ES2316588T3 - Metodo para hacer polipeptidos acilados. - Google Patents
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Abstract
Método para hacer un polipéptido que comprende al menos un residuo de lisina que es acilado en su grupo Eamino, dicho método comprendiendo las siguientes fases: (i) cultivo de una célula de levadura que comprende una secuencia polinucleótida que codifica una molécula precursora de dicho polipéptido bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora, comprendiendo la molécula precursora el polipéptido deseado y una extensión N-terminal, siendo dicha extensión N-terminal seccionable del polipéptido deseado en un sitio de seccionamiento de lisina y teniendo la fórmula siguiente: Xn ----- X1 - Lys donde Lys es un sitio de seccionamiento y X n ----- X 1 es una secuencia péptida con una longitud de 2-14 residuos aminoácidos que tiene la función de prevenir o minimizar la acilación del grupo epsilon-amino libre en el sitio de seccionamiento Lys en la fase (iii) y que tiene la función adicional de proteger el polipéptido precursor expresado contra el seccionamiento endoproteolitico con la condición de que ninguna X sea Lys y de que al menos una X sea His o Glu o Asp; (ii) la separación de la molécula precursora expresada del caldo de cultivo; (iii) preferentemente la acilación del grupo epsilon-amino en al menos un residuo de lisina en el polipéptido deseado sin acilar el grupo epsilon-amino del sitio de seccionamiento de lisina en la extensión N-terminal; (iv) la eliminación de la extensión N-terminal de la molécula precursora acilada por seccionamiento enzimático y (v) el aislamiento del polipéptido acilado por medios adecuados.
Description
Método para hacer polipéptidos acilados.
La presente invención se refiere a un método
para producir polipéptidos en células huéspedes transformadas por
expresión de una molécula precursora del polipéptido deseado que ha
de ser acilada y posteriormente seccionada en un sitio de
seccionamiento Lys en una fase posterior in vitro. La
invención también se refiere a secuencias ADN, vectores y células
huéspedes transformadas para el uso en el método reivindicado.
Además, la presente invención se refiere a determinados precursores
de los polipéptidos deseados y a determinados métodos de
acilación.
La tecnología del ADN recombinante ha permitido
la expresión de polipéptidos externos (heterólogos) en células
microbianas y otras células huéspedes. En la expresión de levadura
de polipéptidos heterólogos después de la transformación de células
de levadura con vectores de expresión adecuada comprendiendo
secuencias de ADN, la codificación de dichos polipéptidos ha tenido
éxito para muchas clases de polipéptidos, tales como insulina y
precursores de insulina, glucagón, péptidos similares al glucagón y
análogos de los mismos.
Un problema común en la expresión de proteínas o
polipéptidos de un tamaño limitado en un huésped recombinante es,
no obstante, la degradación proteolítica del producto expresado por
enzimas proteolíticas producidas por el organismo huésped.
Así, el producto aislado puede ser una mezcla
heterogénea de especies del polipéptido deseado que tenga
diferentes longitudes de cadena de aminoácidos. Otro problema
encontrado en la producción de polipéptidos heterólogos en la
levadura puede ser el bajo rendimiento, supuestamente debido al
tratamiento proteolítico tanto en compartimentos intracelulares como
en la membrana plasmática provocada por el tratamiento aberrante en
los sitios internos en el polipéptido. La levadura contiene varias
proteasas usadas para tratar proteínas de levadura p. ej. Kex2p e
Yps1p que seccionan en el sitio C-terminal de una
secuencia de aminoácidos dibásica, y la carboxipeptidasa Kexip que
digiere los aminoácidos básicos restantes después de la digestión
endoproteolítica por Kex2p, y Stel3p o Dap2p, que seccionan en
X-Ala o X-Pro.
Algunos polipéptidos, p. ej. polipéptidos que
tienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 cadenas
de aminoácidos y ningún o unos pocos enlaces de disulfuro y/o son
ricos en aminoácidos básicos, tales como
R-endorfina, glucagón y péptidos similares al
glucagón, pueden ser especialmente susceptibles a la degradación
intracelular y extracelular proteolítica al ser expresados en una
célula huésped transformada debido a su cadena corta abierta y
estructura estabilizada no disulfúrica dando como resultado un
producto homogéneo que puede ser degradado proteolíticamente en los
extremos N- y C-terminales así como degradado
endoproteolíticamente.
Además, el seccionamiento
N-terminal de los polipéptidos expresados por
enzimas producidas en una célula huésped puede causar un menor
rendimiento de un producto deseado con N-terminal
correcto si el N-terminal del producto expresado
constituye un sitio de seccionamiento para enzimas endógenas. En la
levadura, por ejemplo, la enzima Stel3p secciona en
X-Ala o X-Pro, donde X puede ser
cualquier residuo aminoácido. Así, los polipéptidos con un residuo
Ala o Pro como segundo residuo desde el extremo
N-terminal puede ser seccionado en el extremo
N-terminal y el polipéptido recuperado puede ser
una mezcla de productos de degradación diferente, complicando el
proceso de recuperación y reduciendo el rendimiento global.
Además, los polipéptidos pequeños con o sin
estructura terciaria pequeña y bajo contenido en hélices \alpha
pueden tener una tendencia más elevada a formar placas \beta que
se apilan una sobre otra y forman fibrillas durante la fermentación
y separación corriente abajo y fases de purificación en la
producción en gran escala. La formación de fibrillas puede causar la
precipitación no deseada con pérdida del producto deseado. La
fibrilación puede ser evitada mediante un tratamiento a un pH
elevado. No obstante, dicho tratamiento alcalino es bastante fuerte
para el producto y puede causar la formación no deseada de residuos
D-aminoácidos.
El GLP-1 humano es un péptido de
37 residuos aminoácidos originado a partir de preproglucagón, que
es sintetizado en las células L en el íleo distal, en el páncreas y
en el cerebro. El tratamiento de preproglucagón para obtener
GLP-1_{(7-36)} amida,
GLP-1_{(7-37)} y
GLP-2 ocurre principalmente en las células L. Tanto
GLP-1 como GLP-2 tienen un Ala como
segundo residuo aminoácido desde el extremo
N-terminal y son así propensos al seccionamiento
N-terminal cuando son expresados en un organismo
huésped tal como la levadura.
La introducción de grupos acilo lipofílicos en
péptidos de origen natural o sus análogos ha mostrado llevar a
péptidos acilados que tienen un perfil prolongado en relación al
péptido nativo o análogos inmodificados. Este fenómeno ha sido
divulgado y demostrado en WO 98/08871, que divulga la acilación de
GLP-1 y sus análogos y en WO 98/08872 que expone la
acilación de GLP-2 y sus análogos.
La patente US nº 6,011,007 divulga un método
para acilar un precursor de insulina extendido de forma
N-terminal en el
\varepsilon-NH_{2} de LysB29 y posteriormente
hidrolizar el enlace Arg entre B1 y la extensión
N-terminal con tripsina y carboxipeptidasa B. WO
0055119 divulga un método de acilación donde un grupo amino libre
es reactivado con una amida activada a un pH básico, p. ej.
acilación de Arg^{34}GLP1^{7-37} en el grupo
\varepsilon-NH_{2} de Lys^{26}. WO 9535384
divulga la producción de proteínas recombinantes en la levadura
donde las proteínas son expresadas con una extensión
N-terminal que más adelante puede ser
seccionadas.
Cuando se acilan moléculas precursoras que
comprenden un seccionamiento Lys la acilación del sitio de
seccionamiento Lys debería ser evitada, puesto que tal acilación
prevendrá el seccionamiento posterior. El método según la presente
invención es una solución para este problema como se verá en lo que
sigue.
En su aspecto más amplio, la presente invención
se refiere a un método para producir polipéptidos en células
huéspedes transformadas por expresión de una molécula precursora
del polipéptido deseado, comprendiendo dicha molécula precursora
una extensión N-terminal que permite la acilación
preferencial de la molécula precursora expresada y protege a la
molécula precursora expresada contra la degradación proteolítica
dentro de la célula huésped o en el medio de cultivo. Además, la
molécula precursora es más fácil de purificar y tiene una menor
tendencia a formar fibrillas permitiendo así más flexibilidad al
seleccionar la separación corriente abajo y las fases de
purificación en operaciones a gran escala.
En un aspecto la presente invención se refiere a
un método para hacer un polipéptido que comprende al menos un
residuo de lisina que es acilado en su grupo
\varepsilon-amino, dicho método comprendiendo las
fases siguientes:
- (i)
- cultivar una célula de levadura que comprende una secuencia polinucleótida que codifica una molécula precursora del polipéptido deseado bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora, comprendiendo la molécula precursora el polipéptido deseado y una extensión N-terminal, siendo dicha extensión N-terminal seccionable a partir del polipéptido deseado en un sitio de seccionamiento de lisina y teniendo la fórmula siguiente:
X_{n}
- - - - - X_{1} -
Lys
- \quad
- donde Lys es un sitio de seccionamiento y X_{n} - - - - - X_{1} es una secuencia péptida de 2-14 residuos aminoácidos de largo teniendo la función de prevenir o minimizar la acilación del grupo \varepsilon-amino libre en el sitio de seccionamiento Lys en la fase (iii) y que tiene además la función de proteger al polipéptido precursor expresado del seccionamiento endoproteolítico con la condición de que Lys no sea X y de que al menos una X sea His o Glu o Asp,
- (ii)
- separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo;
- (iii)
- preferentemente acilar el grupo \varepsilon-amino de al menos una lisina en el polipéptido deseado sin acilar el grupo \varepsilon-amino del sitio de seccionamiento Lys en la extensión N-terminal;
- (iv)
- eliminar la extensión N-terminal de la molécula precursora acilada por seccionamiento enzimático y
- (v)
- aislar el polipéptido acilado por medios adecuados.
\vskip1.000000\baselineskip
La extensión N-terminal será
normalmente de hasta 15 aminoácidos de largo y puede ser de
3-15; 3-12; 3-10;
3-9; 3-8; 3-7;
3-6; o 3-5 aminoácidos de largo.
Los aminoácidos en la extensión N-terminal son
seleccionados con un objetivo múltiple: 1) prevenir o minimizar la
acilación del sitio de seccionamiento Lys en el extremo
C-terminal de la extensión
N-terminal; 2) proteger la molécula precursora
expresada contra la degradación endoproteolítica; y 3) prevenir la
precipitación provocada por la fibrilación durante la fermentación y
las fases de tratamiento corriente abajo, tales como separación y
purificación en producción a gran escala. Además, los residuos
aminoácidos en ambos extremos de la extensión
N-terminal deberían ser seleccionados para asegurar
un seccionamiento eficaz de la extensión N-terminal
del polipéptido deseado en el extremo C-terminal
(en el sitio de seccionamiento Lys) y en la célula de levadura en
el extremo N-terminal a partir de posibles
secuencias corriente arriba tales como pre- o
pre-pro péptidos que tienen el propósito de asegurar
el transporte del polipéptido expresado fuera de la célula huésped
y en el medio de cultivo. Finalmente, la extensión
N-terminal puede servir como una marca para la
purificación.
En una forma de realización la presente
invención se refiere a un método donde uno o más residuos
aminoácidos en la extensión N-terminal son capaces
de establecer un sitio de unión complejo de ión metálico junto con
uno o más residuos aminoácidos en el extremo
N-terminal del polipéptido.
La extensión N-terminal que
comprende un sitio de unión de ión metálico puede ser derivado del
N-terminal de albúminas. Ejemplos de sitios de unión
Cu^{+2} son los N-terminales de albúmina sérica
(Peters, T.; All about Albumin, Academic Press, USA (1996) p
121-123) bovina
(Asp-Thr-His-Lys,
SEC ID NO:34) y humana
(Asp-Ala-His-Lys,
SEC ID NO:35) que podría ser usada como la extensión
N-terminal en sinergia con iones de metal pesado,
tales como Cu^{++} presente en el medio de cultivo y durante la
fase de acilación (iii).
La extensión N-terminal
comprendiendo un sitio de unión de ión metálico puede también ser
derivada de los sitios de unión Zn, especialmente en algunas
metaloendopeptidasas EC 3.4.24-.
En una forma de realización, la extensión
N-terminal comprende al menos un residuo de
histidina. Los residuos de histidina en la extensión
N-terminal son normalmente 1-4
residuos posicionados a partir del sitio de seccionamiento de
lisina.
Ejemplos de extensiones
N-terminales que comprenden al menos un residuo de
histidina son
Glu-Glu-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:1);
Glu-(Glu-Ala)_{2}-His-Lys
(SEC ID NO:2); Glu-(Glu-Ala)_{3}
His-Lys (SEC ID NO:3);
Glu-Glu-Gly-His-Lys
(SEC ID NO:4);
Glu-His-Pro-Lys (SEC
ID NO:5);
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:6);
Glu-Glu-His-Cys-Lys
(SEC ID NO:7);
Glu-Glu-His-His-Lys
(SEC ID NO:8);
Glu-His-His-His-Lys
(SEC ID NO:9);
Glu-His-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:10);
Glu-Gly-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:11);
Glu-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:12);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys
(SEC ID NO:13);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys
(SEC ID NO:14);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys
(SEC ID NO:15);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys
(SEC ID NO:16);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys
(SEC ID NO:17);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys
(SEC ID NO:18);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys
(SEC ID NO:19);
Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:24);
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:30); Asp-Thr-His- Lys
(SEC ID NO:34);
Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:36);
Asp-Ser-His-Lys (SEC
ID NO:37);
Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:38);
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:39);
Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:40);
Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:41);
Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:42);
Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:43);
Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:44);
Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:47);
Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:48); y
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:49).
En otra forma de realización la presente
invención se refiere a un método, donde la extensión
N-terminal de la molécula precursora comprende al
menos un residuo aminoácido que es capaz de establecer un puente
salino (enlace fónico) con el sitio de seccionamiento de lisina
N-terminal al polipéptido.
En esta forma de realización, la extensión
N-terminal comprenderá normalmente al menos un Glu
o Asp que puede ser posicionado entre 1 a 5 residuos a partir del
sitio de seccionamiento de lisina. En tal forma de realización, la
extensión N-terminal comprende una secuencia
Glu-Glu. Ejemplos de extensiones
N-terminal que comprenden un residuo Glu son
Glu-Glu-Ala-Glu-Lys
(SEC ID NO:45);
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:46) y Glu-Glu-Lys. En
esta forma de realización la extensión N-terminal
puede además ser capaz de formar una hélice \alpha.
Las extensiones N-terminales que
funcionan como una marca y son capaces de formar un puente salino
son secuencias derivadas del sitio de enteroquinasa en tripsinógeno
bovino que es conocido por enlazar Ca^{+2}. Así, una extensión de
N-terminal adecuada para el uso en el presente
método es
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(SEC ID NO:26).
Una extensión N-terminal que sea
capaz de formar una hélice \alpha comprenderá normalmente una
secuencia que contenga aminoácidos polares que se alternen con
aminoácidos no polares como ha sido descrito por Zhu et al,
Protein Science 2, 384-394 (1993). Ejemplos de
secuencias de este tipo son
Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:29),
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:30);
Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:31);
Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:32);
Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:33);
Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:43); y
Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:44).
En esta forma de realización, la extensión
N-terminal puede comprender también un sitio
N-X-S o
N-X-T de
N-glicosilación eucariótica donde X puede ser
cualquier residuo aminoácido excepto Pro. Ejemplos de extensiones
N-terminales que comprenden un sitio de
glicosilación son
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys
(SEC ID NO:20),
Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:21), Glu-Glu-
Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:22) y
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO: 23).
En otra forma de realización la presente
invención se refiere a un método, donde el polipéptido deseado es
sensible a la degradación proteolítica en su extremo
N-terminal y donde la extensión
N-terminal impide o minimiza dicha degradación
proteolítica. Los polipéptidos de este tipo pueden estar
caracterizados por tener un residuo Ala, Ser, Pro o Gly como segundo
residuo aminoácido desde el extremo N-terminal.
En otra forma de realización el polipéptido
tiene un His o Tyr como residuo aminoácido
N-terminal.
La extensión N-terminal tiene la
fórmula
X_{n}
- - - - - X_{1} -
Lys
donde Lys es un sitio de
seccionamiento y X_{n} - - - - - X_{1}
es una secuencia péptida de 2-14 residuos
aminoácidos de longitud que tiene la función de prevenir o
minimizar que el grupo \varepsilon-amino libre en
el sitio de seccionamiento Lys sea acilado en la fase (iii)
descrita anteriormente. X_{n} - X_{1} protegerá además el
polipéptido expresado deseado del seccionamiento endoproteolítico y
prevendrá la precipitación provocada por fibrilación de la molécula
extendida N-terminal durante la fermentación y las
fases posteriores de separación y de purificación. Los residuos
aminoácidos en X_{n} - - - - - X_{1} son
además seleccionados de modo que se consiga el seccionamiento óptimo
de la extensión N-terminal en su extremo
C-terminal (en Lys). Además, los residuos
aminoácidos en el extremo N-terminal de la
extensión son elegidos de modo que el seccionamiento sea optimizado
en la célula de levadura a partir de las secuencias corriente
arriba de guía-señal en un sitio de seccionamiento
KEX (Lys, Arg). Los residuos aminoácidos en X_{n}
- - - - - X_{1} pueden ser en principio
cualquier residuo aminoácido excepto Lys siempre que la secuencia
péptida cumpla al menos uno de los objetivos requeridos con la
condición de que al menos una X sea His o Glu o Asp y que el número
dos de residuos aminoácidos del extremo N-terminal
de la extensión no sea preferiblemente ni Ala ni
Pro.
En una forma de realización X_{n}
- - - - - X_{1} es de 2-12
residuos aminoácidos de longitud. En otra forma de realización
X_{n} - - - - - X_{1} es de
2-10; 2-9; 2-8;
2-7;2-6; o 2-5
residuos aminoácidos de longitud.
En otra forma de realización X_{n}
- - - - - X_{1} contiene
2-8 residuos aminoácidos que son seleccionados del
grupo que consiste en His; Glu; Ala; Asp; Gly; y pro.
En otra forma de realización X_{n}
- - - - - X_{1} contiene
4-10 residuos aminoácidos que son seleccionados del
grupo que consiste en Glu; Asp; Ala; His; Trp; Tyr; Ile; Val; Met;
y Phe.
En otra forma de realización X_{n}
- - - - - X_{1} contiene
5-8 residuos aminoácidos seleccionados del grupo que
consiste en Glu; Asp; Gly; Asn; Thr; Ser; y Pro.
En todas las formas de realización Glu y/o Asp
son seleccionados preferiblemente como el primer y segundo residuo
aminoácido del extremo N-terminal de la extensión
para asegurar el seccionamiento apropiado en este extremo desde una
pre- o pre-pro-secuencia corriente
arriba mediante un sitio de seccionamiento Kex2p. Además, uno o más
residuos Glu y/Asp en el extremo N-terminal de la
extensión N-terminal protegerá el extremo
N-terminal del polipéptido deseado al final contra
la degradación in vivo durante la fermentación.
Ejemplos de secuencias Lys X_{n}
- - - - - X_{1} son
Glu-Glu-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:1);
Glu-(Glu-Ala)_{2}-His-Lys
(SEC ID NO:2); Glu-(Glu-Ala)_{3}
His-Lys (SEC ID NO:3);
Glu-Glu-Gly-His-Lys
(SEC ID NO:4);
Glu-His-Pro-Lys (SEC
ID NO:5);
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:6);
Glu-Glu-His-Cys-Lys
(SEC ID NO:7);
Glu-Glu-His-His-Lys
(SEC ID NO:8);
Glu-His-His-His-Lys
(SEC ID NO:9);
Glu-His-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:10);
Glu-Gly-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:11);
Glu-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:12);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys
(SEC ID NO:13);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys
(SEC ID NO:14);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys
(SEC ID NO:15);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys
(SEC ID NO:16);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys
(SEC ID NO:17);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys
(SEC ID NO:18);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys
(SEC ID NO:19);
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys
(SEC ID NO:20);
Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:21),
Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:22);
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO: 23);
Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:24); Glu-Glu-Lys;
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(SEC ID NO:26);
Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:29);
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:30);
Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:31);
Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:32);
Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:33);
Asp-Thr-His-Lys (SEC
ID NO:34);
Asp-Ala-His-Lys (SEC
ID NO:35);
Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:36);
Asp-Ser-His-Lys (SEC
ID NO:37);
Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:38);
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:39);
Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:40);
Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:41)
Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:42);
Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:43);
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:44);
Glu-Glu-Ala-Glu-Lys
(SEC ID NO:45);
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:46);
Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:47);
Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:48);
G1u-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:49);
En otra forma de realización, la extensión
N-terminal tiene la secuencia
Asp-X-His-Lys (SEC
ID NO:50) donde X es Ala, Thr o Ser. La secuencia
Asp-X-His-Lys
constituye un sitio de unión de albúmina de ión metálico pesado.
En además otra forma de realización la extensión
N-terminal tiene la secuencia
His-Z_{1}-Z_{2}-Lys
(SEC ID NO:51) donde Z_{1} es Glu; Asp; Asn; Gln; Ser; Thr; Gly;
Leu; Ile; Val; Met; Phe o Tyr y Z_{2} es Leu; Ile; Val; Met; Phe;
Tyr; Trp o Cys. En una forma de realización Z_{1} es Glu o Asp.
La secuencia
His-Z_{1}-Z_{2}-Lys
constituirá junto con un residuo His N-terminal en
el polipéptido deseado un sitio de unión metálico homólogo a los
sitios de unión Zn en determinadas metaloendopeptidasas tales como
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys
(SEC ID NO:13);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys
(SEC ID NO:14);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys
(SEC ID NO:15);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys
(SEC ID NO:16);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys
(SEC ID NO:17);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys
(SEC ID NO:18); y
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys
(SEC ID NO:19).
Se ha descubierto que la extensión
N-terminal se fija establemente a la molécula
precursora de la invención durante la fermentación, protegiendo el
extremo N-terminal de la molécula precursora contra
la actividad proteolítica de las proteasas de levadura, tales como
Stel3p o Dap2p.
\newpage
La extensión N-terminal será
eliminada de la molécula precursora acilada recuperada mediante una
enzima proteolítica que es específica para Lys. Ejemplos de tales
enzimas proteolíticas son tripsina o proteasa I de Achromobacter
lyticus.
El polipéptido precursor del polipéptido deseado
puede tener la fórmula
N-terminal-extensión-Lys-Z_{3}-Z_{4}-*polipéptido*
donde Lys es un sitio de
seccionamiento, la extensión N-terminal tiene
2-14 residuos aminoácidos como se ha descrito
anteriormente, Z_{3} es el residuo aminoácido
N-terminal en el polipéptido deseado y es His o Tyr,
Z_{4} es el siguiente residuo de aminoácido del extremo
N-terminal en el polipéptido deseado y es Ala, Ser o
Gly, y *polipéptido* es la secuencia restante del polipéptido
deseado.
En una forma de realización de la presente
invención *polipéptido* es la parte pertinente de
GLP-1 o GLP-2.
La introducción de grupos acilo lipofílicos en
péptidos de origen natural o análogos de los mismos ha demostrado
llevar a péptidos acilados que tienen un perfil prolongado en
relación al péptido nativo o análogos inmodificados. Este fenómeno
ha sido divulgado y demostrado en WO 98/08871, que divulga la
acilación de GLP-1 y análogos al mismo y en WO
98/08872, que divulga la acilación de GLP-2 y
análogos al mismo. El grupo lipofílico puede ser introducido
mediante separadores mono- o dipéptidos como ha sido divulgado en
WO 98/08871. De forma alternativa, el grupo lipofílico puede ser
introducido por medio de grupos de ácido
\alpha-amino-\alpha,\omega-dicarboxílico,
como se ha descrito en WO 00/55119.
Las presentes moléculas precursoras del
polipéptido contendrán al menos dos grupos de lisina con un grupo
E-amino libre, es decir, el residuo de
seccionamiento de lisina y al menos un residuo de lisina en el
polipéptido deseado. Si todos los grupos de lisina fueran acilados
incluyendo el residuo de seccionamiento de lisina, no sería posible
el seccionamiento posterior de la extensión
N-terminal a partir de la secuencia polipéptida
deseada. Así, uno de los objetivos de expresar el polipéptido
deseado con una extensión N-terminal es prevenir o
minimizar la acilación del grupo E-amino libre en el
sitio de seccionamiento de la lisina. La molécula precursora puede
después ser preferentemente acilada en el residuo de lisina deseado
que en el caso de GLP-1 es la lisina en la posición
26. Después de la acilación la molécula precursora acilada es
seccionada por medios enzimáticos adecuados como se ha descrito
anteriormente y el polipéptido deseado acilado puede ser
aislado.
La fase de acilación (iii) puede ser llevada a
cabo a un pH entre 7 y 12. En determinadas formas de realización,
el pH estará entre 8 y 11,5 o entre 9,0 y 10,5 y un valor de pH de
aproximadamente 9,5 a 10,5 ha demostrado ser eficaz. La temperatura
estará entre menos 5 y 35ºC y normalmente estará entre 0 y 20ºC o
entre 15 y 30ºC.
En una forma de realización de la presente
invención la acilación es llevada a cabo en presencia de iones
metálicos bivalentes tales como Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+},
Co^{2+}, Zn^{2+}, Mg^{2+}, Mn^{2+} y Ca^{2+}. No obstante,
los iones metálicos trivalentes tales como Co^{3+} son también
eficaces para el objetivo de la presente invención.
Según otros aspectos la presente invención se
refiere a polinucleótidos que codifican los precursores
polipéptidos reivindicados y vectores y células huéspedes
transformadas que contienen polinucleótidos de este tipo.
El término "acilación preferencial"
está destinado a incluir un proceso de acilación donde la acilación
tiene lugar en una o más posiciones preferidas en la molécula en un
grado sustancial más elevado que en otras posiciones en la misma
molécula. Así, la acilación en las posiciones preferidas es de al
menos el 50%, preferiblemente al menos el 80% y de la forma más
preferida 90-100% de la acilación total. En el
presente método la acilación del grupo
\varepsilon-amino a partir del sitio de
seccionamiento de lisina en la extensión N-terminal
debería ser evitada o minimizada tanto como fuera posible, puesto
que la acilación en esta posición puede interferir con el
seccionamiento posterior de la extensión N-terminal
del producto final deseado conduciendo a pérdida de
rendimiento.
Con "extensión
N-terminal" se entiende una secuencia
polipéptída fijada de manera extraible al residuo aminoácido
N-terminal en el polipéptido deseado. La extensión
N-terminal puede ser de 2-15
residuos aminoácidos de longitud y comprenderá un residuo Lys como
su residuo aminoácido C-terminal para el
seccionamiento del polipéptido deseado. La extensión
N-terminal protegerá el polipéptido de fusión
expresado contra la degradación proteolítica dentro de la célula
huésped como se ha descrito anteriormente. Además, se cree que
previene o minimiza la acilación del grupo
\varepsilon-amino desde el sitio de seccionamiento de lisina en la extensión N-terminal enmascarando dicho residuo Lys durante el proceso de acilación.
\varepsilon-amino desde el sitio de seccionamiento de lisina en la extensión N-terminal enmascarando dicho residuo Lys durante el proceso de acilación.
Con "polipéptido deseado" se
entiende el polipéptido final obtenido después del seccionamiento
de la extensión N-terminal de la molécula
precursora. Esta expresión cubrirá tanto la versión acilada como no
acilada de dicho polipéptido. La "extensión
N-terminal" incluye el residuo de lisina que
constituye el sitio de seccionamiento para el seccionamiento de la
extensión N-terminal a partir del extremo
N-terminal de polipéptido deseado. Se entenderá que
siempre que se muestre un grupo Lys como aminoácido
C-terminal de una extensión
N-terminal o una secuencia que esté comprendida en
la extensión N-terminal dicho residuo Lys está
directamente enlazado al residuo aminoácido
N-terminal del polipéptido deseado y constituye el
sitio de seccionamiento. El seccionamiento en el residuo Lys (fase
iv) es preferiblemente llevado a cabo mediante una enzima
proteolítica que es específica de Lys. Ejemplos de dichas enzimas
proteolíticas son tripsina o proteasa de Achromobacter
lyticus (ALP).
Un ejemplo de un polipéptido deseado es
GLP-1. La secuencia de aminoácidos de
GLP-1 es dada entre otros por Schmidt et al.
(Diabetologia 28 704-707 (1985). Aunque las
propiedades farmacológicas interesantes de
GLP-1(7-37) y análogos del
mismo han atraído mucha atención en los últimos años, sólo se
conoce poco de la estructura de estas moléculas. La estructura
secundaria de GLP-1 en micelas ha sido descrita por
Thorton et al. (Biochemistry 33 3532 3539 (1994)), pero en
solución normal GLP-1 es considerada una molécula
muy flexible.
Un sistema simple es utilizado para describir
fragmentos y análogos a este péptido. Así, por ejemplo,
Gly^{8}GLP-1_{(7-37)} designa un
fragmento de GLP-1 derivado de
GLP-1_{(1-37)} eliminando los
residuos aminoácidos nº 1 a 6 y sustituyendo los residuos
aminoácidos de origen natural en la posición 8 (Ala) por Gly. De
forma similar,
Lys^{26}(N^{\varepsilon}-tetradecanoil)-GLP-1_{(7-37)}
designa GLP-1_{(7-37)} donde el
grupo \varepsilon-amino del residuo Lys en la
posición 26 ha sido tetradecanoilado.
Otros ejemplos de polipéptidos deseados son
GLP-2 y glucagón, ambos pertenecientes al GRF
(factor de liberación de la hormona de crecimiento), familia de
péptidos que tienen un His o Tyr en la posición
N-terminal y Ser, Ala o Gly en la posición
siguiente, véase Adelhorst K. et al., The Journal of
Biological Chemistry (1994) p. 6275-6278).
"POT" es el Gen de triosa fosfato
isomerasa de Schizosaccharomyces pombe y "TPI1" es el
Gen de triosa fosfato isomerasa de S cerevisiae.
Con "fibrilación" se entiende un
proceso donde son formadas las así llamadas "fibrillas".
"Fibrillas" es un fenómeno bien reconocido y descrito y pueden
estar compuestas de placas antiparalelas \beta. Las moléculas como
GLP con estructura helicoidal \alpha pequeña y una estructura
terciaria pequeña y muy flexible son muy propensas a la agregación
que conduce a precipitación y pérdida de rendimiento si no se toman
condiciones químicas muy crudas en el uso, tales como el
tratamiento alcalino a un pH 12.
Por un "líder" se entiende una
secuencia aminoácida que consiste en un pre-péptido
(el péptido señal) y un propéptido.
El término "péptido señal" es
entendido como un pre-péptido que está presente
como una secuencia N-terminal en la forma precursora
de una proteína. La función del péptido señal es permitir a la
proteína heteróloga facilitar la translocación en el retículo
endoplásmico. El péptido señal es normalmente seccionado en el
curso de este proceso. El péptido señal puede ser heterólogo u
homólogo al organismo de levadura que produce la proteína. Varios
péptidos señales pueden ser usados con el constructo de ADN de la
invención incluyendo el péptido señal YPS1 (formalmente llamado
péptido señal YAP3) o cualquier análogo funcional al mismo
(Egel-Mitani et al. (1990) YEAST
6:127-137 y US 5,726,038) y la señal de factor
\alpha del gen MF\alpha1 (Thorner (1981) en The Molecular
Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern
et al., eds., pp 143-180, Cold Spring Harbor
Laboratory, NY y US 4,870,00 .
El término
"pro-péptido" significa una secuencia
polipéptida cuya función es permitir al polipéptido expresado ser
dirigido desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi y
además a la vesícula secretora para la secreción en el medio de
cultivo (es decir, exportación del polipéptido a través de la pared
celular o al menos a través de la membrana celular al espacio
periplásmico de la célula de levadura). El
pro-péptido puede ser el pro-péptido
factor a de levadura, véase US 4, 546,082 y 4,870,008. De forma
alternativa, el pro-péptido puede ser un
pro-péptido sintético, que quiere decir un
pro-péptido no encontrado en la naturaleza.
Pro-péptidos sintéticos adecuados son aquellos
divulgados en US 5,395,922, 5,795,746, 5,162,498 y WO 98/32867. El
pro-péptido contendrá preferiblemente un sitio de
procesamiento de endopeptidasa en el extremo
C-terminal, tal como una secuencia
Lys-Arg o cualquier análogo funcional a la
misma.
La secuencia polinucleótida de la invención
puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares
establecidos, p. ej. el método de fosfoamidita descrito por Beaucage
et al. (1981) Tetrahedron Letters
22:1859-1869, o el método descrito por Matthes
et al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. Según
el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados,
por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificados,
duplicados y ligados para formar el constructo de ADN sintético.
Una vía actualmente preferida para preparar el constructo de ADN es
por reacción en cadena de polimerasa (PCR).
La secuencia polinucleótida de la invención
puede también ser de origen genómico mezclado, ADNc, y sintético.
Por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc que codifique un
péptido líder puede ser unida a una secuencia genómica o de ADNc
que codifique la molécula precursora de la invención, después de lo
que la secuencia ADN puede ser modificada en un sitio insertando
oligonucleótidos sintéticos que codifiquen la secuencia aminoácida
deseada para la recombinación homóloga conforme a procedimientos
bien conocidos o generando preferiblemente la secuencia deseada por
PCR usando oligonucleótidos adecuados.
La invención comprende un vector que es capaz de
replicar en el microorganismo o célula huésped seleccionado y que
lleva una secuencia polinucleótida que codifica la molécula
precursora de la invención. El vector recombinante puede ser un
vector de replicación autónoma, es decir, un vector que exista como
una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un
elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma
artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar
la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que introducido en la célula huésped es integrado en el genoma y
replicado con el(los) cromosoma(s) donde ha sido
integrado. Además, pueden ser usados un único vector o plásmido o
dos o más vectores o plásmidos que contengan juntos el ADN total
por ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un
transposón. El vector puede consistir en plásmidos lineales o
circulares cerrados y contendrá preferiblemente un
elemento(s) que permita la integración estable del vector en
el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector
en la célula independiente del genoma.
En una forma de realización preferida el vector
de expresión recombinante es capaz de replicar en levadura.
Ejemplos de secuencias que permiten al vector replicar en levadura
son los genes de replicación 2 \muM de plásmido de levadura REP
1-3 y origen de replicación.
Los vectores de la presente invención contienen
preferiblemente uno o más indicadores seleccionables que permiten
la fácil selección de las células transformadas. Un indicador
seleccionable es un gen cuyo producto proporcione una resistencia
biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía para
auxótrofos y similares. Ejemplos de indicadores bacterianos
seleccionables son genes dal de Bacillus subtilis o
Bacillus licheniformis o indicadores que confieren
resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina,
canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los indicadores
seleccionables para el uso en una célula huésped fúngica filamentosa
incluyen amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa),
pyrG (orotidina-5'-fosfato
decarboxilasa) y trpC (antranilata sintasa). Indicadores adecuados
para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2,
MET3, TRP1, y URA3. Un indicador seleccionable preferido para
levadura es el gen TPI de Schizosacaromices pompe (Russell
(1985) Gene 40:125-130).
En el vector, la secuencia polinucleótida es
operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que
muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección
incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede ser
obtenido a partir de genes que codifiquen polipéptidos
extracelulares o intracelulares, bien homólogos o heterólogos a la
célula huésped.
En un huésped de levadura, promotores útiles son
los promotores MF\alpha1, TPI, ADHm Gal o PGK de Saccharomyces
cerevisiae.
El constructo polinucleótido de la invención
será también conectado normalmente de forma operativa a un
terminador adecuado. En la levadura un terminador adecuado es el
terminador TPI (Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet.
1:419-434) o el terminador CYC1.
Los procedimientos usados para ligar la
secuencia polinucleótida de la invención, el promotor y el
terminador, respectivamente, y para insertarlos en un vector
adecuado que contenga la información necesaria para la replicación
en el huésped seleccionado, son bien conocidos por los expertos en
la técnica. Será entendido que el vector puede ser construido bien
preparando primero un constructo de ADN que contenga la secuencia
completa de ADN que codifique la molécula precursora de la
invención, e insertando posteriormente este fragmento en un vector
de expresión adecuado, o insertando secuencialmente fragmentos de
ADN que contengan información genética para los elementos
individuales seguido de ligación.
La célula huésped es una célula de levadura. El
organismo de levadura usado en el proceso de la invención puede ser
cualquier organismo de levadura adecuado que, al cultivarlo,
produzca cantidades grandes de la molécula precursora. Ejemplos de
organismos de levadura adecuados son cepas seleccionadas de las
especies de levadura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum,
Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia
methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida esp.,
Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum esp., y
Geotrichum fermentans.
La transformación de las células de levadura
puede por ejemplo ser efectuada por formación de protoplastos
seguida de la transformación de una manera conocida per se.
El medio usado para cultivar las células pueden ser cualquier medio
convencional adecuado para cultivar organismos de levadura. El
precursor secretado de la invención puede después ser recuperado del
medio por procedimientos convencionales incluyendo la separación de
las células de levadura del medio por centrifugado, filtración o
toma del precursor por una matriz de intercambio iónico o por una
matriz de absorción de fase inversa, por precipitación de los
componentes proteináceos del sobrenadante o filtrado mediante una
sal, p. ej. sulfato de amonio, seguido de purificación por una
variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej. cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
En el presente texto, la designación "un
análogo" es utilizado para designar un péptido donde uno o
más residuos aminoácidos del péptido progenitor han sido
sustituidos por otro residuo aminoácido y/o donde uno o más
residuos aminoácidos del péptido progenitor han sido eliminados y/o
donde unos o más residuos aminoácidos han sido añadidos al péptido
progenitor. Dicha adición puede tener lugar bien en el extremo
N-terminal o en el extremo
C-terminal del péptido progenitor o ambos.
El término "derivado" es usado en el
presente texto para designar un péptido donde uno o más de los
residuos aminoácidos del péptido progenitor han sido químicamente
modificados, p. ej. por alquilación, acilación, formación de
ésteres o formación de amida.
Los residuos aminoácidos son indicados bien por
el código de una letra o de tres letras.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1 muestra el plásmido pKV304 que contiene
el ADN que codifica Arg34
GLP-1_{(7-37)} bajo control
regulador del promotor y terminador TPI y la prepro secuencia
MFalfa. Este plásmido es el plásmido de inicio para hacer plásmidos
de expresión para las moléculas precursoras según la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa huésped ME1719 es una cepa diploide y
tiene un fenotipo que carece de dos actividades de aspartil
proteasa, es decir, YPS1 (previamente llamada YAP3) que secciona el
sitio C-terminal de residuos aminoácidos mono- o
dibásicos (Egel-Mitani, et al., YEAST 6:
127-137, 1990) y PEP4 una proteasa vacuolar A
responsable de la activación de otras proteasas tales como proteasa
B, carboxipeptidasa Y, aminopeptidasa I, RNasa, fosfatasa alcalina,
trehalasa ácida y exopolifosfatasa. Además el gen de triosa fosfato
isomerasa (TPI) ha sido interrumpido cuyo fenotipo hace posible
utilizar glucosa en crecimiento de transformantes en el medio que
contiene glucosa. El contexto genético de ME1719 es
MATa/\alpha \Deltayps1::ura3/\Deltayps1::URA3
pep4-3/pep4-3
\Deltatpi::LEU2/\Deltatpi::LEU2 leu2/leu2
\Deltaura3/\Deltaura3.
Los plásmidos de expresión que contienen
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} extendido
de forma N-terminal fueron hechos como sigue: se
digirió el plásmido pKV304 conteniendo el ADN que codifica
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} sin una
extensión N-terminal con EagI+NcoI o EagI+Asp718.
Después de la electroforesis en agarosa y la purificación
GeneClean^{TM} III, fueron aislados fragmentos de 1,4 kb y 10 kb,
respectivamente. Loa adaptadores oligonucleótidos correspondientes a
varias extensiones N-terminales de
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} que
contiene los sitios de seccionamiento NcoI y Asp718 fueron asimismo
purificados como se ha descrito anteriormente. El fragmento 1,4 kb
(EagI+NcoI), fragmento 10 kb (EagI+Asp718) y el fragmento adaptador
diseñado para la extensión N-terminal de
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
(NcoI+Asp718) fueron ligados y transformados en cepa de E.
coli MT172 y el ADN plásmido fue secuenciado para verificar el
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} correcto
extendido N-terminalmente.
El ADN del plásmido fue después transformado en
cepa de levadura ME1719 y los transformantes de levadura fueron
aislados dos veces sobre placas selectivas MUPD. Las células de
levadura fueron cultivadas en un medio de 5 ml de MUPD durante 3
días a 30ºC y los sobrenadantes del cultivo fueron analizados por
HPLC y MALDI-MS (Desorción mediante Láser Asistida
por Matriz/Espectrometría de Masas por lnonización). El medio MUPD
consiste en 25 g de extracto de levadura (bacto), 5 g de
KH_{2}PO_{4}, 1,5 g de MgSO_{4}.7H_{2}O, agua por
intercambio iónico de 1 litro y pH ajustado a 6,0 con 5 N
H_{2}SO_{4} antes del autoseccionamiento a 121ºC, 20 min. Se
autoseccionaron 30 g de glucosa separadamente en una concentración
del 50%p/v y se añadieron asépticamente.
La Tabla 1 muestra los diferentes precursores
GLP-1 y el rendimiento en comparación con un
control sin extensión N-terminal.
\newpage
(Continuación)
El análogo al GLP-1 fue
producido como se ha descrito en el Ejemplo 1. El caldo de
fermentación fue clarificado por centrifugación y 2620 ml de
sobrenadante fueron diluidos a 7900 ml y el pH fue ajustado a pH
3,1. La conductividad final fue de 4,9 mS/cm. Una columna 2,6 X 100
cm rellenada con 100 ml de Pharmacia Streamline® SP Código no.
17-0993-05 fue equilibrada y
fluidificada como recomienda el proveedor (Pharmacia booklet
18-1124-26, Expanded Gel
Adsorption, Principles and Methods) utilizando un tampón de citrato
de 0,025M con pH 3,1 y posteriormente eluido por 0,5M de Tris base
a un flujo de 0,5 ml/min. Las fracciones que contienen el análogo al
GLP1 fueron identificadas por RP-HPLC analítica
utilizando un gradiente de CH_{3}CN en 0,010M de Tris, 0,015M
Na_{2}SO_{4} pH 7,4 con H_{2}SO_{4} diluido. El volumen de
las muestras agrupadas era de 100 ml conteniendo 361 mg de análogo
al GLP-1 y la pureza era del 72,4%. La muestra fue
nuevamente purificada por RP- HPLC de preparación. El sistema de
tampón consistió en un tampón A de 0,010M Tris, 0,015M de
Na_{2}SO_{4} y 20% de etanol v/v pH 7,5 con H_{2}SO_{4}
diluido y un tampón B consistente en el 70% en etanol. Las partes
alícuotas correspondientes a 90 mg de un análogo de GLP1 fueron
aplicadas a una columna HPLC (250 X 20)mm rellenada con
Nucleosil 300A, 7 \mum, C4 obtenido de
Macherey-Nagel, D, equilibrado con el 10%B la
muestra fue eluida con un gradiente lineal desde el 10%B hasta el
90%B en un total de 720 ml a un caudal de 6 ml/min. El eluyente fue
vigilado a 214 nm y 276 nm. Las muestras conteniendo el análogo de
GLP1 fueron agrupadas, diluidas con un volumen de agua, ajustadas a
un pH 5,0 y enfriadas a 4ºC. El precipitado fue aislado por
centrifugado y liofilizado. Fueron obtenidos 286 mg y la pureza
final fue del 98,0%.
La acilación del análogo al
GLP-1 fue realizada utilizando 10 mg de muestras
del análogo purificado. La muestra fue disuelta en 0,5 ml de 0,05M
Na_{2}CO_{3} e incubada a 15ºC.
Glu(ONSU)N-hexadecanoil metilester fue
disuelto en 0,5 ml de CH_{3}CN y añadido a la solución análoga.
Se tomaron muestras antes de la adición del reactivo y después de
15 y 30 minutos y después de la terminación de la reacción con el
tampón de enfriamiento. A las muestras les fue añadido el tampón de
enfriamiento y fueron diluidas con 20% vol/vol de etanol y fueron
analizadas por RP-HPLC analítica. La acilación en
presencia de iones metálicos bivalentes fue llevada a cabo por
adición del volumen apropiado de una solución de 0,1M de ión
metálico antes de la adición del reactivo de acilación de
aminoácido. El volumen del tampón de Na_{2}CO_{3} fue ajustado
correspondientemente. El acetato de Zn^{2+} fue usado en el
experimento con Zn^{2+} como ión metálico.
La adición de más de 2 equivalentes de Zn^{2+}
fue asociada por precipitación de la muestra. No obstante, el
rendimiento mejoró cuando 2 equivalentes de Zn^{2+} fueron usados
para la acilación junto con un exceso de reactivo de acilación.
Así, un rendimiento del 52% fue obtenido junto con el 7% del
producto de acilación desamidada, que es superior al 42,4% del
rendimiento y al 5,1% del producto desamidado obtenido en ausencia
de Zn^{2+}.
Los resultados son mostrados en la Tabla 2 y
Tabla 3 abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
EEAHK (SEC ID NO:1)-
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fue
acilado por adición de 2 equivalentes de reactivo de acilación en
presencia de 2 equivalentes de Zn^{2+} durante 15 min. como se ha
descrito anteriormente. Un total de 15 \mul fue aplicado a una
columna analítica RP-HPLC usando un sistema tampón
TFA/CH_{3}CN/H_{2}O. El producto purificado correspondiendo a 57
\mug representa un rendimiento de la síntesis del 46%. El
producto fue secado y posteriormente disuelto en 0,025 ml 0,1 m
NaOH a 0ºC e incubado durante 20 min. Después de la hidrólisis del
metilester, a la muestra le fue entonces añadido 15 \mul 0,1 m HCl
y 5 \mul 0,1 m Tris. HCl y un papel indicador del pH midió un pH
de aproximadamente 8-9. A la muestra le fue después
añadida 10 \mul CH_{3}CN y más tarde 1 \mul 1 mg/ml de
proteasa de Achromobacter lyticus I (EC 3.4.21.50) y fue
incubada durante 30 min a temperatura ambiente. Un total de 10
\mul fue aplicado al sistema RP-HPLC como se ha
descrito anteriormente y el más prominente de los 3 picos
correspondiente al 66,2% fue caracterizado además y descubierto
como idéntico al producto deseado. Los resultados son mostrados en
la Tabla 4 abajo.
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El precursor de GLP-1
EEAEK(SEC ID NO: 45)-
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fue
expresado en levadura como se ha descrito anteriormente y recuperado
ajustando la fuerza iónica a 7 en el sobrenadante de fermentación y
por enlace a una columna catiónica SP Sepharose Fast Flow XL
(Amersham-Pharmacia). El precursor fue eluido con
un gradiente de 0-100% de 50 mM de ácido fórmico +
1 M de NaCl en 50 mM de ácido fórmico. Después de 10 volúmenes de
columna la columna fue lavada con 2 volúmenes de 50 mM de ácido
fórmico por elución con 0,5 M de glicina con un pH 9 durante 3,5
volúmenes de columna. Las fracciones fueron analizadas por
MALDI-MS y los grupos precursores fueron
identificados. Estos grupos fueron aplicados en columna (9,4x250
mm) Reverse Phase HPLC a ZORBAX 300SB-CN. La elución
se efectuó con un gradiente del 30-70% de tampón B
(0,1% TFA/80% etanol) en tampón A (0,1% TFA). Las fracciones fueron
identificadas por el modelo de UV y MALDI-MS. Los
grupo fueron recogidos, el etanol fue evaporado al vacío y el
producto fue liofilizado.
5 mg de precursor liofilizado EEAEK(SEC
ID NO:45)-
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fueron
disueltos en 350 \mul de agua y 700 \mul NMP
(N-metil-pirrolidon-2)
a temperatura ambiente y 4 equivalentes de éster
N-hexadecanoil-/ácido
glutámico-\alpha-tert-butiléster-\gamma-succinilimidílico
fueron añadidos en tiempo cero. El pH fue ajustado a 9,5 con EDIPA
(etil-diisopropilamina) y mantenido constante a 9,5
por adición de EDIPA. Después de 60 minutos la reacción fue detenida
por adición de 208 \mul de una solución del 1% de glicina en
agua. El análisis de la mezcla reactiva mostró que el 24% era
producto sin reacción. El 61% fue monoacilado en la posición
Lys^{26}. El 8% fue diacilado en Lys^{26} y en el grupo amino
N-terminal. El 7% fue diacilado en Lys^{6} y
Lis^{26}. Las moléculas mono- y diaciladas fueron convertidas en
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (69%)
monoacilado por tratamiento en el sitio de seccionamiento de lisina
con ALP según procedimientos bien establecidos. El resultado fue
confirmado por HPLC y MALDI-MS.
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Los precursores de GLP-1
EELDARLEALK(SEC ID NO:33)-
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)},
EEAHEiK(SEC ID NO:18)-
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} y
DDDDK(SEC ID Nº: 26)-
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fueron
todos expresados en levadura y purificados como se ha descrito en
el Ejemplo 3.
La acilación fue llevada a cabo como se ha
descrito en el Ejemplo 3. Se usaron 1,3 equivalentes de éster
hexadeca-
noil-/ácido glutámico-\alpha-tert-butiléster-\gamma-succinilimidilico. El análisis de HPLC y MALDI-MS reveló en todos los casos 15-30% de sustrato no reactivo y alrededor del 20% de producto diacilado (Lys^{6}, Lys^{26}) después de la hidrólisis con ALP directamente en la mezcla de acilación. Los resultados son mostrados en la tabla 5.
noil-/ácido glutámico-\alpha-tert-butiléster-\gamma-succinilimidilico. El análisis de HPLC y MALDI-MS reveló en todos los casos 15-30% de sustrato no reactivo y alrededor del 20% de producto diacilado (Lys^{6}, Lys^{26}) después de la hidrólisis con ALP directamente en la mezcla de acilación. Los resultados son mostrados en la tabla 5.
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Esta lista de documentos relacionados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea.
Aquella ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\bullet WO 9808871 A [0009] [0040] [0040]
\bullet WO 9808872 A [0009] [0040]
\bullet US 6011007 A [0010]
\bullet WO 0055119 A [0010] [0040]
\bullet WO 9535384 A [0010]
\bullet US 5726038 A [0054]
\bullet US 487000 A [0054]
\bullet US 4546082 A [0055]
\bullet US 4870008 A [0055]
\bullet US 5395922 A [0055]
\bullet US 5795746 A [0055]
\bullet US 5162498 A [0055]
\bullet WO 9832867 A [0055]
\bullet WO 6289204 A [0083]
\bulletPETERS, T. All about Albumin
Academic Press 1996. 121-123 [0016]
\bulletZHU et al. Protein
Science, 1993, vol. 2, 384-394 [0023]
\bulletSCHMIDT et al.
Diabetologia, 1985, vol. 28, 704-707
[0048]
\bulletTHORTON et al.
Biochemistry, 1994, vol. 33, 3532-3539
[0048]
\bulletADELHORST K. et al. The
Journal of Biological Chemistry, 1994,
6275-6278 [0050]
\bulletEGEL-MITANI et al. YEAST, 1990, vol. 6, 127-137
[0054] [0071]
\bulletTHORNER et al. The
Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae Cold
Spring Harbor Laboratory 1981. 143-180
[0054]
\bulletBEAUCAGE et al. Tetrahedron
Letters, 1981, vol. 22, 1859-1869
[0056]
\bulletMATTHES et al. EMBO
Journal, 1984, vol. 3, 801-805 [0056]
\bulletRUSSELL Gene,
1985, vol. 40, 125-130 [0060]
\bulletALBER et al. J. Mol. Appl.
Genet., 1982, vol. 1, 419-434 [0063]
<110> Novo Nordisk A/S
\hskip1cmEgel-Mitani, Michi
\hskip1cmBalscmidt, Per
\hskip1cmMarkussen, Jan
\hskip1cmDiers, Ivan
\hskip1cmBorglum Kjeldsen, Thomas
\hskip1cmJonassen, Ib
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para hacer polipéptidos
acilados
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6289.204-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patentIn 3.1
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<210> 1
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<211> 5
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<212> PRT
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<220>
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<223> Secuencia péptida sintética
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<212> PRT
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<223> Péptido artificial
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<212> PRT
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<223> Péptido artificial
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<212> PRT
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<220>
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<223> Secuencia péptída sintética
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<223> Secuencia péptida sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia péptida sintética
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<212> PRT
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<223> Secuencia péptida sintética
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<223> Secuencia péptida sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia péptida sintética
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<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características que no encajan en
otras entradas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Ala, Thr o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia péptida sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características que no encajan en
otras entradas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu, Asp, Asn, Gln,
Thr, Gly, Leu, Ile, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características que no encajan en
otras entradas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Leu, Ile, Val, Met,
Phe, Tyr, Trp o Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
Claims (18)
1. Método para hacer un polipéptido que
comprende al menos un residuo de lisina que es acilado en su grupo
E-amino, dicho método comprendiendo las siguientes
fases:
- (i)
- cultivo de una célula de levadura que comprende una secuencia polinucleótida que codifica una molécula precursora de dicho polipéptido bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora, comprendiendo la molécula precursora el polipéptido deseado y una extensión N-terminal, siendo dicha extensión N-terminal seccionable del polipéptido deseado en un sitio de seccionamiento de lisina y teniendo la fórmula siguiente:
X_{n}
- - - - - X_{1} -
Lys
- \quad
- donde Lys es un sitio de seccionamiento y X_{n} - - - - - X_{1} es una secuencia péptida con una longitud de 2-14 residuos aminoácidos que tiene la función de prevenir o minimizar la acilación del grupo \varepsilon-amino libre en el sitio de seccionamiento Lys en la fase (iii) y que tiene la función adicional de proteger el polipéptido precursor expresado contra el seccionamiento endoproteolitico con la condición de que ninguna X sea Lys y de que al menos una X sea His o Glu o Asp;
- (ii)
- la separación de la molécula precursora expresada del caldo de cultivo;
- (iii)
- preferentemente la acilación del grupo \varepsilon-amino en al menos un residuo de lisina en el polipéptido deseado sin acilar el grupo \varepsilon-amino del sitio de seccionamiento de lisina en la extensión N-terminal;
- (iv)
- la eliminación de la extensión N-terminal de la molécula precursora acilada por seccionamiento enzimático y
- (v)
- el aislamiento del polipéptido acilado por medios adecuados.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, donde el
polipéptido es monoacilado.
3. Método según la reivindicación 1, donde los
residuos Glu o Asp son posicionados entre los residuos 1 a 5 a
partir del sitio de seccionamiento de la lisina.
4. Método según la reivindicación 1, donde la
extensión N-terminal comprende una secuencia
Glu-Glu.
5. Método según la reivindicación 1, donde uno o
más residuos de histidina en la extensión
N-terminal son posicionados 1-4
residuos a partir del sitio de seccionamiento de la lisina.
6. Método según la reivindicación 1, donde
X_{n} - - - - - X_{1} es de
2-12 residuos aminoácidos de longitud.
7. Método según la reivindicación 1, donde la
primera y segunda X del extremo N-terminal de la
extensión N-terminal son seleccionados del grupo
que consiste en Glu y Asp.
8. Método según la reivindicación 1, donde
X_{n} - - - - - X_{1} - Lys es
seleccionado del grupo que consiste en
Glu-Glu-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:1);
Glu-(Glu-Ala)_{2}-His-Lys
(SEC ID NO:2);
Glu-(Glu-Ala)_{3}His-Lys
(SEC ID NO:3);
Glu-Glu-Gly-His-Lys
(SEC ID NO:4);
Glu-His-Pro-Lys (SEC
ID NO:5);
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:6);
Glu-Glu-His-Cys-Lys
(SEC ID NO:7);
Glu-Glu-His-His-Lys
(SEC ID NO:8);
Glu-His-His-His-Lys
(SEC ID NO:9);
Glu-His-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:10);
Glu-Gly-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:11);
Glu-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:12);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys
(SEC ID NO:13);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys
(SEC ID NO:14);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys
(SEC ID NO:15);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys
(SEC ID NO:16);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys
(SEC ID NO:17);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys
(SEC ID NO:18);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys
(SEC ID NO:19);
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys
(SEC ID NO:20);
Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:21),
Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:22);
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-
Glu-Pro-Lys (SEC ID NO: 23);
Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:24); Glu-Glu-Lys;
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(SEC ID NO: 26);
Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:29);
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:30);
Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:31);
Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO: 32);
Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:33);
Asp-Thr-His-Lys (SEC
ID NO:34);
Asp-Ala-His-Lys (SEC
ID NO:35);
Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:36);
Asp-Ser-His-Lys (SEC
ID NO:
37); Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:38); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:39); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:40); Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:41); Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEC ID NO:42); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEC ID NO:43); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEC ID NO:44); Glu-Glu-Ala-Glu-Lys (SEC ID NO:45); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEC ID NO:46); Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEC ID NO:47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEC ID NO:48); y Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEC ID NO:49).
37); Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:38); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:39); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:40); Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEC ID NO:41); Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEC ID NO:42); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEC ID NO:43); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEC ID NO:44); Glu-Glu-Ala-Glu-Lys (SEC ID NO:45); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEC ID NO:46); Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEC ID NO:47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEC ID NO:48); y Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEC ID NO:49).
9. Método según la reivindicación 1, donde
X_{n} - - - - - X_{1} - Lys es
seleccionado del grupo que consiste en
Glu-Glu-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:1);
Glu-(Glu-Ala)_{2}-His-Lys
(SEC ID NO:2);
Glu-(Glu-Ala)_{3}His-Lys
(SEC ID NO:3);
Glu-Glu-Gly-His-Lys
(SEC ID NO:4);
Glu-His-Pro-Lys (SEC
ID NO:5);
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:6);
Glu-Glu-His-Cys-Lys
(SEC ID NO:7);
Glu-Glu-His-His-Lys
(SEC ID NO:8);
Glu-His-His-His-Lys
(SEC ID NO:9);
Glu-His-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:10);
Glu-Gly-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:11);
Glu-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:12);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys
(SEC ID NO:13);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys
(SEC ID NO:14);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys
(SEC ID NO:15);
Glu-Glu-Ala-His-
Glu-Met-Lys (SEC ID NO:16);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys
(SEC ID NO:17);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys
(SEC ID NO: 18);
Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys
(SEC ID NO:19);
Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:24);
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:30);
Asp-Thr-His-Lys (SEC
ID NO:34);
Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys
(SEC ID NO:36); Asp-Ser-His- Lys
(SEC ID NO:37);
Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:38);
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO: 39);
Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:40);
Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys
(SEC ID NO:41);
Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:42);
Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:43);
Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:44);
Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:47);
Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO: 48); y
Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys
(SEC ID NO:49).
10. Método según la reivindicación 1, donde
X_{n} - - - - - X_{1} - Lys es
Glu-Glu-Ala-Glu-Lys,
SEC ID NO:45;
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys,
SEC ID NO:46 o Glu-Glu-Lys.
11. Método según la reivindicación 1, donde
X_{n} - - - - - X_{1} - Lys es
seleccionado de grupo que consiste en
Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-su-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:29),
Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:30);
Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:31);
Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:32);
Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys
(SEC ID NO:33);
Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:43); y
Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys
(SEC ID NO:44).
12. Método según la reivindicación 1, donde la
extensión N-terminal es seleccionada del grupo que
consiste en
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys
(SEC ID NO:20),
Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:21),
Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO:22) y
Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys
(SEC ID NO: 23).
13. Método según la reivindicación 1, donde el
seccionamiento enzimático en la fase (iv) es llevado a cabo usando
una endopeptidasa de lisina tal como la proteasa I Achromobacter
lyticus.
14. Método según la reivindicación 1, donde el
polipéptido deseado pertenece al GRF (factor de liberación de la
hormona de crecimiento), familia de péptidos que tienen un His o
Tyr en la posición N-terminal y Ser, Ala o Gly en
la siguiente posición.
15. Método según la reivindicación 14, donde el
polipéptido deseado es GLP-1 o
GLP-2 o un análogo a GLP-1 o GLP2 o
derivado.
16. Método según la reivindicación 15, donde el
análogo a GLP-1 es
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} acilado
en posición Lys^{26}.
17. Método según la reivindicación 1, donde la
fase de acilación (iii) es realizada en un solvente orgánico o en
una mezcla de agua y un solvente orgánico en presencia de iones
metálicos.
18. Método según la reivindicación 1, donde la
fase de acilación es llevada a cabo a un pH entre 7 y 12.
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