ES2316149T3

ES2316149T3 - Un nuevo receptor de hemopoyetina.

Info

Publication number: ES2316149T3
Application number: ES95931079T
Authority: ES
Inventors: Douglas James Hilton
Original assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Current assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Priority date: 1994-09-05
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2015-09-05
Also published as: JP3949715B2; DE69535831D1; WO1996007737A1; EP0804576A4; JPH10505068A; EP0804576B1; US20030149236A1; US20060051842A1; EP0804576A1; US7476732B2; US6274708B1; US7002000B1; HK1004411A1; CA2197873A1; ATE407208T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A NUEVOS RECEPTORES DE HEMOPOYETINA, O A COMPONENTES O PARTES DE LOS MISMOS Y A UN METODO PARA CLONAR LAS SECUENCIAS GENETICAS QUE LOS CODIFICAN. EN PARTICULAR, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A RECEPTORES DE HEMOPOYETINA RECOMBINANTES O SINTETICOS O A COMPONENTES O PARTES DE LOS MISMOS. LAS MOLECULAS DE LOS RECEPTOR O LOS COMPONENTES O PARTES DE LOS MISMOS Y SUS SECUENCIAS GENETICAS DE LA PRESENTE INVENCION SON UTILES EN EL DESARROLLO DE UNA AMPLIA GAMA DE AGONISTAS, ANTAGONISTAS Y REACTIVOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO BASADOS EN LA INTERACCION DE LOS LIGANDOS CON SU RECEPTOR.

Description

Un nuevo receptor de hemopoyetina.

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La presente invención se refiere generalmente a nuevos receptores de hemopoyetina, o componentes o partes de los mismos, y a un método para clonar secuencias genéticas que codifican los mismos. Más particularmente, la invención en cuestión se dirige a receptores de hemopoyetina sintéticos recombinantes o componentes o partes de los mismos. Las moléculas receptoras o los componentes o las partes de las mismas y sus secuencias genéticas de la presente invención son útiles en el desarrollo de una amplia variedad de agonistas, antagonistas y reactivos terapéuticos y diagnósticos basados en la interacción del ligando con su receptor.

Detalles bibliográficos de las publicaciones referidas numéricamente en esta memoria descriptiva se recogen al final de la descripción. Los Números de Identidad de Secuencia (Nº ID SEC) para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se definen después de la bibliografía.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un integrante o grupo de integrantes indicado, pero no la exclusión de ningún otro integrante o grupo de integrantes.

La proliferación, la diferenciación y la función de una amplia variedad de células están controladas por reguladores secretados, conocidos como citoquinas. Una de tales citoquinas es la interleuquina (IL)-11, que es una molécula funcionalmente pleiotrópica (1, 2), caracterizada inicialmente por su capacidad para estimular la proliferación de la línea celular de plasmacitoma dependiente de IL-6, T11 65 (3). Otras acciones biológicas de IL-11 incluyen la inducción de la proliferación de células progenitoras de hemopoyetina multipotenciales (4, 5, 6), la potenciación de la formación de megacariocitos y plaquetas (7, 8, 9, 10), la estimulación de la síntesis de proteínas en fase aguda (11) y la inhibición de la actividad de lipasa de lipoproteínas de adipocitos (12, 13). La función diversa y pleiotrópica de IL-11 la convierte en una importante molécula de hemopoyetina para estudiar, especialmente al nivel de su interacción con su receptor.

La estructura del receptor de IL-11 no es bien conocida. Se sabe que los anticuerpos neutralizadores para gp130 inhiben la proliferación dependiente de IL-11 de células TF-1 (14) y, de ahí, es probable que gp130 forme parte del receptor. Yang y Yin (Biofactors, 4, páginas 15-21, 1992) presentaron que IL-6 e IL-11 parecen usar el transductor de señales gp130 y Fourcin et al. (Eur. J. Immunol., 24, páginas 277-280, 1994) presentaron que IL-11 actúa a través del transductor de señales gp130/la proteína de señalización de IL-6.

Miembros de la familia de receptores de hemopoyetina comprenden generalmente las cadenas \alpha y \beta (15, 16, 17). Sin embargo, hasta la llegada de la presente invención, no había información sobre la existencia de cadenas del receptor de IL-11. Durante el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores desarrollaron un procedimiento de clonación para receptores de hemopoyetina que no requiere un conocimiento previo de sus ligandos. El procedimiento de clonación ha sido satisfactorio para clonar la cadena \alpha de receptor de IL-11, permitiendo, por primera vez, un análisis molecular detallado del receptor de IL-11. Por lo tanto, la presente invención se basa en un método generalizado para clonar receptores de hemopoyetina y en particular cadenas integrantes particulares de los mismos que proporciona una base para desarrollar una gama de agonistas, antagonistas y agentes terapéuticos y diagnósticos basados en el receptor de IL-11.

De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o complementaria de una secuencia que codifica, una cadena \alpha de un receptor de interleuquina (IL)-11 que tiene

(i): una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 3; o

(ii): una secuencia de aminoácidos que es parte de la secuencia de aminoácidos indicada en el Nº ID SEC: 3, comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos los aminoácidos 24 a 432 del Nº ID SEC: 3, o los aminoácidos 1 a 367 del Nº ID SEC: 3 o los aminoácidos 24 a 367 del Nº ID SEC: 3, secuencia que comprende un motivo de la secuencia de aminoácidos como el indicado en el Nº ID SEC: 1:

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

\quad: en donde Xaa es cualquier aminoácido, y secuencia que tiene la función de una cadena \alpha de receptor de IL-11; o

(iii): una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácidos indicada en el Nº ID SEC: 3, que comprende un motivo de la secuencia de aminoácidos como el indicado en el Nº ID SEC: 1:

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

\quad: en donde Xaa es cualquier aminoácido, y que tiene la función de una cadena \alpha de receptor de IL-11.

La presente invención se basa en un método para identificar y/o clonar una secuencia genética que codifica o complementaria de una secuencia que codifica un receptor de hemopoyetina y en particular un receptor de IL-11 o un componente o una parte del mismo, comprendiendo dicho método rastrear una fuente de material genético con uno o más oligonucleótidos degenerados diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia indicada en el Nº ID SEC: 1:

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

en donde Xaa es cualquier aminoácido.

La secuencia definida en el Nº ID SEC: 1 se ha identificado en las cadenas tanto \alpha como \beta de receptores de hemopoyetina y en particular el receptor de IL-11. De acuerdo con esto, el método es aplicable a la clonación de secuencias genéticas que codifican una cadena \alpha, una cadena \beta o una combinación de cadenas tanto \alpha como \beta, tal como en un receptor de longitud completa.

Preferiblemente, la molécula genética es de origen mamífero, tal como, pero no limitado a, seres humanos, animales de ganadería (por ejemplo, ovejas, vacas, cerdos, cabras, caballos), animales para pruebas de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, cobayas), animales de compañía (por ejemplo, gatos, perros) o animales salvajes capturados. Los orígenes más preferidos son de seres humanos y especies múridas (por ejemplo, ratones). La fuente de material genético puede ser una biblioteca genómica o una biblioteca de cDNA obtenida a partir de mRNA de un tipo de célula particular tal como, pero no limitada a, células hepáticas, células de la médula ósea, células de placenta y células de hepatoma. Se prefiere una biblioteca de cDNA y también puede ser una biblioteca de expresión. Por otra parte, para la generación de mutantes, la biblioteca de cDNA puede prepararse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de alto grado de error dando como resultado una biblioteca mutante.

El término "rastreo" incluye cualquier medio conveniente para identificar clones diana. Por ejemplo, puede emplearse hibridación de colonias con sondas oligonucleotídicas o, si se prepara una biblioteca de expresión, el rastreo puede ser, por ejemplo, la actividad enzimática o la interactividad de anticuerpos. Términos tales como "componentes", "partes" o "fragmentos" incluyen separadamente una cadena \alpha y una cadena \beta o partes de las mismas. Preferiblemente, los "componentes", las "partes" y los "fragmentos" son funcionales y más preferiblemente una cadena \alpha o \beta funcional.

La molécula genética puede ser DNA (por ejemplo DNA genómico), cDNA o mRNA lineal o circular cerrado, de cadena simple o doble, o combinaciones de los mismos. La molécula genética también puede incluir un vector tal como un componente de un vector de expresión para facilitar la expresión de la secuencia genética

\hbox{del receptor de IL-11.}

De acuerdo con la presente invención, la secuencia genética codifica la cadena \alpha de receptores de IL-11 y en particular cadena \alpha de receptor de IL-11 múrido codificada por una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 2 o comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 3, o comprende una parte o un derivado de la misma según se define anteriormente. Sin embargo, el método de clonación usado en la presente memoria también puede usarse para clonar o identificar otras secuencias de receptores de hemopoyetina, tales como la que codifica la cadena \alpha de receptor de IL-11 humana y que comprende la secuencia de nucleótidos que se indica en el Nº ID SEC: 4 o una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 5 o una parte o un derivado de la misma también descrito pero no reivindicado en la presente memoria. Las secuencias genéticas entonces identificadas pueden incluir una molécula capaz de codificar un receptor de IL-11 de longitud completa o un fragmento o una porción del mismo tal como una cadena \alpha o una cadena \beta ya sea funcional o no o puede corresponder a una porción del mismo caracterizada por la secuencia de aminoácidos Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser en la que Xaa es cualquier residuo de aminoácido. Adicionalmente, la secuencia genética o parte de la misma puede actuar como una molécula o moléculas antisentido para mRNA que codifica la cadena \alpha o \beta del receptor de IL-11. Tales moléculas antisentido pueden ser útiles en terapia genética o en el diseño racional de agentes agonistas o antagonistas.

En una realización particular, se proporciona una secuencia genética que codifica un receptor de IL-11 o un componente, una parte o un fragmento del mismo en donde dicha secuencia genética comprende una secuencia de nucleótidos a la que puede hibridarse el Nº ID SEC: 2 bajo condiciones de alta restricción. Tal secuencia genética puede definirse por la capacidad de un oligonucleótido seleccionado de la siguiente lista para hibridarse a la misma:

5' (A/G)CTCCA(C/T)TC(A/G)CTCCA 3'	(Nº ID SEC: 6);

5' (A/G)CTCCA(A/G)TC(A/G)CTCCA 3'	(Nº ID SEC: 7);

5' (A/G)CTCCA(N)GC(C/T)CTCCA 3'	(Nº ID SEC: 8);

5' (A/G)CTCCA(N)GG(A/G)CTCCA 3'	(Nº ID SEC: 9);

5' (A/G)CTCCA(C/T)TT(A/G)CTCCA 3'	(Nº ID SEC: 10);

o una secuencia complementaria del mismo o una combinación de los mismos.

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Con el propósito de definir el nivel de restricción, puede hacerse convenientemente referencia a Sambrook et al. (26), que se incorpora en la presente memoria mediante referencia, donde las etapas de lavado de las páginas 9.52-9.57 se consideran alta restricción. Una baja restricción se considera en la presente memoria en SDS al 0,1-0,5% p/v a 37-45ºC durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y la concentración de ácido nucleico implicadas en la hibridación, pueden emplearse condiciones de restricción alternativas tales como condiciones restrictivas medias, que se considera en la presente memoria que son SDS al 0,25-0,5% p/v a \geq 45ºC durante 2-3 horas, o condiciones restrictivas altas como las descritas por Sambrook et al. (26).

La referencia en los Ejemplos a una cadena \alpha se considera una notación abreviada para todo el receptor o diversas partes del mismo, incluyendo la cadena \alpha o \beta.

En una realización adicional, la secuencia genética está fusionada a una secuencia genética heteróloga para codificar de ese modo una molécula de fusión con, por ejemplo, glutationa-S-transferasa, un receptor o una subunidad de la misma para IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, eritropoyetina, trombopoyetina, hormona del crecimiento, prolactina, CNTF, G-CSF, GM-CSF, gp130, o la subunidad p40 de IL- 12.

La molécula genética puede ser DNA (por ejemplo DNA genómico), cDNA o mRNA lineal o circular cerrado, de cadena simple o doble, o combinaciones de los mismos, tal como en la forma de híbridos de DNA:RNA. La molécula genética también puede incluir un vector tal como un componente de un vector de expresión para facilitar la expresión del receptor de IL-11 o sus componentes o partes. En una realización preferida, la secuencia genética codifica la cadena \alpha de IL-11 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en el Nº ID SEC: 3 (múrido) o comprende una parte o un derivado de la misma según se define anteriormente. Lo más preferiblemente, la secuencia genética comprende una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 2 (múrido) o comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida a la misma bajo condiciones de alta restricción.

Un estuche útil para clonar un miembro de la familia de receptores de hemopoyetina o un componente o una parte del mismo puede comprender en forma compartimentada un primer compartimento adaptado para contener al menos una especie de oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos basada en la secuencia de aminoácidos Nº ID SEC: 1:

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

en la que Xaa es cualquier residuo de aminoácido, y opcionalmente uno o más de otros compartimentos adaptados para contener una o más de otras especies de oligonucleótido basadas en el Nº ID SEC: 1 y/o reactivos requeridos para un ensayo de hibridación para secuencias genéticas de receptores de hemopoyetina. El estuche también puede estar envasado para la venta con instrucciones de uso. Oligonucleótidos preferidos incluyen, pero no se limitan a, los Nº ID SEC: 6 a 10.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cadena \alpha de receptor de IL-11 mamífera y que tiene

(i): la secuencia de aminoácidos que se indica en el Nº ID SEC: 3; o

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

\quad: en donde Xaa es cualquier aminoácido, y que tiene la función de una cadena \alpha de receptor de IL-11; o

(iv): una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 3 o una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 24 a 432 del Nº ID SEC: 3, los aminoácidos 1 a 367 del Nº ID SEC: 3 o los aminoácidos 24 a 367 del Nº ID SEC: 3 que está químicamente modificada mediante modificación de la cadena lateral, incorporación de aminoácidos no naturales, reticuladores u otras modificaciones químicas que imponen una limitación de conformación al polipéptido, y que tiene la función de una cadena \alpha de receptor de IL-11.

En una realización, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como la indicada en el Nº ID SEC: 3 (múrido) o que tiene al menos aproximadamente 80% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90-95% o mayor similitud con la secuencia indicada en el Nº ID SEC: 3.

El polipéptido puede tener secuencias de aminoácidos adicionales fusionadas al mismo, incluyendo GST, otra citoquina, un componente de un receptor o gp130. Puede estar glicosilado o no glicosilado dependiendo de la célula usada para producir el mismo. De acuerdo con esto, el polipéptido puede producirse en una célula procariótica (por ejemplo E. coli o especies de Bacilli) o en una célula eucariótica (por ejemplo células mamíferas tales como células BA/F3 [18], células de levadura, células de insecto).

Mutantes y derivados del receptor de hemopoyetina polipeptídico recombinante incluyen sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Por otra parte, los aminoácidos pueden reemplazarse por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como hidrofobia, hidrofilia, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas, grupos interactivos y/o funcionales, etc.

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos simples; las inserciones serán habitualmente del orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácido; y las deleciones variarán de aproximadamente 1-20 residuos. Las deleciones o inserciones se realizan preferiblemente en pares adyacentes, es decir: una deleción de 2 residuos o una inserción de 2 residuos.

Las variantes de aminoácidos mencionadas anteriormente pueden elaborarse fácilmente usando técnicas sintéticas para péptidos bien conocidas en la especialidad, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de DNA recombinante. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en DNA que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo a través de mutagénesis M13. La manipulación de secuencias de DNA para producir proteínas variantes que manifiestan variantes de sustitución, inserción o deleción es bien conocida en la especialidad.

Otros ejemplos de mutantes y derivados recombinantes o sintéticos del polipéptido receptor de hemopoyetina recombinante de la presente invención incluyen sustituciones, deleciones y/o adiciones simples o múltiples en cualquier molécula asociada con el ligando, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o polipéptidos. Formas glicosiladas presentes en la naturaleza o alteradas del ligando en cuestión son particularmente contempladas por la presente invención.

Alteraciones de aminoácidos para el presente polipéptido contemplado en la presente memoria incluyen inserciones tales como fusiones aminoácido- o carboxilo-terminales así como inserciones intrasecuencia de aminoácidos simples o múltiples. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán menores que las fusiones amino- o carboxilo-terminales, del orden de, por ejemplo, 1 a 4 residuos. Las variantes de la secuencia de aminoácidos por inserción son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en la proteína. Las variantes por deleción se caracterizan por la retirada de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes por sustitución son aquellas en las que al menos un residuo de la secuencia se ha retirado y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Tales sustituciones pueden realizarse de acuerdo con la
Tabla 1:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Los términos "análogos" y "derivados" también se extienden a cualquier equivalente químico funcional del ligando caracterizado por su estabilidad y/o eficacia incrementadas in vivo o in vitro. Los términos "análogos" y "derivados" se extienden además a cualquier derivado de aminoácido del ligando que se describe anteriormente.

Análogos del receptor polipeptídico de hemopoyetina contemplado en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, modificaciones en las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o derivación de la molécula y el uso de reticuladores y otros métodos que imponen limitaciones de conformación a los péptidos o sus análogos. Ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contemplados por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como mediante alquilación reductiva con un aldehído seguida por reducción con NaBH_{4}; amidinación con acetimidato de metilo; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con 5'-fosfato de piridoxal seguida por reducción con NaBH_{4}.

El grupo guanidina de los residuos de arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede modificarse mediante activación de carbodiimida a través de la formación de O-acilisourea seguida por derivación subsiguiente, por ejemplo, hasta una amida correspondiente.

Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación con ácido perfórmico hasta ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiólicos; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros compuestos mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino.

Los residuos de triptófano pueden modificarse, por ejemplo, mediante oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo indólico con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Por otra parte, los residuos de tirosina pueden alterarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

La modificación del anillo de imidazol de un residuo de histidina puede conseguirse mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con pirocarbamato de dietilo.

Ejemplos de incorporar aminoácidos y derivados no naturales durante la síntesis de proteínas incluyen, pero no se limitan a, el uso de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienilalanina y/o isómeros D de aminoácidos.

Los reticuladores pueden usarse, por ejemplo, para estabilizar conformaciones tridimensionales, usando reticuladores homobifuncionales tales como los imidoésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH_{2})_{n} con n = 1 a n = 6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que habitualmente contienen un resto reactivo con amino tales como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico para un grupo tal como un resto maleimido o ditio (SH) o carbodiimida (COOH). Además, los péptidos podrían limitarse en cuanto a la conformación mediante, por ejemplo, la incorporación de C_{\alpha}- y N_{\alpha}-metilaminoácidos, la introducción de dobles enlaces entre los átomos C_{\alpha} y C_{\beta} de los aminoácidos y la formación de péptidos cíclicos o análogos introduciendo enlaces covalentes tal como formando un enlace amida entre los extremos N y C, entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el extremo N o C.

Por lo tanto, la presente invención se extiende a péptidos o polipéptidos y análogos de aminoácidos y/o químicos de los mismos que tienen las características identificativas de la cadena \alpha del receptor de IL-11.

De acuerdo con esto, la referencia en la presente memoria a la cadena \alpha del receptor de IL-11 o a un polipéptido que tiene propiedades de la cadena \alpha de IL-11 incluye la molécula presente en la naturaleza, formas recombinantes, sintéticas y análogas de la misma y cualesquiera mutantes, derivados y homólogos humanos y no humanos de la misma incluyendo variantes de aminoácidos y de glicosilación.

La disponibilidad de la cadena \alpha del receptor de IL-11 recombinante y secuencias genéticas que codifican la misma permite por primera vez el desarrollo de una gama de agonistas, antagonistas, agentes terapéuticos y agentes diagnósticos para tratar una variedad de estados que implican una deficiencia de IL- 11, una cantidad excesiva de IL-11 o efectos aberrantes de niveles normales de IL-11 endógena.

La presente invención se describe además mediante las Figuras y/o los Ejemplos no limitativos siguientes.

En las Figuras:

La Figura 1 es una representación de la secuencia de nucleótidos, la secuencia de aminoácidos predicha y la estructura de cDNA de la cadena \alpha del receptor de IL-11 (IL-NrI); (A) Estructura del cDNA de IL-11r\alpha, que muestra las regiones no traducidas 5' y 3' (línea sólida) y la región codificante que contiene la secuencia de señal predicha (\blacksquare), el dominio extracelular maduro (\boxempty) el dominio de transmembrana 100 y el dominio citoplásmico 101. El tamaño y la extensión de cada uno de los clones de cDNA de IL-11r\alpha que se sometía a secuenciación completamente se muestran posteriormente. (B). La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de IL-11r\alpha. La región no traducida se muestra en minúsculas y la región codificante en mayúsculas. Se emplea en todas partes el código convencional de una letra para aminoácidos. Los dos sitios de glicosilación conectados a asparagina potenciales (NXS/T) se muestran subrayados y en negrita. La secuencia de señal potencial y el dominio de transmembrana están remarcados por barras entre la secuencia de nucleótidos y aminoácidos. El dominio de hemopoyetina (D200) está encerrado en una caja y la línea discontinua separa los dos dominios SD100 que comprenden en dominio D200. Una señal de poliadenilación de consenso en la región no traducida 3' se muestra en negrita.

La Figura 2 es una comparación de Nr1 con otros miembros de la familia de receptores de hemopoyetina; Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de Nr1 múrido, la cadena \alpha de receptor de IL-6 múrida, la cadena \alpha de receptor de CNTF humana, la subunidad p40 de IL-12 humana y la cadena \alpha de receptor de GM-CSF múrido. Los alineamientos se llevaron a cabo a simple vista.

La Figura 3 es una representación fotográfica de análisis de la cadena de polimerasa con transcriptasa inversa de mRNA de Nr1; Se preparó RNA citoplásmico a partir de las siguientes fuentes; carril 2, células 3T3-L1; carril 3, células BAd; carril 4, células UMR-106; carril 5, células PC13; carril 6, células NFS-60; carril 7, células FDCP-1; carril 8, células 32D; carril 9, células D35; carril 10, células M1; carril 11, células J774; carril 12, células WEHI-3B D; carril 13, médula ósea humana; carril 14, médula ósea de ratón; carril 15, bazo de ratón; carril 16, timo de ratón; carril 17, ovario de ratón; carril 18, útero de ratón; carril 19, testículo de ratón; carril 20, epidídimo de ratón; carril 21, cerebro de ratón; carril 22, corazón de ratón; carril 23, riñón de ratón; carril 24, músculo de muslo de ratón; carril 25, hígado de ratón y carril 26, glándula salivar de ratón. 1 \mug de cada muestra de RNA y un control que no contenía RNA (carril 1) se sometió a transcripción inversa, con una reacción idéntica realizada en ausencia de transcriptasa inversa. 5% de la reacción de DNA de la primera hebra se sometió a PCR con cebadores específicos para Nr1 (cuadro superior) o la GAPDH de control (cuadro inferior). Los productos de PCR se resolvieron sobre un gel de agarosa al 1,0% p/v, se transfirieron a nitrocelulosa y se hibridaron con oligonucleótidos internos específicos para GAPDH o Nr1.

La Figura 4 es una representación gráfica de análisis de Scatchard de isotermas de saturación de IL-11 que se une a diversas líneas celulares; (A) células Ba/F3 parentales (\medbullet), células Ba/F3 que expresan Nr1 (\medcirc), células Ba/F3 que expresan Nr1 y el receptor de LIF (\blacksquare), (B) células Ba/F3 que expresan el receptor de LIF y gp130 (\medbullet), células Ba/F3 que expresan Nr1 y gp130 (\blacksquare), células Ba/F3 que expresan el Nr1, el receptor de LIF y gp130 (\medcirc), (C) células M1 parentales (\medbullet), células M1 que expresan Nr1 (\medcirc) y (D) células 3T3-L1 (\blacksquare) se incubaron con diversas concentraciones de IL-11 marcada en presencia o ausencia de un exceso de 10-100 veces de IL-11 no marcada. Después de 18 horas de incubación sobre hielo, las IL-11 unida y libre se separaron mediante centrifugación a través de suero de ternero fetal. La ^{125}I-IL-11 unida y libre se cuantificó en un contador \gamma y los datos se representaron como una transformación de Scatchard. En cada caso, los datos se normalizaron para el número de células y se mostraron como unión a 10^{6} células.

La Figura 5 muestra la especificidad molecular de la unión de IL-11 a diversas líneas celulares: células Ba/F3 que expresan los receptores indicados se incubaron en 100 \mul de medio que contenía 60.000 cpm (Nr 1 de Ba/F3 o 6.000 cpm de ^{125}I-IL-11 (Nr 1 de Ba/F3/gp130 y Nr 1 de Ba/F3/gp130/receptor de LIF), en presencia o ausencia de 20 ng de IL-11 o 200 ng de IL-6, LIF, OSM o IL-3. Después de 18 horas de incubación sobre hielo, las IL-11 unida y libre se separaron mediante centrifugación a través de suero de ternero fetal. Las ^{125}I-IL-11 unida y libre se cuantificaron en un contador \gamma y la cantidad de unión se expresó como un porcentaje de la observada en ausencia de
competidor.

La Figura 6 muestra diferenciaciones de células M1 que expresan Nr1 en respuesta a IL-11; 300 células M1 parentales (cuadro izquierdo) o células M1 que expresan Nr1 (cuadro derecho) se cultivaron en 1 ml de agar semisólido con las concentraciones indicadas de LIF (\medcirc) o IL-11 (\medbullet). Después de 7 días, se determinó la proporción de colonias que contenían células diferenciadas.

La Figura 7 muestra la proliferación dependiente de factor de células Ba/F3 que expresan diversas combinaciones de Nr1, gp130 y el receptor de LIF; Células Ba/F3 parentales, células Ba/F3 que expresan Nr1, células Ba/F3 que expresan el Nr1 y el receptor de LIF, células Ba/F3 que expresan receptor de LIF y gyp130, células Ba/F3 que expresan Nr1 y gp130 y células Ba/F3 que expresan Nr1, el receptor de LIF y gp130 se incubaron a 200 células por pocillo en un volumen de 15 \mul, con las concentraciones indicadas de IL-11 (\medbullet), IL-3 (\boxempty) o LIF (\medcirc), o con 3 \mug/ml de IL-6 y 500 ng/ml de cadena \alpha de receptor de IL-6 soluble (\ding{115}). Después de 48 horas, se contaron los números de células
viables.

La Figura 8 es una representación de la secuencia de nucleótidos compuesta y la secuencia de aminoácidos predicha del receptor de IL-11 humano. La secuencia de aminoácidos predicha se presenta usando el código de una sola letra convencional. El asterisco representa el codón de terminación. Los cuatro residuos de cisteína conservados, el motivo WSTWS y los sitios de glicosilación conectados a asparagina potenciales (NXS/T) se muestran en negrita y subrayados. La secuencia de señal potencial y la región de transmembrana se presentan mediante un subrayado delgado y un subrayado doble, respectivamente. Una señal de poliadenilación de consenso se muestra en minúsculas y negrita. La región encerrada en una caja representa el dominio de hemopoyetina de 200 aminoácidos (D200) y está compuesta por dos subdominios de 100 aminoácidos (SD100) según se marca mediante la línea quebrada. Las dos flechas indican la posición se secuencias intrónicas presentes en algunos de los clones de cDNA.

La Figura 9 es una representación de una comparación de la secuencia de aminoácidos predicha de la cadena \alpha del receptor de IL-11 humana (H) y múrido (M). El símbolo de asterisco indica identidad. La marca de almohadilla (#) representa huecos introducidos para mejorar el alineamiento.

La Figura 10 es una representación fotográfica de una transferencia Southern que demuestra hibridación de especies cruzadas de (A) sonda de cDNA de la cadena \alpha del receptor de IL-11 múrido (fragmento Sph I/Sac I de 445 pb) y (B) sonda de cDNA de la cadena \alpha del receptor de IL-11 humana (fragmento Pst I/Xba I de 560 pb del clon Nº 17.1) a DNA genómico humano (H) y múrido (M) digerido con Hind III. Membrana de nailon procesada bajo condiciones de alta restricción (0,2 X SSC, SDS al 0,1% p/v, 65ºC). La exposición era durante 16 horas a -70ºC usando pantallas intensificadoras.

La Figura 11 es una representación esquemática de la estructura del cDNA de IL-11r\alpha humana, que presenta la región no traducida 5' y 3' (línea sólida) y la región codificante que contiene la secuencia de señal 101, el dominio extracelular (\boxempty), la región de transmembrana 100, la porción citoplásmica (\blacksquare) y la cola de poli-A (AAAA). Se indica la posición aproximada de los residuos de cisteína conservados (C) y el motivo WSXWS. El tamaño y la extensión de los cuatro clones de cDNA seleccionados para el análisis se muestran posteriormente. Las posiciones aproximadas de los intrones se indican (V) como su tamaño en pb. La longitud de los clones se representa sin los intrones. El cDNA compuesto se obtuvo de los clones Nº 9.1y Nº 17.1 mediante ligación en el sitio Pst I indicado (flecha) y se usó para estudios de expresión.

La Figura 12 es una representación esquemática de análisis de Scatchard de isotermas de saturación de IL-11 humana que se une a células M1 manipuladas para expresar IL-11r\alpha humana (), células M1 que expresan la IL-11r\alpha múrida (\medbullet), y células M1 parentales (\medcirc). Las células se incubaron con diversas concentraciones de IL-11 marcada en presencia de un exceso de 10-100 veces de IL-11 no marcada. Después de 18 horas de incubación sobre hielo, las IL-11 unida y libre se separaron mediante centrifugación a través de FCS. La IL-11 marcada unida y libre se cuantificó en un contador \gamma y los datos se representaron como una transformación de Scatchard. En cada caso, los datos se normalizaron para el número de células y se mostraron como unión a 10^{6} células. La cantidad de unión no específica estaba entre 0,1 y 1% de la IL-11 marcada total añadida. Se observó unión de alta afinidad para células M1 que expresan IL-11r\alpha humana (Kd=250 pM) e IL-11r\alpha múrida (Kd=275 pM). Las células M1 parentales no presentaban unión específica.

La Figura 13 es una representación fotográfica que muestra la morfología de células M1 parentales y células M1 manipuladas para expresar la cadena \alpha de receptor de IL-11 humana (M1/hIL-11ra) y en respuesta a IL-11 humana (1000 U/ml) y LIF múrida (1000 U/ml). La morfología celular se examinó después de 5 días de incubación. Los cuadros a, b y c muestran células M1 parentales con: solución salina normal (Cuadro a), LIF (Cuadro b) e IL-11 (Cuadro c). El Cuadro d es representativo de células M1/hIL-11r\alpha estimuladas con IL-11 (X400).

La Figura 14 es una representación gráfica que muestra la proliferación de células Ba/F3 parentales (\ding{115}), células Ba/F3 manipuladas para expresar la cadena \alpha de receptor de IL-11 humana (Ba/F3+hIL-11ra) y Ba/F3 manipuladas para expresar cadena \alpha de receptor de IL-11 humana junto con gp130 humana (Ba/F3+hIL-11r\alpha+gp130). Se establecieron tres líneas celulares clonales (Ba/F3+hIL-11r\alpha) (representadas por \medbullet) que eran insensible. Después de la expresión de la molécula de gp130 humana, todas las líneas celulares eran sensibles a IL-11 (símbolos abiertos). Se muestran diluciones en serie de IL-11 humana. Los resultados son medias de triplicados procedentes de dos experimentos. Todas las células proliferaban en IL-3.

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Las siguientes abreviaturas de una y tres letras para residuos de aminoácidos se usan en la memoria descriptiva:

2

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Las siguientes abreviaturas se adoptan en la presente memoria descriptiva:

IL-11:: Interleuquina 11

IL-11r:: Receptor de IL-11

IL-11r\alpha:: Cadena \alpha de receptor de IL-11

D:: Dominio

SD:: Subdominio

Nr1:: IL-11r

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Ejemplo 1

Rastreo de bibliotecas

Se usaron bibliotecas de cDNA de hígado de ratón adulto comerciales clonados en \lambdagt10 y \lambdaZAP (Clonetech, CA, EE. UU. de A. y Stratagene, CA, EE. UU. de A.) para infectar Escherichia coli de la cepa LE392. Las bacterias infectadas se hicieron crecer sobre veinte placas de 150 mm de agar, para dar aproximadamente 50.000 calvas por placa. Las calvas se transfirieron a continuación a membranas de nailon de 150 mm de diámetro (Colony/Plaque Screen^{TM}, NEN Research Products, MA, EE. UU. de A.), las bacterias se sometieron a lisis y el DNA se fijó tratando en autoclave a 100ºC durante min con evacuación en seco. Los filtros se enjuagaron dos veces en dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1% p/v, 0,1 x SSC (SSC es cloruro sódico 150 mM, dihidrato de citrato sódico 15 mM) a temperatura ambiente y se prehibridaron durante la noche a 37ºC en 6 x SSC que contiene 2 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de Ficoll, 2 mg/ml de polivinilpirrolidona, ATP 100 \muM, 10 \mug/ml de tRNA, pirofosfato sódico 2 mM, 2 mg/ml de DNA de esperma de salmón, NP-40 al 0,1% y 200 \mug/ml de azida sódica. El tampón de prehibridación se retiró. Una cantidad de 1,2 \mug de los oligonucleótidos degenerados para hibridación (HYB1, HYB2 y HYB3; Tabla 1) se fosforiló con polinucleótido quinasa de T4 usando 960 \muCi de \gamma^{32}P-ATP (Bresatec, S.A., Australia). El ATP no incorporado se separó del oligonucleótido marcado usando una columna de filtración en gel prerrellena (NAP-5; Pharmacia, Uppsala, Suecia). Los filtros se hibridaron durante la noche a 37ºC en 80 ml del tampón de prehibridación que contenía SDS al 0,1% p/v, en lugar de NP40, y 10^{6} - 10^{7} cpm/ml de oligonucleótido marcado. Los filtros se enjuagaron brevemente dos veces a temperatura ambiente en 6 x SSC, SDS al 0,1% v/v, dos veces durante 30 min a 45ºC en un baño de agua con agitación que contenía 1,5 1 del mismo tampón y a continuación brevemente en 6 x SSC a temperatura ambiente. A continuación, los filtros se secaron con papel secante y se expusieron a película autorradiográfica a -70ºC usando pantallas intensificadoras, durante 7-14 días antes del revelado.

Las calvas que aparecían positivas sobre películas duplicadas orientadas se recogieron, se eluyeron en 1 ml de NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, Tris.HCl 10 mM, pH 7,4, que contenía gelatina al 0,5% p/v y cloroformo al 0,5% v/v y se almacenaron a 4ºC. Después de 2 días, las células LE392 se infectaron con el eluato procedente de los bloques primarios y se cultivaron en placa de nuevo para el rastreo secundario. Este procedimiento se repitió hasta que las calvas hibridantes eran puras.

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Ejemplo 2

Análisis de calvas positivas

Se preparó DNA a partir de calvas positivas usando columnas Promega Magic Lambda DNA (Promega Corporation, WI, EE. UU. de A.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una cantidad de 100 ng de DNA procedente de cada bacteriófago positivo se sometió a secuenciación usando un estuche de secuenciación fmol (Promega Corporation, WI, EE. UU. de A.) con los oligonucleótidos marcados con ^{33}P gt10for, gt10rev y bien HYB1, bien HYB2 o bien HYB3. Los productos se resolvieron sobre un gel de poliacrilamida al 6% p/v y la secuencia de cada clon se analizó usando los programas de comparación de bases de datos Blast y la función de traducción de la serie de programas Wisconsin.

La secuencia de un clon (Nr1-AZ-36) contenía motivos característicos de la familia de receptores de hemopoyetina. Se diseñaron dos oligonucleótidos, Nº 26 y Nº 60 (nucleótidos 946-970 y 1005-1034; Figura 1; Tabla 2) a partir de esta secuencia y se usaron para rastrear de nuevo los filtros primarios a partir de la biblioteca de hígado original y otras dos bibliotecas de cDNA hepático de adulto. El clon de cDNA inicialmente aislado, Nr1-AZ-36, y otros cuatro clones de cDNA (Nrl-30.2, 30.3, 30.4 y 30.17) se sometieron a secuenciación completamente, en ambas hebras, usando el método didesoxi (18) con el estuche de secuenciación de polimerasa de T7 de Pharmacia (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La secuencia del nuevo receptor se comparó con las bases de datos de EMBL y Genbank usando el programa FASTA. Los alineamientos con receptores de citoquina conocidos se llevaron a cabo a simple vista.

Un método más rápido alternativo para el análisis de calvas positivas se identificó usando oligonucleótidos degenerados para el motivo WSXWS.

Calvas positivas primarias se identifican y se recogen.

Se usaron 5 \mul de eluato de calvas primarias en una reacción en cadena de la polimerasa que contenía lo siguiente: 5 \mul de 10 x tampón de PCR con Mg (Boehringer Mannheim,) 1 \mul de dATP, dCTP, dGTP y dTTP 10 mM (Promega Corp), 2,5 \mul de cada cebador en 100 \mug/ml y 0,5 \mul de polimerasa de Taq (Boehringer Mannheim). Los cebadores utilizados eran aquellos cebadores de WSXWS usados en la hibridación en combinación con cebadores específicos para el bacteriófago \lambda en el que se clonaba la biblioteca. Se llevó a cabo PCR en una máquina Perkin Elmer 9600 usando el siguiente protocolo: 96ºC durante 2 min, 25 ciclos de 96ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min, 4ºC indefinidamente.

Se sometieron a electroforesis 20 \mul de la PCR sobre un gel de agarosa al 1% p/v en TAE. Cualquier producto se aisló usando el reactivo GeneClean y se sometió a secuenciación bien usando cebadores de WSXWS marcados con ^{33}P con el estuche de secuenciación fmol (Promega Corp) o bien cebadores de WSXWS no marcados y didesoxinucleótidos fluoresceinados con un secuenciador automatizado. La secuencia se usa a continuación para verificar motivos comunes a receptores de la familia de hemopoyetina.

TABLA 2 Secuencia de oligonucleótidos

3

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Ejemplo 3

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

La síntesis de cDNA de la primera hebra se realizó sobre 1 \mug de poliA+ RNA citoplásmico. La transcripción inversa se llevó a cabo a 42ºC durante 60 min en 20 \mul de Tris.HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 20 mM, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, 1 mM de cada dNTP, 20 \mug/ml de oligo(dT)_{15} y 12,5 unidades de transcriptasa inversa de AMV (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania). Se realizaron reacciones de control para cada muestra de RNA bajo condiciones idénticas, excepto que la transcriptasa inversa se omitió de la reacción. La mezcla de reacción de transcripción inversa se diluyó hasta 100 \mul con agua y se usaron 5 \mul para cada reacción de PCR. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 50 \mul de tampón de reacción (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania) que contenía 200 \muM de cada dNTP, 1 \muM de cada cebador y 2,5 U de polimerasa de Taq (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania). A partir del homólogo Y con otros miembros de la familia de receptores de hemopoyetina, se predijo que los cebadores usados para la amplificación del cDNA de la cadena \alpha del receptor de IL-11 (Nr1) abarcaban al menos un intrón. Estos oligonucleótidos eran Nº 449 y Nº 285 (nucleótidos 133-156 y 677-661; Figura 1, Tabla 2), mientras que para la amplificación de cDNA de GAPDH se usaron los cebadores Nº 495 y Nº 496 (Tabla 2). La PCR se realizó durante 30 ciclos a 94ºC durante 2 min, a 60ºC durante 2 min y a 72ºC durante 3 min en un ciclador Perkin Elmer Cetus Thermal (Perkin Elmer Cetus, CA, EE. UU. de A.). Una parte alícuota de la mezcla de reacción se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,0% p/v y el DNA se transfirió a una membrana Zetaprobe. Se realizaron transferencias Southern según se describe por Reed y Mann (19). La hibridación se llevó a cabo con oligonucleótidos marcados en los extremos (Nº 489 para la cadena \alpha del receptor de IL-11 y Nº 741 para GAPDH; Tabla 2).

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Ejemplo 4

Constructos de expresión

Se usó Nr1-30.3 en una PCR con los cebadores 30fl y 30r1 (Tabla 2) para generar un cDNA que contenía poca región no traducida 5'o 3'. El producto de PCR se clonó en el sitio BstX I de pEF-BOS (21) usando adaptadores para BstX I (Invitrogen, CA, EE. UU. de A.). El inserto de cDNA se sometió a secuenciación en ambas hebras. cDNA que codifican el receptor de LIF humano y gp130 de ratón también se subclonaron en pEF-BOS. Los cDNA del receptor en pEF-BOS se linealizaron con Aat II antes de la transfección. Derivados de pBluescript que contenían cDNA que codifican los marcadores seleccionables puromicina transferasa (pPGKpuropA) y neomicina transferasa (pPGKneopA) transcritos a partir de un promotor de PGK y con la región no traducida 3' de globina \beta se linealizaron con Sca I.

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Ejemplo 5

Transfección celular

Las células se transfectaron establemente mediante electroporación. En resumen, las células se lavaron dos veces en PBS enfriada con hielo y se resuspendieron en PBS en 5 x 10^{6} por ml. Una cantidad de 4 x 10^{6} células se dividió en partes alícuotas en cubetas de electroporación de 0,4 mm con 20 \mug de pEF-BOS con o sin Nr1, gp130 o el receptor de LIF clonado en el sitio BstX I y 2 \mug de los marcadores seleccionables pPGKpuro o pPGKneo. El DNA y las células se incubaron durante 10 minutos sobre hielo y se sometieron a electroporación a 270 V y 960 \muF en un Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU. de A.). Las células se mezclaron con 1 ml de medio de cultivo, se centrifugaron a través de 3 ml de FCS y se resuspendieron en 100 ml de medio de cultivo. A continuación, las células se dividieron en partes alícuotas en cuatro platos de 24 pocillos. Después de dos días, se comenzó la selección mediante la adición de geneticina hasta una concentración de 1,2 mg/ml, de puromicina hasta una concentración de 40 \mug/ml para células M1 y 5 \mug/ml para células Ba/F3. Después de 10-14 días, los clones de células proliferantes se transfirieron a matraces y, después de la expansión, se probaron con respecto a la expresión de receptor.

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Ejemplo 6

Citoquinas

IL-3 e IL-11 múridas se adquirieron de PeproTech (PeproTech, NJ, EE. UU. de A.), LIF humano y OSM humana se produjeron usando el sistema pGEX, esencialmente como se describe (25).

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Ejemplo 7

Ensayos biológicos

La proliferación de células Ba/F3 en respuesta a citoquinas se midió en Lux60 microwell HL-A plate (NuncInc., IL, EE. UU. de A.). Las células se lavaron tres veces en DME que contenía 20% v/v de suero de ternero recién nacido y se resuspendieron a una concentración de 2 x 10^{4} células por ml en el mismo medio. Partes alícuotas de 10 \mul de la suspensión celular se pusieron en los pocillos de cultivo con 5 \mul de diluciones en serie de IL-3, IL-11 o LIF recombinantes purificados, o IL-6 en 3 \mug/ml y cadena \alpha de receptor de IL-6 soluble en 500 ng/ml. Después de 2 días de incubación a 37ºC en una incubadora totalmente humidificada que contenía 10% v/v de CO_{2} en aire, las células viables se contaron usando un microscopio invertido.

Para ensayar la diferenciación de células M1 en respuesta a citoquinas, 300 células se cultivaron en cápsulas de Petri de 35 mm que contenían 1 ml de DME complementado con FCS al 20% v/v, agar al 0,3% p/v y 0,1 ml de diluciones en serie de IL-6, IL-11, LIF u OSM. Después de 7 días de cultivo a 37ºC en una atmósfera totalmente humidificada, que contenía 10% v/v de CO_{2} en aire, las colonias de células M1 se contaron y se clasificaron como diferenciadas si contenían células dispersadas o una corona de células dispersadas alrededor de un centro estrechamente relleno.

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Ejemplo 8

Estudios de unión con IL-11

Se disolvió IL-11 a una concentración de 100 \mug/ml en fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM (PBS), Tween 20 al 0,02% v/v y azida sódica al 0,02% p/v a pH 7,4. La IL-11 se radioyodó de acuerdo con el método de Bolton y Hunter (24). En resumen, 2 \mug de IL-11 se incubaron con 2 mCi de reactivo de Bolton-Hunter monoyodado (New England Nuclear, MA, EE. UU. de A.) a temperatura ambiente en 20 \mul de borato sódico 150 mM, pH 8,5. Después de dos horas la reacción se extinguió con 100 \mul de glicina 1M en el mismo tampón y la proteína marcada se separó de reactivo de Bolton-Hunter no incorporado usando una columna Sephadex G-25 (PD-10; Pharmacia, Uppsala, Suecia) prerrellena equilibrada en PBS que contiene Tween 20 al 0,02% v/v y azida sódica al 0,02% p/v. Antes del uso, la ^{125}IL-11 se diluyó 10 veces con Tris HCl 50 mM, pH 7,5, que contenía Tween 20 al 0,02% v/v y azida sódica al 0,02% p/v y se aplicó a una columna de 250 \mul de CM-Sephamse CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibrada en el mismo tampón. La columna se lavó con 5 ml de tampón de equilibración y se eluyó con partes alícuotas secuenciales de 5 ml de DME que contenía FCS al 10%. En esta fase, el ^{125}I era precipitable en más de 95% con ácido tricloroacético frío. La capacidad de unión de la preparación de ^{125}I-IL-11 se evaluó como se describe previamente (21) y era aproximadamente 80%. La radiactividad específica de la ^{125}I-IL-11 era aproximadamente 130.000 cpm/ng y se determinó mediante análisis de autodesplazamiento (22).

Se realizaron estudios de unión como se describe previamente (22). En resumen, 5 x 10^{5} - 1,5 x 10^{7} células en 40 \mul de medio RPMI-1640 que contenía Hepes 20 mM, pH 7,4, y suero de ternero fetal (RHF) se incubaron durante la noche sobre hielo, con entre 5 x 10^{3} y 2 x 10^{6} cpm de ^{125}I-IL-11, con o sin un exceso de 100 veces de IL-11 no marcada. En otros experimentos, los receptores se saturaron con una cantidad constante de ^{125}I-IL-11 y cantidades crecientes de IL-11 no marcada o IL-3, IL-6, LIF, OSM o G-CSF no marcados. Las ^{125}I-IL-11 asociada a células y libre se separaron mediante centrifugación rápida a través de 180 \mul de suero de ternero fetal y se cuantificaron en un contador \gamma.

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Ejemplo 9

Clonación de receptores de citoquina sobre la base de la similitud de secuencia

Los miembros de la familia de receptores de hemopoyetina exhiben un nivel relativamente bajo de similitud de secuencia. Una de las características ("features") de los receptores en esta familia es el motivo de cinco aminoácidos Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (WSXWS) (15, 16, 17). En un intento de clonar nuevos receptores de hemopoyetina, 10^{6} calvas de una biblioteca de cDNA de hígado de ratón adulto se rastrearon con oligonucleótidos degenerados correspondientes al motivo WSXSW. Se recogieron calvas de bacteriófago \lambda que aparecían positivas sobre los filtros duplicados, se eluyeron y se aislaron mediante dos rondas subsiguientes de enriquecimiento de calvas. A continuación, el DNA de calvas hibridantes puras se sometió a secuenciación.

La utilidad de esta técnica se demostró mediante la identificación de varios cDNA que codifican el receptor de LIF, el receptor de IL-7, gp130 múridos y una nueva secuencia que parecía relacionada con miembros de la familia de receptores de hemopoyetina que se denomina en la presente memoria "Nr1". El cDNA (Nr1-AZ-36) que codifica este nuevo receptor se sometió a secuenciación completamente y, aunque contenía una señal de poliadenilación y una cola de poli-A extensa, estaba claramente truncado en el extremo 5' (Figura 1).

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Ejemplo 10

Aislamiento de cDNA de Nr1 de longitud completa y caracterización del nuevo receptor de citoquina

Para aislar cDNA de Nr1 de longitud completa, la biblioteca original y una segunda biblioteca de hígado de ratón adulto se rastrearon con oligonucleótidos (Nº 26 y Nº 60; Tabla 2) diseñados a parir del extremo 5' del clon Nr1-AZ-36. Ocho clones de cDNA se aislaron y cuatro se sometieron a secuenciación completamente (Figura 1). Los análisis de las secuencias de cDNA revelaban un marco de lectura abierto de 1296 pb que codifica una proteína de 432 aminoácidos de longitud. La secuencia primaria predicha incluía una secuencia líder hidrófoba potencial (residuos 1-23), un dominio extracelular con dos sitios de glicosilación conectados a N potenciales (residuos 24-367), un dominio de transmembrana (residuos 368-393) y una cola citoplásmica corta (residuos 394-432). Se ha estimado inicialmente que el peso molecular nuclear del receptor maduro es aproximadamente 36.000 daltons.

El dominio extracelular contenía residuos característicos de un dominio de hemopoyetina clásico (D200; 15) (Figuras 1 y 2), incluyendo residuos de prolina que preceden a cada subdominio de 100 aminoácidos (SD100), cuatro residuos de cisteína conservados, una serie de residuos polares e hidrófobos y un motivo WSXWS. El dominio receptor de hemopoyetina del nuevo receptor estaba precedido por un dominio similar a inmunoglobulina de 87 aminoácidos y seguido por 37 aminoácidos antes del dominio de transmembrana. En cuanto a su estructura global y su secuencia primaria (Figura 2), el nuevo receptor era el más similar a la cadena \alpha del receptor de IL-6 (24% de identidad de aminoácidos), la cadena \alpha del receptor de CNTF (22% de identidad de aminoácidos) y la subunidad p40 de IL-12 (16% de identidad de aminoácidos).

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Ejemplo 11

Expresión de mRNA de Nr1

La distribución de la expresión de mRNA de Nr1 se analizó mediante transferencia Northern y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Entre un estudio de RNA poliadenilado procedente de 15 muestras de tejido primario y 17 líneas celulares, solo el RNA procedente de la línea celular preadipocítica 3T3-L 1 daba una banda de hibridación detectable de aproximadamente 2,0 kb de longitud en una transferencia Northern. Esto se compara con una longitud de aproximadamente 1650 pb para el cDNA de Nr1 más largo aislado y sugiere que este clon puede no estar completo en el extremo 5'.

La baja abundancia del mRNA de Nr1 sugerida a partir de análisis Northern apuntaba al uso de RT-PCR como un medio de detección más sensible. Todas las muestras contenían mRNA de GAPDH, según se juzgaba por RT-PCR (Figura 3), sin embargo, solo las células 3T3-L1, la línea estromal BAd, la línea celular de carcinoma embrionario PC13 y las líneas celulares de hemopoyetina dependientes de factor FDCP-1 y D35 expresaban mRNA de Nr1 (Figura 3). Una amplia gama de tejidos primarios también era positiva (Figura 3), incluyendo los tejidos hemopoyetínicos médula ósea, bazo y timo, así como el hígado, el cerebro, el corazón, el riñón, el músculo y la glándula salivar. En muestras de mRNA procedentes de varias líneas celulares y tejidos, no podían detectarse transcritos para Nr1. Tales resultados negativos necesitaban confirmarse usando un sistema más cuantitativo para el análisis de mRNA. En experimentos de control, se realizaba PCR sobre mRNA que no se había sometido a transcripción inversa. En ninguna de estas muestras se detectaba un producto de Nr1.

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Ejemplo 12

Nr1 es un receptor de baja afinidad para IL-11 e interactúa con gp130 para generar un receptor de IL-11 de alta afinidad

Dada su similitud de secuencia con las cadenas \alpha de receptores de IL-6 y CNTF y su expresión en células 3T3-L1, se razonó que Nr1 podría ser una cadena \alpha de receptor que interactuaría con gp130 y/o el receptor de LIF para generar un receptor de alta afinidad capaz de transducción de señales. Puesto que no se han descritos cadenas \alpha de receptor, similares en estructura a la cadena \alpha de receptor de IL-6, para LIF, OSM e IL-11, estas citoquinas representan candidatos atractivos para el ligando cognado de Nr1.

Para probar si LIF, OSM o IL-11 se unen al nuevo receptor, la línea celular de hemopoyetina dependiente de factor Ba/F3 y la línea celular leucémica de ratón M1 se transfectaron establemente con el vector pEF-BOS que contiene el cDNA que codifica Nr1. Las células M1 parentales expresan el receptor de LIF y gp130 y, por lo tanto, se unen a ^{125}I-LIF y ^{125}I-OSM. La expresión de Nr1 en células M1 no daba como resultado la unión alterada de ^{125}I-LIF ni ^{125}I-OSM. En contraste, las células Ba/F3 no expresaban ni el receptor de LIF ni gp130 y no se observó unión de ^{125}I-LIF ni ^{125}I-OSM en células Ba/F3 parentales o células que expresaban Nr1.

No podía detectarse unión de ^{125}I-IL-11 en células M1 o Ba/F3 parentales (Figura 4A y C). Sin embargo, notablemente, la expresión de Nr1 en cada tipo de célula daba como resultado la capacidad para unirse a ^{125}I-IL-11, lo que sugería que Nr1 podría ser la cadena \alpha del receptor de IL-11. La transformación de Scatchard de las isotermas de unión de saturación revelaba que la afinidad de IL-11 para su receptor difería entre los dos tipos de células (Figura 4A frente a 4C). La unión de ^{125}I-IL-11 a células Ba/F3 que expresan Nr1 era de muy baja afinidad. Se estimó que la constante de disociación en equilibrio aparente (K_{D}) para esta interacción era aproximadamente 10 pM y las células expresaban un promedio de entre 2.000 y 8.000 receptores en su superficie (Figura 4A). Células M1 transfectadas con un cDNA de Nr1 expresaban un número similar de receptores de IL-11 (Figura 4C), sin embargo, la afinidad de la interacción era superior (K_{D}=400-800 pM). Los receptores de IL-11 expresados sobre células M1 transfectadas con Nr1 era similares en afinidad a los receptores expresados naturalmente sobre células 3T3-L 1 (Figura 4D).

Una explicación para la generación de receptores de baja afinidad o alta afinidad de acuerdo con el tipo de célula en el que se expresa Nr1 es que el propio Nr1 tiene una afinidad intrínsecamente baja para IL-11, pero las células M1 expresan un exceso de un componente receptor adicional requerido para la generación de un complejo de alta afinidad. Existe una evidencia indirecta del papel de gp130 en la transducción de señales del receptor de IL-11, ya que los anticuerpos neutralizadores para gp130 inhibían la proliferación de células TF-1 inducida por IL-11. Para probar esta propuesta directamente, gp130 y/o el receptor de LIF se expresaron en células Ba/F3 parentales o en células Ba/F3 que expresaban Nr1.

Las células Ba/F3 parentales y las células Ba/F3 que expresaban gp130 y el receptor de LIF, solas o en combinación, no se unían a IL-11 (Figura 4A y B). Las células Ba/F3 que expresaban Nr1 y el receptor de LIF se unían a IL-11 con una afinidad muy baja que era indistinguible de células que expresaban la cadena \alpha del receptor de IL-11 sola (Figura 4A). En contraste, cuando gp130 y Nr1 se coexpresaban en células Ba/F3, se generaban receptores de alta afinidad para IL-11 (Figura 4B). La afinidad de los receptores era similar a la de receptores expresados por células 3T3-L1 y células M1 que expresaban la cadena \alpha del receptor de IL-11 (Figura 4B-D). La expresión del receptor de LIF con Nr1 y gp130 no incrementaba la afinidad de unión a IL-11 (Figura 4B).

Nr1 parece ser un receptor que es específico para IL-11. La unión de ^{125}I-IL-11 a células Ba/F3 que expresan Nr1 entraba en competencia con IL-11 no marcada, pero no IL-6, LIF, OSM o IL-3 (Figura 5). Existe una situación más compleja en células en la Nr1 se expresa con gp130 y el receptor de LIF. La unión de ^{125}I-IL-11 a células Ba/F3 que expresaban Nr1 y gp130 entraba en competencia con OSM e IL-11 no marcada (Figura 5), mientras que la unión a células Ba/F3 que expresaban Nr1, gp130 y el receptor de LIF entraba en competencia con LIF, así como OSM e IL-11 (Figura 5).

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Ejemplo 13

La coexpresión de cadena \alpha de receptor de IL-11 y gp130 permite una respuesta proliferativa y de diferenciación a IL-11

Muchas citoquinas ejercen efectos sobre la diferenciación celular así como la división celular. En ausencia de estímulos de diferenciación, las colonias de células M1 leucémicas parentales están estrechamente rellenas y están compuestas por células blásticas no diferenciadas. En respuesta a LIF, OSM e IL-6, pero no IL-11, las colonias de M1 que crecían en agar semisólido se dispersaban debido a la inducción de la diferenciación de macrófagos (Figura 6A). Además, LIF, OSM e IL-6 suprimen la clonogenicidad de células M1 dando como resultado el desarrollo de números reducidos de colonias. Las células M1 que expresaban la cadena \alpha del receptor de IL-11 exhibían una respuesta normal a LIF, OSM e IL-6 pero ahora se diferenciaban en macrófagos cuando eran estimuladas por IL-11 (Figura 6B). Como con LIF, IL-6 y OSM, eran producidas menos colonias por células M1 que expresan Nr1 en presencia de IL-11 que en cultivos de control y estas colonias contenían menos células.

La línea celular de hemopoyetina dependiente de IL-3 Ba/F3 se ha usado para estudiar la capacidad de una variedad de receptores de citoquina para transducir una señal proliferativa. Las células Ba/F3 son absolutamente dependientes de IL-3 para la proliferación, pero no proliferan en respuesta a IL-11, LIF o IL-6. Por lo tanto, se determinó si la expresión de Nr1, gp130 y el receptor de LIF ampliaba el espectro de citoquinas a las que podían responder estas células. Aunque ninguna de las líneas celulares examinadas podía proliferar en respuesta a IL-6 sola, cada línea celular que expresaba gp130, independientemente de si se coexpresaban o no otros receptores, proliferaba en respuesta a una combinación de IL-6 y la cadena \alpha del receptor de IL-6 soluble (Figura 7). La proliferación en respuesta a LIF requería la coexpresión del receptor de LIF y gp130 (Figura 7), sin embargo, estas células eran incapaces de proliferar en respuesta a IL-11. Asimismo, las células Ba/F3 que expresaban Nr1 solo o Nr1 y el receptor de LIF eran incapaces de responder a IL-11 (Figura 7). La respuesta a IL-11 requería la coexpresión tanto de Nr1 como de gp130 (Figura 7). La proliferación semimáxima de estas células se producía a una concentración de IL-11 de entre 20 y 100 pg/ml. La expresión del receptor de LIF, además de Nr1 y gp130, no alteraba esta respuesta (Figura 7).

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Ejemplo 14

Clonación de il-11r\alpha humana

Para determinar la factibilidad de clonar la IL-11r\alpha basándose en la homología con el receptor múrido, se llevó a cabo un análisis de DNA genómico múrido y humano usando un fragmento de cDNA de IL-11r\alpha múrida como una sonda (para el método, véase el Ejemplo 13). La Figura 10A muestra una banda específica de 14 kb en el DNA humano, en comparación con 4,8 kb en el DNA múrido, cuando se examinan bajo condiciones de alta restricción de hibridación (0,2 X SSC, a 65ºC).

La misma sonda múrida (fragmento Sph I/Sac I de 445 pb) se usó a continuación para rastrear aproximadamente 10^{6} calvas procedentes de cinco bibliotecas de cDNA humano. Estas incluían dos bibliotecas de médula ósea de adulto (27; Nº Cat. Clontech HL1058a) y bibliotecas procedentes de la placenta (Nº Cat. Clontech HL1008b), el hígado (Nº Cat. Clontech HL1001a) humanos y una línea celular de hepatoma (Nº Cat. Clontech HL1015b). Las calvas positivas se aislaron y se purificaron mediante rondas sucesivas de rastreo por hibridación (para el método, véase el Ejemplo 17). Se obtuvieron aproximadamente 30 clones positivos de cada una de las bibliotecas de médula ósea de adulto y la biblioteca placentaria. No se identificaron clones positivos de las bibliotecas de hígado o hepatoma a pesar de que el receptor múrido se aislaba de este tejido (véanse los Ejemplos previos). Las calvas positivas también se examinaron durante una estrategia basada en PCR; los eluatos de las calvas se usaron como plantillas en una reacción de PCR cebada con un oligonucleótido antisentido que codifica el motivo WSXWS múrido y un cebador oligonucleotídico apropiado derivado de la secuencia del vector en la región adyacente al sitio de clonación. Tres clones procedentes de una biblioteca de médula ósea se eligieron inicialmente para una caracterización detallada. El análisis Southern usando un fragmento de restricción procedente del cDNA humano identificaba bandas equivalentes a las detectadas usando la IL-11r\alpha múrida, confirmando así la identidad del cDNA humano (Fig. 10B). La secuencia de nucleótidos del inserto procedente de cada uno de estos clones (Nº 9.1, Nº 4.3, Nº 8.2) se determinó en ambas direcciones. El inserto procedente del clon Nº 9.1 se usó para generar una sonda para volver a rastrear la biblioteca de cDNA de médula ósea y daba como resultado la identificación de otro clon único (Nº 17.1, Fig. 11). La secuencia de nucleótidos de este clon también se determinó en ambas direcciones.

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Ejemplo 15

Análisis de la secuencia de IL-11r\alpha humana

Según se representa en la Fig 11, los clones Nº 9.1 y Nº 4.3 estaban incompletos mientras que los clones Nº 8.2 y Nº 17.1 abarcaban toda la región codificante. Los clones Nº 8.2 y Nº 17.1 contenían una secuencia intrónica de 287 pb y los clones Nº 4.3 y Nº 8.2 contenían una secuencia intrónica de 254 pb. Estas secuencias se confirmaron como intrones mediante el análisis de clones de DNA genómico, exhibían secuencias donantes-aceptoras de corte y empalme típicas y se atribuyeron al corte y empalme incompleto del mRNA. La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos compuesta determinada a partir de los cuatro clones de cDNA de IL-11r\alpha. La secuencia incluía 127 pb de región no traducida (UTR) 5' que estaba representada en 3 clones, y una UTR 3' con una señal de poliadenilación y cola de poli-A. Había un marco de lectura abierto de 1269 pb que se predecía que codificaba una proteína de 432 aminoácidos (aa). La proteína predicha tenía una secuencia líder hidrófoba potencial (1-23 aa), una región extracelular (24-366 aa), un dominio de transmembrana (367-392 aa) y una cola citoplásmica (393-423 aa). El dominio extracelular contenía dos posibles sitios de glicosilación conectada a N (Fig. 8). Como con la IL-11r\alpha múrida (véanse los Ejemplos previos) y en común con otros receptores de citoquina (15; 28), la IL-11r\alpha humana exhibía un dominio similar a inmunoglobulina y un dominio de hemopoyetina (D200, Fig. 8) en la región extracelular. La última estaba compuesta por dos subdominios de 100 aa (SD100, Fig. 8) e incluía residuos de prolina que precedían a cada subdominio, cuatro residuos de cisteína conservados, una serie de residuos polares e hidrófobos y el motivo WSXWS. El aminoácido variable "S" se identificó como treonina en el receptor humano en comparación con alanina en el equivalente múrido (véanse los Ejemplos previos).

Se apreciaron varias diferencia entre clones aislados de la misma biblioteca. Una sustitución de nucleótidos en el clon Nº 4.3 (G\leftrightarrowC en el pb 944, Fig. 8) daba como resultado un residuo de aminoácido diferente (E\leftrightarrowQ en el aa 273, Fig. 8). El clon Nº 4.3 y el Nº 17.1 diferían del clon Nº 8.2 en una sustitución de nucleótidos (G\leftrightarrowA en el pb 1135, Fig. 8) en la región codificante sin cambio consiguiente en la proteína. Además, los clones Nº 17.1 y Nº 8.2 diferían en la UTR 3' en una sola sustitución (A\leftrightarrowG en el pb 1658, Fig. 8). Se interpretaba que estas diferencias representaban polimorfismos.

La comparación de las secuencias de las cadenas IL-11r\alpha múrida y humana mostraba un alto grado de homología (Fig. 12). Había una identidad global de 85% a nivel de ácidos nucleicos y 84% a nivel de proteínas. La homología era más evidente en las regiones extracelular y de transmembrana y lo era menos en la cola citoplásmica donde el receptor humano era 8 aminoácidos más corto que el equivalente múrido. Ninguna proteína contenía un dominio similar a tirosina quinasa identificable.

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Ejemplo 16

La expresión de la cadena \alpha del receptor de IL-11 humana da como resultado una unión específica de IL-11 humana y permite la señalización de IL-11

La línea celular leucémica mieloide múrida M1 (29) expresa constitutivamente gp130 múrida, la molécula de señalización para receptores de LIF, IL-6, OSM e IL-11. En respuesta a LIF, OSM y IL-6, colonias de células M1 parentales en agar semisólido se dispersan como células diferenciadas en macrófagos y adquieren la capacidad de migrar a través de agar. Además, existe la supresión de la clonogenicidad que conduce a números de colonias reducidos. Las células M1 manipuladas para expresar la IL-11r\alpha múrida presentaban unión específica de IL-11 y se diferenciaban en respuesta a IL-11 (véanse los Ejemplos previos). La IL-11r\alpha humana se expresaba en células M1 múridas usando el vector de expresión mamífero pEFBOS (30; Ejemplo 15). Se llevaron a cabo estudios de unión usando IL-11 humana marcada con ^{125}I para probar si la IL-11 se unía específicamente a estas células (véase el Ejemplo 15 para los métodos). Según se muestra en la Tabla 3, las células M1 manipuladas para expresar la IL-11r\alpha humana (fracciones reunidas Nº 1 - Nº 4) demostraban una unión específica significativa de IL-11 humana. Las células de control positivas, las células M1 y las células Ba/F3 que expresan la IL-11r\alpha múrida y la gp130 múrida (véanse los ejemplos previos) también mostraban unión de alto nivel. Según se esperaba, las células M1 parentales no exhibían unión específica detectable de IL-11. El análisis de Scatchard de isotermas de saturación de IL-11 que se une a células M1 que expresaban IL-11r\alpha humana confirmaba la unión con alta afinidad (Fig. 13). Se estimó que la constante de disociación en equilibrio aparente (K_{d}) era 250 pM. Estas células expresaban un promedio de 3190 receptores en su superficie. Este resultado era comparable a células M1 que expresan IL-11r\alpha múrida (K_{d}=275 pM, y 4815 receptores/célula) y se atribuía a una interacción de la IL-11r\alpha humana con gp130 múrida.

La Tabla 4 resume los resultados de experimentos de cultivo en agar de células M1 que expresaban IL-11r\alpha humana y muestra su respuesta a LIF e IL-11. Según se describe anteriormente, las células M1 que expresaban la IL-11r\alpha múrida presentaban supresión clonal y diferenciación de macrófagos en respuesta a IL-11. En contraste, las células M1 parentales centrales no respondían a IL-11. Las cuatro fracciones reunidas de células M1 manipuladas para expresar la IL-11r\alpha humana, cuando se trataban con In-11, mostraban una supresión notable de la clonogenicidad (Tabla 4). Además, las pocas colonias que crecían en IL-11 presentaban un fenotipo diferenciado. Todas las líneas celulares mostraban la respuesta esperada a LIF.

Células M1 que expresaban IL-11r\alpha humana y células de control también se examinaron en cultivos en suspensión para evaluar la diferenciación de macrófagos en respuesta a IL-11 y LIF (31; 32). La morfología de los macrófagos se evaluó después de cinco días en el cultivo. Según se muestra en la Fig. 13, la mayoría de las células presentaba un fenotipo de macrófago después de la estimulación con IL-11. Se observaron resultados similares con células M1 que expresaban la IL-11r\alpha múrida, mientras que las células M1 parentales no respondían a IL-11. Así, estos experimentos documentaban la capacidad del cDNA humano aislado para codificar una proteína receptora funcional y demostraban que la cooperación entre la IL-11r\alpha humana y la gp130 múrida era suficiente para la transducción de
señales.

Para tratar directamente el requerimiento de gp130 para la señalización de receptor de IL-11 humano, se examinaron células Ba/F3 múridas. Estas células eran totalmente dependientes de IL-3 para la supervivencia y no expresan constitutivamente gp130. Las células Ba/F3 se manipularon para expresar IL-11r\alpha humana y se expandieron basándose en la expresión del gen de resistencia a puromicina sometido a coelectroporación. Se establecieron tres líneas celulares clonales. Se confirmó que estas expresaban IL-11r\alpha humana según se evaluó mediante la unión de IL-11 humana radiomarcada, aunque a un nivel bajo (106; 97; 116; conteos específicos medios unidos por 10^{6} células frente a unión indetectable para células Ba/F3 parentales). Según se muestra en la Fig. 14, estas células eran insensibles a IL-11. La molécula de gp130 humana se expresó a continuación en cada una de estas líneas clonales: las células proliferaban entonces en respuesta a IL-11 (Fig. 14). Este resultado confirmaba la expresión de la IL-11r\alpha humana, en células Ba/F3, y el requerimiento de gp130 para la proliferación. Las células Ba/F3 parentales usadas como control no respondían a IL-11 y, según se esperaba, todas las células proliferaban en respuesta a IL-3
múrida.

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Ejemplo 17

Rastreo de bibliotecas humanas

Las siguientes bibliotecas de cDNA humano se rastrearon usando la sonda múrida mencionada anteriormente: dos bibliotecas de médula ósea (27; Nº Cat. Clontech HL1058a), una biblioteca placentaria (Nº Cat. Clontech HL1008b), una biblioteca de hígado (Nº Cat. Clontech HL1001a) y una biblioteca de células de hepatoma (Nº Cat. Clontech HL1015b). Aproximadamente 10^{6} calvas procedentes de cada biblioteca se elevaron sobre membranas de nitrocelulosa y se fijaron incubando a 80ºC durante 2 h bajo vacío. Los filtros se prehibridaron durante 1 h y a continuación se hibridaron a 65ºC durante 16 h en una solución que contenía 2 X SSC, 2 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de Ficoll, 2 mg/ml de polivinilpirrolidona, ATP \muM, 50 \mug/ml de tRNA, pirofosfato sódico 2 mM, 2 mg/ml de DNA de esperma de salmón, 200 \mug/ml de azida sódica y SDS al 1% p/v. Los filtros se lavaron finalmente durante 30 min a 65ºC con 0,2 X SSC, SDS al 0,1%. Las calvas positivas sobre filtros duplicados se aislaron y se purificaron mediante rondas adicionales de rastreo por hibridación.

El clon Nº 91 humano (Fig. 11) también se marcó y se usó para sondar una biblioteca de cDNA de médula ósea humana. Esto daba como resultado el clon Nº 17.1.

Una cantidad de 15 \mug de DNA genómico humano (obtenido de leucocitos de sangre periférica) y DNA genómico múrido (obtenido de la línea celular FDCP-1) se digirió hasta la terminación con la enzima de restricción Hind III (Boehringer Mannheim, Alemania). Los fragmentos de DNA se separaron sobre un gel de agarosa al 0,8% p/v y se transfirieron a NaOH 0,4 M sobre una membrana de nailon (Gene Screen Plus, Biotechnology Systems, NEN Research Products).

Un fragmento de digestión con enzimas de restricción Sph I/Sac I de 445 pb procedente del clon 30.1 de IL-11r\alpha múrida (véanse los Ejemplos previos) y un fragmento de digestión de restricción Pst I/Sba I de 560 pb procedente del clon Nº 17.1 de cDNA humano se usaron como sondas. Una cantidad de 100 ng de DNA se marcó usando un estuche de marcaje aleatorio de decanucleótidos (Braesatec, Adelaide, S.A., Australia). El [^{32}P]ATP incorporado se separó del marcador no incorporado usando una columna NICK (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La membrana se prehibridó y se hibridó a 65ºC durante la noche en el tampón recomendado por el fabricante. La membrana se lavó finalmente en SDS al 0,1% p/v SDS, 0,2 X SSC (cloruro sódico 30 mM, citrato trisódico 3 mM) durante 30 min a 65ºC.

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Ejemplo 18

Análisis de calvas positivas a IL-11r\alpha humana

Placas positivas aisladas usando la sonda múrida se rastrearon adicionalmente mediante una estrategia basada en PCR. El eluato procedente de calvas puras (5 \mul) se usó como una plantilla en una reacción de PCR de 50 \mul de volumen usando 2,5 U de polimerasa de Taq (Boehringer Mannheim, Alemania), el tampón suministrado, 200 \muM de cada dNTP. La reacción se cebó con 250 ng de cebador oligonucleotídico antisentido correspondiente al motivo WSXWS 5'-[(G/A)CTCCA(N)GC(G/A)CTCAA-3'] (Nº ID SEC. 23) y un cebador oligonucleotídico vectorial apropiado que flanqueaba los cebadores de cDNA:promotor T3 y T7 clonados para el plásmido pBluescript, y los cebadores directo e inverso ygt10 y ggt11 apropiados. También se realizaron reacciones de control que carecían de la plantilla. Se seleccionaron tres calvas (Nº 91., Nº 4.3, Nº 8.2 aisladas de una biblioteca de médula ósea). Los cDNA se sometieron a secuenciación sobre ambas hebras usando el método de terminación didesoxi (18) y el estuche de secuenciación de polimerasa de T7 de Pharmacia (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

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Ejemplo 19

Constructos de expresión y ensayos biológicos de IL-11r\alpha humana

Un constructo de cDNA que incluía toda la región codificante y la señal de poliadenilación pero que excluía las secuencias intrónicas se elaboró ligando fragmentos de digestión con enzimas de restricción procedentes de Nº 9.1 (fragmento Eco RI/Pst I) y Nº 17.1 (fragmento Pst I/Eco RI). El constructo se clonó en el sitio Bst XI de pEF-BOS (30) usando adaptadores de Bst XI (Invitrogen, San Diego, CA, EE. UU. de A.). Se linealizó con Aat II antes de la electroporación en células M1 y Ba/F3. pPGKpuropA y pPGKneopA son derivados de pBluescript que contienen el cDNA que codifica puromicina transferasa y neomicina transferasa y se sometieron a coelectroporación en células y se usaron como marcadores de selección. gp130 humana clonada en pEF-BOS se sometió a electroporación en células BaF3 manipuladas para expresar la IL-11r\alpha humana. Células M1 (29) se hicieron crecer en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternero fetal (FCS) al 10% v/v en CO_{2} al 10% v/v a 37ºC. Células Ba/F3 (33) se hicieron crecer en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% v/v y medio acondicionado con WEHI-3B D como una fuente de IL-3 (34). Células M1 y Ba/F3 que expresan establemente el constructo de IL-11r\alpha humana se generaron mediante electroporación como se describe anteriormente. Las células se sometieron a coelectroporación con pPGKPuropA. Clones de Ba/F3 que expresaban IL-11r\alpha humana se expandieron con selección del antibiótico puromicina y se introdujo gp130 humana con pPGKneopA. Estas células se expandieron en G418.

Para los ensayos biológicos, células M1 (300 por ml) se cultivaron en DMEM, FCS al 20% v/v, agar al 0,3% p/v y con IL-11 humana (1000 U/ml) o LIF múrido (1000 U/ml) o solución salina normal. Los cultivos se incubaron en aire humidificado con CO_{2} al 10% v/v a 37ºC. Después de 7 días, las colonias se contaron y la diferenciación se evaluó usando criterios estándar (35). En los cultivos en suspensión, 1,5 x 10^{4} células M1 se cultivaron en 1,5 ml de DMEM que contenía FCS al 10% v/v y con o sin IL-11 (1000 U/ml) o LIF (1000 U/ml) y se incubaron como anteriormente. La diferenciación se determinó mediante el examen morfológico de células teñidas con May-Grunwald Giemsa: se examinó un mínimo de 200 células.

La proliferación de células Ba/F3 se midió en un ensayo de micropocillos como el descrito anteriormente. En resumen, 200 células/pocillo se incubaron en 15 \mul de medio que contenía los siguientes estímulos: solución salina normal, interleuquina-3 (IL-3) múrida en una concentración final de 1000 unidades/ml y diluciones en serie de IL-11 humana. Las células viables se contaron después de 48 horas.

La yodación de IL-11 usando el reactivo de Bolton-Hunter y los estudios de unión con células M1 y Ba/F3 se realizaron como se describe previamente con anterioridad.

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Ejemplo 20

Fuente de citoquinas

IL-3 múrida e IL-11 humana se adquirieron de Peprotech (Rocky Hill, NJ, EE. UU. de A.) y LIF múrido y AMRAD de Pty. Ltd. (Melbourne, Australia). La IL-11 humana usada en estudios de unión a ligandos se obtuvo mediante la expresión en células COS-M6. En resumen, un cDNA que codifica la proteína madura para IL-11 humana se obtuvo mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de cDNA derivado de una línea celular estromal humana 197/17 (36). La región codificante madura de IL-11 humana se insertó en pEF/IL3SIG/FLAG que es un vector de expresión derivado de pEF-BOS (30) que contiene secuencias que codifican la secuencia de señal de IL-3 múrida seguido por la secuencia FLAG (Eastman Kodak, CT, EE. UU. de A.), y a continuación se expresó en células COS-M6 dando como resultado la secreción de una proteína de IL-11 humana biológicamente activa con una flag N-terminal. La IL-11 human con flag N-terminal se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG (Eastman Kodak, CT, EE. UU. de A.) según era recomendado por el fabricante, con elución de péptido seguida por cromatografía de filtración en gel sobre Superdex 75 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La proteína purificada daba una sola banda de PM 25.000 sobre geles de poliacrilamida en presencia de SDS.

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Ejemplo 21

Puesto que no estaban disponibles anticuerpos para la cadena \alpha de receptor de IL-11 para verificar la expresión, se sometieron a ingeniería genética constructos para expresar una versión soluble de la cadena \alpha de receptor de IL-11 múrida con un epítopo FLAG N-terminal (International Biotechnologies/Eastman Kodak, CT, EE. UU. de A.). En primer lugar, se generó un derivado del vector de expresión mamífero pEF-BOS de modo que contuviera DNA que codifica la secuencia de señal de IL-3 múrida (MVLASSTTSIHTMLLLLLMLFHLGLQASIS) y el epítopo FLAG (DYKDDDDK), seguido por un sitio de clonación Xba I único. Este vector se denominó pEF/IL3SIG/FLAG.

Se realizó PCR para amplificar fragmentos de DNA que codifican el dominio extracelular sin las regiones de transmembrana o citoplásmica (S24 a Q367). Los cebadores usados eran:

5'-ATCTTCTAGATCCCCCTGCCCCCAAGCT-3'	(Nº ID SEC: 24)

5'ACTTTCTAGATTATTGCTCCAAGGGGTCCCTGTG-3'	(Nº ID SEC: 25)

El producto de PCR de la cadena \alpha de receptor de IL-11 múrida soluble se digirió con Xba I y se clonó, en el marco, en el sitio XbaI de pEF/IL3SIG/FLAG para dar pEF-sIL-11r\alpha.

Para confirmar que la cadena \alpha de receptor de IL-11 múrida soluble podía producirse usando los vectores de expresión pEFSIL-11r\alpha, células COS se transfectaron transitoriamente con estos constructos. En resumen, células COS procedentes de un matraz de cultivo tisular de 175 cm^{2} confluente se resuspendieron en PBS y se sometieron a electroporación (BioRad Gene pulser; 500 \muF, 300 V) con 20 \mug de pEF-sIL-11r\alpha sin cortar en una cubeta de 0,4 cm (BioRad). Después de 2 a 3 días a 37ºC en una incubadora completamente humidificada que contenía CO_{2} al 10% v/v en aire, las células se usaron para análisis de expresión de proteínas. El medio acondicionado se recogió mediante centrifugación y se almacenó estérilmente a 4ºC.

El medio se cromatografió a continuación en una columna de afinidad de anticuerpo anti-FLAG (International Biotechnologies/Eastman Kodak, CT, EE. UU. de A.). Las proteínas que no se unían a la columna se lavaron a su través con PBS, mientras que las proteína de la cadena \alpha de receptor de IL-11 múrida que se unían a la columna se eluyeron con 8 ml de \mug/ml de péptido FLAG. La cadena \alpha de receptor de IL-11 múrida soluble purificada se sometió a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida en presencia de SDS, que se tiñó con plata para revelar la presencia de una banda principal con un peso molecular aparente de aproximadamente 40.000 similar al tamaño predicho de la cadena \alpha del receptor de IL-11 múrida soluble.

La cadena \alpha del receptor de IL-11 múrida soluble purificada se probó con respecto a su capacidad para estimular la diferenciación de células M1 en presencia o ausencia de IL-11. La IL-11 y la cadena \alpha del receptor de IL-11 múrida soluble eran incapaces de estimular la diferenciación de M1 solas, sin embargo, cuando se combinaban, se observaba diferenciación en cultivo tanto líquido como semisólido. Estos resultados demuestran que la cadena \alpha del receptor de IL-11 múrida soluble puede actuar como un agonista, permitiendo que la IL-11 ejerza efectos sobre células que expresan gp130 en ausencia de cadena \alpha del receptor de IL-11 unida a membrana. de este modo, la cadena \alpha del receptor de IL-11 soluble es similar a la cadena \alpha del receptor de IL-6 soluble.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Se entenderá que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, las características, las composiciones y los compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individualmente o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones de cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE (distintos de EE.UU.): AMRAD CORPORATION LIMITED (solo EE.UU.): Douglas James HILTON

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN NUEVO RECEPTOR DE HEMOPOYETINA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: MELBOURNE

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: VICTORIA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 3000

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: AU PROVISIONAL

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-SEP-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: HUGHES DR, E JOHN L

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: EJH/EK

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: +61 3 9254 2777

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFÁX: +61 3 9254 2770

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1705 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 45.. 1340

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 432 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1800 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 128.. 1396

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 423 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTCCAYT CRCTCCA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTCCART CRCTCCA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTCCANGCY CTCCA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTCCANGG RCTCCA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTCCAYT TRCTCCA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(

\vskip0.800000\baselineskip

ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTCCACGG TGGAGCCCAT TGGCT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACACGCGG TACGAGTCAG TGCCAGGGAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAAGTTCA GCCTGGTTAA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTATGAGTA TTTCTTCCAG GGTA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTTCATTG ACCTCAACTA CATG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGCCAGTG AGCTTCCCGT TCAG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCCTCCA GGGGTCCAGT ATGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGCCTCC AGAGGGT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTGTACT TGGAGTCCAG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAAGCTGT GGCGTGATGG CCGTGGGGCA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCGGAGGC CGCTGGCGGG CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTATCAGCTG AAGTTCTCTG GGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTCCANGCR CTCAA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTTCTAGA TCCCCCTGCC CCCAAGCT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTTCTAGA TTATTGCTCC AAGGGGTCCC TGTG

\hfill

34

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o complementaria de una secuencia que codifica, una cadena \alpha de un receptor de interleuquina (IL)-11 que tiene

(i): una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 3; o

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

2. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el receptor de IL-11 es de origen mamífero.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el receptor de IL-11 es de origen humano o múrido.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ácido nucleico es DNA.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha molécula de ácido nucleico

(i): comprende una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 2 o

(ii): es capaz de hibridarse a la secuencia del Nº ID SEC:2 bajo condiciones de alta restricción.

6. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cadena \alpha de receptor de IL-11 mamífera y que tiene

(i): la secuencia de aminoácidos que se indica en el Nº ID SEC: 3; o

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

\quad: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser

8. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el mamífero es una especie humana o múrida.