ES2333942T3 - Precursores de insulina y proceso para su preparacion. - Google Patents
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Abstract
Precursor de insulina que comprende la fórmula B(1 - 29) - X1 - Y - A(1 - 21) donde X1 es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es pro y Y es Lys o Arg.
Description
Precursores de insulina y proceso para su
preparación.
Organismos de levadura producen varias proteínas
que tienen una función fuera de la célula. Proteínas de este tipo
son referidas como proteínas segregadas. Estas proteínas segregadas
se expresan inicialmente dentro de la célula en una forma
precursora o una forma pre conteniendo una secuencia de prepéptido
que asegura la dirección (translocación) eficaz del producto
expresado a través de la membrana del retículo endoplásmico (ER). El
prepéptido, normalmente denominado un péptido señal, es
generalmente seccionado del producto deseado durante la
translocación. Una vez introducida en la vía secretora, la proteína
se transporta al aparato de Golgi. Del Golgi, la proteína puede
seguir diferentes vías que llevan a compartimentos tales como la
vacuola celular o la membrana celular, o puede ser dirigida fuera de
la célula para ser segregada al medio externo (Pfeffer a al. (1987)
Ann. Rev. Biochem. 56:829-852).
La insulina es una hormona polipeptídica
segregada por \beta-células del páncreas y
consiste en dos cadenas de polipéptido, A y B, que se enlazan por
dos puentes disulfuro de intercadena. Además, la cadena A
caracteriza un puente disulfuro de
intra-cadena.
La hormona es sintetizada como una proinsulina
monocatenaria precursora (preproinsulina) que consiste en un
prepéptido de 24 aminoácidos seguido de proinsulina que contiene 86
aminoácidos en la configuración: prepéptido - B - Arg Arg - C - Lys
Arg -A, donde C es un péptido de conexión de 31 aminoácidos.
Arg-Arg y Lys-Arg son sitios de
seccionamiento para el seccionamiento del péptido de conexión de
las cadenas A y B.
Tres métodos más importantes han sido usados
para la producción de insulina humana en microorganismos. Dos
implican Escherichia coli, bien con la expresión de una
proteína de fusión grande en el citoplasma (Frank et al.
(1981) in Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide
Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL. pp 729-739), o uso de un péptido
señal para permitir la secreción en el espacio periplásmico (Chan
et al. (1981) PNAS 78:5401- 5404). Un tercer método utiliza
Saccharomyces cerevisiae para segregar un precursor de
insulina en el medio (Thim et al. (1986) PNAS
83:6766-6770). La técnica anterior expone un número
limitado de precursores de insulina que se expresan en bien E.
coli o Saccharomyces cerevisiae, véase US 5,962,267, WO
95/16708, EP 0055945, EP 0163529, EP 0347845 y EP 0741188.
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La presente invención caracteriza nuevos
péptidos de conexión (Péptidos C) que confieren un rendimiento de
producción aumentada de moléculas de precursor de insulina cuando
se expresa en un microorganismo transformado, en particular
levadura. Precursores de insulina de este tipo pueden después ser
convertidos en insulina humana, insulina humana desB30 o
determinadas insulinas humanas aciladas por una o más fases de
conversión adecuadas bien conocidas.
Los péptidos de conexión de la presente
invención contienen al menos un Pro y generalmente serán
relativamente cortos, normalmente no más largos de 6 - 4 residuos
de aminoácidos de longitud.
El péptido de conexión contiene un sitio de
seccionamiento en su extremo C-terminal que permite
el seccionamiento in vitro del péptido de conexión de la
cadena A. El sitio de seccionamiento permitiendo el seccionamiento
del péptido de conexión de la cadena A es un residuo de aminoácido
único básico Lys o Arg, preferiblemente Lys que es divisible por
tripsina o tripsina como proteasas; la proteasa Acromobactor
lyticus o por una proteasa de carboxipeptidasa.
El seccionamiento del péptido de conexión de la
cadena B se habilita por rotura en el residuo de aminoácido LysB29
natural en la cadena B que da lugar al precursor de insulina
desB30. Si el precursor de insulina debe ser convertido en insulina
humana, el residuo de aminoácido B30 Thr (Thr) puede después ser
añadido por procedimientos enzimáticos bien conocidos, in
vitro. La insulina desB30 puede también ser convertida en una
insulina acilada como se describe en US 5,750,497 y US
5,905,140.
En una forma de realización los precursores de
insulina según la invención comprenden la fórmula
B(1-29) - X1 - Y -
A(1-21), donde X1 es una secuencia peptídica
de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro,
y Y es Lys o Arg.
En otra forma de realización de la presente
invención el Pro es inmediatamente N-terminal al
sitio de rotura Y contiguo a la cadena A. El péptido de conexión
puede contener más de un Pro, pero preferiblemente no más de tres
residuos Pro.
En una forma de realización, el número total de
residuos de aminoácidos en X_{1} será de 1 - 4,
1-3, o 1-2 residuos de aminoácidos.
Los residuos de aminoácidos en X_{1} pueden ser cualquier residuo
de aminoácido codificable y puede ser igual o diferente con la
única condición de que al menos uno es Pro.
En otra forma de realización la secuencia
X_{1} - Y no contendrá dos residuos de aminoácidos básicos
contiguos (Lys, Arg) y en otra forma de realización adicional
X_{1} contendrá un residuo de aminoácido con un grupo COOH libre
(Glu, Asp) o un residuo de aminoácido con un grupo amino libre
(Gln, Asn, His).
Ejemplos de secuencias X_{1} - Y - son
GlnProLys; ThrProLys; GluProLys; GlyProLys; MetProLys; SerProLys;
AspProLys; AlaAspProLys (SEC ID NO:8); AsnAspProLys (SEC ID NO:9);
GluAspProLys (SEC ID NO:10) y AlaAspProLys (SEC ID NO:11).
La presente invención está también relacionada
con las secuencias de polinucleótidos que codifican para los
precursores de insulina reivindicados.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
proceso para hacer un precursor de insulina dicho método
comprendiendo
- (i)
- cultivar una célula de levadura que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un precursor de insulina con la fórmula B(1-29) - X1 - Y - A(1-21) donde X_{1} es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro y Y es Lys o Arg, bajo condiciones de cultivo adecuadas para la expresión de dicho precursor de insulina; y
- (ii)
- aislar el precursor de insulina expresado.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a un proceso para hacer insulina humana desB30 o insulina
humana, dicho método comprendiendo
- (i)
- cultivar una célula de levadura que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un precursor de insulina con la fórmula B(1-29) - X_{1} - Y - A(1-21) donde X_{1} es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro y Y es Lys o Arg, bajo condiciones de cultivo adecuadas para la expresión de dicho precursor de insulina;
- (ii)
- aislar el precursor de insulina del medio de cultivo y
- (iii)
- convertir el precursor de insulina en insulina humana desB30 o insulina humana por conversión in vitro química o enzimática.
En una forma de realización de la presente
invención la célula huésped es una célula huésped de levadura y en
otra forma de realización la célula huésped de levadura es
seleccionada del género Saccharomyces. En otra forma de
realización la célula huésped de levadura es seleccionada de la
especie Saccharomyces cerevisiae.
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Fig. 1 representa el plásmido de expresión
pAK855 de S. cerevisiae que expresa el precursor el líder
TA57 -EEGEPK(SEC ID
NO:1-)-B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21).
Fig. 2 representa la secuencia de nucleótidos
del cassette de expresión del plásmido de expresión de levadura
pAK855 y la secuencia de aminoácidos inferida (SEC ID nº: 2 y
3).
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Por "péptido de conexión" o
"péptido C" se entiende la fracción de conexión
"C" de la secuencia polipeptídica
B-C-A de una molécula tipo
preproinsulina de cadena única. Específicamente, en la cadena de
insulina natural, el péptido C conecta la posición 30 de la cadena
B y la posición 1 de la cadena A. Un "mini péptido C" o
"péptido de conexión" tal como se describe aquí, conecta B29 a
A1 y difiere de la secuencia y longitud del péptido C natural.
Por "IP" se entiende un precursor de
insulina de cadena única en el cual una cadena desB30 se enlaza a
la cadena A de insulina por medio de un péptido de conexión. El
precursor de insulina monocatenario contendrá puentes disulfuro
(tres) correctamente situados como en insulina humana.
Con "desB30" o
"B(1-29)" se entiende una cadena de
insulina B natural carente del residuo de aminoácido B30 y
"A(1- 21)" significa la cadena A de insulina natural.
El mini péptido C y su secuencia de aminoácidos se indican en el
código de aminoácido de tres letras.
Por "precursor de insulina" se
entiende un polipéptido monocatenario que por uno o más procesos
posteriores químicos y/o enzimáticos pueden ser convertidos en
insulina humana o insulina humana desB30.
El término "inmediatamente
N-terminal a" se entiende para ilustrar la
situación en la cual un residuo de aminoácido o una secuencia
peptídica está directamente enlazada en su extremo
C-terminal al extremo N-terminal de
otro residuo de aminoácido o secuencia de aminoácidos mediante un
enlace peptídico.
La presente invención caracteriza nuevos mini
péptidos C que conectan la posición 29 de la cadena de insulina B y
la posición 1 de la cadena A de insulina cuya producción
significativamente aumentada resulta en una célula huésped de
levadura. Mediante el término "producción significativamente
aumentada", "rendimiento de fermentación
aumentado", y similares, se entiende un aumento en la
cantidad segregada de la molécula de precursor de insulina presente
en el sobrenadante del cultivo en comparación con el rendimiento de
un precursor de insulina con un péptido C diferente de los péptidos
C según la presente invención. Un rendimiento de fermentación
"aumentado" es un número absoluto mayor que el control;
preferiblemente, el aumento es del 50% o mayor que el control;
incluso más preferiblemente, el aumento es del 100% o mayor que los
niveles de control.
"POT" es el gen de triosa fosfato
isomerasa de Schizosaccharomyces pombe, y "TP11"
es el gen de triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae.
Por un "líder" se entiende una secuencia de
aminoácidos que consiste en un prepéptido (el péptido señal) y un
pro-péptido.
El término "péptido señal" se
entiende para significar un prepéptido que está presente como una
secuencia N-terminal en la forma precursora de una
proteína. La función del péptido señal es permitir la proteína
heteróloga para facilitar la translocación en el retículo
endoplásmico. El péptido señal es normalmente seccionado en el
curso de este proceso. El péptido señal puede ser heterólogo u
homólogo al organismo de levadura que produce la proteína. Varios
péptidos señal que pueden ser usados con el constructo de ADN de la
invención incluyendo péptido señal de proteasa aspártica de levadura
3 (YAP3) o cualquier análogo funcional (Egel-Mitani
et al. (1990) YEAST 6.127-137 y US
5,726,038) y el \alpha-factor señal del gen
MF\alpha1 (Thorner (1981) en The Molecular Biology of the
Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathem et al., eds.,
pp 143-180, Cold Spring
Harbor-Laboratory, NY y US 4,870,00.
El término
"pro-péptido" significa una secuencia
polipeptídica cuya función es permitir que el polipéptido expresado
sea dirigido del retículo endoplásmico al aparato de Golgi y
adicionalmente a una vesícula secretora para secreción en el medio
de cultivo (es decir, exportación del polipéptido a través de la
pared celular o al menos a través de la membrana celular en el
espacio periplásmico de la célula de levadura). El
pro-péptido puede ser el pro-péptido
\alpha-factor de levadura, véase US 4, 546,082 y
4,870,008. De forma alternativa, el pro-péptido
puede ser un pro-péptido sintético, es decir un
pro-péptido no encontrado en la naturaleza. Los
pro-péptidos adecuados sintéticos son aquellos
descritos en US 5,395,922, 5,795,746, 5,162,498 y WO 98/32867. El
pro-péptido preferiblemente contendrá un sitio de
procesamiento de endopeptidasa en el extremo
C-terminal, tal como una secuencia
Lys-Arg o cualquier análogo funcional de la
misma.
La secuencia de polinucleótidos de la invención
puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares
establecidos, p. ej. el método de fosfoamidita descrito por
Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters
22:1859-1869, o el método descrito por Matthes et
al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. Según el
método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por
ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificados,
duplicados y ligados para formar el constructo de ADN sintético.
Una forma de preparación del constructo de ADN habitualmente
preferida es por reacción en cadena de polimerasa (PCR).
La secuencia de polinucleótidos de la invención
puede también ser de origen mezclado genómico, ADNc, y sintético.
Por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc que codifica un
péptido líder puede ser unida a una secuencia genómica o de ADNc
que codifica las cadenas A y B, después de lo cual la secuencia de
ADN puede ser modificada en un sitio insertando oligonucleótidos
sintéticos que codifican la secuencia de aminoácidos deseada para
recombinación homóloga conforme a un procedimiento bien conocido o
preferiblemente generando la secuencia deseada por PCR usando los
oligonucleótidos adecuados.
La invención comprende un vector que es capaz de
replicación en el microorganismo seleccionado o célula huésped y
que lleva una secuencia de polinucleótidos que codifica los
precursores de insulina de la invención. El vector recombinante
puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector
que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un
elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma
artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar
la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que, introducido en la célula huésped, es integrado en el genoma y
replicado con el(los) cromosoma(s) donde ha sido
integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o
plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en
el genoma de la célula huésped, o un transposón pueden ser usados.
El vector puede ser plásmidos lineales o circulares cerrados y
preferiblemente contiene un(os) elemento(s) que
permite(n) la integración estable del vector en el genoma de
la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula
independiente del genoma.
En una forma de realización preferida, el vector
de expresión recombinante es capaz de replicarse en levadura.
Ejemplos de secuencias que permiten que el vector se replique en
levadura son los genes de replicación REP 1-3 del
plásmido de levadura de 2 \mum y el origen de replicación.
Los vectores de la presente invención
preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que
permiten una selección fácil de células transformadas. Un marcador
seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia
biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a
auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables
bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o
Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren
resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina,
canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Marcadores seleccionables
para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen
amdS (acetamidasa), argB
(ornitina-carbamoiltransferasa), pyrG
(orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa)
y trpC (antranilato sintasa). Marcadores adecuados para
células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3,
TRP1, y URA3. Un marcador seleccionable preferido para levadura es
el gen TPI de Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene
40:125-130).
En el vector, la secuencia de polinucleótidos es
operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que
muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección
incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y pueden ser
obtenidos de genes que codifican polipéptidos extracelulares o
intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula
huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción en una célula huésped bacteriana, son los promotores
obtenidos del operón lac de E. coli., el gen de
agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de
levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de
alfa-amilasa de (amyL) de Bacillus
licheniformis, el gen de alfa-amilasa
(amyM) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de
amilasa maltogénica (amyQ) de Bacillus
stearothermophilus, y el gen de penicilinasa (penP) de
Bacillus licheniformis. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción en una célula huésped filamentosa
fúngica son los promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa
de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus
niger, y alfa-amilasa estable en ácido de
Aspergillus niger. En un huésped de levadura, promotores
útiles son el promotores Ma1, TPI, ADH o PGK de Saccharomyces
cerevisiae.
El constructo polinucleótido de la invención
también será normalmente conectado operativamente a un terminador
adecuado. En levadura un terminador adecuado es el terminador TPI
(Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419434).
Los procedimientos usados para enlazar la
secuencia de polinucleótidos de la invención, el promotor y el
terminador, respectivamente, y para insertarlos en un vector
adecuado conteniendo la información necesaria para replicación en
el huésped seleccionado, son conocidos por los expertos en la
técnica. Será entendido que el vector puede ser construido bien
preparando primero un constructo de ADN que contiene la secuencia
de ADN entera que codifica los precursores de insulina de la
invención, y posteriormente insertando este fragmento en un vector
de expresión adecuado, o consecutivamente insertando fragmentos de
ADN que contienen información genética para los elementos
individuales (tales como la señal, pro-péptido, mini
Péptido C, cadenas A y B) seguido de
ligadura.
ligadura.
La presente invención también se refiere a
células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de
polinucleótidos que codifica los precursores de insulina de la
invención. Un vector comprendiendo tal secuencia de polinucleótidos
se introduce en la célula huésped de modo que el vector es
mantenido como un integrante cromosómico o como un vector
extracromosómico autorreplicante como se ha descrito antes. El
término "célula huésped" comprende cualquier progenie de una
célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a
mutaciones que ocurren durante la replicación. La célula huésped
puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un
microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota. Las células
unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias
gram positivas incluyendo, pero no limitadas a, una célula de
Bacillus, célula de Streptomyces, o bacterias gram
negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. Las
células eucariotas pueden ser células de mamífero, insecto, planta,
o fúngicas. En una forma de realización preferida, la célula
huésped es una célula de levadura. El organismo de levadura usado
en el proceso de la invención puede ser cualquier organismo de
levadura adecuado que, en cultivo, produce cantidades grandes del
precursor de insulina y análogos del precursor de insulina de la
invención. Ejemplos de organismos de levadura adecuados son cepas
seleccionadas de la especie de levadura de Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosacaromyces
pombe, Saccharomyces uvarum, kluyveromices
lactis, Hansenula polimorfa, Pichia pastoris,
Pichia metanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia
lipolytica, Candida sp., Candida utilis,
Candida cacaoi, Geotrichum sp., y Geotrichum
fermentans.
La transformación de las células de levadura
pueden por ejemplo ser efectuadas por formación de protoplasto
seguido de transformación de una manera conocida per se. El
medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio
convencional adecuado para crecer organismos de levadura. El
precursor de insulina segregado de la invención, del cual una
proporción significante estará presente en el medio en forma
correctamente procesada, puede ser recuperado del medio por
procedimientos convencionales incluyendo separación de las células
de levadura del medio por centrifugado, filtración o atrapando el
precursor de insulina por una matriz de intercambio iónico o por
una matriz de absorción de fase inversa, precipitación de los
componentes proteínicos del sobrenadante o filtración mediante una
sal, p. ej. sulfato de amonio, seguido de purificación por una
variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej. cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.
Los precursores de insulina de la invención
pueden ser expresados con una extensión de residuo de aminoácido
N-terminal, como se describe en la patente U.S. nº.
5,395,922 y en la patente europea nº. 765,395A, ambas patentes
están aquí específicamente incorporadas por referencia. Se ha
descubierto que la extensión está fijada de forma estable al
precursor de insulina de la invención durante la fermentación,
protegiendo el extremo N-terminal del precursor de
insulina o análogo del precursor de insulina contra la actividad
proteolítica de proteasas de levadura tal como DPAP. La presencia de
una extensión N-terminal en el precursor de
insulina puede también servir como una protección del grupo amino
N-terminal durante la elaboración química de la
proteína, es decir puede servir como sustituto para un BOC
(t-butil-oxicarbonilo) o grupo de
protección similar. La extensión N-terminal puede
ser eliminada del precursor de insulina recuperado mediante una
enzima proteolítica que es específica para un aminoácido básico (p.
ej., Lys) de modo que la extensión terminal es seccionada del
residuo Lys. Ejemplos de enzimas proteolíticas de este tipo son
tripsina o proteasa Achromobacter lyticus.
Después de secreción al medio de cultivo y
recuperación, el precursor de insulina de la invención será
sometido a diferentes procedimientos in vitro para eliminar
la secuencia de extensión N-terminal posible y el
mini péptido C para dar insulina desB30. Insulina DesB30 puede
luego ser convertida en insulina humana añadiendo un Thr en
posición B30. La conversión del precursor de insulina en insulina
humana por una conversión enzimática adecuada mediante tripsina o
una proteasa de Achromobacter lyticus en presencia de un
éster de L-treonina seguido de la conversión del
éster de treonina de la insulina en insulina por hidrólisis básica
o ácida como se describe en la especificación de la patente
estadounidense nº. 4,343,898 o 4,916,212 o en Research Disclosure,
septiembre 1994/487 cuyas descripciones siendo incorporadas por
referencia en la presente. La insulina desB30 puede también ser
convertida en un derivado acilado como se describe en US 5,750,497
y US 5,905,140 cuyas descripciones están incorporadas por
referencia en la presente.
Como se describe abajo, precursores de insulina
con péptidos C sintéticos fueron construidos caracterizando al
menos un Pro. Plásmidos de expresión de Saccharomyces
cerevisiae que contienen una secuencia de polinucleótidos que
codifica los precursores de insulina reivindicados fueron
construidos por PCR y usados para transformar una célula huésped de
S. cerevisiae. La cantidad de producto expresado fue medida
como un porcentaje de la cantidad de control expresado. Los nuevos
péptidos C de la invención dieron rendimientos aumentados de hasta
el
100%.
100%.
El proceso presente permite la producción de una
insulina humana desB30 acilada por cultivo de una célula huésped
que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un
precursor de insulina de la invención; aislando el precursor de
insulina del medio de cultivo, convirtiendo el precursor de
insulina en insulina humana desB30. y convirtiendo la insulina
humana desB30 en un derivado acilado usando un método de acilación
conveniente.
La presente invención es descrita con más
detalle en los siguientes ejemplos que no están de ninguna manera
destinados a limitar el ámbito de la invención como se reivindica.
Las Figuras anexas están destinadas a ser consideradas como partes
íntegras de la especificación y descripción de la invención.
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Todos los plásmidos de expresión son del tipo
C-POT, similar a aquellos descritos en EP 171. 142,
que se caracteriza por el hecho de que contienen el gen de triosa
fosfato isomerasa de Schizosaccharomyces pombe para la
selección de plásmidos y estabilización en S. cerevisiae. Los
plásmidos también contienen el promotor y terminador de triosa
fosfato isomerasa de S. cerevisiae: estas secuencias son
similares a las secuencias correspondientes en el plásmido pKFN1003
(descrito en WO 90/100075) como son todas las secuencias excepto la
secuencia del fragmento ecoRI-XbaI que codifica la
proteína de fusión del líder y el producto precursor de insulina.
Para expresar proteínas de fusión diferentes, el fragmento
ecoRI-XbaI de pKFN1003 es simplemente sustituido
por un fragmento fragmento ecoRI-XbaI que codifica
el líder-precursor de
insulina-fusión de interés. Tales fragmentos
ecoRI-XbaI pueden ser sintetizados usando
oligonucleótidos sintéticos y PCR según técnicas estándares.
Los transformantes de levadura fueron preparados
por transformación de la cepa huésped M663 de S. cerevisiae
(MATalMAT\alpha
pep4-3/pep4-3 HIS4/his4
tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir^{+}). La cepa de levadura MT663 fue
depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen en relación con la solicitud WO 92/11378 y se le dio
el número de depósito DSM 6278.
MT663 fue crecido en YPGaL (1% extracto de
bacto-levadura, 2% Bacto-peptona,
2% galactosa, 1% lactato) para una O.D. a 600 nm de 0.6 100 ml de
cultivo fueron recogidos por centrifugado, lavados con 10 ml de
agua, recentrifugados y resuspendidos en 10 ml de una solución que
contenía 1.2 M de sorbitol, 25 mM de Na2 EDTA pH = 8.0 y 6.7 mg/ml
de ditiotreitol. La suspensión fue incubada a 30ºC durante 15
minutos, centrifugada y las células resuspendidas en 10 ml de una
solución que contiene 1.2 M de sorbitol, 10 mM de Na_{2} EDTA,
0.1 M de citrato sódico, pH 0 5.8, y 2 mg de Novozym®234. La
suspensión fue incubada a 30ºC durante 30 minutos, las células
recogidas por centrifugado, lavadas en 10 ml de 1.2 M de sorbitol y
10 ml de CAS (1.2 M sorbitol, 10 mM CaCl_{2}, 10 mM de Tris HCI
(Tis = Tris(hidroximetil)aminometano) pH = 7.5) y
resuspendidas en 2 ml de CAS. Para la transformación, 1 ml de
células suspendidas de CAS fue mezclado con aprox. 0.1 mg de ADN
plásmido y dejado a la temperatura ambiente durante 15 minutos. 1
ml de (20% polietilenglicol 4000, 10 mM, CaCl_{2}, 10 mM tris HCI,
pH = 7.5) fueron añadidos y la mezcla fue dejada durante otros 30
minutos a la temperatura ambiente. La mezcla fue centrifugada y el
granulado resuspendido en 0.1 ml de SOS (1.2 M sorbitol, 33% v/v
YPD, 6.7 mM CaCl_{2}) e incubado a 30ºC durante 2 horas. La
suspensión fue luego centrifugada y el granulado resuspendido en
0.5 ml de 1.2 M de sorbitol. Luego, 6 ml de top agar (el medio SC de
SSherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory) conteniendo 1.2 M de sorbitol más 2.5% agar) a
52ºC fue añadido y la suspensión vertida en lo alto de placas que
contienen el mismo medio conteniendo sorbitol y agar
solidificado.
La cepa MT663 de S. cerevisiae
transformada con plásmidos de expresión fue crecida en YPD durante
72 h a 30ºC. La cuantificación del rendimiento de precursor de
insulina en los sobrenadantes de cultivo fue realizada por análisis
de HPLC de fase inversa con insulina humana como un estándar
externo (Snel & Damgaard (1988) Proinsulin heterogenity in pigs.
Horm. Metabol. Res. 20:476-488).
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Ejemplo
1
Los genes sintéticos que codifican proteínas de
fusión, que consisten en el precursor de insulina asociado a una
secuencia guía que consiste en un prepéptido (péptido señal) y un
pro-péptido, fueron construidos usando PCR bajo
condiciones estándares (Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y E.H.F polimerasa
(Boehringer Mannheim GmbH, Sandhoefer Strasse 116, Mannheim,
Alemania). Los fragmentos de ADN resultantes fueron aislados y
digeridos con endonucleasas y purificados usando el Gene Clean kit
(Bio101 Inc., La Jolla, CA, EEUU). Métodos estándares fueron usados
para la ligadura de ADN y la transformación de células de E.
coli fue realizada por el método CaCl_{2} (Sambrook et
al. (1989) supra). Los plásmidos fueron purificados de
células de E. coli transformadas usando columnas QIAGEN
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Las secuencias de nucleótidos fueron
determinadas usando el sistema de secuenciación del ADN de ALF
Pharmacia Biotech con ADN plásmido bicatenario purificado como
molde. Los cebadores oligonucleótidos para PCR fueron obtenidos de
tecnología de ADN (Arhus, Dinamarca):
La secreción del precursor de insulina fue
facilitada por el líder TA57 o el líder TA39 (Kjeldsen et
al., 1998. Protein Expression Purif. 14,
309-316), aunque una variedad de secuencias líder
de levadura conocidas pueden ser usadas.
Como se muestra en la Fig. 1 y 2, el plásmido de
expresión pAK855 de S. cerevisiae que expresa el líder
TA57-EEGEDK(SEC ID NO:1)- precursor de
insulina proteína de fusión fue construido basándose en el plásmido
POT lanzadera de S. cerevisiae-E.
coli (patente U.S. 5,871,957). En Fig. 1 L-IP
indica el cassette de expresión de la proteína de fusión que
codifica el líder-precursor de
insulina-proteína de fusión;
TPI-PROMOTOR es el promotor TPI1 de S.
cerevisiae, TPI-TERMINADOR es el terminador TPI1
de S. cerevisiae; TPI-POMBE indica el gen
POT de S. pombe usado para selección en S.
cerevisiae; ORIGEN indica un origen de replicación de S.
cerevisiae derivado del plásmido de 2 \mum;
AMP-R indica el gen de
\beta-lactamasa que confiere resistencia hacia la
ampicilina, facilitando la selección en E. coli; y
ORIGIN-PBR322 indica un origen de replicación de
E. coli.
El ADN que codifica varias proteínas de fusión
de secuencias líder y precursores de insulina con diferentes mini
péptidos C fue generado por PCR usando oligonucleótidos apropiados
como cebadores, como se describe abajo. Métodos estándares fueron
usados para subclonar fragmentos de ADN que codifican el
líder-precursor de
insulina-proteínas de fusión en el vector de
expresión CPOT en la siguiente configuración:
líder-Lys-Arg-separador-precursor
de insulina, donde Lys-Arg es una endoproteasa
dibásica potencial que procesa el sitio de procesamiento y el
separador es una extensión N-terminal. Para
optimizar el tratamiento de la proteína de fusión por la
endoproteasa Kex2 de S. cerevisiae, el ADN que codifica un
péptido separador (extensión N-terminal), p. ej.
EEGEPK (SEC ID NO:1), fue insertado entre el ADN que codifica el
líder y el precursor de insulina (Kjeldsen, et al.1999b. J.
Biotechnology, 75, 195-208). No obstante, el
presente del péptido separador no es obligatorio. El precursor de
insulina fue segregado como un precursor de insulina monocatenario
extendido de forma N-terminal con un mini péptido C,
que conecta Lys^{B29} y Gly^{A1}. Después de la purificación
del precursor de insulina y eliminación proteolítica de la
extensión N-terminal y el mini péptido C, el
aminoácido Thr^{B30} puede ser añadido a Lys^{B29} por
transpeptidación mediada por enzima, para generar insulina humana
(Markussen, et al. (1987) en "Peptides 1986"
(Theodoropoulos, D:, Ed.), págs. 189-194, Walter de
Gruyter & Co., Berlin.).
El desarrollo de mini péptidos C sintéticos fue
realizado por aleatorización de uno o más codón(es) que
codifican los aminoácidos en el mini péptido C. Los mini péptidos C
sintéticos caracterizan normalmente un sitio de procesamiento
enzimático (Lys) en el C-término que permite la
eliminación enzimática del mini péptido C sintético. La
aleatorización fue realizada usando oligonucleótidos dopados que
introdujeron variaciones del(los) codón(es) en una o
más posiciones del(los) mini péptidos C sintéticos.
Normalmente uno de los dos cebadores (oligonucleótidos) usados para
PCR fue dopado. Un ejemplo de un par de oligonucleótidos usado para
generación por PCR de líder-precursor de insulina
con mini péptidos C sintéticos aleatorizados usados para generar
mini péptidos C sintéticos con la fórmula general:
Xaa-Pro-Lys (XPK) son de la
siguiente manera:
Cebador A:
- \quad
- 5'-TTGCTTAAATCTATAACTAC-3' (SEC ID NO:4)
\newpage
Cebador B:
- \quad
- 5'-TTAGTTTCTAGACTAGTTGCAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGCATT GTTCGACAATACCCTTTGGMNNCTTAGGAGTGTAGAAGAA.-3' (SEC ID NO:5)
- \quad
- N = ACTG
- \quad
- M = AC
Reacción en cadena de polimerasa. La PCR fue
normalmente realizada como se indica abajo: 5 \mul de cebador A
(20 pmol), 5 \mul de cebador B (20 pmol), 10 \mul 10X tampón
PCR, 8 \mul de mezcla dNTP, 0.75 \mul de enzima E.H.F., 1
\mul de plásmido pAK855 como molde (aproximadamente 0.2, \mug de
ADN) y 70.25 \mul de agua destilada.
Normalmente entre 10 y 15 ciclos fueron
realizados, un ciclo normalmente fue 95ºC durante 45 seg.; 55ºC
durante 1 min; 72ºC durante 1.5 min. la mezcla RCP fue
posteriormente cargada sobre un 2% de gel de agarosa y la
electroforesis fue realizada usando técnicas estándares, el
fragmento de ADN resultante fue recortado del gel de agarosa y
aislado por el Gene Clean kit.
La Fig. 2 muestra la secuencia de nucleótidos
del cassette de expresión de ADN de pAK855 usado como molde para
PCR e infirió aminoácidos de la proteína de fusión codificada
(TA57-líder-EEGEPK(SEC ID
NO:1)- precursor de insulina de pAK855 (SEC ID nº: 2 y 3).
Asimismo los cassettes de expresión que
codifican una proteína de fusión
TA39-líder-EEGEEPK(SEC ID
NO:1)-precursor de insulina.
El fragmento de ADN purificado por PCR fue
disuelto en agua y el tampón de restricción de endonucleasas y
digerido con endonucleasas de restricción adecuadas (p. ej. Bgl II
y Xba I) según técnicas estándares. Los fragmentos de ADN
BglII-XbaI fueron sometidos a electroforesis y
purificados usando el Gene Clean Kit.
Los fragmentos de ADN digeridos y aislados
fueron ligados juntos con un vector adecuado (p. ej. del tipo CPOT)
usando T4 DNA-ligasa y condiciones estándares. La
mezcla de ligadura fue posteriormente transformada en una cepa de
E. coli competente seguido de selección con resistencia a la
ampicilina. Los plásmidos de la E. coli resultante fueron
aislados usando columnas QIAGEN.
Los plásmidos fueron posteriormente usados para
transformación de una cepa huésped adecuada de S.
cerevisiae, p. ej., MT663 (MATalMAT\alpha
pep4-3/pep4-3. HIS4/his4
tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir^{+}). Los clones de S.
cerevisiae individuales transformados fueron crecidos en
cultivo líquido, y la cantidad del precursor de insulina segregada
a los sobrenadantes de cultivo fue determinada por
RP-HPLC. La secuencia de ADN que codifica el mini
péptido C sintético de los plásmidos de expresión de clones de
S. cerevisiae que segrega una cantidad aumentada del
precursor de insulina fue luego determinada. Posteriormente, el
secuencia identificada de mini péptidos C sintéticos puede ser
sometida a otra ronda de optimización por aleatorización.
Tabla 1 muestra los precursores de insulina
generados por el método anterior y rendimiento de producción
expresado como un porcentaje de control. La fermentación fue
conducida a 30ºC durante 72 h en 5 ml de YPD. Rendimiento del
precursor de insulina fue determinado por RP-HPLC
del sobrenadante del cultivo, y se expresa con respecto al
rendimiento de una cepa de control que expresa un
líder-precursor de insulina-proteína
de fusión donde el residuo B29 se enlaza al residuo A1 por un mini
péptido C Ala-Ala-Lys. YAP3 es la
secuencia señal YAP3. La secuencia EEGEPK (SEC ID NO:1) es una
extensión N-terminal a la B-cadena y
TA57 es una pro-secuencia sintética QPIDD
TESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDWGLISMAKR (SEC ID NO:6).
TESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDWGLISMAKR (SEC ID NO:6).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
2
Por procedimientos análogos a los procedimientos
descritos en el ejemplo 1, los precursores de insulina con un Pro
en el mini Péptido C bajo el control del líder sintético TA37
QPIDDTESNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAG
GLDWNLI-SMAKR (SEC ID NO:7) y la secuencia señal YAP3 fueron expresados en el huésped de levadura MT663. Los precursores todos comprendieron una extensión N-terminal EEGEPK (SEC. ID NO:1). El aumento en rendimiento de expresión en comparación con un control se muestra en la Tabla 2.
GLDWNLI-SMAKR (SEC ID NO:7) y la secuencia señal YAP3 fueron expresados en el huésped de levadura MT663. Los precursores todos comprendieron una extensión N-terminal EEGEPK (SEC. ID NO:1). El aumento en rendimiento de expresión en comparación con un control se muestra en la Tabla 2.
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Ejemplo
3
Por procedimientos análogos a los procedimientos
descritos en el Ejemplo 1, precursores de insulina con un pro en el
mini péptido C según el control de la secuencia líder del
\alpha-factor fueron expresados en el huésped de
levadura MT663. Los precursores de insulina fueron expresados con y
sin una extensión N-terminal EEAEAEAPK (SEC ID
NO:12). El aumento en rendimiento de expresión en comparación con
un control se muestra en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Extensión
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Gly Glu Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115)..(486)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcttaaat ctataactac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (85)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N es A, C, T o g y m es A o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asp Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asp Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asp Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Asp Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Pro Lys}
Claims (17)
1. Precursor de insulina que comprende la
fórmula
B(1-29) -
X_{1} - Y -
A(1-21)
donde
X_{1} es una secuencia peptídica de 1 - 5
residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es pro y
Y es Lys o Arg.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Precursor de insulina según la reivindicación
1, donde X_{1} es 1-4 residuos de
aminoácidos.
3. Precursor de insulina según la reivindicación
1, donde X_{1} es 1-3 o 1-2
residuos de aminoácidos.
4. Precursor de insulina según la reivindicación
1, donde X_{1} es GluPro y Y es Lys.
5. Precursor de insulina según la reivindicación
1, donde X_{1} es AspPro y Y es Lys.
6. Precursor de insulina según la reivindicación
1, donde X_{1} es GlnPro y Y es Lys.
7. Precursor de insulina según una de
reivindicaciones 1 - 6, donde un pro es inmediatamente
N-terminal a Y.
8. Secuencia de polinucleótidos que codifica un
precursor de insulina con la fórmula
B(1-29) -
X_{1} - Y -
A(1-21)
donde
X_{1} es una secuencia peptídica de 1 - 5
residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro y
Y es un Lys o Arg.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Proceso para hacer un precursor de insulina
dicho método comprendiendo
- (i)
- cultivar una célula de levadura que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un precursor de insulina con la fórmula
B(1-29) -
X_{1} - Y -
A(1-21)
- \quad
- donde
- \quad
- X_{1} es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro y
- \quad
- Y es Lys o Arg,
- \quad
- bajo condiciones de cultivo adecuadas para la expresión de dicho precursor de insulina; y
- (ii)
- aislar el precursor de insulina expresado.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Proceso para hacer insulina humana desB30 o
insulina humana, dicho método comprendiendo
- (i)
- cultivar una célula de levadura que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un precursor de insulina con la fórmula
B(1-29) -
X_{1} - Y -
A(1-21)
- \quad
- donde
- \quad
- X_{1} es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es pro y
- \quad
- Y es Lys o Arg,
- \quad
- bajo condiciones de cultivo adecuadas para la expresión de dicho precursor de insulina;
- (ii)
- aislar el precursor de insulina del medio de cultivo y
- (iii)
- convertir el precursor de insulina en insulina humana desB30 o insulina humana por conversión in vitro química o enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Proceso según la reivindicación 10, donde
X_{1} es 1-4 residuos de aminoácidos.
12. Proceso según la reivindicación 10, donde
X_{1} es 1-3 residuos de aminoácidos.
13. Proceso según la reivindicación 10, donde
X_{1} es 1-2 residuos de aminoácidos.
14. Proceso según una de las reivindicaciones
10-13, donde un pro es inmediatamente
N-terminal a Y.
15. Proceso según la reivindicación 10, donde
X_{1} es GluPro y Yes Lys.
16. Proceso según la reivindicación 10 donde
X_{1} es AspPro y Y es Lys.
17. Proceso según la reivindicación 10, donde
X_{1} es GlnPro y Y es Lys.
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