ES2316387T3 - Receptor acoplado a proteina g sobrexpresado en cancer de prostata y la utilizacion del mismo. - Google Patents

Abstract

El uso de un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste en: a) un polinucleótido de Id. de Sec. Nº 1: b) un polinucleótido de Id. de Sec. Nº 1 desde el residuo de nucleótido número 133 hasta el residuo de nucleótido número 1083; y c) el polinucleótido contenido en el plásmido designado P101P3A11 depositado con el Nº de Registro de la American Type Culture Collection PTA-312; como un marcador para el cáncer de próstata, de riñón, de útero, cervical, de estómago y rectal.

Description

Receptor acoplado a proteína G sobreexpresado en cáncer de próstata y la utilización del mismo.

Campo de la invención

La invención aquí descrita está relacionada con la utilización de un polipéptido derivado de PHOR-1 como marcador de varios cánceres que expresan PHOR-1, en particular los cánceres de próstata.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa de muerte en humanos, cerca de las enfermedades coronarias. A nivel mundial, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en los Estados Unidos, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas anuales, con alrededor de 1,4 millones de nuevos casos diagnosticados cada año. Mientras las muertes por enfermedades coronarias han disminuido significativamente, las resultantes de cáncer en general están aumentando. En la primera parte del próximo siglo, se prevé que el cáncer se convertirá en la principal causa de muerte.

A nivel mundial, varios cánceres sobresalen como los más mortíferos. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovario representan las causas principales de muerte por cáncer. Estos, y virtualmente todos los demás carcinomas, comparten la característica común de la letalidad. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática originada a partir de un carcinoma es fatal. Además, incluso en los pacientes de cáncer que inicialmente sobreviven a sus tumores primarios, la experiencia general demuestra que sus vidas se ven alteradas de forma dramática. Muchos pacientes de cáncer experimentan una gran ansiedad causada por el hecho de ser conscientes de una posible recidiva o fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan una debilitación física tras el tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan una recidiva.

A nivel mundial, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en los hombres. En América del norte y Europa del norte, es de lejos el más común de los cánceres en los hombres y es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres. Sólo en los Estados Unidos, mueren más de 40.000 hombres anualmente de esta enfermedad, detrás sólo del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estos datos, no existe aún un tratamiento efectivo para el cáncer de próstata metastático. La prostatectomía quirúrgica, la terapia de radiación, la terapia de ablación hormonal y la quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desgraciadamente, estos tratamientos no son efectivos para muchos y a menudo se asocian con consecuencias no deseadas.

En el frente diagnóstico, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar de forma precisa tumores en fase temprana localizados sigue siendo una limitación significativa en el manejo de esta enfermedad. Aunque el ensayo de PSA en suero ha sido una herramienta muy útil, se considera en general que su especificidad y utilidad general tienen carencias en varios aspectos importantes.

El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales del cáncer de próstata ha mejorado gracias a la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes fases de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos LAPC (Cáncer de próstata de Los Angeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al pase en varios ratones con deficiencia inmune combinada severa (SCID) y muestran la capacidad de mimetizar la progresión de la enfermedad, lo que incluye la transición de dependencia de los andrógenos a independencia de los andrógenos y el desarrollo de lesiones metastáticas (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3:402). Los marcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7252), antígeno de células madre de próstata (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735), y STEAP (Hubert et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14523).

Aunque los marcadores identificados previamente, como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, sigue siendo necesaria la identificación de marcadores adicionales y dianas terapéuticas del cáncer de próstata y otros relacionados para mejorar aún más su diagnóstico y terapia.

La WO 9.906.550 describe 5 EST derivados de mRNA que codifican proteínas de secreción. Bepler et al. en Genomics 55, Enero 1999, págs. 164-175 describe la secuencia del segmento de cromosoma 11p 15.5 y los genes en la región supresora de la metástasis LOH11A.

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con un nuevo receptor acoplado a proteína G específico de próstata sobreexpresado en cáncer de próstata, denominado PHOR-1. La expresión de PHOR-1 está mayormente restringida a la próstata, y está notablemente sobreexpresado en los tumores de próstata. La expresión de PHOR-1 en muestras emparejadas de próstata normal/tumoral de pacientes con cáncer de próstata avanzado, utilizando tanto métodos de detección de mRNA como de proteína, muestra un elevado grado de sobreexpresión en el tejido tumoral, lo que sugiere que PHOR-1 es un marcador útil para la detección del cáncer de próstata. El análisis de muestras normales/tumorales de otros pacientes de cáncer humanos demuestra una sobreexpresión de PHOR-1 también en cánceres de riñón, uterino, cervical, estómago y rectal. Además, la expresión de PHOR-1 induce el crecimiento de colonias y modula la fosforilación de cAMP y tirosina de forma indicativa de un papel funcional en la tumorogénesis y la transformación, proporcionando una diana estratégica para la terapia del cáncer.

La estructura de PHOR-1 incluye siete presuntos dominios transmembrana que se extienden a lo largo de la secuencia proteica de 317 aminoácidos. PHOR-1 se expresa en la superficie celular, con el extremo N-terminal expuesto en el exterior de la membrana celular. La proteína PHOR-1 es homóloga a la gran familia de receptores olfativos que se expresan en el epitelio y las neuronas olfativos. PHOR-1 muestra una actividad funcional consistente con la de otros receptores acoplados a proteína G, lo que sugiere que PHOR-1 tiene un papel crucial en la regulación del funcionamiento, proliferación y transformación celulares.

Aquí se describen una serie de posibles aproximaciones al tratamiento del cáncer de próstata y otros cánceres que expresan PHOR-1. La orientación en la superficie celular y la naturaleza de acoplamiento a proteína G de este receptor proporciona una serie de aproximaciones terapéuticas utilizando moléculas que afectan a PHOR-1 y su función, así como moléculas que afectan a otras proteínas, factores y ligandos que actúan a través del receptor PHOR-1. Estas aproximaciones terapéuticas incluyen la terapia de anticuerpos con anticuerpos anti-PHOR-1, terapia con moléculas pequeñas y terapia con vacunas. Además, dada su sobreexpresión en cáncer de próstata, PHOR-1 es útil como marcador diagnóstico, de estadio y/o pronóstico para el cáncer de próstata y, de forma similar, puede ser un marcador para otros cánceres que expresan este receptor.

La invención es como se define en la reivindicación 1. La especificación describe los genes, mRNA y/o secuencias codificantes de PHOR-1, preferiblemente en forma aislada, lo que incluye los polinucleótidos que codifican las proteínas PHOR-1 y fragmentos de las mismas, DNA, RNA, híbridos DNA/RNA y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a los genes de PHOR-1 o secuencias de mRNA o partes de las mismas, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con los genes o mRNA de PHOR-1, o con polinucleótidos que codifican PHOR-1. También se describen los medios para aislar los cDNA y genes que codifican PHOR-1. También se describen las moléculas de DNA recombinante que contienen polinucleótidos PHOR-1, las células transformadas o transducidas con tales moléculas y los sistemas de vectores huésped para la expresión de los productos génicos de PHOR-1.

La invención también describe las proteínas PHOR-1 y fragmentos de polipéptido de las mismas, así como anticuerpos que se unen a las proteínas PHOR-1 y los fragmentos de polipéptido de las mismas. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanos, anticuerpos marcados con un marcador detectable, y anticuerpos conjugados con radionúcleos, toxinas u otras composiciones terapéuticas.

La invención también describe los métodos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas PHOR-1 en varias muestras biológicas, así como métodos para la identificación de células que expresan PHOR-1. La invención también describe varias composiciones y estrategias terapéuticas, lo que incluye en particular, las terapias de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas, para el tratamiento de los cánceres de próstata, riñón, cérvix, útero, recto y estómago.

La invención adicionalmente describe un método para la identificación de una molécula que modula una actividad biológica de PHOR-1. El método comprende poner en contacto una molécula con una célula que expresa PHOR-1, ensayar una actividad biológica de PHOR-1 en presencia y ausencia de la molécula, y determinar si la actividad biológica de PHOR-1 se ve alterada por la presencia de la molécula. Una alteración en la actividad biológica de PHOR-1 es indicativa de una molécula que modula una actividad biológica de PHOR-1. Preferiblemente, la actividad biológica de PHOR-1 ensayada en el método comprende una fosforilación de tirosina, acumulación de cAMP citosólico o estimulación del crecimiento de colonias.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1A-1D. Secuencias de nucleótidos (Id. de Sec. Nº1) y aminoácidos deducidos (Id. de Sec. Nº2) del cDNA de PHOR-1 humano (clon GTH10). La presunta metionina de inicio se muestra con letra en negrita. La secuencia muestra dos metioninas adyacentes al inicio, y la secuencia que rodea la segunda metionina (ATG ATG G) muestra una secuencia Kozak. Los siete presuntos dominios transmembrana están en cajas.

Fig. 2. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de PHOR-1 humano con HPRAJ70 (Id. de Sec. Nº4) y RA1c (Id. de Sec. Nº3) utilizando el programa ClustalW 1.7 (BCM Search Launcher). Los presuntos dominios transmembrana se indican en negrita o en cajas. El dominio en cajas se identificó por homología con HPRAJ70 y RA1c. Los dominios en negrita se identificaron utilizando la herramienta de la red SOSUI en http://www.tuat.ac.jp/\simmitaku/advsosui/
submit.html.

Fig. 3. Secuencia de nucleótidos (Id. de Sec. Nº5) del fragmento derivado de SSH correspondiente al gen PHOR-1.

Fig. 4. Representación esquemática de la topología a gran escala de la proteína transmembrana PHOR-1.

Fig. 5A. Análisis de la expresión mediante RT-PCR semicuantitativa que muestra una expresión en humanos de PHOR-1 restringida a la próstata y xenoinjertos de cáncer de próstata. Se muestran: cerebro (carril 1), próstata normal (carril 2), LAPC-4 AD (carril 3), LAPC-4 AD 3 días tras la castración (carril 4), LAPC-4 AD 14 días tras la castración (carril 5), LAPC-4 AI (carril 6), células HeLa (carril 7) y control negativo (carril 8).

Fig. 5B. Análisis de la expresión mediante RT-PCR semicuantitativa que muestra una expresión en humanos de PHOR-1 restringida a la próstata. Se muestran: colon (carril 1), ovario (carril 2), leucocitos (carril 3), próstata normal (carril 4), intestino delgado (carril 5), bazo (carril 6), testículos (carril 7) y timo (carril 8).

Fig. 6A-6C. Muestran los resultados del análisis de la expresión de PHOR-1 mediante Northern blot, que demuestran una expresión restringida a próstata normal y xenoinjertos de cáncer de próstata.

Fig. 6A. Análisis de Northern blot de PHOR-1 en corazón (carril 1), cerebro (carril 2), placenta (carril 3), pulmón (carril 4), hígado (carril 5), músculo esquelético (carril 6), riñón (carril 7) y páncreas (carril 8).

Fig. 6B. Análisis de Northern blot de PHOR-1 en bazo (carril 1), timo (carril 2), próstata normal (carril 3), testículos (carril 4), ovario (carril 5), intestino delgado (carril 6), colon (carril 7) y leucocitos (carril 8).

Fig. 6C. Análisis de Northern blot de PHOR-1 en próstata normal (carril 1), LAPC-4 AD (carril 2), LAPC-4 AI (carril 3), LAPC-9 AD (carril 4) y LAPC-9 AI (carril 5).

Fig. 7. Análisis de dot blot de la expresión del mRNA de PHOR-1 en 76 muestras diferentes de tejidos humanos que muestra una expresión exclusiva en próstata. Las posiciones representan los siguientes tejidos: A1 cerebro completo; A2 cerebelo, izquierdo; A3 sustancia negra; A4 corazón; A5 esófago; A6 colon, transversal; A7 riñón; A8 pulmón; A9 hígado; A10 HL60, leucemia; A11 cerebro fetal; B1 córtex cerebral; B2 cerebelo, derecho; B3 núcleo acumbens; B4 aorta; B5 estómago; B6 colon, descendente; B7 músculo esquelético; B8 placenta; B9 páncreas; B10 HeLa, S3; B11 corazón fetal; C1 lóbulo frontal; C2 cuerpo calloso; C3 tálamo; C4 atrio, izquierdo; C5 duodeno; C6 recto; C7 bazo; C8 vejiga; C9 glándula adrenal; C10 K562, leucemia; C11 riñón fetal; D1 lóbulo parietal; D2 amígdala; D3 glándula pituitaria; D4 atrio, derecho; D5 yeyuno; D6 - -; D7 timo; D8 útero; D9 glándula tiroidea; D10 MOLT-4, leucemia; D11 hígado fetal; E1 lóbulo occipital; E2 núcleo caudato; E3 médula espinal; E4 ventrículo, izquierdo; E5 íleo; E6 - -; E7 leucocitos; E8 próstata; E9 glándula salival; E10 RAJI, linfoma; E11 bazo fetal; F1 lóbulo temporal; F2 hipocampo; F3 - -; F4 ventrículo, derecho; F5 íleo-ciego; F6 - -; F7 nódulo linfático; F8 testículos; F9 glándula mamaria; F10 DAUDI, linfoma; F11 timo fetal; G1 giro paracentral; G2 médula oblongata; G3 - -; G4 septo interventricular; G5 apéndice; G6 - -; G7 médula ósea; G8 ovario; G9 - -; G10 SW480, cáncer de colon; G11 pulmón fetal; H1 hueso; H2 putamen; H3 - -; H4 ápice del corazón; H5 colon, ascendente; H6 - -; H7 traquea; H8 - -; H9 - -; H10 A549, cáncer de pulmón; H11 - -.

Fig. 8A. Análisis de Northern blot de la expresión de PHOR-1 en xenoinjertos de cáncer de próstata humano, que muestran un elevado nivel de sobreexpresión de PHOR-1 en tumores de próstata. Próstata normal (carril 1); LAPC-4 AD (carril 2); LAPC-4 AI (carril 3); LAPC-9 AD (carril 4); LAPC-9 AI (carril 5).

Fig. 8B. Análisis de Northern blot de la expresión de PHOR-1 en muestras de biopsias de pacientes humanos, que muestran un elevado nivel de sobreexpresión de PHOR-1 en tumores de próstata. Próstata normal (carril 6); paciente 1, tejido normal adyacente (carril 7); paciente 1, tumor de Gleason 7 (carril 8); paciente 2, tejido normal adyacente (carril 9); paciente 2, tumor de Gleason 9 (carril 10); paciente 3, tejido normal adyacente (carril 11); paciente 3, tumor de Gleason 7 (carril 12); paciente 4, tejido normal adyacente (carril 13); paciente 4, tumor de Gleason 7 (carril 14).

Fig. 9A. Expresión de PHOR-1 en cáncer de próstata, que muestra sobreexpresión por análisis de Northern en 5 de 7 (u 8 de 10, si se combina con la Fig. 9B) muestras de tumor. Se muestran las muestras emparejadas tumor (T) y normal (N) de los pacientes para los siguientes tipos de tumores: Gleason 7 (par de carriles 1); Gleason 9 (par de carriles 2); Gleason 7 (par de carriles 3-5); Gleason 6 (pares de carriles 6-7); B representa una hiperplasia prostática benigna (HPB); N representa muestras normales adicionales.

Fig. 9B. Expresión de PHOR-1 en cáncer de próstata, lo que muestra sobreexpresión mediante análisis de dot blot en 3 de 3 (o 8 de 10, si se combina con la Fig. 9A) especímenes de tumor. Se muestran pares de muestras tumorales (T) y normales (N) de pacientes de los siguientes tipos de tumores: de Gleason 7 (par de puntos 8); de Gleason 8 (par de puntos 9); de Gleason 7 (par de puntos 10).

Fig. 10. La expresión de PHOR-1 en los tumores humanos demostrada mediante análisis de dot blot pares de muestras de RNA tumoral (T) y RNA normal (N) utilizando cDNA amplificados derivados de pacientes. Se encontró sobreexpresión de PHOR-1 en pacientes 3 de 3 de cáncer de próstata, 6 de 14 pacientes con cáncer de riñón, 2 de 8 pacientes con cáncer de útero, 3 de 8 pacientes de cáncer de estómago y 7 de 7 pacientes de cáncer rectal.

Fig. 11A. Fotomicrografía que muestra la expresión de PHOR-1 en neoplasias intraepiteliales prostáticas (PIN) mediante hibridación in situ con una ribosonda antisentido de PHOR-1.

Fig. 11B. Fotomicrografía que muestra la expresión de PHOR-1 en tejido de cáncer de próstata mediante hibridación in situ con una ribosonda antisentido de PHOR-1.

Fig. 12A. Fotomicrografía que muestra la expresión de PHOR-1 en cáncer de próstata mediante hibridación in situ con una ribosonda antisentido de PHOR-1. Nótese la sobreexpresión en relación a la próstata normal, Fig. 12B.

Fig. 12B. Fotomicrografía que muestra la expresión de PHOR-1 en próstata normal mediante hibridación in situ con una ribosonda antisentido de PHOR-1.

Fig. 13A. Expresión y detección de la proteína PHOR-1 en las células PHOR-1-293T. Las células 293T se transfectaron de manera transitoria con 10 \mug del plásmido pCDNA4 HIS MAN PHOR-1, que contiene un epítopo Express y una cola de HIS fusionados al extremo N-terminal de la secuencia PHOR-1, o vector control y se realizó un ensayo de la expresión de la proteína PHOR-1 mediante citometría de flujo. Para la detección en la citometría de flujo de la proteína PHOR-1, se recogieron las células 293T transfectadas con PHOR-1 y con vector control 2 días tras la transfección y se realizó una tinción con 10 \mug/ml de mAb anti-Express (Invitrogen) seguido de un conjugado anti-ratón con FITC, y luego se analizó en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL. Con flechas se indican los respectivos perfiles fluorescentes de las poblaciones de células control (línea sólida) y transfectadas con PHOR-1 (línea de puntos). Estos resultados demuestran la expresión en la superficie celular y el reconocimiento de la proteína PHOR-1 en células transfectadas.

Fig. 13B. Expresión y detección de la proteína PHOR-1 en células PHOR-1-293T. Las células 293T se transfectaron como se describe en la Fig. 13A, y se realizó un ensayo de la expresión de la proteína PHOR-1 mediante inmunoprecipitación (IP) y western blot. Para los análisis de inmunoprecipitación y western, las células con PHOR-1 y con vector control se recogieron y lisaron en tampón RIPA (Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton-X 1001%, deoxicolato sódico 0,5%, SDS 1%, EDTA 2 mM, PMSF 100 \mug/ml, leupeptina 2 \mug/ml, y ortovanadato sódico 2 mM) para la inmunoprecipitación o en tampón de muestra para SDS-PAGE 2X para los análisis de western de los lisados celulares completos (WCL). Los lisados con RIPA se pre-clarificaron con cuentas de proteína G agarosa y luego se inmunoprecipitaron con 4 \mug de pAb de conejo anti-péptido PHOR-1 purificado por afinidad y cuentas de proteína G agarosa. Las proteínas PHOR-1 inmunoprecipitadas (IP) y las proteínas PHOR-1 presentes en los lisados celulares totales (WCL) se detectaron mediante un análisis de western con un mAb anti-express seguido de un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón-HRP y se visualizaron mediante quimioluminiscencia potenciada y exposición a una película de autoradiografía. La flecha indica la proteína marcada con el epítopo de PHOR-1 esperada de 37 kD detectada por el mAb anti-Express. También se detectó una pincelada de elevado peso molecular en las células transfectadas con PHOR-1 pero no en las células control, lo que puede representar agregados de la proteína PHOR-1 inducidos por la asociación de regiones hidrofóbicas transmembrana. Estos resultados demuestran la expresión en la superficie celular y el reconocimiento de la proteína PHOR-1 en las células transfectadas.

Fig. 14A. Detección mediante citometría de flujo de la expresión de la proteína PHOR-1 en la superficie celular mediante un anticuerpo policlonal específico de PHOR-1. Se utilizó un pAb anti-péptido PHOR-1 purificado por afinidad creado frente a los aminoácidos 1-14 de la secuencia de PHOR-1 para detectar la proteína PHOR-1 unida al epítopo expresada en células 293T transfectadas de manera transitoria. Las células 293T se transfectaron con vector control o con el plásmido pCDNA4 HIS-MAX PHOR-1 (10 \mug) y se recogieron 2 días después. Entonces se realizó una tinción de las células con 10 \mug/ml de mAb anti-Express seguido de un Ab secundario anti-ratón conjugado con FITC y se analizó en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL. Se indican con flechas los respectivos perfiles fluorescentes de las poblaciones celulares control (línea de puntos) y transfectadas con PHOR-1 (línea sólida).

Fig. 14B. Detección por citometría de flujo de la expresión en la superficie celular de la proteína PHOR-1 mediante un anticuerpo policlonal específico de PHOR-1. Se utilizó el pAb anti-péptido PHOR-1 purificado por afinidad generado frente a los aminoácidos 1-14 de la secuencia de PHOR-1 para detectar la proteína PHOR-1 unida al epítopo expresada en células 293T transfectadas de manera transitoria. Las células 293T se transfectaron con vector control o con el plásmido pCDNA4 HIS-MAX PHOR-1 (10 \mug) y se recogieron 2 días después. Entonces se realizó una tinción de las células con 10 \mug/ml de pAb anti-PHOR-1 de conejo purificado por afinidad seguido de un Ab secundario anti-conejo conjugado con FITC y se analizó en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL. Se indican con flechas los respectivos perfiles fluorescentes de las poblaciones celulares control (línea de puntos) y transfectadas con PHOR-1 (línea sólida).

Fig. 15. Reactividad específica de PHOR-1 de suero derivado de ratones inmunizados con el antígeno GST-PHOR-1. Se inmunizaron ratones Balb C con una proteína de fusión glutation-S-transferasa (GST)-PHOR-1, que codifica los aminoácidos 86-310 de la secuencia de la proteína PHOR-1. La reactividad específica del suero de los ratones inmunizados frente a la secuencia de la proteína PHOR-1 se determinó mediante western blot utilizando una proteína de fusión de la proteína de unión a maltosa (MBP)-PHOR-1, que codifica los mismos aminoácidos como antígeno diana. Se utilizó una dilución 1:500 de una muestra representativa de sangre para detectar la hibridación de varias cantidades de proteína MBP-PHOR-1 purificada (2 \mul = \sim100 ng de proteína de fusión) y de lisados bacterianos inducidos. Se muestra el reconocimiento específico de la proteína MBP-PHOR-1, lo que demuestra que hay anticuerpos específicos de PHOR-1 en el suero de los ratones inmunizados.

Fig. 16A. Detección de la expresión de PHOR-1 en la superficie celular de las células tumorales LNCaP. Se realizó una tinción de las células LNCaP con una dilución 1:200 de una combinación de sueros derivados de ratones inmunizados con GST-PHOR-1 o con sueros de ratones preinmunes seguido de un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC. Las células teñidas se analizaron entonces en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL. Se indican con flechas los respectivos perfiles fluorescentes de las poblaciones celulares teñidas con sueros preinmunes (línea sólida) o con sueros inmunes frente a GST-PHOR-1 (línea de puntos). Estos resultados demuestran el reconocimiento de la expresión endógena de PHOR-1 en la superficie celular de las células de cáncer de próstata LNCaP.

Fig. 16B. Detección de la expresión en la superficie celular de PHOR-1 en células tumorales LAPC9. Se realizó una tinción de las células tumorales LAPC9 preparadas a partir de un xenoinjerto de ratón SCID LAPC9 con una dilución 1:200 de una combinación de sueros derivados de ratones inmunizados con GST-PHOR-1 o con sueros de ratones preinmunes seguido de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC. Las células teñidas se analizaron entonces en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL. Se indican con flechas los respectivos perfiles fluorescentes de las poblaciones celulares teñidas con sueros preinmunes (línea sólida) o con sueros inmunes frente a GST-PHOR-1 (línea de puntos). Estos resultados demuestran el reconocimiento de la expresión endógena de PHOR-1 en la superficie celular de las células de cáncer de próstata LAPC9.

Fig. 17. Expresión de PHOR-1 evaluada mediante traducción in vitro en ausencia de células. Se tradujeron un cDNA control y un cDNA de PHOR-1 in vitro utilizando lisados de reticulocitos de conejo. El ensayo de traducción in vitro en ausencia de células demuestra que el cDNA de PHOR-1 se traduce a una proteína de 38-42 kDa, que corresponde al peso molecular calculado de PHOR-1.

Fig. 18A. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en tejidos fijados con formol e incluidos en parafina de cáncer de próstata.

Fig. 18B. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en la línea celular de cáncer de próstata fijada con formol e incluida en parafina, LNCaP.

Fig. 18C. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en tejidos fijados con formol e incluidos en parafina de cáncer de próstata.

Fig. 18D. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en tejidos fijados con formol e incluidos en parafina de próstata normal.

Fig. 18E. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en tejidos fijados con formol e incluidos en parafina de cáncer de próstata.

Fig. 18F. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en tejidos fijados con formol e incluidos en parafina de próstata normal.

Fig. 19A. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en células 293T fijadas con formol e incluidas en parafina.

Fig. 19B. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en células 293T fijadas con formol e incluidas en parafina modificadas para la expresión de PHOR-1.

Fig. 19C. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en células PC3 fijadas con formol e incluidas en parafina.

Fig. 19D. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en células PC3 fijadas con formol e incluidas en parafina modificadas para la expresión de PHOR-1.

Fig. 19E. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en tejidos fijados con formol e incluidas en parafina de cáncer de próstata.

Fig. 19F. Fotomicrografía que muestra un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (péptido 1; aminoácidos 1-14) en células LNCaP fijadas con formol e incluidas en parafina.

Fig. 20A. Análisis Western de la alteración de la fosforilación de la tirosina por PHOR-1. Se cultivaron células PC3, que expresan de forma estable en el vector retroviral pSRa neo o PHOR-1 en FBS al 1% durante toda la noche. Entonces las células se dejaron sin tratar o se trataron con FBS al 10% durante 3 min. Las células se lisaron y analizaron mediante western blot con antifosfotirosina (UBI, Lake Placid, NY).

Fig. 20B. Análisis Western de la alteración de la fosforilación de Erk por PHOR-1. Las células PC3, que expresan de forma estable en el vector retroviral pSRa neo o PHOR-1 se procesaron como se describe para Fig. 19A. Las células se lisaron y analizaron mediante western blot con un mAb anti-fosfo-ERK (Cell Signal, Beverly, MA).

Fig. 20C. Las células PC3 preparadas como se describe para las Fig. 19A-B también se analizaron para Grb2. La superposición del mAb anti-Grb2 (Transduction Laboratories, San Diego, CA) muestra una carga de proteína idéntica.

Fig. 20D. Análisis de Northern de las células PC3-neo y PC3-PHOR-1. Las células PC3 descritas en las Fig. 19A-C anteriormente se evaluaron para la expresión de PHOR-1 mediante northern blot. El RNA se extrajo a partir de las células control PC3-neo y las células PC3 con una transducción estable de PHOR-1, y las transferencias de RNA se hibridaron utilizando una sonda de PHOR-1 (fragmento Xba-Ecor1 del clon GTH10). Se utilizó RNA de los xenoinjertos LAPC4 como control positivo (véase la Fig. 20). Los resultados muestran que el mRNA de PHOR-1 se expresa en las células con transducción retroviral de PC3-PHOR-1 pero no en las células control.

Fig. 20E. Northern blot que muestra la expresión de PHOR-1 en xenoinjertos LAPC4. Se observa una expresión intensa en el LAPC4 dependiente de andrógeno (AD), pero no en el LAPC4 independiente de andrógeno (AI).

Fig. 21A. Se analizó la capacidad de formar colonias en agar blando de las células NIH-3T3 que expresan de forma estable PHOR-1. Las células NIH-3T3 que expresan de forma estable neo se utilizaron como control negativo. El experimento se realizó por duplicado. El ensayo se evaluó 4 semanas tras la siembra de las células.

Fig. 21B. Se analizó la capacidad de formar colonias en agar blando de las células NIH-3T3 que expresan de forma estable PHOR-1. El experimento se realizó por duplicado. El ensayo se evaluó 4 semanas tras la siembra de las células. El contaje de colonias muestra que PHOR-1 induce un aumento de 3 veces en la formación de colonias en relación al control neo (Fig. 21A). Este aumento significativo se ha observado en 2 experimentos separados. Los resultados indican que la expresión de PHOR-1 en las células NIH 3T3 induce un aumento de 3-4 veces en la formación de colonias comparado con el aumento de 5 veces inducido por el potente oncogén Ras (véase la Fig. 21C), lo que sugiere que PHOR-1 tiene una capacidad transformante significativa.

Fig. 21C. Se analizó la capacidad de formar colonias en agar blando de las células NIH-3T3 que expresan de forma estable PHOR-1 (Fig. 21B). Se utilizaron como control positivo células NIH-3T3 que expresan de forma estable un Ras activado. El experimento se realizó por duplicado. El ensayo se evaluó 4 semanas tras la siembra de las células.

Fig. 22. Secuencia de nucleótidos (Id. de Sec. Nº6) y de aminoácidos deducidos (Id. de Sec. Nº7) del ORF de AI138218, un miembro de la familia PHOR-1.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un nuevo receptor acoplado a proteína G específico de próstata sobreexpresado en el cáncer de próstata, denominado PHOR-1. PHOR-1 parece expresarse exclusivamente en la próstata, y está marcadamente sobreexpresado en los tumores de próstata. La expresión de PHOR-1 en parejas de muestras de próstata normal/tumoral de pacientes con cáncer de próstata avanzado, utilizando tanto métodos de detección de mRNA como de proteína, muestra un alto grado de sobreexpresión en el tejido tumoral, lo que sugiere que PHOR-1 es un marcador útil para la detección del cáncer de próstata. Además, la expresión de PHOR-1 induce el crecimiento de colonias, la fosforilación de tirosina y la modulación del cAMP de un modo indicativo de un papel funcional en la tumorogénesis y transformación, lo que proporciona una diana estratégica para la terapia del cáncer.

La proteína PHOR-1 es homóloga de una gran familia de receptores olfativos que se expresan en el epitelio y neuronas olfativas. La naturaleza de su orientación en la superficie celular y el acoplamiento a proteína G de este receptor permite una serie de aproximaciones terapéuticas utilizando moléculas cuya diana es PHOR-1 y su función. Estas aproximaciones terapéuticas incluyen la terapia de anticuerpos con anticuerpos anti-PHOR-1, terapias con moléculas pequeñas y terapias con vacunas. Además, dada su sobreexpresión en el cáncer de próstata, PHOR-1 es útil como marcador diagnóstico, de estadio y/o pronóstico para el cáncer de próstata y, de forma similar, puede servir como marcador para otros cánceres que expresan este receptor.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos de la materia, notaciones y otra terminología científica utilizada aquí pretende tener el significado que comúnmente entiende un experto en la materia en la que esta invención se engloba. En algunos casos, los términos con un significado que comúnmente se entiende se definen aquí para mayor claridad y/o como rápida referencia, y la inclusión de tales definiciones aquí no necesariamente debe constituir una diferencia sustancial frente a lo que generalmente se entiende en la materia. Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados aquí son bien conocidas en general y son comúnmente utilizadas por los expertos en la materia utilizando metodología convencional, como, por ejemplo, las metodologías de clonaje molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican la utilización de equipos y reactivos disponibles comercialmente se realizan generalmente de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a no ser que se indique de otro modo.

Como se utilizan aquí, los términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula de la próstata, y pretenden incluir enfermedad en estadío C según el sistema de la American Urological Association (AUA), enfermedad en estadío C1 C2 según el sistema Whitmore-Jewett, y enfermedad en estadío T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, la cirugía no está recomendada para los pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen evoluciones sustancialmente menos favorables comparado con los pacientes con cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado a un órgano). La enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente mediante la evidencia palpable de induración tras el borde lateral de la próstata, o de asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patológicamente tras una prostatectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende al margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.

Como se utilizan aquí, los términos "cáncer de próstata metastático" y "enfermedad metastática" significan cánceres de próstata que se han extendido a nódulos linfáticos regionales o a puntos distantes, y pretenden incluir la enfermedad en estadío D según el sistema de la AUA y en estadío TxNxM+ según el sistema TNM. Como en el caso del cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía generalmente no está indicada para los pacientes con enfermedad metastática, y la terapia hormonal (ablación de andrógenos) es la modalidad de tratamiento preferible. Los pacientes con cáncer de próstata metastático finalmente desarrollan un estado refractario a los andrógenos entre 12 y 18 meses tras la iniciación del tratamiento, y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren dentro de los 6 meses siguientes. El punto más frecuente de metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis en hueso del cáncer de próstata son, en balance, característicamente osteoblásticas en lugar de osteolíticas (es decir, resultan en una formación neta de hueso). Las metástasis en hueso se encuentran más frecuentemente en la columna vertebral, seguido del fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros puntos comunes de metástasis incluyen los nódulos linfáticos, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastático normalmente se diagnostica mediante una linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, escaneo con radionúcleos de cuerpo completo, radiografía esquelética y/o biopsia de una lesión ósea.

Como se utiliza aquí, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, o una forma modificada de cada tipo de nucleótido, y pretende incluir formas de DNA de cadena sencilla y doble.

Como se utiliza aquí, el término "polipéptido" significa un polímero de al menos 10 aminoácidos. A lo largo de la especificación, se utilizan las designaciones estándar de tres letras o de una letra para los aminoácidos.

Como se utiliza aquí, los términos "hibridar", "hibridación", "hibrida" y similares, utilizados en el contexto de polinucleótidos, pretenden significar las condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente como la hibridación en formamida 50%/6X SSC/SDS 0,1%/ssDNA 100 \mug/ml, en las que las temperaturas de hibridación están por encima de 37ºC y las temperaturas de lavado en 0,1X SSC/SDS 0,1% están por encima de 55ºC, y más preferiblemente a condiciones de hibridación astringentes.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación puede determinarla fácilmente un experto en la materia, y generalmente es un calculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, las sondas de mayor longitud requieren temperaturas superiores para una hibridación adecuada, mientras las sondas de menor longitud necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del DNA desnaturalizado de rehibridar cuando están presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia a la que se hibrida, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas mayores tenderán a generar unas condiciones de reacción más astringentes, mientras temperaturas menores lo serán menos. Para más detalles y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones astringentes" o "condiciones de elevada astringencia", como se define aquí, pueden identificarse con aquellas que: (1) utilizan una baja fuerza iónica y elevada temperatura de lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecilsulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), 50 mM fosfato sódico (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS 0,1% y 10% dextransulfato a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de lavado de alta astringencia que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente astringentes" pueden identificarse como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, dextransulfato al 10%, y 20 mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado mecánicamente, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a alrededor de 37-50ºC. El experto en la materia sabrá como modificar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para ajustarse a factores como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se utiliza para expresar el porcentaje de residuos aminoacídicos que son los mismos en las mismas posiciones relativas. También en este contexto, el término "homología" se utiliza para expresar el porcentaje de residuos aminoacídicos que son idénticos o similares en las mismas posiciones relativas, utilizando los criterios de los aminoácidos conservados del análisis de BLAST, como generalmente se entiende en la materia. Por ejemplo, pueden generarse valores de % de identidad mediante WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996), http://blast.wustl/edu/blast/README.html). A continuación se proporcionan más detalles respecto a las sustituciones de aminoácidos que se consideran conservativas bajo tales criterios.

A lo largo de las siguientes subsecciones se proporcionan definiciones adicionales.

Polinucleótidos PHOR-1

Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos que corresponden o son complementarios de la totalidad o una parte de un gen, mRNA y/o secuencia codificante de PHOR-1, preferiblemente en forma aislada, lo que incluye polinucleótidos que codifican una proteína PHOR-1 y fragmentos de las mismas, DNA, RNA, híbridos DNA/RNA, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a una secuencia génica o de mRNA de PHOR-1 o una parte de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con un gen o mRNA de PHOR-1, o con un polinucleótido que codifica PHOR-1 (en conjunto "polinucleótidos PHOR-1"). Como se utiliza aquí, gen y proteína PHOR-1 pretende incluir los genes y proteínas PHOR-1 que se describen específicamente aquí, y los genes y proteínas que corresponden a otras proteínas PHOR-1 y variantes estructuralmente similares a las anteriores. Estas otras proteínas PHOR-1 y sus variantes generalmente tendrán secuencias codificantes que son altamente homólogas a la secuencia codificante de PHOR-1, y preferiblemente compartirán al menos alrededor de un 50% de aminoácidos idénticos y al menos alrededor de un 60% de aminoácidos homólogos (utilizando los criterios de BLAST), más preferiblemente tendrán una homología del 70% o superior (utilizando los criterios de BLAST).

Una realización de polinucleótido PHOR-1 es un polinucleótido PHOR-1 con la secuencia que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº1). Un polinucleótido PHOR-1 puede comprender un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de PHOR-1 humano como el que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº1), en el que T también pude ser U; un polinucleótido que codifica la totalidad o una parte de la proteína PHOR-1; una secuencia complementaria a la anterior; o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de los anteriores. Otra realización comprende un polinucleótido con la secuencia como la que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº1), del residuo nucleotídico número 133 hasta el residuo nucleotídico número 1083, o del residuo nucleotídico número 388 hasta el residuo nucleotídico número 1062, en la que T también puede ser U. Otra realización comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido PHOR-1 cuya secuencia está codificada por el cDNA que contiene el plásmido p101P3A11, depositado en la American Type Culture Collection el 2 de julio de 1999, con el Nº de registro PTA-312. Otra realización comprende un polinucleótido que es capaz de hibridar bajo condiciones de hibridación astringentes al cDNA de PHOR-1 humano que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº1) o a un fragmento de polinucleótidos del mismo.

Las realizaciones típicas de la invención aquí descritas incluyen los polinucleótidos PHOR-1 que codifican porciones específicas de la secuencia de mRNA de PHOR-1, como las que codifican la proteína y los fragmentos de la misma. Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención aquí descritas incluyen: polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 a alrededor del aminoácido 10 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 20 a alrededor del aminoácido 30 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 30 a alrededor del aminoácido 40 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 40 a alrededor del aminoácido 50 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 50 a alrededor del aminoácido 60 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 60 a alrededor del aminoácidos 70 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácidos 70 a alrededor del aminoácido 80 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 80 a alrededor del aminoácido 90 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2) y polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 90 a alrededor del aminoácido 100 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), etc. Siguiendo ese esquema, los polinucleótidos (de al menos 10 aminoácidos) que codifican porciones de la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 100-317 de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2) son realizaciones típicas de la invención. También se contemplan polinucleótidos que codifican porciones mayores de la proteína PHOR-1. Por ejemplo los polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40, etc.) a alrededor del aminoácido 20, (o 30 o 40 o 50, etc.) de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2) pueden generarse mediante una serie de técnicas bien conocidas en la materia.

Otras realizaciones ilustrativas de la invención aquí descritas incluyen los fragmentos de polinucleótido PHOR-1 que codifican uno o más de los motivos biológicos que contiene la secuencia de la proteína PHOR-1. En una realización, los fragmentos de polinucleótido típicos de la invención pueden codificar una o más de las regiones de PHOR-1 que presentan homología con HPRAJ70 o RA1c, como se muestra en la Fig. 2. En otra realización de la invención, los fragmentos de polinucleótido típicos pueden codificar una o más de las secuencias características de GPCR o secuencias características de un receptor olfativo. En otra realización de la invención, los fragmentos de polinucleótido típicos pueden codificar secuencias que son exclusivas de una o más variantes de corte y empalme alternativo de PHOR-1. En otra realización de la invención, los fragmentos de polinucleótido típicos pueden incluir una porción de la secuencia de nucleótidos que se muestra en el Id. de Sec. Nº1, por ejemplo, del residuo nucleotídico número 388 hasta el residuo nucleotídico número 1062, del residuo nucleotídico número 159 hasta el residuo nucleotídico número 733, del residuo nucleotídico número 854 hasta el residuo nucleotídico número 3136, o del residuo nucleotídico número 133 hasta el residuo nucleotídico número 1083.

Los polinucleótidos de los anteriores párrafos tienen una serie de usos específicos diferentes. Como se ha detectado que PHOR-1 se sobreexpresa en cáncer de próstata y en otros cánceres, estos polinucleótidos pueden utilizarse en métodos de evaluación del estado de los productos génicos de PHOR-1 en tejidos normales frente a cancerosos. Normalmente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína PHOR-1 pueden utilizarse para evaluar la presencia de alteraciones (como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en regiones específicas (como las regiones que contienen un dominio transmembrana) de los Productos génicos de PHOR-1. Ejemplos de ensayo incluyen tanto ensayos de RT-PCR como análisis de polimorfismos de conformación de la cadena sencilla (SSCP) (véase por ejemplo Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378 (1999), en ambos se utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones en la proteína. También están disponibles ensayos y métodos para analizar secuencias y detectar polimorfismos de un único nucleótido (Irizarry, et al., 2000, Nature Genetics 26(2):223-236.

Otras realizaciones de la invención aquí descritas y que se contemplan específicamente son los DNA genómicos, cDNA, ribozimas y moléculas antisentido, lo que incluye las moléculas antisentido morfolino, así como las moléculas de ácido nucleico basadas en un armazón alternativo o que incluye bases alternativas, tanto si se deriva de fuentes naturales o sintéticas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser RNA u otras moléculas, lo que incluye los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas diferentes de los ácidos nucleicos como los derivados fosforotioato, que se unen específicamente a DNA o RNA de forma dependiente de par de bases. Un experto puede obtener fácilmente estos tipos de moléculas de ácido nucleico utilizando los polinucleótidos y secuencias de polinucleótido de PHOR-1 descritas aquí.

La tecnología antisentido implica la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana que se localiza dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, PHOR-1. Véase por ejemplo, Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de PHOR-1 de la presente invención incluyen derivados como los S-oligonucleótidos (derivados fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, anteriormente), que muestran una mayor acción inhibitoria del crecimiento de las células cancerosas. Los S-oligos (nucleósidos fosforotioato) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el que un átomo de oxígeno no enlazante del grupo fosfato está reemplazado por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden prepararse mediante un tratamiento de los correspondientes O-oligos con 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase Iyer, R. P. et al, J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990), estas descripciones se incorporan en su totalidad como referencia aquí. Los oligonucleótidos antisentido de PHOR-1 de la presente invención incluyen adicionalmente los oligonucleótidos antisentido morfolino conocidos en la materia (véase por ejemplo Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic acid Drug Development 6:169-175).

Los oligonucleótidos antisentido de PHOR-1 de la presente invención normalmente pueden ser RNA o DNA que es complementario y que hibrida de forma estable con los primeros 100 codones en N-terminal o los últimos 100 codones en C-terminal, o se solapan con el punto de inicio ATG, del genoma de PHOR-1 o del correspondiente mRNA. Aunque no es necesaria una complementariedad absoluta, es preferible un alto grado de complementariedad. La utilización de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva al mRNA de PHOR-1 y no a mRNA específicos de otras subunidades reguladoras de las quinasas de proteína. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido de PHOR-1 de la presente invención son fragmentos entre 15 y 30-meros de la molécula de DNA antisentido, con una secuencia que hibrida con el mRNA de PHOR-1. Opcionalmente, un oligonucleótido antisentido de PHOR-1 es un oligonucleótido 30-mero que es complementario de una región en los 10 codones iniciales en N-terminal y los 10 codones finales en C-terminal de PHOR-1. Alternativamente, las moléculas antisentido se modifican para utilizar ribozimas en la inhibición de la expresión de PHOR-1. L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

Otras realizaciones específicas de este aspecto de la invención incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que hibridar selectivamente o específicamente con las moléculas de ácido nucleico de la invención o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden estar marcadas con un marcador detectable, como por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminiscente, quelante de metales o enzima. Tales sondas y cebadores pueden utilizarse para detectar la presencia de un polinucleótido PHOR-1 en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína PHOR-1.

Ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden la totalidad o una parte de la secuencia del cDNA de PHOR-1 humano, que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº1). Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente los mRNA de PHOR-1 también se describen en los Ejemplos que siguen. Como entenderá un experto en la materia, pueden prepararse una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes en base a las secuencias que aquí se proporcionan y utilizarse de forma efectiva para amplificar y/o detectar un mRNA de PHOR-1.

Como se utiliza aquí, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando se ha separado sustancialmente de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios de genes diferentes del gen PHOR-1 o que codifican polipéptidos diferentes del producto génico de PHOR-1 o los fragmentos del mismo. Un experto puede utilizar fácilmente los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de PHOR-1 aislado.

Los polinucleótidos de PHOR-1 de la invención son útiles para una serie de propósitos, lo que incluye pero no se limita a su utilización como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del (de los) gen(es), mRNA o fragmentos de los mismos de PHOR-1; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de próstata y otros cánceres; como herramientas para la identificación de moléculas que inhiben específicamente la entrada de calcio en las células de la próstata; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos PHOR-1; como herramientas para modular o inhibir la expresión del (de los) gen(es) PHOR-1 y/o traducción del (de los) transcrito(s) de PHOR-1 y como agentes terapéuticos.

Características moleculares y bioquímicas de PHOR-1

Como se describe en detalle en los Ejemplos a continuación, el gen y la proteína PHOR-1 se han caracterizado de varias formas. Por ejemplo, se han realizado análisis de la codificación de los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos para identificar los elementos estructurales conservados de la secuencia de PHOR-1, las características topológicas, modificaciones post-traduccionales y las moléculas potencialmente relacionadas. Se han realizado análisis de RT-PCR, hibridación in situ y northern blot de la expresión del mRNA de PHOR-1 para establecer el rango de expresión de los diferentes mensajeros de PHOR-1 en los tejidos normales y cancerosos. Se han realizado análisis de Western blot y selección de células activada por fluorescencia (FACS) de la expresión de la proteína PHOR-1 en células transfectadas de forma experimental para determinar la localización en la superficie celular. PHOR-1 tiene un pI de 8,7 y un peso molecular calculado de 35,2 kD.

PHOR-1 es un receptor específico de próstata acoplado a proteína G (GPCR) expresado en niveles elevados en los tumores de próstata avanzados y localizados. La secuencia de la proteína PHOR-1 revela 7 dominios transmembrana potenciales y tiene homología con los GPCR involucrados en el olfato (Raming et al., 1993, Nature 361:353; Malnic et al., 1999, Cell 96:713). Un receptor olfativo de rata que se expresa en el cerebro, conocido como RA1c (Raming et al., 1998, Receptor Channels 6:141), tiene una secuencia con el mayor grado de homología con PHOR-1. PHOR-1 es idéntica a RA1c en un 59,9% en un solapamiento de 299 residuos. El homólogo humano más probable de RA1c, HPRAJ70, también muestra un grado similar de homología con PHOR-1 (idéntico en un 59,4% a HPRAJ70 a lo largo de un solapamiento de 298 residuos). Se ha descrito que la proteína HPRAJ70 es un GPCR específico de próstata (Patente estadounidense Nº 5756309, solicitud PCT WO 96/39435). Los alineamientos de las secuencias de aminoácidos de PHOR-1, HPRAJ70 y RA1c se proporcionan en la Fig. 1B.

La homología de PHOR-1 con los receptores cerebrales olfativos conducen a su denominación como homólogo del receptor olfativo en próstata-1 (del inglés "prostate homologue of Olfactory Receptor-1", PHOR-1). Las proteínas que son miembros de esta familia de receptores muestran un extremo aminoterminal extracelular, tres bucles extracelulares adicionales, tres bucles intracelulares y un extremo carboxiterminal intracelular. La segunda región extracelular de PHOR-1 muestra un punto potencial de N-glucosilación en el residuo 90 (NSTT), lo que sugiere que la proteína puede estar glucosilada. Los GPCR son receptores con siete regiones transmembrana que son estimulados por hormonas polipeptídicas o moléculas pequeñas. Sus señales se transmiten a través de proteínas triméricas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) hasta enzimas efectoras o canales iónicos (Simon et al., 1991, Science 252:802).

Recientemente, también se ha demostrado que los GPCR enlazan con las vías de señalización mitogénica de las quinasas de tirosina (Luttrell et al., 1999, Science 283:655; Luttrell et al., 1999 Curr Opin Cell Biol 11:177). Los GPCR están regulados mediante la fosforilación mediada por las quinasas de GPCR (o GRK), que son activadas de forma indirecta por los GPCR (Pitcher et al., 1998, Ann. Rev. Biochem. 67:653). Los GPCR olfativos transmiten sus señales mediante la activación de la vía del cAMP a través de la ciclasa de adenilato y la vía de la fosfolipasa C al generar inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) (Breer, 1993, Ciba Found Symp 179:97; Bruch, 1996, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 113:451). La generación de cAMP conduce a la activación de la quinasa de proteínas A. El IP3 resulta en un aumento del calcio intracelular, mientras el DAG activa la quinasa de proteínas C.

Como se discute en más detalle en los Ejemplos a continuación, PHOR-1 muestra características funcionales de un GPCR, como se pone en evidencia por el comportamiento de las células transfectadas con un vector que expresa PHOR-1. La expresión de PHOR-1 induce la fosforilación de tirosina de un proteína de 55 kDa y la defosforilación de una proteína de 130 kDa, y también induce la fosforilación de Erk, una quinasa de proteínas activada por mitógenos. La expresión de PHOR-1 modula la concentración de cAMP citoplasmático, como se pone en evidencia por la acumulación de cAMP en las células que expresan PHOR-1 en respuesta al suero fetal bovino (FBS). Además, la expresión de PHOR-1 estimula el crecimiento de colonias en agar blando.

La expresión de PHOR-1 es esencialmente específica de próstata en tejidos humanos adultos normales (Fig. 5-7), con un nivel de expresión muy bajo detectable mediante RT-PCR en ovario normal así como un nivel de expresión muy bajo detectable mediante dot blot con RNA en tejido de corazón. En el cáncer de próstata, PHOR-1 se expresa en xenoinjertos tumorales que se han desarrollado en ratones SCID, así como en muestras tumorales biopsiadas de pacientes con cáncer de próstata avanzado (Fig. 5-7). Las comparativas de la expresión de PHOR-1 en grupos de pares de tejido tumoral frente a los tejidos normales adyacentes tomados de pacientes de cáncer de próstata avanzado y pacientes con cáncer de riñón, útero, cérvix, estómago y recto, mostraron un elevado nivel de sobreexpresión en la gran mayoría de pacientes (Fig. 8-10), lo que indica un alto grado de sobreexpresión en tejidos tumorales.

Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican PHOR-1

Las secuencias de cDNA de PHOR-1 descritas aquí permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican productos génicos de PHOR-1, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto génico de PHOR-1, isoformas de corte y empalme alternativo, variantes alélicas y formas mutantes del producto génico de PHOR-1. Se conocen varios métodos de clonaje molecular que puede utilizarse para aislar los cDNA completos que codifican un gen PHOR-1 (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Ed., Wiley and Sons, 995). Por ejemplo, las metodologías de clonaje en fago lambda pueden utilizarse convenientemente, usando sistemas de clonaje comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express de Stratagene). Los clones fágicos que contienen los cDNA del gen PHOR-1 pueden identificarse hibridándose con cDNA o un fragmento del mismo marcado con PHOR-1. Por ejemplo, en una realización, el cDNA de PHOR-1 (Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº1) o puede sintetizarse una porción del mismo y utilizarse como sonda para detectar cDNA que se solapan y cDNA completos que corresponden a un gen PHOR-1. El gen PHOR-1 puede aislarse mediante el cribado de bibliotecas de DNA genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levaduras (YAC) y similares, con sondas o cebadores del DNA de PHOR-1.

Moléculas de DNA recombinante y sistemas de huésped-vector

La invención también proporciona moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido PHOR-1, lo que incluye pero no se limita a fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YAC, BAC, así como varios vectores virales y no virales bien conocidos en la materia, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas de DNA o RNA recombinantes. Como se utiliza aquí, una molécula de DNA o RNA recombinante es una molécula de DNA o RNA que se ha sometido a manipulación molecular in vitro. Los métodos para generar tales moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, anteriormente).

La invención además proporciona un sistema de huésped-vector que comprende una molécula de DNA recombinante que contiene un polinucleótido PHOR-1 en una célula procariota o eucariota huésped adecuada. Ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por un baculovirus, como la célula Sf9). Ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen varias líneas celulares de cáncer de próstata como LNCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, otras líneas celulares transfectables o transducibles de cáncer de próstata, así como una serie de células de mamífero que se utilizan de forma rutinaria para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más concretamente, puede utilizarse un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de PHOR-1 para generar proteínas PHOR-1 o fragmentos de las mismas utilizando cualquier número de los sistemas de huésped-vector que se utilizan de forma rutinaria y ampliamente conocidos en la materia.

Se encuentran disponibles un amplio rango de sistemas de huésped-vector adecuados para la expresión de las proteínas PHOR-1 o de los fragmentos de las mismas, véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, anteriormente; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, anteriormente). Los vectores preferibles para la expresión en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando estos vectores de expresión, PHOR-1 puede expresarse preferiblemente en varias líneas celulares de cáncer de próstata y diferentes de próstata, lo que incluye por ejemplo las líneas 293, 293T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas huésped-vector de la invención son útiles para la producción de una proteína PHOR-1 o un fragmento de la misma. Tales sistemas huésped-vector pueden utilizarse para estudiar las propiedades funcionales de PHOR-1 y de mutaciones en PHOR-1.

Las proteínas codificadas por los genes PHOR-1, o por los fragmentos de las mismas, tendrán una variedad de usos, que incluyen pero no se limitan a la generación de anticuerpos y métodos para la identificación de ligandos, de otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico de PHOR-1. Los anticuerpos obtenidos frente a la proteína PHOR-1 o fragmentos de la misma pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico, metodologías de imagen (lo que incluye, en particular, imagen del cáncer) y métodos terapéuticos en la gestión de los cánceres humanos caracterizados por la expresión de una proteína PHOR-1, lo que incluye pero no se limita al cáncer de próstata. Se contemplan varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas PHOR-1, lo que incluye pero no se limita a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Tales anticuerpos pueden estar marcados y utilizarse como reactivos inmunológicos para la imagen capaces de detectar las células de próstata (por ejemplo, en métodos de imagen radiográficos de centelleo). Las proteínas PHOR-1 también pueden ser particularmente útiles en la generación de vacunas contra el cáncer, como se describe en detalle a continuación.

Proteínas PHOR-1

Otro aspecto de la presente invención proporciona las proteínas PHOR-1 y los fragmentos polipeptídicos de las mismas. Las proteínas PHOR-1 de la invención incluyen las que se identifican aquí específicamente, así como las variantes alélicas, variantes con sustitución conservativa y homólogos, siempre que tales variantes y homólogos puedan aislarse/generarse y caracterizarse sin una experimentación indebida siguiendo los métodos que se destacan a continuación. También se incluyen las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas PHOR-1 o fragmentos de las mismas, así como las proteínas de fusión de una proteína PHOR-1 y un polipéptido heterólogo. Tales proteínas PHOR-1 se denominarán de forma colectiva proteínas PHOR-1, proteínas de la invención o PHOR-1. Como se utiliza aquí, el término "polipéptidos PHOR-1" se refiere a un fragmento polipeptídico o una proteína PHOR-1 de al menos 10 aminoácidos, preferiblemente al menos 15 aminoácidos.

Una realización específica de una proteína PHOR-1 comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos del PHOR-1 humano como la que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), desde el residuo aminoacídico número 1 hasta alrededor del residuo aminoacídico número 317, como se muestra. Otra realización específica de una proteína PHOR-1 comprende un polipéptido con la secuencia de aminoácidos del PHOR-1 humano como la que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), desde el residuo aminoacídico número 86 hasta alrededor del residuo aminoacídico número 310, como se muestra. Una realización específica de un fragmento de PHOR-1 comprende un péptido seleccionado de entre el grupo que comprende los aminoácidos 1-14 de la secuencia de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (MVDPNGNESSATYF; Id. de Sec. Nº8), los aminoácidos 262-274 de la secuencia de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1A-D (VHRFSKRRDSPLP; Id. de Sec. Nº9), y las porciones extracelulares de PHOR-1 (aminoácidos 1-28, 86-99, 159-202 y 262-272 del Id. de Sec. Nº2). Otras realizaciones específicas incluyen uno o ambos dominios transmembrana identificados en la Fig. 1A-D (Id. de Sec.
Nº2).

En general, las variantes alélicas que aparecen de forma natural del PHOR-1 humano compartirán un elevado grado de identidad estructural y homología (por ejemplo, un 90% o más de identidad). Normalmente, las variantes alélicas de las proteínas PHOR-1 contendrán sustituciones conservativas de aminoácidos en las secuencias de PHOR-1 descritas aquí o contendrán una sustitución con un aminoácido de la posición correspondiente en un homólogo de PHOR-1. Una clase de variantes alélicas de PHOR-1 son las proteínas que comparten un elevado grado de homología con al menos una pequeña región de una secuencia de aminoácidos particular de PHOR-1, pero que además contienen partes radicalmente diferentes de la secuencia, como sustituciones no conservativas, truncación, inserción o cambio de marco de lectura.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos frecuentemente pueden realizarse en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Tales cambios incluyen la sustitución de cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquiera de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservativas, dependiendo del ambiente particular de los aminoácidos y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y alanina (A) frecuentemente pueden ser intercambiables, así como la alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, frecuentemente puede intercambiarse por leucina y isoleucina, y en ocasiones con valina. La lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente intercambiables en posiciones en las que la característica significativa del residuo aminoacídico es su carga y los diferentes pK de estos dos residuos aminoacídicos no son significativos. Otros cambios pueden considerarse "conservativos" en ambientes particulares.

Las proteínas PHOR-1, lo que incluye las variantes, comprenden al menos un epítopo en común con una proteína PHOR-1 con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), de forma que un anticuerpo que se une específicamente a una proteína PHOR-1 o una variante también se unirá específicamente a la proteína PHOR-1 con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2). Una clase de variantes de la proteína PHOR-1 comparte un 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2). Una clase más específica de variantes de la proteína PHOR-1 comprende un dominio extracelular como el que se identifica en la Fig. 4. Las variantes preferibles de la proteína PHOR-1 son capaces de mostrar una o más de las funciones de los GPCR descritas aquí, lo que incluye, por ejemplo, la capacidad de modular la concentración de cAMP citosólico y la fosforilación de tirosinas, y la capacidad de estimular el crecimiento de colonias.

Las proteínas PHOR-1 pueden realizarse de muchas formas, preferiblemente en forma aislada. Como se utiliza aquí, se dice que una proteína está "aislada" cuando se utilizan métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar la proteína PHOR-1 de los constituyentes celulares que normalmente están asociados con la proteína. Un experto puede utilizar fácilmente los métodos de purificación estándar para obtener una proteína PHOR-1 aislada. Una molécula de proteína PHOR-1 purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que impiden la unión de PHOR-1 a un anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso previsto. Las realizaciones de una proteína PHOR-1 incluyen una proteína PHOR-1 purificada y una proteína PHOR-1 funcional soluble. En una forma, tales proteínas PHOR-1 funcionales solubles o los fragmentos de las mismas retienen la capacidad de unirse a un anticuerpo u otro ligando.

La invención también proporciona polipéptidos PHOR-1 que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de PHOR-1, como un polipéptido que corresponde en parte a las secuencias de aminoácidos de PHOR-1 que se muestran en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2). Tales polipéptidos de la invención muestran propiedades de la proteína PHOR-1, como la capacidad de facilitar la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con la proteína PHOR-1.

Las realizaciones de la invención aquí descritas incluyen una amplia diversidad de variantes aceptadas en la materia de las proteínas PHOR-1, como los polipéptidos con inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de PHOR-1 pueden obtenerse utilizando métodos conocidos en la materia como la mutagénesis dirigida, escaneo de alaninas y mutagénesis mediante PCR. Puede realizarse una mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis en cassette [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis por selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas en el DNA clonado para producir el DNA variante de PHOR-1. También puede utilizarse el análisis de escaneo de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferibles están los aminoácidos relativamente pequeños neutrales. Tales aminoácidos incluyen la alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina normalmente es el aminoácido de escaneo preferible entre este grupo ya que elimina la cadena lateral tras el carbono beta y es menos probable alterar la conformación de la cadena principal de la variante. Normalmente, la alanina es también preferible porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones ocultas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no resulta en cantidades adecuadas de la variante pueden utilizarse aminoácidos isoestéricos.

Como se ha discutido anteriormente, las realizaciones de la invención que se reivindica incluyen polipéptidos que contienen una secuencia de la proteína PHOR-1 menor a la de 317 aminoácidos que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2). Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención aquí descrita incluyen polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 30 hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor del aminoácido 80 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2) y polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 100 de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), etc. Siguiendo este esquema, los polipéptidos que consisten en porciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína PHOR-1, de los aminoácidos 100-317, son realizaciones típicas de la invención. Los polipéptidos que consisten en porciones mayores de la proteína PHOR-1 también se contemplan. Por ejemplo, los polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 1 (o 20, o 30, o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20, (o 30, o 40, o 50, etc.) de la proteína PHOR-1 que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2) pueden generarse mediante una serie de técnicas bien conocidas en la materia.

Otras realizaciones ilustrativas de la invención aquí descrita incluyen los polipéptidos PHOR-1 que contienen los residuos aminoacídicos de uno o más de los motivos biológicos que contiene la secuencia polipeptídica de PHOR-1, como la que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2). En una realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener una o más de las regiones de PHOR-1 que presentan homología con HPRAJ70 y/o RA1c. En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de N-glucosilación de PHOR-1, como NESS (Id. de Sec. Nº10) en los residuos 7-10 (numeración desde el primer residuo aminoacídico que se muestra en el Id. de Sec. Nº2), NLTI (Id. de Sec. Nº11) en los residuos 44-47 y/o NSTT en los residuos 90-93 (Id. de Sec. Nº12). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de fosforilación de cAMP de PHOR-1, como RRDS en los residuos 268-271 (Id. de Sec. Nº13). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de fosforilación de la quinasa C de la proteína PHOR-1, como SKR en los residuos 266-268. En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de fosforilación de la quinasa de caseína II de PHOR-1, como SLHE en los residuos 56-59 (Id. de Sec. Nº14), SGID en los residuos 69-72 (Id. de Sec. Nº15) y/o SGME en los residuos 110-113 (Id. de Sec. Nº16). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de N-miristoilación, como GNESSA en los residuos 6-11 (Id. de Sec. Nº17), GLEEAQ en los residuos 21-26 (Id. de Sec. Nº18), GMESTV en los residuos 111-116 (Id. de Sec. Nº19) y/o GTCVSH en los residuos 240-245 (Id. de Sec. Nº20). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de las secuencias características de los GPCR, como los residuos aminoacídicos 112-128 del Id. de Sec. Nº2, y/o uno o más de las secuencias características de los receptores olfativos, como los residuos aminoacídicos 61-82 y/o 239-254 del Id. de Sec. Nº2. Las realizaciones relacionadas con esta invención incluyen los polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos que se han discutido anteriormente, siendo las realizaciones preferibles las que no contienen inserciones, deleciones o sustituciones en los motivos o las secuencias intermedias de estos polipéptidos.

Los polipéptidos PHOR-1 pueden generarse utilizando la tecnología de síntesis de péptidos estándar o utilizando métodos de escisión química bien conocidos en la materia y basados en las secuencias de aminoácido de las proteínas PHOR-1 humanas descritas aquí. Alternativamente, pueden utilizarse métodos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento de polipéptido de una proteína PHOR-1. Respecto a esto, las moléculas de ácido nucleico que codifican PHOR-1 descritas aquí proporcionan un medio para la generación de fragmentos definidos de las proteínas PHOR-1. Los polipéptidos PHOR-1 son particularmente útiles en la generación y caracterización de anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína PHOR-1), en la identificación de agentes o factores celulares que se unen a PHOR-1 o a un dominio estructural particular del mismo, y en diferentes contextos terapéuticos, lo que incluye pero no se limita a las vacunas contra el cáncer. Los polipéptidos PHOR-1 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando varias técnicas analíticas bien conocidas en la materia, lo que incluye, por ejemplo, los métodos de análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o en base a la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos anti-PHOR-1 específicos de subunidad o en la identificación de factores celulares que se unen a PHOR-1.

En una realización específica descrita en los ejemplos a continuación, una forma secretada de PHOR-1 puede expresarse convenientemente en células 293T transfectadas con un vector de expresión dirigida por CMV que codifica PHOR-1 con una cola de 6 X His y MYC en el extremo C-terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen). El PHOR-1 con cola de HIS secretado al medio de cultivo puede purificarse utilizando una columna de níquel y técnicas estándar. Alternativamente, puede utilizarse un sistema de cola de AP. En los ejemplos a continuación se describen varias construcciones para la expresión de PHOR-1.

Las modificaciones de PHOR-1, como las modificaciones covalentes, se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos aminoacídicos diana de un polipéptido PHOR-1 con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos del extremo N- o C-terminal de PHOR-1. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PHOR-1 incluida en el alcance de esta invención comprende la alteración del patrón de glucosilación nativa del polipéptido. La "alteración del patrón de glucosilación nativa" pretende significar para los propósitos aquí descritos, la deleción de una o más porciones carbohidrato que se encuentran en la secuencia nativa de PHOR-1 (eliminando el punto de glucosilación subyacente o delecionando la glucosilación mediante métodos químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más puntos de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de PHOR-1. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de las diferentes porciones de carbohidrato presentes. Otro tipo de modificación covalente de PHOR-1 comprende la unión del polipéptido PHOR-1 a uno de entre una serie de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, del modo en el que indica en las patentes estadounidenses Nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 o 4.179.337.

El PHOR-1 de la presente invención también puede modificarse de forma que se obtenga una molécula quimérica que comprenda PHOR-1 fusionado a otra secuencia de aminoácidos o polipéptido heterólogo. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión de PHOR-1 con una cola de un epítopo de poli-histidina, lo que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente níquel inmovilizado. La cola con el epítopo generalmente se localiza en el extremo amino- o carboxiterminal de PHOR-1. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de PHOR-1 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para obtener una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), tal fusión puede hacerse a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen la substitución de una forma soluble (con el dominio transmembrana delecionado o inactivado) de un polipéptido PHOR-1 con al menos una región variable de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferible, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase también la patente estadounidense Nº 5.428.130 registrada el 27 de junio de 1995.

Anticuerpos PHOR-1

Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a las proteínas y polipéptidos PHOR-1. Los anticuerpos más preferibles se unirán de forma selectiva a la proteína PHOR-1 y no se unirán (o lo harán débilmente) a las proteínas y polipéptidos diferentes de PHOR-1. Los anticuerpos anti-PHOR-1 que se contemplan particularmente incluyen los anticuerpos monoclonales y policlonales, así como los fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o uno o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Como se utiliza aquí, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a la diana, es decir, la región de unión al antígeno.

Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionan específicamente con una proteína PHOR-1 particular y/o un epítopo en un dominio estructural particular. Por ejemplo, los anticuerpos preferibles útiles para la terapia del cáncer y para propósitos de diagnóstico por imagen son los reaccionan con un epítopo en una región extracelular de la proteína PHOR-1 como se expresa en la células cancerosa. Tales anticuerpos pueden generarse utilizando como inmunogéno las proteínas PHOR-1 descritas aquí, o utilizando péptidos predecibles derivados de dominios extracelulares de las mismas. Respecto a esto, y en referencia a la secuencia de la proteína PHOR-1 que se muestra en la Fig. 1, pueden seleccionarse las regiones de la secuencia aminoterminales al dominio transmembrana y utilizarse para diseñar inmunógenos adecuados y reactivos de cribado para obtener y seleccionar anticuerpos específicos de PHOR-1 extracelular.

Los anticuerpos PHOR-1 de la invención pueden ser particularmente útiles en las estrategias terapéuticas contra el cáncer de próstata, ensayos diagnósticos y pronósticos, y metodologías de imagen. De forma similar, tales anticuerpos pueden ser útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de otros cánceres, ya que PHOR-1 también se expresa o sobreexpresa en otros tipos de cáncer. La invención proporciona varios ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de PHOR-1, y proteínas y polipéptidos mutantes de PHOR-1. Tales ensayos generalmente comprenden uno o más anticuerpos PHOR-1 capaces de reconocer y unirse a PHOR-1 o una proteína mutante PHOR-1, según sea adecuado, y puede realizarse utilizando varios formatos de ensayo inmunológico bien conocido en la materia, lo que incluye pero no se limita a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes acoplados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes acoplados a enzima (ELIFA) y similares. Además, la invención también proporciona métodos de imagen inmunológicos capaces de detectar el cáncer de próstata, lo que incluye pero no se limita a los métodos de imagen de radiografía de centelleo utilizando anticuerpos PHOR-1 marcados. Tales ensayos pueden utilizarse clínicamente en la detección, monitorización y pronóstico del cáncer de próstata, en particular cáncer de próstata avanzado.

Los anticuerpos PHOR-1 también pueden utilizarse en métodos para purificar PHOR-1, y proteínas y polipéptidos mutantes PHOR-1, y para aislar homólogos de PHOR-1 y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en una realización, el método para purificar una proteína PHOR-1 comprende la incubación de un anticuerpo PHOR-1, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene PHOR-1 bajo condiciones que permiten que el anticuerpo PHOR-1 se una a PHOR-1; el lavado de la matriz sólida para eliminar impurezas; y la elución de PHOR-1 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos PHOR-1 de la invención incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que mimetizan la proteína PHOR-1.

Los anticuerpos PHOR-1 también pueden utilizarse terapéuticamente, por ejemplo, modulando o inhibiendo la actividad biológica de una proteína PHOR-1 o uniéndose y destruyendo las células cancerosas que expresan la proteína PHOR-1. La terapia de anticuerpos del cáncer de próstata y otros cánceres se describe más específicamente en una subsección separada a continuación.

Varios métodos para la obtención de anticuerpos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando huéspedes mamíferos adecuados utilizando una proteína, péptido o fragmento de PHOR-1, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Ed., Harlow and Carril (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Ejemplos de inmunogénos proteicos incluyen un PHOR-1 recombinante (expresado en un sistema de baculovirus, sistema de mamíferos, etc.), dominio extracelular de PHOR-1, PHOR-1 con una cola de AP, etc. Además, las proteínas de fusión de PHOR-1 también pueden utilizarse como una fusión de PHOR-1 con GST, proteína de unión a maltosa (MBP), proteína verde fluorescente (GFP), HisMax-TOPO o MycHis (véanse los Ejemplos a continuación).

En una realización particular, puede obtenerse una proteína de fusión GST que comprende la totalidad o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del marco abierto de lectura de las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2) y utilizarse como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. Las células que expresan o sobreexpresan PHOR-1 también pueden utilizarse para las inmunizaciones. De forma similar, puede utilizarse cualquier célula diseñada para expresar PHOR-1. Tales estrategias pueden resultar en la producción de anticuerpos monoclonales con la capacidad de reconocer el PHOR-1 endógeno. Otro inmunógeno útil comprende péptidos PHOR-1 unidos a la membrana plasmática de glóbulos rojos de sangre de oveja.

La secuencia de aminoácidos de PHOR-1, como la que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº2), puede utilizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína PHOR-1 para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de PHOR-1 puede utilizarse para identificar las regiones hidrofílicas en la estructura de PHOR-1. Las regiones de la proteína PHOR-1 que muestran una estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente utilizando otros métodos conocidos en la materia, como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los péptidos de PHOR-1 que se prevé pueden unirse a HLA-A2 pueden seleccionarse para la generación de anticuerpos. Como se discute en los ejemplos a continuación, se ha demostrado la inmunogenicidad de los aminoácidos 1-14 (MVDPNGNESSATYF; Id. de Sec. Nº8), aminoácidos 262-274 (VHRFSKRRDSPLP; Id. de Sec. Nº9) y aminoácidos 86-310 de la secuencia de proteínas de PHOR-1 (Id. de Sec. Nº2), que se utilizaron para generar anticuerpos policlonales y monoclonales utilizando conejos y ratones, respectivamente. Esta respuesta de las células B (producción de anticuerpos) es el resultado de una respuesta inicial de las células T originada por las porciones inmunogénicas de PHOR-1.

Los métodos para la obtención de una proteína o polipéptido para su utilización como inmunógeno y para la preparación de conjugados inmunogénicos de una proteína con un transportador como BSA, KLH u otras proteínas transportadoras son bien conocidos en la materia. En algunas circunstancias, puede utilizarse la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otras ocasiones pueden ser efectivos reactivos de unión como los que suministra Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de PHOR-1 se realiza generalmente mediante inyección a lo largo de un periodo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, como generalmente se entiende en la materia. Durante el programa de inmunización, puede medirse el título de anticuerpos para determinar la adecuada formación del anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales PHOR-1 son preferibles y pueden producirse mediante varios métodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden prepararse utilizando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein, o modificaciones que inmortalizan células B productoras, como se conoce generalmente. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban mediante un inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína PHOR-1 o un fragmento de PHOR-1. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que secreta el anticuerpo deseado, las células pueden expandirse y los anticuerpos producirse a partir de cultivos in vitro o de fluido de ascites.

Los anticuerpos o fragmentos también pueden producirse utilizando la tecnología actual mediante métodos recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína PHOR-1 también pueden producirse en el contexto de anticuerpos quiméricos o con injertos de CDR con origen en varias especies. También pueden producirse anticuerpos PHOR-1 humanizados o humanos y son preferibles para su utilización en contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos sustituyendo uno o más de los CDR del anticuerpo no humano por las correspondientes secuencias de un anticuerpo human son bien conocidos (véase por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536). Véase también, Carter et al., 1993, Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151:2296. Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales humanos completos incluyen las tecnologías de presentación en fagos y los animales transgénicos (para una revisión, véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16:535-539).

Los anticuerpos monoclonales humanos completos PHOR-1 pueden generarse utilizando tecnologías de clonaje que usan grandes bibliotecas combinatoriales de los genes de las Ig humanas (es decir, presentación en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications en Man. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, págs. 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Idem, págs. 65-82). Los anticuerpos monoclonales humanos completos PHOR-1 también pueden producirse utilizando ratones transgénicos diseñados para que contengan los locus de los genes de las inmunoglobulinas humanas como se describe en la solicitud de patente PCT W098/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4):607-614). Este método evita la manipulación in vitro necesaria con la tecnología de presentación en fagos y produce de forma eficiente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.

La reactividad de los anticuerpos PHOR-1 con una proteína PHOR-1 puede establecerse mediante una serie de métodos bien conocidos, lo que incluye los análisis de western blot, inmunoprecipitación, ELISA y FACS utilizando, según sea apropiado, las proteínas y péptidos PHOR-1, células que expresan PHOR-1 o extractos de las mismas.

Un anticuerpo PHOR-1 o fragmento del mismo de la invención puede estar marcado con un marcador detectable o conjugado con una segunda molécula, como una citotoxina u otros agentes terapéuticos, y utilizarse para situar la segunda molécula en una célula positiva para PHOR-1 (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita, Jr., V.T. et al., Ed., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4ª Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636). Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen pero no se limitan a ricina, cadena A de la ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracinodiona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas A (PE), PE40, abrina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de saponaria officinalis, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos como ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re. Los marcadores detectables adecuados incluyen pero no se limitan a un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Los anticuerpos también pueden conjugarse a una enzima activadora de un profármaco anticanceroso, capaz de convertir el profármaco en su forma activa. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense Nº 4.975.287.

Además, los anticuerpos específicos biespecíficos de dos o más epítopos PHOR-1 pueden generarse utilizando métodos generalmente conocidos en la materia. Además, pueden modificarse las funciones efectoras del anticuerpo para potenciar el efecto terapéutico de los anticuerpos PHOR-1 sobre las células cancerosas. Por ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de puentes disulfuro entre cadenas y la generación de homodímeros que pueden tener una mejor capacidad de internalización, ADCC y/o muerte celular mediada por complemento (véase por ejemplo, Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922). Los anticuerpos homodiméricos también pueden generarse mediante técnicas de entrecruzamiento conocidas en la materia (por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565).

Animales transgénicos PHOR-1

Los ácidos nucleicos que codifican PHOR-1 o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar los animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos de uso terapéutico. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal con células que contienen un transgén, que se ha introducido en el animal o un ancestro del animal en un estado prenatal, por ejemplo, embrionario. Un transgén es un DNA que se ha integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el cDNA que codifica PHOR-1 puede utilizarse para clonar el DNA genómico que codifica PHOR-1 de acuerdo con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas pueden utilizarse para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el DNA que codifica PHOR-1.

Los métodos para generar animales transgénicos, en particular animales como ratones o ratas, se ha convertido en convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidense Nº 4.736.866 y 4.870.009. Normalmente, células concretas serán elegidas para la incorporación del transgén de PHOR-1 con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica PHOR-1 introducido en la línea germinal del animal en un estadío embrionario pueden utilizarse para examinar el efecto de un aumento de la expresión del DNA que codifica PHOR-1. Tales animales pueden utilizarse como animales de prueba para los reactivos ideados para conferir protección de, por ejemplo, estados patológicos asociados con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y la aparición de una incidencia reducida del estado patológico, comparado con los animales no tratados que poseen el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica en el estado patológico.

Alternativamente, los homólogos no humanos de PHOR-1 pueden utilizarse para obtener un animal "knock out" de PHOR-1, que tiene un gen que codifica PHOR-1 defectivo o alterado como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica PHOR-1 y un DNA genómico alterado que codifica PHOR-1 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica PHOR-1 puede utilizarse para clonar el DNA genómico que codifica PHOR-1 de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica PHOR-1 puede delecionarse o reemplazarse por otro gen, como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para monitorizar la integración.

Normalmente, se incluyen varias kilobases de DNA flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como 3') en el vector (véase por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503 para una descripción de los vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y las células en las que el DNA introducido se ha recombinado de forma homóloga con el DNA endógeno se seleccionan (véase por ejemplo, Li et al., 1992, Cell 69:915). Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Ed., IRL, Oxford, 1987, págs. 113-152).

Un embrión quimérico puede implantarse entonces en un animal receptor hembra pseudoembarazada adecuada y el embrión se lleva a término para obtener el animal "knock out". La progenie que posee el DNA recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para la cría de animales en los que todas las células del animal contienen el DNA recombinado de forma homóloga. Los animales "knock out" pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente a ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido PHOR-1.

Métodos para la detección de PHOR-1

Otro aspecto de la presente invención está relacionado con los métodos para detectar polinucleótidos de PHOR-1, proteínas PHOR 1 y variantes de las mismas, así como métodos para identificar una célula que expresa PHOR-1. El patrón de expresión de PHOR-1 altamente restringido en tejidos sugiere que esta molécula puede servir como marcador diagnóstico para la enfermedad con metástasis. En este contexto, el estado de los productos génicos de PHOR-1 puede proporcionar información útil para predecir una serie de factores lo que incluye susceptibilidad a estadíos avanzados de la enfermedad, tasa de progresión, y/o agresividad del tumor. Tal como se discute en detalle más adelante, el estado de los productos génicos de PHOR-1 en muestras de pacientes pueden analizarse mediante una serie de protocolos que son bien conocidos en la materia lo que incluye análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de northern blot lo que incluye hibridación in situ, análisis por RT-PCR (por ejemplo en muestras microdiseccionadas por captura por láser), análisis western blot y análisis de microchips de tejidos.

Más en particular, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de PHOR-1 en una muestra biológica, como tejido de próstata, tejido de riñón, tejido uterino, muestra cervical, tejido de estómago, tejido rectal, tejido óseo, tejido linfático y otros tejidos, orina, semen, sangre o suero, preparaciones celulares, y similares. Los polinucleótidos de PHOR-1 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de PHOR-1 o los fragmentos del mismo, mRNA de PHOR-1, variante de corte y empalme alternativo de los mRNA de PHOR-1, y moléculas de DNA o RNA recombinante que contienen un polinucleótido de PHOR-1. Son bien conocidos en la materia los métodos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de PHOR-1 y pueden emplearse en la práctica de este aspecto de la invención.

En una realización, un método para detectar un mRNA de PHOR-1 en una muestra biológica comprende la producción de cDNA a partir de la muestra mediante transcripción reversa utilizando al menos un cebador; la amplificación del cDNA así producido utilizando polinucleótidos de PHOR-1 como cebadores directos y reversos para amplificar el cDNA de PHOR-1; y la detección de la presencia del cDNA de PHOR-1 amplificado. De forma opcional, puede determinarse la secuencia del cDNA de PHOR-1 amplificado. En otra realización, un método para detectar un gen de PHOR-1 en una muestra biológica comprende primero aislar el DNA genómico de la muestra; amplificar el DNA genómico aislado utilizando polinucleótidos de PHOR-1 como cebadores directos y reversos para amplificar el gen de PHOR-1; y detectar la presencia del gen PHOR-1 amplificado. Cualquier número de combinaciones de sondas directas y reversas adecuadas puede diseñarse a partir de las secuencias de nucleótidos proporcionadas para PHOR-1 (Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº 1) y utilizarlas para este propósito.

La invención también proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína de PHOR-1 en un tejido de otra muestra biológica como suero, hueso, próstata, y otros tejidos, orina, preparaciones celulares, y similares, así como ensayos citológicos para la detección de células que expresan PHOR-1. Los métodos para detectar una proteína PHOR-1 son también conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis western blot, ensayos de unión molecular y celular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, en una realización, un método para detectar la presencia de una proteína PHOR-1 en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo PHOR-1, un fragmento reactivo de PHOR-1 del mismo, o una proteína recombinante que contenga una región de unión a antígeno de un anticuerpo de PHOR-1; y después detectar la unión de la proteína de PHOR-1 en la muestra.

También se proporcionan los métodos para identificar una célula que expresa PHOR-1. En una realización, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de PHOR-1 comprende detectar la presencia de mRNA de PHOR-1 en la célula. Los métodos para la detección de mRNA concretos en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación utilizando sondas de DNA complementarias (como hibridación in situ utilizando ribosondas marcadas de PHOR-1, northern blot y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos de PHOR-1, y otro tipo de métodos de detección de amplificación, como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de PHOR-1 comprende la detección de la presencia de proteína PHOR-1 en la célula o secretada por la célula. Varios métodos para la detección de proteínas son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para la detección de proteínas PHOR-1 y células que expresan PHOR-1.

El análisis de la expresión de PHOR-1 puede también ser útil como una herramienta para identificar y evaluar los agentes que modulan la expresión génica de PHOR-1. Por ejemplo, la expresión de PHOR-1 está restringida a próstata normal, así como los cánceres de próstata, riñón, útero, cérvix, estómago y recto, y PHOR-1 puede también expresarse en otro tipo de cáncer. La identificación de una molécula o agente biológico que puede inhibir la expresión de PHOR-1 o la sobreexpresión en células cancerígenas puede tener un valor terapéutico. Dicho agente puede identificarse utilizando un cribaje que cuantifique la expresión de PHOR-1 mediante RT-PCR, hibridación de ácidos nucleicos o unión de anticuerpos.

Monitorización del estado de PHOR-1 y sus productos

Los ensayos que evalúan el estado del gen PHOR-1 y los productos génicos de PHOR-1 en un individuo pueden proporcionar información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica de este individuo. Por ejemplo, ya que el mRNA de PHOR-1 está altamente expresado en el cáncer de próstata, riñón, útero, cérvix, estómago y recto, y no en la mayoría de tejido normal, pueden utilizarse los ensayos que evalúan los niveles relativos de transcritos de mRNA de PHOR-1 o proteínas de PHOR-1 en una muestra biológica para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de PHOR-1, como el cáncer, y pueden proporcionar información pronóstica útil para definir opciones terapéuticas adecuadas. De forma similar, los ensayos que evalúan la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PHOR-1 en una muestra biológica, pueden también utilizarse en este contexto.

El descubrimiento de que el mRNA de PHOR-1 está tan altamente expresado en el cáncer de próstata, y no en la mayoría de tejidos normales, proporciona evidencias de que este gen está asociado con crecimiento celular desregulado y por lo tanto identifica este gen y sus productos como dianas que puede utilizar el experto en la materia para evaluar las muestras biológicas de individuos sospechosos de padecer una enfermedad asociada con la desregulación de PHOR-1. En otro ejemplo, debido a que la expresión de PHOR-1 está normalmente restringida a la próstata, también se pueden evaluar muestras biológicas cogidas de otros tejidos para detectar la expresión de PHOR-1 como indicador de metástasis. En este contexto, la evaluación del estado de expresión del gen PHOR-1 y sus productos, puede utilizarse para obtener información sobre el potencial de enfermedad de una muestra de tejido. El término "estado de expresión" en este contexto se utiliza para referirse ampliamente a la variedad de factores involucrados en la expresión, función y regulación de un gen y sus productos, como el nivel de expresión de mRNA, la integridad de los productos génicos expresados (como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos) y las modificaciones transcripcionales y traduccionales a estas moléculas.

El estado de expresión de PHOR-1 puede proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad a un estadío particular de la enfermedad, progresión, y/o agresividad del tumor. La invención proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de expresión de PHOR-1 y diagnosticar cánceres que expresan PHOR-1, como cáncer de próstata, mama, vejiga, pulmón, hueso, colon, páncreas, testículos, cérvix y ovarios. El estado de expresión de PHOR-1 en muestras de pacientes puede analizarse mediante una serie de métodos bien conocidos en la materia, lo que incluye sin limitarse, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis RT-PCR en muestras microdiseccionadas por captura por láser, análisis western blot de muestras clínicas y líneas celulares, y análisis de microchip de tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de expresión del gen PHOR-1 y los productos génicos puede encontrarse, por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 [Northern Blot], 4 [Southern Blot], 15 [Inmunoblot] y 18 [análisis por PCR], Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para monitorizar los productos génicos de PHOR-1 determinando el estado de los productos génicos de PHOR-1 expresados por las células en una muestra de tejido de prueba de un individuo sospechoso de padecer una enfermedad asociada con crecimiento celular desregulado (como hiperplasia o cáncer) y después comparar el estado así determinado con el estado de los productos génicos de PHOR-1 en la correspondiente muestra normal, la presencia de productos génicos de PHOR-1 aberrantes en la muestra prueba en relación con la muestra normal proporciona un indicio de la presencia de crecimiento celular desregulado en las células del individuo.

En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende la detección de un aumento significativo en el mRNA de PHOR-1 o expresión de la proteína en una célula prueba o muestra de tejido en relación con los niveles de expresión de la correspondiente célula normal o tejido. La presencia de mRNA de PHOR-1 puede, por ejemplo, evaluarse en muestras de tejido lo que incluye pero no se limita a cáncer de colon, pulmón, próstata, páncreas, vejiga, mama, ovario, cérvix, testículos, cabeza y cuello, cerebro, estómago, huesos, etc. La presencia de expresión de PHOR-1 significativa en cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de estos cánceres o una metástasis del cáncer originado en otro tejido, ya que los correspondientes tejidos normales no expresan el mRNA de PHOR-1 o lo hacen en niveles bajos.

En una realización relacionada, el estado de la expresión de PHOR-1 puede determinarse a nivel de proteína en lugar de a nivel del ácido nucleico. Por ejemplo, dicho método o ensayo comprenderá la determinación del nivel de proteína PHOR-1 expresada por las células en una muestra de tejido de prueba y comparar el nivel así determinado con el nivel de PHOR-1 expresado en la correspondiente muestra normal. En una realización, se evalúa la presencia de proteína PHOR-1, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos PHOR-1 o las parejas de unión capaces de detectar la expresión de proteína PHOR-1 pueden utilizarse en una serie de formatos de ensayo bien conocidos en la materia para este propósito.

En otras realizaciones relacionadas, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PHOR-1 en una muestra biológica para poder identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dichas realizaciones son útiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo de crecimiento desregulado (véase por ejemplo, Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)). En este contexto, una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los productos génicos de PHOR-1 pueden observarse por los protocolos de northern, Southern, western, PCR y secuenciación de DNA discutidos aquí. Además, otros métodos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos como análisis del polimorfismo de conformación de cadena sencilla son bien conocidos en la materia (véase por ejemplo Patentes Estadounidenses Nº 5.382.510 y 5.952.170).

En otra realización, se puede examinar el estado de metilación del gen PHOR-1 en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de las islas CpG en las regiones reguladoras en 5' del gen, suceden de forma frecuente en células inmortalizadas y transformadas y pueden resultar en la expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa de la clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no en >90% de carcinomas de próstata) aparece silenciada permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada más frecuentemente en los carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de grado alto (PIN) (Brooks et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536).

En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero sí se expresa en el 25-50% de los cánceres de próstata) está inducida por la desoxiazacitidina en las células linfoblastoides, lo que sugiere que la expresión tumoral se debe a la desmetilación (Lethe et al., 1998, Int. J. Cancer 76(6): 903-908). En este contexto, una serie de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas de restricción sensibles a la metilación en aproximaciones de hibridación Southern que no pueden cortar secuencias que contienen sitios CpG metilados para poder evaluar el estado general de metilación de las islas CpG.

Además, la MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todas los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen determinado. Este procedimiento implica la modificación inicial del DNA mediante bisulfito sódico (que convertirá todas las citosinas no metiladas a uracilo) seguido de la amplificación utilizando cebadores específicos para el DNA metilado frente al no metilado. Los protocolos que implican interferencia en la metilación pueden también encontrarse por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995.

En otra realización relacionada, la invención proporciona ensayos útiles en la determinación de la presencia de cáncer en un individuo, que comprende la detección de un cambio significativo en las variantes de corte y empalme alternativas de PHOR-1 expresado en una célula de prueba o tejido muestra en relación con los niveles de expresión en las correspondientes células normales o tejido. La monitorización de las variantes de corte y empalme alternativas de PHOR-1 es útil ya que los cambios en el corte y empalme alternativo de proteínas se sugiere como uno de los pasos en una serie de eventos que conducen a la progresión del cáncer (véase por ejemplo, Carstens et al., Oncogene 15(250: 3059-3065 (1997)).

La amplificación génica proporciona un método adicional para evaluar el estado de PHOR-1. La amplificación génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante Southern blot convencional, northern blot para cuantificar la transcripción de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blot (análisis de DNA), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente, en base a las secuencias proporcionadas aquí. Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, lo que incluye dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, por lo que tras la formación del dúplex en una superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

Además de los tejidos descritos anteriormente, puede investigarse convenientemente la presencia de células cancerígenas en sangre periférica, lo que incluye pero no se limita a cáncer de próstata, utilizando RT-PCR para detectar la expresión de PHOR-1. La presencia de mRNA de PHOR-1 amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos por detección de RT-PCR para células tumorales en sangre periférica se están evaluando actualmente para utilizarse en el diagnóstico y manejo de una serie de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los ensayos de RT-PCR son bien conocidos en la materia.

Un aspecto relacionado de la invención está dirigido hacia la predicción de la susceptibilidad de un individuo para desarrollar cáncer. En una realización, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende la detección de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 en una muestra de tejido, su presencia indica susceptibilidad al cáncer, en el que el grado de expresión del mRNA de PHOR-1 presente es proporcional al grado de susceptibilidad. En una realización específica, se examinó la presencia de PHOR-1 en tejido de próstata, con la presencia de PHOR-1 en la muestra proporcionando una indicación de susceptibilidad al cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor de próstata). En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PHOR-1 en una muestra biológica para poder identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, la presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos de PHOR-1 en la muestra proporciona un indicio de susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor).

Otro aspecto relacionado de la invención está dirigido hacia métodos para valorar la agresividad del tumor. En una realización, un método para valorar la agresividad del tumor comprende determinar el nivel de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 expresada en las células de una muestra del tumor, en comparación con el nivel así determinado con el nivel de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 expresada en el correspondiente tejido normal tomado del mismo individuo o muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de expresión de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 en la muestra de tumor en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En una realización específica, se evalúa la agresividad de los tumores de próstata determinando la extensión en la que PHOR-1 se expresa en las células tumorales, cuanto mayor es el nivel de expresión indica mayor agresividad del tumor. En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PHOR-1 en una muestra biológica para poder identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, la presencia de una o más perturbaciones es indicio de tumores más agresivos.

Otro aspecto relacionado de la invención está dirigido hacia métodos para observar la progresión de un tumor en un individuo a lo largo del tiempo. En una realización, los métodos para observar la progresión de un tumor en un individuo a lo largo del tiempo comprende determinar el nivel de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 expresada en las células de una muestra del tumor, en comparación con el nivel así determinado con el nivel de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 expresada en la muestra de tejido equivalente tomado del mismo individuo en otro momento, en el que el grado de expresión de mRNA de PHOR-1 o proteína PHOR-1 en la muestra de tumor a lo largo del tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En una realización específica, se evalúa la progresión de un cáncer mediante la determinación de la extensión en que la expresión de PHOR-1 en las células tumorales se altera durante el tiempo, cuanto mayor es el nivel de expresión indica mayor progresión del cáncer. En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PHOR-1 en una muestra biológica para poder identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, la presencia de una o más perturbaciones es indicio de progresión del cáncer.

Las aproximaciones diagnósticas anteriores pueden combinarse con cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y de diagnóstico conocidos en la materia. Por ejemplo, otra realización de la invención descrita aquí está dirigida a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PHOR-1 y los productos génicos de PHOR-1 (o perturbaciones en el gen de PHOR-1 y productos génicos de PHOR-1) y un factor que está asociado con el tumor maligno como forma de diagnóstico y para pronosticar el estado de una muestra de tejido. En este contexto, puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados con el cáncer como la expresión de genes asociados con el cáncer (lo que incluye expresión de PSA, PSCA y PSM) así como observaciones citológicas evidentes (véase por ejemplo Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Eptsein, 1995, Hum. Pathol. 1995 Feb; 26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PHOR-1 y los productos génicos de PHOR-1 (o perturbaciones en el gen de PHOR-1 y productos génicos de PHOR-1) y un factor adicional que está asociado con el tumor es útil, por ejemplo, porque la presencia de un grupo o constelación de factores específicos que coinciden, proporcionan información crucial para el diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido.

En una realización típica, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PHOR-1 y los productos génicos de PHOR-1 (o perturbaciones en el gen de PHOR-1 y productos génicos de PHOR-1) y un factor que está asociado con la malignidad implica la detección de la sobreexpresión de mRNA de PHOR-1 o proteína en una muestra de tejido, la detección de la sobreexpresión de mRNA de PSA o proteína en una muestra de tejido, y observar una coincidencia de la sobreexpresión de mRNA de PHOR-1 o proteína y mRNA de PSA o proteína. En una realización específica, se examina la expresión de mRNA de PHOR-1 y PSA en tejido de próstata. En una realización preferida, la coincidencia de la sobreexpresión de mRNA de PHOR-1 y mRNA de PSA en la muestra proporciona una indicación de cáncer de próstata, susceptibilidad al cáncer de próstata o la emergencia o existencia de un tumor de próstata.

Los métodos para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de PHOR-1 o proteína se describen aquí y el uso de tecnologías estándar de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas son bien conocidos en la materia. Los métodos estándar de detección y cuantificación de mRNA de PHOR-1 incluyen hibridación in situ utilizando ribosondas marcadas de PHOR-1, northern blot y tecnologías relacionadas utilizando sondas de polinucleótido de PHOR-1, análisis RT-PCR utilizando cebadores específicos de PHOR-1, y otros métodos de detección de tipo amplificación, como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, se puede utilizar la RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de PHOR-1 como se describe en los Ejemplos que siguen más adelante. Cualquier número de cebadores capaces de amplificar PHOR-1 pueden utilizarse para este propósito, lo que incluye pero no se limita a los diferentes grupos de cebadores especifíficamente descritos aquí. Los métodos estándar de detección y cuantificación de proteínas pueden utilizarse para este propósito. En una realización específica, pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína PHOR-1 de tipo salvaje en un ensayo inmunohistoquímico de tejido biopsiado.

Identificación de moléculas que interactuan con PHOR-1

Las secuencias de proteína PHOR-1 descritas aquí permiten al experto en la materia identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interaccionan con PHOR-1 y las rutas activadas por PHOR-1 mediante cualquiera de los protocolos aceptados en la materia. Por ejemplo puede utilizarse uno de los sistemas denominados sistemas de trampa de interacción (también referido como "ensayo de dos híbridos"). En tales sistemas, las moléculas que interaccionan reconstituyen un factor de transcripción y dirigen la expresión de un gen marcador, cuya expresión se investiga entonces. Los sistemas típicos para identificar las interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariota se describen por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nº 5.955.280, 5.925.523, 5.846.722 y 6.004.746.

Alternativamente se pueden identificar moléculas que interaccionan con secuencias de proteína de PHOR-1 mediante el cribaje de bibliotecas de péptidos. En dichos métodos, los péptidos que se unen a moléculas receptoras seleccionadas, como PHOR-1, se identifican mediante el cribaje de bibliotecas que codifican una colección de aminoácidos aleatoria o controlada. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de la cubierta de bacteriófagos, y las partículas de bacteriófagos se criban entonces frente a los receptores de interés. Los péptidos que poseen una amplia variedad de usos, como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, pueden identificarse de esta manera sin una información previa de la estructura del ligando esperado o molécula receptora. Las bibliotecas de péptidos típicas y métodos de cribado que se pueden utilizar para identificar moléculas que interaccionan con secuencias de proteína de PHOR-1 se describen por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nº 5.723.286 y 5.733.731. Ejemplos de ensayos para identificar moléculas que interaccionan con o alteran la función de un GPCR se describen en Moon et al., 1999, PNAS 96(25):14605-14610; Breer et al., 1998, Ann. N. Y. Acad. Sci. 855:175-181; y Sinnett-Smith et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(39):30644-30652.

Alternativamente, las líneas celulares que expresan PHOR-1 pueden utilizarse para identificar las interacciones proteína-proteína mediadas por PHOR-1. Esta posibilidad puede examinarse utilizando técnicas de inmunoprecipitación como se muestra por otros (Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). Normalmente la proteína PHOR-1 puede inmunoprecipitarse a partir de líneas celulares de cáncer de próstata que expresan PHOR-1 utilizando anticuerpos anti-PHOR-1. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos frente a la cola de His en una línea celular diseñada para expresar PHOR-1 (vectores mencionados anteriormente). El complejo imnmunoprecipitado puede analizarse por la asociación de proteínas mediante procedimientos como western blot, marcaje de proteínas en la metionina 355, microsecuenciación de proteínas, tinción de plata y electroforesis bidimensional en gel.

Las moléculas pequeñas que interaccionan con PHOR-1 pueden identificarse a través de realizaciones relacionadas con los ensayos de cribado. Por ejemplo, las moléculas pequeñas pueden identificarse si interfieren con la función de GPCR, lo que incluye moléculas que interfieren con la capacidad de PHOR-1 de mediar la fosforilación y de-fosforilación, señalización de segundo mensajero y tumorogénesis. Los métodos típicos se discuten por ejemplo en la Patente Estadounidense Nº 5.928.868 e incluye métodos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización ilustrativa, el ligando híbrido se introduce en células que a su vez contienen un primer y un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye DNA para expresar una proteína híbrida que codifica una proteína diana unida a una secuencia codificante para un módulo transcripcional. Las células además contienen un gen marcador, cuya expresión está condicionada a la proximidad de la primera y segunda proteínas híbridas entre ellas, un evento que ocurre sólo si el ligando híbrido se une a los sitios diana de ambas proteínas híbridas. Aquellas células que expresan el gen marcador se seleccionan y se identifica la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida desconocida.

Una realización típica de esta invención consiste en un método de cribaje de una molécula que interacciona con una secuencia de aminoácidos de PHOR-1 mostrada en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), que comprende los pasos de poner en contacto una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de PHOR-1, permitiendo a la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de PHOR-1 interaccionar bajo condiciones que facilitan una interacción, determinar la presencia de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de PHOR-1 y después separar las moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de PHOR-1 de las moléculas que interaccionan con la secuencia de aminoácidos de PHOR-1. En una realización específica, el método incluye además purificar una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de PHOR-1. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de PHOR-1 se pone en contacto con una biblioteca de péptidos.

Métodos terapéuticos y composiciones

La identificación de PHOR-1 como una proteína de cáncer de próstata, abre un abanico de aproximaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata. Tal como se discutió anteriormente, PHOR-1 es un receptor acoplado a proteína G (GPCR), y su expresión induce el crecimiento de colonias y modula el cAMP y la fosforilación de tirosina. Además, PHOR-1 presenta epítopos en la superficie celular que pueden ser dianas para terapia.

El perfil de expresión de PHOR-1 recuerda al de MAGE, PSA y PMSA, que son genes específicos de tejido que están sobreexpresados en melanomas y otros tipos de cáncer (Van den Eynde y Boon, Int J Clin Lab Res. 27:81-86, 1997). Debido a su expresión específica de tejido y los niveles de expresión altos en cáncer, estas moléculas están siendo investigadas en la actualidad como dianas para vacunas contra el cáncer (Durrant, Anticancer Drugs 8:727-733, 1997; Reynolds et al., Int J Cancer 72:972-976, 1997). El patrón de expresión de PHOR-1 proporciona la evidencia de que es además una diana ideal para una aproximación a una vacuna contra el cáncer para el cáncer de próstata, ya que su expresión no se detecta en la mayoría de tejidos normales. Sus características estructurales como GPCR también proporcionan evidencias de que PHOR-1 puede ser una diana de molécula pequeña, así como una diana para estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Las estrategias terapéuticas pueden diseñarse para inhibir la función GPCR de la molécula o para dirigirse hacia la molécula de PHOR-1 en sí.

De acuerdo con esto, las aproximaciones terapéuticas dirigidas contra las porciones extracelulares de PHOR-1, o que pretenden inhibir la actividad de la proteína PHOR-1, se espera que sean útiles para pacientes que padecen de cáncer de próstata y otros cánceres que expresan PHOR-1. Las aproximaciones terapéuticas que pretenden inhibir la actividad de la proteína PHOR-1 generalmente son de dos clases. Una clase comprende diferentes métodos para inhibir la unión o asociación de la proteína PHOR-1 con su pareja de unión o con otras proteínas. Otra clase comprende una serie de métodos para inhibir la transcripción del gen PHOR-1 o traducción del mRNA de PHOR-1.

PHOR-1 como diana de superficie celular para terapias basadas en anticuerpos

La expresión en la superficie celular de PHOR-1 indica que esta molécula es una diana atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Debido a que PHOR-1 se expresa en células cancerígenas y no en la mayoría de células normales, se espera que la administración sistémica de composiciones inmunoreactivas a PHOR-1 presenten excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, inespecíficos y/o no dirigidos provocados por la unión de la molécula inmunoterapéutica a los órganos y tejidos a los que no se dirige. Los anticuerpos específicamente reactivos con los dominios extracelulares de PHOR-1 pueden ser útiles para tratar cánceres que expresan PHOR-1 de forma sistémica, tanto conjugados con una toxina o con un agente terapéutico, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función celular.

Los anticuerpos anti-PHOR-1 pueden introducirse en un paciente para que el anticuerpo se una a PHOR-1 en las células cancerígenas y mediar así la destrucción de las células y el tumor y/o inhibir el crecimiento de las células o el tumor. Los mecanismos mediante los que los anticuerpos ejercen su efecto terapéutico puede incluir la citólisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, modulación de la función fisiológica de PHOR-1, inhibición de la unión a ligando o rutas de transducción de señales, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y/o mediante la inducción de apoptosis. Los anticuerpos frente a PHOR-1 pueden conjugarse a agentes terapéuticos o tóxicos y utilizarse para liberar el agente terapéutico o tóxico directamente en las células tumorales portadoras de PHOR-1. Ejemplos de agentes tóxicos incluyen, pero no se limita a, calchemicina, maitansinoides, radioisótopos como ^{131}I, itrio, y bismuto.

La inmunoterapia del cáncer que utiliza anticuerpos anti-PHOR-1 puede seguir las instrucciones generadas a partir de las diferentes aproximaciones que se han utilizado con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, lo que incluye pero no se limita al cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunas aproximaciones terapéuticas implican la conjugación de anticuerpos desnudos a una toxina, como la conjugación de ^{131}I a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Bexxar, Coulter Pharmaceutical), mientras que otras implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, como HerceptinTM (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para el tratamiento del cáncer de próstata, por ejemplo, puede administrarse anticuerpos anti-PHOR-1 junto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal.

Aunque la terapia con anticuerpo anti-PHOR-1 puede ser útil para todos los estadíos del cáncer, la terapia con anticuerpos será adecuada en particular en el cáncer avanzado o metastásico. El tratamiento con terapia de anticuerpos de la invención puede estar indicada para pacientes que han recibido previamente una o más quimioterapias, mientras que es preferible la combinación de terapia con anticuerpos de la invención con un régimen de radiación o quimioterapia para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, en particular para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad de los agentes quimioterapéuticos.

Será deseable para algunos pacientes de cáncer evaluar la presencia y el nivel de expresión de PHOR-1, preferiblemente utilizando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, análisis cuantitativo por imágenes de PHOR-1, u otras técnicas capaces de indicar de forma fiable la presencia y el grado de expresión de PHOR-1. El análisis inmunohistoquímico de las biopsias de tumor o especímenes quirúrgicos pueden ser preferibles para este propósito. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en la materia.

Los anticuerpos monoclonales anti-PHOR-1 útiles en el tratamiento del cáncer de próstata y otros tipos de cáncer incluyen aquellos que no son capaces de iniciar una respuesta inmune potente frente al tumor y aquellos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. Respecto a esto, los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-PHOR-1 pueden provocar la lisis de células tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o mediada por el complemento, requiriendo ambas una porción intacta de Fc de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con sitios del receptor Fc de células efectoras o proteínas del complemento. Además, los mAb anti-PHOR-1 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento del tumor, son útiles en la práctica de la invención. Los mecanismos potenciales mediante los que tales mAb directamente citotóxicos pueden actuar incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y la inducción de apoptosis. El mecanismo mediante el que un mAb anti-PHOR-1 particular ejerce un efecto anti-tumoral podrá evaluarse utilizando cualquier número de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por el complemento, y similares, como se conoce generalmente en la materia.

El uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros mAb no humanos, o quiméricos humano/ratón puede inducir respuestas inmunes moderadas a fuertes en algunos pacientes. En algunos casos, esto resultará en la eliminación del anticuerpo de la circulación y reducción de la eficacia. En los casos más graves, dicha respuesta inmune puede llevar a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden provocar fallo renal. De acuerdo con esto, los anticuerpos monoclonales preferibles utilizados en la practica de los métodos terapéuticos de la invención son aquellos que son totalmente humanos o humanizados y que se unen específicamente al antígeno diana de PHOR-1 con alta afinidad pero que no presentan antigenicidad o ésta es muy baja en el paciente.

Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAb anti-PHOR-1 únicos así como la combinación, o cócteles de diferentes mAb. Dichos cócteles de mAb pueden presentar ciertas ventajas considerando que contienen mAb dirigidos contra diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente mAb citotóxicos con mAb que confían en la funcionalidad inmunoefectora. Dichos mAb en combinación pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de mAb anti-PHOR-1 puede combinarse con otros agentes terapéuticos, lo que incluye pero no se limita a varios agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos, e inmunomoduladores (por ejemplo, IL-2, GM-CSF). El mAb anti-PHOR-1 puede administrarse en su forma "desnuda" o no conjugada, o puede tener agentes terapéuticos conjugados.

Las formulaciones de anticuerpo anti-PHOR-1 pueden administrarse por medio de cualquier ruta capaz de liberar los anticuerpos al sitio del tumor. Las rutas de administración potencialmente efectivas incluyen, pero no se limitan, a la ruta intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, y similares. El tratamiento involucrará generalmente la administración repetida de la preparación de anticuerpo anti-PHOR-1 por medio de una ruta aceptable de administración como la inyección intravenosa (IV), normalmente a una dosis que está en el rango de alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis de mAb en el rango de alrededor de 10-500 mg por semana serán efectivas y bien toleradas.

Basado en la experiencia clínica con el mAb Herceptina en el tratamiento de cáncer de mama metastásico, una carga de dosis inicial de aproximadamente 4 mg/kg IV seguido de dosis semanales de alrededor de 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-PHOR-1 puede representar un régimen de dosificación aceptable. Preferiblemente, la carga de dosis inicial se administra en una infusión de 90 minutos o mayor. La dosis de mantenimiento periódica puede administrarse como una infusión de 30 minutos o mayor, siempre que la dosis inicial sea bien tolerada. No obstante, un experto en la materia entenderá, que varios factores pueden influir en el régimen de dosis ideal en un caso en particular. Dichos factores puede incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y la vida media del Ab o mAb utilizado, el grado de expresión de PHOR-1 en el paciente, la cantidad de antígeno PHOR-1 secretado circulante, el nivel de concentración del estado de equilibrio deseado del anticuerpo, frecuencia de tratamiento, y la influencia de agentes quimioterapéuticas utilizadas en combinación con el método de tratamiento de la invención.

De forma óptima, se evaluará el nivel en circulación del antígeno PHOR-1 secretado en suero de pacientes, para ayudar en la determinación del régimen de dosis más efectiva y factores relacionados. Dichas evaluaciones pueden también utilizarse con el propósito de monitorizar durante la terapia, y serán útiles para evaluar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (como los niveles en suero de PSA en la terapia del cáncer de próstata).

Inhibición de la función de la proteína PHOR-1

La invención incluye varios métodos y composiciones para inhibir la unión de PHOR-1 a su pareja de unión o ligando, o su asociación con otra(s) proteína(s) así como métodos para inhibir la función de PHOR-1. Las moléculas dirigidas contra el extremo N-terminal de PHOR-1, como el anticuerpo descrito en los ejemplos que siguen a continuación, son en particular atractivos para inhibir la función de la proteína porque probablemente estén dirigidos a un sitio de unión a ligando en PHOR-1.

Inhibición de PHOR-1 con proteínas recombinantes

En una aproximación, se utilizan las moléculas recombinantes que son capaces de unirse a PHOR-1, previniendo de esta manera que PHOR-1 acceda o se una a su(s) pareja(s) de unión o asociarse con otra(s) proteína(s), para inhibir la función de PHOR-1. Dichas moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la(s) parte(s) reactiva(s) de una molécula de anticuerpo específico de PHOR-1. En una realización particular, el dominio de unión a PHOR-1 de una pareja de unión de PHOR-1 puede crearse en una proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión al ligando PHOR-1 unido a la porción Fc de una IgG humana, como la IgG1 humana. Dicha porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden administrarse en su forma soluble a pacientes que padecen de un cáncer asociado con la expresión de PHOR-1, lo que incluye pero no se limita a cáncer de próstata, mama, vejiga, pulmón, huesos, colon, páncreas, testículos, cérvix y ovarios, en los que la proteína de fusión dimérica se une de forma específica a PHOR-1 bloqueando por lo tanto la interacción de PHOR-1 con una pareja de unión. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden combinarse además en proteínas multiméricas utilizando tecnologías de ligación de anticuerpos conocidas.

Inhibición de PHOR-1 con anticuerpos intracelulares

En otra aproximación, los vectores recombinantes que codifican anticuerpos de cadena única que se unen de forma específica a PHOR-1 pueden introducirse en células que expresan PHOR-1 por medio de tecnologías de transferencia de genes, en las que la cadena única codificada del anticuerpo anti-PHOR-1 se expresa intracelularmente, se une a la proteína PHOR-1, e inhibe por lo tanto su función. Los métodos para crear dichas cadenas únicas intracelulares de anticuerpos son bien conocidas. Dichos anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos", pueden dirigirse específicamente hacia un compartimiento particular den-tro de la célula, proporcionando el control sobre la actividad inhibidora en la que se centra el tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado con éxito en la materia (para revisión, véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Los intracuerpos han demostrado eliminar virtualmente la expresión de receptores de superficie que de otra manera serían abundantes. Véase, por ejemplo, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gen Ther. 1: 332-337.

Los anticuerpos de cadena única comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidos por un polipéptido enlazante flexible, y se expresan como un polipéptido único. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena única pueden expresarse como un fragmento de cadena única de la región variable unido a la región constante de la cadena ligera. Las señales de tráfico intracelular bien conocidas, pueden crearse en vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican dichos anticuerpos de cadena única para localizar de forma precisa el intracuerpo expresado en el compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos hacia el retículo endoplasmático (RE), pueden diseñarse para que incorporen un péptido líder y, de forma opcional, una señal de retención en el RE en el extremo C-terminal, como el motivo de aminoácidos KDEL. Los intracuerpos que pretenden ejercer su actividad en el núcleo pueden diseñarse para que incluyan una señal de localización nuclear. Las porciones lipídicas pueden enlazarse a los intracuerpos para anclar el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos pueden también dirigirse para que ejerzan su función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos pueden utilizarse para secuestrar factores del citosol, previniendo por lo tanto que sean transportados a su destino celular natural.

En una realización, los intracuerpos frente a PHOR-1 se diseñan para que se unan de forma específica a un dominio particular de PHOR-1. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos que se unen de forma específica a la proteína PHOR-1 pueden utilizarse para prevenir que las moléculas relacionadas con PHOR-1 tengan acceso al núcleo, previniendo de esta manera que ejerzan cualquier actividad biológica dentro del núcleo.

Para poder dirigir la expresión de dichos intracuerpos de forma específica hacia células tumorales particulares, la transcripción del intracuerpo puede situarse bajo el control regulatorio de un promotor y/o potenciador adecuado específico de tumor. Para poder localizar la expresión del intracuerpo de forma específica en la próstata, por ejemplo, puede utilizarse el promotor de PSA y/o promotor/potenciador (Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense Nº 5.919.652).

Inhibición de la transcripción o traducción de PHOR-1

Dentro de otra clase de aproximaciones terapéuticas, la invención proporciona varios métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen de PHOR-1. De forma similar, la invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir la traducción del mRNA de PHOR-1 en proteína.

En una aproximación, un método para inhibir la transcripción del gen PHOR-1 comprende el contacto del gen PHOR-1 con un polinucleótido antisentido de PHOR-1. En otra aproximación, un método para inhibir la traducción del mRNA de PHOR-1 comprende el contacto del mRNA de PHOR-1 con un polinucleótido antisentido. En otra aproximación, se puede utilizar una ribozima específica de PHOR-1 para romper el mensajero de PHOR-1, inhibiendo de esta manera la traducción. Dichos métodos basados en polinucleótidos antisentido y ribozimas pueden también dirigirse contra las regiones reguladoras del gen PHOR-1, como el promotor de PHOR-1 y/o elementos potenciadores. De forma similar, pueden utilizarse las proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción del gen PHOR-1 para inhibir la transcripción del mRNA de PHOR-1. Los diferentes polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos mencionados anteriormente se han descrito anteriormente. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir la transcripción y traducción es bien conocido en la materia.

Otros factores que inhiben la transcripción de PHOR-1 a través de la interferencia con la activación transcripcional de PHOR-1 pueden también ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan PHOR-1. De forma similar, pueden ser útiles los factores que son capaces de interferir con el procesamiento de PHOR-1 para el tratamiento de cánceres que expresan PHOR-1. Los métodos de tratamiento del cáncer que utilizan dichos factores están también den-tro del alcance de la invención.

Consideraciones generales para las estrategias terapéuticas

Las tecnologías de transferencia génica y terapia génica pueden utilizarse para la liberación de moléculas polinucleótido terapéuticas hacia las células tumorales que sintetizan PHOR-1 (es decir, polinucleótidos antisentido, ribozimas, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de PHOR-1). Se conocen varias aproximaciones en la materia sobre terapia génica. Los vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de PHOR-1, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de PHOR-1, y demás, pueden liberarse en las células tumorales utilizando dichas aproximaciones de terapia génica.

Las aproximaciones terapéuticas anteriores pueden combinarse con cualquiera de la amplia variedad de regímenes de quimioterapia o terapia de radiación. Estas aproximaciones terapéuticas pueden permitir también el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia y/o administración con menor frecuencia, en particular en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de dichas composiciones, puede evaluarse utilizando varios sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro para evaluar el potencial terapéutico incluyen los ensayos de crecimiento celular, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de actividad promotora de tumores, ensayos de unión capaces de determinar la extensión en la que la composición terapéutica inhibirá la unión de PHOR-1 a una pareja de unión, etc.

Puede evaluarse in vivo, el efecto de una composición terapéutica de PHOR-1 en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, el cáncer xenogénico de modelos de próstata en los que se introducen explantes humanos de cáncer de próstata o pases de xenoinjerto de tejidos en animales inmunocomprometidos, como ratones desnudos o SCID, son adecuados en relación con el cáncer de próstata y han sido descritos en (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT WO98/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de abril, 1998, describe varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaz de resumir el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis, y la formación de metástasis osteoblástica característica del último estadío de la enfermedad. La eficacia puede predecirse utilizando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, regresión tumoral o metástasis, y similares. Véase, también, los Ejemplos a continuación.

Los ensayos in vivo que cualifican la promoción de la apoptosis pueden también ser útiles en la evaluación de composiciones terapéuticas potenciales. En una realización, los ratones portadores de xenoinjertos tratados con la composición terapéutica, pueden examinarse en busca de la presencia de focos apoptóticos y compararse con ratones portadores de xenoinjertos control no tratados. El grado en que se encuentran los focos apoptóticos en los tumores de los ratones tratados, proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.

Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos anteriores puede formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un transportador adecuado para el método de liberación deseado. Los transportadores adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y no es reactivo con el sistema inmunitario del paciente. Como ejemplo se incluye, pero no se limita a, cualquier número de transportadores farmacéuticos estándar como soluciones salinas tamponadas de fostato estériles, agua bacteriostática, y similares (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, A. Osal., Ed., 1980).

Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse por medio de cualquier ruta capaz de liberar la composición terapéutica hacia el sitio del tumor. Las rutas potencialmente efectivas de administración incluyen, pero no se limitan a, ruta intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica, y similares. Una formulación preferible para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática preservada, agua estéril no preservada, y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen cloruro sódico estéril para inyección al 0,9%, USP. Las preparaciones terapéuticas de proteína pueden estar liofilizadas y almacenadas como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y después reconstituirse en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, conservante alcohol bencílico, o en agua estéril antes de la inyección.

Las dosificaciones y protocolos de administración para el tratamiento del cáncer utilizando los métodos anteriores variará con el método y el cáncer diana y dependerá generalmente en una serie de otros factores apreciados en la materia.

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Vacunas contra el cáncer

La invención proporciona además vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína PHOR-1 o fragmento de la misma, así como vacunas basadas en el DNA. En vista de la expresión restringida en próstata y tumores de PHOR-1, las vacunas contra el cáncer de PHOR-1 se espera que sean efectivas en la prevención específica y/o tratamiento de cánceres que expresan PHOR-1 sin crear efectos inespecíficos sobre los tejidos no diana. Es bien conocido en la materia el uso de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por células para utilizar en la terapia anticancerígena, y se ha empleado en el cáncer de próstata utilizando los inmunógenos PSMA humano y PAP de roedores (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117). Dichos métodos pueden practicarse fácilmente utilizando una proteína PHOR-1, o fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica PHOR-1 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar de forma apropiada el inmunógeno PHOR-1.

Por ejemplo, los sistemas de liberación de genes virales pueden utilizarse para liberar una molécula de ácido nucleico que codifica PHOR-1. Varios sistemas de liberación de genes virales que pueden utilizarse en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a, virus de la viruela, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, virus de la gripe, virus de la polio, virus adenoasociado, lentivirus, y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663). También se pueden utilizar los sistemas de liberación no víricos utilizando DNA desnudo que codifica una proteína PHOR-1 o fragmento de la misma introducida en el paciente (por ejemplo por vía intramuscular) para inducir una respuesta antitumoral. En una realización, puede utilizarse el cDNA de longitud completa de PHOR-1 humano.

En una realización, una vacuna de PHOR-1 contra el cáncer está basada en la identificación de péptidos inmunogénicos dentro de la secuencia de aminoácidos de PHOR-1 mostrada en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2). Tal como se discute posteriormente en los ejemplos, se ha visto que porciones específicas de PHOR-1 inducen respuestas en las células T y B. Se utilizó una proteína de fusión de GST que abarca los aminoácidos 86-310 de PHOR-1 (Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº 2) para generar una respuesta inmune en ratones para la producción de anticuerpos monoclonales. Esta misma proteína de fusión GST-PHOR-1, así como dos péptidos correspondientes a los aminoácidos 1-14 (MVDPNGNESSATYF; Id. de Sec. Nº 8) y 262-274 (VHRFSKRRDSPLP; Id. de Sec. Nº 9) de PHOR-1, se han utilizado para generar una respuesta inmune en conejos para la producción de anticuerpos policlonales. Así, estas porciones específicas de PHOR-1, y polinucleótidos que codifican estas porciones, pueden seleccionarse para la producción de una vacuna contra el cáncer.

En otra realización, pueden emplearse las moléculas de ácido nucleico de PHOR-1 que codifican epítopos específicos de linfocitos T citotóxicos (CTL). Los epítopos CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos (por ejemplo, Epimer, Universidad de Brown) para identificar péptidos dentro de una proteína PHOR-1 que son capaces de unirse de forma óptima a alelos específicos de HLA. Un algoritmo adecuado es el algoritmo de búsqueda de motivos peptídicos de HLA disponible en la página web de la Sección de Análisis Molecular y Bioinformática (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/). Este algoritmo está basado en la unión de secuencias de péptido específicas en la hendidura de las moléculas de HLA de clase I y específicamente de HLA-A2 (Falk et al., 1991, Nature 351:290-6; Hunt et al., 1992, Science 255:1261-3; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152:163-75). El algoritmo de búsqueda de motivos peptídicos de HLA permite localizar y puntuar péptidos 8-meros, 9-meros, y 10-meros a partir de la predicción de unión a HLA-A2 de un secuencia completa de proteínas así como otras moléculas de clase I. La mayoría de péptidos que se unen a HLA-A2 son 9-meros, que contienen preferiblemente una leucina en la posición 2 y una valina o leucina en la posición 9 (Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7). La unión real de péptidos a HLA-A2 puede evaluarse mediante estabilización de la expresión de HLA-A2 en la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento de antígenos (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36:129-38). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse in vitro mediante la estimulación de CTL CD8+ en presencia de células dendríticas (Xue et al.; Peshwa et al., supra).

También pueden emplearse varias estrategias ex vivo. Una aproximación implica el uso de células dendríticas para presentar el antígeno de PHOR-1 a un sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas que expresan MHC de clase I y II, coestimulador B7 e IL-12, son de esta manera células presentadoras de antígeno altamente especializadas. En el cáncer de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) en un ensayo clínico de Fase I para estimular los sistemas inmunitarios de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Se pueden utilizar células dendríticas para presentar péptidos de PHOR-1 a células T en el contexto de las moléculas de MHC de clase I y II. En una realización, se pulsan células dendríticas autólogas con péptidos de PHOR-1 capaces de unirse a moléculas MHC. En otra realización, se pulsan células dendríticas autólogas con la proteína PHOR-1 completa. Otra realización implica la sobreexpresión del gen PHOR-1 en células dendríticas utilizando varios vectores de mejora conocidos en la materia, como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gen Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adenoasociado, transfección de DNA (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869), y transfección de RNA derivado de tumores (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). Las células que expresan PHOR-1 pueden también crearse para expresar inmunomoduladores, como GM-CSF, y utilizarse como agentes inmunizantes.

Los anticuerpos anti-PHOR-1 antiidiotípicos pueden tam-bién utilizarse en la terapia contra el cáncer como vacunas para inducir una respuesta inmune en células que expresan una proteína PHOR-1. De forma específica, la generación de anticuerpos antiidiotípicos es bien conocida en la materia y puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-PHOR-1 antiidiotípicos que imitan un epítopo en una proteína PHOR-1 (véase, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Dicho anticuerpo antiidiotípico puede utilizarse en las estrategias de vacunas contra el
cáncer.

Los métodos de inmunización genética pueden utilizarse para generar respuestas inmunes profilácticas o terapéuticas humorales y celulares dirigidas contra células de cáncer que expresan PHOR-1. Las construcciones que comprenden DNA que codifica una proteína/inmunógeno de PHOR-1 y secuencias reguladoras adecuadas, pueden inyectarse directamente al músculo o en la piel de un individuo, de tal forma que las células del músculo o la piel incorporan la construcción y expresan la proteína/inmunógeno de PHOR-1 codificada. La expresión de la proteína/inmunógeno de PHOR-1 resulta en la generación de inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica frente al cáncer de próstata y otros que expresan PHOR-1. Se pueden utilizar varias técnicas de inmunización genética profiláctica o terapéutica conocidas en la materia (para revisión, véase la información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com).

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Equipos

La invención también proporciona equipos para utilizar en las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente. Dichos equipos pueden comprender un medio transportador compartimentalizado para recibir en un sitio cerrado uno o más contenedores como por ejemplo viales, tubos, y similares, que comprende cada uno de ellos uno de los elementos separados a utilizar en el método. Por ejemplo, uno de los contenedores puede comprender una sonda que está marcada o que puede marcarse para ser detectada. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleótido específico de una proteína PHOR-1 o un gen o mensajero de PHOR-1, respectivamente. Cuando el equipo utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el equipo puede también tener contenedores que contengan nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un contenedor que comprenda una forma indicadora, como una proteína de unión a biotina, como avidina o estreptavidina, unida a una molécula marcadora, como una marca enzimática, fluorescente, o radioisó-
topo.

El equipo de la invención comprenderá normalmente el contenedor descrito antes y uno o más contenedores diferentes que comprendan materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, lo que incluye tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso. Puede haber presente una etiqueta en el contenedor para indicar que la composición se utiliza para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y puede también indicar directrices para el uso in vivo o in vitro, como las descritas anteriormente.

EL cDNA de PHOR-1 se depositó bajo los términos del tratado de Budapest el 2 de Julio de 1999, en la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) como plásmido p101P3A11, y se le asignó el número de Registro PTA-312.

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Ejemplos

Varios aspectos de la invención se describen y se ilustran más profundamente por medio de varios ejemplos a continuación, ninguno de ellos pretende limitar el alcance de la invención.

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Ejemplo 1

Aislamiento generado por SSH del fragmento de cDNA del gen PHOR-1 Materiales y Métodos

Xenoinjertos LAPC:

Los xenoinjertos LAPC se obtuvieron del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y se generaron tal como se describe (Klein et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Los xenoinjertos LAPC-4 dependientes e independientes de andrógenos (LAPC-4 AD y AI, respectivamente) y los xenoinjertos LAPC-9 (LAPC-9 AD y AI, respectivamente) se cultivaron en ratones macho intactos SCID o en machos castrados, respectivamente, y se sometieron a pases como pequeños pedazos de tejido en machos receptores. Los xenoinjertos LAPC-4 AI derivan de tumores LAPC-4 AD y los xenoinjertos LAPC-9 AI derivan de tumores LAPC-9 AD. Para generar los xenoinjertos AI, los ratones macho portadores de los tumores LAPC AD se castraron y se mantuvieron durante 2-3 meses. Tras el recrecimiento de los tumores LAPC, los tumores se recogieron y se sometieron a pases en ratones macho castrados o en hembras SCID.

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Líneas celulares:

Se obtuvieron líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) a partir del ATCC y se mantuvieron en DMEM con un 10% de suero fetal bovino.

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Aislamiento de RNA:

El tejido tumoral y las líneas celulares se homogeneizearon en reactivo de Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar RNA total. EL RNA poli A se purificó a partir de RNA total utilizando los equipos Oligotex mRNA Mini y Midi de Qiagen. Se cuantificaron los mRNA y RNA total mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis en gel.

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Oligonucleótidos:

Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.

DPNCDN (cebador de síntesis de cDNA) (Id. de Sec. Nº 21):

5'TTTTGATCAAGCTT303'

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Adaptador 1 (Id. de Sec. Nº 22 y 23, respectivamente):

5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3'

\hskip6.8cm

3'GGCCCGTCCTAG'5

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Adaptador 2 (Id. de Sec. Nº 24 y 25, respectivamente):

5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3'

\hskip6.9cm

3'CGGCTCCTAG'5

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Cebador de PCR 1 (Id. de Sec. Nº 26):

5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3'

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Cebador anidado (NP) 1 (Id. de Sec. Nº 27):

5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3'

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Cebador anidado (NP) 2 (Id. de Sec. Nº 28):

5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3'

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Hibridación sustractiva por supresión:

Se utilizó la técnica de hibridación sustractiva por supresión (SSH) para identificar los cDNA que corresponden a los genes que pueden estar sobreexpresados en el cáncer de próstata dependiente de andrógenos en comparación con el cáncer independiente de andrógenos.

Los cDNA de doble cadena que corresponden al xenoinjerto LAPC-4 AD de 14 días post castración (probador) y el xenoinjerto LAPC-4 AD (conductor) se sintetizaron a partir de 2 \mug de RNA poli(A)+ aislado de tejido de xenoinjerto, como se ha descrito antes, utilizando el equipo PCR-Select cDNA Subtraction Kit de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como cebador. La síntesis de la primera y segunda cadena se llevó a cabo tal como se describe en el protocolo del manual del usuario del equipo (CLONTECH Nº de Protocolo PT1117-1, Nº de Catálogo K1804-1). El cDNA resultante se digirió con Dpn II durante 3 h a 37ºC. El cDNA digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.

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El cDNA conductor (LAPC-4 AD) se generó mediante la combinación en una proporción 1:1 de cDNA de LAPC-4 AD digerido con Dpn II con una mezcla de cDNA digeridos que derivan de hiperplasia benigna de próstata humana (HBP), líneas celulares humanas HeLa, 293, A431, Colo205, e hígado de ratón.

El cDNA probador (LAPC-4 AD, 14 días post castración) se generó mediante la dilución de 1 \mul de cDNA de LAPC-4 AD 14 días post castración digerido con Dpn II (400 ng) en 5 \mul de agua. El cDNA diluido (2 \mul, 160 ng) se ligó entonces a 2 \mul de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC durante la noche, utilizando 400 u de ligasa de DNA T4 (CLONTECH). La ligación terminó con 1 \mul de EDTA 0,2 M y se calentó a 72ºC durante 5 min.

La primera hibridación se realizó añadiendo 1,5 \mul (600 ng) del cDNA conductor a cada uno de los dos tubos que contienen 1,5 \mul (20 ng) de cDNA probador ligado al Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las muestras se cubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un termociclador MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y después se dejó que hibridara durante 8 h a 68ºC. Las dos hibridaciones se mezclaron entonces junto con 1 \mul adicional de cDNA conductor recién desnaturalizado y se dejaron hibridar durante la noche a 68ºC. La segunda hibridación se diluyó entonces en 200 \mul de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 minutos y se guardó a -20ºC.

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Amplificación por PCR, clonaje y secuenciación de fragmentos génicos generados a partir de SSH:

Para amplificar los fragmentos génicos resultantes de las reacciones de SSH, se realizaron dos amplificaciones de PCR. En la reacción primaria de PCR, se añadió 1 \mul de la mezcla de hibridación final diluida a 1 \mul de Cebador de PCR 1 (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \mul 50 x mezcla de polimerasa de cDNA Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. La PCR 1 se realizó utilizando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min., 94ºC durante 25 seg., después 27 ciclos de 94ºC durante 10 seg., 66ºC durante 30 seg., 72ºC durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones primarias de PCR separadas para cada experimento. Los productos se juntaron y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reacción secundaria de PCR, se añadió 1 \mul de los productos juntados de la reacción primaria de PCR diluida a la misma mezcla de reacción tal como se utilizó para la PCR 1, excepto que se utilizaron los cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) en lugar del Cebador de PCR 1. La PCR 2 se realizó utilizando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 seg., 68ºC durante 30 seg., 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa
al 2%.

Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 utilizando el equipo T/A vector cloning kit (Invitrogen). Las células de E. coli transformadas se sometieron a selección de colonias por color azul/blanca y por ampicilina. Las colonias blancas se picaron y distribuyeron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en cultivo líquido durante la noche. Para identificar los insertos, se realizó la amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las condiciones de la PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los clones bacterianos se guardaron en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó el DNA plasmídico, se secuenció, y se sometió a búsquedas de homología de ácidos nucleicos en las bases de datos del GenBank, dBest, y NCI-CGAP.

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Análisis de la expresión por RT-PCR:

Las primeras cadenas de cDNA se generaron a partir de 1 \mug de mRNA con oligo (dT)12-18 hibridando con el sistema de Preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se utilizó el protocolo del fabricante y se incluyó una incubación de 50 minutos a 42ºC con la transcriptasa reversa seguida con tratamiento de RNasa H a 37ºC durante 20 min. Tras completar la reacción, el volumen se incrementó a 200 \mul con agua antes de la normalización. Las primeras cadenas de cDNA de los 16 tejidos normales humanos diferentes se obtuvieron de Clontech.

La normalización de las primeras cadenas de cDNA de los diferentes tejidos se realizó utilizando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (Id. de Sec. Nº 29) y 5'agccacacgcagct cattgtagaagg 3' (Id. de Sec. Nº 30) para amplificar la \beta-actina. La primera cadena de cDNA (5 \mul) se amplificó en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTPs, 1X tampón de PCR (Clontech, Tris-HCL 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y 1X polimerasa de DNA Klentaq (Clontech). Se tomaron 5 \mul de la reacción de PCR a los 18, 20, y 22 ciclos y se utilizaron para electroforesis en gel de agarosa. La PCR se realizó utilizando un termociclador MJ Research bajo las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 seg., seguida de 18, 20, y 22 ciclos de 94ºC durante 15 seg., 65ºC durante 2 min., 72ºC durante 5 seg. Se llevó a cabo una extensión final a 72ºC durante 2 min. Tras la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de 283 pb de la \beta-actina de los diferentes tejidos se compararon mediante inspección visual. Los factores de dilución para las primeras cadenas de cDNA se calcularon para resultar en intensidades de banda iguales a las intensidades de banda de la \beta-actina en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR. Fueron necesarias tres rondas de normalización para lograr las mismas intensidades de banda en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR.

Para determinar los niveles de expresión del gen PHOR-1, se analizaron 5 \mul de primera cadena de cDNA normalizada mediante PCR utilizando 25, 30, y 35 ciclos de amplificación utilizando los siguientes pares de cebadores, que se diseñaron con la asistencia de (MIT; para más detalles, véase, www.genome.wi.mit.edu) (Id. de Sec. Nº 31 y 32, respectivamente):

101P3A11.1	ATCCTGACTAGGTTGTGGTTGGAG
101P3A11.2	TGTGGTTGGGAGTTCTAAAGAGGA

El análisis semicuantitativo de la expresión se logró comparando los productos de PCR en el número de ciclos que proporcionó intensidades de banda suaves.

Resultados

Se llevaron a cabo varios experimentos de SSH tal como se describe en el apartado de Materiales y Métodos, supra, y llevaron al aislamiento de numerosos clones de fragmentos de genes candidatos. Todos los clones candidatos se secuenciaron y se sometieron a análisis de homología frente a todas las secuencias en las principales bases de datos génicas públicas y de EST para proporcionar información sobre la identidad del correspondiente gen y para ayudar a la decisión de analizar un gen particular para la expresión diferencial. En general, los fragmentos de genes que no tienen homología a ninguna secuencia conocida en ninguna de las bases de datos utilizadas, considerándose de esta manera que representan nuevos genes, así como los fragmentos de genes que muestran homología a las secuencias de expresión de colas (EST) previamente secuenciadas, se sometieron a análisis de expresión diferencial mediante RT-PCR y/o análisis northern.

Uno de los clones SSH, que comprende alrededor de 427 pb, no mostró homología a ningún gen conocido, y se designó 101P3A11. Este clon representa un fragmento del cDNA de longitud completa que codifica PHOR-1 tal como se muestra en la Fig. 1A (véase también el Ejemplo 2). La secuencia del fragmento de SSH 101P3A11 se muestra en la Fig. 3.

El análisis inicial de RT-PCR (Fig. 5A-B) mostró la expresión de 101P3A11 solo en la próstata, LAPC-4 AD, LAPC-4 AD 3 días y LAPC-4 AD 14 días post-castración, pero no en LAPC-4 AI. Se detectó una menor expresión en el ovario.

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Ejemplo 2

Aislamiento del cDNA que codifica PHOR-1 de longitud completa

Se aisló un cDNA (GTH10) de longitud completa de 3136 pb de una biblioteca prostática, revelando un ORF de 317 aminoácidos (Fig. 1A-D). La secuencia de proteínas revela 7 dominios transmembrana y posee homología a los receptores de proteína G acoplados (GPCR) involucrados en el olfato (Raming et al., 1993, Nature 361: 353; Malnic et al., 1999, Cell 96:713). La secuencia más homóloga a 101P3A11 es un receptor olfativo de rata expresado en el cerebro conocido como RA1c (Raming et al., 1998, Receptor Channels 6: 141). Es idéntica en un 59,9% a RA1c en un solapamiento de 299 residuos. El homólogo humano de RA1c es probablemente HPRAJ70, una GPCR especifica de próstata identificada por Human Genome Sciences (US 5756309, WO 96/39435). Los alineamientos de ambos genes con 101P3A11 se muestra en la Fig. 2. El cDNA de 101P3A11 de longitud completa codifica una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 59,4% a HPRAJ70 en un solapamiento de 298 residuos. La homología de 101P3A11 con los receptores olfativos de cerebro nos llevó a denominarlo gen Prostático Homólogo al Receptor Olfativo-1 (PHOR-1). Las proteínas que son miembros de esta familia de receptores presentan un extremo amino terminal extracelular, tres bucles adicionales extracelulares, tres bucles intracelulares y un extremo carboxi terminal intracelular. La segunda región extracelular de PHOR-1 muestra un sitio potencial de N-glicosilación en el residuo 90 (NST) lo que sugiere que la proteína puede estar glicosilada.

El cDNA de longitud completa PHOR-1 (p101P3A11, clon GTH10) se depositó en la American Type Culture Collection el 2 de julio de 1999, y se le asignó el número de acceso PTA-312.

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Ejemplo 3

Análisis de la expresión del gen PHOR-1

La expresión del mRNA de PHOR-1 en tejidos humanos normales se analizó inicialmente mediante northern blot en dos blots de múltiples tejidos (Clontech; Palo Alto, California), que comprenden un total de 16 tejidos humanos normales diferentes, utilizando el fragmento SSH 101P3A11 marcado (Ejemplo 1) como sonda. Las muestras de RNA se normalizaron cuantitativamente con una sonda de \beta-actina. Los resultados de este análisis se muestran en las Fig. 6A-C. La expresión de un tránscrito de 3,5 kb se detectó tan sólo en la próstata normal.

La expresión de PHOR-1 en tejidos normales se analizó en más profundidad utilizando un dot blot de RNA multi-tejido que contenía 76 muestras diferentes (que representan la mayoría de tejidos normales así como unas cuantas líneas celulares de cáncer) que mostró una fuerte expresión de PHOR-1 sólo en la próstata (Fig. 7). Se detectó una expresión significativamente inferior en tejido coronario.

Además, puede utilizarse una RT-PCR para analizar la expresión de PHOR-1 en diferentes tejidos, lo que incluye cánceres derivados de pacientes. Se generaron primeras cadenas de cDNA a partir de 1 \mug de mRNA con cebadores oligo (dT)12-18 utilizando el sistema de preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se puede utilizar el protocolo del fabricante que incluye una incubación de 50 min. a 42ºC con transcriptasa reversa seguida de un tratamiento con RNasa H a 37ºC durante 20 min. Tras completar la reacción, el volumen se incrementó a 200 \mul con agua antes de la normalización. Se prepararon primeras cadenas de cDNA a partir de varios tejidos de interés. La normalización puede realizarse mediante PCR utilizando cebadores para actina y GAPDH. Se realizó la PCR semicuantitativa utilizando cebadores para PHOR-1.

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Ejemplo 4

Expresión de PHOR-1 en xenoinjertos de cáncer de próstata y muestras de pacientes Análisis de Northern de xenoinjertos de cáncer de próstata y especímenes clínicos

Para analizar la expresión de PHOR-1 en tejidos de cáncer de próstata, se realizó un northern blot en RNA derivado de los xenoinjertos LAPC y en un panel de muestras de cáncer de próstata con su tejido de próstata normal adyacente emparejado. Los resultados muestran altos niveles de expresión de PHOR-1 en LAPC-4 AD, LAPC-9 AD y LAPC-9 AI. Se detectó una menor expresión en próstata normal y no se observó ninguna expresión en LAPC-4 AI (Fig. 8). El análisis de 4 pares normal/tumor de especimenes clínicos emparejados derivados de pacientes de cáncer de próstata mostró expresión de PHOR-1 en todas las muestras de pacientes (Fig. 8). Curiosamente, en 3 de los 4 pares emparejados, la expresión de PHOR-1 era 5-20 veces superior en las muestras de tumor comparado con el tejido normal adyacente emparejado. Estos resultados sugieren que PHOR-1 específico de próstata se sobreexpresa en el cáncer y puede tener un papel funcional en la patología del cáncer de próstata.

Análisis de Northern y de Dot Blot de muestras de pacientes Tumor/Normal emparejadas

El análisis de Northern y de dot blot mostró una sobreexpresión de PHOR-1 en 8 de los 10 tumores de cáncer de próstata (puntuaciones Gleason entre 6 y 9) en comparación con sus tejidos normales adyacentes (Figura 9A-B). Un análisis de Dot blot utilizando cDNA amplificados derivados de pacientes (Clontech, CA) mostró una sobreexpresión de PHOR-1 en 3/3 pacientes con cáncer de próstata, 6/14 pacientes con cáncer de riñón, 2/8 con cáncer uterino, 1/1 con cáncer cervical, 3/8 con cáncer de estómago y en 7/7 pacientes con cáncer rectal (Figura 10).

RNA in situ

El análisis de RNA in situ utilizando una ribosonda antisentido para PHOR-1 mostró una expresión glandular epitelial y en células basales significativa en pacientes con próstata normal (4/4), con PIN (1/1) y con cáncer de próstata (6/6). La ribosonda sentido para PHOR-1 no muestra tinción o muy poca. La tinción de RNA in situ en PIN y cáncer de próstata se muestra en la Figura 11A-B. La intensidad de la tinción en las células de cáncer, fue generalmente superior a la observada en glándulas normales (Figura 12A-B). Los resultados del análisis de RNA in situ también demuestran que la expresión observada en los tejidos de próstata se da en el epitelio glandular, células basales y células cancerosas.

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Ejemplo 5

Expresión de proteína PHOR-1 recombinante en células bacterianas Construcciones pGEX

Para expresar PHOR-1 en células bacterianas, se fusionaron porciones de PHOR-1 al gen de la glutatión S-transferasa (GST) mediante clonaje en pGEX-2T o pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ). Todas las construcciones se realizaron para generar secuencias de proteína recombinante PHOR-1 con la GST fusionada en el extremo N-terminal, con o sin un epítopo de seis histidinas en C-terminal. La cola epítopo de seis histidinas se generó añadiendo los codones de histidina al cebador de clonaje en el extremo 3' del ORF. Un sitio de reconocimiento para trombina o PreScission TM permite la escisión de la cola de GST de PHOR-1 o de las construcciones pGEX-2T y pGEX-6P-1, respectivamente. EL gen de la resistencia a la ampicilina y el origen de pBR322 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Los siguientes fragmentos de PHOR-1 se clonaron en pGEX-6P-1:

Aminoácidos 128 a 238

Aminoácidos 188 a 317

Aminoácidos 100 a 295

El siguiente fragmento de PHOR-1 se clonó en pGEX-2T: Aminoácidos 86 a 310.

Pueden realizarse construcciones adicionales en pGEX-6P-1 abarcando las siguientes regiones de la proteína PHOR-1:

Aminoácidos 1 a 128

Aminoácidos 1 a 188

Aminoácidos 1 a 317

Aminoácidos 52 a 238.

Construcciones pMAL

Para expresar PHOR-1 en células bacterianas, se fusionaron porciones de PHOR-1 al gen de la proteína de unión a maltosa (MBP) mediante el clonaje en pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, MA). Todas las construcciones se realizaron para generar secuencias de proteína PHOR-1 recombinante con la MBP fusionada en el extremo N-terminal y un epítopo de seis histidinas en el extremo C-terminal. La cola epítopo de seis histidinas se generó añadiendo los codones de histidina al cebador 3' de clonaje. Un sitio de reconocimiento de Factor Xa permite la escisión de la cola de GST del PHOR-1. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X se optimizaron para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o periplasma respectivamente. La expresión en periplasma potencia el plegamiento de proteínas con puentes disulfuro. Los aminoácidos 86 a 310 de PHOR-1 se clonaron tanto en pMAL-c2X como en
pMAL-p2X.

Se pueden realizar construcciones adicionales en pMAL-c2X y pMAL-p2X abarcando las siguientes regiones de la proteína PHOR-1:

Aminoácidos 1 a 128

Aminoácidos 1 a 188

Aminoácidos 1 a 317

Aminoácidos 52 a 238

Aminoácidos 100 a 295

Aminoácidos 128 a 238

Aminoácidos 188 a 317.

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Ejemplo 6

Expresión de Proteína PHOR-1 recombinante en sistemas de mamíferos Construcción de pcDNA4/HisMax-TOPO

Para expresar PHOR-1 en células de mamífero, el ORF de 951 pb de PHOR-1 se clonó en pcDNA4/HisMax-TOPO Versión A (nº cat K864-20, Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteína se condujo desde el promotor de citomegalovirus (CMV) y el potenciador de la traducción SP163. La proteína recombinante posee epítopos Xpress^{TM} y seis histidinas fusionadas al extremo N-terminal. El extremo C-terminal de la proteína recombinante posee una fusión de 28 aminoácidos resultante de secuencias del vector previas al codón de terminación. El vector pcDNA4/HisMax-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad del mRNA, junto con el origen de SV40 para la replicación episomal y un rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T mayor. El gen de la resistencia a la Zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de la resistencia a la ampicilina y el origen de ColE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.

Construcción pcDNA3.1/MycHis

Para expresar PHOR-1 en células de mamífero, el ORF de PHOR-1 de 951 pb se clonó en el vector pcDNA3.1/MycHis Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteínas se dirigió desde el promotor de citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante posee myc y seis histidinas fusionadas con el extremo C-terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis contiene también la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad del mRNA, junto con el origen de SV40 para la replicación episomal y el rescate simple de vector en líneas celulares que expresan el antígeno T mayor. El gen de la resistencia a la neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de la resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.

Construcción pcDNA3.ICT-GFP-TOPO

Para expresar PHOR-1 en células de mamífero y para permitir la detección de la proteína recombinante utilizando fluorescencia, el ORF de 951 pb se clonó en pcDNA3.1CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de proteínas se dirigió desde el promotor de citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante posee la proteína verde fluorescente (GFP) fusionada al extremo C-terminal, facilitando los ensayos no invasivos, de detección in vivo y de biología celular. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad del mRNA, junto con el origen de SV40 para la replicación episomal y el rescate simple de vector en líneas celulares que expresan el antígeno T mayor. El gen de la resistencia a la neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de la resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.

Se puede realizar una construcción adicional con una fusión de GFP en el extremo N-terminal en pcDNA3.1NT-GFP-TOPO abarcando la longitud completa de la proteína PHOR-1.

Construcciones pSR\alpha

Para generar líneas celulares de mamífero que expresan PHOR-1 de forma constitutiva, el ORF de 951 pb se clonó en construcciones pSRa y se generaron líneas celulares estables. Se generaron retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos mediante la transfección de construcciones pSRa en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o cotransfección de pSRa y un plásmido ayudante (\varphi-) en células 293, respectivamente. Los retrovirus pueden utilizarse para infectar una serie de líneas celulares de mamíferos, resultando en la integración del gen clonado, PHOR-1, en las líneas celulares huésped. La expresión de proteína está dirigida desde una repetición larga terminal (LTR). El gen de la resistencia a la neomicina permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de la resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Se realizó una construcción adicional de pSR\alpha que fusionó la cola FLAG al extremo C-terminal para permitir la detección utilizando anticuerpos anti-FLAG. La secuencia FLAG 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (Id. de Sec. Nº 33) se añadió al cebador de clonación al extremo 3' del ORF.

Se pueden realizar construcciones adicionales de pSR\alpha para producir las proteínas de fusión GFP y myc/6 HIS tanto en N-terminal como en C-terminal de la proteína PHOR-1 de longitud completa.

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Ejemplo 7

Producción de PHOR-1 recombinante en un sistema de Baculovirus

Para generar una proteína recombinante PHOR-1 en un sistema de expresión de baculovirus, el cDNA PHOR-1 se clonó en el vector de transferencia a baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona una cola de His en el extremo N-terminal. Específicamente, el pBlueBac-PHOR-1 se cotransfectó con un plásmido ayudante pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinantes (véase manual de instrucciones de Invitrogen para más detalle). Los baculovirus se recogieron entonces a partir del sobrenadante celular y se purificaron mediante ensayo de placas.

La proteína recombinante PHOR-1 se generó entonces mediante infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con el baculovirus purificado. La proteína recombinante PHOR-1 se puede detectar utilizando un anticuerpo anti-PHOR-1. La proteína PHOR-1 se puede purificar y utilizar en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para PHOR-1.

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Ejemplo 8

Anticuerpos policlonales y monoclonales contra PHOR-1

Se derivaron tres inmunógenos para poder generar reactivos de anticuerpos que se unen específicamente a PHOR1. Dos antígenos eran péptidos que codifican los aminoácidos 1-14 (MVDPNGNESSATYF; Id. de Sec. Nº 8) y los aminoácidos 262-274 (VHRFSKRRDSPLP; Id. de Sec. Nº 9) de la secuencia de la proteína PHOR-1. Se predice que estos péptidos codifican el extremo N-terminal extracelular y el bucle extracelular entre los presuntos dominios transmembranales 6º y 7º, respectivamente, de la proteína PHOR1, que es el sitio de unión a ligando esperable. El tercer inmunógeno fue una proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST) que abarca los aminoácidos 86-310 de la secuencia de la proteína PHOR-1. Esta proteína de fusión se generó mediante amplificación mediada por PCR de los nucleótidos 388-1062 del cDNA clonado de PHOR-1 con los siguientes cebadores (Id. de Sec. Nº 34,35, respectivamente):

CEBADOR	5' CCGAATTCCATCTTCTGGTTCAATTTC
	\hskip1cm EcoRI
CEBADOR	3' CCTCTCGAGTTCACATGGAAAAGTCGAAG
	\hskip1cm XhoI

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El producto resultante se clonó en los sitios de restricción EcoRI y XhoI del vector de fusión de GST pGEX-2T (Pharmacia). La proteína de fusión recombinante GST-PHOR-1 se purificó a partir de bacterias inducidas por cromatografía de afinidad en sefarosa-glutatión.

Además de los antígenos anteriores, se pueden utilizar otros péptidos y proteínas producidos en bacterias y baculovirus y que codifican otras regiones de la secuencia de la proteína PHOR-1 para generar anticuerpos reactivos específicos de PHOR-1. Dichos reactivos pueden estar dirigidos a regiones de la proteína PHOR-1 que pueden modular la función de PHOR-1, como un anticuerpo que bloquea la unión de ligando. Dichos reactivos pueden utilizarse para discernir la función y rutas de transducción de señales de la proteína PHOR-1.

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Generación de anticuerpos policlonales

Para generar sueros policlonales para PHOR-1, se utilizaron la proteína de fusión con GST purificada y los péptidos acoplados a hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin en inglés) para inmunizar conejos individuales como se explica a continuación. Los conejos se inmunizaron con 200 \mug del antígeno proteína de fusión o péptido-KLH mezclado con adyuvante completo de Freund. Los conejos se inyectaron entonces cada dos semanas con 200 \mug de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund. Se tomaron muestras de sangre aproximadamente cada 7-10 días tras cada inmunización. La titulación de cada antisuero de péptido fue de al menos 1 X 10^{5} como se pudo determinar mediante ELISA con los correspondientes inmunógenos. La titulación del suero de la proteína de fusión-GST fue de al menos 1 X 10^{6}.

El antisuero del péptido se purificó por afinidad mediante pases del suero por una columna de afinidad compuesta del correspondiente péptido covalentemente unido a una matriz Affigel (BioRad). El suero obtenido de la proteína de fusión-GST se semipurificó inicialmente mediante la eliminación del anticuerpo reactivo frente a GST mediante pases por una columna de afinidad de GST. El anticuerpo específico de PHOR-1 se aisló entonces mediante pases sobre una columna de afinidad GST-PHOR-1. Alternativamente, el antisuero específico de PHOR-1 puede aislarse mediante cromatografía de afinidad utilizando una proteína de fusión de la proteína de unión a maltosa (MBP)-PHOR-1 que codifica los mismos aminoácidos. El suero purificado por afinidad de los conejos inmunizados con el péptido N-terminal de la secuencia PHOR-1 inmunoprecipita la proteína PHOR-1 de los lisados de células transfectadas con el cDNA de PHOR-1 (Figura 13A-B) y detecta la expresión de la proteína PHOR-1 en la superficie celular mediante análisis de citometría de flujo de las células transfectadas (Figura 14A-B).

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Generación de anticuerpos monoclonales murinos

Para generar mAb dirigidos contra PHOR-1 se inmunizaron ratones Balb C por vía intraperitoneal con 200 \mug de proteína de fusión GST-PHOR-1 mezclada con adyuvante completo de Freund. Los ratones se inmunizaron posteriormente cada 2-4 semanas con 200 \mug de antígeno mezclado en adyuvante incompleto de Freund. Tras 3 inmunizaciones, la titulación de los sangrados de prueba de estos ratones fue de al menos 1,2 x 10^{6} determinada mediante ELISA y reconocen específicamente la secuencia de aminoácidos de PHOR-1, como se muestra mediante western blot utilizando una proteína de fusión MBP que codifica los mismos aminoácidos presentes en la proteína de fusión GST (Fig. 15). El análisis de citometría de flujo de las células LNCaP y las células de xenoinjerto LAPC9 muestran un cambio de fluorescencia cuando se tiñen con una combinación de sangrados de ratones inmunizados en comparación con sus propios sueros preinmunes, lo que demuestra una detección de proteína PHOR-1 en la superficie celular (Fig. 16A-B).

Una vez obtenida una reactividad y especificidad adecuadas tal como se determinó mediante ELISA, análisis de western blot y citometría de flujo, se lleva a cabo la fusión y generación de hibridoma con procedimientos establecidos bien conocidos en la materia (Harlow y Lane, 1988).

También se pueden utilizar estrategias de inmunización y antígenos alternativos para generar mAb con reactividad específica y especificidad frente a varias regiones de la proteína PHOR-1. Dichos antígenos pueden incluir péptidos y proteínas recombinantes adicionales producidas en bacterias y baculovirus que codifican varias regiones de la secuencia de la proteína PHOR-1. También se puede utilizar una estrategia de inmunización basada en células, en la que el cDNA de PHOR-1 se sobreexpresa en células como los fibroblastos de ratón NIH3T3 o células B murinas 300.19, y se utilizan como inmunógeno células enteras o preparaciones de membrana de esas células.

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Ejemplo 9

Caracterización de la expresión de la proteína PHOR-1

Se transfectaron de forma transitoria células 293T con el plásmido de expresión pCDNA4 HIS/MAX (Invitrogen) en el que se fusionó el cDNA de PHOR-1 en el extremo amino terminal con dos colas epítopo, Express y His G. Las células transfectadas con vector control vacío y con PHOR-1 se tiñeron con un mAb que reconoce de forma específica el epítopo N-terminal Express o con un pAb de conejo dirigido a los 14 aminoácidos del extremo N-terminal de la secuencia de PHOR-1. Tal como se muestra en la Figura 13A y las Figuras 14A-B, las células transfectadas con PHOR-1 muestran un cambio de fluorescencia específico en comparación con las células control tanto con el mAb anti-Express como con el pAb. Este cambio indica que PHOR-1 se expresa en la superficie celular con el extremo N-terminal expuesto en la parte externa de la membrana plasmática, lo cual coincide con la topología de los receptores acoplados a proteína G conocidos. La expresión de PHOR-1 en estas células se confirmó además mediante inmunohistoquímica (véase el siguiente ejemplo).

La inmunoprecipitación y el análisis de western de la proteína PHOR-1 con la cola epítopo de las células transfectadas muestra una banda inmunoreactiva de 37 kD que coincide con el peso molecular predicho de la proteína PHOR-1, deducido de la secuencia de aminoácidos (Figura 13B). Además, se observa una pincelada inmunoreactiva de alto peso molecular en las células transfectadas con PHOR-1 que puede representar agregados de proteína insolubles en presencia de SDS y calor, mediados por la interacción hidrofóbica de los 7 dominios transmembra-
nales.

Se utilizó suero de ratones inmunizados con la proteína GST- PHOR-1 para examinar la expresión de proteína PHOR-1 endógena. Las células de cáncer de próstata LNCaP y LAPC9, que expresan ambas el mRNA de PHOR-1, presentan un cambio de fluorescencia cuando se tiñen con suero inmune en comparación con suero preinmune, lo que demuestra la expresión de proteína PHOR-1 en la superficie celular en estas poblaciones de células (Fig 16). Además, el siguiente ejemplo muestra el uso de este suero para detectar la expresión endógena de PHOR-1 en próstata normal, cáncer de próstata y líneas celulares de cáncer de próstata.

La expresión de PHOR-1 se evaluó mediante traducción in vitro libre de células. El cDNA control y el cDNA de PHOR-1 se tradujeron in vitro utilizando lisados de reticulocito de conejo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Los resultados del ensayo in vitro libre de células se muestran en la Figura 17, y demuestra que el cDNA de PHOR-1 se traduce en una proteína de 38-42 kDa, que corresponde con el peso molecular calculado de PHOR-1.

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Ejemplo 10

Detección inmunohistoquímica de PHOR-1 en próstata normal, cáncer de próstata y líneas celulares de cáncer de próstata Métodos

Se realizaron secciones de los bloques de tejido fijado en formalina e incluido en parafina de 4 micras y se colocaron sobre portaobjetos para microscopio de hueco capilar cargados positivamente (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Tras la eliminación de la cera en xileno, seguido de la hidratación mediante series de alcohol, se pretrataron las secciones de tejido en un vaporizador durante 20 minutos en presencia de citrato sódico (10 mM, pH 6,0) seguido de una incubación de 10 minutos en proteinasa K (1:40) para optimizar la reactividad del anticuerpo. Tras enfriar durante 5 minutos, los portaobjetos se inmunotiñeron utilizando la técnica de biotina-estreptavidina-peroxidasa. Brevemente, los portaobjetos se incubaron en suero de bloqueo (cabra normal) durante 5 minutos, seguido de 2 \mug/ml de anticuerpo primario policlonal de conejo anti-PHOR-1 (25 minutos), anticuerpo secundario biotinilado de cabra anti-IgG de conejo (25 min.), bloqueo de la peroxidasa endógena (3 X 1,5 minutos), y complejo de estreptavidina conjugada con la enzima peroxidasa, Vector Labs, Burlingame, CA (10 minutos). Entre cada incubación, se lavaron las secciones en tampón. Se utilizó el cromógeno DAB - diaminobencidina (QualTek Molecular Labs) para desarrollar la reacción proporcionando un precipitado marrón. Los portaobjetos se contratiñeron posteriormente con hematoxilina y se cubrieron con un cubreobjetos.

Resultados

La expresión endógena de la proteína PHOR-1 se demostró en el análisis inmunohistoquímico del anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (PÉPTIDO 1: aminoácidos 1-14) (Figura 18A-F). La tinción en cáncer de próstata es mayor que la tinción observada en próstata normal. La tinción está localizada apicalmente dentro del epitelio luminal de la próstata normal (Figuras 18E y 18F). La tinción observada en el cáncer de próstata también está localizada apicalmente en el cáncer de grado bajo a medio (Figuras 18B y 18C) y en todas las células de cáncer de próstata más avanzado (Figura 18A). La línea celular de cáncer de próstata, LNCaP también muestra una tinción similar en casi todas las células (Figuras 18D y 19F).

La especificidad del anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (PÉPTIDO 1) se demuestra en la Figura 19A-F. La línea celular modificada 293T-PHOR-1 (Figura 19B), que expresa la proteína PHOR-1 de la construcción episomal pcDNA4 HIS/MAX, y la línea celular PC3-PHOR-1 (Figura 19D), que expresa PHOR-1 de forma estable a partir de una construcción pSR\alpha integrada, muestran ambas una tinción marrón específica que no está presente en las líneas celulares parentales, no modificadas (Figuras 19A y 19C, respectivamente). La tinción en la línea celular 293T-PHOR-1 (Figura 19B) es muy fuerte en un subgrupo de células, como se puede esperar de una transfección transitoria con una construcción pcDNA4 HIS/MAX que dirige la expresión de PHOR-1 a partir de un promotor de CMV. No obstante, la tinción en la línea celular PC3-PHOR-1 (Figura 19D) está presente en todas las células observadas, como se puede esperar de una línea celular estable.

Estos datos demuestran que el anticuerpo policlonal de conejo anti-PHOR-1 (PÉPTIDO 1) reconoce de forma específica la proteína PHOR-1. Además, la tinción observada en PC3-PHOR-1 (Figura 19D) es muy parecida al patrón de tinción e intensidad vistas en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP (Figura 19F) y en cáncer de próstata (Figura 19E).

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Ejemplo 11

Alteración de la fosforilación de la tirosina y Erk mediante PHOR-1

Las células PC3, que expresan de forma estable neo o PHOR-1 en el vector retroviral pSR\alpha, se cultivaron en FBS al 1% durante la noche. Las células se dejaron entonces sin tratar o se trataron con FBS al 10% durante 3 min. Las células se lisaron y se analizaron mediante western blot con mAb anti-fosfotirosina (UBI, Lake Placid, NY) (Figura 20A), o anti-fosfo-Erk (Cell Signal, Beverly, MA) (Figura 20B). La superposición del mAb Anti-Grb2 (Transduction Laboratories, San Diego, CA) muestra una carga de proteína idéntica (Figura 20C). En la Figura 20D, se evaluó la expresión de PHOR-1 mediante northern blot. (Véase también la Figura 19D para la demostración inmunohistoquímica de la expresión de PHOR-1 por las células PC3-PHOR-1.) El RNA se extrajo de las células control PC3-neo y las células PC3 transducidas de forma estable con PHOR-1 y los blots de RNA se hibridaron utilizando la sonda de PHOR-1 (fragmento Xba-Ecor1 del clon GTH10). Se utilizó el RNA de los xenoinjertos LAPC4 como control positivo (Figura 20E). Los resultados muestran que el mRNA de PHOR-1 se expresa en las células PC3-PHOR-1 transducidas con retrovirus, pero no en las células control, y que una vez expresado, PHOR-1 altera el patrón de fosforilación de las células PC3.

La fosforilación de la tirosina juega un papel importante en los eventos de transmisión de señales de la superficie celular hacia el núcleo. Además, se ha demostrado que la fosforilación de la tirosina aparece a través del GPCR (Liebmann C, Bohmer FD. Curr Med. Chem. 2000,7:911 y Maudsley S, Pierce KL, Zamah AM, Miller WE, Ahn S, Daaka Y, Lefkowitz RJ, Luttrell LM. J. Biol. Chem. 2000, 275:9572), y resulta en la activación de las cascadas de señalización que contribuyen al efecto del GPCR. Estos resultados (mostrados en la Fig. 20A-B) indican que, cuando PHOR-1 se expresa en células PC3, induce la fosforilación de la tirosina de una proteína de 55 kDa y la desfosforilación de una proteína de 130 kDA. Además, la expresión de PHOR-1 induce un incremento de 2-3 veces en la fosforilación de Erk, que es una proteína asociada con la mitogénesis y la transformación (Greulich H, Erikson RL, J Biol Chem. 1998; 273:13280), lo que indica que PHOR-1 activa la cascada de Erk.

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Ejemplo 12

PHOR-1 modula la concentración citoplasmática del cAMP

Se compararon las células parentales y las células que expresan PHOR-1 por su capacidad de inducir la acumulación citoplasmática de cAMP. Las células 293T se transfectaron con vector pcDNA4 HIS MAX vacío o con pcDNA4 HIS MAX PHOR-1. Las células se deprivaron en suero bovino fetal al 1% (FBS) durante la noche y se incubaron con medio sólo o en presencia de FBS al 10%. Las células se lisaron y se analizó el contenido de cAMP mediante inmunoensayo ligado a enzima (EIA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Linco Research, St Charles, MI). Los resultados se muestran en la Tabla 1, e indican que la expresión de PHOR-1 altera la concentración de cAMP en respuesta a FBS.

1

Todos los GPCR caracterizados, lo que incluye los receptores olfativos, funcionan mediante la activación de la ruta del cAMP. En ausencia de ligando, los GPCR están normalmente en un estado inactivo. Tras la unión del ligando o la sobreexpresión, los GPCR adquieren una conformación activa y forman complejos con proteínas G. Esta interacción resulta en la disociación de subunidades de proteína G y la activación de la adenilato ciclasa, que resulta en la acumulación de cAMP (Birnbaumer L, Cell 1992, 71:1069). El aumento de producción de cAMP resulta en la activación de varias rutas de señalización corriente abajo que median el efecto de los GPCR. La demostración en este ejemplo que la expresión de PHOR-1 en células 293T permite la acumulación de cAMP en respuesta a FBS indica que PHOR-1 funciona como un GPCR bajo estas condiciones.

Además, el contenido de cAMP se determinó para dos xenoinjertos de cáncer de próstata que difieren en su dependencia de andrógenos y expresión de PHOR-1. LAPC4AD es un xenoinjerto de cáncer de próstata dependiente de andrógenos que muestra una fuerte expresión de PHOR-1, tal como se evidencia por el northern blot mostrado en la Figura 20E. El contenido de cAMP de estas células, también mostrado en la Tabla anterior, fue significativamente inferior que el de las células LAPC4AI, que son independientes de andrógenos y no expresan PHOR-1.

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Ejemplo 13

PHOR-1 induce el crecimiento de colonias en agar blando

Se analizaron las células NIH-3T3 que expresan de forma estable PHOR-1 por su capacidad de formar colonias en agar blando. Se utilizaron células NIH-3T3, que expresan de forma estable neo o Ras activado como controles negativo y positivo, respectivamente. El experimento se realizó por duplicado. El ensayo se evaluó 4 semanas tras la siembra de las células. Los resultados se muestran en la Figura 21 y en la Tabla 2.

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2

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El contaje de colonias muestra que PHOR-1 induce un aumento de 3 veces en la formación de colonias en relación al control neo. Este aumento significativo se observó en 2 experimentos separados. Estos resultados indican que la expresión de PHOR-1 en las células NIH 3T3 induce un aumento de 3-4 veces en la formación de colonias en comparación con un aumento de 5 veces por el potente oncogén Ras, lo que sugiere que PHOR-1 posee capacidades transformantes significativas.

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Ejemplo 14

Mapeo cromosómico del gen PHOR-1

La localización cromosómica de PHOR-1 se determinó utilizando el panel de híbridos de radiación GeneBridge4 (Walter et al., 1994, Nat. Genetics 7:22) (Research Genetics, Huntsville A1). Se utilizaron los siguientes Cebadores de PCR para localizar PHOR-1 (Id. de Sec. Nº 31, 32, respectivamente):

101P3A11.1	ATCCTGACTAGGTTGTGGTTGGAG
101P3A11.2	TGTGGTTGGGAGTTCTAAAGAGGA

El vector de mapeo resultante para los 93 DNA del panel de híbridos de radiación fue:

100000000100100001101000011110100010000201010100001100000001000011100 001000000111101100001
111

Este vector y el programa de mapeo de http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl situó a PHOR-1 en el telómero del cromosoma 11 en 11p15.5.

Como el gen PHOR-1 humano se sitúa en el cromosoma 11p15.5, se pueden utilizar polinucleótidos que codifican diferentes regiones de la proteína PHOR-1 para caracterizar las anormalidades citogenéticas en el cromosoma 11, banda p15.5 que se ha identificado que están asociadas con diferentes tipos de cáncer. En particular, se han identificado una serie de anormalidades cromosómicas en 11p15,5 como anormalidades citogenéticas frecuentes en una serie de diferentes tipos de cáncer (véase, por ejemplo, Lai et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6(8):3172-6; Oya y Schulz, 2000, Br. J. Cancer 83(5):626-31; Svaren et al., Sept. 12, 2000, J. Biol. Chem.). Como consecuencia, los polinucleótidos que codifican regiones especificas de la proteína PHOR-1 proporcionan nuevas herramientas que pueden utilizarse para delinear con mayor precisión que antes, la naturaleza específica de las anormalidades citogenéticas en esta región del cromosoma 11 que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la materia para expandir la sensibilidad del cribaje cromosómico para poder identificar anormalidades cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase, por ejemplo, Evans et al., 1994, Am. J. Obstet. Gynecol. 171(4):1055-1057).

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Ejemplo 15

Identificación de rutas potenciales de transducción de señales

Para determinar si PHOR-1 activa directa o indirectamente las rutas de transducción de señales conocidas en células, se llevaron a cabo ensayos marcadores de la transcripción basados en la luciferasa (luc) en células que expresan PHOR-1. Estos marcadores transcripcionales contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que yacen corriente abajo en las rutas de transducción de señales conocidas. Los marcadores y ejemplos de sus factores de transcripción asociados, rutas de transducción de señales, y estímulos de activación se listan a continuación.

1. NFkB-luc, NFkB/Rel; quinasa Ik/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés

2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación

3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés

4. ARE-luc, receptor de andrógeno; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

5. p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés

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Los efectos mediados por PHOR-1 pueden investigarse en células que muestran expresión de mRNA. Pueden introducirse plásmidos marcadores de Luciferasa mediante transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de la luciferasa, un indicador de la actividad transcripcional relativa, se mide mediante incubación de los extractos celulares con sustrato luciferina y la luminiscencia de la reacción se monitoriza en un luminómetro.

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Ejemplo 16

Ensayos in vitro de la función de PHOR-1

La expresión de PHOR-1 en cáncer de próstata proporciona evidencias de que este gen posee un papel funcional en la progresión tumoral y/o iniciación del tumor. Es posible que PHOR-1 funcione como receptor involucrado en la activación de las señales de proliferación. La función de PHOR-1 puede investigarse en células de mamífero utilizando aproximaciones in vitro. Para la expresión en mamíferos, PHOR-1 puede clonarse en un cierto número de vectores apropiados, lo que incluye pcDNA 3.1 myc-His-tag y el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). utilizando dichos vectores de expresión, PHOR-1 puede expresarse en varias líneas celulares, lo que incluye PC-3, NIH 3T3, LNCaP y 293T. La expresión de PHOR-1 puede monitorizarse utilizando anticuerpos anti-PHOR-1 y análisis northern blot.

Las líneas celulares de mamífero que expresan PHOR-1 pueden analizarse en varios ensayos in vitro e in vivo, lo que incluye proliferación celular en cultivo de tejidos, activación de señales apoptóticas, formación de tumores en ratones SCID, e invasión in vitro utilizando un sistema de cultivo por invasión de membrana (MICS; Welch et al., Int. J. Cancer 43: 449-457). El fenotipo celular PHOR-1 se compara con el fenotipo de células que carecen de expresión de PHOR-1.

Las líneas celulares que expresan PHOR-1 pueden también investigarse para la alteración de propiedades invasivas y migratorias midiendo el pase de células a través de una cámara de membrana porosa cubierta de matrigel (Becton Dickinson). El pase de células a través de la membrana hacia el lado opuesto se monitoriza utilizando un ensayo fluorescente (Becton Dickinson Technical Bulletin #428) utilizando células indicadoras cargadas con calcein-Am (Molecular Probes). Las líneas celulares analizadas incluyen células parentales y células PC3, NIH 3T3 y LNCaP que sobreexpresan PHOR-1. Para determinar si las células que expresan PHOR-1 poseen propiedades quimiotácicas, se monitorizan las células indicadoras por si pasan a través de la membrana porosa hacia un gradiente de medio acondicionado para PHOR-1 en comparación con medio control. Este ensayo puede también utilizarse para cualificar y cuantificar la neutralización específica del efecto inducido por PHOR-1 mediante composiciones terapéuticas candidatas para tratar el cáncer.

La función de PHOR-1 puede evaluarse utilizando tecnología de RNA antisentido acoplada a los diferentes ensayos funcionales descritos anteriormente, por ejemplo crecimiento, invasión y migración. Los oligonucleótidos de RNA antisentido pueden introducirse en células que expresan PHOR-1, previniendo así la expresión de PHOR-1. Las células que contienen control y antisentido pueden analizarse para la proliferación, invasión, migración, potencial apoptótico y transcripcional. Puede evaluarse el efecto local así como el efecto sistémico de la pérdida de expresión de PHOR-1.

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Ejemplo 17

Ensayo in vivo para la promoción de crecimiento tumoral por PHOR-1

El efecto de la proteína PHOR-1 sobre el crecimiento de células tumorales se puede evaluar in vivo mediante sobreexpresión génica en ratones portadores de tumores. Por ejemplo, los ratones SCID pueden inyectarse por vía subcutánea en cada costado con 1 x 10^{6} de cada una de las células PC3, TSUPR1, o DU145 que contienen vector tkNeo vacío o con PHOR-1. Se pueden utilizar al menos dos estrategias: (1) expresión constitutiva de PHOR-1 bajo regulación de un promotor como un promotor constitutivo obtenido de genomas de virus como el virus del polioma, virus de la viruela aviar (UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y Virus 40 de simio (SV40), o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de la inmunoglobulina, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped, y (2) expresión regulada bajo el control de un sistema de vector inducible, como ecdisona, tet, etc., siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped. Se monitoriza entonces el volumen del tumor cuando aparecen tumores palpables y se sigue durante el tiempo para determinar si las células que expresan PHOR-1 crecen a una tasa superior y si los tumores producidos por las células que expresan PHOR-1 demuestran características de agresividad alterada (por ejemplo, aumento de la metástasis, vascularización, respuesta reducida a fármacos quimioterápicos). Adicionalmente, se les puede implantar a los ratones 1 x 10^{5} de las mismas células de forma ortotópica para determinar si PHOR-1 posee un efecto en el crecimiento local en la próstata o en la capacidad de metástasis de las células, específicamente en los pulmones, nódulos linfáticos, y médula ósea.

El ensayo también es útil para determinar el efecto inhibidor sobre PHOR-1 de las composiciones terapéuticas candidatas, como por ejemplo, intracuerpos frente a PHOR-1, moléculas antisentido de PHOR-1 y ribozimas.

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Ejemplo 18

Clonaje de genes miembros de la familia de PHOR-1

PHOR-1 es homólogo a una gran familia de receptores olfativos que se expresan en el epitelio olfativo y en neuronas. En un intento de identificar genes adicionales que son homólogos a PHOR-1, la secuencia de proteínas de PHOR-1 se utilizó como sonda electrónica para identificar miembros de la familia en base de datos de EST (secuencia de expresión de colas) pública (dBest). Utilizando la función "tblastn" en el NCBI (National Center for Biotechnology Information) se hizo una búsqueda en la base de datos dBest por la secuencia de la proteína PHOR-1. El análisis reveló un nuevo miembro de la familia (Fig. 22). La EST, AI138213, se aisló de una biblioteca de placenta humana y es homóloga a la región carboxi-terminal de PHOR-1. Ésta muestra un 49,5% de identidad con PHOR-1 sobre un solapamiento de 95 aminoácidos. Se está analizando la expresión de este nuevo miembro de la familia en muestras de próstata y de cáncer de próstata y se clonará a partir de una biblioteca de cDNA humano.

Una aproximación alternativa para encontrar nuevos miembros de la familia es diseñar oligonucleótidos degenerados en regiones conservadas del gen (Raming et al., 1993, Nature 361:353). Éstos pueden utilizarse en reacciones de RT-PCR sobre la primera cadena de cDNA derivada de próstata o cáncer de próstata para aislar nuevos miembros de la familia GPCR. Para aislar miembros de la familia de PHOR-1 utilizando RT-PCR, se escogieron las siguientes regiones conservadas para el diseño de oligonucleótidos: SLHEPMY (a.a. 56-62; Id. de Sec. Nº 36), AMAFDRY (a.a. 119-125; Id. de Sec. Nº 37), YVAICHP (a.a. 125-131; Id. de Sec. Nº 38), KAFGTCV (a.a. 237-243; Id. de Sec. Nº 39), y GVKTKEI (a.a. 294-300; Id. de Sec. Nº 40). Los oligonucleótidos degenerados utilizados fueron los siguientes:

(1) para SLHEPMY: 1A-5'AGYCTNCAYSMNCCNATGTAY3' (Id. de Sec. Nº 41),

1B-5'TCNCTNCAYSMNCCNATGTAY3' (Id. de Sec. Nº 42),

1C-5'AGYTTRCAYSMNCCNATGTAY3' (Id. de Sec. Nº 43),

1D-5'TCNTTRCAYSMNCCNATGTAY3' (Id. de Sec. Nº 44);

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(2) para AMAFDRY: 2A-5'GCNATGGCNTTYGAYCGNTAY3' (Id. de Sec. Nº 45),

2B-5'GCNATGGCNTTYGAYAGRTAY3' (Id. de Sec. Nº 46);

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(3) para YVAICHP: 3A-5'TAYGTNGCNATHTGYCAYCCN3' (sentido) (Id. de Sec. Nº 47),

3B-5'NGGRTGRCADATNGCNACRTA3' (antisentido) (Id. de Sec. Nº 48);

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(4) para KAFGTCV: 4A-5'NACRCANGTNCCRAANGCYTT3' (antisentido) (Id. de Sec. Nº 49);

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(5) para GVKTKEI: 5A-5'DATYTSYTTNGTYTTNRCNCC3' (antisentido) (Id. de Sec. Nº 50);

en las que (A) representa adenina, (C) citosina, (G) guanina, (T) timina, (R) adenina o guanina, (Y) citosina o timina, (S) citosina o guanina, (D) adenina o guanina o timina, (H) adenina o citosina o timina, (N) adenina o guanina o citosina o timina.

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Se utilizó la siguiente combinación de cebadores para amplificar los miembros de la familia a partir de la primera cadena de cDNA: conjunto de 1A- 1D y 3B; conjunto de 1A-1D y 4A; conjunto de 1A-1D y 5A; conjunto de 2A+2B y 4A; conjunto de 2A+2B y 5A; 3A y 4A; 3A y 5A. Los productos de PCR resultantes se ligaron entonces en el vector PCR2.1 (Invitrogen) y se transformaron posteriormente en E. coli DH5. Tras la selección de colonias por el color azul/blanco y la selección por ampicilina en agar, las colonias blancas resistentes a ampicilina se expandieron en cultivo líquido para la purificación de plásmidos y la secuenciación de insertos de cDNA. Las secuencias de estos clones se compararon con la secuencia PHOR-1 y se buscaron en bases de datos públicas y privadas disponibles. Las secuencias que representan nuevos miembros de la familia de PHOR-1 se seleccionaron para un posterior análisis y clonaje de longitud completa.

A lo largo de esta solicitud, se ha hecho referencia a varias publicaciones. Los resultados de estas publicaciones se incorporan aquí en su totalidad por referencia.

La presente invención no debe limitarse en su alcance por las realizaciones descritas aquí, que son ilustraciones únicas de aspectos individuales de la invención, y cualquier aspecto funcionalmente equivalente está dentro del alcance de la invención. Serán evidentes a los expertos en la materia las diferentes modificaciones a los modelos y métodos de la invención, además de las descritas aquí, a partir de la descripción y enseñanzas anteriores, y de forma similar, dichas modificaciones, están dentro del alcance de la invención. Tales modificaciones u otras realizaciones pueden ponerse en práctica sin alejarse del verdadero alcance y espíritu de la invención.

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<110> Arthur B. Raitano

\hskip1cm

Daniel E.H. Afar

\hskip1cm

Aya Jakobovits

\hskip1cm

Mary Faris

\hskip1cm

Rene S. Hubert

\hskip1cm

Steve Chappell Mitchell

\hskip1cm

Douglas C. Saffran

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<120> NUEVO RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNA G SOBREEXPRESADO EN CÁNCER DE PRÓSTATA y LA UTILIZACIÓN DEL MISMO

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<130> 129.24WOU1

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<150> 60/157,902

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<151> 1999-10-05

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<160> 50

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 3136

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (133)...(1083)

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<400> 1

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4

5

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<210> 2

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<211> 317

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 320

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<212> PRT

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<213> Proteína de rata

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<400> 3

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7

8

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<210> 4

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<211> 320

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 4

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9

10

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<210> 5

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<211> 427

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<400> 5

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11

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<210> 6

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<211> 501

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(501)

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<400> 6

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12

13

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<210> 7

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<211> 163

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 7

14

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<210> 8

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 8

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15

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<210> 9

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 9

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16

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<210> 10

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 10

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17

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<210> 11

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 11

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18

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<210> 12

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 12

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19

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<210> 13

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 13

\hskip1cm

20

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<210> 14

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 14

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21

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<210> 15

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 15

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22

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<210> 16

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 16

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23

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<210> 17

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 17

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24

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<210> 18

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 18

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25

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<210> 19

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FLAG tag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

57

Claims (12)

1. El uso de un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste en:

a) un polinucleótido de Id. de Sec. Nº 1:

b) un polinucleótido de Id. de Sec. Nº 1 desde el residuo de nucleótido número 133 hasta el residuo de nucleótido número 1083; y

c) el polinucleótido contenido en el plásmido designado P101P3A11 depositado con el Nº de Registro de la American Type Culture Collection PTA-312;

como un marcador para el cáncer de próstata, de riñón, de útero, cervical, de estómago y rectal.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que el cáncer es cáncer de próstata.

3. El uso de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de forma específica al polipéptido de Id. de Sec. Nº 2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de próstata, de riñón, de útero, cervical, de estómago y rectal.

4. El uso de la reivindicación 3 en el que el anticuerpo o fragmento se conjuga con una toxina o un agente terapéutico.

5. El uso de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de forma específica al polipéptido de Id. de Sec. Nº 2 en un método para detectar el cáncer de próstata, de riñón, de útero, cervical, de estómago y rectal.

6. El uso de la reivindicación 5 en el que el anticuerpo o fragmento está marcado con un marcador detectable.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en el que el anticuerpo o fragmento es monoclonal.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en el que el fragmento es un Fab, F(ab')2, Fv o fragmento sFv.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano o comprende residuos de la región de unión murina y residuos de anticuerpo humano.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cadena única que comprende los dominios variables de las cadenas ligera y pesadas.

11. El uso de un vector que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal o fragmento específico para el péptido de Id. de Sec. Nº 2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de próstata, de riñón, de útero, cervical, de estómago y rectal.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en el que dicho método comprende contactar la muestra con un anticuerpo o fragmento que se une de forma específica al polipéptido de Id. de Sec. Nº 2, y detectar la unión de cualquier proteína en la muestra, en la que la presencia de unión indica la presencia de dicho cáncer.