ES2316802T3

ES2316802T3 - Biotransformacion de xilano y acido levulinico a termoplasticos biodegradables.

Info

Publication number: ES2316802T3
Application number: ES03754748T
Authority: ES
Inventors: James P. Nakas; Stuart W. Tanenbaum; Thomas Keenan
Original assignee: Research Foundation of the State University of New York
Current assignee: Research Foundation of the State University of New York
Priority date: 2002-09-23
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2023-09-22
Also published as: EP1585821A4; US20060105439A1; EP1585821B1; ATE413465T1; AU2003272560A8; WO2004027076A3; EP1585821A2; AU2003272560A1; DE60324597D1; CA2499650A1; WO2004027076A2

Abstract

Proceso para producir co-polímero de polihidroxialcanoatos (PHA) comprendiendo monómeros de 3-OH-valerilo (3-HV) y 3-OH-butirilo (3-HB), comprendiendo el proceso lo siguiente: Añadir a un medio que contiene Burkholderia cepacia una cantidad de xilosa como fuente de carbono primaria y una primera cantidad de ácido levulínico como fuente de carbono secundaria; Añadir una segunda cantidad de ácido levulínico al medio entre aproximadamente 16 horas y aproximadamente 24 horas después de que se haya añadido la primera cantidad de ácido levulínico, En el que la segunda cantidad de ácido levulínico es mayor que la primera cantidad de ácido levulínico.

Description

Biotransformación de xilano y ácido levulínico a termoplásticos biodegradables.

Antecedentes de la invención

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres biodegradables que en algunos microorganismos son una reserva intracelular de carbono y energía y que son sintetizados por una variedad de microorganismos cuando se proporcionan fuentes de carbono en exceso y el crecimiento es perjudicado por la falta de al menos un otro nutriente. Recientemente, los PHAs han recibido una mayor atención debido a sus propiedades termoplásticas o elastoméricas que se parecen a las de los plásticos derivados del petróleo, aunque son completamente biodegradables en el medio ambiente (Holmes 1988). Por ello, además de ser sintetizados biológicamente, estos materiales poliméricos alternativos son capaces de ser transformados en los productos de degradación inocuos que son el CO_{2} y el H_{2}O a través de una degradación microbiológica natural (Imam et al. 1999). Con la selección apropiada de microorganismo, fuente de carbono, co-sustrato y condiciones de cultivo, un copoliéster biodegradable puede ser producido con propiedades similares a las del polipropileno, evitándose a la vez muchas de las características ambientalmente recalcitrantes de los plásticos derivados del petróleo (Bertrand et al. 1990). Además de ser biodegradables, los poliésteres de tipo PHA también son reciclables, de modo similar a los termoplásticos de base petroquímica (Madison y Huisman 1999). Puesto que la gran mayoría de plásticos son sintetizados a partir de materias primas a base de petróleo, nuestro método con el que intentamos mejorar esta tecnología se centrará en la utilización de un residuo de la industria papelera, es decir el xilano, como la principal fuente de carbono para la transformación microbiana a estos polímeros ambientalmente compatibles.

Esta nueva generación de termoplásticos biopoliméricos representa una alternativa atractiva a los plásticos derivados a partir de materias primas a base de combustibles fósiles en tiempos de continuo aumento del precio del petróleo, de dificultades de gestión de desechos, y de continua contaminación global. Otra ventaja comerzializable de estos biopolímeros es su producción a partir de recursos renovables utilizados como fuente de carbono primaria y co-sustrato. La producción basada en sustratos de coste relativamente bajo podría hacer que los los termoplásticos derivados de PHA sean más competitivos económicamente frente a los plásticos derivados del petróleo, puesto que lo más costoso en la producción de PHAs son el sustrato y el proceso de separación (Byrom 1987). Ramsay et al. (1995) demostraron la capacidad que Pseudomonas pseudoflava tiene para producir poli-\beta-hidroxialcanoatos utilizando los principales azúcares presentes en la hemicelulosa como fuentes de carbono únicas. Naylor et al., en el documento U.S. 5 871 980, revelan la producción de PHA mediante la fermentación de Alcaligenes sp. alimentando las células con un ácido alifático que típicamente contiene uno o varios grupos alquílicos con 8 a 25 átomos de carbono. Naylor et al. demuestran que la adición opcional de una molécula de número impar de carbonos, como por ejemplo ácido propiónico o alcohol n-propílico, puede originar la producción de PHAs que contienen hasta 30 mol% de valerato.

El poli-3-hidroxibutirato [P(3HB)] es probablemente el mejor caracterizado de todos los PHAs. Sin embargo, los polímeros de [P(3HB)] son altamente cristalinos y frágiles, de lo que resulta un espectro de aplicaciones bastante limitado. Debido a estas limitaciones, investigaciones recientes han enfocado la síntesis de un co-polímero compuesto por 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato para crear poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) [P(3HB-co-3HV], un poliéster de resistencia elevada y propiedades mecánicas más flexibles otorgadas por su singular composición monomérica (Holmes 1988). Las propiedades físicas y térmicas del co-polímero [P(3HB-co-3HV)] y de otros poliésteres del tipo PHA pueden ser reguladas variando sus estructuras moleculares y composiciones monoméricas mediante la selección juiciosa de microorganismo, relaciones de sustrato/co-sustrato y condiciones generales de fermentación. La familia de termoplásticos de PHA producidos por nuestras investigaciones abarca un amplio espectro de materiales poliméricos industrialmente útiles. Esta clase de polímeros muestra propiedades físicas y mecánicas que van desde plásticos cristalinos duros hasta cauchos elásticos, con perfiles de temperatura de fusión que permiten la extrusión, el moldeo por inyección y la fabricación de fibras (fiber spinning) a nivel comercial para crear una variedad de productos de valor añadido (Sudesh et al. 2000).

El co-polímero, [P(3HB-co-3HV)], puede ser sintetizado por varias cepas bacterianas, incluyendo Ralstonia eutropha (denominada anteriormente Alcaligenes eutrophus), Methylobacterium sp., especies seleccionadas de Pseudomonas, y varios clones recombinantes que crecen sobre mezclas del apropiado carbohidrato suministrador de monómeros y un ácido graso de cadena impar, como por ejemplo ácido propiónico, suministrado como co-sustrato con la fuente de carbono primaria (Madison y Huisman 1999).

Las cepas bacterianas recombinantemente ingenierizadas pueden ser manipuladas a fin de modular la relación HB:HV en el co-polímero. Por ejemplo, Aldor y Keasling (2001) demostraron que la composición de [P(3HB-co-3HV)] puede ser controlada también por ingeniería metabólica de una cepa recombinante de Salmonella enterica, lo que incluía la regulación ("dialing") de la composición variando el nivel de inducción de un gen crítico de biosíntesis de PHA. Schubert et al. (1998) informan sobre la expresión de PHA en E. coli transformado con genes de biosíntesis de PHA constitutivamente expresados de R. eutropha. Choi et al. (1998) informan sobre la clonación de genes de biosíntesis de PHA a partir de Alcaligenes latus. Véase también, p. ej., los documentos U.S. 6 593 116 y 6 316 262.

El ácido levulínico es un ácido 4-ceto-pentanoico obtenible por hidrólisis ácida de azúcares de 6 carbonos, que pueden ser derivados a partir de residuos renovables procedentes de flujos residuales que contienen carbohidratos (Bozell et al. 2000). Co-polímeros de [P(3HB-co-3HV)] han sido producidos microbianamente (Alcaligenes sp. SH-69) a partir de glucosa y ácido levulínico, mostrando este co-sustrato de ácido orgánico un efecto estimulante significativo tanto en el crecimiento celular como en la acumulación de co-polímeros (Jang y Rogers 1996). Jang y Rogers (1996) informan que el ácido levulínico es un sustrato de bajo coste que se compara favorablemente con los ácidos propiónicos, valéricos o pentanoicos como un co-sustrato para la producción de PHAs. Steinbuchel et al. (1998) describen la producción y caracterización de poliésteres que contienen ácido 4-hidroxivalérico y ácidos hidroxialcanoicos de cadena media a partir del ácido octanoico como fuente principal de carbono y el ácido levulínico como co-sustrato.

Chung et al. (2001) proponen adiciones repetidas de cantidades iguales de ácido levulínico como fuente secundaria de carbono a un medio que contiene Ralstonia eutropha y glucosa, sacarosa o sorbitol como fuente primaria de carbono. De esta manera, la concentración del ácido levulínico podía ser mantenida a niveles bajos en comparación con experimentos en los cuales el ácido levulínico fue añadido una sola vez al comienzo del cultivo celular, reduciéndose así sus efectos tóxicos e inhibitorios sobre el crecimiento celular. Sin embargo, mientras que aumentan la masa celular total y la producción total de copoliésteres de [P(3HB-co-3HV)], el mol% final de 3HV en los copoliésteres es reducido significativamente.

Resumen de la invención

La invención comprende la utilización de xilosa como una fuente de carbono primaria, y ácido levulínico como una fuente de carbono secundaria, o co-sustrato, para la fermentación microbiana utilizando Burkholderia cepacia como microorganismo capaz de convertir carbono en co-polímeros de PHA que comprenden monómeros de 3-OH-valerilo (3-HV) y 3-OH-butirilo (3-HB). De acuerdo con la invención, el mol% de 3HV es incrementado añadiendo al medio una segunda cantidad de ácido levulínico entre aproximadamente 16 horas y aproximadamente 24 horas después de que se haya añadido la primera cantidad de ácido levulínico, siendo la segunda cantidad de ácido levulínico mayor que la primera cantidad de ácido levulínico.

En otro aspecto de la invención, las cantidades relativas de hidroxivalerato (HV) e hidroxibutirato (HB) contenidas en el PHA son moduladas ajustando la relación de xilosa al cosustrato que es el ácido levulínico.

En otro aspecto de la invención, se emplean formas oxidadas, o derivatizadas de otra manera, de xilosa, ácido levulínico, o ambos, para producir polímeros con monómeros similarmente derivatizados.

Descripción detallada de la invención

Una de las mayores limitaciones a la comercialización de los PHA como reemplazo de los polímeros a base de petróleo sigue siendo el coste relativamente alto de su producción. Por este motivo, muchos esfuerzos han sido dirigidos hacia el desarrollo de cepas de mayor productividad y hacia fermentaciones más eficientes. Hemos utilizado xilosa y oligomeros de xilosa, derivados del componente de xilano, hidrolizado a ácido, de biomasa forestal, generado por la industria papelera, como la fuente de carbono primaria. En la actualidad, la mayor parte de esta fuente de carbono eminentemente fermentable o es descargado al medio ambiente o quemado para generar calor dentro de la planta. La biomasa del sauce es una fuente útil de xilanos porque crece rápidamente y porque el proceso de pulpación o deslignificación produce cantidades relativamente grandes de celulosa y xilano residual.

En la práctica de la presente invención, la relación del co-sustrato, que es el ácido levulínico, al sustrato primario, que es la xilosa, permite el control de la composición 3HB/3HV del co-polímero. La relación de valerato/butirato en el polímero de [P(3HB-co-3HV)] tiene una influencia de importancia industrial sobre sus propiedades físicas y mecánicas, incluyendo las temperaturas de fusión y de transición vítrea, la resistencia a la tracción, elasticidad, el módulo de flexión y el perfil de descomposicion (Doi 1990). El método que se describe en el presente documento produce un co-polimero de [P(3HB-co-3HV)] de composición regulada, utilizando preferentemente flujos residuales hemicelulósicos como la fuente de carbono principal y formulaciones apropiadas de ácido levulínico, que también son derivadas preferentemente de materias primas renovables de bajo coste. Experimentos preliminares, en los que se utilizó ácido levulínico, indican una utilización microbiana selectiva de este co-sustrato en la producción de co-polímeros de [P(3H3-co-3HV)], según es evidenciado por el incremento progresivo en la fracción de ácido 4-hidroxivalérico, regulado por adiciones definidas de co-sustrato. Véase el Ejemplo 2, que sigue más adelante.

La presente invención permite también la producción de polímeros con propiedades ventajosas, p. ej. relaciones HV:HB controladas y mejoradas, mayor viscosidad, indicando un peso molecular más alto/mayor longitud media de cadena, etc.

En la práctica de la invención, microorganismos del tipo Burkholderia cepacia son cultivados de acuerdo a técnicas estándar. Similarmente, los PHA producidos de esta manera pueden ser cosechados utilizando técnicas estándar. Véase, p. ej., Horowitz et al., U.S. 5 871 980.

El proceso propuesto puede ser utilizado también para producir homopolímeros, co-polímeros, terpolímeros etc. de PHA derivatizados, p. ej., seleccionando microorganismos fermentadores provistos de la maquinaria metabólica necesaria para la utilización de los sustratos apropiados precursores de PHA. Esto puede conseguirse ingenierizando mediante la ingeniería genética de microorganismos de tal modo que expresen genes metabólicos requeridos, o mediante el tratamiento enzimático pre-fermentativo de sustratos de PHA para la producción de polímeros novedosos con estructuras únicas de cadena principal y cadenas laterales. Los polímeros resultantes muestran propiedades físicas, químicas y mecánicas únicas, con relación a sus composiciones monoméricas y estructuras cristalinas. Según hemos mencionado anteriormente, se conocen métodos para la ingeniería genética de microorganismos productores de PHAs. Técnicas para el tratamiento pre-fermentativo de sustratos también son conocidas por el estado de la técnica. Por ejemplo, la xilosa puede ser utilizada en una fermentación de PHA en combinación con una versión oxidada/derivatizada de ácido levulínico u otro producto relacionado de condensación de ácido levulínico.

Las funcionalidades provistas de hidroxilo de los monómeros de 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato no polimerizados son sustratos potencialmente oxidables que podrían ser condensados con otras porciones para producir monómeros derivatizados y, por ende, estructuras de red cristalina drásticamente diferentes en los polímeros de PHA resultantes (cambio de propiedades físicas, químicas y mecánicas).

Las reacciones de oxidación o derivatización serían catalizadas por una enzima seleccionada antes de la adición al medio de fermentación. Típicamente, la oxidación o condensación (p ej. para formar otra molécula que ofrece rasgos estructurales únicos) ocurriría en la posición 3-OH. El ácido levulínico derivatizado sería añadido a la fermentación de PHA como el co-sustrato con xilosa, para ser, a continuación, reconocido por enzimas suministradoras de monómeros y enzimas de PHA polimerasa nativas o recombinantes y sometido a la acción de las mismas. Por ejemplo, la oxidación en la posición 3-hidroxi del precursor de PHA, 3-OH-valeril-CoA, puede producir monómeros únicos que serían reconocidos por la PHA sintasa/polimerasa de la cepa huésped e incorporados en las crecientes cadenas de PHA. Formas derivatizadas de xilosa pueden ser utilizadas de igual manera para preparar monómeros diferentes. Por ello, esta invención, en algunas realizaciones, abarca la utilización de ácido levulínico, xilosa, o ambos, oxidados o derivatizados de otra forma. Tales fuentes de carbono derivatizadas serían preparadas típicamente fuera de la fermentación y añadidas al medio de fermentación, aunque las técnicas de ingeniería genética permitirían introducir en el microorganismo fermentador genes necesarios para derivatizar la fuente de carbono biológicamente e in situ.

El proceso propuesto puede ser utilizado también para producir PHAs con monómeros de 4-HV. Steinbuchel et al. (1998) demostraron la producción de poliésteres de PHA compuestos por 3-HB, 3-HV, 4-HV, y monómeros de hidroxialcanoato de longitud de cadena media (hexanoato y octanoato), utilizando una cepa recombinante de Pseudomonas putida. La fermentación controlada utilizó ácido octanoico y levulínico como fuentes de carbono. Este estudio utilizó deliberadamente ácido levulínico como precursor de 4-HV, porque el ácido 4-hidroxivalérico no es comercialmente disponible. En los Ejemplos descritos más adelante en este documento, el ácido levulínico fue el precursor de los monómeros de 3-HV. Sin embargo, mediante la selección correcta del microorganismo fermentador, p. ej., por ingeniería genética, o mediante la selección apropiada de las condiciones de fermentación, la invención puede ser utilizada para producir polímeros que comprenden monómeros de 4-HV mediante la utilización de xilosa y ácido levulínico como fuentes de carbono.

Si al medio de fermentación se añaden sustratos de acido graso más largos que el ácido levulínico, pueden producirse polímeros que comprenden monómeros de PHA de longitud de cadena media (MCL-PHA) además de los monómeros de 3-HV y 3-HB. Tales monómeros de MCL-PHA incluyen, por ejemplo, 3-hidroxihexanoato (3-HHx) y 3-hidroxioctanoato (3-HO) Los ácidos grasos que son incluidos como fuentes de carbono adicionales incluyen, p. ej., ácido dodecanoico, ácido decanoico y ácido octanoico, así como ácidos grasos de cadena más larga tales como ácido oleico u oleato o aceite de palma. La inclusión de semejantes fuentes de carbono adicionales pueden resultar en polímeros novedosos con propiedades físicas/mecánicas más deseables (p. ej. puntos de fusión más bajos, mayor flexibilidad, mayor porcentaje de alargamiento a la rotura, etc.).

Las cadenas laterales alquílicas de los monómeros de PHA están generalmente saturadas, aunque en la literatura se han descrito también funcionalidades aromáticas, insaturadas, halogenadas y ramificadas.

En una producción de PHA típica, se cultivan microorganismos tipo Burkholderia cepacia en un medio que utiliza xilosa y ácido levulínico como fuente de carbono principal y co-sustrato de ácido orgánico, respectivamente. Alícuotas esterilizadas de estos sustratos son añadidas a un medio definido de sales minerales, seguido por la inoculación. Típicamente, la xilosa es añadida en una cantidad de hasta aprox. un 4% peso/volumen de concentración en el caldo final, p. ej. de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0% peso/volumen. Tratándose de xilosa granulada, ésta es disuelta en agua destilada, autoclavada y añadida como dosis única inmediatamente antes de la inoculación. Parece que la concentración del 2-3% peso/volumen de xilosa origina densidades celulares y una producción de PHA bastante elevadas, siendo la concentración de ácido levulínico variada a fin de modular la fracción de hidroxivalerato del copolímero.

Dependiendo de la fuente de biomasa leñosa y del procedimiento/condiciones hidrolíticas, la concentración de xilosa estimada en el hidrolizado de xilano detoxificado final varía típicamente entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 2,5% peso/volumen. Adicionalmente, el esquema de dosificación y administración variará cuando el esquema de producción de PHA es convertido en un cultivo a base de fermentador, en el que la xilosa y el ácido levulínico pueden ser añadidos periódicamente a lo largo de toda la fermentación. Este tipo de fermentación también puede dividirse en dos etapas, la primera de las cuales proporciona condiciones de crecimiento balanceadas y concentaciones de sustrato relativamente altas a fin de maximizar las densidades celulares. A continuación, estas células son transferidas a un medio de crecimiento de nitrógeno limitado/no balanceado para la producción de un producto polimérico de PHA:

De acuerdo con la presente invención, la xilosa es preferentemente derivada de biomasa leñosa. La biomasa leñosa, p. ej. la biomasa forestal, comprende tres fracciones fácilmente separables: una fracción de lignina, una fracción celulósica y una fracción hemicelulósica. La fracción enriquecida en hemicelulosa comprende xilanos de los cuales se puede derivar la xilosa. Las fracciones hemicelulósicas de biomasas leñosas pueden contener sustancias inhibidoras del crecimiento microbiano, las cuales son preferentemente eliminadas antes de utilizar la xilosa obtenida a partir de las mismas. Por ello, se revela un proceso para detoxificar xilanos, haciendo de este modo una composición que comprende la fracción hemicelulósica de biomasa leñosa apropiada para la utilización como fuente de carbono para la fermentación. Este proceso comprende extraer solventes volátiles de una fracción enriquecida en hemicelulosa de una biomasa leñosa, preferentemente mediante destilación bajo vacío, aunque también pueden utilizarse otros métodos, p. ej., la extracción con utilización de otros solventes orgánicos tales como, p. ej., éter dietílico. A continuación, el proceso preferentemente comprende ajustar el pH del destilado a encima de neutro, p. ej., aproximadamente 8 a aproximadamente 12, preferentemente alrededor de 10, y mantener el pH alto durante varios minutos a varias horas, p. ej., durante al menos 30 minutos aproximadamente, preferentemente durante 1 hora aproximadamente, para extraer solventes volátiles; ajustar el pH a debajo de neutro, p. ej., aproximadamente 6 a aproximadamente 2, preferentemente alrededor de 5 a alrededor 6, p. ej. con un ácido orgánico tal como el ácido sulfúrico; contactar la preparación acidificada con un tamiz por acción molecular, p. ej. carbón activado, durante varios minutos a varias horas, p. ej., durante al menos 30 minutos aproximadamente, preferentemente durante 1 hora aproximadamente; y ajustar a continuación el pH a aproximadamente 7; extraer calcio, p. ej., mediante precipitación con fosfato de potasio. Opcionalmente, esta preparación es esterilizada por filtración antes de la inoculación. Además, la composición es opcionalmente suplementada con suplementos nutricionales para mejorar el crecimento microbiano, p. ej., con sales, oligoelementos y vitaminas, p. ej., antes de la esterilización por filtración.

Típicamente, tal procedimiento es como sigue:

1. Reducir una fracción hemicelulósica de una biomasa leñosa a la mitad de su volumen, utilizando un evaporador instantáneo.

2. Reemplazo de volumen con agua y volver a evaporar con evaporador instantáneo a la mitad del volumen, pero sin reemplazar esta vez el volumen.

3. Filtración por papel filtrante & embudo Büchner.

4. Tratar con hidróxido de calcio hasta pH 10 y mantener durante 1 hora.

5. Volver a filtrar como en el punto n.º 3

6. Ajustar el pH a 5,5 utilizando ácido sulfúrico/añadiendo sulfito sódico (1 g/L).

7. Tratar con carbón activado durante 1 hora, después volver a filtrar como en el punto n.º 3

8. Controlar de nuevo el pH; ajustar a 7.

9. Añadir fosfato de potasio (monobásico) hasta que cese la precipitación y/o la formación de una suspensión (para eliminar el calcio):

10. Filtración para extraer el fosfato de calcio.

11. Añadir sales, oligoelementos y vitaminas según se necesiten para el crecimiento microbiano.

12. Esterilización filtro. En este punto, el hidrolizado es típicamente un líquido claro y ligeramente amarillo y está listo para la inoculación.

Varios métodos pueden utilizarse para preparar el material de partida cargado de xilano, es decir, la fracción, enriquecida en hemicelulosa, de biomasa leñosa. Un proceso ilustrativo es el protocolo desarrollado por el Laboratorio Nacional de Investigación de Energía Renovable (National Renewable Energy Research Laboratory; Golden/Colorado), que es un procedimiento conocido como Clean Fractionation (CF) Process, o proceso NREL CF. Este proceso es revelado en el documento U.S. 5 730 837. La fracción hemicelulósica producida en este proceso es rica en azúcares de cinco carbonos (principalmente xilosa) y es denominado por ello "flujo de C5" ("C5 stream"). Descrito brevemente, el procedimiento incluye el tratamiento de una biomasa leñosa con solventes orgánicos (es decir, metilisobutilcetona (MIBK) y etanol (EtOH), un ácido, p. ej. ácido sulfúrico, y agua para la separación selectiva de los tres componentes principales de la biomasa leñosa: lignina, celulosa y hemicelulosa. El flujo hemicelulósico es una solución acuosa diluida que contiene MIKB y EtOH en concentraciones inhibidoras del crecimiento, para las cuales los pasos de destilación/eliminación (n.º 2 y n.º 3, véase arriba) son incluidos en el procedimiento de hidrólisis-detoxificacion arriba descrito.

En un segundo método ilustrativo, virutas de madera procedentes de una variedad de especies de árboles son tratadas a altas temperaturas (140-180ºC) y a altas presiones en cámaras de acero inoxidable, utilizándose agua como solvente extractor. En este proceso, la estructura de lignina es parcialmente degradada, permitiendo un grado relativamente alto de extracción hemicelulósica a la fase acuosa. Las virutas de madera de color restantes son guardadas para otras aplicaciones celulósicas y el hidrolizado de xilano de color marrón fangoso es detoxificado, p. ej. por hidrólisis ácida, según queda descrito más arriba, para la subsiguiente fermentación de PHA. Los pasos de destilacion (n.º 2 y n.º 3, véase arriba) no son necesarios para este hidrolizado a base de agua, aunque el residuo del procedimiento de detoxificación es útil.

El ácido levulínico puede conseguirse, por ejemplo, de la Biofine Corporation (Glens Falls, New York) como una sustancia cristalina refinada. El proceso Biofine es básicamente una hidrólisis ácida realizada en dos pasos con azúcares de 6 carbonos, que resulta en la producción, eficiente respecto al coste, de ácido levulínico con una productividad relativamente alta. Este proceso es descrito en un artículo publicado por Bozell et al. (2000). Descrito brevemente, materiales que contienen carbohidratos son hidrolizados en un primer reactor a 210-230ºC en presencia de 1-5% de acido mineral. El hidroximetilfurfural producido en esta hidrólisis inicial es extraído y continuamente suministrado a un segundo reactor para una hidrólisis adicional a 195-215ºC para producir ácido levulínico. El rendimiento de ácido levulínico es del orden del 60% o superior.

Generalmente, el ácido levulínico es añadido al medio de fermentación de PHA primero como una dosis inicial baja (aproximadamente 0,07% peso/volumen) conjuntamente con la xilosa. A continuación, después de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas, cuando se estima que comienza la formación de polímeros de PHA (la densidad óptica a 540 nm, que indica la densidad celular, en este punto es generalmente de 0,3 a 0,5 utilizando B. Cepacia en una fermentación de PHA con xilosa/ácido levulínico), se añade una segunda dosis de ácido levulínico, siendo la segunda cantidad de ácido levulínico mayor que la primera cantidad para incrementar el mol% de 3HV en el PHA resultante. El aspecto importante respecto a la añadidura de ácido levulínico en este momento es que la producción de PHA está a punto de empezar, ya que la concentración de nitrógeno en el frasco de agitación ha disminuido a niveles insuficientes para un crecimiento óptimo y por ello favorecedores de la acumulación de PHA. Utilizando este procedimiento de fermentación en frasco agitado, la formación del homopolímero de poli(hidroxibutirato) es minimizada y la producción del copolímero deseado de [P(3HB-co-3HV)] con un mol% de 3HV alto es fomentada. El ácido levulínico es añadido en varias concentraciones en la segunda dosis (es decir, generalmente en concentraciones que llegan hasta el 0,8% peso/volumen), dependiendo de la fracción molar de hidroxivalerato deseada en el copolímero de P(3HB-co-3HV).

Según lo revelado más arriba, el ácido levulínico es añadido típicamente como una dosis inicial del 0,07% peso/volumen. Para preparar PHAs con cantidades crecientes de monómero de 3-HV, el ácido es añadido a continuación en segundas dosis progresivamente crecientes (generalmente 0,1 a 0,8% peso/volumen) aproximadamente 20 horas post-inoculación, dependiendo de la fracción molar deseada de HV en el PHA resultante. Asumiendo el 2,2% peso/volumen de xilosa, la relación de ácido levulínico a xilosa en el medio de fermentación final llegará por ello hasta 0,4, es decir, 0,87/2,2 (segunda dosis de ácido levulínico del 0,8% peso/volumen). El ácido levulínico es conocido como un inhibidor de la biosíntesis de tetrapirrol y puede ejercer efectos inhibidores de PHA y de crecimiento al ser administradro en concentraciones lo suficientemente altas. Por este motivo, la concentración de ácido levulínico añadida a los cultivos es a menudo limitada a fin de obtener cantidades del producto de PHA suficientes para el aislamiento y la caracterización.

Después de cultivar los microorganismos durante un período de hasta una semana aproximadamente, el PHA es coleccionado, p. ej. liofilizando las células coleccionadas del caldo de cultivo, triturando las células desecadas, suspendiendo las células trituradas en un solvente orgánico, y precipitando a continuación el PHA, p. ej. con etanol. El precipitado puede ser filtrado y reprecipitado para mejorar la pureza antes del secado final.

Los cultivos de frasco agitado cargados de PHA son generalmente cosechados por centrifugación tras aproximadamente 65 a aproximadamente 75 horas post-inoculación (asumiendo una fermentación de xilosa y ácido levulínico a base de B. cepacia). Con cultivos en frasco agitado de B. cepacia, el OD540 del caldo (densidad óptica a 540 nm) varía entre 2,5 y 3,5 en este momento. El objetivo de optimizar el tiempo de cosecha es el de maximizar el rendimiento de producción en términos de porcentaje de biomasa seca ocupada por los polímeros de PHA. Si se permite que la fermentación continúe durante un período más largo que este periódo de tiempo óptimo, entonces los microorganismos empezarán a metabolizar el polímero como una reserva de carbono y energía (es decir, cuando las fuentes exógenas de carbono disponibles en el medio de fermentación han sido agotadas). Por ello, el tiempo óptimo para la cosecha de células/polímero variará dependiendo del organismo fermentador y el método de fermentación (frasco agitado o fermentador).

El análisis composicional y la caracterización de los polímeros de PHA pueden conseguirse mediante espectroscopia de ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN en soluciones, al objeto de cuantificar la relación molar de HV/HB para varias cantidades y relaciones de xilosa y ácido levulínico y de otra manera para optimizar las condiciones de fermentación.

Ejemplos Ejemplo 1

Microorganismo y condiciones de fermentación. Experimentos en frasco agitado empleando Burkholderia cepacia (denominada anteriormente Pseudomonas cepacia) ATCC 17759 se realizaron utilizando 585 ml de cultivos compuestos de: 500 ml de solución de sales minerales/oligoelementos definida, limitada en nitrógeno, según queda descrito por Bertrand et al. (1990), 33 ml de solución de xilosa concentrada (de materia prima del 36% peso/volumen, concentración de 2,2% peso/volumen en el caldo final), 2 ml de solución de ácido levulínico (de solución de partida de 42% peso/volumen en agua destilada, con pH ajustado a 7,2 con NaOH, concentración de 0,07% peso/volumen en el caldo final), y 50 ml de inóculo de cultivo de gérmenes. El nitrógeno fue limitado aún más reduciendo la concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} a 1,5 g/L. Los cultivos de gérmenes preinóculo para todos los experimentos fueron preparados en frascos Fernbach de 2800 ml, con contenido de 0,8% peso/volumen caldo nutritivo o 2,2% peso/volumen de xilosa y 0,07% peso/volumen de ácido levulínico, e incubados a 28ºC y 150 rpm durante 72 horas. Los cultivos de producción de PHA fueron incubados a 28ºC y 150 rpm durante 20 horas (OD_{540}: 0,3 a 0,5), añadiéndose tras este tiempo a los cultivos apropiados segundas dosis de la solución de ácido levulínico arriba descrita. Los frascos de agitación fueron incubados durante otras 48 a 50 horas y cosechados (OD_{540}: 2,5 a 3,0) para la extracción de biomasa y PHA.

Preparación de biomasa y muestras de PHA. Los cultivos de caldo se a partir de los frascos de agitación por centrifugación en botellas Nalgene a 10.000 rpm durante 10 minutos. A continuación, los pellets celulares húmedos fueron lavados en 100 ml de H_{2}Od (agua destilada), sometidos a una segunda centrifugación y transferidos a botellas de vidrio de 200 ml de capacidad para su liofilización (-50ºC, presión de vacío de 0,05 mmHg, 12 a 18 horas). Los pellets celulares secados fueron pesados, molidos a polvo, suspendidos en cloroformo (es decir, 0,1 g de polvo celular liofilizado/ml), e incubados en recipientes de vidrio de 150 ml de capacidad a 60ºC durante 24 horas. El co-polímero de [P(3HB-co-3HV)] fue precipitado de las soluciones viscosas de cloroformo por mezcla de proporción 1:10 con EtOH 95% y a continuación filtrado usando papel-filtro Whatman Nº 1, de 9 cm. Las tortas blancas y secadas de co-polímero de [P(3HB-co-3HV)] fueron resolubilizadas en cloroformo para la extracción secundaria y terciaria de residuo, antes de ser coladas, una vez disueltas en el solvente, en platillos de Petri de vidrio Pyrex de 10 cm para la preparación de muestras de película. El solvente de cloroformo residual fue eliminado de las muestras de película de copolímero de [P(3HB-co-3HV)] mediante secado con horno de vacío a 70ºC y 20 pulgadas Hg de presión de vacío durante 24 horas. Las películas examinadas fueron disueltas y coladas para formar películas a los 60-100 días de su producción inicial y hechas envejecer a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 días antes de su caracterización
física/térmica.

Ejemplo 2

B. cepacia ATCC 17759 fue cultivada esencialmente según se describe en el Ejemplo 1 con la excepción de que se suministró nuevamente ácido levulínico a las 20 horas y la cantidad de ácido levulínico en el nuevo suministro fue variada en diferentes lotes. Específicamente, el ácido levulínico fue añadido a todos los cultivos inicialmente como una dosis de 7% peso/volumen y después como dosis progresivamente crecientes (generalmente 0,1 a 0,6% peso/volumen) a las 20 horas post-inoculación. Por consiguiente, la relación de ácido levulínico a xilosa en el medio de fermentación final varió desde 0,03, es decir 2,2:0,07 (sin segunda dosis de ácido levulínico), hasta 0,3, es decir 2,2:0,67 (segunda dosis de ácido levulínico de 0,6% peso/volumen).

La caracterización composicional de estas muestras de PHA por medio de estudios de ^{13}C RMN, ^{1}H RMN (300 MHz) y de difracción de rayos X ha comprobado que las películas hechas por dilución y colada (solvent casting) son co-polímeros compuestos por 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato (P(3HB-co-3HV). La tabla que se presenta a continuación muestra los efectos que las diferentes cantidades de ácido levulínico en el segundo suministro tienen sobre la cantidad relativa de 3HV contenida en el co-polímero final de P(3HB-co-3HV). La cantidad de ácido levulínico en el segundo suministro no tuvo ningún efecto sustancial sobre la biomasa total recogida o la producción de
co-polímero.

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Claims

1. Proceso para producir co-polímero de polihidroxialcanoatos (PHA) comprendiendo monómeros de 3-OH-valerilo (3-HV) y 3-OH-butirilo (3-HB), comprendiendo el proceso lo siguiente:

Añadir a un medio que contiene Burkholderia cepacia una cantidad de xilosa como fuente de carbono primaria y una primera cantidad de ácido levulínico como fuente de carbono secundaria;

Añadir una segunda cantidad de ácido levulínico al medio entre aproximadamente 16 horas y aproximadamente 24 horas después de que se haya añadido la primera cantidad de ácido levulínico,

En el que la segunda cantidad de ácido levulínico es mayor que la primera cantidad de ácido levulínico.

2. Proceso según la reivindicación 1, en el que la segunda cantidad de ácido levulínico es añadida aproximadamente 20 horas después de que se haya añadido la primera cantidad de ácido levulínico.

3. Proceso según la reivindicación 1, en el que la primera cantidad de ácido levulínico es de aproximadamente 0,07% peso/volumen y la segunda cantidad de ácido levulínico es de aproximadamente 0,1 a 0,8% peso/volumen.

4. Proceso según la reivindicación 1, en el que la xilosa es derivada de los xilanos presentes en la hemicelulosa.

5. Proceso según la reivindicación 4, en el que la hemicelulosa es derivada de biomasa forestal.

6. Proceso según la reivindicación 4, en el que ácido levulínico es derivado de residuos orgánicos.

7. Proceso según la reivindicación 5, en el que el ácido levulínico es derivado de biomasa forestal.

8. Proceso según la reivindicación 1, en el que la relación de HV a HB es modulada ajustando la relación de xilosa a ácido levulínico.

9. Proceso según la reivindicación 1, en el que la relación de xilosa a ácido levulínico en el medio de fermentación después de que se hayan añadido las cantidades adicionales de ácido levulínico varía entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,0.

10. Proceso según la reivindicación 1, en el que la xilosa es oxidada o derivatizada de otra manera anterior o posteriormente a la añadidura al medio de cultivo.

11. Proceso según la reivindicación 1, en el que el ácido levulínico es oxidado o derivatizado de otra manera anterior o posteriormente a la añadidura al medio de cultivo.