ES2316473T3 - Uso de derivados de 1-azabiciclo(2.2.2)octan-3-ona para el tratamiento de tumores. - Google Patents
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Abstract
El uso de compuestos que tienen la fórmula I ** ver fórmula** en donde R 2 ó R 3 son iguales o diferentes y se eligen del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1-C 15, alquenilo C 1- C15, alquinilo C1-C15, alcoxi C1-C15, alquilamino C1-C15, arilo, aril alquilo C6-C15, carboxi alquilo C1-C15, alquilcarboxilato de alquilo C2-C15, tioalquilo C1-C15, hidroxialquilo C1-C15, en donde dichos grupos pueden estar sustituidos opcionalmente con halógeno o de 2-hidroximetil-3,3-dihidroxi-1-azabiciclo[2,2,2]octano para la preparación de producto farmacéutico para el tratamiento de cáncer.
Description
Uso de derivados de
1-azobiciclo[2.2.2]octan-3-ona
para el tratamiento de tumores cancerosos.
La presente invención se refiere al uso de
compuestos de bajo peso molecular, que son capaces de restaurar la
función inductora de apoptosis de mutante p53 para la preparación de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de cáncer.
La diana más común para las mutaciones en
tumores es el gen p53. El hecho de que aproximadamente la mitad de
todos los tumores humanos porten mutaciones de este gen es un
testimonio sólido de su papel crítico como supresor de tumores. El
p53 detiene el ciclo celular y/o activa la apoptosis en respuesta a
diversos estímulos de estrés, incluyendo el daño de ADN, la hipoxia
y la activación de oncogenes (Ko y Prives, 1996; Sherr, 1998).
Mediante la activación, el p53 inicia las respuestas biológicas
dependientes de p53 a través de la transactivación de genes diana
específicos que portan estructuras de unión de ADN de p53. Además,
la polifacética proteína p53 puede promover la apoptosis a través
de la represión de determinados genes que carecen de sitios de unión
de p53, y también mecanismos independientes de la transcripción
(Bennet y col., 1998; Gottlieb y Oren, 1998; Ko y Prives, 1996).
Los análisis realizados sobre un gran número de genes mutantes p53
en tumores humanos han revelado una fuerte selección hacia
mutaciones que desactivan la función de unión de ADN específica de
p53; la mayoría de las mutaciones de tumores son mutaciones
puntuales agrupadas en el dominio de núcleo de p53 (residuos
94-292) que aloja la actividad de unión de ADN
específica (Béroud y Soussi, 1998).
Tanto la detención del ciclo celular como la
apoptosis inducidas por p53 podrían estar implicadas en la supresión
tumoral mediada por p53. Mientras que la detención del ciclo
celular inducida por p53 podría revertirse concebiblemente de
diversas formas, la muerte celular inducida por p53 tendría la
ventaja de ser irreversible. De hecho, existen evidencias de
modelos animales in vivo (Symonds y col., 1994) y de tumores
humanos (Bardeesy y col., 1995) que indican que la apoptosis
dependiente de p53 desempeña un papel fundamental en la eliminación
de tumores emergentes, particularmente en respuesta a la
señalización oncogénica. Además, la capacidad de p53 para inducir
la apoptosis a menudo determina la eficacia de la terapia de cáncer
(Lowe y col., 1994). Teniendo en cuenta el hecho de que más del 50%
de los tumores humanos portan mutaciones de p53, parece altamente
deseable restaurar la función de supresión de crecimiento tumoral
mediada por el p53 natural. La ventaja de esta estrategia es que
permitirá una eliminación selectiva de células tumorales que portan
el p53 mutante. Las células tumorales son particularmente sensibles
a la reactivación de p53, supuestamente por dos razones principales.
En primer lugar, se sensibilizan células tumorales frente a la
apoptosis debido a la activación de oncogén (revisado en Evan y
Littlewood, 1998). En segundo lugar, las proteínas p53 mutantes
tienden a acumularse en altos niveles en las células tumorales. Por
tanto, la restauración de la función natural en el abundante y
presumiblemente "activado" mutante de p53 debería activar una
respuesta apoptótica masiva en las ya sensibilizadas células
tumorales, mientras que las células normales que expresan niveles
bajos o indetectables de p53 no deberían verse afectadas. La
posibilidad de la reactivación de p53 como estrategia anticáncer se
apoya en el hecho de que un amplio intervalo de proteínas p53
mutantes son susceptibles de reactivación. Por tanto, una estrategia
terapéutica basada en la recuperación de la apoptosis inducida por
p53 debería ser a la vez potente y ampliamente aplicable.
Considerados en conjunto, estos descubrimientos
sugieren firmemente que la restauración farmacológica de función de
p53 daría como resultado la eliminación de células tumorales. Por
consiguiente, existe una necesidad en este campo para identificar
sustancias y métodos que permitan dicha restauración de la función
de p53.
Con el anterior propósito, se ha demostrado que
la p53 es una proteína de unión específica de ADN, que actúa como
activador transcripcional de genes que controlan el crecimiento y la
muerte celular. Por tanto, la capacidad de la proteína p53 para
inducir apoptosis es dependiente de su función de unión específica
de ADN. Las proteínas p53 mutantes que portan sustituciones de
aminoácidos en el dominio del núcleo de la p53, lo que elimina la
unión específica de ADN, son incapaces de inducir apoptosis en las
células. Por tanto, con el objetivo de obtener sustancias y métodos
como los descritos, la reactivación de la unión específica de ADN de
la p53 es esencial para activar la apoptosis dependiente de p53 en
tumores durante afecciones patológicas.
La presente invención proporciona el uso de
compuestos, correspondientes a la fórmula I, que son capaces de
reactivar la función inductora de apoptosis de las proteínas p53
mutantes para preparar un producto farmacéutico para el tratamiento
de cáncer. Dicha reactivación es proporcionada por la restauración
de la actividad de unión de ADN específica de secuencia y de la
función de transactivación transcripcional de las proteínas p53
mutantes, y la modulación de los epítopos dependientes de la
conformación de la proteína p53. Por consiguiente, las sustancias
de acuerdo con la invención se usarán en composiciones farmacéuticas
y en métodos para el tratamiento de pacientes afectados por varios
tipos de tumores.
La Figura 1 A-B muestra las
estructuras moleculares de los compuestos PRIMA-1 y
MIRA-1 (no de acuerdo con la invención).
La Figura 2 A-C ilustra la
supresión de crecimiento de células tumorales que expresan p53
mutante debida a las sustancias PRIMA-1, de acuerdo
con la invención, y MIRA-1 (no de acuerdo con la
invención).
La Figura 3 A, B y C ilustra cómo las sustancias
PRIMA-1, de acuerdo con la invención, y
MIRA-1 (no de acuerdo con la invención), inducen la
apoptosis en células tumorales humanas de un modo dependiente de la
p53 mutante.
La Figura 4 A-C describe cómo
los compuestos MIRA-1 (no de acuerdo con la
invención) y PRIMA-1, de acuerdo con la invención,
conservan la conformación natural de la proteína p53.
La Figura 5 describe cómo las sustancias
PRIMA-1 y MIRA-1 (no de acuerdo con
la invención) son capaces de conservar la unión de ADN específica
de secuencia de la proteína p53 natural tras desactivación
térmica.
La Figura 6 A-B ilustra que las
sustancias PRIMA-1 y MIRA-1, no de
acuerdo con la invención, restauran la conformación natural de la
proteína p53 mutante en células.
La Figura 7 A-B ilustra cómo las
sustancias PRIMA-1, de acuerdo con la invención, y
MIRA-1 (no de acuerdo con la invención), reactivan
la proteína p53 mutante para la unión de ADN específica.
La Figura 8 ilustra la correlación entre la
capacidad de los compuestos PRIMA-1 y
MIRA-1 (no de acuerdo con la invención) para
restaurar la unión de ADN específica y la función de inducción de la
apoptosis de la p53 mutante.
La Figura 9 A-C muestra cómo
PRIMA-1 y MIRA-1 (no de acuerdo con
la invención) transactivan la expresión de genes diana de p53 de un
modo dependiente de la p53 mutante.
La Figura 11 ilustra la actividad
anti-tumoral de PRIMA-1 in
vivo.
La Figura 12 A-B ilustra la
supresión del crecimiento de células tumorales que expresan p53
mutante mediante análogos estructurales de las sustancias
MIRA-1 (no de acuerdo con la invención) y
PRIMA-1.
La Figura 13 A-G, los análogos
pueden restaurar la función de supresión del crecimiento de
diferentes mutantes de p53.
La Figura 14, inducción de p21,
MDM-2 en células Hl299 mediante
MIRA-2 (no de acuerdo con la invención),
PRIMA-2 e inducción de MDM-2 en
células SW480 mediante PRIMA-3.
La Figura 15, la supresión del crecimiento
mediante análogos es dependiente de la función de transactivación
transcripcional de la p53.
La Figura 16 muestra las estructuras moleculares
de análogos de las sustancias MIRA-1 (no de acuerdo
con la invención) y PRIMA-1.
La Tabla I ilustra cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 (no de acuerdo con
la invención) suprimen el crecimiento de diferentes líneas
celulares de tumores humanos de un modo dependiente del mutante de
p53.
La Tabla II describe cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 (no de acuerdo con
la invención) inhiben la formación de colonias de un modo
dependiente del mutante de p53.
La Tabla III describe cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 (no de acuerdo con
la invención) restauran la función de transactivación
transcripcional del mutante de p53.
La Tabla IV ilustra cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 (no de acuerdo con
la invención) restauran la unión de ADN específica de secuencia de
diferentes proteínas p53 mutantes.
La Tabla V describe cómo MIRA-3
(no de acuerdo con la invención) y PRIMA-2 inhiben
la formación de colonias de un modo dependiente del mutante de
p53.
En la presente invención se usan los siguientes
términos y expresiones:
Tal como se describe en la presente memoria, las
expresiones "sustancia S" o "compuesto S" se refieren
ambas a compuestos de acuerdo con la fórmula I mostrada a
continuación:
en
donde
R_{2} ó R_{3} son iguales o diferentes y se
eligen del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{15}, alquenilo
C_{1}-C_{15}, alquinilo
C_{1}-C_{15}, alcoxi
C_{1}-C_{15}, alquilamino
C_{1}-C_{15}, arilo, aril alquilo
C_{6}-C_{15}, carboxi alquilo
C_{1}-C_{15}, alquilcarboxilato de alquilo
C_{2}-C_{15}, tioalquilo
C_{1}-C_{15}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{15}, en donde dichos grupos pueden
estar sustituidos opcionalmente con halógeno. Un compuesto
preferido es la
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona,
que se muestra a continuación. Este compuesto también recibe el
nombre de PRIMA-1.
Otro compuesto preferido de acuerdo con la
fórmula I es la 9-(azabiciclo[2,2,2]
octano-3-ona)-6-cloro-9H-purina,
que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describe en la presente memoria, las
expresiones "sustancia F" o "compuesto F" se refieren
ambos a compuestos de acuerdo con la fórmula II (no de acuerdo con
la invención) mostrada a continuación:
en
donde
R_{1} se elige del grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{15}, alquenilo
C_{1}-C_{15}, alquinilo
C_{1}-C_{15}, alcoxi
C_{1}-C_{15}, alquilamino
C_{1}-C_{15}, arilo, aril alquilo
C_{6}-C_{15}, carboxi alquilo
C_{1}-C_{15}, alquilcarboxilato de alquilo
C_{2}-C_{15}, tioalquilo
C_{1}-C_{15}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{15}, en donde dichos grupos pueden
estar sustituidos opcionalmente con halógeno. Un compuesto
preferido es la
1-N-(1-propioniloximetil)-maleimida,
que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto también recibe el nombre de
MIRA-1 (no de acuerdo con la invención). Otros
compuestos de acuerdo con la fórmula II son
N-acetiloxi-metil-maleimida
y N-hidroximetil-maleimida.
El término "halógeno", "halo" o
"haluro" se refiere a un átomo de cloro, bromo o yodo. El
término "estereoisómero" se refiere a un compuesto constituido
por los mismos átomos enlazados mediante los mismos enlaces pero con
diferentes estructuras tridimensionales que no son
intercambiables.
Un compuesto de la invención puede estar en
forma libre, por ejemplo, en forma anfotérica, o en forma de sal,
por ejemplo sal de adición ácida o aniónica. Un compuesto en forma
libre puede ser convertido a forma sal de un modo conocido en la
técnica, y viceversa.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos de fórmula I (en forma de productos solubles o
dispersables en agua o en aceite) incluyen las sales no tóxicas
convencionales o las sales de amonio cuaternarias de dichos
compuestos, que se forman, por ejemplo, a partir de ácidos o bases
inorgánicos u orgánicos. Los ejemplos de dichas sales de adición
ácida incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato,
bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, camforato,
camforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato,
dodecilsulfato, etanosulfonato, furmarato, glucoheptanoato,
glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro,
hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato,
lactato, maleato, metanosulfonato,
2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato,
paemoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato,
picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato,
tosilato y undecanoato. Las sales básicas incluyen sales de amonio,
sales de metal alcalino tales como sales sódicas y potásicas, sales
de metal alcalinotérreo tales como sales de calcio y de magnesio,
sales con bases orgánicas tales como sales de diciclohexilamina,
N-metil-D-glucamina,
y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina y otros
similares. Asimismo, los grupos básicos que contienen nitrógeno
pueden ser cuaternizados con agentes tales como haluros de alquilo
inferiores, tal como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo,
propilo y butilo; dialquil sulfatos como los dimetil, dietil,
dibutil y diamil sulfatos, haluros de cadena larga tales como
cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y
estearilo, haluros de aralquilo como los bromuros de bencilo y
fenetilo, y otros.
En general, tal como se usa en la presente
memoria, el término "alquilo" incluye las manifestaciones
lineales, de cadena ramificada y cíclicas del mismo, a menos que se
indique lo contrario, particularmente restos tales como metilo,
etilo, isopropilo, n-butilo,
t-butilo,
-CH_{2}-t-butilo, ciclopropilo,
n-propilo, ventilo, ciclopentilo,
n-hexilo, ciclohexilo y ciclohexilmetilo. Lo mismo
es aplicable a los términos "alquenilo" y "alquinilo". El
término "aralquilo", cuando se emplea, incluye aquellos restos
arilos unidos a un resto puente de alquileno, preferiblemente
metileno o etileno.
"Arilo" incluye tanto restos carbocíclicos
como heterocíclicos de los cuales fenilo, piridilo, pirimidinilo,
piracinilo, indolilo, indazolilo, furilo y tienilo son los de más
interés; incluyendo estos restos sus isómeros de posición tales
como, por ejemplo, 2-, 3- ó 4-piridilo, 2- ó
3-furilo y tienilo, 1-, 2- ó
3-indolilo o el 1- y 3-indazolilo,
así como los análogos dihidro y tetrahidro de los restos furilo y
tienilo. También se incluyen en el término "arilo" restos
carbocíclicos fusionados como pentalenilo, indenilo, naftalenilo,
azulenilo, heptalenilo, acenaftilenilo, fluórenlo, fenalenilo,
fenantrenilo, antracenilo, acefenantrilenilo, aceantrilenilo,
trifenilenilo, pirenilo, crisenilo y naftacenilo. También se
incluyen en el término "arilo" otros radicales heterocíclicos
como 2- ó 3-benzo[b]tienilo, 2- ó 3-
nafto[2,3-b]tienilo, 2- ó 3-
tiantrenilo, 2H-piran-3-(ó 4- ó
5-)ilo, 1-isobenzo-furanilo,
2H-cromenil-3-ilo,
2- ó 3- fenoxatiinilo, 2- ó 3-pirrolilo, 4- ó
3-pirazolilo, 2-piracinilo,
2-pirimidinilo, 3-piridacinilo,
2-indolicinilo, 1-isoindolilo,
4H-quinolicin-2-ilo,
3-isoquinolilo, 2-quinolilo,
1-ftalacinilo, 1,8-naftiridinilo,
2-quinoxalinilo, 2-quinazolinilo,
3-cinolinilo, 2-pteridinilo,
4aH-carbazol-2-ilo,
2-carbazolilo,
beta-carbolin-3-ilo,
3-fenantridinilo, 2-acridinilo,
2-perimidinilo, 1-fenacinilo,
3-isotiazolilo, 2-fenotiacinilo,
3-isoxazolilo, 2-fenoxacinilo,
3-isocromanilo, 7-cromanilo,
2-pirrolin-3-ilo,
2-imidazolidinilo,
2-imidazolin-4-ilo,
2-pirazolidinilo,
3-pirazolin-3-ilo,
2-piperidilo, 2-piperacinilo,
1-indolinilo, 1-isoindolinilo,
3-mofolinilo, benzo[b]isoquinolinilo y
benzo[b]furanilo, incluyendo los isómeros de posición
de los mismos excepto porque los restos heterocíclicos no pueden
estar unidos directamente a través de su átomo de nitrógeno, uno,
dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre
alquilo C_{1-6}, haloalquilo, alcoxi, tioalcoxi,
aminoalquilamino, dialquilamino, hidroxi, halo, mercapto, nitro,
carboxaldehído, carboxi, carboalcoxi y carboxamida.
Todos los restos
C_{1}-C_{15} son preferiblemente restos
C_{1}-C_{6}, y todos los restos
C_{1}-C_{6} tales como alquilo
C_{1}-C_{6}, alquenilo
C_{1}-C_{6}, alcoxi
C_{1}-C_{6} e hidroxialquilo
C_{1}-C_{6} son más preferiblemente restos
C_{1}-C_{3} (que contienen 1-3
átomos de carbono en lugar de 1-6 átomos de
carbono).
Un "derivado" es una sustancia modificada
mediante la variación de la estructura química de las sustancias F
y/o S originales. Dichos derivados de las sustancias pueden implicar
la inserción, eliminación o sustitución de uno o más grupos
funcionales sin alterar fundamentalmente la actividad esencial de la
sustancia.
Un "equivalente funcional" significa una
sustancia que puede no contener un fragmento o porción activa de F
y S pero que tiene alguna o todas las propiedades de las sustancias
F y S, en particular la propiedad de reactivar la función inductora
de apoptosis de p53 mutante mediante unión con la misma. Más
específicamente, un equivalente funcional preferido puede ser un
compuesto en el que parte o toda la estructura es reemplazada por
otra estructura. Dicho equivalente funcional de acuerdo con la
invención proporcionará una disposición espacial de los restos
químicos reactivos que se asemeja en gran medida a la disposición
tridimensional de grupos activos de las sustancias F y/o S de
acuerdo con la presente invención. Como resultado de esta geometría
de sitios activos similar, el equivalente funcional tiene efectos
sobre sistemas biológicos que son similares a la actividad biológica
de las moléculas originales.
Un "resto funcional" significa una molécula
que no es una sustancia derivada de F y/o S, por ejemplo una
molécula de marcador, fármaco o vehículo.
El término "marcador" tal como se usa en la
presente memoria significa un resto, que ha sido unido, tanto
covalentemente como no covalentemente, a la sustancia de la presente
con el objetivo de proporcionar una señal detectable. De este modo,
dicho "marcador" puede detectarse mediante sistemas
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o
químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P,
colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas
(por ejemplo, como los usados habitualmente en un ELISA), biotina,
dioxigenina o haptenos y proteínas para las cuales se dispone de
antisueros o anticuerpos monoclonales (por ejemplo, la sustancia de
la fórmula puede hacerse detectable, por ejemplo, incorporando un
radiomarcador en una sustancia, o puede usarse para detectar
anticuerpos específicamente cultivados contra la sustancia).
El término "anticuerpo" se refiere a un
polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina
o por genes de inmunoglobulina, o por fragmentos de los mismos, que
se unen específicamente y reconocen un analito (antígeno).
Por consiguiente, en un primer aspecto, la
presente invención se refiere a la sustancia S capaz de restaurar
la conformación natural y la unión de ADN específica de secuencia,
la transactivación transcripcional, y las funciones inductoras de
apoptosis de p53 mutante. La sustancia S comprende
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona
(PRIMA-1) (Figura 1B) o un equivalente funcional de
dicha estructura. Por tanto, debe entenderse que dicha sustancia no
necesita ser idéntica a la estructura de la fórmula I, sino que
puede incluir variaciones, siempre que se mantenga su actividad.
Por tanto, dicha sustancia también puede ser un derivado de la
estructura de fórmula I, o una porción activa de la misma. En este
contexto, una "porción activa" significa una porción de la
sustancia S que contiene menos grupos que la estructura completa de
la anterior sustancia, pero que mantiene la propiedad de rescatar
la función de la p53 mutante. También debe entenderse que en la
presente solicitud, la p53 humana es particularmente preferida,
incluso aunque también puedan contemplarse otras moléculas p53 de
otros orígenes.
Por tanto, aunque el documento WO 93/24525
sugirió que las secuencias de aminoácidos derivadas de la proteína
humana p53 pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos que
incluyen una sobreexpresión de p53, la presente invención es la
primera que especifica que el compuesto de bajo peso molecular S es
capaz de ejercer dicho efecto a través de la reactivación de la
función inductora de apoptosis de la proteína p53 mutante.
Más específicamente, la sustancia de acuerdo con
la invención es capaz de proporcionar dicha reactivación de la
función inductora de apoptosis de la p53 a través de la restauración
de la actividad de unión de ADN específica de secuencia con la p53
mutante (por defecto). De este modo, incluso aunque la patente WO
95/19367 sugiera que la unión de p53 a sitios de unión de ADN puede
influir en la expresión de los genes reguladores de apoptosis, la
reactivación de la función inductora de apoptosis de p53 mutante por
acción de la sustancia S nunca ha sido identificada antes de la
presente invención.
En una realización preferida de la invención, la
sustancia o equivalente funcional de la misma se acopla a un resto
funcional, lo que aumenta el efecto reactivante de p53 de dicha
sustancia. Tal como se ha mencionado antes, dicho resto puede ser
por ejemplo una molécula de marcador, de fármaco o de vehículo. En
una realización, el resto funcional es una molécula vehículo
acoplada a la presente sustancia. En una realización alternativa, el
resto funcional es una molécula reactivante de p53.
Por tanto, en una realización, la presente
sustancia se acopla a un marcador, proporcionando una señal
detectable. Una amplia variedad de marcadores y técnicas de
conjugación son conocidas y se han publicado extensivamente, tanto
en bibliografía científica como de patentes. Los marcadores
adecuados incluyen diversos radiomarcadores, enzimas, sustratos,
cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos
quimioluminiscentes, partículas magnéticas y otros similares.
En relación a la preparación de la presente
sustancia, se encuentran métodos generales por ejemplo en March
1987. Una vez sintetizadas, las moléculas de acuerdo con la
invención pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar
en la técnica, que incluyen la purificación por HPLC u otras
técnicas cromatográficas, electroforesis de gel y otros similares,
véase de forma general Scopes, Protein Purification,
Springer-Verlag, NY, 1982. Para la preparación de
equivalentes funcionales, se pueden encontrar técnicas para el
desarrollo de nuevas composiciones de mayor potencia y/o de mayor
biodisponibilidad y/o de mayor estabilidad que las sustancias
originales en, por ejemplo,
March 1987.
March 1987.
La patente WO 95/17213 se refiere a moléculas
que se unen al mismo ADN que la p53, mediante lo cual puede
activarse la transcripción de la misma. Por tanto, aunque se refiere
a la activación de la transcripción de genes regulados por p53, la
WO 95/17213 resuelve otro problema que el de la presente invención
mediante el uso de moléculas diferentes.
La patente WO 97/14794 y una publicación de
Foster y col. (1999) también se refieren al problema de cómo activar
la actividad de unión de ADN específico de secuencia de p53
latente. Para lograrlo, se usa un fragmento del dominio regulador
C-terminal de la p53, o compuestos de bajo peso. Sin
embargo, el dominio regulador C-terminal (WO
97/14794) se usó para activar la proteína p53 natural y no la
mutante, como se describe en la presente invención. Además, la base
de la presente invención la forman compuestos sintéticos de bajo
peso molecular que tienen un farmacóforo diferente del descrito en
Foster y col. (1999).
Por consiguiente, se han identificado compuestos
de bajo peso molecular que pueden usarse para reactivar la función
inductora de apoptosis de la p53. La restauración de la función en
p53 mutante se puede lograr en células vivas mediante el
tratamiento de dichas células con las sustancias en medio de cultivo
de tejidos. Además, también se ha descubierto que la sustancia S es
capaz de reactivar la actividad de unión de ADN específica de
secuencia de la p53. Se demuestra que la sustancia S restaura la
unión de ADN de la p53 in vitro y la función de
transactivación de la p53 en células vivas.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende una sustancia
de acuerdo con la invención, y tal como se ha definido antes, junto
con un vehículo farmacéutico aceptable. Las composiciones
farmacéuticas de acuerdo con la invención, y para su uso de acuerdo
con la invención, pueden comprender, además de una de las
anteriores sustancias, un excipiente, tampón o estabilizante
farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro material bien
conocido por los especialistas en la técnica y apropiado para la
aplicación pretendida. Dichos materiales deberían ser no tóxicos y
no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. Los
ejemplos de técnicas y protocolos para este fin pueden, por ejemplo,
encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición,
Osol, A. (ed.), 1980.
La composición de acuerdo con la invención puede
prepararse para cualquier ruta de administración, por ejemplo,
oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular o
intraperitoneal. La naturaleza precisa del vehículo o de otro
material dependerá de la ruta de administración. Para una
administración parenteral, se emplea una disolución acuosa
parenteralmente aceptable, que esté libre de pirógeno y que tenga un
pH, una isotonicidad y una estabilidad requeridas. Los
especialistas en la técnica son capaces de preparar disoluciones
adecuadas y en la bibliografía se describen numerosos métodos (para
una breve revisión de métodos de administración de fármacos, véase
Langer, Science 249: 1, 527-1533 (1990)). Se pueden
incluir, según se requiera, conservantes, estabilizantes, tampones,
antioxidantes y/u otros aditivos. Los especialistas en la técnica
pueden determinar los niveles de dosis, teniendo en cuenta el
trastorno que se va a tratar, la condición del paciente concreto,
el sitio de administración, el método de administración y otros
factores. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados
anteriormente pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed.). 1980.
En otra realización, la composición de acuerdo
con la invención comprende además uno o más reactivantes de p53
adicionales.
Un tercer objetivo de la presente invención es
el uso de las sustancias definidas anteriormente como medicamento.
En particular, la invención se refiere al uso de dichas sustancias
como medicamentos para el tratamiento de tumores humanos de
diferente origen que contienen proteína p53 mutante o natural. Por
consiguiente, la presente invención también se refiere al uso de
las sustancias definidas anteriormente en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de tumores humanos.
Otro aspecto de la invención es un método de
escrutinio de compuestos capaces de restaurar la función de
supresión del crecimiento a proteínas p53 mutantes, en el que se
usan las sustancias de acuerdo con la invención. Las presentes
sustancias pueden usarse en métodos de escrutinio de: compuestos que
tengan una o más de las actividades biológicas de las sustancias
descritas antes, o compuestos que estén unidos al mismo sitio de una
molécula de p53. Convencionalmente, los compuestos candidatos
pueden seleccionarse de una biblioteca combinatoria sintética. Los
ejemplos de procedimientos de escrutinio de equivalentes
incluyen:
A. Sembrar células que expresen p53 mutante bajo
el control de un promotor regulable (por ejemplo mediante
tetraciclina) en placas de microtitulación de 96 pocillos, seguido
de un tratamiento con una biblioteca de compuestos de bajo peso
molecular, y detectar la supresión del crecimiento ejercida por los
compuestos candidatos usando el reactivo WST-1
(Roche) 24-48 horas después del tratamiento.
B. Usar las sustancias y una biblioteca de
compuestos candidatos no marcados para encontrar compuestos
candidatos que presenten sinergias con las sustancias en la
restauración de la función de supresión del crecimiento a la p53
mutante.
Un aspecto adicional de la invención es un
método para diseñar un compuesto orgánico capaz de reactivar la
función de supresión del crecimiento de proteínas p53 mutantes, en
donde se usa una sustancia de acuerdo con la invención como
compuesto "líder". En una realización preferida del mismo, el
compuesto orgánico se modela para asemejarse a la estructura
tridimensional de la fórmula I o de un fragmento más corto de dicha
estructura, que exhiba de forma preferible sustancialmente la misma
actividad.
El diseño de equivalentes de un compuesto
farmacéuticamente activo conocido es una estrategia conocida para
el desarrollo de compuestos farmacéuticos basada en un compuesto
"líder". Esto puede ser deseable si el compuesto activo es
difícil o caro de sintetizar, o si presenta un efecto tóxico, o
cuando no es adecuado para un método de administración particular.
El diseño, síntesis y evaluación de equivalentes se usa generalmente
para evitar el escrutinio aleatorio de un número grande de
moléculas en busca de una propiedad fijada como objetivo.
Existen varias etapas incluidas comúnmente en el
diseño de una forma equivalente a partir de un compuesto que tenga
una propiedad objetivo dada. En primer lugar, se determinan las
partes concretas del compuesto que son críticas y/o importantes
para determinar la propiedad objetivo. Esto puede hacerse variando
sistemáticamente los grupos laterales de la sustancia, por ejemplo,
sustituyendo un grupo cada vez. Las partes de las sustancias que
constituyen la región activa del compuesto son conocidas como sus
"farmacofóros".
Una vez descubierto el farmacóforo, su
estructura se modela de acuerdo con sus propiedades físicas, por
ejemplo, su estereoquímica, sus enlaces, su tamaño y/o su carga,
usando datos procedentes de una serie de fuentes (técnicas
espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y RMN). El análisis
computacional, el mapeo de similitud (que modela la carga y/o el
volumen de un farmacóforo, más que los enlaces entre átomos) y otras
técnicas pueden usarse en este proceso de modelización.
En una variante de esta estrategia, se modela la
estructura tridimensional del ligando y su pareja de unión. Esto
puede ser especialmente útil cuando un ligando y/o su pareja de
unión cambian de conformación al unirse, permitiendo que un modelo
tome nota de este hecho en el diseño del equivalente.
A continuación se selecciona una molécula
plantilla sobre la cual se pueden anclar grupos químicos que imiten
al farmacóforo. La molécula plantilla y los grupos químicos anclados
a ella pueden seleccionarse convencionalmente de tal modo que el
equivalente sea fácil de sintetizar, tenga probabilidad de ser
farmacológicamente aceptable, y no se degrade in vivo, a la
vez que mantenga la actividad biológica del compuesto líder. El
equivalente o equivalentes obtenidos de este modo pueden a
continuación ser escrutados para ver si tienen la propiedad
objetivo, o hasta qué punto la presentan. Se puede llevar a cabo una
optimización o modificación adicional para llegar a uno o más
equivalentes finales para la evaluación clínica o in
vivo.
En este contexto, los métodos descritos en la
bibliografía permiten un escrutinio eficaz de bibliotecas en busca
de actividades de unión deseadas (véase Pluckthun & Ge, Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 30, 296-298 (1991); las
patentes de EE.UU. Nºs 5 733 731; 5 872 015 y 5 612 895. Además, en
la bibliografía se dispone de algoritmos para realizar
comparaciones de bases de datos tridimensionales, véase por ejemplo,
Cooper y col., J. Comput.-Aided Mol. Design, 3:
253-259 (1989) y las referencias citadas; Brent y
col., J. Comput.-Aided Mol. Design, 2: 311-310
(1998) y las referencias citadas. También se dispone de software
comercial para dichas búsquedas a partir de casas tales como Day
Light Information Systems, Inc., Irvine, California 92714, y
Molecular Design Limited, 2132 Faralton Drive, San Leandro,
California 94577.
Finalmente, la presente invención también se
refiere a métodos de tratamiento médico en donde se usan las
sustancias de acuerdo con la invención.
Figura 1: muestra fórmulas estructurales de
1-(Propoximetil)-maleimida (A) y
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona
(B).
Figura 2: ilustra cómo las sustancias
MIRA-1 y PRIMA-1 suprimen el
crecimiento de células que expresan p53 mutante, pero no afectan al
crecimiento de células que carecen de expresión de p53. Más
específicamente, la Figura 2A muestra cómo los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1 suprimen el
crecimiento de células Saos-2
His-273 que expresan p53 mutante. Por el contrario,
el efecto del tratamiento sobre células Saos-2 que
carecen de expresión de p53 fue bastante menor. El gráfico ilustra
la diferencia entre la viabilidad de las células tratadas con los
compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 en
presencia y en ausencia de p53 mutante, expresado como el porcentaje
de reducción de reactivo de proliferación celular
WST-1 en comparación con las células no tratadas. El
grado de reducción de WST-1, que refleja un número
de células vivas, se midió mediante un lector de microplacas a una
\lambda de 490 nm de acuerdo con el fabricante (Roche). La
supresión de crecimiento se calculó como la diferencia en
absorbancia a \lambda 490 nm entre las células no tratadas y las
tratadas, y se expresa como porcentaje respecto al control no
tratado. Supresión de crecimiento = 100% x (Absorbancia_{control}
- Absorbancia_{tratadas})/Absorbancia_{control}. Se
identificaron dos compuestos, el compuesto MIRA-1 y
el PRIMA-1, que suprimían el crecimiento celular de
células que expresan p53 mutante pero que no afectan al crecimiento
de células que carecen de expresión de p53. Figura 2B: muestra que
PRIMA-1 suprime el crecimiento de 3 líneas
celulares que expresan mutantes His-273 y
His-175 de p53 bajo el control de promotor
dependiente de doxiciclina. En estas tres líneas celulares, el
PRIMA-1 muestra efecto de supresión del crecimiento
en células de un modo dependiente del mutante de p53. Figura 2C:
muestra curvas de crecimiento de células
Saos-2-His-273
tratadas con PRIMA-1 en ausencia o en presencia de
p53 mutante. Figura 2D: muestra que los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 suprimen
predominantemente el crecimiento de células que expresan p53
mutante. La capacidad de los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 para suprimir el crecimiento se evaluó
usando 16 líneas celulares con diferente estatus de p53: células
que no expresan p53 (nulas en p53), células que expresan p53 natural
y células que expresan diferentes proteínas p53 mutantes. La
instalación experimental fue la descrita en la Figura 2A. Las
diferencias en la viabilidad fueron estadísticamente significativas
según un ensayo-t independiente.
Figura 3: ilustra la inducción de apoptosis
dependiente de p53 ejercida por PRIMA-1 y
MIRA-1 en la línea celular
Saos-2-His-273. Más
específicamente, la Figura 3A muestra cómo los inhibidores de
caspasa suprimen la inducción de muerte celular por los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 en células
Saos-2-His-273. La
inducción de apoptosis se determinó mediante análisis FACS de
células fijadas con etanol teñidas con yoduro de propicio (PI) como
porcentaje de una población sub-G1. Se añadieron
inhibidores de caspasa Z-DEVD-FMK y
BOC-D-FMK (Enzyme Systems Products,
CA) a Saos-2-His-273
cultivadas en ausencia de doxiciclina a una concentración de 5
\mug/mL antes del tratamiento con compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 (25 \muM y 100
\muM, respectivamente). El porcentaje de células muertas en los
cultivos no tratados en los controles tratados solo con inhibidores
de caspasa fue sustraído. Figura 3B: representa la tinción TUNEL de
células
Saos-2-His-273
tratadas con PRIMA-1 en una concentración 25 \muM
durante 48 horas. Se usó tinción Hoechst para teñir los núcleos
celulares. Figura 3C: muestra la inducción de apoptosis ejercida
por los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1
en células Saos-2 y
Saos-2-His-273. Se
midió el porcentaje de células apoptóticas mediante análisis FACS
tal como se ha descrito en la Figura A. Panel superior: se indujo
apoptosis en células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 (no doxiciclina) después de 48 horas de tratamiento
con MIRA-1 10 \muM, pero no en células
Saos-2 nulas en p53 con sustancias
PRIMA-1 (50, 75 y 125 \muM) y
MIRA-1 (10 \muM). Panel inferior, se indujo
apoptosis mediante PRIMA-1 (50, 75 y 125 \muM) en
células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 mutante, mientras que en ausencia de expresión de p53
en células Saos-2, la sustancia
PRIMA-1 fue mucho menos eficaz.
Figura 4: muestra cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 estabilizan la
conformación nativa (natural) de p53 usando ELISA. Más
específicamente, la Figura 4A ilustra cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 conservan el
epítopo PAb1620 dependiente de conformación tras desactivación
térmica de proteínas p53 mediante incubación durante 30 minutos a
37ºC. Panel superior, proteína p53 natural GST; panel medio,
proteína p53 mutante GST-His-175;
panel inferior, proteína p53 mutante
GST-Gln-248. Las preparaciones de
proteína fueron calentadas en presencia o en ausencia de
PRIMA-1 y MIRA-1 y se analizaron
mediante ELISA. Se tomó como 100% la absorbancia de la muestra de
control incubada en hielo. Figura 4B: muestra cómo los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 previenen el
despliegue de proteínas p53 medido a través de la aparición de
epítopo PAb240 en proteínas p53 tras calentar a 37ºC. Panel
superior, proteína p53 natural GST; panel inferior, proteína p53
mutante GST-His-175. Figura 4C:
muestra que PRIMA-1 y MIRA-1 no
afectan al epítopo DO1 independiente de la conformación. No se
observaron cambios en el epítopo D0-1 tras
incubación de las proteínas p53 a 37ºC. Panel superior, proteína p53
natural GST; panel inferior, proteína p53 mutante
GST-Gln-248.
Figura 5: ilustra la conservación de la unión de
ADN específica de la proteína p53 natural GST por acción de las
sustancias PRIMA-1 y F. El ensayo de desplazamiento
de banda llevado a cabo esencialmente como se ha indicado antes
(Selivanova y col., 1996). La proteína p53 natural GST se desactivó
mediante 30 minutos de incubación a 37ºC en presencia o en ausencia
de las sustancias PRIMA-1 y MIRA-1,
y a continuación se evaluó su unión de ADN. En las bandas 1 y 2, se
añadieron PRIMA-1 y anticuerpo monoclonal PAb421.
Banda 3, desactivación de unión de ADN de wtp53 mediante
calefacción. Bandas 4-7 y 8-11,
restauración de la unión de ADN específica mediante incubación con
concentraciones crecientes de los compuestos MIRA-1
y PRIMA-1, respectivamente.
Figura 6: muestra la restauración de epítopo
PAb1620 de p53 natural en células
SKOV-His-175 que expresan el
mutante His-175 de p53. Se usó anticuerpo monoclonal
PAb1620 de ratón para detectar la conformación natural de la p53,
mientras que la tinción con anticuerpo policlonal de conejo
anti-p53 muestra el nivel global de p53. Los
núcleos celulares fueron teñidos con Hoechst. Figura 6A, aparición
de epítopo PAb1620 tras tratamiento con PRIMA-1.
Figura 6B, restauración de epítopo PAb1620 tras incubación con
MIRA-1.
Figura 7: muestra la restauración de la unión de
ADN específica de la proteína p53 mutante
GST-His-175 por acción de los
compuestos PRIMA-1 y MIRA-1. Figura
7A: Bandas 1-3, la p53 mutante
GST-His-175 es incapaz de unirse a
ADN. Bandas 4-6 y bandas 7-9,
restauración de la unión de ADN específica de la p53 mutante
mediante incubación con concentraciones crecientes (45 ng, 450 ng y
18 \mug) de los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1, respectivamente. Se añadió anticuerpo
PAb421 a todas las mezclas de reacción. Figura 7B: los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de
restaurar la unión de ADN específica de secuencia de la p53 mutante
endógena Trp-282 en extractos celulares procedentes
de células BL-60 de linfoma de Burkitt, detectada a
través de un ensayo de desplazamiento de banda. Banda 1, la p53
mutante endógena Trp-282 en extractos celulares
procedentes de células BL60 de linfoma de Burkitt no se une a ADN.
Bandas 2 y 9, los anticuerpos monoclonales PAb421 y/o PAb1801 no
restauran la unión de ADN de la p53 mutante Trp-282.
La incubación con concentraciones crecientes (90 ng, 900 ng y 18
\mug) de compuesto MIRA-1 (bandas
3-5 y 10-12) o de compuesto
PRIMA-1 (bandas 6-8 y
13-15) restauró la unión de ADN de la proteína p53
mutante Trp-282. Se añadió anticuerpo monoclonal
PAb421 a las mezclas de reacción en las bandas 2-8;
se añadió PAb1801 a las mezclas de reacción en las bandas
9-15.
Figura 8: ilustra la correlación entre la
capacidad de los compuestos PRIMA-1 y
MIRA-1 para restaurar la unión de ADN específica y
la función inductora de apoptosis de la p53 mutante. Más
específicamente, la función inductora de apoptosis de la proteína
p53 mutante Phe-176 en células de carcinoma renal
KRC/Y no fue restaurada por los compuestos PRIMA-1
y MIRA-1, al contrario que la p53 mutante
His-273 en células
Saos-2-His-273,
determinado mediante análisis FACS. El porcentaje de células
apoptóticas fue detectado mediante análisis FACS tal como se ha
descrito en la Figura 3A. La apoptosis se indujo en células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 (no doxiciclina) después de 48 horas de tratamiento
con las sustancias PRIMA-1 y MIRA-1,
pero no es células KRC/Y o en células Saos-2 nulas
en p53.
Figura 9: demuestra la restauración de la
actividad de transactivación transcripcional a p53 mutante por
acción de PRIMA-1 y MIRA-1. Figura
9A: PRIMA-1 y MIRA-1 indujeron el
informador LacZ que responde a p53 natural en células
A-431 que portan p53 mutante
His-273. Figura 9B: la activación dependiente de p53
mutante del informador EGFP que responde a p53 natural en células
SKOV-His-175 tratadas con
PRIMA-1. Sólo las células cultivadas en ausencia de
doxiciclina (p53 mutante express) mostraron expresión EGFP. Figura
9C, el MIRA-1 indujo informador EGFP que responde a
p53 natural en células
SKOV-His-175.
Figura 10: demuestra la inducción de los genes
diana de p53, p21 y MDM-2. Figura 10A: muestra la
inducción de p21 y MDM-2 endógenas en células
H1299-His-175 tratadas con 25 \muM
de PRIMA-1 o con 10 \muM de
MIRA-1. La expresión de proteínas se analizó usando
análisis de transferencia Western. Figura 10B: muestra que los
genes diana de p53 en células
H1299-His-175 son inducidos por
PRIMA-1 sólo en presencia de p53 mutante. Figura
10C: representa la inducción de genes diana de p53 en células de
carcinoma de colon SW480 tratadas con PRIMA-1 que
portan p53 mutante His-273/Ser-309.
La sustancia PRIMA-1 no indujo los mismos genes
diana de p53 en células de carcinoma de colon
HCT-116 que portan p53 natural.
Figura 11: describe una actividad
anti-tumoral de PRIMA-1. Se
inyectaron células
Saos-2-His-273 a
ratones SCID. Intravenosamente (20 ó 100 mg/kg) o intratumor (20
mg/kg). La inyección con PRIMA-1 comenzó 3 días
después de la inyección de células y continuó durante 3 días
consecutivos dos veces por día. Se midieron los volúmenes de los
tumores una vez cada tres días después de dos meses.
Figura 12: ilustra como los análogos
estructurales de MIRA-1 (Figura 12A) y
PRIMA-1 (Figura 12B) suprimieron el crecimiento de
células que expresan p53 mutante pero no afectaron a las células sin
expresión de p53. Los análogos de MIRA-1:
MIRA-2, MIRA-3 y los análogos de
PRIMA-1: PRIMA-2,
PRIMA-3 inhibieron el crecimiento de células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 mutante medido 48 horas después del tratamiento. El
gráfico muestra que los compuestos PRIMA-2,
PRIMA-3 y MIRA-2,
MIRA-3 suprimieron selectivamente el crecimiento de
células que contenían p53 mutante en concentraciones menores a las
de los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1
originales. El sistema experimental fue el descrito en la Figura
2A.
Figura 13: muestra cómo los análogos de
PRIMA-1 y MIRA-1 pueden suprimir el
crecimiento de células que expresan diferentes p53 mutantes bajo el
control de promotor dependiente de tetraciclina (la célula no
expresa p53 mutante en presencia de doxiciclina). Figura 13A,
PRIMA-2 y PRIMA-3 restauraron la
función de supresión del crecimiento de p53 mutante
His-175 en células SKOV. Figura 13B,
PRIMA-3 reactivó el mutante Trp-248
de p53 en células de adenocarcinoma de pulmón H1299. Figura 13C,
MIRA-2 y MIRA-3 restauraron la
función de supresión del crecimiento de mutante
His-175 de p53 en células SKOV. Figura 13D,
MIRA-2 y MIRA-3 restauran la función
de supresión de crecimiento de mutante His-273 de
p53 en células SKOV. Figura 13E, MIRA-3 restauró la
función de supresión de crecimiento de His-175 en
células H1299. Figura 13F, PRIMA-3 restauró la
función de supresión de crecimiento mutante His-175
de p53 en células H1299. Figura 13G, PRIMA-2
reactivó p53 mutante His-273 en células SKOV.
Figura 14: inducción de genes diana de p53
mediante análogos de PRIMA-1 y
MIRA-1. Figura 14A, inducción de p21 y
MDM-2 en células
H1299-His-175 mediante
MIRA-2 y PRIMA-2. Figura 14B,
inducción de MDM-2 en células de carcinoma de colon
SW480-His-273 mediante
PRIMA-3.
Figura 15: la supresión del crecimiento inducida
por análogos es dependiente de la función de transactivación
transcripcional de la p53. Figura 15A, tratamiento con
H1299-His-175 convertidas a
cicloheximida resistentes al tratamiento con
MIRA-3. El efecto de la cicloheximida fue notable en
células sin expresión de p53 mutante (dox+), sin embargo, dicho
efecto fue bastante menor comparado con las células que expresan p53
mutante (dox-). Figura 15B, muestra que la mutación en el dominio
de transactivación de la p53 mutante His-175
protegió a las células SKOV frente al tratamiento con
PRIMA-2.
Figura 16: muestra las fórmulas estructurales de
los compuestos MIRA-2, MIRA-3
(Figura 13A) y PRIMA-2 y PRIMA-3
(Figura 13B).
A continuación la presente invención será
descrita con más detalle a través de ejemplos que no pretenden
limitar el alcance de la invención en modo alguno. Todas las
referencias aportadas a continuación o en cualquier parte de la
presente especificación se incluyen aquí a modo de referencia.
Los plásmidos que codifican la proteína de
fusión p53 natural GST-humana y las proteínas p53
mutantes GST-humanas His-175 se han
descrito previamente (Selivanova y col., 1996). El plásmido
p53-EGFP contiene 13 sitios sintéticos de unión de
ADN de consenso para p53 en frente de la secuencia codificadora de
EGFP. Se llevaron a cabo experimentos de transfección transitoria
con Lipofectamina 2000 de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante (Invitrogen^{TM} Life Technologies, Groningen,
Holanda).
Se obtuvo una biblioteca de compuestos de bajo
peso molecular en el National Cancer Institute (NCI), Bethesda,
EE.UU. Para más información, véase la página web
http://dtp.nci.nih.gov.
Para el escrutinio se usó la línea celular
Saos-2-His-273
transfectada de forma estable con una construcción que permite la
expresión de p53 mutante His-273 de un modo
dependiente de tetraciclina (Selivanova y col., 1997). Se inhibió
la expresión de p53 mediante incubación de las células con
doxiciclina (5 \mug/mL). Las células fueron cultivadas en placas
de 96 pocillos con una densidad de 3000 células por pocillo con o
sin doxiciclina, y fueron tratadas con 25 \muM de los compuestos
procedentes de la biblioteca NCI de compuestos de bajo peso
molecular (LMW, del inglés "Low Molecular Weight"). Después de
48 horas de incubación, se añadió a las células el reactivo
WST-1 (Roche) de proliferación celular. El grado de
reducción de WST-1, que refleja la viabilidad
celular, se midió mediante un lector de microplacas a \lambda 490
nm de acuerdo con el fabricante (Roche).
Las células fueron llevadas a placas de 12
pocillos con una densidad de 30.000/cm^{2} y fueron tratadas con
los compuestos. Después de 48 h de incubación las células fueron
recolectadas mediante tripsinización, fueron fijadas con etanol al
70%, tratadas con ARNasa A (0,25 mg/mL) y teñidas con yoduro de
propicio (0,02 mg/mL). Las muestras se analizaron en un FACScan
Becton Dickinson. Los datos fueron analizados mediante el software
CellQuest, versión 3.2.1.
Las células fueron tratadas con los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 y fueron sembradas
en placas a 500 células por placa. Las colonias fueron teñidas con
Giemsa y contabilizadas 14 días después de la siembra.
Se llevaron a cabo ensayos de transactivación
usando construcciones de promotor que responden a p53 ligadas al
gen informador de luciferasa (PG-luc) mediante el
Sistema de Ensayo de Informador de Luciferasa Dual (Promega) de
acuerdo con el fabricante. La línea celular
Saos-2-His273 transfectada de forma
estable con plásmido informador de luciferasa
PG-luc (2 mg) fue tratada con los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 a una concentración
de 50 y 10 \muM, respectivamente. Se determinó la actividad de
luciferasa 1, 3,5 y 15 horas después del tratamiento.
Las proteínas GST-p53 fueron
preparadas como se ha descrito (Selivanova y col., 1997). Se
llevaron a cabo ensayos de desplazamiento de banda en tampón de
unión que contiene HEPES 100 mM pH 7,5, KCl 50 mM, 1 mg/mL de BSA,
0,1% de Triton X-100, MgCl_{2} 2 mM y DTT 1 mM
esencialmente como en Selivanova y col., 1996.
Se calentaron 20 ng de
GST-nat-p53,
GST-mut-p53-175 y
GST-mut-p53-248 a
37ºC durante 30 minutos o se mantuvieron en hielo. El procedimiento
se llevó a cabo con o sin los compuestos de ensayo. Los análisis
ELISA se realizaron tal como se ha descrito (Foster y col., 1999).
En resumen, después del tratamiento, las muestras fueron diluidas
con tampón de recubrimiento (KCl 150 mM, HEPES 25 mM) suplementado
con DTT 10 mM. Toda la mezcla se aplicó a placas ELISA (MaxiSorp,
Nunc) y se incubó a +4ºC durante 35 minutos. Los pocillos se lavaron
con tampón de recubrimiento. Los pocillos fueron bloqueados con
leche desnatada al 5% en PBS mediante incubación a +4ºC durante 1
h. Los pocillos fueron enjuagados dos veces con PBS seguido de la
adición de anticuerpos primarios de ratón (Pab 1620 o Pab 240)
diluidos 1:250 en tampón de recubrimiento. Las muestras se incubaron
a +4ºC durante 30 minutos. Los pocillos se enjuagaron dos veces con
PBS. Después de eso, se incubó un anticuerpo secundario
(anti-ratón, conjugado con peroxidada de rábano) con
las muestras a +4ºC durante 30 minutos. A continuación las placas
fueron lavadas 5 veces con PBS y se añadió un sustrato de
peroxidada. Se monitorizó la absorbancia a \lambda 405 nm
mediante un lector ELISA.
La tinción TUNEL, la inmunotinción, la tinción
lacZ, la preparación de extractos celulares, los análisis ELISA con
extractos celulares y los análisis de transferencia Western fueron
realizados de acuerdo con los procedimientos estándares.
Todos los estudios con animales fueron aprobados
por el comité de ética animal local, y el cuidado de los animales
se realizó según las guías institucionales. Para la determinación de
la toxicidad, se dividieron en 4 grupos 12 ratones SCID (con un
peso promedio de 25 g). Tres grupos recibieron diariamente
inyecciones i.v. de 1, 10 y 100 mg/kg de PRIMA-1 en
PBS durante 5 días. Los animales de control fueron inyectados con
PBS. Se midió el peso de los ratones durante 1 mes después de la
última inyección. Para determinar la actividad
anti-tumoral de PRIMA-1, 12 ratones
SCID fueron inoculados con 1 x 10^{6} células
Saos-2-His-273 en
Matrigel al 90% (Becton Dickinson, Le
Pont-De-Claix, Francia)
subcutáneamente y unilateralmente en los costados derechos. Después
de 3 días los ratones fueron divididos en 4 grupos. Dos grupos
recibieron inyecciones i.v. de PRIMA-1 con una
dosis de 20 ó 100 mg/kg, un grupo recibió inyecciones intratumor de
PRIMA-1 con una dosis de 20 mg/kg, y el último
grupo se usó como control. Las inyecciones se realizaron dos veces
al día durante 3 días. Se midió el volumen del tumor durante 2
meses.
De acuerdo con la presente invención, la
biblioteca NCI de compuestos de bajo peso molecular ha sido
escrutada para obtener compuestos que puedan suprimir el
crecimiento de células tumorales humanas de un modo dependiente de
p53 mutante.
La línea celular
Saos-2-His-273
transfectada de forma estable con una construcción que permite la
expresión de p53 mutante His-273 de un modo
dependiente de tetraciclina fue usada para el escrutinio (Selivanova
y col., 1997). Las células fueron cultivadas en placas de 96
pocillos con una densidad de 3000 células por pocillo con o sin
doxiciclina. El tratamiento se llevó a cabo con una concentración 25
\muM de cada compuesto químico de la biblioteca NCI de compuestos
de bajo peso molecular (LMW). Después de 48 horas de incubación, se
añadió el reactivo WST-1 (Roche) de proliferación
celular a las células. El grado de reducción de
WST-1, que es proporcional a la viabilidad celular,
se midió mediante un lector de microplacas a \lambda 490 nm de
acuerdo con el fabricante (Roche). Se identificaron dos compuestos
que eran capaces de suprimir el crecimiento de células
Saos-2-His-273 que
expresan p53, pero no afectó al crecimiento de células
Saos-2 que no expresan p53 mutante (Figura 1A).
La capacidad de los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 para suprimir el
crecimiento de células que expresan p53 mutante se evaluó usando un
ensayo de formación de colonia. Se trataron células
Saos-2 y
Saos-2-His-273 con
diferentes dosis de los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1, y se sembraron en placas. Las células
fueron teñidas con Giemsa y puntuadas en función de la aparición de
colonias después de 14 días. Tal como se muestra en la Tabla II, el
tratamiento con 5 \muM del compuesto MIRA-1 redujo
drásticamente el número de colonias formadas por células
Saos-2 que expresan His-273 (15% del
control sin tratar), pero fue menos eficiente para inhibir células
Saos-2 que carecen de p53 (48% de inhibición). El
tratamiento con el compuesto PRIMA-1 fue inhibidor
de un modo dependiente de la p53 mutante a mayores dosis, alrededor
de 50-100 \muM.
A continuación, se evaluó la capacidad de los
compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 para
suprimir el crecimiento de células tumorales de un modo dependiente
de p53 mutante usando una serie de de líneas celulares tumorales
humanas con diferente status de p53 (nulas en p53, de p53 natural,
de p53 mutante). Las líneas celulares humanas fueron las
siguientes. Nula en p53: Saos-2, osteosarcoma; K562,
leucemia mieloide aguda; y HL60, leucemia promielocítica. Células
que expresan p53 natural: NHF, fibroblastos humanos normales; HeLa,
carcinoma cervical (porta proteína HPV E6, que conduce a
degradación de p53); U2OS, osteosarcoma; y línea celular de
linfoblastoides LARC 171 positiva en EBV. Líneas que expresan p53
mutante: líneas de linfoma de Burkitt BL41 (p53 mutante
Gln-248); DG75 (His-283); Raji
(Gln-213, His-243); Ramos
(Asp-254); BJAB (Arg-193), y
Saos-2-His-273,
SKOV-His-175,
SKOV-His-273 y
H1299-His-175 que expresan p53
mutantes bajo el control de promotor dependiente de doxiciclina.
Además, se usó la línea de linfoma de células T J3D nula en p53 de
ratón. Como puede verse en la Tabla I, los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1 suprimieron el
crecimiento de células que expresan p53 mutante más eficientemente
que el de las células nulas en p53 y que contienen p53 natural. Los
datos de estos experimentos se resumen en un gráfico mostrado en la
Figura 2B. Las diferencias en las respuestas entre los grupos de
líneas celulares (nulas en p53, de p53 natural y de p53 mutante)
fueron estadísticamente significativas, como pudo verificarse a
través de un ensayo-t independiente.
Tal como se muestra en la Figura 2C,
PRIMA-1 inhibió por completo el crecimiento de
células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 mutante. En ausencia de expresión de p53 mutante, el
compuesto PRIMA-1 solo causó una reducción menor de
la velocidad de crecimiento.
Para abordar la cuestión de si la supresión del
crecimiento inducida por los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 se produce debido a la inducción de
apoptosis, se evaluó si los inhibidores de caspasa pueden inhibir la
supresión de crecimiento inducida por MIRA-1 y
PRIMA-1. Se trataron células
Saos-2-His 273 con los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1 en presencia o en
ausencia de los inhibidores de caspasa
Z-DEVD-FMK y
BOC-D-FMK (Enzyme Systems Products,
CA). La inducción de la muerte celular se determinó mediante
análisis FACS de células fijadas con etanol teñidas con yoduro de
propidio (PI) como el porcentaje de población
sub-G1. Como es evidente a partir de la Figura 2A,
los inhibidores de caspasa suprimieron la muerte celular inducida
por los compuestos PRIMA-1 y
MIRA-1. Por lo tanto, se concluye que los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1 pueden inducir
apoptosis. Adicionalmente, se detectó morfología apoptótica en las
células
Saos-2-His-273
teñidas con colorante de Hoechst después del tratamiento con
compuesto PRIMA-1. La tinción TUNEL de células
Saos-2-His-273
tratadas con compuesto PRIMA-1 también confirmó la
inducción de apoptosis (datos no mostrados). También se observó una
diferencia en la cinética de inducción de apoptosis inducida por
los compuestos PRIMA-1 y F: mientras que la
apoptosis inducida por PRIMA-1 fue evidente después
de 48 horas de tratamiento, el compuesto MIRA-1
indujo la muerte celular mucho más rápidamente, a las
6-12 horas de tratamiento (datos no mostrados).
Estos resultados sugieren que los compuestos PRIMA-1
y MIRA-1 activan diferentes mecanismos
apoptóticos.
Se examinó si la apoptosis inducida por los
compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 es
dependiente de p53 usando células
Saos-2-His-273
cultivadas en presencia o en ausencia de doxiciclina. Tal como se
muestra en la Figura 3B, la inducción de apoptosis por los
compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 se
produjo sólo en presencia de expresión de p53. Considerados
combinados, estos resultados indican claramente que la supresión de
crecimiento por los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 está mediada por una p53 mutante y no se
debe a toxicidad celular no específica.
Para profundizar en el mecanismo molecular de la
reactivación de p53 mutante mediada por los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1, se evaluó si la
conformación de p53 se ve afectada por dichos compuestos. Se ha
demostrado que mutaciones puntuales en p53 dan como resultado la
desestabilización de la conformación nativa del dominio de núcleo
de p53, lo que produce la pérdida del epítopo dependiente de
conformación específico de la variante natural para el anticuerpo
monoclonal PAb1620 y la aparición de un nuevo epítopo reconocido por
el anticuerpo monoclonal PAb240 (Cho y col., 1994). Además, la
desnaturalización térmica de la p53 natural tiene un efecto
similar. Por tanto, se examinó si los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 pueden estabilizar
la conformación nativa (natural) de la p53. Los resultados
presentados en la Figura 4A demuestran que los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 preservan el
epítopo dependiente de la conformación para anticuerpo PAb1620 de
las proteínas p53 naturales y mutantes calentadas durante 30
minutos a 37ºC. Para la proteína GST-natp53 la
diferencia entre las muestras tratadas y no tratadas en el epítopo
PAb1620 remanente después del tratamiento con el compuesto
PRIMA-1 alcanza una significancia estadística a p =
0,05
(n = 5) de acuerdo con un ensayo-t emparejado. Cabe destacar que los resultados de la Figura 4B demuestran que los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de prevenir el desplegamiento de proteínas p53 medido a través de la aparición de epítopo PAb240 en proteínas p53 al calentar a 37ºC. Según un ensayo-t emparejado, la diferencia en la aparición de epítopo de PAb240 entre las muestras de control y las tratadas con PRIMA-1 para las proteínas GST-natp53 y GST p53 mutante-His175 alcanzó una significancia estadística a p = 0,01 y p = 0,1, respectivamente. La Figura 4C muestra que el epítopo no conformacional del extremo N de la p53 reconocido por anticuerpo DO-1 no se ve afectado por la incubación con los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1. Por tanto, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 son capaces de preservar la conformación nativa de proteínas p53 mutantes.
(n = 5) de acuerdo con un ensayo-t emparejado. Cabe destacar que los resultados de la Figura 4B demuestran que los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de prevenir el desplegamiento de proteínas p53 medido a través de la aparición de epítopo PAb240 en proteínas p53 al calentar a 37ºC. Según un ensayo-t emparejado, la diferencia en la aparición de epítopo de PAb240 entre las muestras de control y las tratadas con PRIMA-1 para las proteínas GST-natp53 y GST p53 mutante-His175 alcanzó una significancia estadística a p = 0,01 y p = 0,1, respectivamente. La Figura 4C muestra que el epítopo no conformacional del extremo N de la p53 reconocido por anticuerpo DO-1 no se ve afectado por la incubación con los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1. Por tanto, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 son capaces de preservar la conformación nativa de proteínas p53 mutantes.
Para evaluar si la PRIMA-1 puede
convertir p53 mutante a conformación de p53 natural, se usaron los
anticuerpos específicos de conformación PAb1620 y PAb240. El
tratamiento de proteína p53 GST natural recombinante con
PRIMA-1 dio como resultado un 40% de aumento de la
fracción PAb1620+ y un descenso correspondiente de la fracción
PAb240+, mientras que la fracción DO-1+ permaneció
sin cambios. En experimentos similares con MIRA-1 se
observó aproximadamente un 40% de aumento en la fracción PAb1620+ y
aproximadamente un 20% de reducción en la fracción Pab240+. Se
midió la fracción de p53 PAb1620+ en extractos proteicos de células
SKOV-His-175 tratadas con
PRIMA-1 usando ELISA. Después de tratamiento con
PRIMA-1 150 \muM, la fracción PAb1620+ alcanzó 146
\pm 18% (el valor para las células no tratadas se fijó en 100%),
mientras que la fracción DO-1 fue 88 \pm 9%. Esto
demuestra que el PRIMA-1 puede estabilizar p53
mutante en una conformación natural, tanto in vitro como en
células
vivas.
vivas.
Además, la inmunotinción con PAb1620 demostró la
capacidad del PRIMA-1 para convertir p53 mutante a
conformación natural en células vivas. Tal como se muestra en la
Figura 6A, el tratamiento de células
SKOV-His-175 con
PRIMA-1 dio como resultado la aparición de p53
positiva en PAb1620 en células y un descenso concomitante en los
niveles totales de p53 de acuerdo con la tinción con anticuerpo
anti-p53 policlonales. Se observó un efecto similar
en las células tratadas con MIRA-1 (Figura 6B).
A continuación se abordó la cuestión de si la
restauración de la función inductora de apoptosis de las proteínas
p53 por los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 opera a través de la actividad de unión de
ADN específica de la p53. ¿Los compuestos PRIMA-1 y
MIRA-1 restauran la unión de ADN específica de p53?
Se investigó la unión de ADN de proteínas p53 en presencia o
ausencia de los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 en un ensayo de desplazamiento de banda,
tal como se ha descrito anteriormente (Selivanova y col., 1996;
Selivanova y col., 1997). Los resultados presentados en la Figura
5A demuestran que los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 son capaces de restaurar la unión de ADN
específica de la proteína p53 mutante
GST-His-175, tal como se muestra en
la Figura 5B. La sustitución de arginina en la posición 175 causa
un importante despliegue del dominio de núcleo de unión de ADN de la
p53. Por tanto, la restauración de la unión de ADN de este mutante
se consideró una tarea excepcionalmente difícil. La restauración de
la unión de ADN de p53 mutante His-175 demuestra una
elevada potencia de los compuestos identificados. Puesto que se
demostró que el mutante His-175 gana una función
oncogénica, este resultado parece ser de especial importancia. Los
compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 también
fueron capaces de restaurar la unión de ADN específica de secuencia
de la p53 mutante Trp-282 endógena en extractos
celulares procedentes de células BL-60 de linfoma
de Burkitt, tal como se muestra en la Figura 6B.
Se evaluó la capacidad de los compuestos
PRIMA-1 y MIRA-1 para restaurar las
propiedades de unión de ADN específica de una amplia serie de
mutantes de p53 de punto caliente, usando extractos celulares de
líneas celulares tumorales humanas que portan diferentes mutantes
de p53 como fuente de proteína p53 endógena. El compuesto
PRIMA-1 restauró la unión de ADN específica de 13
de cada 14 proteínas p53 mutantes evaluadas en ensayos de
desplazamiento de banda, independientemente de la unión de ADN
residual (véase la Tabla III). El compuesto MIRA-1
restauró la unión de ADN de 3 de cada 14 proteínas p53 mutantes
(Tabla III). Por tanto, los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 no solo fueron capaces de restaurar la
unión de ADN de proteínas p53 mutantes recombinantes, sino que
reactivaron la unión de ADN de una serie de proteínas p53 mutantes
endógenas en extractos celulares. La única excepción para el
compuesto PRIMA-1 fue el mutante
Phe-176, que no fue reactivado por ninguno de los
compuestos.
Considerando los resultados obtenidos de que los
compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 no son
capaces de restaurar la unión de ADN específica de la proteína p53
mutante Phe-176 en células KRC/Y, se evaluó si la
función inductora de apoptosis de dicho mutante podría ser
reactivada mediante los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1. Las células KRC/Y fueron tratadas con
concentraciones 50 \muM y 75 \muM de los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1, respectivamente,
y se midió el porcentaje de células muertas mediante análisis FACS
tal como se ha descrito antes. Tal como se demuestra en la Figura
5, la inducción de apoptosis en células KRC/Y fue mucho menos
prominente en comparación con las células
Saos-2-His-273. De
hecho, la respuesta de células KRC/Y al tratamiento fue comparable
con la de las células Saos-2 que no expresan p53.
Por tanto, parece que el defecto causado por la sustitución del
residuo Cys de la posición 176 es irreversible. La sustitución del
residuo Cys elimina la unión de un átomo de Zn que mantiene unidos
los lazos de unión de ADN del dominio de núcleo de p53. Por lo
tanto, el desplegamiento de esta proteína p53 mutante es
probablemente demasiado pronunciado para ser restaurado.
Para profundizar en si el
PRIMA-1 ejerce su efecto a través de la
transactivación transcripcional mediada por p53 y en la síntesis de
proteína de novo, se evaluó el efecto de la cicloheximida
sobre la apoptosis/inhibición de crecimiento inducida por
PRIMA-1. El pretratamiento de células
SKOV-His-175 con cicloheximida antes
de la adición de PRIMA-1 causó un aumento que
cuadriplicó la supervivencia celular de acuerdo con el ensayo de
proliferación WST-1. El tratamiento de cicloheximida
también hace a las SKOV-His-175
resistentes a MIRA-1, que da como resultado un
aumento de 4 veces en la supervivencia celular. Además, se ha
descubierto que la viabilidad de células SKOV que portan p53
mutante His-175-22/23 que tiene un
dominio de transactivación desactivado fue al menos el doble que la
de células SKOV-His-175 tras
tratamiento con PRIMA-1. Además, las células
SKOV-His-175 fueron al menos tres
veces más sensibles al tratamiento con MIRA-1 en
comparación con las células
SKOV-His-175-22/23.
Considerándolos en conjunto, estos resultados proporcionan una
evidencia convincente de que la transactivación transcripcional por
p53 es crítica para la muerte celular inducida por
PRIMA-1 y MIRA-1.
Habiendo establecido que los compuestos
MIRA-1 y PRIMA-1 pueden reactivar la
unión de ADN específica de p53 mutante in vitro, se abordó la
cuestión de si los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 pueden restaurar la función de
transactivación transcripcional de p53 mutante en células vivas. Se
trataron células
Saos-2-His-273 que
portaban un gen informador PG-luciferasa que
responde a p53 con los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 y se midió la actividad de luciferasa
usando el sistema Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) de
acuerdo con el fabricante. Tal como se muestra en la Tabla IV, los
compuestos MIRA-1 y PRIMA-1
estimularon la transcripción del gen de luciferasa hasta
1,5-2 veces su valor. De forma interesante, la
cinética de la inducción de la expresión de gen de luciferasa
difirió entre los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1. Mientras que el compuesto
MIRA-1 estimuló la expresión de luciferasa hasta el
doble ya tras 3,5 horas, con el compuesto PRIMA-1
sólo se obtuvo una inducción del doble tras 15 horas de
tratamiento. La cinética de inducción de la expresión de gen de
luciferasa se correlaciona con la inducción rápida y lenta de la
apoptosis ejercida por los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1, respectivamente.
El tratamiento de células A431 que portan p53
mutante His-273 endógena y un informador lacZ que
responde a p53 con 50 \muM de PRIMA-1 durante 20
horas dio como resultado la aparición de células positivas en lacZ
mientras que las células no tratadas fueron negativas (Figura 9A).
Se obtuvieron resultados similares después del tratamiento con 5
\muM de MIRA-1 tras 12 horas.
También se transfectaron temporalmente células
SKOV-His-175 con un informador EGFP
que responde a p53. La Figura 9B muestra una fuerte inducción de
expresión de EGFP en células
SKOV-His-175 que expresan p53
mutante después de tratamiento con PRIMA-1 durante
24 horas. Por el contrario, las células
SKOV-His-175 cultivadas en
presencia de doxiciclina (sin p53) no expresaron niveles detectables
de EGFP. La inducción de EGFP también se observó en células
tratadas con MIRA-1 5 \muM durante 24 horas
(Figura 9C).
Como confirmación final de que
PRIMA-1 y MIRA-1 pueden rescatar la
transactivación transcripcional de la p53 mutante, se examinó si
PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de
inducir dos genes diana de p53 clásicos, el p21 y el MDM2. El
tratamiento de células H1299-His-175
que expresan p53 mutante con PRIMA-1 o
MIRA-1 dio como resultado una sólida inducción
tanto de MDM2 como de p21 (Figura 10A). Cabe destacar que el
tratamiento con compuesto PRIMA-1 o
MIRA-1 de las mismas células en ausencia de
expresión de p53 mutante no provocó ninguna inducción de MDM2 ni de
p21 (Figura 10B). Además, ambos productos químicos indujeron MDM2 y
p21 en células SW480 de carcinoma de colon que portaban p53 mutante
His-273 endógena (Figura 10C), pero no causaron
ningún cambio significativo en los niveles de proteína MDM2 y p21
en células HCT116 de carcinoma de colon que portan p53 natural.
La estimulación de la función de transactivación
transcripcional por los compuestos MIRA-1 y
PRIMA-1 se correlacionó con los datos obtenidos en
experimentos de desplazamiento de banda, y demuestra que los
compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden
trabajar ambos in vitro e in vivo como reactivantes de las
funciones de unión de ADN específica y de transactivación de la
p53.
Las inyecciones intravenosas de
PRIMA-1 en ratones no provocaron ningún cambio obvio
en el comportamiento o en el peso en comparación con los animales
de control no tratados. El peso medio de los ratones de control no
tratados fue de 20 \pm 0,6 g (media \pm DE, n = 3) y el peso
medio de los ratones tratados con PRIMA-1 con la
mayor dosis usada, de 100 mg/kg, fue de 20 \pm 0,2 g después de un
mes de observación. Para determinar el efecto del
PRIMA-1 en xenoinjertos de tumores humanos, los
ratones fueron inoculados con células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 mutante. Los animales recibieron inyecciones
intratumorales (20 mg/kg) o intravenosas (20 ó 100 mg/kg) de
PRIMA-1 dos veces al día durante tres días. En el
grupo de control no tratado, el volumen tumoral medio después de 59
días fue de 555,7 \pm 284 mm^{3} (media \pm DE, n = 3). En ese
momento, los ratones que recibieron inyecciones intravenosas de
PRIMA-1 con una dosis de 100 mg/kg presentaban un
volumen tumoral medio de 11,7 \pm 8 mm^{3}, y los ratones
tratados con 20 mg/kg de PRIMA-1 i.v. presentaron un
volumen tumoral medio de 53 \pm 48,5 mm^{3} (Figura 5). Los
ratones que recibieron inyecciones intratumorales de 20 mg/kg de
PRIMA-1 presentaron un volumen tumoral medio de 5,3
\pm 2,7 mm^{3}. Las diferencias en el volumen tumoral entre los
ratones de control no tratados y los animales tratados con
PRIMA-1 son todas estadísticamente significativas
(P = 0,041 para las inyecciones intratumorales de 20 mg/kg, P =
0,066 para la inyección intravenosa de 20 mg/kg, y P = 0,045 para
la inyección intravenosa de 100 mg/kg, según el
ensayo-t realizado para el todo el periodo de
observación). Por tanto, el PRIMA-1 tiene actividad
anti-tumoral in vivo en este modelo de tumor
animal.
Con el objetivo de identificar los grupos
activos de los compuestos PRIMA-1 y
MIRA-1, reactivantes de p53, se evaluó una serie de
análogos estructurales de los compuestos MIRA-1 (23
compuestos) y PRIMA-1 (16 compuestos). Se
cultivaron células
Saos-2-His-273 en
presencia o en ausencia de doxiciclina y células
Saos-2 parentales fueron tratadas con los análogos
estructurales, y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Se
evaluó el efecto de los análogos estructurales sobre el crecimiento
celular usando diferentes concentraciones de los compuestos, que
oscilaron entre 2,5 y 25 \muM. Los compuestos
MIRA-2 (no de acuerdo con la invención),
MIRA-3 (no de acuerdo con la invención), y
PRIMA-2, PRIMA-3, fueron
identificados como capaces de suprimir el crecimiento de células
Saos-2-His-273 que
expresan p53 mutante (tet-). Al mismo tiempo, los análogos
identificados no afectaron al crecimiento de células
Saos-2-His-273 que
no expresaban p53 mutante en presencia de doxiciclina (tet+) o de
la línea celular parental Saos-2 que carece de p53.
Aunque los análogos estructurales no poseían una mayor actividad
que los compuestos identificados originalmente, los compuestos
PRIMA-2 y PRIMA-3 suprimieron
selectivamente el crecimiento de células que contenían p53 mutante a
menores concentraciones (2,5 \muM y 5 \muM, respectivamente)
que las requeridas para obtener el efecto selectivo con el compuesto
PRIMA-1 (10 \muM). Además, los compuestos
MIRA-2 y MIRA-3 suprimieron el
crecimiento de células de un modo dependiente de p53 mutante a una
concentración 10 \muM, en comparación con 25 \muM que requiere
el compuesto MIRA-1 para obtener un efecto
selectivo.
Se ha examinado si los análogos seleccionados
pueden restaurar la función de supresión de crecimiento de
diferentes p53 mutantes de punto caliente usando líneas celulares
con expresión dependiente de doxiciclina de p53 mutantes
His-175 y Gln-248. Se midió la
supresión de crecimiento por análogos en presencia o ausencia de
expresión de p53 tal como se ha descrito en la Figura 1. Tal como
se demuestra en la Figura 13A, los análogos de
PRIMA-1, PRIMA-2 y
PRIMA-3, restauraron la función de supresión de
crecimiento a p53 mutante His-175 en células
SKOV-His-175. La reactivación de
otro mutante p53 Gln-248 por el compuesto
PRIMA-3 se muestra en la Figura 13B. Los análogos
de MIRA-1 indujeron supresión de crecimiento
dependiente de p53 mutante en células
SKOV-His-175 (Figura 13C). Cabe
destacar que la concentración de análogos requerida para alcanzar la
supresión de crecimiento dependiente de p53 fue inferior en todos
los casos, lo que indica una mayor potencia de los análogos.
A continuación se abordó la cuestión de si el
efecto de supresión de crecimiento dependiente de p53 por efecto de
los análogos de PRIMA-1 y MIRA-1
podría reproducirse en líneas celulares tumorales de diferente
origen. Se comparó la inhibición del crecimiento por análogos de
MIRA-1 en dos líneas celulares tumorales que
expresan p53 mutante His-273, la línea de
osteosarcoma
Saos-2-His-273 y la
línea de carcinoma de ovario
SKOV-His-273, y se obtuvo
restauración del mutante His-273 en ambas líneas
tumorales (Figura 13D). El crecimiento de células de carcinoma de
pulmón H1299-His-175 que expresan
p53 mutante His-175 también fue inhibido por
MIRA-3 de un modo dependiente de p53 mutante
(Figura 13E). Por tanto, la reactivación de p53 mutante por análogos
de MIRA-1 no depende del origen de las células
tumorales.
Se llegó a la misma conclusión en experimentos
con análogos de PRIMA-1. Tanto el
PRIMA-2 como el PRIMA-3 reactivaron
el mutante His-175 en células SKOV y H1299 (Figura
13F). La restauración de la función de mutante
His-273 en células Saos-2 y SKOV
por acción de PRIMA-2 se muestra en la Figura
13G.
Se determinó el efecto de los análogos sobre la
supervivencia a largo plazo de las células tumorales en presencia o
en ausencia de expresión de p53 en un ensayo de formación de
colonia. Tal como se muestra en la Tabla V, PRIMA-2
y MIRA-3 suprimieron la formación de colonias en
células H1299-His-175 de un modo
dependiente de p53 mutante.
Por tanto, los análogos de
MIRA-1 y PRIMA-1 son capaces de
restaurar la función de supresión del crecimiento de los tres
mutantes de p53 de punto caliente más comunes a concentraciones más
bajas que los compuestos originales, e independientemente de los
antecedentes genéticos.
Con el objetivo de determinar el efecto de los
análogos sobre la función de transactivación transcripcional de p53
mutante, se evaluó la expresión de genes diana de p53 después del
tratamiento con análogos de células de carcinoma de colon SW480 que
expresan p53 mutante His-273 endógena. Tal como se
demuestra mediante análisis de transferencia Western,
PRIMA-2 y PRIMA-3, así como
MIRA-2 y MIRA-3, indujeron expresión
de los genes diana de p53 p21 y MDM-2 de un modo
dependiente de p53 mutante (Figura 14). Por tanto, los análogos de
PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de
restaurar la función de transactivación de la transcripción de la
p53 mutante.
A continuación se abordó la cuestión de si la
supresión del crecimiento por acción de los análogos depende de la
transactivación transcripcional mediada por p53. El tratamiento de
células H1299-His-175 con
cicloheximida evitó la supresión de crecimiento por
MIRA-3, lo que indica que se requiere una nueva
síntesis proteica (Figura 15A). Tal como se muestra en la Figura
15B, el efecto de supresión del crecimiento de
PRIMA-2 fue eliminado completamente en células
H1299-His-175-22/23,
que expresan una p53 mutante defectuosa transcripcionalmente que
porta sustituciones en las posiciones 22 y 23 además de la 175.
Estos resultados permiten concluir que la función de
transactivación transcripcional de la p53 mutante es necesaria para
el efecto de supresión de los análogos.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (6)
- El uso de compuestos que tienen la fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
6 \vskip1.000000\baselineskip
en dondeR_{2} ó R_{3} son iguales o diferentes y se eligen del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{15}, alquenilo C_{1}-C_{15}, alquinilo C_{1}-C_{15}, alcoxi C_{1}-C_{15}, alquilamino C_{1}-C_{15}, arilo, aril alquilo C_{6}-C_{15}, carboxi alquilo C_{1}-C_{15}, alquilcarboxilato de alquilo C_{2}-C_{15}, tioalquilo C_{1}-C_{15}, hidroxialquilo C_{1}-C_{15}, en donde dichos grupos pueden estar sustituidos opcionalmente con halógeno o de 2-hidroximetil-3,3-dihidroxi-1-azabiciclo[2,2,2]octano para la preparación de producto farmacéutico para el tratamiento de cáncer. - 2. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es 2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona, 9-[2-(1-azabiciclo[2,2,2]-3-oxooctil)]-metil-6-cloro-9H-purina ó 2-hidroximetil-3,3-dihidroxi-1-azabiciclo[2,2,2]octano.
- 3. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, junto con un vehículo, diluyente y/o excipiente potenciador farmacéuticamente aceptable.
- 4. Un compuesto que tiene la fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
7 \vskip1.000000\baselineskip
en dondeR_{2} ó R_{3} son iguales o diferentes y se eligen del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{15}, alquenilo C_{1}-C_{15}, alquinilo C_{1}-C_{15}, alcoxi C_{1}-C_{15}, alquilamino C_{1}-C_{15}, arilo, aril alquilo C_{6}-C_{15}, carboxi alquilo C_{1}-C_{15}, alquilcarboxilato de alquilo C_{2}-C_{15}, tioalquilo C_{1}-C_{15}, hidroxialquilo C_{1}-C_{15}, en donde dichos grupos pueden estar sustituidos opcionalmente con halógeno o de 2-hidroximetil-3,3-dihidroxi-1-azabiciclo[2,2,2]octano para la preparación de producto farmacéutico para el tratamiento de cáncer. - 5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, que es 2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona, 9-[2-(1-azabiciclo[2,2,2]-3-oxooctil)]-metil-6-cloro-9H-purina ó 2-hidroximetil-3,3-dihidroxi-1-azabiciclo[2,2,2]octano.
- 6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, junto con un vehículo, diluyente y/o excipiente potenciador farmacéuticamente aceptable.
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