ES2345712T3 - Parejas de union especifica de holo-transcobalaminas y su uso en el ensayo de la cobalamina. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar parejas de unión específica para la holoTC, que tengan una mayor especificidad para la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, que comprende seleccionar un banco de ligantes específicos potenciales con al menos un péptido cíclico que comprende el motivo SX1 X2YX3 WD X4 X5 X6 en el que: X1 = F, G, L X2 = F, L, R X3 = L, P, Q X4 = M, Q, Y X5 = D, F X6 = M, R o el motivo SFFYSLCYCW, sus construcciones, o construcciones de al menos una de las regiones I a III de la TC humana como se define a continuación: I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269 II) Ile 161 a Val 243 III) Arg 271 a Asp 297; en el que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo.

Description

Parejas de unión específica de holo-transcobalaminas y su uso en el ensayo de la cobalamina.

La presente invención se refiere a un método para ensayar la holotranscobalamina (holoTC) en muestras de origen biológico, en especial de mamífero, y a parejas de unión específica ("specific binding partners", sbp) para la transcobalamina (TC) para su uso en dichos ensayos, así como a su producción.

La holoTC es el complejo entre la cobalamina y su proteína transportadora sérica transcobalamina.

La cobalamina o vitamina B_{12} es un vitamina hidrosoluble que forma parte del complejo de la vitamina B que se encuentra en los alimentos. La molécula central consiste en un anillo de corrina de cuatro unidades pirrol que rodean a un átomo de cobalto. La cobalamina es la única vitamina que no puede ser sintetizada por los animales y debe ser absorbida desde los alimentos en el intestino. Es sintetizada por microorganismos, en particular por bacterias anaerobias y levaduras.

La cobalamina actúa in vivo como coenzima, y se sabe que las enzimas de cobalamina catalizan tres tipos de reacciones: (1) redisposiciones intramoleculares, por ejemplo la formación de succinil CoA a partir de L-metilmalonil CoA; (ii) metilaciones, por ejemplo la formación de metionina mediante la metilación de la homocisteína; y (iii) la reducción de ribonucleótidos para producir desoxirribonucleótidos en algunos microorganismos. También se cree que la deficiencia en cobalamina puede alterar la regulación de las citoquinas y del factor del crecimiento (véase Miller, Nutrition Review, 60:142-144 (2002), y Scalabrino et al., J. Neuroimmunology, 127:37-42 (2002)).

En el proceso de la digestión, la cobalamina, liberada de los alimentos mediante su cocinado o mediante el entorno ácido del estómago, es unida por una proteína salivar denominada haptocorrina, en lo sucesivo denominada HC (pero en la técnica también se denomina R-ligante o transcobalamina I y II colectivamente), para formar un complejo. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo de cobalamina-haptocorrina, la holohaptocorrina (holoHC), en el íleon, liberando cobalamina que entonces se une a una proteína denominada factor intrínseco, que es segregada por la mucosa gástrica, para formar otro complejo. El complejo de cobalamina-factor intrínseco se une a un receptor específico en el revestimiento del íleon terminal, tras lo cual es disociado por un factor de liberación y la cobalamina es transportada activamente a través de la membrana del íleon y se secreta hacia la corriente sanguínea unida a su proteína transportadora transcobalamina (TC).

Debe reconocerse que la TC se ha denominado en el pasado transcobalamina II (TCII). En la presente se utiliza TC, apoTC y holoTC para indicar TCII, apo-TCII y holo-TCII, respectivamente.

La cobalamina no circula en la sangre en forma libre en ninguna cantidad apreciable. Aproximadamente 99% de la cobalamina es unida por uno de HC, TC y albúmina.

La proteína responsable de transportar la cobalamina hacia los tejidos diana es la TC. La TC es una proteína traza fundamental sin la cual la cobalamina no puede atravesar las membranas celulares. A pesar de esta importante función metabólica, sólo aproximadamente 6-25% de la cobalamina en el suero está unida a TC y la mayoría es portada por HC. La TC es un polipéptido de una única cadena de 45 kDa que se encuentra principalmente en el suero, el fluido seminal y el fluido cerebroespinal. La cobalamina unida a TC (holo-TC) se une a receptores específicos sobre las membranas celulares y, una vez unida, el complejo de holo-TC se introduce en las células mediante pinocitosis.

La TC es sintetizada por el hígado, el endotelio vascular, los enterocitos, los macrófagos y los fibroblastos, y circula predominantemente como apo-TC, es decir, sin cobalamina unida. Tiene una semivida corta de aproximadamente 90 minutos.

Se cree que la secuencia de aminoácidos de la TC humana es la siguiente:

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Los primeros 18 aminoácidos, que aparecen en cursiva, son una secuencia conductora que no se encuentra en la proteína madura que circula en la sangre. Además, existe un serie de polimorfismos conocidos, de los cuales la sustitución de la arginina, en lugar de la prolina, en la posición 259 (que aparece en negrita) (SEQ ID NO:2) es el más habitual y es igualmente abundante que la secuencia mostrada. Otros polimorfismos descritos son M198T, I219L, Q234R y S376L.

Puesto que la cobalamina debe absorberse de los alimentos, cualquier trastorno que produzca una función gástrica mermada, por ejemplo la gastroenteritis, o trastornos que produzcan atrofia gástrica, o una incapacidad para producir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor de liberación, TC o receptores de TC puede dar como resultado una captación mermada de cobalamina y su deficiencia resultante.

Ciertos subgrupos de población, por ejemplo los ancianos, las mujeres embarazadas, los pacientes con enfermedad gastrointestinal crónica o aguda, los que padecen ciertas enfermedades autoinmunológicas, los que tienen una historia familiar de anemia perniciosa, y los que padecen SIDA, son particularmente propensos a una deficiencia en cobalamina.

Las manifestaciones clínicas de la deficiencia en cobalamina son variadas y numerosas, pero principalmente implican anemia, hematopoyesis megaloblástica y trastornos funcionales y estructurales del sistema nervioso. Aproximadamente 60% de los individuos diagnosticados como deficientes en cobalamina son anémicos, pero en muchos, los síntomas neurológicos son las únicas señales clínicas observadas. Aproximadamente 10% de los pacientes muestran síntomas psiquiátricos y aproximadamente 40% muestran síntomas neurológicos y psiquiátricos.

El diagnóstico temprano de la deficiencia en cobalamina es fundamental para asegurar una buena prognosis para los pacientes, puesto que algunas de las manifestaciones de la deficiencia en cobalamina, en particular los efectos neuropsiquiátricos, son irreversibles si no se detectan y se alivian rápidamente con una terapia con cobalamina.

Por tanto, resulta deseable evaluar de forma precisa el nivel de cobalamina de un individuo de una manera conveniente y eficaz, para establecer si el individuo puede o no estar sufriendo una deficiencia en cobalamina. Puesto que la TC es la responsable de transportar la cobalamina hacia el interior de las células, el contenido en holoTC de una muestra corporal proporciona un mejor indicador de la deficiencia en cobalamina que el contenido total en cobalamina.

Debido a que la holoTC está presente en fluidos corporales en concentraciones tan bajas, los métodos de ensayo previos no han sido en general totalmente satisfactorios. Un paciente con un nivel sérico en holoTCII en el extremo más bajo del intervalo normal tiene, de forma típica, una concentración sérica de holoTCII de aproximadamente 30 x 10^{-12} M, y los ensayos convencionales basados en la absorción física de TC sobre un sustrato sólido, por ejemplo sílice, tienen un límite inferior de detección de aproximadamente 40 x 10^{-12} M. Por tanto, estos ensayos tienen un valor relativamente bajo para la evaluación de la deficiencia en holo-TCII (véase Wickramasinghe et al., J. Clin. Path., 49:755-758 (1996)).

En el documento WO00/17659, se propuso emplear parejas de unión específica (sbp) para TCII u holo-TCII en un método de ensayo para la holo-TCII, proporcionando con ello un método de ensayo de holo-TCII que puede adaptarse con más facilidad a su automatización y a los requisitos de un laboratorio analítico con alta capacidad de procesamiento.

Los inventores han descubierto ahora un epitopo concreto de la holoTC para el cual pueden generarse sbp que presenten una excelente discriminación entre apoTC y holoTC. Además, mediante la creación de un "mimotopo" de péptido cíclico que imita al epitopo de holoTC, también se pueden producir sbp que permiten obtener un método de ensayo para holoTCII que sea muy susceptible a su automatización y a su uso en ensayos de alta capacidad de procesamiento.

Para métodos de ensayo que puedan adaptarse con facilidad a las principales plataformas automáticas, por ejemplo Centaur® (Bayer, Alemania), Elecsys® (Roche), o Axysm® (Abbott), son necesarios sbp para holoTC. Sin embargo, aún no se han descrito sbp que discriminen entre apoTC y holoTC, necesarios para estos formatos de ensayo. Los métodos de ensayo que emplean parejas de unión específica a TC son adecuados para su automatización pero requieren más etapas para separar y medir el contenido en holoTC, lo cual hace que los métodos sean más difíciles de automatizar y reduce el número de plataformas comerciales que puedan comercializar con éxito el ensayo.

Sólo existen unos pocos informes en la bibliografía acerca de anticuerpos policlonales con afinidades por la TC humana (véase Morelli et al., J. Lab. Clin. Med., 89:645-652 (1976); vanKapel et al., Biochem. Biophys. Acta, 676:307-313 (1981); Quadros et al., J. Biol. Chem., 261:15455-15460 (1086); y Nexø et al., Clin. Chem., 46:1643-1649 (2000)), y hay todavía menos informes en la bibliografía acerca de anticuerpos monoclonales con afinidad por la TC humana (véase Carmel et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 188:77-81 (1988); y McLean et al., Blood, 89:235-242 (1997)). Ninguno de estos autores indican que hayan descubierto ligantes que discriminen entre apoTC y holoTC. Quadros (Biochem. Biophys. Res. Comm., 222:149-154 (1996)) utilizó anticuerpos que bloqueaban la unión de la cobalamina a apoTC para estudiar el transporte de cobalamina hacia el interior de las células.

De hecho, no está totalmente claro si las diferencias en las propiedades fisicoquímicas entre la apoforma y la holoforma de la transcobalamina son suficientes para permitir el desarrollo de anticuerpos o de otras sbp, específicos para una sola de las formas. De hecho, los informes que indican que el receptor de holoTC natural también une a apoTC con alta afinidad (véase Nexø et al., Biochem. Biophys. Acta, 628:190-200 (1980), y el hecho de que no se hayan indicado anticuerpos específicos de holoTC, sugieren que, en la práctica, puede que no sea posible producir estas sbp.

Las sbp (es decir, los ligandos de unión específica), como por ejemplo anticuerpos, tienen dos propiedades particulares que tienen gran importancia en la susceptibilidad de su uso en ensayos como los de la presente invención. Éstas son su afinidad y su especificidad. Las afinidades de los anticuerpos varían de aproximadamente 10^{7} a aproximadamente 10^{11} M^{-1}, y otras sbp pueden mostrar afinidades dentro de un intervalo similar. Los anticuerpos de alta afinidad (>10^{9} M^{-1}) en general se prefieren en la técnica para los ensayos de diagnóstico, porque permiten la captura de analitos a concentraciones bajas.

El hecho de que pueda encontrarse una sbp de alta afinidad para un analito concreto depende intrínsecamente de la carga superficial y de la topología del analito. Si existen motivos adecuados (epitopos), entonces los ligantes de anticuerpos, peptídicos, oligoméricos de ADN/ARN o de compuestos químicos orgánicos que se correspondan con ese motivo pueden generarse mediante métodos convencionales. Así, por ejemplo, cuando se ha identificado un anticuerpo de alta afinidad para un epitopo concreto, esto indica que pueden encontrarse sbp de otro tipo con afinidad para ese epitopo. La afinidad depende de la naturaleza intrínseca del epitopo y del grado de correspondencia entre el epitopo y el sitio de unión de la sbp (a veces denominado paratopo).

La segunda propiedad importante que muestran las sbp es la especificidad. Es la capacidad que tiene una sbp para reconocer a su pareja de unión hasta la exclusión de otras moléculas que se encuentren en la muestra que se está ensayando. Esto depende, de forma típica, de cuál es el epitopo de una molécula que es reconocido por la sbp, de hasta qué punto es exclusivo es este epitopo para la molécula de analito, y de hasta qué punto se corresponde exactamente el sitio de unión de la sbp. Puesto que se requiere una región de unión que tenga una alta correspondencia con la carga y la topología del analito para las sbp de alta afinidad y de alta especificidad, las sbp con alta especificidad en general también tienen alta afinidad.

El método mediante el cual se identifican las sbp se basa, de forma típica, en rondas repetidas de selección bajo condiciones cada vez más rigurosas para identificar sbp con afinidad muy alta por su pareja de unión. Esto identifica sbp de unión extremadamente fuerte y se supone que el ligando de unión más fuerte será el más específico y mostrará la mayor discriminación.

Por contraste con las técnicas habituales, los inventores han seleccionado anticuerpos de baja afinidad y los han estudiado. De manera sorprendente, mediante este método se han identificado anticuerpos que muestran una buena especificidad por la holoTC frente a la apoTC. Estos anticuerpos pueden utilizarse en ensayos de holoTC y para la identificación de "mimotopos" que imitan el epitopo de holoTC específico, a partir de los cuales pueden generarse otros ligandos específicos de holoTC, incluyendo los que tienen alta afinidad y también alta especificidad. Los anticuerpos y los generados a partir del mimotopo a su vez pueden utilizarse para identificar (de modo experimental o informático) el epitopo en la holoTC que confiere la especificidad.

El anticuerpo principal identificado se denomina en la presente "3C4" y muestra una especificidad mayor al menos en 70 veces por la holoTC frente la apoTC. El anticuerpo "3C4" tiene una afinidad relativamente débil (Ka<10^{7} M^{-1}).

En un primer aspecto, la presente invención por tanto proporciona una pareja de unión específica para la holoTC, como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, que tiene una especificidad mayor por holoTC frente a apoTC en al menos 40 veces, preferiblemente en al menos 50 veces, y lo más preferiblemente en al menos 70 veces (por ejemplo, en 100 veces o más).

La sbp preferiblemente muestra la anterior discriminación entre apo/holo en el caso de apo/holoTC nativas y apo/holoTC recombinantes. Más preferiblemente, la especificidad entre la apoTC y la holoTC nativas humanas es al menos tan grande como entre la apoTC y la holoTC recombinantes.

Los inventores han descubierto que existen al menos 7 epitopos sobre la TC humana y, de éstos, al menos uno (denominado en la presente epitopo 4) aparece en holoTC pero no en apoTC. Además, se ha descubierto que el epitopo 4 está presente sólo en la proteína no reducida (es decir, no desnaturalizada) y no en la proteína reducida (desnaturalizada), lo cual indica que el epitopo 4 es un epitopo conformacional o discontinuo.

Los epitopos conformacionales son regiones antigénicas que consisten en restos que están muy espaciados en la secuencia primaria (lineal) de la proteína pero que se aproximan mucho cuando la proteína se pliega. Estos epitopos no pueden deducirse, predecirse ni modelarse a partir del conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína, porque no tienen correlación con ella. Este epitopo sólo existe en la conformación tridimensional de la proteína.

La composición y la secuencia de los aminoácidos que comprende un epitopo conformacional específico sólo pueden deducirse en la actualidad a partir del conocimiento de la estructura cristalina de la proteína. Sin embargo, no se determinado ninguna estructura cristalina de la holoTC o TC humanas, ni de ninguna proteína transportadora de cobalamina de cualquier especie. Sólo se ha publicado un informe preliminar sobre la cristalización de la TC humana, que indica que la TC humana cristaliza como dos moléculas independientes en una unidad asimétrica que no es muy adecuada para un análisis de difracción de rayos X (véase Garau et al., Acta Cryst., D57:1890-1892 (2001)). Por tanto, en la actualidad no es posible determinar el epitopo exacto de un anticuerpo específico de la conformación para TC. Estos datos preliminares además indican que una estructura cristalina verdadera, de alta definición, de la TC human puede ser imposible de generar con los métodos actuales.

Sin embargo, los presentes inventores han identificado, de modo sorprendente, ciertos aminoácidos y regiones de aminoácidos de la secuencia de TC que pueden proporcionar la región epitópica del epitopo 4, como se describe en la presente.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona una pareja de unión específica, según se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, para la holoTC que se une al menos a un punto en al menos una de las regiones I, II o III de la TC humana;

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297 (o preferiblemente Lys 296).

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Preferiblemente, la pareja de unión específica para la holoTC se unirá a cada una de las regiones I y II, a cada una de las regiones II y III, o a cada una de las regiones I y III. Lo más preferiblemente, la pareja de unión específica se unirá a cada una de las regiones I, II y III.

En la secuencia de TC humana más habitual, las regiones I a III tendrán las secuencias:

2

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Los restos aminoácidos que se cree que son significativos se indican en negrita.

Más preferiblemente, la regiones I a III tendrán las secuencias que aparecen a continuación.

En la secuencia de TC humana más habitual, estas regiones tendrán las secuencias:

3

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Los restos aminoácidos que se cree que son muy significativos se indican en negrita.

Cuando en la presente una pareja de unión o ligando se describe como que se une a una región de una proteína, como TC, esto indica que existe al menos una interacción entre la pareja de unión y al menos un aminoácido en la región. Es raro que todos los aminoácidos en una región contribuyan a la unión del ligando, pero preferiblemente la unión indicará que el ligando y al menos dos aminoácidos en la región interaccionan, más preferiblemente tres, cuatro, cinco o más aminoácidos en la región (por ejemplo, 8 ó 10) interaccionan con el ligando. Las interacciones pueden medirse, por ejemplo, estudiando la estructura del ligando cuando está cristalizado o modelado con la proteína. Unas distancias menores que aproximadamente 0,5 nm se consideran, de forma típica, que indican interacciones.

Los ligandos de unión específica preferidos para TC interaccionan con las regiones I a III mediante al menos uno de los restos significativos indicados en negrita anteriormente. Más preferiblemente, los ligandos de unión específica para TC interaccionan con las regiones I a III mediante al menos uno de los restos muy significativos indicados en negrita anteriormente. Lo más preferiblemente, al menos la mitad de las interacciones se producen con los restos significativos o muy significativos indicados en negrita anteriormente.

Ya que no se cuenta con una estructura cristalina de la TC humana se han generado mimotopos que imitan al epitopo 4 de TC mediante el uso del anticuerpo 3C4. Se seleccionó un banco de presentación de fagos de péptidos constreñidos con disulfuros, con el anticuerpo monoclonal (mAb) específico de holoTC 3C4, y se identificó una serie de péptidos específicos que forman dos motivos similares (véase el ejemplo 4). Los péptidos eran específicos de mAb 3C4. No se unían a mAb dirigidos contra otros epitopos sobre holoTC, y la unión de mAb 3C4 fue bloqueada por holoTC indicando, por tanto, que eran verdaderos miméticos y competidores del epitopo 4 específico de holoTC (véase el ejemplo 5).

Los péptidos, tales como los mimotopos, descritos en la presente se especifican en términos de los códigos de una letra bioquímicos convencionales para los aminoácidos naturales, que son muy conocidos en la técnica. De éstos, de particular importancia para la presente invención son: alanina (A), cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), fenilalanina (F), glicina (G), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), leucina (L), metionina (M), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q), arginina (R), serina (S), treonina (T), valina (V), triptófano (W) y tirosina (Y).

El mimotopo proporcionado consiste en un péptido constreñido con el motivo:

SX_{1} X_{2}YX_{3} WD X_{4} X_{5} X_{6}

en el que:

X_{1} = F, G, L

X_{2} = F, L, R

X_{3} = L, P, Q

X_{4} = M, Q, Y

X_{5} = D, F

X_{6} = M, R (SEQ ID NO:8)

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o el motivo

SFFYSLCYCW (SEQ ID NO:9)

opcionalmente unido a la superficie de una célula o un fago.

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Estos mimotopos, y en particular sus construcciones de polihapteno, son útiles en ensayos de competición para la holoTC, en los que pueden portar un marcador adecuado. Los mimotopos también pueden utilizarse para identificar parejas de unión específica alternativas para la holoTC que tengan especificidad para la holoTC frente a la apoTC, y que tengan opcionalmente una alta afinidad por holoTC.

Por tanto, la presente invención proporciona un método de ensayo para la holoTC que comprende el uso de un mimotopo de péptido constreñido (preferiblemente marcado) que comprende el motivo:

SX_{1} X_{2}YX_{3} WD X_{4} X_{5} X_{6}

en el que:

X_{1} = F, G, L

X_{2} = F, L, R

X_{3} = L, P, Q

X_{4} = M, Q, Y

X_{5} = D, F

X_{6} = M, R

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o el motivo

SFFYSLCYCW

opcionalmente unido a la superficie de una célula o un fago, o una construcción de dos o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5 ó 6) de dichos mimotopos. Este método de ensayo puede ser un método en el que la holoTC se preune a una pareja de unión específica para la holoTC, y el resto de los sitios de unión son detectados mediante el mimotopo. Sin embargo, preferiblemente el método de ensayo es un ensayo de competición en el que el mimotopo o su construcción descritos anteriormente actúan como competidor de la holoTC por los sitios de unión específica sobre un ligando de unión específica para holoTC.

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En este método de ensayo, la sbp en general estará inmovilizada o podrá inmovilizarse.

De forma típica, este ensayo implicará poner en contacto una muestra procedente de un sujeto humano o animal con una cantidad limitada de una pareja de unión específica para la holoTC que tenga un número restringido de sitios de unión. La holoTC procedente de la muestra y el mimotopo o la construcción del mimotopo entonces compiten por la unión a estos sitios. Las porciones unidas y no unidas entonces se separan preferiblemente (por ejemplo, mediante precipitación debida a la reticulación o la adición de un agente de precipitación, enjuagado de una sbp inmovilizada sobre un sustrato, filtración, separación magnética, centrifugación, cambio de condiciones como el pH, etc.) para producir una fracción unida y una fracción no unida. La holoTC en la muestra puede entonces determinarse midiendo la cantidad de mimotopo o construcción de polihapteno del mimotopo (opcionalmente marcados) unida en la fracción unida o que permanece sin unir en la fracción no unida, y relacionando esto con la cantidad de holoTC presente en la muestra. Una gran cantidad de unión del mimotopo a la sbp representa una menor cantidad de holoTC en la muestra. Cuando el mimotopo o la construcción del mimotopo unido o no unido es capaz de detectarse sin la separación de las fracciones unidas y no unidas, por ejemplo mediante cambios en la transmisión de la luz tras añadir un agente estimulante de la aglutinación, o de la polarización de la fluorescencia cuando la sbp, el mimotopo o la construcción de holoTC esté marcado de modo fluorescente, etc., es posible que el método de ensayo no necesite la separación de las fracciones unidas y no unidas.

Las muestras adecuadas para la evaluación de las concentraciones de holoTC en todos los aspectos pertinentes de la presente invención pueden ser cualquier muestra que contenga holoTC, por ejemplo un fluido corporal o una muestra de tejido, o una muestra preparada a partir de éstos. Sin embargo, preferiblemente la muestra será un fluido corporal, por ejemplo fluido seminal, fluido cerebroespinal o fluido amniótico, más preferiblemente una muestra derivada de la sangre, en particular una muestra de suero.

Las parejas de unión específica adecuadas incluyen anticuerpos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpos, construcciones de anticuerpos, oligopéptidos (por ejemplo, péptidos cíclicos constreñidos), oligonucleótidos (por ejemplo, aptámeros de ADN o ARN), moléculas orgánicas pequeñas, etc., cualquiera de las cuales puede estar inmovilizada o puede inmovilizarse. Las parejas de unión específica preferidas (por ejemplo, para estos ensayos) son los anticuerpos, en particular los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos y construcciones (por ejemplo, fragmentos F_{AB}) y se prefiere particularmente el anticuerpo monoclonal 3C4 como se describe en la presente, sus fragmentos y sus construcciones. Las sbp preferidas también incluyen aptámeros oligonucleotídicos (es decir, secuencias cortas, preferiblemente constreñidas, de ADN o ARN bicatenario, o de forma más habitual, monocatenario).

Las sbp particularmente preferidas son los fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) que comprenden las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos completos unidas por un conector para formar un único polipéptido, codificado por una única secuencia de ADN. Éstos pueden prepararse a partir de la codificación del ARNm para los anticuerpos completos mediante técnicas conocidas en la técnica. Estos scFv tienen la ventaja de que son significativamente más pequeños que los anticuerpos completos y, por tanto, pueden disponerse de manera más próxima y formarse en construcciones con una mayor densidad de sitios de unión. También pueden expresarse en E. coli y/o en bacteriófagos y, por tanto, pueden fabricarse en grandes cantidades con más facilidad que mediante su expresión en líneas celulares de mamífero y están más dispuestos a modificaciones genéticas y a la optimización. Los scFv pueden secuenciarse con facilidad y las secuencias de los scFv correspondientes a TC2 y 3C4 aparecen en el ejemplo 11 (tabla 6). Estos scFv se compararon con los correspondientes anticuerpos completos y se descubrió que tenían especificidades similares (ejemplo 11).

Además de identificar scFv con regiones de unión equivalentes a TC2 y 3C4, los scFv correspondientes a 3C4 se han sometido a dos rondas de maduración de afinidad mediante mutación y selección (véase el ejemplo 33). Por tanto, cuando en la presente se indica el uso del anticuerpo TC2, se prefiere de forma similar emplear el fragmento de anticuerpo monocatenario ScFv_TC2 o su equivalente madurado para la afinidad, y cuando en la presente se indica el uso del anticuerpo 3C4, se prefiere de forma similar emplear el fragmento de anticuerpo monocatenario ScFv_3C4 o su equivalente madurado para la afinidad.

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Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios pueden marcarse para su detección mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente y, cuando están marcados de esta manera, se prefiere que el marcador se una al scFv a través de la región conectora. Lo más preferiblemente, el marcador se unirá a la región conectora a través de una cadena lateral funcional, en particular el grupo SH de una cisteína o el grupo OH de una tirosina.

Por tanto, la presente invención proporciona además anticuerpos monocatenarios que se corresponden con cada uno de los anticuerpos descritos en los ejemplos en la presente y, en particular, con scFv específicos para los epitopos 4 y 5, como se describe en la presente. Los más preferibles son TC2_ScFv y 3C4_ScFv como se muestra en la tabla 6 y los equivalentes madurados para la afinidad indicados en las tablas 9 y 10.

Para mejorar las características de unión de 3C4_ScFv, éste se sometió a una modificación genética y a una optimización (maduración de la afinidad). Se generaron bancos de mutagénesis aleatoria de tamaño de 10^{5}-10^{6} clones individuales y se expresaron sobre la superficie de bacteriófagos utilizando técnicas conocidas en la técnica. La maduración de la afinidad del scFv 3C4 produjo 12 nuevos clones de scFv con mayor afinidad y que mantenían la especificidad para holoTC (tabla 9). Los mejores clones de scFv se sometieron a una segunda ronda de mutagénesis y construcción de bancos, a partir de los cuales se seleccionaron 9 nuevos scFv, de los cuales seis tenían mayor afinidad que el mejor del banco de la primera generación (clon 3.10ES en la tabla 10). En el ejemplo 15 se describe un método para realizar la maduración de la afinidad mediante el uso de técnicas muy conocidas.

Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios de anticuerpos monoclonales pueden construirse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, McCafferty J., Hoogenboom H.R, y Chiswell, D.J. (ed.) (1996), Antibody Engineering - A practical approach, IRL Press, Oxford, Reino Unido). Por comodidad pueden utilizarse kits disponibles en el mercado, como el kit de purificación de ARNm QuickPrep®, para la preparación de ARNm, el módulo de scFv de ratón para la preparación de scFv de anticuerpos, y el módulo de expresión para la expresión del anticuerpo scFv como una proteína soluble en E. coli (Amersham Biosciences). Un método típico para la producción de scFv a partir de cualquier anticuerpo IgG completo descrito en la presente, mediante el uso de técnicas muy conocidas y kits disponibles en el mercado se describe en el ejemplo 12.

Las parejas de unión específica adecuadas para un ensayo que comprenda el uso de los mimotopos descritos anteriormente preferiblemente serán específicas para un epitopo que se solapa con el epitopo 4, como se describe en la presente. De forma típica, estos ligandos serán específicos para el epitopo 4.

Los métodos para la inmovilización de cualquiera de los ligandos descritos en la presente son muy conocidos en la técnica e incluyen la unión covalente, como mediante la formación de enlaces amida, disulfuro o amina (por ejemplo, mediante el uso de un agente de acoplamiento de carbodiimida), la absorción fisicoquímica, como la absorción de tioles sobre oro, el acoplamiento de parejas de unión específica inmovilizadas (como biotina y estreptavidina o anticuerpos antirratón de cabra para capturar mAb murinos), y la creación de precipitados de anticuerpos insolubles. Los ligandos inmovilizados pueden preunirse a un sustrato o pueden inmovilizarse durante un ensayo mediante la adición de un sustrato o un agente de precipitación que porte una pareja de unión adecuada.

Los sustratos adecuados para la inmovilización de cualquiera de los ligandos de unión específica descritos en la presente son muy conocidos, e incluyen superficies como superficies de vidrio o poliméricas, en especial las superficies de platos, o láminas o placas de ensayo de microvaloración, en particular el interior de los pocillos de las mismas, las superficies de portaobjetos de SPR, portaobjetos AFM, etc., las superficies de esferas, como esferas de vidrio o poliméricas, membranas, como membranas de celulosa o poliméricas, y también geles y macromoléculas como resinas y dendrímeros que se hinchan o se solubilizan bajo ciertas condiciones, pero que pueden precipitarse o separarse mediante técnicas como filtración o cromatografía de exclusión molecular. Los sustratos más preferidos son esferas poliméricas magnetizables, como las disponibles en Bangs-Laboratories (por ejemplo, Estapor® EMI-100/40), chips de SPR (por ejemplo, de Biacore), y las superficies de placas de microvaloración.

Las especies marcadas, como se describen en la presente, pueden marcarse para su detección mediante cualquiera de un gran número de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos de marcaje incluyen marcaje fluorescente (por ejemplo, con fluoresceína, rodamina, proteína fluorescente verde, etc.), marcaje luminiscente con proteínas como la luciferasa o con agentes quimioluminiscentes (como luminol, (3-aminoftalfdrazida) o complejos de azatrifenileno-metal luminiscente cercano al infrarrojo), marcaje cromático con agentes absorbentes o dispersores de la luz, como tintes, marcaje enzimático (por ejemplo, con peroxidasa alcalina), radiomarcaje con núcleos como tritio, carbono-14 o radioyodo, con o sin el uso de agentes de centelleo, y marcaje magnético, en especial con sustancias paramagnéticas como dextrano marcado con ferro-óxido. También son adecuados los ensayos de proximidad de centelleo y los métodos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. Se prefieren los métodos magnéticos, luminiscentes y fluorescentes, en particular los métodos quimioluminiscentes.

Cuando un método de detección requiera la adición de un cosustrato, como un agente oxidante, éste se añadirá en una etapa adecuada, de forma típica al mismo tiempo que el marcador o después de las etapas de lavado adecuadas. Como alternativa, las especies descritas en la presente pueden "marcarse" por medio de su propia masa. En estos casos, éstas pueden detectarse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR), siendo dicha técnica muy conocida en la técnica, y que utiliza, de forma típica, equipos de SPR de suministradores como Biacore. Otros métodos físicos para el marcaje incluyen la unión de la "punta" de un microscopio de fuerza (por ejemplo, un microscopio de fuerza atómica (AFM) o un microscopio de fuerza química), en que la unión se detecta por una desviación alterada de dicha punta.

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Cuando se emplean en cualquiera de las realizaciones de la invención, los mimotopos y otros péptidos descritos en la presente pueden ser péptidos sintéticos, formados mediante métodos como la síntesis peptídica en fase sólida, o pueden formarse mediante biosíntesis, como mediante bacterias o mediante presentación sobre la superficie de fagos. Cuando los péptidos (por ejemplo, los mimotopos) se biosintetizan puede segregarse desde la célula, fago, organismo, etc. biosintetizante, o pueden presentarse sobre su superficie. En el caso de la presentación sobre la superficie, los péptidos se presentarán, de forma típica, sobre un fago, por ejemplo como un conjugado unido a toda o a parte de la proteína de la envuelta del fago. Estos péptidos (por ejemplo, mimotopos o conjugados de regiones epitópicas) pueden utilizarse en los métodos de la invención mediante la escisión de la superficie del fago o mediante el uso del fago completo, o de la parte o la fracción del fago que incluya el péptido presentado. Cuando el péptido va a utilizarse para la generación de una respuesta inmunológica, el uso del fago completo tendrá la ventaja de provocar al sistema inmunológico sin que sea necesario conjugar el péptido (mimotopo, etc.) con un vehículo inmunogénico distinto.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para identificar parejas de unión específica para la holoTC, que tengan un especificidad mayor para la holoTC frente a la apoTC en al menos 40 veces, como en al menos 50 veces, más preferiblemente en al menos 70 veces, y lo más preferiblemente en 100 veces o más, que comprende seleccionar un banco de ligantes específicos potenciales con el mimotopo de péptido descrito anteriormente, o sus construcciones o conjugados. Este método tomará la forma, de manera típica, de un ensayo de inmunopurificación ("panning"), similar al descrito utilizando la holoTC en los ejemplos 1 y 2 a continuación, pero tiene la ventaja de que el mimotopo representa un epitopo equivalente al epítopo 4 de la holoTC y, por tanto, la mayoría de los ligantes identificados deberían mostrar una unión específica a la holoTC frente a la apoTC. Los ligantes adecuados pueden comprender mAb o sus fragmentos o construcciones, como se describe en los ejemplos 1 y 2 a continuación, pero es evidente que la misma técnica puede modificarse de modo fácil y habitual para la selección de otras especies, por ejemplo moléculas orgánicas pequeñas, aptámeros u oligopéptidos (por ejemplo, utilizando bancos de presentación de fagos peptídicos) de maneras similares a las descritas en el ejemplo 4 a continuación. De igual forma, estos mimotopos y sus construcciones pueden utilizarse en métodos de ensayo de alta capacidad de procesamiento convencionales para identificar ligantes de holoTC específicos a partir de bancos de péptidos sintéticos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas pequeñas, como los que están disponibles en el mercado.

Los aptámeros son el tipo de sbp preferido identificables mediante una selección contra los anteriores mimotopos. Cuando se identifiquen estos aptámeros de ADN o ARN, tendrán la anterior especificidad por holoTC frente a apoTC.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para inducir anticuerpos específicos de la holoTC humana en un sujeto mamífero, o preferiblemente en un sujeto no mamífero (por ejemplo, aviar, piscícola o reptiliano), que comprende administrar los mimotopos descritos anteriormente, o sus construcciones y/o conjugados inmunogénicos (en especial sus construcciones de polihapteno conjugadas con proteínas adecuadas, como BSA) a dicho sujeto. Preferiblemente, dicho sujeto será aviar. Los pollos son particularmente adecuados. El mimotopo, su construcción o conjugado será inmunogénico y preferiblemente presentará múltiples copias del mimotopo para inducir una respuesta inmunológica. Este método comprenderá, en general, administrar una construcción antigénica adecuada del mimotopo descrito anteriormente, permitiendo que transcurra un tiempo adecuado para que se genere una respuesta inmunológica, opcionalmente administrando una o más dosis de refuerzo de la misma o de otra construcción de mimotopo, y extrayendo los anticuerpos del sujeto, en forma de un extracto de anticuerpos policlonales o preferiblemente en forma de células secretoras de anticuerpos, que entonces pueden cultivarse utilizando métodos conocidos en la técnica. En una realización de este método, puede utilizarse la holoTCII humana o un fragmento o construcción de ésta para la inmunización inicial del sujeto no mamífero, o para una o más de las inmunizaciones de refuerzo, o ambos.

Las parejas de unión específica para holoTC también pueden identificarse mediante el uso de conjugados de péptidos diseñados para expresar al menos una de las regiones epitópicas I, II y III del epitopo 4 descrito en la presente. Estos péptidos se basarán en las secuencias de la holoTC humana;

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297 (o preferiblemente Lys 296).

De forma típica, las regiones tendrán las secuencias indicadas en la presente anteriormente.

Un conjugado de péptido adecuado, por tanto, tendrá de forma típica la secuencia I, II o III, o sus fragmentos, flanqueada por secuencias conectoras adecuadas para proporcionar la presentación tridimensional deseable de la región. Preferiblemente, todas o partes de las secuencias I y II, las secuencias II y III, o las secuencias I y III estarán presentes con secuencias conectoras entre ambas. Más preferiblemente, las tres secuencias I, II y III estarán presentes, completas o en parte, al menos una vez en el conjugado (en cualquier orden) con secuencias conectoras dispuestas entre ellas y con secuencias flanqueantes en uno o ambos extremos. Todas las secuencias conectoras y/o flanqueantes pueden tener puntos de entrecruzamiento, como restos cisteína, para permitir el control de la estructura tridimensional del conjugado de péptido. Los conjugados también pueden incluir las secuencias de mimotopos indicadas anteriormente, además de las regiones I-III o en lugar de toda o parte de una o más de estas regiones. Las secuencias adecuadas pueden sintetizarse de modo químico o, de forma más típica, se expresarán en células o fagos mediante métodos análogos a los descritos en la presente para la expresión de mimotopos.

Cuando se emplean partes de cualquiera de las regiones I a III en la presente, estas partes incluyen preferiblemente algunos de los restos significativos o, preferiblemente, muy significativos indicados en la presente anteriormente. Preferiblemente, al menos la mitad de estos restos están presentes en posiciones equivalentes en los conjugados a sus posiciones en las secuencias que se indicaron anteriormente.

Los conjugados de péptidos descritos anteriormente forman otra realización de la invención, así como su uso en ensayos y para identificar parejas de unión específica para la holoTC. Los conjugados de péptidos (y sus construcciones, equivalentes marcados, etc.) pueden ser, por tanto, sustituidos por los mimotopos descritos en la presente en cualquier realización adecuada de la invención, incluyendo los métodos para identificar ligantes específicos, los métodos de ensayo y los métodos para inducir reacciones inmunológicas.

En otra realización, la invención proporciona un método de ensayo para ensayar la holoTC en una muestra (por ejemplo, una muestra líquida de origen biológico), comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra con una pareja de unión específica para la holoTC, y detectar los conjugados resultantes de holoTC y la pareja de unión específica, en el que dicha pareja de unión específica tiene una especificidad mayor para holoTC con relación a la apoTC al menos en 40 veces, preferiblemente al menos en 50 veces, más preferiblemente al menos en 70 veces (véase, por ejemplo, el ejemplo 6 que aparece a continuación).

En este método, como resulta convencional en los ensayos de diagnóstico, la detección del conjugado puede ser directa o indirecta, y cuantitativa, semicuantitativa o cualitativa. La detección directa puede ser, por tanto, de una propiedad del conjugado que se diferencie de la de la holoTC y sbp sin conjugar (por ejemplo, la masa o la emisión de radiación, las características de absorción o de dispersión). La detección indirecta puede realizarse, por ejemplo, mediante la detección de los conjugados formados en competición con los conjugados de holoTC:sbp, o mediante la detección de un conjugado de otro ligando (por ejemplo, un ligando marcado) y el conjugado de holoTC:sbp, o mediante la separación del conjugado de la muestra, la liberación de cobalamina y la detección de la cobalamina liberada. La detección cualitativa y semicuantitativa puede implicar determinar si la holoTC está presente en la muestra por encima o por debajo de un límite de concentración predeterminado, o a concentraciones mayores o menores que en algún patrón seleccionado, por ejemplo para proporcionar una indicación sencilla de si la fuente de la muestra padece o no una deficiencia en holoTC. De forma deseable, el ensayo implicará la determinación cuantitativa del contenido en holoTC, y opcionalmente también el contenido total en TC y/o el contenido total en cobalamina. La pareja de unión específica utilizada en este método de ensayo también (y preferiblemente) será una pareja de unión específica para un péptido constreñido que comprende el motivo:

SX_{1} X_{2}YX_{3} WD X_{4} X_{5} X_{6}

en el que:

X_{1} = F, G, L

X_{2} = F, L, R

X_{3} = L, P, Q

X_{4} = M, Q, Y

X_{5} = D, F

X_{6} = M, R

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o el motivo

SFFYSLCYCW

y en particular puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento o una construcción o un aptámero de ADN/ARN con esta especificidad. Además, la sbp de holoTC utilizada en este método puede (y preferiblemente estará) bloqueada para la unión a holoTC mediante la unión anterior de ciertas otras sbp con afinidad por apoTC y holoTC. En una realización preferida, la pareja de unión específica será un anticuerpo monoclonal con especificidad para un epitopo que se solapa con el epitopo 4 de TC como se describe en la presente, o un fragmento o construcción de dicho anticuerpo. En particular, dicho anticuerpo será específico para el epitopo 4 y, por ejemplo, puede unirse a cualquiera de una, cualquiera de dos o todas las tres regiones I-III sobre TC, como se describió anteriormente. Más preferiblemente, dicho anticuerpo, fragmento o construcción será el anticuerpo 3C4 como se describe en la presente (o un scFv correspondiente) o su fragmento o construcción. Las parejas de unión específica adecuadas pueden identificarse mediante técnicas convencionales basadas en la selección para la unión a TC, al mimotopo o a una construcción apropiada de las regiones I, II y/o III, como se describe en la presente.

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El proceso de selección de sbp de holoTC implicará, de forma típica, (i) seleccionar para la capacidad de unirse a holoTC y/o el mimotopo o su construcción, y (ii) rechazar las sbp candidatas sin la especificidad requerida con respecto a holoTC y apoTC. De forma deseable, el proceso de selección de sbp también implica el rechazo de sbp candidatas que se unan a la haptocorrina o a otras proteína séricas, puesto que sino el ensayo de holoTC de la invención requerirá separar la TC de la HC u otras proteínas sanguíneas antes de ponerse en contacto con la sbp.

Por consiguiente, la sbp de holoTC según la invención es preferiblemente una sbp que tiene una mayor especificidad por dicho mimotopo o construcción, con relación a la apoTC, al menos en 40 veces, en especial al menos en 50 veces, más preferiblemente al menos en 70 veces. La sbp de holoTC también tendrá preferiblemente una mayor selectividad por holoTC frente a las holoformas de otras proteínas de unión a cobalamina (incluyendo por ejemplo HC y el factor intrínseco) al menos en 50 veces, preferiblemente al menos en 70 veces, y más preferiblemente en 100 veces o más.

En el método de ensayo de la invención, la pareja de unión específica de holoTC puede utilizarse para capturar la holoTC, o puede utilizarse para identificar la holoTC previamente capturada por un ligando secundario.

Cuando se emplea la sbp de holoTC para capturar la holoTC, en general estará inmovilizada sobre un sustrato adecuado o puede inmovilizarse mediante el uso de un agente inmovilizante o precipitante como se analizó anteriormente. Estos sustratos, agentes y métodos de inmovilización son muy conocidos en la técnica e incluyen los métodos descritos anteriormente. La holoTC capturada por la pareja de unión específica de holoTC puede entonces identificarse poniendo en contacto un ligando secundario opcionalmente marcado. Este ligando secundario puede ser específico para holoTC pero en general será específico para TC (apo- y holo-) y puede unirse a cualquier epitopo presentado por la holoTC unida. Como alternativa, el ligando secundario puede utilizarse para unir la holoTC capturada y un ligando terciario marcado con especificidad para el ligando secundario. Este ligando terciario entonces también se añade, por ejemplo posterior o simultáneamente. Cuando la detección se realiza mediante ciertas técnicas sensibles a la masa o sensibles al índice de refracción, como SPR, el ligando puede estar "marcado" puramente por su propia masa.

Un método de ensayo típico que utiliza esta técnica de "captura específica" comprende las etapas de:

poner en contacto una muestra líquida procedente de un sujeto (como un paciente humano o un animal, en particular un mamífero) con una pareja de unión específica para holoTC inmovilizada o inmovilizable para formar un conjugado de holoTC:sbp,

poner en contacto la pareja de unión específica con un ligando secundario para TC u holoTC de forma que el ligando secundario se une a la holoTC unida para formar un conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario,

separar el ligando secundario no unido del conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario y opcionalmente aumentar la concentración del conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario,

opcionalmente liberar el conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario del sustrato y/o un conjugado de
holoTC:ligando secundario de la sbp, en el que la liberación se realiza preferiblemente hacia un volumen de líquido menor que el volumen de la muestra líquida,

opcionalmente añadir un cosustrato o ligando terciario para facilitar la detección del conjugado de
holoTC:sbp:ligando secundario o del conjugado de holoTC:ligando secundario,

detectar el conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o un conjugado de holoTC:ligando secundario, y

relacionar la cantidad detectada de conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o de un conjugado de
holoTC:ligando secundario con la concentración de holoTC en la muestra líquida para proporcionar una medición cuantitativa, semicuantitativa o cualitativa de la holoTC presente en la muestra líquida, y opcionalmente relacionar la holoTC presente en la muestra líquida con la presencia o la ausencia de una deficiencia en cobalamina en el sujeto.

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Se construyó un ensayo preferido para la holoTC descrito en la presente basado en el mAb 3C4 como anticuerpo de captura, y un anticuerpo de alta afinidad no solapante (ejemplo 6.3) o aptámero (ejemplo 14) como sbp de detección. Se verificó la precisión de este ensayo mediante la comparación con un ensayo comercial para holoTC, HoloTC RIA® (Axis-Shield, Noruega) (ejemplo 7). El ensayo comercial se basa en un principio diferente, la captura en fase sólida de la TC total (apoTC + holoTC) y la liberación de la cobalamina unida en holoTC, seguido de un radioinmunoensayo de unión competitiva (Ulleland et al., Clin. Chem., 48:526-532 (2002)). El método de ensayo de la invención se correlaciona bien con el ensayo comercial con r = 0,96.

La unión de sbp específicas de holoTC, como 3C4, será bloqueada por la unión anterior de sbp específicas para ciertos epitopos solapantes presentes en holoTC y opcionalmente también presentes en apoTC. Los ejemplos de estas sbp bloqueantes incluyen sbp específicas para el epitopo 5, como se describe en la presente, y en particular el anticuerpo monoclonal TC2 como se describe a continuación. Otros ejemplos son ligandos que se unen al menos a una de las regiones I a III, como se describe en la presente. El bloqueo de la unión de holoTC por estas sbp específicas de TC puede utilizarse para caracterizar aún más las sbp específicas para holoTC de la presente invención.

En un método de ensayo preferido, que forma otro aspecto de la invención, se emplea una sbp de holoTC (opcionalmente marcada) como ligando de detección para la holoTC, previa, simultánea o posteriormente capturada por un ligando secundario inmovilizado o inmovilizable. Este ligando secundario también puede ser específico para holoTC, con lo que se aumenta la especificidad del ensayo, pero más preferiblemente se unirá a holoTC y a apoTC. Preferiblemente, este ligando secundario tendrá una afinidad por TC que es mayor que la de la sbp de holoTC. Esta afinidad puede ser, por ejemplo, al menos 10^{8} M^{-1}, o al menos 10^{9} M^{-1}, pero es preferiblemente al menos 10^{10} M^{-1}, y lo más preferiblemente 10^{11} M^{-1} o mayor. Preferiblemente en especial, el ligando de captura de TC es aquel que no provoque una reducción significativa en la especificidad de la sbp de holoTC por holoTC frente a apoTC. Más preferiblemente, el ligando de captura no debe provocar una reducción significativa en la afinidad de la sbp de holoTC por holoTC. Estos ligandos de captura preferidos incluye los que se unen a un epitopo que no se solapa con el epitopo al cual se une la sbp de holoTC, y preferiblemente no se unen de una manera que provoque un cambio en la conformación del epitopo al cual se une la sbp de holoTC. Los ligandos de captura preferidos son los que no provocan que la especificidad de la sbp de holoTC disminuya por debajo de al menos 40 veces, preferiblemente al menos 50 veces, en especial al menos 70 veces. Los ligandos de captura preferidos en general no se unirán a ninguna de las regiones I a III como se describe en la presente.

Un ensayo típico según esta realización de la invención puede comprender las etapas de:

poner en contacto un volumen conocido de una muestra líquida procedente de un sujeto animal (en particular un mamífero y preferiblemente un paciente humano) con un ligando de captura (como un mAb inmovilizado o inmovilizable, scFv o aptámero de ADN/ARN) que tiene especificidad por TC, con lo que se forma un conjugado de TC:ligando de captura,

opcionalmente separar una fracción que contiene sustancialmente todo el conjugado de TC:ligando de captura de una fracción que no contiene sustancialmente conjugado de TC:ligando de captura, opcionalmente en un volumen reducido conocido,

poner en contacto dicho conjugado de TC:ligando de captura con una pareja de unión específica de holoTC (preferiblemente marcada) (como un mAb, aptámero, péptido de unión específica, etc. como se describió anteriormente, en particular el mAb 3C4 o un scFv correspondiente) para proporcionar un conjugado de sbp:holoTC:ligando de captura,

opcionalmente separar la sbp de holoTC no unida del conjugado de sbp:holoTC:ligando de captura,

opcionalmente añadir un cosustrato o ligando terciario para facilitar la detección de la sbp de holoTC unida,

detectar la holoTC unida,

relacionar la sbp de holoTC unida detectada con los volúmenes para proporcionar una indicación cuantitativa, semicuantitativa o cualitativa de la holoTC presente en dicha muestra líquida, y opcionalmente relacionar la holoTC presente en la muestra líquida con la presencia o la ausencia de una deficiencia en cobalamina en el sujeto.

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La muestra líquida puede pretratarse, si se desea, para aumentar su concentración de TC y/o para eliminar o disminuir la HC (es especial la holoHC) y, si se desea, la albúmina contenida. Esto puede implicar, de forma típica, la aplicación de una muestra a un sustrato con el que se une HC o TC, la separación del sustrato y la fase líquida, y (cuando el sustrato se une a TC) la liberación de la TC del sustrato para formar una nueva muestra líquida de volumen menor preferiblemente conocido. Esta disminución en la HC es particularmente importante cuando la etapa de detección de holoTC final implica la detección de la cobalamina liberada de la holoTC.

Las etapas de estos métodos pueden reordenarse de modo apropiado, en formas que serán obvias para los expertos en la técnica, por ejemplo para permitir el contacto del ligante específico de holoTC con la holoTC antes de la captura de la TC con el ligando de captura.

Los ligandos de captura adecuados para su uso en el anterior método de ensayo de la presente invención se unen a uno o más epitopos de TC distintos del epitopo unido por cualquier ligante específico de holoTC (como el epitopo 4 descrito en la presente). Además, el ligando de captura debe unirse preferiblemente a un epitopo que no se solape con ninguno de estos epitopos específicos de holoTC. Como se describió anteriormente, se han identificado al menos 7 epitopos de TC, de los cuales al menos 4 no se solapan con el epitopo 4 específico de holoTC. Preferiblemente, y en particular cuando la muestra líquida se pone en contacto con el ligando de captura antes de ponerse en contacto con cualquier ligante específico de holoTC, el ligando de captura debe unirse a un epitopo o debe unirse de tal forma que la unión de cualquier ligante específico de holoTC no sea inhibida ni sea menos específica para holoTC.

El ligando de captura debe unirse preferiblemente de forma que no produzca un cambio sustancial en la configuración de cualquier epitopo específico de holoTC. Éstos en general no se unirán a ninguna de las regiones I a III, como se describe en la presente.

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Se han identificado anticuerpos monoclonales que no tienen un efecto inhibidor significativo sobre la unión o la especificidad del mAb 3C4, como se describe en los ejemplos a continuación. Estos anticuerpos son muy adecuados para su uso como ligandos de captura en un método de ensayo de la invención. En particular, los ligandos que se unen al epitopo 2, como se describe en la presente, son muy adecuados para su uso como ligandos de captura en los métodos de ensayo de la invención. Se han identificado ligandos de anticuerpos monoclonales para el epitopo 2 y son muy adecuados. Sin embargo, los ligandos de captura más preferidos son ligandos pequeños (como scFv), preferiblemente con una alta afinidad por TC. Los ligandos pequeños pueden unirse de forma más concentrada a un sustrato y, por tanto, proporcionan un mayor efecto de concentración, permitiendo aumentar la sensibilidad del ensayo. Los fragmentos de anticuerpos, los ligantes de péptidos pequeños (en particular péptidos constreñidos), los oligómeros de ácidos nucleicos (por ejemplo, aptámeros) y las moléculas orgánicas pequeñas son todos ligandos pequeños preferidos. Los fragmentos de mAb (y scFv) generados contra el epitopo 2 son los más preferidos. Las construcciones que comprenden múltiples repeticiones de dichos ligandos pequeños, que pueden estar unidas por enlaces químicos y/o conectores comparativamente pequeños, también son adecuadas.

Cuando la holoTC presente en una muestra líquida es capturada por un ligando de captura específico de TC y se pone en contacto con un ligando específico de holoTC (preferiblemente marcado) para detectar la holoTC, la TC capturada puede haber sido puesta en contacto (de forma previa, simultánea o, preferiblemente, posterior) con un ligando de detección de TC para determinar la TC total capturada por el ligando de captura y/o un ligando de detección de apoTC para determinar la apoTC capturada por el ligando de captura. El contenido en TC y/o apoTC determinado de esta forma puede relacionarse con el contenido en TC y/o apoTC de la muestra de fluido, puede utilizarse para determinar el nivel de saturación de holoTC de la TC, o puede utilizarse como patrón interno o verificación mediante la comparación con la cantidad determinada de holoTC.

Los ligandos de detección de TC adecuados son preferiblemente parejas de unión específica marcadas para la TC, como mAb, aptámeros, etc. como se describió anteriormente, que sean específicos por un epitopo de TC que no se solape con el epitopo unido por el ligando de captura (como el epitopo 2, como se describe en la presente) ni con el epitopo unido por cualquier ligando de unión específica de holoTC (por ejemplo, el epitopo 4 como se describe en la presente). Los ligandos de detección de TC adecuados también incluyen los mAb generados contra los epitopos 1, 3, 6 y 7, como se describe en la presente, y sus fragmentos y construcciones, opcionalmente marcados de maneras conocidas por los expertos en la técnica y descritas anteriormente.

El marcaje de cualquier ligando de detección de TC puede ser igual o diferente al marcaje de cualquier ligante específico de holoTC. Cuando se emplean métodos como SPR para la detección, ambos marcadores se detectarán mediante la masa, normalmente de modo secuencial. Cuando se emplean métodos como la detección fotométrica (fluorescencia, luminiscencia, etc.), los marcadores preferiblemente serán distinguibles (por ejemplo, por la longitud de onda de excitación y/o detección) y pueden detectarse de modo simultáneo o secuencial.

Los ligandos de detección de apoTC adecuados pueden ser ligandos con una afinidad de unión específica por apoTC frente a holoTC (por ejemplo, cobalamina o conjugados de cobalamina, opcionalmente conjugados con un resto productor de señal) pero preferiblemente son ligandos que se unen a un epitopo que se solapa con el epitopo unido por un ligante específico de holoTC (como una de las regiones I a III). Un ensayo que utilice dicho ligando comprenderá, de forma típica, las etapas de unir la TC capturada procedente de una muestra líquida con un ligante específico de holoTC, posteriormente poner en contacto la TC capturada con un ligando de detección de apoTC específico para un epitopo presente sobre apoTC y holoTC pero que se solapa con el epitopo unido por el ligante específico de holoTC, y detectar el ligante específico de holoTC y el ligando de detección de apoTC. Se evitará sustancialmente que este ligando de detección de apoTC se una a holoTC mediante la presencia de ligante específico de holoTC preunido, pero se unirá libremente al correspondiente epitopo sobre apoTC, proporcionando con ello una señal que representa la cantidad de apoTC presente en la muestra de fluido.

Al igual que con cualquier ligando de detección de TC, el marcaje del ligando de detección de apoTC puede ser igual o diferente del marcaje de cualquier ligante específico de holoTC. Cuando se emplean métodos como SPR para la detección, ambos marcadores se detectarán mediante la masa, normalmente de modo secuencial. Cuando se emplean métodos como la detección fotométrica (fluorescencia, luminiscencia, etc.), los marcadores preferiblemente serán distinguibles (por ejemplo, por la longitud de onda de excitación y/o detección) y pueden detectarse de modo simultáneo o secuencial. Preferiblemente se utilizará la detección secuencial cuando el método utilizado para detectar los dos ligandos proporcione señales indistinguibles, y se utilizará la detección simultánea cuando las señales de los dos ligandos puedan distinguirse.

Otro método de ensayo muy preferido de la invención utiliza el mAb 3C4 como anticuerpo de detección (ejemplos 6 y 17). Esta estrategia tiene al menos dos ventajas: (i) la utilización como sbp de captura (por ejemplo, un anticuerpo) de un mAb o aptámero con mayor afinidad por TC permite que prácticamente toda la TC en la muestra pueda ser capturada y concentrada; (ii) la utilización del mAb 3C4 como anticuerpo de detección aumenta la afinidad funcional del mAb 3C4. Sin embargo, la KD para 3C4 se ha estimado como >100 mM, porque los anticuerpos monoclonales son divalentes, y el uso de ambos sitios de unión disminuye la constante de disociación y, por tanto, también disminuye la KD funcional (avidez). En el caso del mAb 3C4, la constante de disociación disminuyó de 2 x 10^{-3} s^{-1} a 2 x 10^{-4} s^{-1} cuando se utilizó el mAb 3C4 como anticuerpo de detección en lugar de como anticuerpo de captura. Como se analizó anteriormente, un anticuerpo de captura adecuado debe ser preferiblemente un mAb que no comprometa la afinidad ni la especificidad del mAb 3C4 por holoTC. Los inventores han descubierto que los anticuerpos contra el epitopo 2 son los que mejor cumplen estos requisitos. Aunque el aptámero b974-3t1, como se describe en la presente, se solapa parcialmente con el mAb 3C4 (véase 11 y ejemplo 17), este solapamiento no es suficiente para comprometer la afinidad ni la especificidad del mAb 3C4 y se mantiene la suficiente afinidad para cumplir con los requisitos del ensayo (véanse los ejemplos 16 y 17).

También se demostró la medición simultánea de holoTC y apoTC en el mismo ensayo utilizando anticuerpos dirigidos contra los epitopos 4 y 5 (ejemplos 8 y 9). Estos epitopos se solapan completamente en holoTC, mientras que el epitopo 4 no está presente en apoTC. Por tanto, añadiendo a una muestra que contenga una mezcla de apoTC y holoTC, primero mAb 3C4, que se une al epitopo 4, y después mAb TC2, que se une al epitopo 5, y teniendo los anticuerpos conjugados a diferentes ligandos productores de señal, se puede medir directamente la apoTC y la holoTC en la misma muestra. Como alternativa, la apoTC y la holoTC pueden capturarse primero y concentrarse mediante un ligante no solapante (en especial un aptámero o un anticuerpo monoclonal), preferiblemente que se una al epitopo 2, antes de la detección. Cuando la apoTC se detecta debido al "bloqueo" de un epitopo presente sobre apoTC y holoTC mediante la unión a un epitopo presente sólo sobre holoTC (como por ejemplo el epitopo 5 se bloquea por la unión al epitopo 4), no es necesario que este bloqueo sea completo. Cuando se proporciona unión a holoTC bajo ciertas condiciones que bloquean una proporción conocida de los sitios de unión o cuando el número de sitios revelados es insignificante en comparación con el nivel total de apoTC, entonces pueden generarse datos útiles. Preferiblemente, más del 80% de los sitios sobre holoTC serán bloqueados por la unión a holoTC, más preferiblemente 90% o más, y lo más preferiblemente al menos 95%.

Además, se demostró la medición simultánea de holoTC y de la TC total en el mismo ensayo utilizando anticuerpos dirigidos contra los epitopos 4 y 6 (ejemplo 10) y el aptámero b974-3t1 (figura 12, ejemplo 17). Estos epitopos no se solapan y ninguno se solapa con el epitopo 2. Por tanto, añadiendo a una muestra que contenga una mezcla de apoTC y holoTC, primero mAb 3C4, que se une al epitopo 4, y después mAb 3C12, que se une al epitopo 6, y teniendo los anticuerpos conjugados a diferentes ligandos productores de señal, se puede medir directamente la apoTC y la TC total en la misma muestra. También puede lograrse la medición simultánea de la holoTC y la TC total en el mismo ensayo mediante el uso de b974-3t1 como sbp de captura, y detectando la holo TC y la TC total utilizando mAb 3C4 (epitopo 4) y mAb 4-7 (epitopo 2B), respectivamente (véase el ejemplo 17).

En otro aspecto, la invención también proporciona un kit para su uso en un método de ensayo según la invención, siendo dicho kit como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas y comprendiendo dicho kit una pareja de unión específica para la holoTC, opcionalmente marcada o inmovilizada, que tenga una mayor especificidad por holoTC frente a apoTC al menos en 40 veces (por ejemplo, en 50 veces o más); opcional y preferiblemente un ligando de unión a TC opcionalmente marcado o inmovilizado; opcionalmente una pluralidad de disoluciones de holoTC de concentración conocida; y opcionalmente instrucciones para la realización de dicho método de ensayo.

La presente invención se describirá con más detalle a continuación haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes y haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1a representa el "sensograma" de SPR que muestra la unión de mAb 3C4 a la holoTC (871 RU) y la ausencia de unión a la apoTC (0 RU) inmovilizada sobre un chip por un mAb específico para el epitopo 2;

la figura 1b es equivalente a la figura 1, con mAb 5H2 (epitopo 2) como ligando de captura; se muestra la unión de mAb 3C4 a la holoTC (185 RU) y la ausencia de unión a la apoTC (0 RU);

la figura 2 representa la afinidad y la especifidad de diversos anticuerpos descritos en la presente para la holoTC y la apoTC nativas;

la figura 3a representa un "mapa de epitopos" de TC generado mediante el método de cartografiado de epitopos descrito en la presente;

la figura 3b representa un "mapa de epitopos" modificado de TC generado mediante el método de cartografiado de epitopos descrito en la presente;

la figura 3c representa otro "mapa de epitopos" modificado de TC generado mediante el método de cartografiado de epitopos descrito en la presente;

la figura 4a representa los resultados de aplicar disoluciones patrón de holoTC a un método de ensayo para la holoTC como se describe en la presente, utilizando el anticuerpo 3C4 como anticuerpo de captura;

la figura 4b representa los resultados de aplicar disoluciones patrón de holoTC a un método de ensayo para la holoTC como se describe en la presente, utilizando el anticuerpo 3C4 como anticuerpo de captura y utilizando detección de la absorbancia;

la figura 4c representa los resultados de aplicar disoluciones patrón de holoTC a un método de ensayo para la holoTC como se describe en la presente, utilizando anticuerpos monocatenarios específicos para holoTC como anticuerpos de captura;

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la figura 4d representa los resultados de aplicar disoluciones patrón de holoTC a un método de ensayo para la holoTC, utilizando el anticuerpo 3C4 como anticuerpo de captura y utilizando detección de la luminiscencia;

la figura 5a representa una curva patrón generada a partir de mezclas patrón de holoTC y apoTC en un método de ensayo de la invención, que muestra la cantidad de mAb 3C4, como ligando de detección, unida a la holoTC sobre un anticuerpo de captura;

la figura 5b es una curva equivalente a 5a que muestra la cantidad de mAb 3C4, como ligando de detección, unida a la holoTC sobre un anticuerpo de captura, en que el anticuerpo de captura es mAb TC7;

la figura 6a representa una comparación entre un método de ensayo como se describe en la presente y un ensayo de holoTC comercial;

la figura 6b representa otra comparación entre un método de ensayo como se describe en la presente y un ensayo de holoTC comercial;

la figura 7a representa la unión de anticuerpos específicos para el epitopo 4 (3C4) y el epitopo 5 (TC2) secuencialmente, a mezclas inmovilizadas de holoTC y apoTC;

la figura 7b representa la misma unión que se observa en la figura 7a pero el ligando de captura es mAb TC7.

la figura 8 representa una curva patrón de saturación de cobalamina TC que muestra la unión relativa a los epitopos 4 (por 3C4) y 6 (por 3C12) para holoTC y apoTC inmovilizadas en proporciones conocidas;

la figura 9 representa la unión de anticuerpos específicos para el epitopo 4 (3C4) y el epitopo 6 (3C12) secuencialmente a mezclas inmovilizadas de holoTC y apoTC;

la figura 10 representa la inhibición de la unión entre TC y diversos mAb descritos en la presente provocada por el polisacárido heparina en diversas concentraciones;

la figura 11 representa un "sensograma" de SPR que muestra la unión del aptámero b971-3T1 a holoTC inmovilizada sobre un chip por mAb 3C4 (línea superior). No se observa respuesta (línea inferior) cuando se utiliza apoTC en lugar de holoTC porque mAb 3C4 no reconoce a apoTC (y por tanto no la captura);

la figura 12 representa la unión secuencial de anticuerpos específicos para el epitopo 4 (3C4) y el epitopo 2B (4-7) a holoTC y apoTC capturadas por el aptámero b974-3t1 (las flechas que apuntan hacia abajo indican el momento de las inyecciones). No se observa respuesta cuando 3C4 se inyecta sobre la apoTC capturada porque el epitopo 4 no está presente;

la figura 13a representa la estructura de la TC humana que muestra el epitopo 4;

la figura 13b representa la estructura de la TC humana que muestra el sitio de unión a heparina 4;

la figura 14 muestra una representación esquemática de diversos epitopos identificados sobre holoTC;

la figura 15a representa la interacción entre el paratopo de 3C4 y las regiones epitópicas preferidas de holoTC; y

la figura 15b representa la interacción entre el paratopo extendido de 3C4 y las regiones epitópicas de holoTC.

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Ejemplo 1 Desarrollo de anticuerpos monoclonales de ratón específicos para la transcobalamina humana y la holotranscobalamina humana 1.1) Inmunización

Ratones hembra BALB/c se inyectaron por vía intraperitoneal con 20 \mug de holoTC humana recombinante mezclada con el inmunomodulador AdjuPrime (Pierce, IL, EEUU), seguido de dos inyecciones de refuerzo de 20 \mug en intervalos de cuatro semanas.

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1.2) Fusión

Cuatro días después del refuerzo final se retiraron los bazos y los esplenocitos se fusionaron con el plasmacitoma sensible a HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; Sigma) OUR1 (un subclón de X63-Ag8.653) utilizando PEG (Boehringer Mannheim, Alemania). Los productos de fusión se cultivaron en bandejas 5 x 96F (Nunc) en presencia de HAT en medio de cultivo (DMEM/F12 de Ham (Invitrogen) más CPSR3 al 10% (Sigma)). Las fusiones se alimentaron después de una semana con medio de cultivo que contenía HT (Sigma).

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1.3) Selección primaria

Después de dos semanas se seleccionó el medio procedente de los hibridomas utilizando un ensayo de captura en fase sólida. El medio celular se mezcló con 10 \mul de una suspensión al 1% (en p/v) de 1 \mum de esferas magnetizables revestidas con un anticuerpo IgG antirratón de oveja (Merck-Estapor, Francia) y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 h. Las esferas magnetizables con anticuerpos monoclonales de ratón unidos se aislaron utilizando un imán y se lavaron cuatro veces con 1 ml de tampón fosfato, pH 7,2, NaCl 0,15 M y albúmina de suero bovino 1 mg/ml. Las esferas lavadas se resuspendieron en 100 \mul de suero humano reunido (Scantibodies, EEUU) que se había pretratado con cobalamina marcada con 57Co (ICN, EEUU) para convertir la apoTC en el suero en holoTC marcada con 57Co. Las mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 30 min y las esferas se aislaron utilizando un imán. Se contó la radiactividad asociada con las esferas en un contador gamma.

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1.4) Clonación

Los pocillos positivos para anticuerpos anti-TC se clonaron mediante dilución limitada en bandejas de 96 pocillos F (Nunc), presembradas con células condicionadoras peritoneales de Balb/c (10.000 por pocillo). Se seleccionaron los clones positivos y se reclonaron hasta que 100% de los subclones producían el anticuerpo específico. Los cultivos madre se congelaron en nitrógeno líquido, en CPSR3 (Sigma) que contenía DMSO al 10% (Sigma).

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1.5) Selección secundaria

Se aislaron anticuerpos a partir del medio celular sobre esferas magnetizables como se describió anteriormente. Se mezclaron 10 \mul de las esferas revestidas con anticuerpo con suero premarcado con 57Co, como se describió anteriormente, en presencia de concentraciones crecientes de apoTC o holoTC humanas recombinantes.

Las líneas celulares quiméricas murinas preparadas como se indicó anteriormente y que expresan los siguientes anticuerpos se depositaron en the European Collection of Cell Culture (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido, en nombre de Axis-Shield ASA:

4

Cuando se emplean en la presente, los anteriores números de los epitopos se utilizan para indicar los epitopos de TC y/u holoTC que se unen a los correspondientes anticuerpos.

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Ejemplo 2 Afinidades y especificidades de anticuerpos monoclonales seleccionados

Las afinidades y especificidades de los anticuerpos monoclonales se evaluaron mediante resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento Biacore® (Biacore, Suecia).

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2.1) Inmovilización del anticuerpo policlonal de IgG antirratón de conejo o de anticuerpos monoclonales de ratón sobre el chip CM5 revestido con dextrano

La superficie carboxilada del chip CM5 revestido con dextrano (Biacore, Suecia) se activó según el protocolo suministrado por el fabricante. Al poco tiempo se inyectó N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M/clorhidrato de N-etil-N'-[3-(dimetilamino)propil]carbodiimida (EDC) 0,2 M sobre el chip carboxilado a 10 \mul/min durante 7 min, después se inyecta anticuerpo policlonal de IgG antirratón de conejo 50 \mug/ml en tampón acetato 10 mM, pH 5,0, a 10 \mul/min durante 7 min y, por último, el chip se bloquea mediante una inyección de etanolamina 1 M a 10 \mul/min durante 7 min. La inmovilización de los anticuerpos monoclonales de ratón sobre el chip revestido con dextrano se realizó de la misma forma.

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2.2) Unión de anticuerpos monoclonales de ratón al chip de dextrano revestido con IgG antirratón de conejo

Los anticuerpos monoclonales de ratón que no estaban disponibles en forma purificada y, por tanto, no pudieron inmovilizarse directamente sobre el chip revestido con dextrano (ejemplo 2.1), se unieron al chip de dextrano revestido con IgG antirratón de conejo. Los anticuerpos se diluyeron hasta aproximadamente 50 \mug/ml en tampón HEPES 0,01 M, pH 7,4, 0,15 M, EDTA 0,003 M y tensioactivo P20 al 0,005% (en v/v) (HBS-EP) y se inyectaron sobre el chip a 5 \mug/min durante 3 min. La unión del anticuerpo monoclonal fue seguida a tiempo real y se registró la cantidad de masa unida en RU (unidades refractarias) en el sensograma.

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2.3) Unión de apoTC y holoTC a anticuerpos monoclonales de ratón

La apoTC y la holoTC se diluyeron en HBS-EP hasta diferentes concentraciones y se inyectaron sobre el chip con anticuerpo monoclonal de ratón inmovilizado a 5 \mul/min durante 3 min. Se registraron la constante de afinidad y la constante de disociación de la unión para diferentes concentraciones de apoTC y holoTC, y se estimaron las constantes de afinidad (tabla 1). Los sensogramas típicos generados mediante este método se muestran en las figuras 1a y 1b.

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2.4) Cartografiado de epitopos

Se caracterizó el patrón de especificidad de los epitopos con un grupo de 17 mAb para crear un mapa de epitopos funcionales (tabla 1). Los anticuerpos se unieron por parejas a holoTC o apoTC. Un primer mAb se inmovilizó sobre el chip revestido con dextrano como se describe en el ejemplo 2.1 o se une al chip de IgG antirratón. En el último caso, después se inyectó suero de ratón diluido 1:10 para saturar el exceso de sitios de unión sobre el chip de IgG antirratón. Se inyectó holoTC o apoTC y se unen al primer mAb seguido del segundo mAb. Todos los mAb se combinaron en todas las permutaciones posibles y los mAb que no podían unirse al mismo tiempo, o aquellos cuya unión resultó comprometida por el primer anticuerpo, se consideraron que eran total y parcialmente solapantes, respectivamente. Basándose en los datos de solapamiento se construyó después un mapa de epitopos (figura 3a). Este mapa de epitopos entonces se expandió al que se muestra en la figura 3b basándose en los resultados del ejemplo 17 a continuación. El mapa de epitopos se volvió a expandir para incluir las regiones epitópicas descritas en los ejemplos 18 y 19, como se muestra en la figura 3C. La tabla 2 muestra los datos para la unión de anticuerpos con cada tipo de epitopo.

Los anticuerpos monoclonales contra los epitopos 4 y 5 sólo podían separarse mediante su unión diferencial a apoTC. Mientras que los epitopos se solapan completamente sobre holoTC, en apoTC están totalmente separados porque el epitopo 4 no está presente (o está presente sólo débilmente) sobre apoTC.

Se sabe que la TC tiene un sitio de unión para el polisacárido endógeno heparina. También se ensayó el efecto inhibidor de la heparina sin fraccionar de peso molecular medio de 12000 Da (Sigma) sobre la interacción entre holoTC y diversos mAb. Como se indica en la figura 3b, se descubrió que el sitio de unión a la heparina se solapa mucho con el epitopo 6, algo con el epitopo 4 y en un grado menor con el epitopo 2A.

Otros experimentos que utilizan una preparación purificada del anticuerpo 3C12, contra el epitopo 6, indicaron que este epitopo se solapa parcialmente con los epitopos 1 y 2.

Las muestras sanguíneas procedentes de pacientes deficientes en TC que tienen un sitio de ruptura críptico intraexónico en el gen TC, que produce una delección de 27 aminoácidos (117-144) en la TC expresada, fueron amablemente suministradas por Dr. Fares Namour. La TC mutada fue reconocida por mAb -39 pero no por mAb 2-2, lo que indica que el epitopo 2 se solapa significativamente con la secuencia 117-144. El polimorfismo de TC habitual P259R no comprometió el reconocimiento por ninguno de los anticuerpos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Cartografiado de epitopos de la TC humana

5

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Los anticuerpos entre paréntesis se solapan parcialmente con mAb nº 1.

TABLA 2

7

Ejemplo 3 Especificidades de anticuerpos monoclonales en suero 3.1) Inmovilización de anticuerpos monoclonales sobre partículas magnéticas revestidas con IgG antirratón de cabra

Anticuerpos monoclonales diluidos hasta aproximadamente 7 \mug/ml en PBS, pH 7,4, que contenía BSA 1 mg/ml, se mezclaron con partículas magnéticas revestidas con IgG antirratón de conejo al 0,2% (en p/v) con un diámetro de 0,8 \mum (Merck Eurolab, Francia) durante 1 h a temperatura ambiente. Las esferas entonces se aislaron utilizando un imán, se lavaron tres veces con PBS frío y se resuspendieron en PBS que contenía BSA 1 mg/ml.

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3.2) Unión de la holoTC nativa a anticuerpos monoclonales inmovilizados

Se mezclaron 10 \mul de anticuerpos monoclonales unidos a esferas magnéticas (3.1) con 100 \mul de suero pretratado con 57Co-cobalamina (aproximadamente 5 fmol; ICN, EEUU) para convertir toda la apoTC en holoTC marcada con 57Co, y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 h. Las esferas entonces se sedimentaron utilizando un imán, se lavaron dos veces con PBA frío que contenía BSA 1 mg/ml y, después de una sedimentación con un imán, se contaron en un contador gamma.

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3.3) Unión de apoTC nativa a anticuerpos monoclonales inmovilizados

Se mezclaron 10 \mul de anticuerpos monoclonales unidos a partículas magnéticas (3.1) con 100 \mul de suero, y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 h. Las esferas entonces se sedimentaron utilizando un imán y el sobrenadante se guardó. Las esferas se lavaron dos veces con PBA frío que contenía BSA 1 mg/ml y, después de una sedimentación con un imán, se resuspendieron en 100 \mul de PBS que contenía BSA 1 mg/ml y 57Co-cobalamina (aproximadamente 50 fmol) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 h, tras lo cual las esferas se sedimentaron mediante un imán, se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA 1 mg/ml, y se contaron en un contador gamma. Para estimar la cantidad de apoTC que permanece en los sobrenadantes séricos, éstos se trataron con 57Co-cobalamina (aproximadamente 50 fmol) y después con 10 \mul de esferas magnéticas revestidas con un anticuerpo anti-TC de alta afinidad, que tiene la capacidad para unir prácticamente toda la TC en una muestra de suero (véase Ulleland et al., Clin.
Chem., 48:526-532 (2002)). Las esferas se sedimentaron utilizando un imán y se contaron en un contador gamma.

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3.4) Especificidad de los anticuerpos monoclonales por la holoTC nativa

La unión de holoTC y apoTC por los anticuerpos monoclonales se comparó con la de un anticuerpo anti-TC humana que se había determinado previamente que retiraba la holoTC y la apoTC del suero de forma cuantitativa (véase Ulleland et al., Clin. Chem., 48:526-532 (2002)). Los resultados aparecen en la figura 2. El anticuerpo monoclonal específico para el epitopo 4 (mAb 3C4) se unía a holoTC pero no a cantidades detectables de apoTC. Los anticuerpos contra otros epitopos se unían a holoTC y a apoTC.

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Ejemplo 4 Bioinmunopurificación de un banco de péptidos de presentación de fagos con mAb 3C4

Se inmunopurificaron los bancos de péptidos 13-meros ciclados con disulfuro (Cosmix Molecular Biologicals GmbH, Alemania); sin embargo, puede utilizarse cualquier banco de péptidos de variabilidad suficiente (>10^{8} variantes) y que preferiblemente estén constreñido para disminuir la flexibilidad.

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4.1) Procedimiento de acoplamiento para mAb 3C4

Se lavaron 20 \mul de carboxiesferas Dynal® tres veces en 1 ml de PBS que contenía Tween 20 al 0,005% (PBST). La activación de las esferas se realizó en 100 \mul de EDC 0,5 M/NHS 0,1 M durante 10 min a temperatura ambiente. Se inmovilizaron 4 \mug de mAb 3C4 a las esferas en 100 \mul de tampón acetato, pH 4,0, durante 45 min a temperatura ambiente. El bloqueo se realizó con etanolamina 100 \muM en PBS. Después del bloqueo, las esferas se lavaron tres veces en PBS.

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4.2) Procedimiento de inmunopurificación

Se incubaron aproximadamente 10^{12} de fágmidos encapsulados de cada banco durante 1 h con 20 \mul de esferas revestidas con 3C4. Como control, se utilizaron 20 \mul de carboxiesferas sin diana. Después de una incubación, las esferas se lavaron con PBST. La elución de los fágmidos encapsulados se realizó con glicina-HCl, pH 2,2 (Gly) durante 10 min, seguido inmediatamente de una neutralización con Tris-HCl, pH 8,0 (Tris). La amplificación y la purificación de las partículas de fago unidas se realizó según protocolos convencionales. Básicamente, 1 ml de fago se traslada a 1 ml de células de E. coli en fase logarítmica. Se incuba durante 30 min sin agitación y después durante 30 min con agitación a 37ºC. Se centrifuga a 1000 g durante 10 min y después se resuspende en 1 ml de medio 2TY (16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, y 5 g de NaCl por litro, pH 7,0, esterilizado) y se cultivan las bacterias en una placa cuadrada grande que contenía ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1%. Se incuban las placas durante la noche a 30ºC. Al día siguiente se añaden 10 ml de 2TY y se desprenden las células de las placas. Se añaden 100-500 \mul a 50 ml de 2TY, que contenía ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 1%, y se cultiva a 37ºC hasta una DO600 de aproximadamente 0,5, lo cual dura aproximadamente 2 h. Se añade un exceso en 10 veces de fago adyuvante, por ejemplo fago M13, y se incuba durante 30 min a 37ºC sin agitación y después durante 30 min con agitación. Se centrifuga a 1000 g y se resuspenden las células en 50 ml de 2TY que contenía ampicilina 100 \mug/ml y kanamicina 50 \mug/ml. Se incuba durante la noche a 30ºC, se centrifuga a 2500 g durante 15 min, y se trasladan los sobrenadantes a tubos nuevos y se añade un volumen 1/5 de PEG al 20%, NaCl 2,5 M. Se incuba en hielo durante 1 h, se centrifuga a 2500 g durante 15 min, se resuspende el sedimento en 1 ml de PBS, se centrifuga a 12000 g durante 2 min para eliminar las bacterias residuales y se trasladan los sobrenadantes a tubos nuevos y se emplean 100 \mul para la siguiente ronda de selección. Se observó un enriquecimiento cuantitativo ya después de la segunda ronda de inmunopurificación, y los clones de la segunda y de la tercera ronda se secuenciaron. Varios clones aparecieron más de una vez y en todos ellos se obtuvieron siete secuencias diferentes, que forman dos motivos:

Motivo 1:

CSX_{1} X_{2}YX_{3}WDX_{4}X_{5}X_{6}CS

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en el que CS es parte del marco de trabajo, y

X_{1} = F, G, L

X_{2} = L, P, Q

X_{3} = D, F

X_{4} = M, Q, Y

X_{6} = M, R

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Motivo 2:

CSFFYSLCYCWCS

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4.3) ELISA de selección

Se revistieron placas de microvaloración con 100 \mul de mAb 3C4 1 \mug/ml o anticuerpo control no relacionado en PBS durante la noche a 4ºC. El resto de los sitios de unión se bloquearon con albúmina de suero bovina (BSA) 20 mg/ml en PBS durante 1 h. Algunos pocillos sólo se revistieron con BSA. Se añadieron los fágmidos encapsulados monoclonales a una concentración de 10^{10} a 10^{8} cfu por pocillo en PBS y se incubaron durante 1 h. Las preparaciones de fágmidos encapsulados se centrifugaron para eliminar los agregados. Los pocillos se lavaron 6 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,1% y 3 veces con PBS. Para la detección de los fagos unidos se añadieron 100 \mul de anticuerpo anti-M12 conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (por ejemplo, de Pharmacia) diluido 1/5000 en PBS a cada pocillo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se lavaron 5 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,1% y 3 veces con PBS. Se añadió el sustrato cromogénico o-fenildiamina en ácido cítrico, pH 4,0, suplementado con H_{2}O_{2} y se detuvo la reacción generadora de color después de 2-5 min mediante la adición de H_{2}SO_{4} 2 M. Los resultados se muestran en la tabla 3.

TABLA 3

8

Los aminoácidos indicados en cursiva están conservados y son parte del marco de trabajo del banco.

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Ejemplo 5 Evaluación de la especificidad de fagos seleccionados mediante resonancia de plasmón de superficie

Se inmovilizaron anticuerpos covalentemente sobre un chip CM5 revestido de dextrano como se describe en el ejemplo 2. Los fagos se diluyeron en 10 veces en HBS-EP y se inyectaron a 10 \mul/min durante 3 min. Las cantidades de fágmido unido se registraron a tiempo real y se expresaron en unidades de respuesta (RU). Para evaluar el bloqueo por holoTC se inyectó 1 \muM de holoTC a 10 \mul/min durante 5 min antes de la inyección de los fágmidos a 10 \mul/min durante 3 min. La inhibición se calculó como el número de RU del fágmido unido a 3C4 con pretratamiento con holoTC, dividido entre el número de RU unidas sin pretratamiento, por 100.

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TABLA 4 Unión de los fágmidos a mAb 3C4 y bloqueo con holoTC 1 \muM

9

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TABLA 5 Unión de fágmidos a anticuerpos anti-TC que tienen diferentes epitopos sobre TC

10

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Ejemplo 6 Ensayo para la medición directa de holoTC 6.1) Yodación del anticuerpo monoclonal 3-9

El mAb 3-9 se marcó con 125I utilizando tubos de yodación prerrevestidos con IODO-GEN® (Pierce, EEUU) y un protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, el tubo que contenía 50 \mug de reactivo de yodación IODO-GEN® evaporado se enjuaga con 1 ml de Tris 0,025 M, NaCl 0,4 M, pH 7,4 (Tris). Después se añaden 50 \mug de anticuerpo en Tris y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. Se añaden 50 \mul de tirosina 10 mg/ml en Tris y se incuba durante 5 min y después la mezcla se cromatografía sobre una columna de NAP-5 equilibrada con 10 ml de tampón fosfato 0,01 M, NaCl 0,3 M, mertiolato al 0,01%, y BSA 1 mg/ml, pH 7,3.

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6.2) Inmovilización de mAb 3C4 específico para holoTC sobre esferas magnéticas

Se lavaron 4 mg de Estapor® EMI-100/40, 0,83 \mum de esferas magnéticas tres veces en 4 ml de tampón MES 0,05 M enfriado en hielo, pH 6,0 (MES). La activación se realizó en 42 ml de EDC 0,063 M/sulfo-NHS 0,033 M durante 15 min a temperatura ambiente. Las esferas activadas se enjuagaron dos veces en 30 ml de MES. Se inmovilizaron 2,8 mg de mAb 3C4 sobre la esferas en 6,8 ml de MES durante 2 h a temperatura ambiente. El bloqueo se realizó con BSA 5 mg/ml, etanolamina 0,05 M en PBS. Después las esferas de bloqueo se lavaron tres veces en PBS y se resuspendieron en 40 ml de PBS.

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6.3) Ensayo para la holoTC utilizando mAb 3C4 como anticuerpo de captura

Se mezclaron 800 \mul de suero con 800 \mul de PBS y se añadieron 50 \mul de esferas magnéticas revestidas con mAb 3C4. Después de una incubación a temperatura ambiente durante 1 h, las esferas se separaron utilizando una rejilla magnética, se lavaron tres veces cn 400 \mul de PBS que contenía BSA 1 mg/ml (PBA), y se resuspendieron en 400 \mul de PBA. Después se añadieron 50000 cpm de mAb 3-9 marcado con 125I y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las esferas se separaron con la rejilla magnética, se lavaron tres veces con 400 \mul de PBA y se contaron en un contador gamma. Se construyó la curva patrón utilizando calibradores formados por holoTC humana recombinante, y se procesa en paralelo con las muestras. Una curva patrón típica se observa en la figura 4.

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6.4) Ensayo para la holoTC utilizando mAb 3C4 como anticuerpo detector

Los acontecimientos de unión fueron seguidos a tiempo real utilizando una resonancia de plasmón de superficie y se realizaron en un instrumento Biacore (Biacore^{TM}, Suecia). Un anticuerpo monoclonal anti-TC humana dirigido contra el epitopo 2 de la TC se inmovilizó sobre un chip CM5 revestido con dextrano, como se describió en el ejemplo 2.1 anterior. El chip con el anticuerpo inmovilizado se introdujo en el instrumento, tras lo cual se inyectaron 15 \mul de holoTC y apoTC 18 ng/\mul. La proporción de holoTC a apoTC variaba de 0:100 a 100:0, pero la cantidad total siempre era la misma, 18 ng/\mul. Después se inyectaron 5 \mul de mAb 3C4 50 ng/\mul y se registró la cantidad de anticuerpo unido en el sensograma. La figura 5a representa la curva patrón típica. La figura 5b muestra una curva generada de la misma forma, en la que el ligando de captura para el epitopo 2 era mAb TC7.

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6.5) Conjugación del anticuerpo monoclonal 3-11 con peroxidasa de rábano

El mAb 3-11 se conjugó con peroxidasa de rábano (HRP) utilizando el kit de HRP activado con maleimida EZ-Link^{TM} (Pierce, EEUU) y un protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, el mAb 3-11 en PBS es modificado con un exceso molar en 25 veces de SATA (S-acetiltioacetato de N-succinimidilo) en DMF (dimetilformamida) y, después de 30 min, se desprotegió con un exceso molar en 90 veces de hidroxilamina durante 2 h a temperatura ambiente. El anticuerpo tiolado se desala y después se deja reaccionar con un exceso en 8 veces de HRP activado con maleimida EZ-Link^{TM} a temperatura ambiente durante 1 h. El conjugado se dializa tres veces contra un volumen en exceso en 100 veces de PBS.

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6.6) Conjugación del anticuerpo 3-11 con fosfatasa alcalina

El mAb 3-11 se biotiniló utilizando el kit de sulfo-NHS-LC-biotinilación EZ-Link^{TM} (Pierce, EEUU) y un protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, 10 nmol del mAb 3-11 en PBS se mezcla con un exceso molar en 20 veces de sulfo-NHS-LC-biotina en agua desionizada. Se mantuvo en hielo durante 2 h y después se purificó la proteína en una columna de filtración en gel equilibrada con PBS. Por último, se deja que el anticuerpo biotinilado se una a fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., EEUU).

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6.7) Ensayo de "sándwich" no isotópico para holoTC utilizando mAb 3C4 como anticuerpo de captura

Se revistieron placas Maxisorb (NUNC-Immuno^{TM}, Dinamarca) con mAb 3C4 10 \mug/ml en PBS durante la noche a 4ºC y después se bloquearon con BSA 10 mg/ml en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. A cada pocillo se le añadieron 50 \mul de suero y 50 \mul de PBS, y se dejó en incubación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con 200 \mul de PBA + Tween al 0,05% (PBA+), se añadieron 100 \mul de mAb 3-11 conjugado con HRP (véase 6.5) y se dejó la mezcla en incubación durante 30 min a temperatura ambiente. Cada pocillo se lavó tres veces con 200 \mul de PBA+ y 200 \mul de HRP-sustrato, se añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; Kirkegaard & Perry Laboratories, EEUU) y se incubó durante 10 min. La reacción se extinguió con 100 \mul de HCl 0,12 M y se midió el desarrollo de color a 450 nm. Una curva patrón típica se muestra en la figura 4B.

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6.8) Ensayo de "sándwich" no isotópico para holoTC utilizando scFv 3C4 como anticuerpo de captura

Se revistieron placas Maxisorb (NUNC-Immuno^{TM}, Dinamarca) con mAb anti-his-marcador 10 \mug/ml (abcam, Reino Unido) en PBS durante la noche a 4ºC y después se bloquearon con BSA 10 mg/ml en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. A cada pocillo se le añadieron 50 \mul de holoTC y 50 \mul de PBS, y se dejó en incubación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con 200 \mul de PBA + Tween al 0,05% (PBA+), se añadieron 100 \mul de mAb 3-11 conjugado con HRP (véase 6.5) y se dejó la mezcla en incubación durante 30 min a temperatura ambiente. Cada pocillo se lavó tres veces con 200 \mul de PBA+ y 100 \mul de HRP-sustrato, se añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; Kirkegaard & Perry Laboratories, EEUU) y se incubó durante 10 min. La reacción se extinguió con 100 \mul de HCl 0,12 M y se midió el desarrollo de color a 450 nm. Una curva patrón típica que utiliza el tipo salvaje y dos mutantes modificados se muestra en la figura 4C.

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6.9) Ensayo de esferas no isotópico para holoTC utilizando mAb 3C4 como anticuerpo de captura

Se mezclaron 50 \mul de suero y 50 \mul de PBS con 10 \mul de esferas magnéticas revestidas con mAb 3C4. Después de una incubación a temperatura ambiente durante 20 min, las esferas se separaron utilizando una rejilla magnética, se lavaron seis veces con 200 \mul de PBA+, y se resuspendieron en 100 \mul de mAb 3-11 conjugado con AP. Después de 20 min, las esferas se separaron con la rejilla magnética, se lavaron seis veces con PBA+, se añadió sustrato Lumiphos®Plus (Aureon Biosystems GmbH, Austria), y se leen en un luminómetro. Una curva patrón típica se muestra en la figura 4D.

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Ejemplo 7 Ensayo de comparación con el ensayo comercial

Se cuantificaron 15 muestras de suero con unos valores de holoTC que variaban de 14 pm a 130 pM, según se determina mediante un ensayo disponible en el mercado para la holoTC, HoloTC RIA®, mediante el ensayo para la holoTC descrito en el ejemplo 6.3. Una comparación de los valores obtenidos mediante los dos métodos demostró una buena correlación (r = 0,96) (figura 6a).

Se cuantificaron 24 muestras de suero con unos valores de holoTC que variaban de 24 pmol/l a 148 pmol/l, según se determina mediante un ensayo disponible en el mercado para la holoTC, HoloTC RIA®, mediante el ensayo para la holoTC descrito en el ejemplo 6.7. Una comparación de los valores obtenidos mediante los dos métodos demostró una buena correlación (r = 0,98) (figura 6B).

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Ejemplo 8 Ensayo dual para holoTC y apoTC

Los acontecimientos de unión fueron seguidos a tiempo real utilizando una resonancia de plasmón de superficie y se realizaron en un instrumento Biacore (Biacore^{TM}, Suecia). El anticuerpo de captura (un anticuerpo monoclonal anti-TC humana de alta afinidad dirigido contra el epitopo 2 de la TC) se inmovilizó sobre un chip CM5 revestido con dextrano, como se describió en el ejemplo 2.1 anterior. El chip con el anticuerpo inmovilizado se introdujo en el instrumento, tras lo cual se inyectaron 15 \mul de una mezcla de holoTC y apoTC. Las cantidades relativas de holoTC y apoTC variaban pero la concentración total de TC era constante, 18 ng/\mul. La cantidad de holoTC unida se determinó mediante la inyección de 60 \mul de 400 ng/\mul del anticuerpo específico de holoTC, el mAb 3C4. La cantidad de mAb 3C4 unido se registró en el sensograma. El chip se sometió a una etapa de lavado y después se determinó la cantidad de apoTC unida mediante la inyección de 5 \mul de 25 ng/\mul de mAb TC2. El mAb TC2 es específico para TC pero se solapa completamente con el mAb 3C4 sobre holoTC y, por tanto, cuando se inyecta posteriormente al mAb 3C4, detecta sólo la fracción de apoTC. Las figuras 7a y 7b muestra la relación entre apoTC y holoTC capturadas por el primer anticuerpo y la cantidad de los mAb 3C4 y TC2 unidos. Debido a que el mAb 3C4 es un anticuerpo de baja afinidad es difícil obtener el bloqueo completo de holoTC, pero debido a que la holoTC sólo es 6-25% de la TC total, un bloqueo de >90% es suficiente. En la figura 7b, el primer anticuerpo es TC7.

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Ensayo 9

Ensayo dual para holoTC y apoTC

Se inmoviliza un anticuerpo monoclonal específico anti-TC humana, que no se solapa con los epitopos 4 ni 5, por ejemplo, dirigido contra el epitopo 2, sobre esferas magnéticas como se describió en el ejemplo 2.1 anterior. Una parte alícuota de suero o de plasma (100-500 \mul) se mezcla con un volumen 1/10 del anticuerpo inmovilizado y opcionalmente con PBS (>100 \mul) y se deja en incubación durante 30 min a temperatura ambiente. Las esferas se sedimentan utilizando un imán, se lavan dos veces con PBS y se resuspenden en PBS que contiene 1 mg/ml de BSA. Se añade un exceso de mAb 3C4 conjugado con un resto productor de señal y se incuba durante 30 min, y las esferas entonces se sedimentan y se lavan como antes, y se resuspenden en PBS que contiene 1 mg/ml de BSA. Se añade un exceso de mAb TC2 conjugado con un resto productor de señal diferente y la mezcla se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Las esferas se sedimentan y se lavan como antes. Por último, los mAb 3C4 y TC2 unidos se miden utilizando su respectivo resto productor de señal, y se determinan las concentraciones de holoTC y apoTC mediante la interpolación en una curva patrón.

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Ejemplo 10 Ensayo dual para holoTC y TC total: saturación de TC

Los acontecimientos de unión fueron seguidos a tiempo real utilizando una resonancia de plasmón de superficie y se realizaron en un instrumento Biacore (Biacore^{TM}, Suecia). El anticuerpo de captura (un anticuerpo monoclonal anti-TC humana de alta afinidad dirigido contra el epitopo 2 de la TC) se inmovilizó sobre un chip CM5 revestido con dextrano, como se describió en el ejemplo 2.1 anterior. El chip con el anticuerpo inmovilizado se introdujo en el instrumento, tras lo cual se inyectaron 15 \mul de una mezcla de holoTC y apoTC. Las cantidades relativas de holoTC y apoTC variaban pero la concentración total de TC era constante, 18 ng/\mul. La cantidad de holoTC unida se determinó mediante la inyección de 60 \mul de 400 ng/\mul del anticuerpo específico de holoTC, el mAb 3C4. La cantidad de mAb 3C4 unido se registró en el sensograma. El chip se sometió a una etapa de lavado y después se determinó la cantidad de TC total unida mediante la inyección de 15 \mul de 100 ng/\mul de mAb 3C12. El mAb 3C12 es específico para TC y se une al epitopo 6, que no se solapa con los epitopos 2 y 4 (figura 3). Dejando que los mAb 3C4 y 3C12 se unan a holoTC/apoTC inmovilizadas, de manera simultánea o consecutiva, pueden determinarse los contenidos en holoTC y TC total y expresarse como valores absolutos o como el nivel de saturación. La figura 8 muestra una curva patrón típica para la saturación de TC. La figura 9 muestra la unión de los anticuerpos 3C4 y 3C12 a holoTC y TC total en la muestra, respectivamente.

Tabla 6. Secuencias de los fragmentos de anticuerpo Fv monocatenarios de los anticuerpos monoclonales TC2 y 3C4.

Las secuencias VH aparecen en letras mayúsculas, seguidas de la secuencia conectora en letras minúsculas y por último aparecen las secuencias VL en mayúsculas:

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Ejemplo 11 Fragmentos de anticuerpos monocatenarios que se corresponden con los mAb TC2 y 3C4

Se generaron y se secuenciaron anticuerpos monocatenarios que se corresponden con TC2 y 3C4. Las secuencias se muestran en la tabla 6, en la que para cada scFv, la región variable de la cadena pesada (VH) se muestra en letras mayúsculas, seguida de la secuencia conectora en letras minúsculas, y seguida de la secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL). Los scFv que tienen las secuencias que aparecen en la tabla 6 se inmovilizaron sobre chips SPR y se comparó la cinética de unión con la de los correspondientes anticuerpos IgG completos utilizando el método descrito en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 8, que demuestra que la especificidad de los scFv es equivalente a la del correspondiente anticuerpo completo.

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Tabla 6. Secuencias de scFv

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Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de scFv

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TABLA 8 Comparación de la cinética de unión para anticuerpos IgG y scFv anti-TC humana según se mide mediante SPR (Biacore)

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Ejemplo 12 Preparación de fragmentos de anticuerpos monocatenarios a partir de ARNm utilizando métodos comerciales 12.1) Preparación de ARNm

Se prepara ARNm puro a partir de células de hibridoma utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrep® (Amersham Biosciences) y el protocolo suministrado en él.

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12.2) Conversión a ADNc

El ARNm se utiliza como molde para preparar ADNc. Se emplean cebadores hexaméricos aleatorios para cebar la síntesis de ADNc y generar un heterodúplex de ADNc:ARNm utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra (Amersham Biosciences) y el protocolo suministrado.

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12.3) PCR de los genes V_{H} y V_{L}

El heterodúplex de ADNc:ARNm se desnaturaliza con calor y la hebra de ADNc se emplea como molde para la PCR, en presencia de cebadores específicos diseñados para la amplificación de los dominios V_{H} y V_{L} de la mezcla de cebadores ligeros y pesados (Amersham Biosciences). Como alternativa, en la bibliografía aparecen varios de estos cebadores (por ejemplo, en McCafferty, supra) y pueden prepararse mediante métodos sintéticos convencionales.

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12.4) Purificación de los genes V_{H} y V_{L} amplificados

Los fragmentos amplificados de la PCR de la cadena V_{H} y V_{L} se purifican por separado mediante electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% con tinción con bromuro de etidio. Las bandas de V_{H} y V_{L} se retiran cuidadosamente y el producto de la PCR se recupera con el kit de purificación de gel S.N.A.P.^{TM} (Invitrogen, nº de catálogo K1999-25) o un producto comercial similar.

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12.5) Ensamblaje de los genes V_{H} y V_{L} en genes de scFv

Los dominios de las cadenas V_{H} y V_{L} se unen entre sí utilizando el fragmento conector (GGGS), para producir una secuencia de scFv completa. El conector es lo suficientemente flexible como para permitir que los dominios de V_{H} y V_{L} mantengan su conformación de unión al antígeno, y conecta a los dominios de V_{H} y V_{L}. Otros conectores son muy conocidos y comprende aproximadamente 15 aminoácidos.

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12.6) Amplificación con PCR, digestión y acoplamiento al fágmido

El anticuerpo scFv se amplifica utilizando cebadores que incorporan sitios para enzimas de restricción (SfiI y NotI (Promega)). El ADN amplificado se purifica como en 12.4 anterior, se digiere con estas enzimas y por último se subclona en el fágmido pCANTAB-5E (Amersham Biosciences).

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12.7) Transformación y expresión de anticuerpos solubles

El vector que contenía el gen de scFv se introduce en células de E. coli mediante electroporación y las células se cultivan bajo condiciones que permiten que sólo crezcan las células infectadas con el vector. Preferiblemente, se elige una cepa de E. coli que transporte la proteína sintetizada hacia el espacio periplásmico (por ejemplo, HB2151).

Para simplificar la purificación del anticuerpos scFv sintetizado, el gen de scFv en 12.6 puede subclonarse en un vector de expresión que inserta un "marcador" en el extremo C-terminal del anticuerpos (por ejemplo, pCANTAB6; marcador his). El "marcador" es reconocido por el anticuerpo monoclonal y puede utilizarse para una purificación mediante cromatografía de afinidad.

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12.8) Transformación y expresión de anticuerpos scFv sobre la superficie de bacteriófagos

El vector pCANTAB5E que contiene el gen scFv se introduce en una cepa supresora de E. coli (por ejemplo, TG1), que permite que el anticuerpo scFv se presente sobre la superficie del fago. Las partículas del fago que presentan los anticuerpos scFv se preparan fundamentalmente como se describe en 4.2.

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Ejemplo 13 Maduración de afinidad de scFv utilizando la presentación de fagos

Para construir un banco de scFv presentado sobre la superficie de bacteriófagos se siguen fundamentalmente las etapas del ejemplo 12 pero se introduce un método de mutagénesis de PCR en la etapa 12.6. Varios de estos métodos están descritos pero en general se recomienda una estrategia de mutagénesis no localizada, como PCR propensa a errores (por ejemplo, el kit de mutagénesis aleatoria Genemorph®, Stratagene, EEUU) o de reordenamiento de cadenas (por ejemplo, la diversidad inducida por fragmentos, FIND^{TM}, Alligator Biosciences AB, Suecia) para introducir mutaciones aleatoriamente a través de los genes V. En el último caso, se requieren al menos dos clones de anticuerpos scFv diferentes entre los que reordenar las cadenas (tabla 6). Entonces se realiza una bioinmunopurificación de los bancos mutantes para seleccionar los clones de mayor afinidad.

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13.1) Amplificación por PCR propensa a errores

El ADN del anticuerpo scFv se amplifica mediante PCR utilizando cebadores de secuenciación para los genes V del anticuerpo y Taq polimerasa, en presencia de MnCl_{2} 0,5-2,0 mM, que reduce la fidelidad de la Taq polimerasa. El ADN amplificado se purifica, se digiere y se subclona como se describe en el ejemplo 12.

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13.2) Reordenamiento de cadenas (FIND^{TM}, Alligator Biosciences AB)

Al menos dos ADN de anticuerpos scFv diferentes se fragmentan con exonucleasa (por ejemplo, BAL31; Fermentas Life Sciences, Lituania) para generar poblaciones de fragmentos monocatenarios. Los fragmentos de ADNmc se purifican mediante una extracción con fenol/precipitación con etanol seguidas de una electroforesis como se describió en 12.4. Los fragmentos de ADNmc se reensamblan y se amplifican mediante PCR utilizando secuencias cebadoras que asocian los extremos 3' y 5' de los fragmentos. Los scFv asociados se purifican y se subclonan como se describe en el ejemplo 12.

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13.3) Bioinmunopurificación de los bancos mutantes

Los bancos generados tenían un tamaño de 10^{5}-10^{6} clones individuales. La holoTC se biotiniló como se describe en 6.6 y se une a esferas revestidas de estreptavidina (Dynabeads®, Dynal Biotech, Noruega). El procedimiento de bioinmunopurificación se realizó fundamentalmente como se describió en 4.2. Para asegurarse de que la especificidad de holoTC no resultó comprometida se realizó la inmunopurificación en presencia de un exceso en al menos 100 veces de apoTC. Como alternativa, los bancos se pretrataron con un exceso de apoTC inmovilizada sobre esferas magnéticas.

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13.4) Selección con ELISA

Los clones de anticuerpos de fagos individuales se seleccionaron mediante ELISA fundamentalmente como se describe en 4.3, utilizando placas de microvaloración revestidas con holoTC. Las placas se prepararon mediante la unión de holoTC biotinilada sobre pocillos de microvaloración revestidos con estreptavidina (NUNC^{TM}, Dinamarca). Los anticuerpos de fagos seleccionados se transformaron y se expresaron como anticuerpos scFv solubles, como se describe en 12.7.

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13.5) Evaluación de los anticuerpos scFv seleccionados

Los anticuerpos scFv seleccionados se evaluaron mediante resonancia de plasmón de superficie fundamentalmente como se describe en el ejemplo 2. Las preparaciones de anticuerpos purificados se inyectaron sobre un chip con holoTC inmovilizada. El chip de holoTC se preparó mediante la unión de holoTC a un chip preparado como se describe en 2.1 o mediante la unión de holoTC biotinilada sobre un chip SA revestido de estreptavidina (Biacore, Suecia). Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 9 y 10.

TABLA 9 Mediciones de afinidad de scFv 3C4 mutado a partir de la primera ronda de construcciones de bancos

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TABLA 10 Mediciones de afinidad de scFv 3C4 mutado a partir de la segunda ronda de construcciones de bancos

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Los valores de k_{disoc} indicados son en general mayores que los de la tabla 9 porque la cantidad de antígeno unido fue menor en este experimento, 500 RU, comparado con 3500 RU, y por tanto se produjeron menos nuevas uniones.

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Ejemplo 14 Reconfiguración de anticuerpos scFv para producir de nuevo un formato de anticuerpos de longitud completa

Los fragmentos de anticuerpos scFv se vuelven a reconfigurar para producir de nuevo el formato de anticuerpo de longitud completa uniendo los scFv de los clones de ADNc a regiones constantes genómicas de ratón o humanas utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales (por ejemplo, McCafferty J., Hoogenboom H.R, y Chiswell, D.J. (ed.) (1996), Antibody Engineering - A practical approach, IRL Press, Oxford, Reino Unido). Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera quiméricos se colocan bajo el control de un promotor vírico fuerte (por ejemplo, hCMV-MIE), y se cotransfectan en la línea celular COS-1 (ATCC nº CRL1650) o la línea celular de mieloma NS0 (ATCC nº 85110503), para la expresión transitoria y estable del anticuerpo, respectivamente. Para minimizar el riesgo de que existan autoanticuerpos interferentes contra Fc de IgG de mamífero (por ejemplo, el factor reumatoide), la reconfiguración puede realizarse en el formato IgG3, que es menos susceptible a estos autoanticuerpos.

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14.1) Transfección de células COS-1

Las células COS-1 se colocan en una placa Petri el día antes de la transfección. El ADN plasmídico, que contiene el gen que se va a expresar, se transfecta en las células utilizando, por ejemplo, Fugene 6 (Roche), y el anticuerpo se recolecta del medio después de 3 días.

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14.2) Transfección de células NS0

El ADN plasmídico se transfecta en aproximadamente 10E7 células NS0 en hielo mediante electroporación. Las células entonces se cultivan en un medio selectivo que sólo permite sobrevivir a las células transfectadas. El anticuerpo se recolecta del medio celular tres semanas después de la transfección.

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Ejemplo 15 Cartografiado de epitopos del aptámero b974-3t1

Se determinó la especificidad de epitopo del aptámero b974-3t1 de 18.000 Da.

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15.1) Unión del aptámero a holoTC inmovilizada sobre diversos mAb anti-TC humana

Se inmovilizó una matriz de 10 anticuerpos anti-TC humana diferentes sobre un chip revestido de dextrano que se había rerrevestido con IgG antirratón de conejo. El procedimiento fue como se describió anteriormente para el ejemplo 2.2. La holoTC (15 \mul, 0,4 \muM) se inyectó y se dejó que se uniese al mAb, seguido del aptámero b974-3t1 (15 \mul,
1 \muM).

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15.2) Unión de la holoTC por el aptámero inmovilizado en presencia y en ausencia de diversos mAb anti-TC humana

El aptámero b974-3t1 se inmovilizó sobre partículas magnéticas revestidas con estreptavidina (0,8 \mum) en un método análogo al ejemplo 3.1 anterior, sustituyendo las partículas revestidas con IgG antirratón de ese ejemplo por partículas de estreptavidina. Entonces se deja que las partículas capturen a la holoTC nativa como se describió en el ejemplo 3.2 anterior, en presencia de 9 anticuerpos específicos de TC diferentes. Todos los anticuerpos estaban presentes a 10 \mug/ml excepto 5H2 y 3C4, que se ensayaron a 100 \mug/ml.

TABLA 11 Unión del aptámero a holoTC inmovilizada sobre diversos mAb y unión de holoTC al aptámero inmovilizado en presencia de diversos mAb

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Como puede observarse en la tabla 11, el aptámero b974-3t1 se solapa completa o casi completamente con los anticuerpos del epitopo 6 y con algunos anticuerpos del epitopo 2 (2A). Se obtienen resultados ambiguos con el mAb 3-9 y en cierto grado con 5H2; el aptámero y el mAb se unían ambos simultáneamente con holoTC en un escenario pero no en el otro; sin embargo, no es infrecuente que el modo de presentación afecte a la eficacia de unión. Puesto que se observa unión simultánea en al menos un experimento, se excluye el solapamiento completo.

En línea con el fuerte solapamiento del aptámero con el epitopo 6, el solapamiento con la heparina también es muy fuerte (véase la figura 3 del mapa de epitopos y la figura 10 de los datos de inhibición).

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Ejemplo 16 Captura de holoTC por el anticuerpo específico de holoTC 3C4 y detección por el aptámero b974-3t1

Los acontecimientos de unión fueron seguidos a tiempo real utilizando una resonancia de plasmón de superficie y se realizaron en un instrumento Biacore (Biacore^{TM}, Suecia). El anticuerpo monoclonal 3C4 se inmovilizó sobre un chip CM5 revestido con dextrano, como se describió en el ejemplo 2.1 anterior. El chip con el anticuerpo inmovilizado se introdujo en el instrumento, tras lo cual se inyectaron 15 \mul de holoTC o apoTC 0,4 M, y después 15 \mul del aptámero b974-3t1 1 \muM. El aptámero se une a un nivel de aproximadamente 10 RU con la holoTC capturada; 39 mRU del aptámero se unen por RU de holoTC capturada (figura 11, curva superior). Puesto que la apoTC no fue capturada por el mAb 3C4 específico de holoTC, en este segundo caso el aptámero no se unió (figura 11, curva superior).

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Ejemplo 17 Captura de apoTC y holoTC por el aptámero específico de TC b974-3t1 inmovilizado y detección de la holoTC unida utilizando el mAb 3C4 y la TC total (apoTC y holoTC) por el anticuerpo del epitopo 2 mAb 4-7 17.1) Inmovilización del aptámero sobre un chip SA revestido con estreptavidina

El aptámero b974-3t1 biotinilado se inmovilizó sobre un chip SA revestido con estreptavidina (Biacore, Suecia). El aptámero se diluyó hasta aproximadamente 18 \mug/ml en tampón HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005% (en v/v) suplementado con CaCl_{2} 2 mM y MgCl_{2} 2 mM (HBS-P+), y se inyectó sobre el chip a 5 \mul/min durante 7 min. La unión del aptámero se siguió a tiempo real y la cantidad de masa unida se registró en RU (unidades de respuesta) en el sensograma. El aptámero se inmovilizó sobre el chip a aproximadamente 1500 RU.

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17.2) Unión de apoTC y holoTC al aptámero inmovilizado

La apoTC y la holoTC se diluyeron en HBS-P+ hasta aproximadamente 18 \mug/ml y se inyectaron sobre el chip con el aptámero inmovilizado a 5 \mul/min durante 7 min. La cantidad de masa unida se registró con el sensograma.

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17.3) Detección de la apoTC y la holoTC unidas mediante anticuerpos monoclonales específicos de TC y holoTC

El anticuerpo monoclonal mAb 3C4, específico para holoTC, diluido hasta 50 \mug/ml en HBS-P+, se inyectó sobre el chip con la apoTC o la holoTC capturadas a 5 \mul/min durante 1 min. Después se inyectó un anticuerpo monoclonal con especificidad por TC pero sin especificidad por holoTC y con un epitopo que no se solapa con mAb 3C4 (anticuerpo del epitopo 2; mAb 4-7) a 5 \mul/min durante 1 min. La masa unida de cada mAb se registró en el sensograma.

La figura 12 muestra un sensograma típico que muestra la captura de apoTC y holoTC por el aptámero inmovilizado, seguido de la unión de los mAb 3C4 y 4-7 a la TC capturada. Las flechas identifican las inyecciones de TC (iny.), mAb 3C4 (3C4) y mAb 4-7 (4-7), y lavado (lv). Mientras que el mAb 3C4 se une sólo a la holoTC capturada, el mAb 4-7 se unía igual de bien a la apoTC y a la holoTC (tabla 12). Como se muestra en la figura 12, el aptámero b974-3t1 muestra una ligera especificidad por holoTC frente a apoTC (es decir, la cantidad de TC unida al chip era mayor que cuando estaba en la forma holo). Se estimó que la preferencia era de aproximadamente 3 veces.

TABLA 12 Unión de los mAb 3C4 y 4-7 a apoTC y a holoTC capturadas por el aptámero b974-3t1

19

Ejemplo 18 Predicción desde el principio de la estructura tridimensional de la transcobalamina humana

La simulación se realizó utilizando el servidor de predicción HMMSTR/Rosetta. El servidor HMMSTR/Rosetta predice la estructura de las proteína a partir de la secuencia: la estructura secundaria en forma de 3 estados (H, E, L), la estructura local en forma de ángulos de torsión del esqueleto (phi, psi), la estructura supersecundaria en forma de símbolos de contexto (para las cadenas y las vueltas beta), y la estructura terciaria en forma de coordenadas (C. Bystoff, V. Thorsson, D. Baker). El HMMSTR es un modelo de Markov oculto basado en el banco de sitios I de motivos de estructura-secuencia. Los sitios I predicen los motivos de estructura locales del problema, y éstos entonces son utilizados por Rosetta para generar la estructura tridimensional. Rosetta es un programa de plegamiento de proteínas de inserción de fragmentos Monte Carlo desarrollado por Kim Simons, David Baker, Ingo Rudzinski y Charles Kooperberg (Simons et al., 1997). La secuencia de aminoácidos de la transcobalamina humana se tomó de Swissprot nº ID P20062.

La figura 13 muestra la estructura tridimensional predicha de la apotranscobalamina con la mutación de deleción (véase el ejemplo 2.4) en formato de cinta. La figura 13 superior muestra la parte delantera de la TC mostrándose el epitopo de mab 3C4 (del ejemplo 19) como esferas rosas. La figura 13 inferior muestra la parte trasera de la TC mostrándose el sitio de unión a la heparina provisional como esferas.

La proximidad espacial predicha de la deleción de 27 aminoácidos y el sitio de unión a la heparina provisional fue corroborada por el descubrimiento experimental de los inventores (ejemplos 2 y 13) de que los anticuerpos contra el epitopo 2, que se solapa con la mutación de deleción, son inhibidos por la heparin y el aptámero b974-3t1, que se unen ambos al sitio de unión a la heparina. Además, debido a que los anticuerpos contra el epitopo 6 son inhibidos por la heparina y el aptámero b974-3t1 y, en cierto grado, por los anticuerpos del epitopo 1 y 2, la estructura tridimensional indica que el epitopo 6 monta en horcajadas el sitio de unión a la heparina.

La figura 14 muestra un dibujo de la estructura de la holoTC como una pirámide de tres lados y muestra la localización de los diferentes epitopos de anticuerpos basándose en datos experimentales.

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Ejemplo 19 Predicción desde el principio del epitopo de mAb 3C4 sobre holoTC

Cambridge Proteomics Ltd realizaron simulaciones del acoplamiento de la cobalamina con la apoTC y del acoplamiento del mAb 3C4 con la holoTC utilizando su tecnología de simulación patentada. La secuencia de aminoácidos de la apotranscobalamina se tomó de Swissprot nº ID P20062. La cadena se dio forma en un principio de manera aleatoria. Los disulfuros que se sabe que se forman entre las cisteínas 21 y 267, 83 y 96, 116 y 309, y 165 y 205 (S.N. Fedosov et al., J. Biol. Chem., 1999, 274:26015-26020) fueron programados para crearse cuando los azufres en los respectivos restos cisteína se aproximaban hasta una distancia de 2,038 \pm 0,05 \ring{A}. La estructura tridimensional de la cobalamina se tomó de la entrada de PDB 1BMT (regiones de unión de la metionina sintasa B12) y se relajó en agua antes de hacerla reaccionar con la TC. Como se indica en la bibliografía, la unión de la cobalamina provocó cambios estructurales significativos en la TC (E. Hippe, Biochem. Biophys. Acta, 1970, 208:337-339).

Como los inventores sólo determinaron la secuencia de aminoácidos en la región CDR del mAb 3C4 (tabla 7), la estructura inicial se basó en la secuencia CDR de mAb 3C4 insertada en el modelo de IgG1 humana (E.A. Padlan, Mol. Immunol., 1994, 31:169-217). Las regiones variables se dieron forma en un principio de manera aleatoria.

Cuando se simuló la interacción entre el mAb 3C4 y la holoTC, la orientación inicial se eligió de manera aleatoria, estando la región de unión del anticuerpo apuntando entre el bucle C165-C205 y el extremo C-terminal (320-427) de la holoTC. La distancia inicial entre el anticuerpo y la holoTC era de más de 10 \ring{A} y la fuerza iónica de la disolución se ajustó a 50.

Todas las simulaciones se realizaron en una estación de trabajo Linux que funcionaba con procesadores Intel Xeon.

El epitopo se definió como los aminoácidos en la holoTC que en el complejo predicho se localizan a <5 \ring{A} de los aminoácidos en el anticuerpo. Treinta y seis aminoácidos cumplían estos requisitos, y pueden organizarse en tres regiones discretas que abarcan los aminoácidos 39-77 más 265-269, 161-243, y 271-297 (tabla 13A). Incluyendo los aminoácidos adyacentes, el número de restos aminoácidos que definen el epitopo es 68 (tabla 13B). El epitopo se localiza alrededor de un túnel en la proteína (figura 13). En el otro lado del túnel se une la cobalamina.

En el anticuerpo, los aminoácidos que se corresponden con el epitopo y el epitopo extendido son 32 y 39, respectivamente, constituyendo el paratopo y el paratopo extendido. Los aminoácidos se organizan en dos regiones, 14 y 16 restos en la cadena VL, y 18 y 23 restos en la cadena VH para el paratopo y el paratopo extendido, respectivamente (tablas 14A y B). La interacción entre el paratopo (anticuerpo) y el epitopo (holoTC) y los restos implicados se muestra en la figura 15A. La correspondiente interacción entre el paratopo extendido y el epitopo extendido se muestra en la figura 15B.

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TABLA 13A Restos del epitopo

20

TABLA 13B Epítopo extendido

21

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TABLA 14A Restos del paratopo

23

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TABLA 14B Paratopo extendido

24

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<110> Axis-Shield ASA

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<120> Ensayo de Cobalamina

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<130> 44.95.79036/003.jc

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<160> 19

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 427

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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25

26

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<210> 2

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<211> 427

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 2

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27

28

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<210> 3

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 5

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip1cm

32

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<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> X

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X1 = F, G, L

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> X

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<222> (3) .. (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X2 = F, L, R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> X

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X3 = L, P, Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> X

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X4 = M, Q, Y

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> X

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X5 = D, F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> X

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X6 = M, R

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\hskip1cm

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 738

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 729

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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43

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 246

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<212> PRT

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<213> Artificial

\newpage

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<400> 18

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44

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<210> 19

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<211> 243

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<212> PRT

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<213> Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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45

Claims (26)

1. Un método para identificar parejas de unión específica para la holoTC, que tengan una mayor especificidad para la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, que comprende seleccionar un banco de ligantes específicos potenciales con al menos un péptido cíclico que comprende el motivo

SX_{1} X_{2}YX_{3} WD X_{4} X_{5} X_{6}

en el que:

X_{1} = F, G, L

X_{2} = F, L, R

X_{3} = L, P, Q

X_{4} = M, Q, Y

X_{5} = D, F

X_{6} = M, R

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o el motivo SFFYSLCYCW, sus construcciones, o construcciones de al menos una de las regiones I a III de la TC humana como se define a continuación:

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297;

en el que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo.

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2. Un método según la reivindicación 1, en el que dichos péptidos cíclicos son presentados sobre la superficie de fagos.

3. Una pareja de unión específica que puede obtenerse mediante el método de la reivindicación 1 que tiene una especificidad mayor por la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, en la que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo, que también tiene afinidad por al menos uno de los motivos o regiones especificados en la reivindicación 1.

4. Una pareja de unión específica para la holoTC, que tiene una mayor especificidad para la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, en la que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo, que también tiene afinidad por al menos un péptido cíclico que comprende el motivo

SX_{1} X_{2}YX_{3} WD X_{4} X_{5} X_{6}

en el que:

X_{1} = F, G, L

X_{2} = F, L, R

X_{3} = L, P, Q

X_{4} = M, Q, Y

X_{5} = D, F

X_{6} = M, R

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o el motivo SFFYSLCYCW, o que se une al menos a una de las regiones I, II o III de la TC;

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297.

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5. Una pareja de unión específica para la holo TC según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que dichos péptidos cíclicos son presentados sobre la superficie de fagos.

6. Una pareja de unión específica para la holoTC según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que la unión de dicha pareja de unión específica a la holoTC es bloqueada por la unión de una pareja de unión específica que tiene afinidad por un sitio presente sobre holoTC y apoTC que se solapa con el sitio de unión sobre holoTC de dicha pareja de unión específica para la holoTC.

7. Una pareja de unión específica según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que la pareja de unión específica es el anticuerpo 3C4 depositado en the European Collection of Cell Cultures con el nº de registro 02110741.

8. Una pareja de unión específica según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que la pareja de unión específica es un anticuerpo monocatenario con la secuencia de aminoácidos:

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46

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o su anticuerpo monocatenario madurado para la afinidad.

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9. Un método de ensayo para ensayar la holoTC en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con una pareja de unión específica para la holoTC y detectar los conjugados resultantes de holoTC y la pareja de unión específica, en el que dicha pareja de unión específica es según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que dichos conjugados de holoTC y la pareja de unión específica se detectan directamente mediante una propiedad del conjugado.

11. Un método según la reivindicación 9, en el que dichos conjugados de holoTC y la pareja de unión específica se detectan indirectamente detectando otros conjugados formados en competición, o detectando un conjugado de la pareja de unión específica, la holoTC y otro ligando.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha pareja de unión específica para la holoTC está inmovilizada o es inmovilizable, y se emplea para capturar la holoTC.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha pareja de unión específica para la holoTC se emplea para detectar la holoTC que está capturada por un ligando secundario inmovilizado o inmovilizable.

14. Un método de ensayo para la holoTC según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende el uso de un mimotopo de péptido constreñido que comprende el motivo

SX_{1} X_{2}YX_{3} WD X_{4} X_{5} X_{6}

en el que:

X_{1} = F, G, L

X_{2} = F, L, R

X_{3} = L, P, Q

X_{4} = M, Q, Y

X_{5} = D, F

X_{6} = M, R

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o el motivo

SFFYSLCYCW

o una construcción de dos o más de dichos mimotopos.

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15. Un método según la reivindicación 14, en el que dicho mimotopo es presentado sobre la superficie de fagos.

16. Un método según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que dicho mimotopo se utiliza como competidor para la holoTC en la unión a dicha pareja de unión específica para la holoTC.

17. Un método según la reivindicación 9, que comprende:

i) poner en contacto una muestra líquida procedente de un sujeto, con una pareja de unión específica (sbp) para la holoTC inmovilizada o inmovilizable para formar un conjugado de holoTC:sbp,

ii) poner en contacto la pareja de unión específica con un ligando secundario para TC u holoTC de forma que el ligando secundario se une a la holoTC unida para formar un conjugado de sbp:holoTC:ligando secundario,

iii) separar el ligando secundario no unido del conjugado de sbp:holoTC:ligando secundario,

iv) opcionalmente liberar el conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario de estar inmovilizado y/o liberar un holoTC:ligando secundario de la sbp,

v) opcionalmente añadir un cosustrato o ligando terciario para facilitar la detección del conjugado de
holoTC:sbp:ligando secundario o del conjugado de holoTC:ligando secundario,

vi) detectar el conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o un conjugado de holoTC:ligando secundario, y

vii) relacionar la cantidad detectada de conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o de conjugado de holoTC:ligando secundario con la concentración de holoTC en la muestra líquida para proporcionar una medición de la holoTC presente en la muestra líquida.

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18. Un método según la reivindicación 17, que comprende además relacionar la concentración de la holoTC presente en la muestra líquida con la presencia o la ausencia de una deficiencia en cobalamina en el sujeto.

19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, que comprende además medir la apoTC o la TC total.

20. Un método para inducir anticuerpos específicos de la holoTC humana en un sujeto no mamífero, que comprende administrar una sustancia inmunogénica que comprende un motivo como se define en la reivindicación 4, o que comprende al menos una de las regiones I a III como se define en la reivindicación 4, a dicho sujeto.

21. Un kit para su uso en un método de ensayo según las reivindicaciones 9 a 19, comprendiendo dicho kit una pareja de unión específica para la holoTC, opcionalmente marcada o inmovilizada, según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

22. Un kit según la reivindicación 21, en el que dicha pareja de unión específica es como se define en la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

23. Un kit según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, que comprende además un ligando de unión a TC opcionalmente marcado o inmovilizado.

24. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, que comprende además una pluralidad de disoluciones de holoTC de concentración conocida.

25. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, que comprende además instrucciones para la realización de dicho método de ensayo.

26. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, que comprende además una pluralidad de disoluciones de apoTC de concentración conocida.