ES2315896T3 - Polipeptido. - Google Patents
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Abstract
Armazón proteico de unión a ácidos grasos, denominado FASTbody, que puede unirse específicamente a uno o más ligandos, derivándose dicho armazón de una proteína de unión a ácidos grasos intracelular eucariota y comprendiendo dicho armazón un polipéptido de cadena sencilla con las propiedades estructurales siguientes: (a) el armazón contiene 10 hebras beta, denominadas ABCDEFGHI y J, conectadas mediante regiones de bucle que determinan la especificidad de unión a ligando, en el que las hebras beta forman juntas una estructura de almeja beta; y en el que (b) las regiones de bucle que conectan beta-A y beta-B; beta-C y beta-D; beta-E y beta-F; beta-G y beta-H; beta-I y beta-J se ubican en el mismo sitio de la estructura de almeja beta; en el que el armazón de unión a ácidos grasos no contiene ninguna cisteína que forme puentes disulfuro; en el que el armazón no comprende un motivo de hélice-bucle-hélice.
Description
Polipéptido.
La presente invención se refiere a una cadena
polipeptídica nueva que forma un pliegue tridimensional particular
caracterizado por un sándwich \beta. Alterando la secuencia de
aminoácidos en regiones específicas del polipéptido de la
invención, se desarrollan características de unión nuevas. También
se describen métodos para la generación de un polipéptido según la
invención y utilizaciones de los polipéptidos de la invención.
El reconocimiento macromolecular tiene lugar
cuando dos o más superficies pueden establecer suficientes puntos
de contacto, permitiendo que se produzca una unión específica.
Aunque el reconocimiento macromolecular es un fenómeno observado
generalmente en todos los sistemas vivos, el mejor caracterizado ha
sido el sistema inmunitario. Siendo un ejemplo el sistema
inmunitario humano, que consiste en un gran número de moléculas de
anticuerpo estructuralmente similares, que presentan cada una
diferencias de secuencia minoritarias en las regiones variables de
la estructura del anticuerpo. Estas pequeñas diferencias dan como
resultado la generación de una plétora de especificidades de
unión.
Los anticuerpos que se producen de manera
natural son proteínas de múltiples dominios compuestas por cadenas
pesadas y ligeras. La estructura global del anticuerpo puede
dividirse en dominios funcionales diferentes según su función
biológica. Ciertas partes de la molécula de anticuerpo interacciona
con moléculas receptoras en las células eucariotas, dando lugar así
a una respuesta biológica, denominándose estas partes a menudo
dominios constantes. Otras partes de la molécula de anticuerpo
contienen un gran grado de variación de secuencia entre diferentes
moléculas de anticuerpo, proporcionando así diferentes moléculas de
anticuerpo con capacidad de unirse a una gama diversa de diferentes
moléculas. Esta variación de secuencia observada en las partes
variables de la molécula de anticuerpo permite que se cree un número
inmenso de superficies estructurales diferentes. Cuando la región
variable de un anticuerpo dado puede realizar interacciones
suficientes con un antígeno, se produce una unión específica. La
variación de secuencia de anticuerpos diferentes está confinada en
seis regiones de bucle, tres en la cadena pesada y tres en la cadena
ligera.
Estas regiones de bucle están dispuestas sobre
una denominada estructura de sándwich \beta, en la que los bucles
individuales conectan hebras \beta (Amit AG. 1986).
Se ha demostrado anteriormente que fragmentos
más pequeños de la estructura del anticuerpo conservan sus
propiedades de reconocimiento del antígeno. Al mismo tiempo, tal
fragmento más pequeño puede proporcionar mejores reactivos en
cierta aplicación terapéutica. De la manera más notable, se ha
demostrado la generación de fragmentos de las partes variables,
dando lugar a o bien fragmentos scFv en los que las partes variables
de la cadena pesada y ligera están unidas mediante un ligador
peptídico o una modificación por ingeniería genética artificial de
un puente disulfuro para unir covalentemente la cadena pesada y
ligera.
La tecnología de ADN recombinante ha
proporcionado herramientas que permiten la generación in
vitro de repertorios de moléculas de anticuerpo. Cuando se
introducen los genes que codifican para tales anticuerpos en
sistemas que permiten un ligamiento del genotipo con el fenotipo, es
viable la selección de anticuerpos específicos basándose en sus
características de unión (Marks JD et al. 1991). Lo más
frecuentemente un sistema de este tipo ha sido el sistema de
exposición en fago (Smith GP. 1985).
Se ha demostrado que la generación y selección
de fragmentos de anticuerpo es una técnica poderosa para identificar
moléculas de unión nuevas. Sin embargo, tales fragmentos de
anticuerpo están compuestos por dos cadenas (pesada y ligera) que
tienen que plegarse juntas con el fin de obtener una representación
funcional de los segmentos de bucle para la unión a antígeno. A
menudo, el plegado funcional de estas dos cadenas y su apareamiento
funcional está alterado, proporcionando así un fragmento de
anticuerpo inestable. Además, tienen que formarse varios puentes
disulfuro intracatenarios para garantizar el plegado funcional de
tales fragmentos de anticuerpo, limitando así las aplicaciones en
las que la expresión intracelular es una cuestión. Los fragmentos de
anticuerpo globales presentan una serie de inconvenientes
graves.
Se han descrito varios armazones nuevos, todos
los cuales presentan la característica común de que pueden
adaptarse secuencias al azar, siendo los ejemplos el desarrollo del
dominio Z (Nord K. et al. 1997), minicuerpo (Pessi A. et
al. 1995), Tendamistat (McConnel SJ. y Hoess RH 1995), dedo de
zinc (Choo Y. y Klug A. 1995), citocromo B_{562} (Ku J. y Schults
P.G. 1995), inhibidor de tripsina (Rottgen P. y Collins J. 1995),
hélice enrollada sintética (Houston M.E. et al. 1996),
proteínas tipo "knottin" (Smith G.P. et al. 1998),
proteína fluorescente verde (Abedi M.R. et al 1998),
fibronectina (Koide A. et al. 1998), anticalina (Beste G.
et al. 1999), CTLA-4 (Nuttall S.D. et
al. 1999) y tetranectina (Graversen J.H. et al. 2000).
Cada uno de estos armazones presenta ciertas características únicas
que hacen que la aplicación en zonas definidas sea beneficiosa,
pero como con los anticuerpos, cada uno también presenta varios
inconvenientes. La siguiente invención presenta un armazón
optimizado, generado para solucionar algunos de los problemas
mencionados anteriormente, tales como la aplicación a la unión a
ligando intracelular.
\newpage
Las proteínas de unión a ácidos grasos (FABP)
son una familia diversa de proteínas intracelulares. El papel
fisiológico preciso de las FABP no se entiende completamente, pero
la acumulación de evidencias sugiere que la función principal de
las FABP es unirse a ácidos grasos, que muestran una solubilidad
limitada, y ayudar de ese modo en el transporte de ácidos grasos
(Stewart J.M. 2000).
Un suministro adecuado de ácidos grasos de
cadena larga es importante para el funcionamiento apropiado de las
células eucariotas. Los ácidos grasos actúan como bloques de
construcción para los fosfolípidos de membrana y son un sustrato
principal para la producción de energía. Además, los ácidos grasos
son precursores de moléculas de señalización y mediadores de la
expresión de diversos genes que codifican para proteínas implicadas
en el metabolismo lipídico. Las características de unión de
H-FABP y su presencia predominante en fibras
musculares de tipo I y IIA sugieren todavía su implicación funcional
en el metabolismo oxidativo (Glatz JFC 2003).
Las FABP intracelulares y citoplasmáticas forman
un grupo de por lo menos nueve tipos de proteína distintos. Son
proteínas de 14 a 15 kDa de 126-134 aminoácidos, y
se denominan tras el primer tejido de aislamiento o identificación
(tabla 1) (Zimmerman A.W. 2001). Algunos tipos
(L-FABP, H-FABP) se producen en más
de un tejido mientras que otros (I-FABP,
A-FABP, M-FABP,
B-FABP) se limitan sólo a un tejido.
Los primeros estudios cristalográficos que se
notificaron que entraban en la bibliografía fueron de
I-FABP de rata recombinante (Sacchettini J.C. et
al. 1988). Los análisis estructurales de varias FABP han
revelado plegamientos tridimensionales marcadamente similares que
consisten en 10 hebras \beta antiparalelas que forman un barril
\beta. Este barril \beta está tapado por dos
\alpha-hélices cortas dispuestas en una
estructura de hélice-bucle-hélice
(figura 1). La presente evidencia sugiere que la estructura de
hélice-bucle-hélice junto con los
giros que conectan las hebras \beta C-D y
D-E, funciona como un "portal dinámico" que
regula la entrada y salida de ácidos grasos de la cavidad de unión
a ligando interna (Reese-Wagoner A. et al.
1999). En particular, la transferencia de ácidos grasos a membranas
parece controlarse mediante el motivo de
hélice-bucle-hélice (Liou
H-L et al 2002, Córsico B 2004)). Esta clase
de FABP, a la que también pertenece H-FABP, se ha
denominado FABP activa de membrana. Éstas catalizan tanto la
disociación del ácido graso de la membrana donadora como la unión a
la membrana aceptora (Glatz J.F.C. 2003).
La topología de las FABP es comparable a otras
dos familias de familias estructurales estrechamente relacionadas,
concretamente las lipocalinas y estreptavidinas. Sin embargo,
mientras que la estructura de la familia de FABP comprende una
estructura de almeja de 10 láminas \beta con una tapa de
hélice-bucle-hélice, las otras dos
comprenden estructuras de 8 hebras \beta y ningún motivo de
hélice-bucle-hélice. El barril de
FABP es más aplanado y elíptico que o bien el de las lipocalinas o
bien el de la estreptavidina (figura 2 y figura 3). Basándose en
las similitudes estructurales, se ha sugerido que las tres familias
distintas forman parte de un grupo más grande, la superfamilia
estructural calicina (Flower D.R. 1993). En contraposición con las
estructuras extraordinariamente similares, los miembros de la
familia de FABP muestran una similitud de la secuencia de
aminoácidos del 22-73%, con 39 residuos sumamente
conservados (Zimmerman A.W. y Veerkamp J.H. 2002).
La presencia de uno o más puentes disulfuro es
una característica única de la E-FABP, mientras que
se ha mostrado que los residuos de cisteína presentes en otras
moléculas FABP no participan en la formación de puentes
disulfuro.
En general, las proteínas de las familias de
lipocalina y estreptavidina son proteínas extracelulares, mientras
que las FABP son intracelulares. Debido a la distribución celular,
la mayoría de las FABP no contienen cisteínas que puedan participar
en la formación de puentes disulfuro, siendo la única excepción la
FABP epidérmica (Gutierrez-Gonzalez L.H. et
al. 2002), aunque no se ha verificado la formación de un puente
disulfuro funcional. Por otra parte, las lipocalinas y
estreptavidinas se basan lo más a menudo en la formación de puentes
disulfuro para su estabilidad estructural (Flower D.R 1996).
Además de unirse a ácidos grasos en la cavidad
de las FABP, se ha mostrado que se unen sondas tales como bisANS y
ANS, tal unión se ha asociado habitualmente con propiedades de un
estado de glóbulo fundido de una proteína, indicando en
consecuencia una estructura flexible con un alto grado de pérdida de
estructura. Sin embargo, para I-FABP se verificó
que la unión de bisANS y ANS tiene lugar dentro del bolsillo de esta
estructura compacta bien plegada (Arighi C.N. et al 2003).
Poseen todas una cavidad de unión a ligando de aproximadamente 1000
\ring{A}2 ubicada en la mitad superior del barril \beta.
Gunnarsson et al (2004), Protein
Engineering Design and Selection 17(3):
213-221 da a conocer una molécula de unión a
hidratos de carbono (CBM4-2) como armazón.
Simpson et al (2002), Biochemistry
41(18): 5712-5719 da a conocer una estructura
en disolución de la molécula de unión a CBM4-2.
Proba et al (1998), Journal of Molecular Biology
275(2): 245-253 da a conocer fragmentos de
anticuerpo scFv que no requieren puentes disulfuro para su
estabilidad.
La presente invención se refiere a una cadena
polipeptídica nueva que forma un pliegue tridimensional particular
caracterizado por un sándwich \beta. Alterando la secuencia de
aminoácidos en regiones específicas del polipéptido de la
invención, puede ajustarse la especificidad de la unión a
ligando.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente
invención proporciona un armazón proteico de unión a ácidos grasos
(FASTbody) que puede unirse específicamente a uno o más ligandos,
armazón que comprende un polipéptido de cadena sencilla con las
siguientes propiedades estructurales:
- (a)
- el armazón contiene 10 hebras \beta (denominadas ABCDEFGI y J) conectadas mediante regiones de bucle que determinan la especificidad de unión a ligando, en el que las hebras forman una estructura de almeja \beta; y en el que
- (b)
- las regiones de bucle que conectan \beta-A y \beta-B; \beta-C y \beta-D; \beta-E y \beta-F; \beta-G y \beta-H; \beta-I y \beta-J se ubican en el mismo sitio de la estructura de almeja \beta;
en el que el armazón de unión a ácidos grasos no
contiene ninguna cisteína que forme puentes disulfuro y en el que el
armazón no comprende un motivo de
hélice-bucle-hélice.
En los FASTbodies descritos anteriormente, la
unión a ligando específico tiene lugar mediante la interacción de
una o más regiones de bucle del armazón proteico de unión a ácidos
grasos (FASTbody) con ese ligando específico.
Según el aspecto anterior de la invención,
ventajosamente, el FASTbody según la invención puede unirse
específicamente a RAS.
Según el aspecto anterior de la invención,
ventajosamente, un FASTbody según la presente invención consiste en
un polipéptido de cadena sencilla con las siguientes propiedades
estructurales:
- (a)
- el armazón contiene 10 hebras \beta (denominadas ABCDEFGHI y J) conectadas mediante regiones de bucle que determinan la especificidad de unión a ligando, en el que las hebras \betaforman juntas una estructura de almeja \beta; y en el que
- (b)
- las regiones de bucle que conectan \beta-A y \beta-B; \beta-C y \beta-D; \beta-E y \beta-F; \beta-G y \beta-H; \beta-I y \beta-J se ubican en el mismo sitio de la estructura de almeja \beta; en el que el armazón de unión a ácidos grasos no contiene ninguna cisteína que forme puentes disulfuro; en el que el armazón no comprende un motivo de hélice-bucle-hélice.
Según el aspecto anterior de la invención,
preferentemente se sustituye el motivo de
hélice-bucle-hélice de una proteína
de unión a ácidos grasos por otro péptido durante la generación de
los FASTbodies de la invención. Un péptido de este tipo puede ser
de cualquier longitud y secuencia adecuadas. Ventajosamente, el
péptido es un péptido al azar de 9 aminoácidos. Todavía más
preferentemente, el péptido al azar de 9 aminoácidos es tal como se
describe en la presente memoria
Según el aspecto anterior de la invención, la
expresión "un armazón proteico de unión a ácidos grasos"
(FASTbody) se refiere a un armazón según la invención tal como se
describió anteriormente. Los inventores han concebido las
características esenciales del armazón de unión a ligando según la
invención basándose en experimentos diseñados para investigar las
relaciones de estructura/función en diversas proteínas de unión a
ácidos grasos. Se describe una selección de estos experimentos en
los ejemplos. En particular, el armazón de unión a ácidos grasos
según la invención se generó inicialmente para eliminar el motivo de
hélice-bucle-hélice de la proteína
de unión a ácidos grasos de adipocitos (A-FABP) y
sustituirlo por un péptido de 9 aminoácidos aleatorizado, en
particular un péptido al azar de 9 aminoácidos tal como se describe
en la presente memoria.
En otra forma de realización preferida de la
invención, el armazón proteico de unión a ácidos grasos según la
invención comprende, preferentemente consiste en una proteína de
unión a ácidos grasos FABP en la que el motivo de
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia de aminoácidos. Preferentemente, el motivo de
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia de aminoácidos al azar tal como se define en la
presente memoria. Lo más preferentemente, el motivo de
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia de 9 aminoácidos al azar. Lo más preferentemente
todavía, los FASTbodies según la invención comprenden, están
preferentemente constituidos por una proteína de unión a ácidos
grasos de adipocitos (a-FABP) en el que el motivo
de hélice-bucle-hélice se sustituye
por una secuencia de aminoácidos al azar, preferentemente el motivo
de hélice-bucle-hélice se sustituye
por una secuencia de 9 aminoácidos al azar.
Los presentes inventores consideran que la
estructura de armazón de la invención puede compararse con una
estructura de anticuerpo, en la que las regiones de bucle
individuales se comparan con las diferentes regiones CDR del
anticuerpo. Específicamente, los inventores consideran que en el
caso en el que los FASTbodies se basan en una proteína de unión a
ácidos grasos en la que se sustituye el motivo de
hélice-bucle-hélice por un péptido,
preferentemente una secuencia de aminoácidos al azar de 9
aminoácidos, entonces la secuencia peptídica puede compararse con
regiones CDR3 de cadena pesada, dado que su posición en el armazón
puede adaptar variaciones significativas en longitud y estructura
sin alterar el plegado global del armazón.
Las características esenciales de un armazón
según la invención se basan en los resultados de estos experimentos.
En particular, los presentes inventores han encontrado que la
estructura de almeja de hebras \beta parece ser importante para
determinar la integridad estructural del armazón de unión a ligando
de la invención, mientras que las regiones de bucle parecen
determinar la especificidad de la unión a ligando. Además, los
inventores consideran que la ausencia de cisteínas que forman
puentes disulfuro en el armazón de unión a ácidos grasos
(FASTbodies) según la invención es necesaria para permitir el
plegado correcto de los FASTbodies en un entorno intracelular. Por
tanto, los inventores consideran que la última característica es
esencial para la unión de ligando específico a FASTbodies según la
invención en un entorno intracelular.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para generar un armazón proteico de
unión a ácidos grasos (FASTbody), procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar una proteína de unión a ácidos grasos de cadena polipeptídica sencilla, o el ácido nucleico que la codifica; y
- (b)
- aleatorizar el motivo de hélice-bucle-hélice, o el ácido nucleico que lo codifica.
Según el aspecto anterior de la invención, el
término "aleatorización" (el motivo de
hélice-bucle-hélice) del FASTbody
de la invención se refiere al proceso de alterar la secuencia de
aminoácidos del motivo de modo que la secuencia de aminoácidos
resultante del motivo de
hélice-bucle-hélice no es el 100%
idéntico al motivo de
hélice-bucle-hélice comprendido por
la proteína de unión a ácidos grasos a partir de la que se genera el
FASTbody de la invención.
La "aleatorización de una secuencia de
aminoácidos" tal como se define en la presente memoria puede
lograrse usando cualquier técnica adecuada que dé cómo resultado el
cambio de por lo menos un aminoácido de la secuencia de aminoácidos
relevante de modo que la secuencia de aminoácidos resultante no es
el 100% idéntica a la misma secuencia de aminoácidos antes del
"proceso de aleatorización". Las técnicas adecuadas incluyen
mutación, deleción, inserción, translocación de ácidos nucleicos
que codifican para algo o toda de la región relevante.
Alternativamente, la aleatorización tal como se define en la
presente memoria puede lograrse al nivel de aminoácidos usando
técnicas similares, concretamente, mutación, deleción, inserción,
translocación de uno o aminoácidos que comprenden la secuencia
relevante. En una realización preferida del aspecto anterior de la
invención, la "aleatorización" se logra sustituyendo parte o
toda de la región relevante (por ejemplo parte o todo del motivo de
hélice-bucle-hélice) por una segunda
secuencia de aminoácidos. Tal sustitución puede lograrse o bien al
nivel de ácido nucleico o bien al nivel de aminoácidos. Este
procedimiento se describe con mayor detalle en los ejemplos.
Los expertos en la materia apreciarán que puede
generarse un FASTbody según la invención al nivel de
proteína/polipéptido o al nivel de ácido nucleico. Por tanto, en el
caso de que se genere el FASTbody al nivel de polipéptido, entonces
se aleatoriza el motivo de
hélice-bucle-hélice de una
proteína/polipéptido de unión a ácidos grasos. En cambio, en el
caso de que se prepara el FASTbody según la invención al nivel de
ácido nucleico, entonces se aleatoriza el ácido nucleico que
codifica para un motivo de
hélice-bucle-hélice de una proteína
de unión a ácidos grasos, tal como se define en la presente
memoria.
Según el aspecto anterior de la invención,
ventajosamente, el procedimiento de la invención comprende una
etapa adicional (c) en la que se aleatoriza una o más regiones de
bucle que conectan hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G,
H, I y/o J, o el ácido nucleico que las codifica, tal como se define
en la presente memoria. Según esta realización preferida del
aspecto anterior de la invención, preferentemente, se aleatoriza la
región de bucle que conecta las hebras \beta B y E tal como se
define en la presente memoria. Más ventajosamente todavía, se
aleatorizan las regiones de bucle que conectan
\beta-E y \beta-F,
\beta-G y \beta-H y
\beta-I y \beta-J tal como se
define en la presente memoria.
Según el aspecto anterior de la invención,
preferentemente, la proteína de unión a ácidos grasos es proteína de
unión a ácidos grasos de adipocito (FABP-A). Las
fuentes de proteínas de unión a ácidos grasos adecuadas resultarán
evidentes para los expertos en la materia y se describen en la
descripción detallada de la invención.
Según el aspecto anterior de la invención, el
término "sustitución" (el motivo de
hélice-bucle-hélice) se refiere al
procedimiento de eliminar el motivo de
hélice-bucle-hélice e insertar en su
lugar una a secuencia peptídica
adecuada.
adecuada.
Las secuencias peptídicas "adecuadas" para
su utilización según el procedimiento de la invención pueden ser de
cualquier longitud desde 3 aminoácidos hasta 100 aminoácidos.
Ventajosamente, una secuencia peptídica adecuada es desde 3 hasta
50, o de 3 a 20 aminoácidos de longitud, más preferentemente, es
desde 3 hasta 15 aminoácidos de longitud. Todavía más
preferentemente, es desde 3 hasta 10 aminoácidos de longitud. Lo más
preferentemente, cuando el péptido es uno que sustituye el motivo
de hélice-bucle-hélice, entonces la
secuencia peptídica según la invención es de preferentemente 9
aminoácidos de longitud. Además, en el caso en que el péptido
funcione para sustituir el bucle que conecta las hebras \beta B y
E, entonces el péptido es preferentemente de 5 aminoácidos de largo
o de 7 aminoácidos de largo. Ventajosamente, un péptido para su
utilización según el procedimiento de la invención es una secuencia
"peptídica aleatorizada" tal como se describe en la presente
memoria. Los expertos en la materia apreciarán que el péptido según
la etapa (b) anterior puede o no comprender elementos estructurales
secundarios.
Según la presente invención, la expresión
"péptido aleatorio" se refiere a una secuencia de aminoácidos
de secuencia no definida. Es decir se refiere a una secuencia de
aminoácidos de cualquier secuencia. Un péptido aleatorizado de este
tipo puede generarse utilizando cualquier procedimiento conocido
para los expertos en la materia. Ventajosamente, un péptido
"aleatorio" según la presente invención se generará utilizando
un sintetizador de péptidos.
Todavía otro aspecto, la presente invención
proporciona un armazón proteico de unión a ácidos grasos (FASTbody)
obtenible según el procedimiento de la invención.
Ventajosamente, los FASTbodies según la
invención comprenden, están constituidos preferentemente por, una
de las proteínas de unión a ácidos grasos seleccionadas de entre el
grupo constituido por: A-FABP,
I-FABP, L-FABP,
H-FABP, E-FABP,
IL-FABP, B-FABP,
M-FABP y T-FABP en las que el motivo
de hélice-bucle-hélice se
"aleatoriza" tal como se define en la presente memoria.
Preferentemente el motivo de
hélice-bucle-hélice se sustituye por
una secuencia peptídica aleatoria de 9 aminoácidos descrita en la
presente memoria.
Más ventajosamente, el FASTbody según la
invención comprende, preferentemente consiste en, una de las
proteínas de unión a ácidos grasos seleccionadas de entre el grupo
constituido por: A-FABP, I-FABP,
L-FABP, H-FABP,
E-FABP, IL-FABP,
B-FABP, M-FABP y
T-FABP en las que el motivo de
hélice-bucle-hélice se ha
aleatorizado tal como se define en la presente memoria y
adicionalmente una o más de las regiones de bucle que conectan una
o más de las hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, I y
J se "aleatorizan" tal como se describe en la presente
memoria.
Más ventajosamente, un FASTbody según la
invención comprende, preferentemente consiste en,
a-FABP en la que la región
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia peptídica aleatorizada, preferentemente los 9
aminoácidos y adicionalmente las regiones de bucle que conectan una
o más de las hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, I y
J se "aleatoriza" tal como se describe en la presente
memoria.
Lo más ventajosamente, un FASTbody según la
invención comprende, preferentemente consiste en,
a-FABP en la que la región
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia peptídica aleatoria tal como se define en la
presente memoria, preferentemente el péptido aleatorio de 9
aminoácidos descrito en los ejemplos y adicionalmente las regiones
de bucle que conectan las hebras \beta denominadas E y F se
"aleatoriza" tal como se describe en la presente memoria. En
otra forma de realización preferida del aspecto anterior de la
invención, un FASTbody según la invención comprende,
preferentemente consiste en, a-FABP en la que la
región de hélice-bucle-hélice se ha
sustituido por una secuencia peptídica aleatoria tal como se define
en la presente memoria, preferentemente el péptido aleatorio de 9
aminoácidos descrito en los ejemplos y adicionalmente las regiones
de bucle que conectan las hebras \beta denominadas E y F, G y H e
I y J se "aletorizan" tal como se describe en la presente
memoria.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un constructo de ácido nucleico que codifica para un
armazón proteico de unión a ácidos grasos (FASTbody) según la
invención.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona un vector que comprende un constructo de ácido
nucleico según la invención.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona una célula huésped que comprende un vector
según la invención.
Así en un aspecto adicional la presente
invención proporciona un procedimiento para cambiar la especificidad
de unión a ligando de un armazón de unión a ácidos grasos
(FASTbody) según la invención, procedimiento que comprende las
etapas de:
- (a)
- proporcionar un armazón de unión a ácidos grasos según la invención, y
- (b)
- aleatorizar uno o más bucles que conectan las hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, I y J.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona una biblioteca de armazones proteicos de unión
a ácidos grasos (FASTbodies) según la invención.
Según el aspecto anterior de la invención,
ventajosamente, los FASTbodies según la invención comprenden,
preferentemente consisten en, una de las proteínas de unión a
ácidos grasos seleccionadas de entre el grupo constituido por:
A-FABP, I-FABP,
L-FABP, H-FABP,
E-FABP, IL-FABP,
B-FABP, M-FABP y
T-FABP en las que el motivo de
hélice-bucle-hélice se
"aleatoriza" tal como se define en la presente memoria.
Preferentemente el motivo de
hélice-bucle-hélice se sustituye por
una secuencia peptídica aleatoria de 9 aminoácidos descrita en la
presente memoria.
Más ventajosamente, los FASTbodies según la
invención comprenden, preferentemente consisten en, una de las
proteínas de unión a ácidos grasos seleccionadas de entre el grupo
constituido por: A-FABP, I-FABP,
L-FABP, H-FABP,
E-FABP, IL-FABP,
B-FABP, M-FABP y
T-FABP en las que el motivo de
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia de aminoácidos aleatorizada, preferentemente una
secuencia peptídica aleatorizada, preferentemente una secuencia
peptídica aleatoria de 9 aminoácidos descrita en la presente memoria
y adicionalmente una o más de las regiones de bucle que conectan
una o más de las hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H,
I y J se "aleatoriza" tal como se describe en la presente
memoria.
Más ventajosamente, un FASTbody según la
invención comprende, preferentemente consiste en,
a-FABP en la que la región de
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia peptídica aleatorizada, preferentemente los 9
aminoácidos y adicionalmente las regiones de bucle que conectan una
o más de las hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, I y
J se "aleatoriza" tal como se describe en la presente
memoria.
Lo más ventajosamente, un FASTbody según la
invención comprende, preferentemente consiste en,
a-FABP en la que la región de
hélice-bucle-hélice se ha sustituido
por una secuencia peptídica aleatoria tal como se define en la
presente memoria, preferentemente el péptido aleatorio de 9
aminoácidos descrito en los ejemplos y adicionalmente las regiones
de bucle que conectan las hebras \beta denominadas E y F se
"aleatoriza" tal como se describe en la presente memoria. En
una realización preferida adicional del aspecto anterior de la
invención, un FASTbody según la invención comprende,
preferentemente consiste en, a-FABP en la que la
región de hélice-bucle-hélice se ha
sustituido por una secuencia peptídica aleatoria tal como se define
en la presente memoria, preferentemente el péptido aleatorio de 9
aminoácidos descrito en los ejemplos y adicionalmente las regiones
de bucle que conectan las hebras \beta denominadas E y F, G y H e
I y J se "aletorizan" tal como se describe en la presente
memoria.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona un procedimiento para seleccionar un armazón
de unión a ácidos grasos según la invención, armazón que puede
unirse a un ligando definido, procedimiento que comprende las etapas
de:
- (a)
- proporcionar una biblioteca de proteínas de unión a ácidos grasos (FASTbody) según la invención,
- (b)
- someter a prueba la capacidad de la biblioteca según la etapa (a) para unirse al ligando definido; y
- (c)
- seleccionar los armazones de unión a ácidos grasos según la etapa (b) que pueden unirse al ligando definido.
Los presentes inventores han descubierto
sorprendentemente que la unión del ligando específico a los
FASTbodies según la invención está modulada por la presencia o
ausencia de unión de ácidos grasos al FASTbody.
Así en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona la utilización de un ácido graso para modular
la unión de ligando específico a FASTbodies según la invención.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona la utilización de ácido graso para monitorizar
la unión de FASTbodies a uno o más ligandos específicos.
Según el aspecto de la invención mencionado
anteriormente, ventajosamente la utilización comprende medir la
cantidad de ácidos grasos unidos al FASTbody. Tras la unión de
ligando a FASTbody la tasa de disociación de ácido graso del
FASTbody se alterará, permitiendo así que se obtenga una
correlación.
Tal como se utiliza en la presente memoria la
expresión "ácido graso" incluye dentro de su alcance derivados
de ácidos grasos, homólogos, análogos y/o fragmentos de los mismos
siempre que tales derivados, homólogos, análogos y/o fragmentos de
los mismos presenten la actividad requerida de unión a FASTbody y la
modulación consiguiente de unión de ligando específica a un FASTbody
tal como se describe en la presente memoria.
Según el aspecto anterior de la invención,
preferentemente el ácido graso es uno o más seleccionado de entre
el grupo constituido por los siguientes: ácido láurico, ácido
mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico,
ácido estérico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico,
ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico o
análogos fluorescentes de los anteriores. Los expertos en la materia
apreciarán que esta lista no pretende ser limitativa.
Los presentes inventores consideran que los
FASTbodies y/o las bibliotecas de los mismos según la invención
pueden utilizarse para generar sistemas de validación adecuados para
su utilización en combinación con selecciones de alto rendimiento de
nuevas entidades químicas.
Así en un aspecto final, la presente invención
proporciona un procedimiento para identificar un candidato de
fármaco potencial que puede desplazar la unión de un FASTbody según
la invención al antígeno diana, procedimiento que comprende las
etapas de:
- (a)
- proporcionar una biblioteca de FASTbodies según la invención,
- (b)
- proporcionar una muestra de uno o más candidatos de fármaco,
- (c)
- examinar la biblioteca para determinar la capacidad del uno o más candidatos de fármaco para desplazar la unión de uno o más FASTbodies dentro de la biblioteca según la etapa (a).
\vskip1.000000\baselineskip
Según el aspecto anterior de la invención, las
moléculas que se encuentra que desplazan la unión de uno o más
FASTbodies en una biblioteca según la invención representan
candidatos de fármacos potenciales. Preferentemente el
procedimiento según el aspecto anterior de la invención puede
efectuarse utilizando tecnología de selección de alto rendimiento.
La tecnología adecuada será familiar para los expertos en la
materia.
\newpage
El término "biblioteca" de FASTbodies según
la presente invención se refiere a una mezcla de polipéptidos o
ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta por
miembros, que presentan una única secuencia de polipéptido o ácido
nucleico. Hasta este punto, biblioteca es sinónimo de repertorio.
Las diferencias de secuencia entre miembros de la biblioteca son
responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La
biblioteca puede adoptar la forma de una mezcla simple de
polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en forma de
organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células de
animal o vegetales y similares, transformadas con una biblioteca de
ácidos nucleicos. Preferentemente, cada organismo o célula
individual contiene solamente un miembro de la biblioteca.
Ventajosamente, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de
expresión, con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos
codificados por los ácidos nucleicos.
La "aleatorización de una secuencia de
aminoácidos" tal como se define en la presente memoria puede
lograrse utilizando cualquier técnica adecuada que da como
resultado el cambio de por lo menos un aminoácido de una secuencia
de aminoácidos relevante de modo que la secuencia de aminoácidos
resultante no es el 100% idéntica a aquella secuencia de
aminoácidos antes del "procedimiento de aleatorización". Las
técnicas adecuadas incluyen mutación, deleción, inserción,
translocación de ácidos nucleicos que codifican para parte de o toda
la región relevante. Alternativamente, la aleatorización tal como
se define en la presente memoria puede lograrse al nivel de
aminoácidos utilizando técnicas similares, concretamente, mutación,
deleción, inserción, translocación de uno o aminoácidos que
comprenden la secuencia relevante. En una realización preferida del
aspecto anterior de la invención, la "aleatorización" se logra
sustituyendo parte de o toda la región relevante (por ejemplo parte
de o todo el motivo de
hélice-bucle-hélice de un FASTbody
según la presente invención) por una segunda secuencia de
aminoácidos. Tal sustitución puede lograrse o bien al nivel de ácido
nucleico o bien al nivel de aminoácidos.
"Anticuerpos" se definen en la presente
memoria como construcciones que utilizan la región de unión
(variable) de tales anticuerpos, y otras modificaciones de
anticuerpo. Así, un anticuerpo útil en la invención puede
comprender anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpo,
agregados de anticuerpo polifuncionales, o en general cualquier
sustancia que comprende uno o más sitios de unión específicos de un
anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser fragmentos
tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab')_{2} o cualquier
derivado de los mismos, tales como una fragmentos Fv de cadena
sencilla. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser no
recombinantes, recombinantes o humanizados. El anticuerpo puede ser
de cualquier isotipo de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM,
etcétera. Además, agregados, polímeros, derivados y conjugados de
inmunoglobulinas o sus fragmentos pueden utilizarse cuando sea
apropiado.
Según la presente invención, la expresión
"péptido aleatorizado" se refiere a una secuencia de
aminoácidos de secuencia no definida. Es decir, se refiere a una
secuencia de aminoácidos de cualquier secuencia. Un péptido
aleatorizado de este tipo puede generarse utilizando cualquier
procedimiento conocido para los expertos en la materia.
Ventajosamente, un péptido "aleatorio" según la presente
invención se generará utilizando un sintetizador de péptidos.
La CDR (región determinante de la
complementariedad) de un dominio variable de cadena pesada y ligera
de molécula de inmunoglobulina describe aquellos residuos de
aminoácido que no son residuos de región de entramado y que están
contenidos en bucles hipervariables de las regiones variables. Estos
bucles hipervariables están directamente implicados en la
interacción de la inmunoglobulina con el ligando. Los residuos de
estos bucles tienden a mostrar un grado inferior de conservación que
los de la región de entramado.
Intracelular significa dentro de una célula. La
célula puede ser cualquier célula, procariota o eucariota, y se
selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por una
célula bacteriana, una célula de levadura y una célula eucariota
superior. Las más preferidas son células de levadura y células de
mamífero. Además el término "intracelular" se refiere a
entornos que se asemejan a o imitan un entorno intracelular. Así,
"intracelular" puede referirse a un entorno que no está dentro
de la célula, sino que es in vitro.
Unión específica en el contexto de la presente
invención, significa que la interacción entre el FASTbody y el
ligando es específica, es decir, en el caso de que varias moléculas
se presentan al FASTbody, el último solamente se unirá a una o a
pocas de aquellas moléculas presentadas. Ventajosamente, la
interacción FASTbody-ligando será de alta afinidad.
La interacción entre FASTbody y ligando estará mediada por
interacciones no covalentes tales como enlaces de hidrógeno y Van
der Waals. Generalmente, la interacción se producirá en las regiones
de bucle del FASTbody.
La figura 1 muestra una representación
esquemática de la proteína de unión a ácidos grasos de adipocito.
Las 10 hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, I, J están
representadas en cuadrados, mientras que el motivo de
hélice-bucle-hélice que conecta
hebra \beta A y B se muestra como cilindros. Los bucles que
conectan los elementos estructurales secundarios están representados
en líneas finas.
La figura 2 muestra una representación
tridimensional de la estructura de proteína de unión a ácidos grasos
de adipocito complejada con sulfonato de
1-anilino-8-naftaleno
creada utilizando el programa visualizador Swiss-PDB
(http://www.expasy.org/spdbv/). Las coordenadas (2ANS) se tomaron de
PDB.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La figura 3 muestra la comparación de secuencias
entre proteína de unión a ácidos grasos de adipocito de ser humano y
ratón, mostrándose los elementos estructurales secundarios. Las
regiones de hélice se muestran como cuadrados y hebras b se muestran
como líneas que terminan con una flecha, las regiones de bucle se
indican con la letra t.
La figura 4 muestra la secuencia de gen
transcrita de proteína de unión a ácidos grasos de adipocito humana
de tipo natural, derivada del Genebank con número de registro: NM
001442. La secuencia traducida está destacada en amarillo.
La figura 5 muestra una comparación de
secuencias entre proteína de unión a ácidos grasos de adipocito
humana de tipo natural y la proteína de unión a ácidos grasos de
adipocito recombinante modificada clonada en el vector fagémido
pHEN2. En la primera línea se da la secuencia de aminoácidos de tipo
natural de A-FABP con elementos estructurales
secundarios (cursiva indica hélice, azul indica lámina y negro
subrayado residuos de bucle).
La figura 6 muestra la comparación de secuencias
entre la proteína de unión a ácidos grasos de adipocito recombinante
modificada en pHEN2 antes y después de eliminar la región de
hélice-bucle-hélice. En la variante
sin hélice de la proteína de unión a ácidos grasos de adipocito los
sitios de reconocimiento de enzima de restricción únicos para KpnI,
XhoI y BspEI se añadieron tal como se detalla en el ejemplo 1.
La figura 7 muestra la comparación de secuencias
entre la variante sin hélice de la proteína de unión a ácidos grasos
de adipocito y la primera biblioteca de FASTbody en la que región de
hélice-bucle-hélice de la proteína
de unión a ácidos grasos de adipocito se sustituyó por un inserto de
9 aminoácidos aleatorizado. En el procedimiento de aleatorización se
utiliza el codón NNK.
La figura 8 muestra los resultados de ELISA
obtenidos con 4 agentes de unión a FASTbody seleccionados frente a
RAS. En el ELISA los pocillos se recubrieron con 50 ng de cada uno
de los antígenos indicados (RAS, ubiqutina, leche desnatada y BSA).
Para evitar la unión a la superficie de plástico libre se bloquearon
los pocillos añadiendo leche desnatada en polvo al 3% en PBS,
seguido por incubación con 50 \mul de un sobrenadante de fago de
los agentes de unión a FASTbody individuales
(2-4-F,
3-12-F,
3-11-E y
1-4-H). Se detectó la unión a
FASTbody haciendo reaccionar con un anticuerpo monoclonal frente a
la partícula de fago seguido por el desarrollo con OPD. Los tres
agentes de unión 2-4-F,
3-12-F y
3-11-E se unen específicamente a RAS
mientras que 1-4-H no muestra unión
significativa.
La figura 9 muestra los resultados de ELISA
obtenidos con los mismos 4 agentes de unión a FASTbody seleccionados
tal como se muestra en la figura 8. En el ELISA los pocillos se
recubrieron con 50 ng de cada uno de los antígenos indicados (RAS,
ubiqutina, lecha desnatada y BSA). Para evitar la unión a la
superficie de plástico libre se bloquearon los pocillos añadiendo
BSA al 2% en PBS, seguido por incubación con 50 \mul de
sobrenadante de fago de los agentes de unión a FASTbody individuales
(2-4-F,
3-12-F,
3-11-E y
1-4-H). Se conoce que BSA se une
fuertemente a ácidos grasos, por tanto cualquier ácido graso unido a
las estructuras del FASTbody se desplazarían bloqueando e incubando
los FASTbodies en presencia de BSA. Se detectó la unión a FASTbody
haciendo reaccionar con un anticuerpo monoclonal frente a la
partícula de fago seguido por el desarrollo con OPD. FASTbodies de
los clones 2-4-F y
3-11-E no muestran una unión
significativa a RAS en comparación con al antecedente, indicando así
que el reconocimiento de RAS de estos FASTbodies depende de los
ácidos grasos que están presentes en el armazón de FASTbody.
3-12-F conserva algo de la
especificidad de unión hacia RAS.
La figura 10 muestra parte de la secuencia del
agente de unión 3-11-E seleccionado
para la unión frente a la proteína RAS. Solamente se muestra parte
de la secuencia de alrededor de la secuencia 9 de aminoácidos. El
sitio de restricción NcoI está ubicado en el codón de iniciación
para los FASTbodies, mientras que XhoI y BspEI están ubicados en
cualquier sitio del inserto de 9 aminoácidos. Los 9 aminoácidos se
muestran en cursiva.
La figura 11 muestra una representación
esquemática de las construcciones de biblioteca basándose en el
agente de unión 3-11-E. Tal como se
resume en el ejemplo 3. Se realizaron dos reacciones de PCR
utilizando el agente de unión 3-11-E
en pHEN2 como molde. Una utilizando el oligonucleótido que ceba en
la secuencia vector corriente arriba del codón de iniciación del
FASTbody (FABP64S) junto con un oligonucleótido inmediatamente
delante del bucle que conecta la hebra b E y F, y la otra utilizando
un oligonucleótido que ceba en la secuencia vector corriente arriba
del extremo del FASTbody (FABP545AS) junto con dos oligonucleótidos
diferentes utilizados para insertar una secuencia aleatoria de 5 y 7
aminoácidos respectivamente en el bucle que conecta la hebra b E y
F. Se utilizó una amplificación mediante PCR secundaria para
ensamblar los dos fragmentos antes del clonado de los productos de
PCR en los sitios PstI y NotI.
La figura 12 muestra los resultados de ELISA de
un conjunto seleccionado de agentes de unión obtenidos a partir de
las dos bibliotecas de FASTbodies construidas utilizando el agente
de unión 3-11-E seleccionado
anteriormente frente a RAS como molde. Se aleatorizaron las dos
bibliotecas tal como se mostró anteriormente en el ejemplo 3.
Cinco de los clones positivos obtenidos después
de la selección de las bibliotecas de FASTbody generadas utilizando
3-11-E como molde y el agente de
unión 3-11-E se sometieron a prueba
en un ELISA diseñado para destacar la importancia de añadir ácidos
grasos libres a los FASTbodies. Se permitió a los agentes de unión
unirse a leche desnatada en polvo sola, Ras bloqueada con leche
desnatada en polvo, leche desnatada en polvo y oleato, RAS con
oleato y bloqueada con leche desnatada en polvo, leche desnatada en
polvo con oleato y oleato presente en todas las etapas de lavado e
incubación, Ras con oleato y bloqueada con leche desnatada en polvo
y oleato presente en todas las etapas de lavado e incubación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Mientras que todos los clones de las nuevas
bibliotecas generaron agentes de unión con unión aumentada a RAS, la
influencia del oleato presente solamente en la etapa de
recubrimiento o en todas las demás etapas de lavado e incubación
varió entre los clones.
La figura 13 muestra la secuencias de los 5
agentes de unión seleccionados a partir de las bibliotecas de
FASTbodies basándose en el agente de unión
3-11-E con aleatorización del bucle
que conecta hebra b E y F.
Se marcan los residuos aleatorizados como gris
en el nivel de ADN. Todos los clones presentan secuencias diferentes
estableciendo el potencial de generar diversas series de agentes de
unión utilizando el armazón FASTbody. Además se identificaron los
agentes de unión con tanto 5 como 7 aminoácidos aleatorizados
estableciendo la flexibilidad de las regiones de bucle para alojar
secuencia bucle de longitud variable.
La figura 14 muestra un vector pET11d modificado
en el que la clonación en NcoI y NotI permite la expresión de una
proteína de fusión con una etiqueta myc e His añadida al extremo C
Terminal de la proteína de fusión.
La figura 15 muestra una representación
esquemática del vector de expresión permitiendo la expresión
intracelular de los FASTbodies en Mucor.
La figura 16 muestra la secuencia detallada del
vector pEUKA7-kan.
La figura 17 muestra la expresión intracelular
del agente de unión 3-11-E
89-8-E de RAS expresado a partir del
vector pEUKA7-kan. Como control se hicieron crecer
los KFA143 (Appel et al. 2004) en condiciones aerobias y
anaerobias.
La figura 18 muestra esquemáticamente el
ensamblaje del fragmento de gen sintético para la creación de la
biblioteca de FASTbodies aleatorizada total tal como se describe en
el ejemplo 7.
La figura 19 muestra un experimento de ELISA en
FASTbodies de una biblioteca aleatorizada total. Se realizó el ELISA
tal como se describe en el ejemplo 8 y los resultados se dan como
absorbancia a 490 nm. Se marcan los clones positivos con sombreado
gris.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria
presentan el mismo significado tal como se entiende comúnmente por
un experto en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética
molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y
bioquímica). Se utilizan técnicas convencionales para los
procedimientos moleculares, genéticos y bioquímicos (véase
generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short
Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons,
Inc. que se incorporan a la presente memoria como referencia) y
procedimientos químicos.
Pueden generarse armazones de unión a ácidos
grasos (FASTbodies) según la presente invención a partir de una o
más proteínas de unión a ácidos grasos.
Tales proteínas de unión a ácidos grasos pueden
clasificarse tal como se muestra en la Tabla 1.
En una realización preferida de la invención, se
generan FASTbodies según la invención a partir de
A-FABP (proteína de unión a ácidos grasos de
adipocito).
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de unión a ácidos grasos a partir
de las cuales puede generarse un FASTbody según la presente
invención comprenden una gran región de hebra \beta que forma una
estructura de almeja \beta tal como se define en la presente
memoria y una pequeña región helicoidal. Juntas estas estructuras
(cuyas características se describen a continuación) crean un espacio
de unión de ácido graso específico.
Los primeros estudios cristalográficos
notificados que entraron en la bibliografía fueron de
I-FABP de rata recombinante. Los análisis
estructurales de varios FABP han revelado plegamientos
tridimensionales notablemente similares constituidos por 10 hebras
\beta antiparalelas que forman un cilindro \beta (Zanotti G.
1999). Este cilindro \beta está tapado por \betados
\alpha-hélices cortas dispuestas en una estructura
de hélice-bucle-hélice (figura 1).
La presente evidencia sugiere que la estructura de
hélice-bucle-hélice junto con las
vueltas que conectan las hebras \beta C-D y
D-E, funcionan como un "portal dinámico" que
regula la entrada y la salida de ácido graso de la cavidad de unión
a ligando interna. En particular, la transferencia de ácidos grasos
a membranas parece controlarse mediante el motivo de
hélice-bucle-hélice (Liou
H-L et al 2002, Córsico B 2004)). Esta clase
de FABP, a la que también pertenece H-FABP, se ha
denominado FABP activas de membrana. Éstos catalizan tanto la
disociación de la membrana donadora como la unión a la membrana
aceptora (Glatz J.F.C. 2003).
La topología de las FABP es comparable otras dos
familias de familias estructurales estrechamente relacionadas,
concretamente las lipocalinas y las estreptavidinas. Sin embargo
mientras que la estructura de la familia de FABP comprende una
estructura de almeja de 10 láminas \beta con una tapa de
hélice-bucle-hélice, las otras dos
comprenden estructuras de 8 hebras \beta y ningún motivo de
hélice-bucle-hélice. El cilindro de
FABP es más plano y elíptico que cualquiera de las lipocalinas o
estreptavidina. Basándose en las similitudes estructurales, se ha
sugerido que las tres familias distintas forman parte de un grupo
mayor, la superfamilia estructural calicina (Flower D.R. 1993). A
diferencia de estructuras notablemente similares, los miembros de
la familia de FABP muestran una similitud de secuencia de
aminoácidos del 22-73%, con 39 residuos sumamente
conservados.
Algunos detalles de estas topologías
estructurales se presentan a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
En la estructura de hebra beta (\beta), el
segmento de polipéptido adopta una conformación extendida, en la
que los ángulos phi y psi están alrededor de -120º y +120º
respectivamente. Los grupos R de los aminoácidos alternan en
ubicación con respecto al plano definido por el esqueleto de tal
modo que cada segundo está ubicado en un lado del plano y cada
segundo alterno está en el lado opuesto del plano.
\vskip1.000000\baselineskip
En la estructura de alfa hélice, el esqueleto de
polipéptido está dispuesto en una hélice helicoidal que presenta
aproximadamente 3,6 residuos por vuelta. Los grupos R del aminoácido
se extienden hacia fuera de la hélice compacta formada del
esqueleto. En una estructura de este tipo la unidad de repetición
que consiste en una única vuelta completa de la hélice, se extiende
aproximadamente 0,54 nm a lo largo del eje longitudinal. La alfa
hélice es la disposición más simple que puede adoptarse por un
polipéptido teniendo en consideración la limitación impuesta por los
enlaces peptídicos planares.
\vskip1.000000\baselineskip
La topología de almeja \beta consiste en dos
láminas \beta antiparalelas de cinco hebras que rodean una gran
cavidad cargada de disolvente dentro de la cual se une el ligando.
Esta topología de almeja \beta. Esta topología de almeja \beta
está presente en todos los miembros de la familia de la proteína de
unión a ácidos grasos y es una característica esencial del armazón
proteico de unión a ácidos grasos (FASTbodies) según la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de unión a ácidos grasos
comprenden dos \alpha-hélices que unen hebras beta
A y B. Es decir, las hebras \beta A y B se unen mediante un
motivo de hélice-bucle-hélice. El
armazón proteico de unión a ácidos grasos (FASTbodies) según la
invención conserva esta característica en ciertas formas de
realización. Los presentes inventores consideran que la presencia
del motivo de hélice-bucle-hélice no
es necesaria con el fin de mantener la integridad de la cavidad de
unión a ácidos grasos, pero puede servir para regular la afinidad de
unión a ácidos grasos (Cistola, D. P 1996).
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto la presente invención
proporciona un armazón proteico de unión a ácidos grasos (FASTbody)
que puede unirse específicamente a uno o más ligandos, armazón que
comprende un polipéptido de cadena sencilla con las siguientes
propiedades estructurales:
- (a)
- el armazón contiene 10 hebras \beta (denominadas ABCDEFGHI y J) conectadas mediante regiones de bucle que determinan la especificidad de unión a ligando, en el que las hebras \beta forman juntas una estructura de almeja \beta; y en el que
- (b)
- las regiones de bucle que conectan \beta-A y \beta-B; \beta-C y \beta-D; \beta-E y \beta-F; \beta-G y \beta-H; \beta-I y \beta-J se ubican en el mismo sitio de la estructura de almeja \beta; en las que el armazón de unión a ácidos grasos no contiene ninguna cisteína que forme puentes disulfuro; en las que el armazón no comprende un motivo de hélice-bucle-hélice.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han estudiado las
relaciones de estructura/función en miembros de la familia de la
proteína de unión a ácidos grasos. Han utilizado la información
obtenida para diseñar un armazón. De manera importante, un armazón
de este tipo consiste en regiones de bucle que pueden interaccionar
de manera específica con uno o más ligandos. Además han utilizado
esta información para examinar la influencia de los ácidos grasos
asociados con la estructura de armazón y la influencia de dichos
ácidos grasos en la unión de ligandos. Algunas de las
consideraciones estructurales tomadas en consideración para diseñar
un armazón de unión a ácidos grasos (FASTbody), armazón según la
presente invención, se enumeran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando la estructura de la proteína de unión a
ácido graso del parásito platelminto Echinococcus granulosus
(Eg-FABP1) se compara con otro miembro de la familia
estructural la proteína de mielina P2, las diferencias
estructurales principales aparecen en las vueltas antes y después de
la hebra \beta H (Jakobsson E. 2003). A pesar de las diferencias
estructurales en las regiones de vuelta alrededor de la hebra
\beta H, la conformación y ubicación de esta hebra son idénticas
en las dos proteínas, sugiriendo por tanto que se permite un cierto
grado de variación de secuencia en regiones de vuelta, aunque
todavía conservando las características estructurales globales.
Anteriormente, estudios han investigado la
influencia de mutar aminoácidos individuales en
I-FABP. Se seleccionaron los residuos basándose en
una probable influencia en el plegamiento o la estabilidad. Leu64
ubicada en el bucle que conecta hebra \beta D y hebra \beta E
hace numerosos contactos con residuos en otras hebras, y mutantes
en el residuo 64 mostraron una disminución notable en la estabilidad
(Rajabzadeh M. 2003). Aunque esto puede ser cierto para
determinados residuos clave conservados, se ha examinado un gran
número de mutantes de otras proteínas FABP y muestran estabilidades
similares o moderadamente disminuidas con una conservación de las
características estructurales globales (Zimmerman A.W., et
al. 1999).
La alta flexibilidad que es necesaria para una
captación y distribución apropiadas de ácidos grasos, implica
principalmente flexibilidad de la región de
hélice-bucle-hélice, mientras que se
conserva la estabilidad conformacional global de la estructura de
almeja \beta, tal como se ha mostrado para las
I-FABP y L-FABP (Constantine K.L.
et al. 1998; Arighi C.N. 2003; Córsico B. 2004).
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura de FABP global muestra estabilidad
conformacional significativa, aunque existe una extensión
significativa de estabilidades entre los miembros individuales. La
estabilidad medida mediante desnaturalización de urea muestra que
H-FABP es la más estable con un punto medio de
desnaturalización a urea 5,95 M, que va seguido por
A-FABP (5,36 M), I-FABP (5,20 M),
B-FABP (4,07 M), Il-FABP (3,78 M),
M-FABP (3,00 M), E-FABP (2,57 M) y
L-FABP (1,85 M) (Zimmerman A.W. 2001). Esta
estabilidad conformacional no se correlaciona con la afinidad para
unión a ligando.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios anteriores produjeron una variante sin
hélice de la I-FABP de rata con el fin de examinar
el papel del motivo de
hélice-bucle-hélice en la unión a
ligando (Wu F., et al. 2001). En la variante sin hélice el
motivo de hélice-bucle-hélice se
sustituyó por un ligador de ser-gly. El dicroísmo
circular y los espectros de RMN indicaron que esta variante de
I-FABP presenta un alto contenido en lámina \beta
y una topología de almeja \beta similar a la de la proteína de
tipo natural (Steele R.A. et al. 1998). La conformación del
esqueleto del variante sin hélice es casi superponible con el
dominio de lámina \beta de I-FABP de tipo
natural. La estabilidad de la variante sin hélice se reduce
ligeramente tras la desnaturalización con tratamiento con
guanidina. Las tasas de asociaciones a ligando para la variante sin
hélice y la proteína de tipo natural eran comparables, pero las
tasas de disociación eran 16 veces inferiores para la proteína de
tipo natural. La presente invención ha mostrado que tras la unión
de un ligando a los FASTbodies de la presente invención, se
alterará la tasa de disociación de ácidos grasos que se unen a los
FASTbodies, permitiendo así una correlación entre la unión a
ligando y la tasa de disociación de ácidos grasos que va a
realizarse. Estos datos indican que la
\alpha-hélice de I-FABP no es
necesaria para mantener la integridad de la cavidad de unión a
ácidos grasos pero puede servir para regular la afinidad de unión a
ácidos grasos (Cistola D.P. 1996). Además estudios de transferencia
de ácido graso mostraron que en ausencia del dominio de
\alpha-hélice, no se produce transferencia
colisional efectiva de ácidos grasos a membranas de fosfolípidos,
indicando que la región de \alpha-hélice de FABP
es esencial para la interacción con membranas.
Para varias mutaciones de punto único así como
H-FABP y de A-FABP quimérica se han
observado conservación de la estructura secundaria global (Richier
G.V. et al 1998, Liou H-L 2002) lo que
refuerza adicionalmente la idea de que la variación de secuencia
pueda acomodarse sin destruir el plegamiento global de la FABP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores utilizaron la
información obtenida estudiando las relaciones de estructura/función
de proteínas de unión a ácidos grasos descritas anteriormente con
el fin de diseñar un armazón de FABP según la invención. Entonces
se crearon bibliotecas de tales moléculas por los presentes
inventores con el fin de seleccionar FASTbodies según la presente
invención que muestran una o más especificidades de unión a ligando
deseadas. Preferentemente el uno o más ligandos es RAS.
Un ejemplo de una estrategia utilizada en la
generación de una biblioteca de FASTbodies específica de ligando
según la presente invención se proporciona a continuación:
En primer lugar la región
hélice-bucle-hélice, se sustituyó
por un péptido de 9 aminoácidos aleatorio. Se seleccionó la
biblioteca en RAS y agentes de unión obtenidos. En la siguiente
etapa se seleccionó uno de los agentes de unión aislados
seleccionando en RAS como para aleatorización del bucle que conecta
hebra \beta E y F, tal como se define en la presente memoria. Se
crearon dos bibliotecas diferentes, una que presentaba 5
aminoácidos aleatorizados sustituyendo el bucle y una que presentaba
7 aminoácidos aleatorizados sustituyendo el bucle. De nuevo se
seleccionaron las nuevas bibliotecas para unión hacia RAS. Se
aislaron varios clones con afinidad de unión aumentada según se
consideró a partir de experimentos de ELISA.
Se dio un resultado imprevisto cuando se cambió
el reactivo de bloqueo del utilizado normalmente leche desnatada en
polvo al 2 % en PBS a BSA al 2% en PBS. El cambio en el reactivo de
bloqueo dio como resultado una señal disminuida para algunos de los
agentes de unión aislados hacia RAS. BSA une y transporta ácidos
grasos en el suero, consecuentemente BSA presenta una afinidad
significativa para ácidos grasos. En estudios anteriores se ha
mostrado que la afinidad de unión de un variante sin hélice de
I-FABP presenta una afinidad de unión reducida de
20-100 hacia ácidos grasos.
Dado que existe una reducción similar de
afinidad de unión para ácidos grasos para el presente armazón
modificado mediante ingeniería genética construido en la
A-FABP, los resultados anteriores indicaron que la
presencia de ácidos grasos en el armazón seleccionado puede regular
la unión de armazón individual a sus dianas.
Basándose en esta nueva observación
potencialmente pueden aislarse agentes de unión regulables hacia
dianas predefinidas. Además puede utilizarse una dependencia de los
ácidos grasos presentes en el FASTbody para medir la unión de
ligando al FASTbody midiendo la unión a ácidos grasos del
FASTbody.
Siguiendo la prueba del concepto descrita
anteriormente se ha construido una nueva biblioteca en la que la
región de hélice-bucle-hélice se
sustituye por el péptido de 9 aminoácidos aleatorio, descrito
anteriormente, junto con aleatorización de las regiones de bucle
que conectan \beta-E y \beta-F;
\beta-G y \beta-H;
\beta-I y \beta-J.
La biblioteca resultante se ha seleccionado
frente a diversas dianas, incluyendo RAS, y se ha obtenido una serie
diversa de agentes de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "biblioteca" de FASTbodies según
la presente invención se refiere a una mezcla de polipéptidos o
ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta por
elementos, que presentan una única secuencia de polipéptido o ácido
nucleico. Hasta este punto, biblioteca es sinónimo de
repertorio. Las diferencias de secuencia entre los elementos
de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la
biblioteca. La biblioteca puede tomar la forma de una mezcla
sencilla de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en forma
de organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células
animales o vegetales y similares, transformados con una biblioteca
de ácidos nucleicos. Preferentemente, cada organismo o célula
individual contiene solamente un elemento de la biblioteca. De
manera ventajosa, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de
expresión, con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos
codificados por los ácidos nucleicos.
Pueden prepararse bibliotecas de (armazones
proteicos de unión a ácidos grasos) FASTbodies según la presente
invención utilizado cualquier procedimiento adecuado conocido por
los expertos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
En la técnica es conocida una variedad de
sistemas de selección que son adecuados para su utilización en la
presente invención. Se describen a continuación ejemplos de tales
sistemas.
Los sistemas de expresión de bacteriófago lambda
pueden seleccionarse directamente como placas de bacteriófagos o
como colonias de lisógenos, ambos tal como se describieron
anteriormente y (Huse et al. (1989) Science, 246: 1275;
Caton y Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinax
et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8095;
Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:
2432) y son de utilidad en la invención. Mientras que tales
sistemas de expresión pueden utilizarse para seleccionar hasta
10^{6} elementos diferentes de una biblioteca, realmente no son
adecuados para seleccionar grandes números (superiores a
10^{6}).
De particular utilidad en la construcción de
bibliotecas son sistemas de presentación de selección, que permiten
que un ácido nucleico se una al polipéptido que expresa. Tal como se
utiliza en la presente memoria, un sistema de presentación de
selección es un sistema que permite la selección, mediante medios de
presentación adecuados, de los elementos individuales de la
biblioteca mediante la unión de ligandos genéricos y/o diana.
\vskip1.000000\baselineskip
En la técnica son conocidos protocolos de
selección para aislar elementos deseados de bibliotecas grandes,
tal como se tipifica por técnicas de presentación en fago. Tales
sistemas, en los que se presentan diversas secuencias peptídicas
sobre la superficie de bacteriófago filamentoso (Scott y Smith
(1990) Science, 249: 386), han demostrado ser útiles para
crear bibliotecas de fragmentos de anticuerpo (y las secuencias de
nucleótidos que codifican para ellos) para la selección y
amplificación in vitro de fragmentos de anticuerpo
específicos que se unen a un antígeno diana (McCafferty et
al., documento WO 92/01047). Las secuencias de nucleótidos que
codifican para las regiones V_{H} y V_{L} se unen a los
fragmentos génicos que codifican para las señales líder que las
dirigen al espacio periplásmico de E. coli y como resultado
los fragmentos de anticuerpo resultantes se presentan sobre la
superficie del bacteriófago, normalmente como fusiones a proteínas
de recubrimiento de bacteriófago (por ejemplo, pIII o pVIII). De
manera alternativa, se presentan fragmentos de anticuerpo de manera
externa sobre cápsides de fago lambda (phagebodies). Una
ventaja de los sistemas de presentación basados en fagos es que,
debido a que son sistemas biológicos, pueden amplificarse los
elementos de la biblioteca seleccionados simplemente cultivando el
fago que contienen el elemento de biblioteca seleccionado en células
bacterianas. Además, puesto que la secuencia de nucleótidos que
codifica para el elemento de biblioteca de polipéptidos está
contenida en un vector fagémido o de fago, la secuenciación,
expresión y posterior manipulación genética es relativamente
sencilla.
En la técnica son conocidos bien procedimientos
para la construcción de bibliotecas de presentación de anticuerpos
en bacteriófagos y bibliotecas de expresión en fago lambda
(McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et
al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson
et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991)
Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl.
Acad Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic
Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147:
3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et
al. (1991) citado anteriormente; Barbas et al. (1992)
citado anteriormente; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867;
Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et
al. (1992) Science, 258: 1313, incorporado a la presente memoria
como referencia). Pueden utilizarse técnicas similares para la
generación de bibliotecas de FASTbody según la presente
invención.
Un enfoque particularmente ventajoso ha sido la
utilización de bibliotecas en fago de scFv (Huston et al.,
1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883;
Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87:
1066-1070; McCafferty et al. (1990) citado
anteriormente; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624;
Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Chiswell et
al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992)
J. Biol. Chem., 267). Se han descrito diversas formas de realización
de bibliotecas de scFv presentadas en proteínas de recubrimiento de
bacteriófago. También se conocen mejoras de enfoque de presentación
en fago, por ejemplo tal como se describe en los documentos
WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council et al.) y
documento WO97/08320 (Morphosys), que se incorporan a la presente
memoria como referencia.
Otros sistemas para generar bibliotecas de
polipéptidos implican la utilización de maquinaria enzimática libre
de células para la síntesis in vitro de los elementos de la
biblioteca. En un procedimiento, se seleccionan moléculas de ARN
mediante rondas alternas de selección frente a un ligando diana y
amplificación por PCR (Tuerk y Gold (1990) Science, 249: 505;
Ellington y Szostak (1990) Nature, 346: 818). Puede usarse una
técnica similar para identificar secuencias de ADN que se unen a un
factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen y Bach
(1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry y Joyce (1992) Science,
257: 635; documentos WO92/05258 y WO29/14843). De un modo similar,
puede usarse traducción in vitro para sintetizar polipéptidos
como un procedimiento para generar bibliotecas grandes. Estos
procedimientos que generalmente comprenden complejos de polisomas
estabilizados, se describen adicionalmente en los documentos
WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058 y
WO29/02536. Los sistemas de presentación alternativos que no se
basan en fagos, tales como los dados a conocer en los documentos
WO95/22625 y WO95/11922 (Affymax) utilizan los polisomas para
presentar polipéptidos para la selección.
Aún otra categoría de técnicas implica la
selección de repertorios en compartimentos artificiales, que
permiten la unión de un gen con su producto génico. Por ejemplo, un
sistema de selección en el que los ácidos nucleicos que codifican
para productos génicos deseables, puede seleccionarse en
microcápsulas formadas por emulsiones de agua en aceite se describe
en los documentos WO99/02671, WO00/40712 y Tawfik & Griffiths
(1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Los
elementos genéticos que codifican para un producto génico que
presenta una actividad deseada se compartimentan en microcápsulas y
entonces se transcriben y/o traducen para producir sus productos
génicos respectivos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas.
Posteriormente se clasifican los elementos genéticos que producen
el producto génico que presenta la actividad deseada. Este enfoque
selecciona productos génicos de interés detectando la actividad
deseada mediante una variedad de medios.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden construirse bibliotecas destinadas para
su utilización en la selección usando técnicas conocidas en la
técnica, por ejemplo tal como se expuso anteriormente, o pueden
adquirirse de fuentes comerciales. Una vez se elige un sistema de
vector y se clonan una o más secuencias que codifican para
polipéptidos de interés en el vector de biblioteca, puede generarse
diversidad dentro de las moléculas clonadas llevando a cabo
mutagénesis antes de la expresión; de manera alternativa, las
proteínas codificadas pueden expresarse y seleccionarse, tal como
se describió anteriormente, antes de la mutagénesis y se realizan
rondas adicionales de selección. La mutagénesis de secuencias de
ácido nucleico que codifican para polipéptidos estructuralmente
optimizados se lleva a cabo mediante procedimientos moleculares
convencionales. Es de particular utilidad la reacción en cadena de
la polimerasa, o PCR, (Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol.,
155: 335, incorporado a la presente memoria como referencia). La
PCR, que utiliza múltiples ciclos de replicación de ADN catalizada
por una ADN polimerasa dependiente de ADN, termoestable para
amplificar la secuencia diana de interés, se conoce bien en la
materia. La construcción de diversas bibliotecas de anticuerpos se
ha tratado en Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12,
433-55, y referencias citadas en el mismo.
La PCR se realiza utilizando ADN de molde (por
lo menos 1 fg; de manera más útil, 1-1000 ng) y por
lo menos 25 pmol de cebadores de oligonucleótido; puede ser
ventajoso utilizar una cantidad mayor de cebador cuando el conjunto
de cebadores sea fuertemente homogéneo, ya que cada secuencia está
representada solamente por una pequeña fracción de las moléculas
del conjunto, y las cantidades se vuelven limitativas en los últimos
ciclos de amplificación. Una mezcla de reacción típica incluye: 2
\mul de ADN, 25 pmol de cebador de oligonucleótido, 2,5 \mul de
10X tampón de PCR 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA),
0,4 \mul de dNTP 1,25 \muM, 0,15 \mul (ó 2,5 unidades) de Taq
ADN polimerasa (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada
hasta un volumen total de 25 \mul. Se recubre con aceite mineral
y se realiza la PCR utilizando un ciclador térmico programable. La
duración y temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, así como el
número de ciclos, se ajusta según los requisitos de rigurosidad
vigentes. Los tiempos y la temperatura de apareamiento se determinan
tanto mediante la eficacia con la que se espera que un cebador se
aparee con un molde como el grado de apareamiento erróneo que va a
tolerarse; obviamente, cuando se amplifican y se someten a
mutagénesis moléculas de ácido nucleico, se requiere apareamiento
erróneo, por lo menos en la primera ronda de síntesis. La capacidad
para optimizar la rigurosidad de las condiciones de apareamiento
del cebador resulta evidente para un experto en la materia. Se
utiliza una temperatura de apareamiento de entre 30ºC y 72ºC. La
desnaturalización inicial de las moléculas de molde se produce
normalmente a entre 92ºC y 99ºC durante 4 minutos, seguido por
20-40 ciclos que consisten en desnaturalización
(94-99ºC durante 15 segundos a 1 minuto),
apareamiento (temperatura determinada tal como se trató
anteriormente; 1-2 minutos), y extensión (72ºC
durante 1-5 minutos, dependiendo de la longitud del
producto amplificado). La extensión final es generalmente durante 4
minutos a 72ºC, y puede ir seguida por una etapa indefinida
(0-24 horas) a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los FASTbodies según la presente invención que
presentan una especificidad de unión a ligando definida pueden
construirse y/o seleccionarse a partir de bibliotecas tal como se
describe en la presente memoria. Tales FASTbodies pueden generarse
utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria.
Los ligandos de FASTbody pueden ser sintéticos o
producirse de manera natural. Los ligandos que se producen de manera
natural incluyen anticuerpos, péptidos, otras proteínas incluyendo
por ejemplo hormonas y moléculas de señalización y ácidos
grasos.
Tal como se utiliza en la presente memoria la
expresión "ácido graso" incluye dentro de su alcance derivados,
homólogos, análogos de ácido graso y/o fragmentos de los mismos
siempre que tales derivados, homólogos, análogos y/o fragmentos de
los mismos presenten la actividad requerida de unión a FASTbody y la
correspondiente modulación de unión específica de ligando a un
FASTbody tal como se describe en la presente memoria.
En una realización preferida del aspecto
anterior de la invención, el FASTbody según la presente invención
puede unirse de manera específica a RAS.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden utilizarse o bien proteínas recombinantes
o bien las derivadas de fuentes naturales para generar anticuerpos
utilizando técnicas convencionales, bien conocidas por los expertos
en la materia. Por ejemplo, se administra la proteína (o
"inmunógeno") para sensibilizar a un mamífero tal como un mono,
cabra, conejo o ratón. Los anticuerpos resultantes pueden recogerse
como sueros policlonales, o pueden inmortalizarse células
productoras de anticuerpos de animales sensibilizados (por ejemplo
mediante fusión con una pareja de fusión de inmortalización para
producir un hibridoma), células que entonces producen anticuerpos
monoclonales.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de antígeno se utiliza o bien sola o
bien conjugada con un vehículo convencional con el fin de aumentar
su inmunogenicidad, y se genera un antisuero frente al conjugado
péptido-vehículo en un animal, tal como se
describió anteriormente. El acoplamiento de un péptido con una
proteína vehículo e inmunizaciones pueden realizarse tal como se
describe (Dymecki et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 4815).
Se valora el suero frente a antígeno de proteína mediante ELISA o
de manera alternativa mediante inmunotransferencia de puntos o
manchas (Boersma y Van Leeuwen (1994) J. Neurosci. Methods, 51:
317). Se muestra que el suero reacciona considerablemente con los
péptidos apropiados mediante ELISA, por ejemplo, siguiendo los
procedimientos de Green et al. (1982) Cell, 28: 477.
\vskip1.000000\baselineskip
Se conocen bien técnicas para preparar
anticuerpos monoclonales, y pueden prepararse anticuerpos
monoclonales utilizando cualquier antígeno candidato,
preferentemente unido a un vehículo, tal como se describe por
Arnheiter et al. (1981) Nature, 294, 278. Los anticuerpos
monoclonales se obtienen normalmente a partir de cultivos tisulares
de hibridoma o a partir de fluido ascítico obtenido de animales en
los que se ha introducido el tejido de hibridoma. No obstante,
puede describirse que los anticuerpos monoclonales son "generados
frente a" o "inducidos por" una proteína.
Tras generarse, se somete a prueba la función y
la especificidad de los anticuerpos monoclonales mediante
cualquiera de un número de medios. También pueden utilizarse
procedimientos similares para someter a prueba anticuerpos
recombinantes producidos mediante presentación en fago u otras
tecnologías de selección in vitro. Asimismo pueden
examinarse hibridomas productores de anticuerpos monoclonales (o
sueros policlonales) para determinar la unión de anticuerpos al
inmunógeno. Las pruebas inmunológicas particularmente preferidas
incluyen inmunoensayos unidos a enzimas (ELISA),
inmunotransferencia e inmunoprecipitación (véase Voller, (1978)
Diagnostic Horizons, 2: 1, Microbiological Associates Quarterly
Publication, Walkersville, MD; Voller et al. (1978) J. Clin.
Pathol., 31: 507; patente US reexpedida número 31.006; patente UK
2.019.408; Butler (1981) Methods Enzymol., 73: 482; Maggio, E.
(ed.), (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL) o
radioinmunoensayos (RIA) (Weintraub, B., Principles of
radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986, págs.
1-5, 46-49 y 68-78),
todo para detectar la unión del anticuerpo al inmunógeno frente al
que se ha generado. Resultará evidente para un experto en la materia
que o bien la molécula de anticuerpo o bien el inmunógeno debe
marcarse para facilitar tal detección. Resultarán bien conocidas
para los expertos en la materia técnicas para marcar moléculas de
anticuerpo (véase Harlour y Lane (1989) Antibodies, Cold
Spring Harbor Laboratory, págs. 1-726).
De manera alternativa, pueden utilizarse otras
técnicas para detectar la unión al inmunógeno, confirmando de ese
modo la integridad del anticuerpo que ha de servir o bien como
antígeno genérico o bien como antígeno diana según la invención.
Éstos incluyen procedimientos cromatográficos tales como SDS PAGE,
isoelectroenfoque, inmunotransferencia tipo Western, HPLC y
electroforesis capilar.
Los "anticuerpos" se definen en la presente
memoria como construcciones que utilizan la región de unión
(variable) de tales anticuerpos, y otras modificaciones de
anticuerpos. Por tanto, un anticuerpo útil en la invención puede
comprender anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpo,
agregados de anticuerpos polifuncionales, o en general cualquier
sustancia que comprende uno o más sitios de unión específica de un
anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser fragmentos
tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab')_{2} o cualquier
derivado de los mismos, tales como fragmentos Fv de cadena
sencilla. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser no
recombinantes, recombinantes o humanizados. El anticuerpo puede ser
de cualquier isotipo de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM,
etc. Además pueden utilizarse agregados, polímeros, derivados y
conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea
apropiado.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante los experimentos descritos
anteriormente, se descubrió que la presencia de uno o más ácidos
grasos unidos al FASTbody de la presente invención regula la unión
específica de armazones individuales a su ligando. De manera
específica se ha encontrado que la presencia de uno o más ácidos
grasos seleccionados de entre el grupo constituido por los ácidos
grasos mostrados a continuación en la tabla 2, en el espacio de
unión de ácido graso de un FASTbody según la invención regula la
unión específica del ligando al armazón.
Tal como se utiliza en la presente memoria la
expresión "ácido graso" incluye dentro de su alcance derivados
de ácido graso, homólogos, análogos y/o fragmentos de los mismos,
siempre que tales derivados, homólogos, análogos y/o fragmentos de
los mismos presenten la actividad requerida de unión a FASTbody y la
correspondiente modulación de la unión específica del ligando a un
FASTbody tal como se describe en la presente memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera ventajosa, el ligando es RAS. De
manera más ventajosa, el ligando es RAS y el ácido graso es uno o
más de los enumerados. De manera más ventajosa, el ligando es RAS y
el ácido graso es ácido oleico.
Por tanto, según la presente invención, se
contemplan FASTbodies en los que la afinidad de unión a ligando
puede regularse mediante la unión del FASTbody al ligando en
presencia de uno o más ácidos descritos en la presente memoria.
Además puede realizarse la medición de la unión a ligando del
FASTbody extrapolando el cambio en la disociación de ácido graso
con respecto a la afinidad de unión del FASTbody a ligando.
Los resultados anteriores indican que la
estructura de armazón seleccionada puede compararse con anticuerpos,
comparándose las regiones de bucle individuales con las diferentes
regiones CDR del anticuerpo, especialmente el péptido aleatorizado
de 9 aminoácidos puede compararse con las regiones CDR3 de cadena
pesada, puesto que esta posición en el armazón puede alojar
variaciones significativas en la longitud y estructura sin perturbar
el plegamiento global del armazón.
La nueva característica del presente armazón es
la ausencia de formación de puentes disulfuro para la estabilidad,
haciéndolo particularmente bien adecuado para la selección
intracelular. Se mostró que el agente de unión seleccionado hacia
RAS humano recombinante en ELISA competitivo, competía por la unión
de RAF a RAS. Como una primera prueba del efecto intracelular in
vivo, se expresó el agente de unión de manera intracelular en
Mucor.
Cultivando Mucor que expresa el agente de
unión en condiciones aerobias se observó fenotipo de ramificación
aumentada. Mediante crecimiento anaerobio de las mismas cepas de
Mucor, se observó inhibición del crecimiento. Estos dos
fenotipos se han observado anteriormente en experimentos publicados,
en los que se inhibe la ruta de transducción de señales en la que
RAS toma parte (Lübbehüsen T. et al. 2004). Consideradas
juntas, las nuevas características de la presente invención pueden
usarse de manera ventajosa para diseñar sistemas de validación para
su utilización en combinación con otros sistemas de selección de
alto rendimiento para identificar pequeñas entidades químicas de
valor terapéutico. Se describe detalles de tales procedimientos en
las siguientes patentes y solicitudes que se incorporan a la
presente memoria como referencia: US nº 6.010.861, US nº 6.617.114,
W09954728.
La invención se describirá a continuación en los
ejemplos siguientes que no deben considerarse limitativos de la
invención.
Se amplificó el gen que codifica para la
A-FABP (figura 4) utilizando PCR. Como molde se
utilizó A-FABP en el vector de expresión eucariota
pMT21 (Celis J.E. 1996). Se utilizaron los dos cebadores FABPback y
FABPfor en la amplificación incorporando un sitio NcoI en la parte
N-terminal de FABP y un sitio Not1 en la parte
C-terminal. Además se delecionó la cisteína presente
en el extremo C-terminal de wt
A-FABP.
La amplificación de A-FABP se
realizó utilizando 25 pmol de cada cebador, dNTP 0,2 mM, MgCl_{2}
1,5 mM, 1x tampón de Taq polimerasa (Tris-HCl 20 mM
(pH 8,4), KCl 50 mM) y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa.
Se realizó la reacción de amplificación
utilizando el siguiente perfil de temperatura: 96ºC 5 min.; 20 x
(96ºC 30 s; 55ºC 30 s; 72ºC 1 min.); 72ºC 10 min.
Se purificó el producto de PCR utilizando el kit
de purificación de PCR de Qiagen.
Se digirieron el vector pHEN2 y los productos de
PCR con las enzimas de restricción NcoI y NotI a 37ºC durante la
noche. Tras la purificación en gel se ligó el inserto de
A-FABP en el vector pHEN2 digerido utilizando T4 ADN
ligasa en una reacción convencional (figura 5).
Se sometió a electroporación la ligación en
bacterias electrocompetentes TG-1 y se sembraron en
placa sobre placas de TYE/amp/glu.
Se tomaron y secuenciaron colonias usando M13rev
y M13Back.
En la secuencia de tipo natural de la
A-FABP, una secuencia de reconocimiento de ADN para
la enzima de restricción KpnI está situada 25 nucleótidos antes del
comienzo del motivo de
hélice-bucle-hélice. Con el fin de
introducir sitios de restricción únicos a una distancia cercana a
cualquier sitio de la región de
hélice-bucle-hélice y al mismo
tiempo eliminar el motivo de
hélice-bucle-hélice, se realizó una
reacción de PCR esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1
utilizando el cebador FABPback descrito anteriormente y
El cebador de
hélice-menos-directo introduce
sitios de XhoI y BstEI únicos.
Se purificó el producto de PCR resultante y se
escindió usando KpnI y NotI y se ligó en vector
pHEN2-aFABP (figura 6). Se sometió a electroporación
el ligamiento en TG-1 y se verificó la secuencia
mediante secuenciación de ADN utilizando cebadores M13 rev y M13
Back.
\vskip1.000000\baselineskip
Para crear una biblioteca de 9 aminoácidos
aleatorizada, en la que la región aleatorizada sustituye el motivo
de hélice-bucle-hélice, se digirió
con XhoI y BspEI el pHEN2 descrito anteriormente que contenía la
A-FABP sin hélice.
Se construyó el inserto en una reacción de
extensión en la que se usó oligonucleótido ran9helix sintético como
molde en una PCR de un único sitio.
Se realizó la amplificación de oligonucleótidos
aleatorizados utilizando 25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos
ran9helix y ampran9, dNTP 0,2 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 1x tampón de
Taq polimerasa (Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM)
y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Se realizó la reacción de
amplificación utilizando el siguiente perfil de temperatura: 96ºC 5
min.; 10 x (96ºC 30 s; 55ºC 30 s; 72ºC 1 min.); 72ºC 10 min.
Se purificó el producto de PCR y se digirió
utilizando un exceso de XhoI y BspEI en una reacción durante la
noche tras la que se purificó el inserto en un Microcon 100 para
eliminar los extremos del inserto.
Se realizó el ligamiento utilizando una razón de
inserto con respecto a vector de 10:1. Se extrajo con fenol el
ligamiento y se precipitó con una precipitación con acetato de
sodio/etanol convencional y se disolvió en H_{2}O.
Se sometió a electroporación la mezcla de
ligamiento purificada en TG-1 en 20
electroporaciones independientes, que se mezclaron y se cultivaron
en placa sobre placas de TYE/AMP/glu.
Se realizó una serie de diluciones de 10 veces
con el fin de determinar el número de clones independientes
obtenidos.
La biblioteca de 9 aminoácidos aleatorizada
(figura 7) contenía de 5x10^{6} a 1x10^{7} clones independientes
de los que se eligieron 20 al azar para verificación de
secuencia.
Se cortaron en escarpa las bacterias de las
placas de TYE/AMP/glu grandes añadiendo 3 ml de 2xTY/AMP a cada
placa, obteniendo de ese modo una suspensión. Se reunió el contenido
de todas las placas y se añadió glicerol hasta una concentración
final del 15% antes de su almacenamiento en alícuotas a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de presentar las estructuras de
FASTbody sobre la superficie de bacteriófago filamentosos se
recuperó el fagémido utilizando un fago auxiliar según
procedimientos convencionales.
- 1.
- Se añadieron 500 \mul de reserva de la biblioteca de FASTbody de 9 aminoácidos a 200 ml de 2xTY que contenían ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1%.
- 2.
- Cultivar con agitación a 37ºC hasta que la DO 600 sea de 0,5.
- 3.
- Añadir 1x10^{12} de fago auxiliar KM13 (Kristensen P. 1998)
- 4.
- Incubar sin agitación a 37ºC durante 45 min. y con agitación a 37ºC durante 45 min.
- 5.
- Centrifugar a 3.000 g durante 10 min. Resuspender en 500 ml de 2xTY que contiene ampicilina 100 \mug/ml, kanamicina 50 \mug/ml.
- 6.
- Incubar con agitación a 30ºC durante la noche.
- 7.
- Centrifugar el cultivo durante la noche a 3.300 g durante 30 min.
- 8.
- Añadir 125 ml de PEG/NaCl (Polietilenglicol 6000 al 20%, NaCl 2,5 M) a 500 ml sobrenadante. Mezclar bien y dejar durante 1 h sobre hielo.
- 9.
- Centrifugar a 3.300 g durante 30 min. Separar vertiendo PEG/NaCl. Volver a centrifugar brevemente y aspirar cualquier resto restante de PEG/NaCl.
- 10.
- Resuspender el sedimento en 40 ml de PBS y centrifugar a 11.600 g durante 10 min. en una microcentrífuga para eliminar cualquier residuo bacteriano restante.
- 11.
- Añadir 8 ml de PEG/NaCl, mezclar y dejar sobre hielo durante 1 hora.
- 12.
- Centrifugar a 3.300 g durante 30 min. Separar vertiendo PEG/NaCl. Volver a centrifugar brevemente y aspirar cualquier resto restante PEG/NaCl.
- 13.
- Resuspender el sedimento en 20 ml de PBS y centrifugar a 11.600 g durante 10 min. en una microcentrífuga para eliminar cualquier residuo bacteriano restante.
- 14.
- Añadir glicerol hasta una concentración final del 15% y almacenar a -80ºC en pequeñas alícuotas hasta su utilización.
- 15.
- Para valorar la reserva de fago diluir 1 \mul de fago en 100 \mul de PBS, 1 \mul de éste en 100 \mul de PBS, etc. hasta que hay 6 diluciones en total. Añadir 900 \mul de TG1 a una DO 600 de 0,5 a cada tubo e incubar a 37ºC en un baño de agua durante 30 min. Sembrar en placa cada dilución sobre una placa de TYE que contiene ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1% y cultivar durante la noche a 37ºC. La reserva de fago debe ser de 10^{12}-10^{13}/ml.
Para examinar el potencial para generar agentes
de unión a partir de la biblioteca de FASTbody aleatorizada de 9
aminoácidos, se realizaron selecciones de prueba en la RAS humana
recombinante comercialmente disponible de sigma (R9894). La
selección seguía esencialmente procedimientos convencionales tal
como se describió anteriormente:
- 1)
- Recubrir el tubo para inmunización durante la noche con 4 ml de HCO_{3} 50 mM pH 9,6 que contiene 50 \mug de RAS.
- 2)
- Al día siguiente lavar el tubo 3 veces con PBS
- 3)
- Llenar el tubo hasta su capacidad máxima con MPBS al 2% (leche en polvo desnatada al 2% en PBS). Incubar a t.a. reposando en el banco durante 2 h para bloquear.
- 4)
- Lavar el tubo 3 veces con PBS.
- 5)
- Añadir de 10^{12} a 10^{13} de fago de la biblioteca de FASTbody de presentación en fago en 4 ml de MPBS al 2%. Incubar durante 60 min. a t.a. girando utilizando un soporte giratorio que gira en la vertical y entonces reposar durante 60 min. más a t.a. Desechar el sobrenadante.
- 6)
- Lavar los tubos 10 veces con PBS que contiene Tween 20 al 0,1% y 10 veces con PBS.
- 7)
- Eliminar por agitación el PBS en exceso y eluir el fago añadiendo 500 \mul de tripsina-PBS (50 \mul de disolución madre de tripsina 10 mg/ml añadida a 450 \mul de PBS) y girar durante 10 min. a t.a. utilizando un soporte giratorio que gira en la vertical.
- 8)
- Tomar 10 ml de TG1 a una DO 600 de 0,5 y añadir el fago eluido. Incubar durante 30 min. a 37ºC sin agitación.
- 9)
- Preparar diluciones de 10 veces y cultivar en placa las mismas sobre placas de TYE que contienen ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1%. Se recogen las bacterias restantes mediante centrifugación a 3.000 g durante 10 min., se disuelve el sedimento en 200-500 \mul de medio y se cultivan en placa sobre placas de TYE que contienen ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1%.
- 10)
- Cultivar las placas a 37ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza un ELISA con el fin de identificar
colonias individuales que producen partículas de fago que expresan
la estructura de FASTbody que reconocen RAS:
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Inocular colonias individuales a partir de las placas de la primera ronda de selección en 100 \mul de 2xTY que contiene ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1% en placas de 96 pocillos. Cultivar con agitación (250 rpm) durante la noche a 37ºC.
- 2.
- Utilizar un dispositivo de transferencia de 96 pocillos para transferir un pequeño inóculo desde esta placa hasta una segunda placa de 96 celdas-pocillos que contiene 200 \mul de 2xTY con ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1% por pocillo. Cultivar con agitación (250 rpm) a 37ºC durante 2 h. (Preparar reservas de glicerol de placa de 96 pocillos original, añadiendo glicerol hasta una concentración final del 15%, y luego almacenar las placas a -80ºC).
- 3.
- Tras 2 h de incubación añadir 25 \mul de 2xTY que contiene ampicilina 100 \mug/ml, glucosa al 1% y 10^{9} de fago auxiliar KM13 (Kristensen P. 1998).
- 4.
- Agitar (250 rpm) a 37ºC durante 1 h. Centrifugar a 1.800 g durante 10 min., luego eliminar por agitación el sobrenadante.
- 5.
- Resuspender el sedimento en 200 \mul de 2xTY que contiene ampicilina 100 \mug/ml y kanamicina 50 \mug/ml. Cultivar con agitación (250 rpm) durante la noche a 30ºC.
- 6.
- Centrifugar a 1.800 g durante 10 min. y utilizar 50 \mul del sobrenadante en ELISA de fago.
\vskip1.000000\baselineskip
- 7.
- Se recubre una placa NUNC maxisorp de 96 pocillos durante la noche con 100 \mul de HCO_{3} 50 mM pH 9,6 que contiene 50 ng de RAS por pocillo. Además se recubren dos placas con antígenos no relevantes (ubiquitina y BSA) para comprobar la reactividad cruzada hacia el otro antígeno. También se deja una placa vacía controlando el fago que porta un armazón que se une al agente de bloqueo. Se tratan todas las placas de manera similar a la indicada a continuación
- 8.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS.
- 9.
- Añadir 300 \mul por pocillo de MPBS al 2% (leche desnatada en polvo al 2% en PBS) para bloquear e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
- 10.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS. Añadir 50 \mul de sobrenadante de fago de lo anterior y 50 \mul de MPBS al 4%.
- 11.
- Incubar durante 2 h a temperatura ambiente con agitación. Desechar la disolución de fago y lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,1% y 3 veces con PBS.
- 12.
- Añadir 1 en dilución de 5000 veces de HRP-anticuerpo-anti-M1311 en 100 \mul de MPBS al 2% por pocillo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- 13.
- Lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,1% y 3 veces con PBS
- 14.
- Añadir 100 \mul de disolución de sustrato (4 comprimidos de OPD en 12 ml de H_{2}O y 50 ml de H_{2}O_{2} al 30%).
- 15.
- Detener la reacción añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico 1 M.
- 16.
- Leer la DO a 495 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describió anteriormente se
sometieron a prueba 96 colonias para determinar la unión a RAS,
ubiquitina, BSA y leche desnatada en polvo en PBS. Se aislaron
varios clones positivos, a continuación se representa la unión 4
clones a los 4 antígenos. Los tres clones
2-4-F;
3-12-F;
3-11-E mostraron una unión
específica a RAS (figura 8).
A medida que la producción de partículas de fago
tenía lugar mediante el crecimiento en un extracto de levadura, se
consideró una posibilidad de que los FASTbodies posiblemente podían
unirse a un ácido graso al mismo tiempo que se unían a la RAS
diana.
Puesto que BSA se une de manera natural a ácidos
grasos, se realizó un experimento de ELISA en el que el leche
desnatada en polvo utilizado en las etapas de bloqueo e incubación
descritas en el procedimiento anterior se sustituyó por BSA al 2%.
Si el FASTbody se une a ácidos grasos y esta unión es necesaria para
la unión a la RAS diana, se esperaría una disminución en la unión a
la RAS diana en presencia de BSA. La figura 9 muestra el resultado
del ELISA, especialmente para los clones
2-4-F y
3-11-E, se observa una disminución
en la unión específica a RAS, indicando por tanto que la unión a
RAS se ve influida por la presencia de ácidos grasos en los
FASTbodies.
Basándose en uno de los clones aislados para la
unión a RAS (3-11-E del ejemplo 2,
véase la figura 10 para información de secuencia) se construyó una
nueva biblioteca mediante aleatorización a hebra \beta E y F de
conexión en bucle.
Con el fin de permitir una fácil manipulación
del bucle entre la hebra \beta E y F se introdujo un sitio de
restricción único tras la secuencia de bucle. Junto con la presencia
de un sitio de restricción PstI único delante de la secuencia de
bucle, esto permite una fácil manipulación de la región de
bucle.
Los dos cebadores \beta5\beta6SerS y
FABP545AS se utilizaron en la amplificación. El cebador
\beta5\beta6SerS incorpora un sitio XbaI tras la secuencia de
bucle y al mismo tiempo porta el sitio de restricción PstI
permitiendo la inserción en la estructura principal de FABP. El
cebador FABP545AS está ubicado 142 nucleótidos corriente abajo del
sitio NotI.
Se realizó la amplificación utilizando 25 pmol
de cada cebador, dNTP 0,2 mM, 1x tampón de Pfu polimerasa
(Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM) y 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa. Como molde se utilizó ADN
de fagémido del clon 3-11-E. Se
realizó la reacción de amplificación utilizando el siguiente perfil
de temperatura: 96ºC 5 min.; 20 x (96ºC 30 s; 55ºC 30 s; 72ºC 1
min.); 72ºC 10 min. Se purificó el producto de PCR de 329 pares de
bases y se digirió con las enzimas de restricción PstI y NotI
utilizando condiciones convencionales y se ligó en el fagémido que
codifica para el agente de unión
3-11-E.
Se generaron dos bibliotecas diferentes
insertando 5 y 7 aminoácidos aleatorizados en la E \beta y F
\beta de conexión en bucle.
Se realizaron dos reacciones de PCR utilizando
condiciones convencionales tal como se resumió anteriormente en la
figura 11.
La primera PCR primaria utilizó los cebadores
FABP 61S y \beta5\beta6 AS, amplificando un fragmento que
comenzaba alrededor del sitio HindIII en la secuencia de vector y
que acababa delante del bucle entre la hebra \beta E y F.
La segunda PCR primaria utilizaba los cebadores
FABP545AS y o bien b5b6S R5 o bien b5b6S R7 (introduciendo 5 y 7
residuos aleatorizados respectivamente), amplificando un fragmento
que cubría el bucle que iba a aleatorizarse y que acababa en la
secuencia de vector.
Se purificaron los productos de PCR utilizando
el kit de preparación de PCR de Qiagen según las instrucciones. Se
ensamblaron los fragmentos de PCR en una reacción de PCR secundaria
utilizando los mismos cebadores externos tal como anteriormente
(FABP 61S y FABP 545AS) en condiciones convencionales de PCR.
Se purificó en gel el producto de PCR y se
digirió con las enzimas de restricción PstI y NotI (utilizando
procedimientos convencionales tal como se resumió anteriormente).
Tras el ligamiento en el vector que codifica para el
3-11-E FASTbody se digirió
previamente con las mismas enzimas y se purificó.
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca de segunda generación basada en el
agente de unión 3-11-E a RAS, en la
que la región de bucle que conecta E \beta y F \beta se había
sustituido o bien con 5 o bien 7 aminoácidos aleatorizados, se
seleccionó para la unión a RAS tal como se describió en el ejemplo
2.
Tras la selección se sometieron a prueba 96
colonias para determinar la unión a RAS utilizando un procedimiento
similar al descrito anteriormente en el ejemplo 2.
Para 5 de los FASTbodies que proporcionaban una
señal más fuerte en comparación con el FASTbody original
3-11-E, se examinó adicionalmente la
influencia de añadir ácidos grasos durante las etapas de unión y de
lavado.
- 1.
- Se recubre una placa NUNC maxisorp de 96 pocillos durante la noche añadiendo 100 \mul de leche desnatada en polvo al 2% en PBS en la primera fila. En la segunda fila 100 \mul de HCO_{3} 50 mM pH 9,6 que contiene 50 ng de RAS por pocillo. En la tercera fila 100 \mul de leche desnatada en polvo al 2% y oleato 100 \muM. En la cuarta fila 100 \mul de HCO_{3} 50 mM pH 9,6 que contiene 50 ng de RAS por pocillo y oleato 100 \muM. La quinta fila 100 \mul de leche desnatada en polvo al 2% y oleato 100 mM. Y finalmente en la sexta fila 100 \mul de HCO_{3} 50 mM pH 9,6 que contiene 50 ng de RAS por pocillo y oleato 100 \muM.
- 2.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS. El PBS utilizado para lavar las filas 5 y 6 además contenía oleato 100 \muM.
- 3.
- Añadir 300 \mul por pocillo de MPBS al 2% (leche desnatada en polvo al 2% en PBS) para bloquear e incubar durante 2 h a temperatura ambiente. La disolución de bloqueo utilizada para la serie 5 y 6 contenía oleato 100 \muM.
- 4.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS de nuevo lavar la fila 5 y 6 con PBS que contiene oleato 100 \muM. Añadir 50 \mul de sobrenadante de fago de lo anterior y 50 \mul de MPBS al 4%, añadir oleato hasta 100 \muM en la fila 5 y 6.
- 5.
- Incubar durante 2 h a temperatura ambiente con agitación. Desechar la disolución de fago y lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,1% y 3 veces con PBS. De nuevo los tampones utilizados para la fila 5 y 6 contenían oleato 100 \muM.
- 6.
- Añadir dilución de 1 en 5000 de HRP-anticuerpo-anti-M1311 en 100 \mul de MPBS al 2% por pocillo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente, incubar la fila 5 y 6 en presencia de oleato 100 \muM.
- 7.
- Lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,1% y 3 veces con PBS con oleato 100 \muM añadido a las disoluciones de lavado para la fila 5 y 6.
- 8.
- Añadir 100 \mul de disolución de sustrato (4 comprimidos OPD en 12 ml de H2O y 50 ml de H_{2}O_{2} al 30%).
- 9.
- Detener la reacción añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico 1 M.
- 10.
- Leer la DO a 495 nm
Los resultados del ELISA se muestran en la
figura 12 e indican claramente que la aleatorización del bucle que
conecta la hebra b E y F da como resultado en FASTbodies con una
capacidad de unión aumentada a RAS utilizada en la selección. Para
algunos de los agentes de unión existe una clara influencia sobre la
adición de oleato en el experimento de ELISA, estableciendo por
tanto que la unión de FASTbodies al ligando está modulada por la
presencia de ácidos grasos libres en el experimento.
Se analizaron adicionalmente todos los clones
mediante secuenciación de ADN utilizando procedimiento convencional.
Las secuencias de bucle de los FASTbodies aislados se muestran en la
figura 13. Todas las secuencias son diferentes y pueden obtenerse
agentes de unión a partir de la biblioteca aleatorizada de 5
aminoácidos y la biblioteca aleatorizada de 7 aminoácidos.
Para permitir pruebas de las propiedades de
unión de los agentes de unión aislados, se clonaron los agentes de
unión en el vector de expresión pET-11d.
El vector de expresión pET-11d
se había modificado previamente para contener un sitio NotI seguido
por etiqueta myc y una etiqueta his, permitiendo por tanto que se
clonara el agente de unión como un fragmento de NcoI/NotI (figura
13).
Los FASTbodies pueden subclonarse en el vector
pET-11d modificado digiriendo el vector pHEN2 que
porta el FASTbody con las enzimas de restricción NcoI y NotI. El
fragmento de ADN es el purificado en gel y ligado en el vector
pET-11d modificado digerido previamente con las
mismas enzimas. El ligamiento sigue protocolos convencionales. El
ligamiento es el transformado en cepas de E. Coli con una T7
ADN polimerasa bajo el control de un promotor de lacZ, tal como
ER2566 (novagen).
Se tomaron clones de placas TYE, se cultivaron
durante la noche a 37ºC en 2xTY complementado con ampicilina 100
\mug/ml y glucosa al 1%, antes de la dilución 1:100 en 2xTY con
ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 0,1% y se incubaron durante
cuatro horas a 37ºC con agitación (la DO600 debe ser de
aproximadamente 0,7-0,9). Se indujeron los cultivos
mediante la adición de IPTG 1 mM y se cultivaron durante la noche a
temperatura ambiente. Se sedimentaron las células a 6000xg y se
resuspendieron en Na_{x}H_{y}PO_{4} 50 mM pH 8,0 antes de la
lisis en prensa francesa (American Instruments Co., inc. Silver
Spring, MD, EE.UU.). Se aclaró la suspensión posteriormente
mediante centrifugación (26000xg) y se complementó el sobrenadante
con imidazol 30 mM y NaCl 300 mM antes de someterse a cromatografía
de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Se incubó
Ni-NTA con el sobrenadante durante 2 horas a 4ºC, y
posteriormente se lavó un mínimo de 100 ml de tampón de lavado
(Na_{x}H_{y}PO_{4} 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 30 mM)
seguido por 50 ml de tampón de lavado altamente salino
(Na_{x}H_{y}PO_{4} 50 mM pH 8,0, NaCl 750 mM, imidazol 30 mM).
Se eluyó la proteína con tampón de lavado complementado con
imidazol hasta 300 mM. Se determinó la concentración de proteína
Bradford y se analizó la pureza mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE).
Para establecer la actividad biológica de la
expresión de un FASTbody que se une a RAS se introdujo de manera
intracelular la unión a RAS (Appel K.F. et al 2004 y figura
15 y figura 16) digiriendo el vector pHEN2 que porta el FASTbody
con la enzima de restricción NcoI según
3-11-E
89-8-E en el vector
pEUKA7-kan mediante procedimientos convencionales
tal como se describió anteriormente. Se trató el plásmido
linealizado con T4 ADN polimerasa para crear un extremo romo según
las instrucciones del fabricante. Después de esto se generó el
fragmento de ADN que codificaba para el FASTbody escindiendo con la
enzima de restricción NotI en una reacción convencional y se
purificó en gel el fragmento de ADN antes del ligamiento en el
vector pEUKA7-Kan.
Se realizaron la formación y transformación de
protoplastos tal como se describió anteriormente (Appel K.F. et
al. 2004) con las siguientes modificaciones. Se prepararon
protoplastos mediante tratamiento enzimático de líneas germinales
con una mezcla de 125 \mug de quitosanasa-RD (US
Biological, MA, US) y 5 U de quitinasa (de Streptomyces
griseus, Sigma) en un volumen final de 2 ml. Se llevó a cabo la
digestión de la pared celular durante 2-3 h a 28ºC.
Normalmente, se usaron 1-10 \mug de ADN por
transformación. Se seleccionaron los transformantes en medio YNB.
Las cepas de transformante de Mucor KFA143 en las que se
sustituye el FASTbody por el gen de kanamicina sirvieron como
control.
Se cultivaron cepas de Mucor
transformadas en condiciones aerobias o anaerobias respectivamente
(figura 17). Cuando se cultivó Mucor en condiciones aerobias
se observó un aumento marcado de ramificación, se ha obtenido un
fenotipo que se asemeja a los otros fenotipos cuando se expresa
Mucor en el que se ha mutado el gen de RAS. Cuando se
cultivó en condiciones anaerobias se observó poco o nada de
crecimiento, también en línea con estudios previos de otros. En
conclusión, existe un efecto marcado sobre el fenotipo cuando se
expresan FASTbodies que se unen a las proteínas RAS de manera
intracelular en Mucor.
\vskip1.000000\baselineskip
Se creó una biblioteca de fragmentos génicos
sintéticos que codificaban las regiones del sitio PstI y para el
sitio NotI del FASTbody mediante ensamblaje de oligonucleótidos tal
como se describe a continuación. La biblioteca de fragmentos
génicos sintéticos da como resultado la aleatorización de las
regiones de bucle que conectan hebra \beta E-F,
hebra \beta G-H, hebra \beta I-J
(figura 18). La biblioteca de fragmentos génicos sintéticos se
combinó entonces con la biblioteca descrita en el ejemplo 1, creando
juntas una biblioteca de FASTbodies totalmente aleatorizada.
Se ensamblaron los 8 oligonucleótidos sintéticos
Proampfor; ProRan1; Profor 1.2; ProRan 2; Profor 3.2; ProRan3;
Profor 5 y Proampback realizando 10 reacciones de ensamblaje
conteniendo cada una 10 pmol de cada oligonucleótido y dNTP 0,2 mM,
MgCl_{2} 1,5 mM, 1x tampón de Taq polimerasa
(Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM) y 2,5 unidades
de Taq ADN polimerasa. Se incubaron las reacciones de ensamblaje con
el siguiente perfil de temperatura durante 5 ciclos (96ºC 30 s;
50ºC 30 s; 72ºC 1 min.) seguido por incubación a 72ºC durante 10
min. Con el fin de amplificar los fragmentos génicos ensamblados se
añadieron 25 pmol de cada uno de los cebadores Proampfor y
Proampback a cada reacción y se realizó la amplificación en 10
ciclos con el siguiente perfil (96ºC 30 s; 55ºC 30 s; 72ºC 1 min.) y
finalmente se extendió a 72ºC durante 10 min.
Se purificaron en gel los fragmentos génicos
resultantes utilizando el kit de purificación en gel de Qiagen y se
digirieron con las enzimas de restricción PstI y NotI utilizando
condiciones convencionales. Se purificó plásmido de la biblioteca
de FASTbody preparada tal como se describió en el ejemplo 1 a partir
de 200 ml de cultivo de TG-1 utilizando el kit de
preparación Midi-plasmid de Qiagen según las
instrucciones del fabricante y se digirió el plásmido utilizando
PstI y NotI utilizando procedimientos convencionales. Se purificó en
gel el vector pHEN2 que contenía parte del gen de FASTbody que
portaba la secuencia de 9 aminoácidos aleatorizada y se llevó a
cabo la optimización de reacciones de ligamiento utilizando T4 ADN
ligasa en condiciones convencionales. Se sometió a electroporación
la biblioteca de FASTbodies aleatorizada total ligada resultante en
TG-1 y se recuperó la biblioteca esencialmente tal
como se describe en el ejemplo 1 para la biblioteca de 9
aminoácidos, dando como resultado una biblioteca de FASTbody que
contenía 2x10^{7} secuencias diferentes tal como se estimó a
partir del número de clones obtenidos de la reacción de
ligamiento.
\newpage
Se usó la biblioteca de FASTbody aleatorizada
total descrita en el ejemplo 7 para seleccionar agentes de unión
frente a RAS tal como se describió en el ejemplo 2 siendo la única
modificación que se añadió oleato 0,1 mg/ml a todos los
tampones.
Se obtuvieron 2x10^{5} colonias tras cuya
selección se tomaron 96 y se realizó una recuperación monoclonal con
el fin de realizar ELISA tal como se describió en el ejemplo 2 con
la única modificación de que se añadió oleato 0,1 mg/ml a todos los
tampones.
Tal como se muestran en la figura 19 había por
lo menos 13 clones positivos cuando se tomaba como positivo una
puntuación por encima de 0,08 como medida mediante absorbancia a 490
nm.
Describiéndose haciendo referencia a las formas
de realización preferidas específicas, debe apreciarse que la
invención tal como se reivindica no debe limitarse de manera
indebida a dichas formas de realización específicas.
Claims (16)
1. Armazón proteico de unión a ácidos grasos,
denominado FASTbody, que puede unirse específicamente a uno o más
ligandos, derivándose dicho armazón de una proteína de unión a
ácidos grasos intracelular eucariota y comprendiendo dicho armazón
un polipéptido de cadena sencilla con las propiedades estructurales
siguientes:
- (a)
- el armazón contiene 10 hebras \beta, denominadas ABCDEFGHI y J, conectadas mediante regiones de bucle que determinan la especificidad de unión a ligando, en el que las hebras \beta forman juntas una estructura de almeja \beta; y en el que
- (b)
- las regiones de bucle que conectan \beta-A y \beta-B; \beta-C y \beta-D; \beta-E y \beta-F; \beta-G y \beta-H; \beta-I y \beta-J se ubican en el mismo sitio de la estructura de almeja \beta; en el que el armazón de unión a ácidos grasos no contiene ninguna cisteína que forme puentes disulfuro; en el que el armazón no comprende un motivo de hélice-bucle-hélice.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Armazón de unión a ácidos grasos según la
reivindicación 1, que está constituido por un polipéptido de cadena
sencilla con las propiedades estructurales siguientes:
- (a)
- el armazón contiene 10 hebras \beta, denominadas ABCDEFGHI y J, conectadas mediante regiones de bucle que determinan la especificidad de unión a ligando, en el que las hebras \beta forman juntas una estructura de almeja \beta; y en el que
- (b)
- las regiones de bucle que conectan \beta-A y \beta-B; \beta-C y \beta-D; \beta-E y \beta-F; \beta-G y \beta-H; \beta-I y \beta-J se ubican en el mismo sitio de la estructura de almeja \beta; en el que el armazón de unión a ácidos grasos no contiene ninguna cisteína que forme puentes disulfuro; en el que el armazón no comprende un motivo de hélice-bucle-hélice.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento para generar un armazón
proteico de unión a ácidos grasos tal como se definió en la
reivindicación 1, denominado FASTbody, que se deriva de una proteína
intracelular eucariota y comprendiendo dicho procedimiento:
- (a)
- proporcionar una proteína de unión a ácidos grasos de cadena polipeptídica sencilla, o el ácido nucleico que la codifica; y
- (b)
- aleatorizar el motivo de hélice-bucle-hélice, o el ácido nucleico que lo codifica.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según la reivindicación 3, que
comprende una etapa adicional (c), en el que se aleatorizan una o
más regiones de bucle que conectan hebras \beta denominadas A, B,
C, D, E, F, G, H, I y/o J, o el ácido nucleico que las codifica.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que se aleatoriza la región de bucle que conecta las hebras
\beta B y E.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que se aleatorizan las regiones de bucle que conectan
\beta-E y \beta-F,
\beta-G y \beta-H y
\beta-I y \beta-J.
7. Armazón proteico de unión a ácidos grasos,
denominado FASTbody, que se deriva de una proteína intracelular
eucariota que puede obtenerse según el procedimiento según
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Constructo de ácido nucleico que codifica
para un armazón proteico de unión a ácidos grasos, denominado
FASTbody, según la reivindicación 1 ó 2.
9. Vector que comprende un constructo de ácido
nucleico según la reivindicación 8.
10. Célula huésped que comprende un vector según
la reivindicación 9.
11. Procedimiento para cambiar la especificidad
de unión a ligando de un armazón de unión a ácidos grasos,
denominado FASTbody, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
- (a)
- proporcionar un armazón de unión a ácidos grasos según la reivindicación 1 ó 2, y
- (b)
- aleatorizar uno o más bucles que conectan las hebras \beta denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, I y J.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Biblioteca de armazones proteicos de unión a
ácidos grasos, denominados FASTbodies, según la reivindicación 1 ó
2.
\newpage
13. Procedimiento para seleccionar un armazón de
unión a ácidos grasos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7, armazón que puede unirse a un ligando definido, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas que consisten en:
- (a)
- proporcionar una biblioteca de proteína de unión a ácidos grasos, denominada FASTbody, según la reivindicación 12;
- (b)
- someter a prueba la capacidad de la biblioteca según la etapa (a) para unirse al ligando definido; y
- (c)
- seleccionar los armazones de unión a ácidos grasos según la etapa (b) que pueden unirse al ligando definido.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Utilización de un ácido graso en la
modulación de la unión de ligando específico a uno o más FASTbodies
según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
15. Utilización de un ácido graso en la
monitorización de la unión de ligandos específicos a uno o más
FASTbodies según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
16. Procedimiento de identificación de un
candidato a fármaco potencial que puede desplazar la unión de un
FASTbody según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 a la diana,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
- (a)
- proporcionar una biblioteca de FASTbodies según la reivindicación 12,
- (b)
- proporcionar una muestra de uno o más candidatos a fármaco; y
- (c)
- explorar la biblioteca para determinar la capacidad del uno o más candidatos a fármaco para desplazar la unión de uno o más FASTbodies dentro de la biblioteca según la etapa (a).
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