ES2316574T3 - Anticuerpo de tipo humano contra el factor viii de la coagulacion sanguinea. - Google Patents
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Abstract
Un fragmento génico que codifica una cadena VH de un anticuerpo humano contra el factor de la coagulación sanguínea VIII (FVIII) que tiene una actividad de inhibición de la actividad de coagulación (actividad inhibidora) del FVIII humano, donde dicho anticuerpo anti-FVIII humano no reconoce un complejo FVIII/factor von Willebrand (vWF) y reconoce únicamente el FVIII sin vWF, y donde las regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3) de dicha cadena VH tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEC ID Nº:13); CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Val Ser Ala Gln Arg Phe Gln Gly (Xaa = Thr o Ala) (SEC ID Nº:14); CDR3: Gly Val Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEC ID Nº:15).
Description
Anticuerpo de tipo humano contra el factor VIII
de la coagulación sanguínea.
La presente invención se refiere a proporcionar
un anticuerpo inhibidor humano contra el factor de coagulación
sanguíneo VIII (en lo sucesivo también denominado "FVIII" en
este documento) y un fragmento de anticuerpo que se une al FVIII
humano y que de esta manera inhibe específicamente la actividad de
coagulación del FVIII.
La hemofilia A es una enfermedad genética en la
que un trastorno o deficiencia de FVIII conduce a una reducción de
la actividad de coagulación sanguínea, dando como resultado
hemorragias en los intestinos o en las articulaciones, etc. Para el
tratamiento de pacientes que padecen hemofilia A, se han llevado a
cabo tratamientos suplementarios con FVIII. Sin embargo, en
aproximadamente el 10% (del 8 al 15%) de los pacientes que reciben
un tratamiento suplementario, se ha observado la inducción de un
anticuerpo contra el FVIII. Este anticuerpo, denominado
"anticuerpo inhibidor anti-FVIII", hace
ineficaz el tratamiento suplementario con los factores de la
coagulación sanguínea y dificulta extremadamente el tratamiento
hemostático de los pacientes con hemofilia.
La aclaración de la naturaleza del anticuerpo
inhibidor anti-FVIII y su mecanismo de producción
permitiría inhibir o regular la producción del anticuerpo
inhibidor. Hasta este momento, se ha investigado usando un
anticuerpo inhibidor anti-FVIII (anticuerpo
policlonal) purificado a partir de sueros de pacientes hemofílicos
que tienen anticuerpos inhibidores anti-FVIII o un
anticuerpo inhibidor anti-FVIII de ratón (anticuerpo
monoclonal de ratón), proporcionándose una gran cantidad de
información. Sin embargo, en cuanto a la clonación de un anticuerpo
inhibidor anti-FVIII procedente de pacientes, apenas
ha habido informes.
Por otro lado, un estudio epidemiológico ha
demostrado que los pacientes hemofílicos presentan baja incidencia
de arteriosclerosis, tal como infarto de miocardio, en particular,
una incidencia significativamente baja de infarto de miocardio
letal (Br. J. Haemotol. 1990, 75, 525-530; Lancet
1995, 345 (8943) 152-155); y que un aumento del
nivel del FVIII en plasma podría ser un factor de riesgo para el
infarto arterial o la arteriosclerosis (Semin. Hematol. 1997, 34,
171-187; Thromb. Res. 1997, 84,
359-362).
Por lo tanto, se espera que, si pudiera
mantenerse una baja coagulación sanguínea usando un anticuerpo
inhibidor anti-FVIII, esto podría contribuir a la
prevención y tratamiento del infarto arterial y de la
arteriosclerosis. En particular, un anticuerpo
anti-FVIII que reconoce específicamente el FVIII
activado sin factor de von Willebrand (en lo sucesivo también
denominado en este documento "vWF") muestra un tiempo de
eliminación en sangre muy largo impidiendo la formación del
complejo del FVIII normalmente unido con el vWF en sangre, y por lo
tanto puede ser un fármaco anti-trombótico
excelente con el que puede mantenerse una baja coagulación sanguínea
durante un largo periodo de tiempo con una sola administración y
pueden reducirse en gran medida las hemorragias u otros efectos
secundarios adversos.
Han sido numerosos los intentos para preparar
anticuerpos monoclonales de ratón contra FVIII en muchos
laboratorios incluyendo los preparados por los presentes inventores
y de esta manera se han producido varios anticuerpos monoclonales
contra FVIII. Algunos de ellos han demostrado inhibir la actividad
del FVIII y comportarse como un anticuerpo inhibidor
anti-FVIII. Con estos anticuerpos monoclonales de
ratón, se han obtenido numerosos resultados incluyendo el análisis
de regiones que inhiben la actividad del FVIII, etc.
Sin embargo, apenas se ha preparado con éxito un
anticuerpo inhibidor anti-FVIII completamente
humano, aunque se ha intentado durante más de diez años en muchos
laboratorios con la técnica del hibridoma (técnica del hibridoma
humano/ratón o humano/humano) o la técnica de transformación EB,
usando linfocitos de pacientes que tienen anticuerpos inhibidores
anti-FVIII.
En 1998, Marc G. Jacquemin et al.
informaron por primera vez del establecimiento de un método para
preparar un anticuerpo inhibidor anti-FVIII
completamente humano usando la técnica de transformación EB (Blood,
92(2), 1998, 496-506). Establecieron el
anticuerpo BO2C11 que se pensaba que inhibía la unión del FVIII con
el vWF o con fosfolípidos y que reconocía el dominio C2 del FVIII.
Los genes VH y VL de este anticuerpo procedían del fragmento DP5 y
V\kappa3, respectivamente. También consiguieron establecer clones
productores de anticuerpos inhibidores anti-Factor
VIII contra el dominio C1 con un método similar e informaron que los
anticuerpos procedían de DP64 y V\kappa3 (Blood, 95, 2000,
156-163). Hasta este momento, únicamente Marc G.
Jacquemin et al. han establecido un clon que produce dicho
anticuerpo inhibidor anti-FVIII de procedencia
humana con la técnica del hibridoma (técnica del hibridoma
humano/ratón o humano/humano) o la técnica de transformación EB.
Por otro lado, la tecnología de presentación de
anticuerpos en fagos comunicada por J. D. Marks et al. (J.
Mol. Biol, 222, 581-597, 1991) es ventajosa ya que
puede seleccionarse un repertorio de anticuerpos de linfocitos de
pacientes en un menor periodo de tiempo y en más clones que en la
técnica del hibridoma convencional o en la técnica de
transformación EB. En los últimos años, se ha intentado usar esta
tecnología de presentación de anticuerpos en fagos para aislar el
anticuerpo inhibidor.
\global\parskip0.990000\baselineskip
W. H. Ouehand et al. informaron en el
Congreso Internacional de Trombosis y Hemostasis, en junio de 1995
(Israel) (1995, ISTH) que clonaron un anticuerpo monocatenario
(scFv) anti-FVIII humano procedente de bibliotecas
de fagos de presentación de anticuerpos humanos de donantes sanos y
de una biblioteca de anticuerpos de fagos humanos sintéticos. J.
Davis et al. también informaron en el Congreso Internacional
de Trombosis y Hemostasis, en junio de 1997, que clonaron un
anticuerpo monocatenario (scFv) anti-FVIII humano
procedente de bibliotecas de fagos de presentación de anticuerpos
humanos donde los genes VH procedían de pacientes hemofílicos y los
genes VL procedían de donantes sanos. En estos informes, sin
embargo, las bibliotecas de fagos de presentación de anticuerpos
humanos se construyeron de una manera sintética o
semi-sintética en la que ni VH ni VL procedían de
pacientes hemofílicos. Además, aunque los clones obtenidos en estos
informes se unían al FVIII como se demuestra por un ELISA, no se
demostró si los clones inhibían la actividad de coagulación del
FVIII.
En el año 2000, E. N. van den Brink et
al. informaron que habían construido una biblioteca de fagos de
presentación de anticuerpos en los que los genes de cadena VL
procedían de donantes sanos y los genes de cadena VH procedían de
pacientes que tenían los anticuerpos inhibidores y aislaron cuatro
clones reactivos con el FVIII, de los cuales dos clones
reaccionaban con el dominio C2 del FVIII mientras que los otros dos
reaccionaban con el dominio A2 del FVIII [van Den Brink, Human
antibodies with specificity for the C2 domain of factor VIII are
derived from VH1 germline genes (Blood, 2000; 95:
558-563); Molecular analysis of human
anti-factor VIII antibodies by V gene phage display
identifies a new epitope in the acidic region following the A2
domain (Blood, 2000; 96: 540-545)].
Se ha notificado que el dominio C2 del FVIII
participaba en la unión con vWF o con fosfolípidos y era una región
principal de reconocimiento de muchos anticuerpos inhibidores
anti-FVIII presentes en la sangre de los pacientes
(Healey, J. F. et al., Residues Glu2181 - Val2243 contain a
major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of
human factor VIII, Blood, 1998, 92, 3701-3709).
De acuerdo con el estudio de van den Brink et
al., los fragmentos del anticuerpo contra el dominio C2
obtenidos de este modo no tenían una actividad inhibidora contra el
FVIII. Por consiguiente, aún no se ha aislado con éxito un
anticuerpo anti-FVIII humano con actividad
\hbox{inhibidora, por lo que no se ha podido proporcionar
suficiente información.}
Se supuso que el motivo de por qué un anticuerpo
anti-FVIII humano con actividad inhibidora no podía
aislarse con éxito con la tecnología de fagos de presentación de
anticuerpos es porque los genes de cadena VL de los fragmentos de
anticuerpos no procedían de pacientes y porque podía haber algunos
problemas en el procedimiento de selección.
Los presentes inventores trataron y resolvieron
los problemas mencionados anteriormente. Como resultado, los
presentes inventores consiguieron aislar nuevos anticuerpos
inhibidores anti-FVIII que tenían una marcada
especificidad y la actividad inhibidora para el FVIII de linfocitos
de un paciente mediante la tecnología de fagos de presentación de
anticuerpos y analizaron las cadenas VH y VL de dichos anticuerpos
específicos.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a los siguientes puntos:
Punto 1. Un fragmento génico que codifica una
cadena VH de un anticuerpo humano contra el factor de la coagulación
sanguínea VIII (FVIII) que tiene una actividad de inhibición de la
actividad de coagulación (actividad inhibidora) del FVIII humano,
donde dicho anticuerpo anti-FVIII humano no reconoce
un complejo FVIII/factor von Willebrand (vWF) y reconoce únicamente
el FVIII sin vWF, y donde las regiones determinantes de
complementariedad (CDR1 a CDR3) de dicha cadena VH tienen las
siguientes secuencias aminoacídicas:
- \quad
- CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEC ID Nº:13);
- \quad
- CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Val Ser Ala Gln Arg Phe Gln Gly (Xaa = Thr o Ala) (SEC ID Nº:14);
- \quad
- CDR3: Gly Val Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEC ID Nº:15).
Punto 2. El fragmento génico del punto 1, en el
que dicha cadena VH tiene una secuencia de nucleótidos que codifica
la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste
en las SEC ID Nº: 2, 6 y 10.
Punto 3. Un fragmento génico que codifica una
cadena VL de un anticuerpo anti-FVIII humano que
tiene una actividad de inhibición de la actividad de la coagulación
(actividad inhibidora) del FVIII humano, donde dicho anticuerpo
anti-FVIII humano no reconoce un complejo
FVIII/factor von Willebrand y reconoce únicamente el FVIII sin vWf,
y donde las regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a
CDR3) de dicha cadena VL tienen las siguientes secuencias de
aminoácidos:
- \quad
- CDR1: Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xa1 Xa2 Tyr Leu Asn (Xa1 = Ser o Thr; Xa2 = Ser o Arg) (SEC ID Nº: 16);
- \quad
- CDR2: Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser (SEC ID Nº:17);
- \quad
- CDR3: Gln Xa1 Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr (Xa1 = Gln o His; Xa2 = Ser o Thr; Xa3 = Leu o Ile) (SEC ID Nº: 18).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Punto 4. El fragmento génico del punto 3, en el
que dicha cadena VL tiene una secuencia de nucleótidos que codifica
la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste
en las SEC ID Nº: 4, 8 y 12.
Punto 5. Un gen FV monocatenario (scFv) que
comprende el fragmento génico que codifica la cadena VH que se
indica en el punto 1 ó 2 unido al fragmento génico que codifica la
cadena VL que se indica en el punto 3 ó 4.
Punto 6. Un fragmento génico que codifica el
anticuerpo anti-FVIII humano que comprende el
fragmento génico que codifica la cadena VH que se indica en el
punto 1 ó 2 unido al fragmento génico que codifica la cadena VL que
se indica en el punto 3 ó 4, donde dicho fragmento génico que
codifica la cadena VH y dicho fragmento génico que codifica la
cadena VL están unidos a un gen de cadena CH de anticuerpo humano y
a un gen de cadena CL de anticuerpo humano, respectivamente.
Punto 7. Un fragmento génico que codifica un
fragmento de anticuerpo anti-FVIII humano que
comprende el fragmento génico que codifica la cadena VH que se
indica en el punto 1 ó 2 y/o el fragmento génico que codifica la
cadena VL que se indica en el punto 3 ó 4, donde dicho fragmento
génico que codifica la cadena VH y/o dicho fragmento génico que
codifica la cadena VL están unidos a un gen de cadena CH de
anticuerpo humano o a una parte del mismo y a un gen de cadena CL
de anticuerpo humano o a una parte del mismo, respectivamente.
Punto 8. El fragmento génico del punto 7, en el
que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona entre el grupo que
consiste en Fab, Fab' y F(ab')_{2}.
Punto 9. Un fragmento génico que codifica un
fragmento de anticuerpo anti- FVIII humano que comprende el gen de
Fv monocatenario que se indica en el punto 5 unido a un gen de
cadena CH de anticuerpo humano o a una parte del mismo o a un gen
de cadena CL de anticuerpo humano o a una parte del mismo.
Punto 10. Un anticuerpo
anti-FVIII humano o un fragmento de anticuerpo
anti-VIII humano expresado mediante la técnica de
ingeniería genética a partir de un vector de expresión en el que se
incorpora el fragmento génico que se indica en cualquiera de los
puntos 1 a 9.
Punto 11. Un medicamento para la prevención y el
tratamiento de trombosis que comprende el anticuerpo
anti-FVIII humano o el fragmento de anticuerpo
anti-VIII humano que se indica en el punto 10.
Punto 12. Un agente de diagnóstico para el FVIII
activado que comprende el anticuerpo anti-FVIII
humano o el fragmento de anticuerpo anti-FVIII
humano que se indica en el punto 10.
Punto 13. Uso del anticuerpo
anti-FVIII humano o el fragmento de anticuerpo
anti-FVIII humano que se indica en el punto 10 para
preparar un medicamento para la prevención y tratamiento de
trombosis.
La figura 1 muestra una medición del FVIII
humano por ELISA donde una placa ELISA inmovilizada con el
anticuerpo monoclonal de ratón A2 anti-FVIII humano
se combina con los clones de scFv obtenidos.
La figura 2 muestra una medición de FVIII con el
kit TestTeam FVIII usando los tres scFv anti-FVIII
humano purificados.
La figura 3 muestra la estimación de una
actividad residual del FVIII con los scFv purificados midiendo el
Tiempo de Activación Parcial de Tromboplastina (APTT) donde se usó
como FVIII humano el FVIII sin vWF o una preparación de FVIII que
comprendía vWF multimérico.
Para obtener información sobre la región
variable (V) de un anticuerpo inhibidor anti-FVIII
humano, los presentes inventores amplificaron en primer lugar,
mediante la RT-PCR, los ADNc de cadenas pesadas y
ligeras de inmunoglobulina de linfocitos B de sangre periférica de
un paciente con hemofilia A que tenía anticuerpos inhibidores
anti-FVIII. Ambos ADNc obtenidos se unieron entre
sí con ADN enlazadores para preparar ADN de Fv monocatenarios (scFv)
en combinaciones aleatorias de cadenas VH y VL procedentes de
linfocitos de pacientes.
Los ADN de scFv se incorporaron en el vector
fagémido pCANTAB5E para preparar bibliotecas de fagos de
presentación de scFv de pacientes con hemofilia A que comprenden
10^{7} clones. Las bibliotecas después se hicieron reaccionar con
FVIII inmovilizado en una fase sólida mediante anticuerpo monoclonal
anti-FVIII para seleccionar clones de fagos de
presentación de scFv anti-FVIII capaces de unirse a
FVIII.
El anticuerpo monoclonal
anti-FVIII usado en este documento se prepara
mediante técnicas convencionales e incluye un anticuerpo monoclonal
de ratón. El anticuerpo monoclonal anti-FVIII
reconoce preferiblemente un epítopo conformacional del dominio A2
del FVIII o de una cadena L del FVIII activado. Con el uso de este
anticuerpo, es posible mantener el FVIII sobre el soporte sólido
sin afectar significativamente a su conformación. De esta manera,
en este sistema de selección descrito en el contexto de esta
invención, se obtendrán clones de fagos que presentan scFv
anti-FVIII que reconocen epítopos distintos de los
reconocidos por los respectivos anticuerpos monoclonales
anti-FVIII de ratón.
Marcando el anticuerpo monoclonal con biotina y
usando partículas magnéticas inmovilizadas con avidina como una
fase sólida, pueden recuperarse fácilmente clones de fagos de
presentación de scFv anti-FVIII capaces de unirse
al FVIII humano.
Los anticuerpos monoclonales
anti-FVIII de ratón conjugados con biotina permiten
la selección sin necesidad de purificar el FVIII y con una cantidad
muy pequeña de FVIII.
Como resultado de la selección, se aislaron
siete clones de scFv con actividad para unirse a
anti-FVIII y tres de estos clones inhibieron la
actividad de coagulación del FVIII. Los tres clones obtenidos
consistían en un gen de VH de DP-5
(1-24) de la familia VH1 y un gen de VL de DPK9
(012/02) de la familia V\kappa1. Los otros cuatro clones
consistían en un gen de VH de DP-88 ó 4M28 de la
familia VH1 y un gen de VL de DPK22, Vg, DPK9 o IGLV6S1, que eran
diferentes de los de los clones que tenían la actividad inhibidora.
Los genes de VH de los clones que inhibían la actividad de
coagulación del FVIII procedían del segmento DP-5
como en Marc G. Jacquemin et al., pero una secuencia de
aminoácidos de CDR3 en VH difería mucho de la de Marc G. Jacquemin
et al. Además, al observar que la actividad de estos clones
para unirse al FVIII casi se había perdido tras la mutación de
serina o treonina en glutamina en la CDR3 de la cadena de VL, se
reveló que la CDR3 de la cadena VL juega un papel importante en la
unión de estos clones al FVIII.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
de las cadenas VH y VL de los tres clones obtenidos (YK3.3.38,
YK3.3.40 e YK3.3.50) se muestran en la lista de secuencias en la que
las secuencias de las cadenas VH y VL de YK3.3.38 se mostraron en
las SEC ID Nº: 1-2 y 3-4; las
secuencias de las cadenas VH y VL de YK3.3.3.40 en las SEC ID Nº:
5-6 y 7-8; y las secuencias de las
cadenas VH y VL de YK3.3.3.50 en las SEC ID Nº:9-10
y 11-12, respectivamente.
Entre estas secuencias, las secuencias de
aminoácidos de CDR1 a CDR3 de las cadenas VH y VL se muestran en
las SEC ID Nº: 13 a 18. Las CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen
por E. A. Kabat et al. [Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 4 ed., U.S. Department of Health and Human
Services, Washington DC 1987].
[cadena VH]
- \quad
- CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEC ID Nº:13)
- \quad
- CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Val Ser Ala Gln Arg Phe Gln Gly (Xaa = Thr o Ala) (SEC ID Nº:14)
- \quad
- CDR3: Gly Val Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEC ID Nº:15)
\vskip1.000000\baselineskip
[cadena VL]
- \quad
- CDR1: Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xa1 Xa2 Tyr Leu Asn (Xa1 = Ser o Thr; Xa2 = Ser o Arg) (SEC ID Nº: 16);
- \quad
- CDR2: Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser (SEC ID Nº:17);
- \quad
- CDR3: Gln Xa1 Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr (Xa1 = Gln o His; Xa2 = Ser o Thr; Xa3 = Leu o Ile) (SEC ID Nº: 18).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
mostradas en las SEC ID Nº: 1-2 y
3-4, 5-6 y 7-8,
9-10 y 11-12 corresponden
respectivamente a la región V de cadena pesada (cadena VH) y de
cadena ligera (cadena VL) del anticuerpo inhibidor
anti-FVIII humano que tiene actividad para inhibir
la actividad de coagulación del FVIII.
La cadena VH y/o la cadena VL descritas en este
documento se obtuvieron en forma de scFv mediante la tecnología de
fagos de presentación de anticuerpos. Sin embargo, su aplicación no
se limita a los scFv. Concretamente, la cadena VH y/o la cadena VL
descritas en este documento también pueden tener la forma de una
molécula completa de un anticuerpo en el que la cadena VH y/o la
cadena VL están unidas a la región constante de una inmunoglobulina
humana, o en forma de otros fragmentos de anticuerpo, incluyendo
Fab, Fab' o F(ab')_{2} en los que la cadena VH y/o la
cadena VL están unidas a una parte de la región constante de una
inmunoglobulina humana, o un anticuerpo monocatenario (scAb) en el
que el scFv está unido a la región constante de una inmunoglobulina
humana.
La presente invención también prevé una molécula
de proteína modificada, donde una molécula de proteína del
anticuerpo o fragmento de anticuerpo de esta invención se conjuga
con un modificador de elevado peso molecular.
Como resultado del análisis de la naturaleza del
fragmento de anticuerpo obtenido de acuerdo con la presente
invención, el epítopo del FVIII reconocido por el fragmento de
anticuerpo se perdió por el tratamiento con SDS del FVIII. Además,
tras la unión con el fragmento de anticuerpo, el FVIII no podía
unirse a fosfolípidos o al vWF. De esta manera se concluyó que el
fragmento de anticuerpo no se unía al FVIII unido a vWF como aparece
en el flujo sanguíneo, sino que solo se une a una forma activada
del FVIII sin vWF.
El fragmento de anticuerpo compite con los
anticuerpos inhibidores del plasma de un paciente. Se presumió por
tanto que el fragmento de anticuerpo reconocía el mismo epítopo que
los anticuerpos inhibidores del paciente, un epítopo dependiente de
la estructura en el dominio C2, y que tenía propiedades parecidas a
las de los anticuerpos inhibidores del paciente.
La actividad inhibidora del FVIII del fragmento
de anticuerpo fue extremadamente potente, es decir, de 6.700 a
29.100 unidades Bethesda/mg.
Como se ha mencionado anteriormente, el
anticuerpo monoclonal humano y la molécula del fragmento de
anticuerpo de la presente invención pueden inhibir de forma potente
la actividad de coagulación del FVIII y por tanto pueden incluirse
en un medicamento para la prevención y el tratamiento de trombosis.
En particular, el anticuerpo monoclonal humano y la molécula de
fragmento de anticuerpo de la presente invención no reconocen un
complejo FVIII-vWF, sino que reconocen únicamente
una forma activada del FVIII sin factor de von Willebrand, lo que
les permite reaccionar con el FVIII activado
\hbox{solo pero no
con el complejo FVIII-vWF como sucede normalmente
en la sangre.}
Esto demuestra que el anticuerpo monoclonal
humano y la molécula de fragmento de anticuerpo de la presente
invención es un nuevo agente anti-trombótico
excelente en el que caben esperar efectos excelentes no encontrados
en los agentes anti-trombóticos convencionales,
tales como una elevada vida media en sangre y un menor grado de
efectos secundarios adversos tales como hemorragias y sus efectos
pueden controlarse midiendo el APTT.
Además, basándose en sus propiedades, el
anticuerpo monoclonal humano y la molécula de fragmento de
anticuerpo de la presente invención pueden combinarse con un
anticuerpo anti-FVIII que reconoce un epítopo
diferente (determinante antigénico) para proporcionar un
inmunoensayo
\hbox{para medir un nivel en sangre de un FVIII
activado sin vWF.}
Además, el anticuerpo monoclonal humano y la
molécula de fragmento de anticuerpo de la presente invención tienen
muchas aplicaciones cuando se forman en un complejo con un material
inmunoabsorbente que comprende un adsorbente inmunologicamente
inactivo.
En primer lugar, puede aplicarse para purificar
una cantidad muy pequeña del FVIII presente en el plasma humano o
en el suero por cromatografía de afinidad. También puede aplicarse
para purificar el FVIII producido en el sobrenadante de cultivo por
células de cultivo transformadas mediante la técnica de
recombinación genética.
En segundo lugar, en este documento se describe
que el anticuerpo monoclonal humano y la molécula de fragmento de
anticuerpo de la presente invención pueden usarse en un inmunoensayo
para purificar anticuerpos anti-idiotipo contra la
región variable de la molécula a partir de fracciones o
preparaciones de plasma humano o suero o inmunoglobulina humana.
Esto implica nuevas opciones de medicamentos para el tratamiento de
pacientes que tienen los anticuerpos inhibidores con propiedades
similares a las del anticuerpo de la presente invención.
Concretamente, es posible que estos medicamentos
inhiban la actividad de los anticuerpos inhibidores
anti-FVIII al eliminar los anticuerpos inhibidores
por medio de la administración sucesiva de los anticuerpos
anti-idiotipo mencionados anteriormente a los
pacientes antes de o simultáneamente con la administración de las
preparaciones del FVIII, o mediante una técnica de inmunoadsorbente
usando los anticuerpos anti-idiotipo. Actualmente,
en el tratamiento de pacientes que tienen los anticuerpos
inhibidores, especialmente en caso de hemorragias graves o durante
la operación, se han administrado a los pacientes grandes cantidades
de preparaciones del FVIII para neutralizar los anticuerpos
inhibidores en sangre y alcanzar el nivel hemostático. Se sabe, sin
embargo, que este tratamiento induce un aumento de los anticuerpos
inhibidores que conduce a una reducción del efecto hemostático o la
tendencia a hemorragias. Los anticuerpos
anti-idiotipo que se describen en este documento,
por el contrario, son ventajosos puesto que tienen una baja
inmunogenicidad como anticuerpo humano y menos efectos secundarios
adversos debido a su especificidad.
También es posible eliminar específicamente
anticuerpos inhibidores cuando se inmoviliza una columna con los
anticuerpos anti-idiotipo en lugar de una columna
inmovilizada con Proteína A que se ha usado para retirar
anticuerpos inhibidores.
La presente invención también describe un nuevo
fármaco de terapia de tolerancia para inducir la producción de
anticuerpos anti-idiotipo contra el anticuerpo
inhibidor usando un péptido de la región variable, específicamente
de la región determinante de complementariedad (CDR), del anticuerpo
monoclonal humano o del fragmento de anticuerpo de la presente
invención, o un soporte de alto peso molecular modificado con dicho
péptido. Ya se ha intentado la terapia de tolerancia con las
preparaciones del FVIII en pacientes que tienen anticuerpos
inhibidores. En esta terapia, las preparaciones del FVIII se
administran repetidamente en un curso regular a pacientes cuando no
hay sangrado de manera que se reduce la titulación de inhibidores o
los anticuerpos inhibidores se eliminan totalmente. Sin embargo
esta terapia tiene la desventaja de ser extremadamente costosa,
conlleva un riesgo de aumentar la tendencia a hemorragias o
anafilaxis, y sólo puede aplicarse a pacientes que tienen los
anticuerpos inhibidores a un nivel comparativamente inferior, ya que
en esta terapia las preparaciones del FVIII de 100 a 200
unidades/kg se administran diariamente dos veces al día o las
preparaciones del FVIII de 25 unidades/kg se administran cada dos
días durante un largo periodo de tiempo.
La patente japonesa Nº 2838166 describe una
composición farmacéutica para inhibir la producción de inhibidores
usando un complejo inmunológico que comprende un antígeno de FVIII y
un inhibidor de FVIII obtenido a partir del plasma de pacientes y
un método para inhibir la producción de inhibidores. Sin embargo, el
anticuerpo inhibidor anti-FVIII usado en este
documento se prepara básicamente a partir de componentes del plasma
humano de pacientes y, por tanto, sería necesario un trabajo
prodigioso para preparar el componente y difícilmente podría
mantenerse una calidad homogénea. Además, se han notificado casos en
los que se ha observado una gran cantidad de complejos
inmunológicos en el plasma de pacientes que tienen los anticuerpos
inhibidores. Por lo tanto, es necesario considerar la mejora de la
deposición de los complejos en el bazo así como los efectos
secundarios adversos.
En contraste, como se ha descrito de acuerdo con
la presente invención, la producción de anticuerpos
anti-idiotipo contra el anticuerpo inhibidor se
induce usando un péptido de la región variable, especialmente de la
región determinante de complementariedad (CDR), del anticuerpo
monoclonal humano o el fragmento de anticuerpo de la presente
invención, o un soporte de alto peso molecular modificado con dicho
péptido, que permita de esta manera la manipulación como una vacuna
convencional.
Cuando los pacientes tienen anticuerpos
inhibidores con la misma especificidad y reactividad que los del
anticuerpo monoclonal humano y fragmento de anticuerpo de la
presente invención, se considera que su idiotipo también es el
mismo.
Los presentes inventores han descubierto que,
entre las regiones variables del anticuerpo descrito en este
documento, la región CDR3 de la cadena H y la región CDR3 de la
cadena C contribuyen particularmente a estabilizar la unión entre
los anticuerpos inhibidores y el FVIII. Por lo tanto, cabe esperar
que pueda suprimirse la acción de los anticuerpos inhibidores en la
sangre inmunizando pacientes con péptidos de estas CDR para inducir
la producción de anticuerpos anti-idiotipo. Además,
los medicamentos y usos descritos en el contexto de la presente
invención, en los que se induce la producción de anticuerpos
anti-idiotipo contra la región determinante de
complementariedad, entre otras cosas, de los anticuerpos
inhibidores, permitiría una terapia segura de la trombosis, siendo
dicha terapia extremadamente específica y sin riesgo de aumentar la
tendencia a hemorragias, etc.
El anticuerpo monoclonal humano de la presente
invención puede neutralizar la actividad de coagulación del Factor
VIII y puede comprender un medicamento para la prevención y el
tratamiento de la trombosis. El anticuerpo monoclonal humano de la
presente invención no reconoce un complejo de Factor VIII/factor von
Willebrand, sino que reconoce únicamente el Factor VIII sin el
factor von Willebrand. Por consiguiente, puede ser un excelente
agente anti-trombótico nuevo con una vida media
extremadamente larga en la sangre con menor tendencia a las
hemorragias, y su efecto pueden controlarse midiendo el APTT.
El anticuerpo monoclonal de la presente
invención también permite la detección in vitro del FVIII
activado en sangre.
El anticuerpo monoclonal humano de la presente
invención también posibilita aislar un péptido para que sea un
epítopo antigénico y aislar anticuerpos
anti-idiotipo en plasma. Se espera que el péptido y
los anticuerpos anti-idiotipo obtenidos sean
eficaces, desde el punto de vista de los mecanismos de
neutralización o tolerancia, para el tratamiento de los pacientes
hemofílicos que tienen el anticuerpo inhibidor.
La presente invención describe además un nuevo
fármaco de terapia de tolerancia para inducir la producción de
anticuerpos anti-idiotipo contra los anticuerpos
inhibidores usando un péptido de la región variable, especialmente
de la región determinante de complementariedad (CDR), del anticuerpo
monoclonal humano o del fragmento de anticuerpo de la presente
invención, o un soporte de alto peso molecular modificado con dicho
péptido.
La presente invención se explica con más detalle
mediante los siguientes ejemplos que, sin embargo, no pretenden
limitar el alcance de la presente invención en ningún sentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
1
Se construyó una biblioteca de fagos en relación
con el método indicado por J. D. Marks et al. (J. Mol. Biol.,
222:581-597, 1991).
Los linfocitos se separaron con Ficoll a partir
de sangre periférica (28 ml) de un paciente que presentaba el
anticuerpo inhibidor anti-FVIII, se lavaron
minuciosamente con PBS y se trataron con ISOGEN (Nippon Gene Co.,
Ltd) para preparar un ARN total. El ARN total obtenido se dividió en
tres partes, y con cada una de ellas se realizó una transcripción
inversa con cebadores p específicos para las regiones constantes de
IgG humana, cadena \kappa o cadena \lambda con el kit de
Síntesis de ADNc de Cadena Inicial (Pharmacia bio tec) para
preparar los ADNc para las regiones constantes respectivas. Los ADNc
obtenidos se usaron después como una plantilla para amplificar los
genes de la región V del anticuerpo mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos para familias
génicas como una combinación de VH + JH, V\kappa + J\kappa, y
V\lambda + J\lambda, como indicó Marks et al.
Los genes de VH y V\kappa, y los genes de VH y
V\lambda, respectivamente, se unieron entre sí con los ADN
enlazadores por la técnica de la PCR de ensamblaje para preparar ADN
de scFv monocatenarios. Los ADN de scFv obtenidos se añadieron con
sitios de enzimas de restricción NotI y SfiI por PCR, se sometieron
a electroforesis en gel de agarosa y se purificaron. Los ADN de
scFv purificados se digirieron con enzimas de restricción SfiI
(Takara) y NotI (Takara) y se clonaron en el fagémido pCANTAB5E
(Pharmacia). Los fagémidos pCANTAB5E en los que se habían
incorporado los ADN de scFv se introdujeron en células TG1 de E.
coli por electroporación por separado de
VH-V\kappa y VH-V\lambda. A
juzgar por el número de células TG1 transformadas, se estimó que
VH-V\kappa y VH-V\lambda tenían
una diversidad de clones de 1,03 x 10^{7} y 4,85 x 10^{6},
respectivamente. Usando las células TG1 transformadas, se
expresaron anticuerpos de los fagos usando el fago auxiliar M13KO7
para preparar una
\hbox{biblioteca de fagos de presentación de
scFv procedente de un paciente.}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
El Factor VIII (Cross Eight M; 10 unidades/ml)
disuelto en un tampón de selección (leche descremada al 4%,
albúmina de suero bovino al 0,5%, IgG de ratón a 50 \mug/ml, Tween
20 al 0,1%, TBS; 500 \mul) y 0,5 \mug/ml de anticuerpos
monoclonales anti-Factor VIII conjugados con biotina
FVIII:C14-182 (ratón; Factor VIII que reconoce la
cadena L) o FVIII:C14-282 (ratón; FVIII que reconoce
el dominio A2 de la cadena H) disueltos en un tampón de selección
(500 \mul) se mezclaron en un tubo de plástico (FALCON 2058) para
reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A esto se
añadió la biblioteca de fagos de presentación de anticuerpos humanos
procedentes de pacientes (una solución de fagos que presentan
anticuerpos monocatenarios; 1 ml) para reaccionar a temperatura
ambiente durante 1 hora y después a 4ºC durante una noche.
Se añadieron partículas magnéticas unidas a
avidina (Perseptive; 100 \mul) tratadas con leche descremada al
2%/
Tween 20 al 0,05%/TBS a la mezcla anterior de anticuerpo monoclonal anti-VIII conjugado con FVIII/biotina (1 ml) y la mezcla se mezcló suavemente boca abajo durante 15 minutos. Las partículas magnéticas se recogieron con una rejilla magnética y se lavaron ocho veces con Tween 20 al 0,05%/TBS y después dos veces con tampón Tris. Después de lavar las partículas magnéticas, se suspendieron en un tampón de glicina (1 ml) y se dejó reposar la suspensión a temperatura ambiente durante 10 minutos para eluir los fagos de presentación de anticuerpos monocatenarios. A la solución de fagos eluidos, después de ajustar el pH con Tris(hidroximetil)aminometano-HCL (pH 7,5; 500 \mul), se le añadió cultivo TG1 de E. coli (5 ml) en fase de crecimiento logarítmico y se agitó la mezcla suavemente a 37ºC durante una hora para infectar TG1 de E. coli.
Tween 20 al 0,05%/TBS a la mezcla anterior de anticuerpo monoclonal anti-VIII conjugado con FVIII/biotina (1 ml) y la mezcla se mezcló suavemente boca abajo durante 15 minutos. Las partículas magnéticas se recogieron con una rejilla magnética y se lavaron ocho veces con Tween 20 al 0,05%/TBS y después dos veces con tampón Tris. Después de lavar las partículas magnéticas, se suspendieron en un tampón de glicina (1 ml) y se dejó reposar la suspensión a temperatura ambiente durante 10 minutos para eluir los fagos de presentación de anticuerpos monocatenarios. A la solución de fagos eluidos, después de ajustar el pH con Tris(hidroximetil)aminometano-HCL (pH 7,5; 500 \mul), se le añadió cultivo TG1 de E. coli (5 ml) en fase de crecimiento logarítmico y se agitó la mezcla suavemente a 37ºC durante una hora para infectar TG1 de E. coli.
Las células TG1 infectadas se centrifugaron a
3.000 x g durante 5 minutos, y después de retirar el sobrenadante,
se suspendieron en medio 2 x YT (200 \mul), se inocularon en una
placa SOBAG, y se cultivaron en una incubadora a 30ºC toda la
noche. Las colonias formadas se recuperaron añadiendo una cantidad
apropiada de medio 2 x YT y suspendiendo las colonias con un
raspador (Coastor). Las células TG1 (500 \mul) se inocularon en
medio 2 x YTAG y se rescataron con un fago auxiliar para preparar
una biblioteca de fagos de presentación de anticuerpos humanos
después de la selección. La selección se repitió tres veces para
cada biblioteca de fagos procedente de pacientes hemofílicos,
VH-V\kappa y VH-V\lambda. Tras
la tercera selección, los clones se seleccionaron opcionalmente de
la placa SOBAG, y se confirmó la expresión de scFv, se confirmó su
especificidad mediante ELISA de tipo sándwich de FVIII y se analizó
la secuencia de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
3
Se expresó un scFv soluble con E. coli
HB2151, se recuperó a partir de una fracción periplásmica de E.
coli y se purificó ligeramente. Cuando se necesitó purificación
adicional, la purificación de afinidad se realizó con el Módulo de
Purificación RAPAS (Pharmacia Biotech).
La pureza de la proteína scFv purificada se
confirmó mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS y transferencia de Western
dirigida al epítopo E-Tag en el extremo
C-terminal de la proteína scFv. Se determinó la
concentración de proteínas del scFv purificado con un kit de Ensayo
de Proteínas (BIO-RAD).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
4
Para seleccionar los clones aislados se realizó
un ELISA según se describe a continuación.
Para la selección, se inmovilizaron dos
anticuerpos monoclonales de ratón anti-FVIII que
reconocen distintos determinantes antigénicos, FVIII:
C14-182 que reconoce la cadena L del FVIII y
FVIII:C14-282 que reconoce el dominio A2 de la
cadena H del FVIII, en una placa ELISA. Los anticuerpos monoclonales
anti-FVIII (5 \mug/ml; 100 \mul/pocillo),
FVIII:C14-182 ó FVIII:C14-282 se
colocaron en una placa ELISA (módulo MAXISORP (Nunc)) y la paca se
selló con un sellador de placas (Sanko Junyaku Co., Ltd.) y se dejó
reposar a temperatura ambiente o a 4ºC durante la noche para
inmovilizar los anticuerpos. Después de lavar con TBS tres veces, se
añadió un 1% de BSA en TBS (300 \mul/pocillo) a la placa, que
después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora para
el bloqueo.
A la placa ELISA se le añadió una solución de
Factor VIII (Cross Eight M1000; Cruz Roja Japonesa; 10 unidades/ml;
100 \mul/pocillo) y la placa se selló con un sellador de placas y
se dejó reposar a 37ºC durante 2 horas. Después se desechó la
solución de FVIII, la placa ELISA se lavó 5 veces con una solución
de lavado de placas ELISA y se añadieron soluciones de muestra (100
\mul/pocillo) que contenían los scFv o los fagos que presentan
los scFv para reaccionar a temperatura ambiente durante toda la
noche. Después de desechar las soluciones de muestra y de lavar
cinco veces la placa ELISA con una solución de lavado, se añadió un
anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (100
\mul/pocillo) para reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después de
desechar la solución de la reacción y de lavar cinco veces la placa
ELISA con una solución de lavado de placas ELISA, se añadió una
solución de sustrato para el revelado (TMBZ-peróxido
de hidrógeno; 100 \mul/pocillo) para el revelado a temperatura
ambiente a 37ºC durante 5 a 10 minutos con protección contra la luz.
Se añadió ácido sulfúrico 1 N (100 \mul/pocillo) a la placa para
parar el revelado y se midió la absorbancia a 450 nm con el
Multiplate Autoreader SPECTRA MAX de Molecular Device. Como
resultado, se confirmó que los 99 clones estimados eran específicos
para el FVIII mediante ELISA de tipo sándwich de FVIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
5
Se amplificaron por PCR las regiones
flanqueantes del gen de scFv de las colonias aisladas. Los productos
de la PCR obtenidos se digirieron con tres a cinco enzimas de
restricción tales como PstI y KpnI y se sometieron a electroforesis
en gel de agarosa y las colonias se clasificaron basándose en sus
patrones de bandas. Como resultado, se identificaron 13 clones que
contenían un gen completo de scFv. Las secuencias de ADN de los
genes de VH y VL de estos clones se determinaron con el kit Dye
Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (Applied
Biosystems).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se realizaron ensayos ELISA de FVIII y de
inhibición de la actividad de coagulación para los scFv purificados
para confirmar que 7 scFv se unían específicamente al FVIII. Entre
éstos, se encontraron tres scFv que inhibían la actividad de
coagulación del FVIII. Estos tres clones, YK3.3.38, YK3.3.40 y
YK3.3.50, se estudiaron adicionalmente.
En una placa (módulo MAXISORP (Nunc))
inmovilizada con los anticuerpos monoclonales
anti-FVIII, FVIII:C14-182 o
FVIII:C14-282, se añadió una solución de FVIII
(Cross Eight M1000; Cruz Roja Japonesa; 100 \mul/pocillo),
preparada a una concentración de 0,001 a 10 unidades/ml, y la placa
ELISA se selló con un sellador de placas y se dejó reposar a 37ºC
durante 2 horas. Después de retirar la solución del FVIII por
aspiración y de lavar 5 veces la placa con una solución de lavado,
se añadió una solución de scFv (100 \mul/pocillo) para reaccionar
a temperatura ambiente durante la noche. Después de retirar la
solución de muestra aspirando y de lavar 5 veces la placa con una
solución de lavado, se añadió un anticuerpo
anti-Etag marcado con peroxidasa de rábano picante
(100 \mul/pocillo) para reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después
de retirar la solución de muestra aspirando y de lavar 5 veces la
placa con una solución de lavado, se añadió una solución de sustrato
para el revelado (TMBZ-peróxido de hidrógeno; 100
\mul/pocillo) para el revelado a temperatura ambiente a 37ºC
durante 10 minutos con protección contra la luz. Se añadió ácido
sulfúrico 1 N (100 \mul/pocillo) a la placa para parar el
revelado y se midió la absorbancia a 450 nm con el Multiplate
Autoreader SPECTRA MAX de Molecular Device.
La figura 1 muestra los resultados obtenidos con
el scFv YK3.3.38, indicando que el FVIII podía detectarse y medirse
con una sensibilidad tan alta como 0,01 unidades/ml o superior. Este
sistema de medida tenía una sensibilidad suficiente para controlar
el FVIII activado en la sangre, ya que se había notificado que el
nivel en sangre del FVIII es de 0,01 unidades/ml o incluso superior
en circunstancias con alta tendencia al sangrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Los anticuerpos monocatenarios humanos
anti-Factor VIII aislados se estimaron midiendo el
Tiempo de Activación Parcial de Tromboplastina (APTT) usando el kit
TestTeam FVIII (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) y plasma
deficiente en FVIII.
La reacción en el kit TestTeam FVIII se realizó
de acuerdo con las instrucciones del fabricante adjuntas para el
procedimiento (A), método de punto final, salvo que se redujo la
escala a 1/4 para poder medir con un pocillo de microtitulación de
96 pocillos.
La medición del Tiempo de Activación Parcial de
Tromboplastina (APTT) se realizó con Fibrintimer (Behring) como se
describe en: National Committee for Clinical Laboratory Standards,
Collection, transport and processing of blood specimens for
coagulation testing and performance of coagulation assays, 2nd
Edition, Approved Guideline, NCCLS Publication
H21-A2, Villanova, PA. 1991; Sirridge, M. S.;
Shannon, R., Laboratory Evaluation of Hemostasis and Thrombosis,
3rd Ed., Philadelphia: Lea and Febinger, 1983:
130-133.
Para una reacción de
antígeno-anticuerpo, se mezclaron una cantidad
equivalente de una disolución de la muestra del anticuerpo y una
solución del FVIII (Cross Eight M; 1 unidad/ml) para reaccionar a
37ºC durante más de 2 horas. Después se tomaron las medidas del kit
TestTeam FVIII o del Tiempo de Activación Parcial de Tromboplastina
(APTT).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se estudió el efecto de la presencia del vWF
usando el FVIII casi sin vWF (Cross Eight M; Cruz Roja Japonesa) y
el FVIII purificado que comprendía vWF multimérico (Confact F;
Juridical Foundation the
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute). La figura 3 muestra los resultados de las mediciones del
Tiempo de Activación Parcial de Tromboplastina (APTT) obtenido con
YK3.3.38. Para comparar, se usó plasma disponible comercialmente
procedente de pacientes que tenían los anticuerpos inhibidores
(GedrgeKingMedical, Inc. lot GK1833-929J2).
El estudio reveló que los clones de los
anticuerpos anti-FVIII de la presente invención,
YK3.3.38, YK3.3.40 y YK3.3.50, no inactivaban el FVIII unido con
vWF pero inactivaban el FVIII sin vWF.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Juridical Foundation The
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute
\vskip0.400000\baselineskip
<120> anticuerpo de tipo humano contra el
factor VIII de la coagulación sanguínea.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 663248
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2001-177640
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 120
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 324
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<212> ADN
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<213> Humano
\newpage
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 8
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\hskip0,8cm
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<210> 9
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<211> 360
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 120
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 324
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR1 de la secuencia Nº: 2, 6 ó
10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 14
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR2 de la secuencia Nº: 2, 6 ó
10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa Thr o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
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<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR3 de la secuencia Nº: 2, 6 ó
10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
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<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR1 de la secuencia Nº: 4, 8 ó
12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xa1 representa Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xa2 representa Ser o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR2 de la secuencia Nº: 4, 8 ó
10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR3 de la secuencia Nº: 4, 8 ó
12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xa1 representa Gln o His.
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xa2 representa Ser o Thr.
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xa3 representa Leu o Ile.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (13)
1. Un fragmento génico que codifica una cadena
VH de un anticuerpo humano contra el factor de la coagulación
sanguínea VIII (FVIII) que tiene una actividad de inhibición de la
actividad de coagulación (actividad inhibidora) del FVIII humano,
donde dicho anticuerpo anti-FVIII humano no reconoce
un complejo FVIII/factor von Willebrand (vWF) y reconoce únicamente
el FVIII sin vWF, y donde las regiones determinantes de
complementariedad (CDR1 a CDR3) de dicha cadena VH tienen las
siguientes secuencias de aminoácidos:
- \quad
- CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEC ID Nº:13);
- \quad
- CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Val Ser Ala Gln Arg Phe Gln Gly (Xaa = Thr o Ala) (SEC ID Nº:14);
- \quad
- CDR3: Gly Val Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEC ID Nº:15).
2. El fragmento génico de la reivindicación 1,
en el que dicha cadena VH tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que
consiste en las SEC ID Nº: 2, 6 y 10.
3. Un fragmento génico que codifica una cadena
VL de un anticuerpo anti-FVIII humano que tiene una
actividad de inhibición de la actividad de la coagulación
(actividad inhibidora) del FVIII humano, donde dicho anticuerpo
anti-FVIII humano no reconoce un complejo
FVIII/factor von Willebrand y reconoce únicamente el FVIII sin vWf,
y donde las regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a
CDR3) de dicha cadena VL tienen las siguientes secuencias de
aminoácidos:
- \quad
- CDR1: Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xa1 Xa2 Tyr Leu Asn (Xa1 = Ser o Thr; Xa2 = Ser o Arg) (SEC ID Nº: 16);
- \quad
- CDR2: Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser (SEC ID Nº:17);
- \quad
- CDR3: Gln Xa1 Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr (Xa1 = Gln o His; Xa2 = Ser o Thr; Xa3 = Leu o Ile) (SEC ID Nº: 18).
4. El fragmento génico de la reivindicación 3,
en el que dicha cadena VL tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que
consiste en las SEC ID Nº: 4, 8 y 12.
5. Un gen de FV monocatenario (scFv) que
comprende el fragmento génico que codifica la cadena VH que se
indica en la reivindicación 1 ó 2 unido al fragmento
\hbox{génico que codifica la cadena VL que se indica en la
reivindicación 3 ó 4.} 6. Un fragmento génico que codifica el
anticuerpo anti-FVIII humano que comprende el
fragmento génico que codifica la cadena VH que se indica en la
reivindicación 1 ó 2 unido al fragmento génico que codifica la
cadena VL que se indica en la reivindicación 3 ó 4, donde dicho
fragmento génico que codifica la cadena VH y dicho fragmento génico
que codifica la cadena VL están unidos a un gen de cadena CH de
anticuerpo humano y a un gen de cadena CL de anticuerpo humano,
respectivamente.
7. Un fragmento génico que codifica el fragmento
de anticuerpo anti-FVIII humano que comprende el
fragmento génico que codifica la cadena VH que se indica en la
reivindicación 1 ó 2 y/o el fragmento génico que codifica la cadena
VL que se indica en la reivindicación 3 ó 4, donde dicho fragmento
génico que codifica la cadena VH y/o dicho fragmento génico que
codifica la cadena VL están unidos a un gen de cadena CH de
anticuerpo humano o a una parte del mismo y un gen de cadena CL de
anticuerpo humano o a una parte del mismo, respectivamente.
8. El fragmento génico de la reivindicación 7,
donde dicho fragmento de anticuerpo se selecciona entre el grupo
que consiste en Fab, Fab' y F(ab')_{2}.
9. Un fragmento génico que codifica el fragmento
del anticuerpo anti-FVIII humano que comprende el
gen de Fv monocatenario que se indica en la reivindicación 5 unido
a un gen de cadena CH de anticuerpo humano o a una parte del mismo
o a un gen de cadena CL de anticuerpo humano o a una parte del
mismo.
10. Un anticuerpo anti-FVIII
humano o un fragmento de anticuerpo anti-VIII humano
expresado mediante la técnica de ingeniería genética a partir de un
vector de expresión en el que se incorpora el fragmento génico que
se indica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un medicamento para la prevención y el
tratamiento de trombosis que comprende el anticuerpo
anti-FVIII humano o el fragmento de anticuerpo
anti-VIII humano que se indica en la reivindicación
10.
12. Un agente de diagnóstico del FVIII activado
que comprende el anticuerpo anti-FVIII humano o el
fragmento de anticuerpo anti-FVIII humano que se
indica en la reivindicación 10.
13. Uso del anticuerpo
anti-FVIII humano o del fragmento de anticuerpo
anti-FVIII humano que se indica en la
reivindicación 10 para preparar un medicamento para la prevención y
tratamiento de trombosis.
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