470A1 (en) * 2002-02-19 2005-06-30 Sze Siu K. Device for isoelectric focussing
AU2003218132A1 (en) * 2002-03-12 2003-09-29 Syngenta Participations Ag Microcapillary hybridization chamber
US7901939B2 (en) 2002-05-09 2011-03-08 University Of Chicago Method for performing crystallization and reactions in pressure-driven fluid plugs
JP2005529335A (ja) * 2002-06-10 2005-09-29 フィネクサス， インク． 開放チャンネルを使って生体分子を固体相として抽出するシステムと方法
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
US6962822B2 (en) * 2002-08-07 2005-11-08 International Business Machines Corporation Discrete nano-textured structures in biomolecular arrays, and method of use
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
AU2004229440B2 (en) * 2003-04-10 2010-08-12 President And Fellows Of Harvard College Formation and control of fluidic species
US7247487B2 (en) 2003-06-18 2007-07-24 Ortho-Clinical Diagnostics Reducing working fluid dilution in liquid systems
KR100573621B1 (ko) * 2003-07-18 2006-04-25 주식회사 디지탈바이오테크놀러지 세포 개체수 계수용 장치 및 그 제조방법
WO2005021151A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 President And Fellows Of Harvard College Electronic control of fluidic species
WO2005066613A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-21 President And Fellows Of Harvard College Assay device and method
EP2523004B1 (en) 2004-01-26 2020-05-20 President and Fellows of Harvard College Method of determining a sample component and immunoassay
US8030057B2 (en) * 2004-01-26 2011-10-04 President And Fellows Of Harvard College Fluid delivery system and method
GB2422664A (en) * 2005-01-28 2006-08-02 Ethicon Inc Device for detecting an enzyme in a sample
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7077175B2 (en) * 2004-04-09 2006-07-18 Hongfeng Yin Particle packing of microdevice
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
US7834530B2 (en) * 2004-05-27 2010-11-16 California Institute Of Technology Carbon nanotube high-current-density field emitters
US9477233B2 (en) * 2004-07-02 2016-10-25 The University Of Chicago Microfluidic system with a plurality of sequential T-junctions for performing reactions in microdroplets
US7655470B2 (en) 2004-10-29 2010-02-02 University Of Chicago Method for manipulating a plurality of plugs and performing reactions therein in microfluidic systems
JP2006029798A (ja) * 2004-07-12 2006-02-02 Hitachi Software Eng Co Ltd 試薬を内蔵した高反応効率生体物質検査チップ
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US20060166223A1 (en) * 2005-01-26 2006-07-27 Reed Michael W DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces
WO2006096571A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for forming multiple emulsions
US20070054119A1 (en) * 2005-03-04 2007-03-08 Piotr Garstecki Systems and methods of forming particles
WO2006105110A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Inverness Medical Switzerland Gmbh Assay device and methods
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US8501416B2 (en) 2005-04-19 2013-08-06 President And Fellows Of Harvard College Fluidic structures including meandering and wide channels
US20060280029A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-14 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic mixer
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
WO2007024798A2 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Applera Corporation Apparatus, system, and method using immiscible-fluid-discrete-volumes
JP3116709U (ja) * 2005-09-13 2005-12-15 有限会社メタボスクリーン 微小流路チップ
TW200734641A (en) * 2005-12-26 2007-09-16 Inst Of Microchemical Technology Microchip for immunoassay, kit for immunoassay and immunoassay method
US8747669B1 (en) 2005-12-29 2014-06-10 Spf Innovations, Llc Method and apparatus for the filtration of biological samples
US7384549B2 (en) * 2005-12-29 2008-06-10 Spf Innovations, Llc Method and apparatus for the filtration of biological solutions
WO2007081385A2 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
DE602007009811D1 (de) * 2006-01-27 2010-11-25 Harvard College Koaleszenz fluider tröpfchen
US20080050735A1 (en) * 2006-02-01 2008-02-28 Elena Pushnova Nucleic acid testing method for point-of-care diagnostics and genetic self-monitoring
JP4664846B2 (ja) * 2006-03-29 2011-04-06 株式会社東芝 核酸検出用デバイス
JP4167697B2 (ja) * 2006-04-13 2008-10-15 株式会社東芝 核酸検出用デバイス
JP4685691B2 (ja) * 2006-04-13 2011-05-18 株式会社日立ソリューションズ 検査チップ及び検査チップシステム
EP2530167A1 (en) * 2006-05-11 2012-12-05 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
DE102006027675B4 (de) * 2006-06-14 2011-05-12 Siemens Ag Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US8053191B2 (en) 2006-08-31 2011-11-08 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
EP2136786B8 (en) * 2007-03-28 2012-11-14 President and Fellows of Harvard College Apparatus for forming droplets
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
JP5305361B2 (ja) 2007-05-04 2013-10-02 オプコ・ダイアグノスティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 流体コネクタおよびマイクロ流体システム
US7850861B1 (en) 2007-06-18 2010-12-14 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Microfluidic device, and related methods
EP2209555B1 (en) * 2007-06-28 2016-03-16 Life Technologies Corporation Detecting and mixing in a conduit in integrated bioanalysis systems
US9795697B2 (en) * 2007-09-19 2017-10-24 Opko Diagnostics, Llc Liquid containment for integrated assays
US8075854B2 (en) * 2007-11-08 2011-12-13 The Ohio State University Research Foundation Bioprocessing Innovative Company Microfluidic chips for rapid multiplex ELISA
CN102027367B (zh) 2008-02-29 2016-03-23 西北大学 促进生物反应的屏障
US8222049B2 (en) * 2008-04-25 2012-07-17 Opko Diagnostics, Llc Flow control in microfluidic systems
WO2009151515A1 (en) 2008-05-06 2009-12-17 Qd Vision, Inc. Solid state lighting devices including quantum confined semiconductor nanoparticles
WO2009137053A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Qd Vision, Inc. Optical components, systems including an optical component, and devices
US9207385B2 (en) 2008-05-06 2015-12-08 Qd Vision, Inc. Lighting systems and devices including same
US20090318303A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-24 International Business Machines Corporation Microfluidic selection of library elements
US9879360B2 (en) * 2008-06-20 2018-01-30 International Business Machines Corporation Microfluidic selection of library elements
EP2328681B1 (en) * 2008-07-15 2014-11-26 L3 Technology Limited Assay test card
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
CA3069082C (en) 2008-09-20 2022-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
US9186128B2 (en) 2008-10-01 2015-11-17 Covidien Lp Needle biopsy device
US9782565B2 (en) 2008-10-01 2017-10-10 Covidien Lp Endoscopic ultrasound-guided biliary access system
US8968210B2 (en) 2008-10-01 2015-03-03 Covidien LLP Device for needle biopsy with integrated needle protection
US9332973B2 (en) 2008-10-01 2016-05-10 Covidien Lp Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection
US11298113B2 (en) 2008-10-01 2022-04-12 Covidien Lp Device for needle biopsy with integrated needle protection
EP2340435A1 (en) * 2008-10-08 2011-07-06 Université de Strasbourg Microfluidic devices for reliable on-chip incubation of droplets in delay lines
EP3572796B8 (en) 2008-10-27 2023-01-18 Genalyte, Inc. Biosensors based on optical probing and sensing
WO2010080115A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Claros Diagnostics, Inc. Improved reagent storage in microfluidic systems and related articles and methods
DK2391451T3 (en) 2009-02-02 2018-10-15 Opko Diagnostics Llc STRUCTURES FOR MANAGING LIGHT INTERACTION WITH MICROFLUIDIC DEVICES
EP2404160A4 (en) * 2009-03-07 2012-08-22 Hewlett Packard Development Co ANALYSIS DEVICE AND DETECTION METHOD USING THE DEVICE
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
WO2011028764A2 (en) 2009-09-02 2011-03-10 President And Fellows Of Harvard College Multiple emulsions created using jetting and other techniques
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
EA024999B1 (ru) 2009-11-24 2016-11-30 Опкоу Дайагностикс, Ллк. Смешивание и доставка текучих сред в микрофлюидных системах
WO2011066185A1 (en) * 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
US20120258552A1 (en) * 2009-11-30 2012-10-11 Sekisui Medical Co., Ltd. Homogeneous measurement method and measuring reagent
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
WO2011085075A2 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
EP2556380B1 (en) 2010-01-11 2020-08-12 Waters Technologies Corporation Apparatus for controlling sample position in a liquid chromatography system
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP4484577A3 (en) 2010-02-12 2025-03-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
JP2011221009A (ja) * 2010-03-25 2011-11-04 Fujifilm Corp 生体物質検出装置
US20110244581A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-06 Abbott Point Of Care, Inc. Biologic fluid analysis system with sample motion
CA3016967C (en) 2010-04-16 2021-08-31 Opko Diagnostics, Llc Systems and devices for analysis of samples
US20110262989A1 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
USD645971S1 (en) 2010-05-11 2011-09-27 Claros Diagnostics, Inc. Sample cassette
US20120113671A1 (en) * 2010-08-11 2012-05-10 Sridhar Sadasivan Quantum dot based lighting
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
CN103502448B (zh) 2010-11-12 2017-03-29 Gen9股份有限公司 核酸合成的方法和设备
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
EP3412778A1 (en) 2011-02-11 2018-12-12 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
EP2502674A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-26 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method for performing molecular reactions by using immiscible intermediate fluids
BR112013029729A2 (pt) 2011-05-23 2017-01-24 Basf Se controle de emulsões, incluindo emulsões múltiplas
EP3216872B1 (en) 2011-06-02 2020-04-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
CN103764265A (zh) 2011-07-06 2014-04-30 哈佛学院院长等 多重乳剂和用于配制多重乳剂的技术
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US20130078740A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 University Of Rochester Preparation of microfluidic device on metal nanoparticle coated surface, and use thereof for nucleic acid detection
US9864121B2 (en) 2011-11-22 2018-01-09 Samsung Electronics Co., Ltd. Stress-resistant component for use with quantum dots
US20130157378A1 (en) * 2011-12-15 2013-06-20 James Lawrence Burg Attenuating dye for interrogating multiple surfaces, and method thereof
MY193914A (en) 2012-03-05 2022-11-01 Oy Arctic Partners Ab Methods and apparatuses for predicting risk of prostate cancer and prostate gland volume
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
CA2871505C (en) 2012-04-24 2021-10-12 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
CA2872177A1 (en) 2012-05-08 2013-11-14 Quidel Corporation Device for isolating an analyte from a sample, and methods of use
IL236303B (en) 2012-06-25 2022-07-01 Gen9 Inc Methods for high-throughput nucleic acid assembly and sequencing
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
AU2013302756C1 (en) 2012-08-14 2018-05-17 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014031523A2 (en) * 2012-08-19 2014-02-27 University Of Rochester Method for preparing microfluidic device with reduced channel height
US10501735B2 (en) 2012-08-23 2019-12-10 Quidel Corporation Device with controlled fluid dynamics, for isolation of an analyte from a sample
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014116813A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Douglas Scientific Silica-based biological material isolation
KR20200140929A (ko) 2013-02-08 2020-12-16 10엑스 제노믹스, 인크. 폴리뉴클레오티드 바코드 생성
EP2969156B1 (en) 2013-03-13 2019-04-10 Opko Diagnostics, LLC Mixing of fluids in fluidic systems
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
WO2015103367A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Raindance Technologies, Inc. System and method for detection of rna species
WO2015138343A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Click Diagnostics, Inc. Cartridge-based thermocycler
BR112016023625A2 (pt) 2014-04-10 2018-06-26 10X Genomics, Inc. dispositivos fluídicos, sistemas e métodos para encapsular e particionar reagentes, e aplicações dos mesmos
WO2015200893A2 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
CA2953469A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
US12312640B2 (en) 2014-06-26 2025-05-27 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
BR112017008877A2 (pt) 2014-10-29 2018-07-03 10X Genomics Inc métodos e composições para sequenciamento de ácido nucleico-alvo
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
KR102587637B1 (ko) 2014-12-12 2023-10-10 옵코 다이어그노스틱스, 엘엘씨 성형에 의해 제조되는 유체 시스템을 비롯한, 항온 처리 채널을 포함하는 유체 시스템
ES2898103T3 (es) 2014-12-31 2022-03-03 Visby Medical Inc Dispositivos para pruebas de diagnóstico molecular
JP6769969B2 (ja) 2015-01-12 2020-10-14 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 核酸配列決定ライブラリーを作製するためのプロセス及びシステム、並びにこれらを使用して作製したライブラリー
MX2017010857A (es) 2015-02-24 2017-12-11 10X Genomics Inc Metodos para la cobertura de secuencia de acidos nucleicos seleccionados como diana.
EP3262407B1 (en) 2015-02-24 2023-08-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
USD804682S1 (en) 2015-08-10 2017-12-05 Opko Diagnostics, Llc Multi-layered sample cassette
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
JP6954899B2 (ja) 2015-12-04 2021-10-27 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 核酸の解析のための方法及び組成物
US10852310B2 (en) 2015-12-11 2020-12-01 Opko Diagnostics, Llc Fluidic systems involving incubation of samples and/or reagents
US10987674B2 (en) 2016-04-22 2021-04-27 Visby Medical, Inc. Printed circuit board heater for an amplification module
WO2017197040A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Click Diagnostics, Inc. Devices and methods for nucleic acid extraction
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
WO2018005710A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Click Diagnostics, Inc. Devices and methods for the detection of molecules using a flow cell
USD800331S1 (en) 2016-06-29 2017-10-17 Click Diagnostics, Inc. Molecular diagnostic device
USD800914S1 (en) 2016-06-30 2017-10-24 Click Diagnostics, Inc. Status indicator for molecular diagnostic device
USD800913S1 (en) 2016-06-30 2017-10-24 Click Diagnostics, Inc. Detection window for molecular diagnostic device
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US12264411B2 (en) 2017-01-30 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis
WO2018147862A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Determine viscosity of fluids using a capillary channel
GB2562762B (en) * 2017-05-24 2022-07-13 Univ Heriot Watt Microfluidic mixing
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3445876B1 (en) 2017-05-26 2023-07-05 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
KR20200079264A (ko) 2017-11-09 2020-07-02 비스비 메디컬, 인코포레이티드 표적 바이러스 검출을 위한 휴대용 분자 진단 디바이스 및 방법
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN112262218B (zh) 2018-04-06 2024-11-08 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
AU2019337088A1 (en) 2018-09-03 2021-05-06 Visby Medical, Inc. Devices and methods for antibiotic susceptibility testing
US11352675B2 (en) 2020-01-03 2022-06-07 Visby Medical, Inc. Devices and methods for antibiotic susceptability testing
WO2022086492A1 (en) * 2020-10-19 2022-04-28 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Devices for oscillating a fluid sample
CN112730868B (zh) * 2020-12-26 2023-11-07 安徽皖仪科技股份有限公司 一种用于连续流动分析仪的进样系统
USD1064314S1 (en) 2021-08-13 2025-02-25 Visby Medical, Inc. Molecular diagnostic device
JP2025535098A (ja) * 2022-10-10 2025-10-22 ルミラディーエックス ユーケー リミテッド セグメント化された流体混合
DE102023208697A1 (de) * 2023-09-08 2025-03-13 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Oberflächenfunktionalisiertes Substrat und Verfahren zu seiner Herstellung

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3804593A (en) * 1964-05-25 1974-04-16 Technicon Instr Automatic analysis apparatus and method
US3479141A (en) 1967-05-17 1969-11-18 Technicon Corp Method and apparatus for analysis
BE756423A (fr) * 1969-09-22 1971-03-22 Technicon Instr Procede et appareil pour la determination automatique d'echantillons, en particulier d'echantillons sanguins
DD143379A3 (de) * 1978-07-25 1980-08-20 Kallies Karl Heinz Indikatorroehrchen zur glukosebestimmung
US4253846A (en) 1979-11-21 1981-03-03 Technicon Instruments Corporation Method and apparatus for automated analysis of fluid samples
US4853336A (en) 1982-11-15 1989-08-01 Technicon Instruments Corporation Single channel continuous flow system
US4753775A (en) * 1985-04-12 1988-06-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Rapid assay processor
US4685463A (en) * 1986-04-03 1987-08-11 Williams R Bruce Device for continuous in vivo measurement of blood glucose concentrations
US4853366A (en) * 1988-03-16 1989-08-01 Eastman Kodak Company Pyrazolidinedione arylidene dye-donor element for thermal dye transfer
US5622868A (en) * 1989-04-27 1997-04-22 Microbiological Research Authority Camr (Centre For Applied Microbiology & Research) Analytical apparatus utilizing a colorimetric or other optically detectable effect
US5776672A (en) * 1990-09-28 1998-07-07 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US5268147A (en) * 1992-02-26 1993-12-07 Miles, Inc. Reversible direction capsule chemistry sample liquid analysis system and method
US5399497A (en) * 1992-02-26 1995-03-21 Miles, Inc. Capsule chemistry sample liquid analysis system and method
US5637469A (en) * 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems
US6156270A (en) 1992-05-21 2000-12-05 Biosite Diagnostics, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes
US5494562A (en) * 1994-06-27 1996-02-27 Ciba Corning Diagnostics Corp. Electrochemical sensors
US5707799A (en) 1994-09-30 1998-01-13 Abbott Laboratories Devices and methods utilizing arrays of structures for analyte capture
US5656502A (en) * 1995-06-07 1997-08-12 Diagnostic Chemicals Limited Test strip holder and method of use
US6130098A (en) * 1995-09-15 2000-10-10 The Regents Of The University Of Michigan Moving microdroplets
US5942443A (en) * 1996-06-28 1999-08-24 Caliper Technologies Corporation High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US5804384A (en) 1996-12-06 1998-09-08 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting multiple analytes in samples
NZ516848A (en) * 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
JP3938982B2 (ja) 1997-08-29 2007-06-27 オリンパス株式会社 Ｄｎａキャピラリィ
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
WO1999042809A1 (en) 1998-02-20 1999-08-26 Sanguinex Cell analysis methods and apparatus
US6210910B1 (en) 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
US6175752B1 (en) * 1998-04-30 2001-01-16 Therasense, Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US6348354B1 (en) * 1998-07-06 2002-02-19 Bayer Corporation Method and apparatus for controlling a stream of liquid test packages in a capsule chemistry analysis system
US6473171B1 (en) * 1999-01-15 2002-10-29 Coors Brewing Company Biocompatible apparatus for ultrasensitive and rapid detection of contaminants in liquids
FR2790092B1 (fr) * 1999-02-24 2001-03-30 Commissariat Energie Atomique Procede de determination d'un analyte present dans une solution
US7351376B1 (en) * 2000-06-05 2008-04-01 California Institute Of Technology Integrated active flux microfluidic devices and methods
US6610499B1 (en) 2000-08-31 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Capillary array and related methods

Also Published As

Publication number Publication date
US7741104B2 (en) 2010-06-22
US6989237B2 (en) 2006-01-24
US6818184B2 (en) 2004-11-16
US8003376B2 (en) 2011-08-23
US20060160162A1 (en) 2006-07-20
WO2002018949A2 (en) 2002-03-07
AU2001286525A1 (en) 2002-03-13
US20050048561A1 (en) 2005-03-03
US20030207308A1 (en) 2003-11-06
DE60136194D1 (de) 2008-11-27
WO2002018949A3 (en) 2003-01-16
EP1313552A2 (en) 2003-05-28
EP1313552B1 (en) 2008-10-15
US20100279899A1 (en) 2010-11-04
US6610499B1 (en) 2003-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2315302T3 (es) Ensayo de capilaridad y procedimientos relacionados.
AU780575B2 (en) Spatially-encoded analyte detection
US6660480B2 (en) Method for analyzing nucleic acids by means of a substrate having a microchannel structure containing immobilized nucleic acid probes
ES2288760T3 (es) Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies.
US8841116B2 (en) Inline-injection microdevice and microfabricated integrated DNA analysis system using same
AU770678B2 (en) Focusing of microparticles in microfluidic systems
US6772070B2 (en) Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer
CN1942590B (zh) 多元化学和生化反应的流体装置和方法
ES2234107T3 (es) Procedimientos y sistemas para el transporte mejorado de fluidos.
KR100351531B1 (ko) 기하형상이 개선된 채널을 채용하는 미소 유체 장치
CN100386627C (zh) 过滤型蛋白芯片
US20030152927A1 (en) Closed substrate platforms suitable for analysis of biomolecules
US20050221333A1 (en) Microfluidic apparatus, systems, and methods for performing molecular reactions
CA2353461A1 (en) Integrated portable biological detection system
JP2002525600A (ja) 細胞ベースのスクリーニングのための小型化細胞アレイ方法および装置
EP1710562A2 (en) Microfluidic system and method of utilization
US20250360502A1 (en) Microfluidic device for analyzing steady state biological reactions
Olsen Microfluidic Selection of Aptamers towards Applications in Precision Medicine
Selchow Chromatin Immunoprecipitation in Fused Silica Capillaries-A Miniaturization Approach to Mapping Protein-DNA Interaction in Cells