ES2316882T3 - Enzimas de aspergillus aculeatus con una actividad xilanasa. - Google Patents

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Stephan Christgau
Lene Nonboe Andersen
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Abstract

Enzima que presenta actividad xilanasa, dicha enzima es codificada por una secuencia de ADN: a) comprendida en o comprendiendo la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1, o b) una secuencia de codificación de un polipéptido que presenta una actividad xilanasa que es al menos idéntica a 70% sobre toda la longitud a una xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1.

Description

Enzimas de Aspergillus aculeatus con una actividad xilanasa.
Campo de invención
La presente invención se refiere a una enzima con actividad xilanasa, un método para producir la enzima, una preparación de enzima comprendiendo la enzima, y un uso de la enzima para varios propósitos industriales.
Antecedentes de la invención
El xilano, un componente principal de hemicelulosa vegetal, es un polímero de D-xilosa enlazado por enlaces beta-1,4-xilosídicos. El xilano puede ser degradado en xilosa y xilo-oligómeros por hidrólisis con ácido o enzimática. La hidrólisis enzimática de xilano produce azúcares libres sin los subproductos formados con el ácido (por ejemplo furanos).
Unas enzimas capaces de degradar el xilano y otros polisacáridos de la pared celular vegetal son importantes para la industria alimentaria, esencialmente para la industria panadera y para el tratamiento de frutas y verduras tal como la producción de zumo de frutas o la elaboración de vinos, donde se utiliza su capacidad para catalizar la degradación del esqueleto o cadenas laterales del polisacárido de pared celular vegetal (Visser et al., Xylans and Xylanases, 1991).
Otras aplicaciones para las xilanasas son la disgregación enzimática de residuos agrícolas para la producción de combustibles alcohólicos, el tratamiento enzimático de alimentos para animales para una hidrólisis de pentosanas, la fabricación de pulpas disolventes para la producción de celulosa, y el bioblanqueo de la pulpa de madera [Detroym R.W. en: Organic Chemicals from Biomass, (CRC Press, Boca Raton, FL, 1981) 19-41.; Paice, M.G., and L. Jurasek., J. Wood Chem. Technol. 4: 187-198.; Pommier, J.C., J. L. Fuentes, G. Goma., Tappi Journal (1989): 187-191.; Senior, D. J., et al., Biotechnol. Letters 10 (1988):907-912].
WO 92/17573 expone una xilanasa esencialmente pura derivada de las especies fúngicas H. insolens y de ADN recombinante de codificación de dicha xilanasa. La xilanasa es útil como levadura artificial, aditivo alimentario, y en la preparación de papel y pulpa.
WO 92/01793 expone una xilanasa derivada de las especies fúngicas Aspergillus tubigensis. Se ha mencionado, pero no se ha demostrado que las xilanasas relacionadas pueden derivar de otros hongos filamentosos, cuyos ejemplos son Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium y Trichoderma. Las xilanasas son útiles en la preparación de pan o de alimentos para animales, la elaboración de cerveza y la reducción de la viscosidad o para la mejora de la filtrabilidad del almidón de cereal.
Shei et al., 1985, y Fournier et al., 1985 describen una purificación y caracterización de endoxilanasas aisladas de A. Niger.
WO 91/19782 y EP 463 706 exponen una xilanasa derivada de origen Aspergillus niger y la producción recombinante de la misma. La xilanasa es útil en la industria de panadería, la elaboración de cerveza, la industria de fabricación de papel, y el tratamiento de residuos agrícolas, etc.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención consiste en preparar xilanasas de un solo componente.
La enzima según la invención exhibiendo actividad xilanasa es codificada por una secuencia de ADN
a)
comprendida en o comprendiendo la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1; o
b)
una secuencia de codificación de un polipéptido con una actividad xilanasa siendo al menos idéntica en un 70% sobre la longitud total a una xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1.
En una forma de realización, la invención se refiere a una enzima exhibiendo una actividad xilanasa, dicha enzima es codificada por una secuencia de ADN comprendiendo la secuencia parcial siguiente
1
o una secuencia que es idéntica en un 70% a ésta sobre la longitud total de codificación de un polipéptido con una actividad xilanasa.
El término "homólogo" está destinado a indicar un polipéptido codificado por ADN que se hibridiza en la misma sonda que el ADN codificante para la enzima xilanasa en ciertas condiciones específicas (tales como un prerremojo en 5xSSC y una prehibridación durante 1 h a \sim40ºC en una solución de 5xSSC, solución de Denhardt 5x, 50 mM de fosfato sódico, pH 6.8, y 50 \mug de ADN de timo de ternero ultrasonicado desnaturalizado, seguido de una hibridación en la misma solución donde se ha añadido una sonda marcada con 32 P-dCTP de 50 \muCi durante 18 h a \sim40ºC seguido de un lavado tres veces en 2xSSC, 0,2% de SDS a 40ºC durante 30 minutos). Más específicamente, el término se refiere a una secuencia de ADN que es idéntica al menos en un 70% sobre longitud total a la xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1, tal como al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o incluso idéntica al menos en un 95% sobre longitud total a la xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1. El término está previsto para incluir modificaciones de cualquiera de las secuencias de ADN mostradas arriba, tales como sustituciones de nucleótido que no producen otra secuencia de aminoácidos de la xilanasa, pero que corresponden al uso de un codón del organismo huésped en el que el constructo de ADN está introducido o sustituciones de nucleótido que no producen una secuencia diferente de aminoácidos y por consiguiente, posiblemente, una estructura de proteína diferente que pueda producir una xilanasa mutante con propiedades diferentes a las de la enzima nativa. Otros ejemplos de modificaciones posibles son la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cada extremo de secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cada extremo o al interior de la secuencia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una preparación enzimática útil para la degradación de componentes de la pared celular vegetal, dicha preparación siendo enriquecida con una enzima exhibiendo una actividad xilanasa como se ha descrito anteriormente.
En los aspectos finales, la invención se refiere al uso de una enzima o preparación enzimática de la invención para varias aplicaciones industriales.
Descripción detallada de la invención
En una forma de realización preferida la enzima de la invención comprende o está comprendida en la secuencia de aminoácidos aparente de la SEC ID Nº: 2, o una secuencia análoga de la misma. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 ha sido deducida a partir de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº. 1, de codificación de xilanasa I tal como se ha definido anteriormente.
En el presente contexto, el término "secuencia análoga" está destinado a indicar una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEC ID Nº. 2 por uno o más residuos de aminoácidos. La secuencia análoga puede ser una secuencia obtenida por modificación de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2, por ejemplo implicando una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos, una deleción de uno o más residuos de aminoácidos en cada uno de o ambos extremos de la enzima o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, o una inserción de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos puede ser realizada adecuadamente por medio de una modificación de la secuencia de ADN de codificación de la enzima, por ejemplo por mutagénesis dirigida o aleatoria o por una combinación de estas técnicas de acuerdo con procedimientos bien conocidos. De forma alternativa, la secuencia análoga puede ser una de una enzima derivada de otro origen que la xilanasa correspondiente a la SEC ID Nº 2. La secuencia análoga exhibirá generalmente un grado de homología (en términos de identidad) de al menos 70%, tal como al menos 75%, 80%, 85%, 90% o incluso 95% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2.
La enzima de la invención puede ser aislada por un método general consistiendo en
-
\vtcortauna clonación, en vectores adecuados, de una biblioteca de ADN de Aspergillus aculeatus,
-
\vtcortauna transformación de células huéspedes de levadura adecuadas con dichos vectores,
-
\vtcortauna cultivo de las células huéspedes en condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificada por un clon en la biblioteca de ADN, y
-
\vtcortauna selección de clones positivos por determinación de cualquier actividad xilanasa de la enzima producida por tales clones.
Una descripción más detallada de este método de selección está provista en el ejemplo 1 más abajo.
La secuencia de ADN que codifica para la enzima puede ser aislada por ejemplo mediante una selección de una biblioteca de ADNc de Aspergillus aculeatus, por ejemplo cepa CBS 101.43, disponible al público por el Centraalbureau voor Schimmelcultures, Delft, NL, y una selección de clones expresando la actividad enzimática apropiada (es decir, actividad xilanasa tal como está definido por la capacidad de la enzima para hidrolizar enlaces glicosídicos en xilano). La secuencia de ADN apropiada puede ser aislada después del clon mediante unos procedimientos estándar, por ejemplo tal y como está descrito en el ejemplo 1. Se espera que una secuencia de ADN que codifica para una enzima homóloga pueda ser derivada de forma similar mediante una selección de una biblioteca de ADNc de otro microorganismo, en particular un hongo, tal como una cepa de otra especie Aspergillus, en particular una cepa de
A. aculeatus o A. Niger, una cepa de especie Trichoderma, en particular una cepa de T. harzianum, o T. reesie, una cepa de especie Fusarium, en particular una cepa de F. oxysporum, o una cepa de especie Humicola o una cepa de especie Scytallidium.
De manera alternativa, el ADN que codifica para una xilanasa de la invención puede, conformemente a unos procedimientos bien conocidos, ser aislado convenientemente del ADN de cualquiera de los organismos mencionados anteriormente mediante el uso de sondas oligonucleótidas sintéticas preparadas en base a una secuencia de ADN o de aminoácidos descrita aquí.
La secuencia de ADN puede ser insertada posteriormente en un vector de expresión recombinante. Éste puede ser cualquier vector que puede estar expuesto convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la selección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se tiene que introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de célula huésped y se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado.
En el vector, la secuencia de ADN que codifica la xilanasa debería ser conectado operativamente a un promotor adecuado y a una secuencia de terminador. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre una actividad transcripcional en la célula huésped seleccionada y puede derivar de genes que codifican proteínas, sean homólogos o bien heterólogos a la célula huésped. Los procedimientos usados para enlazar las secuencias de ADN que codifica para la xilanasa, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlas dentro de vectores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, en referencia a Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
La célula huésped que está transformada con la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención es preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula fúngica tal como una levadura o célula fúngica filamentosa. En particular, la célula puede pertenecer a unas especies Aspergillus, más preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso incluyendo la formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped está descrito en EP 238 023 (de Novo Nordisk NS), cuyos contenidos están incorporados en la presente como referencia. La célula huésped también puede ser una célula de levadura, por ejemplo una cepa de Saccharomyces cerevisiae, en particular de Saccharomyces cerevisiae.
En un aspecto ulterior, la presente invención se refiere a un método de producción de una enzima según la invención, donde una célula huésped adecuada transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima es cultivada bajo unas condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es recuperada del cultivo.
El medio empleado para cultivar las células huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células huéspedes en cuestión. La xilanasa expresada puede ser segregada convenientemente en el medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo mediante unos procedimientos bien conocidos incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, la precipitación de componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como el sulfato de amonio, seguido de unos procedimientos cromatográficos como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, o similar.
La xilanasa purificada puede ser empleada para la inmunización de animales para la producción de anticuerpos. Más específicamente, el antisuero contra la xilanasa de la invención puede aumentar mediante la inmunización de conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente páginas 27-31). Unas inmunoglobulinas purificadas pueden ser obtenidas a partir de los antisueros, por ejemplo mediante la precipitación de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de una diálisis y cromatografía por intercambio iónico, por ejemplo en DEAE-Sephadex. Una caracterización inmunoquímica de proteínas puede realizarse sea por análisis de doble difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, páginas 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., capítulo 2).
En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a una preparación enzimática útil para la degradación de componentes de la pared celular vegetal, dicha preparación siendo enriquecida con una enzima exhibiendo actividad xilanasa como se ha descrito anteriormente. De esta manera, un refuerzo de la capacidad de degradación de la pared celular de la preparación enzimática puede ser obtenido.
La preparación enzimática habiendo sido enriquecida con una enzima de la invención puede por ejemplo ser una preparación enzimática comprendiendo actividades enzimáticas múltiples, en particular una preparación enzimática comprendiendo enzimas múltiple que degradan la pared celular vegetal tales como Pectinex®, Pectinex Ultra SP®, Celluclast o Celluzyme (todas disponibles con Novo Nordisk NS). En el presente contexto, el término "enriquecido" indica que se ha aumentado la actividad xilanasa de la preparación enzimática, por ejemplo con un factor de enriquecimiento de 1.1, convenientemente debido a la adición de una enzima de la invención preparada según el método descrito anteriormente.
De forma alternativa, la preparación enzimática enriquecida con una enzima exhibiendo una actividad xilanasa puede ser una preparación que comprende una enzima de la invención como el componente enzimático principal, por ejemplo una preparación enzimática monocomponente.
La preparación enzimática puede ser preparada según unos métodos conocidos en la técnica y puede estar en forma de líquido o preparación seca. Por ejemplo, la preparación enzimática puede tener la forma de un granulado o de un microgranulado. La enzima que debe ser incluida en la preparación puede ser estabilizada conforme a unos métodos conocidos en la técnica.
La preparación enzimática de la invención puede, además de una xilanasa de la invención, contiene una o varias enzimas que degradan otras paredes celulares vegetales, por ejemplo aquellas con actividades celulíticas, xilanolíticas o pectinolíticas como la \alpha-arabinosidasa, \alpha-glucoronisidasa, \beta-xilosidasa, acetil xilano esterasa, arabinanasa, ramnogalacturonasa, pectina acetilesterasa, galactanasa, poligalacturonasa, pectina liasa, pectato liasa, glucanasa o pectina metilesterasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser producible(s) por medio de un microorganismo del género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae, o Trichoderma.
La preparación enzimática según la invención es usada preferiblemente como un agente para la degradación o modificación de paredes celulares vegetales o de cualquier material conteniendo xilano originado a partir de paredes de células vegetales debido a la alta actividad degradante de la pared celular vegetal de la xilanasa de la invención.
Se dan unos ejemplos más abajo de usos preferidos de la preparación enzimática de la invención. La dosificación de la preparación enzimática de la invención y otras condiciones en las que se usa la preparación pueden ser determinadas con base en métodos conocidos en la técnica.
Las xilanasas de la invención hidrolizan enlaces (\beta-1,4 en xilanos. Los xilanos son polisacáridos que poseen un esqueleto compuesto por xilosa con enlaces \beta-1,4. El esqueleto puede tener diferentes ramas laterales, como la arabinosa, acetilo, ácido glucurónico, ramas laterales de ácido 4-metilglucurónico. La composición y número de ramas laterales varia según la fuente del xilano. Las ramas laterales de arabinosa dominan en xilanos de endospermo de cereal, mientras que los xilanos de madera dura contienen relativamente más sustituyentes de acetilo y de ácido glucurónico (Michael P. Coughlan y Geoffrey P.Hazlewood. Biotechnol. Appl. Biochem. 17: 259-289 (1993). El xilano producido a partir de algas rojas contiene una mezcla de xilosa con enlaces \beta-1,4 y \beta-1,3 en el esqueleto, este tipo de xilano es degradable por xilanasas para variar la extensión debido a los enlaces 1,4 en el esqueleto.
La degradación de xilano por xilanasas es facilitada mediante la eliminación completa o parcial de las ramas laterales. Los grupos acetilo pueden ser eliminados por alcali, o por acetil xilano esterasas, los grupos laterales de arabinosa pueden ser eliminados mediante un tratamiento de ácido suave o por alfa-arabinosidasas y las ramas laterales de ácido glucurónico pueden ser eliminadas por alfa-glucuronisidasas. Los oligómeros que son liberados por las xilanasas, o por una combinación de xilanasas y de enzimas de hidrolización en ramas laterales como se ha mencionado anteriormente pueden ser degradadas después para liberar xilosa mediante las beta-xilosidasas.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser usadas sin otras enzimas xilanolíticas o con una actividad limitada de otras enzimas xilanolíticas para degradar xilanos para la producción de oligosacáridos. Los oligosacáridos pueden ser empleados como agentes de estabilización, tales como oligosacáridos de arabinoxilano liberados a partir de un material de pared celular de cereal, o de arabinoxilanas más o menos purificadas de cereales.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser empleadas en combinación con otras enzimas xilanolíticas para degradar xilanos en xilosa y otros monosacáridos. La xilosa liberada puede convertirse en otros compuestos como unos sabores de furanona.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser empleadas solas o junto con otras enzimas como las glucanasas para mejorar la extracción de aceite de un material vegetal rico en aceite, como el aceite de maíz extraído de los embriones de maíz.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser empleadas en la industria panadera para mejorar el desarrollo, la elasticidad y/o la estabilidad de la masa y/o el volumen, la estructura de la miga y/o las propiedades que impiden la formación del gusto rancio del producto horneado. Aunque las xilanasas puedan ser usadas para la preparación de masas o productos cocidos al horno obtenidos a partir de cualquier tipo de harinas (por ejemplo a base de centeno, cebada, avena, o maíz) las xilanasas de la invención han demostrado ser particularmente útiles en la preparación de masas o productos cocidos al horno hechos a base de trigo o comprendiendo cantidades esenciales de trigo. Los productos cocidos al horno producidos con una xilanasa de la invención incluyen pan, panecillos, baguettes y similares. Para los propósitos de la industria panadera, la xilanasa de la invención puede ser usada como la actividad enzimática única o principal, o puede ser usada en combinación con otras enzimas como una lipasa, amilasa, oxidasa (por ejemplo glucosa-oxidasa, peroxidasa), lacasa y/o proteasa.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser usadas para modificar los alimentos para animales y pueden ejercer su efecto, sea in vitro (por modificación de los componentes del producto alimentario) o in vivo. Las xilanasas son particularmente apropiadas para una adición a composiciones de alimentos para animales incluyendo cantidades elevadas de arabinoxilanos y glucuronoxilanos, por ejemplo un producto alimentario incluyendo cereales como la cebada, el trigo, el centeno o la avena o el maíz. Cuando se añade a un alimento, la xilanasa mejora significativamente la rotura in vivo de la materia de pared celular vegetal en parte debido a una reducción de la viscosidad intestinal (Bedford et al., 1993), por lo que se consigue un mejor uso de los nutrientes vegetales por parte del animal. De ese modo, la proporción del índice de crecimiento y/o de conversión del alimentario (es decir, el peso del alimentario ingerido con respecto al aumento de peso) del animal es mejorada. El uso de una xilanasa de la invención en la preparación de alimento para animales está ilustrado en el Ejemplo 8.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser usadas en la industria de fabricación de papel y de pulpa, entre otras cosas en el proceso de blanqueo para aumentar el brillo de las pulpas blanqueadas en el cual la cantidad de clorina usada en las fases de blanqueo pueden ser reducidas, y aumentar el refinado de las pulpas en el proceso de papel reciclado (Eriksson, K.E.L., Wood Science and Technology 24 (1990): 79-101; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988): 235-239 and Pommier et al., Tappi Journal (1989): 187-191). Además, las xilanasas pueden ser usadas para el tratamiento de pulpa lignocelulósica para mejorar la aptitud al blanqueo de la misma. De este modo, se puede reducir la cantidad de clorina necesaria para obtener un blanqueo satisfactorio de la pulpa. El tratamiento de pulpa lignocelulósica puede, por ejemplo, ser realizado tal y como está descrito en WO 93/08275, WO 91/02839 y WO 92/03608.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser usadas en la elaboración de cerveza, en particular para mejorar la filtrabilidad del mosto por ejemplo conteniendo cebada y/o malta de sorgo. Las xilanasas pueden ser usadas de la misma manera que las pentosanasas usadas convencionalmente para la elaboración de cerveza, por ejemplo tal y como está descrito por Viétor et al., 1993 y en EP 227 159. Además, las xilanasas pueden ser usadas para el tratamiento de bagazo, es decir de los residuos de la producción del mosto de cerveza conteniendo cebada o cebada malteada u otros cereales, para mejorar la utilización de los residuos para, por ejemplo, alimentos para animales.
Las xilanasas de la presente invención pueden ser usadas para separar los componentes de los materiales de célula vegetal, en particular, los componentes de cereal como los componentes de trigo. La separación del trigo en gluten y almidón presenta un interés particular, es decir, componentes de interés comercial considerable. El proceso de separación puede ser realizado usando métodos conocidos en el estado de la técnica, de manera conveniente un proceso llamado de golpeo (o proceso de molienda húmeda) realizado en forma de proceso con hidroclón o decantador. En el proceso de golpeo, la materia prima es una dispersión bombeable diluida del material vegetal tal como el trigo expuesto a una separación. En un proceso de separación del trigo, la dispersión se realiza normalmente a partir de harina de trigo y agua.
Las xilanasas de la invención pueden ser usadas también en la preparación de zumos de fruta o de vegetales para aumentar el rendimiento, y en la hidrólisis enzimática de varios materiales derivados de la pared de la célula vegetal o de materiales residuales por ejemplo de la producción de papel, o residuos agrícolas tales como pajas de trigo, zuros de maíz, plantas de maíz enteras, cáscaras de nueces, pasto, cáscaras vegetales, cáscaras de soja, bagazos, pulpa de remolacha azucarera, y similares.
El material vegetal puede ser degradado con el fin de mejorar diferentes tipos de tratamiento, facilitar la purificación o extracción de otro componente aparte de los xilanos tal como la purificación de beta-glucano u oligómeros de beta-glucano procedentes de cereales, mejorar el valor del producto alimentario, reducir la capacidad de retención de agua, mejorar la degradabilidad en plantas de aguas residuales, mejorar la conversión por ejemplo del pasto y maíz para el ensilado, etc.
Finalmente, las xilanasas de la invención pueden ser usadas para la modificación de la viscosidad de material derivado de una pared celular vegetal. Por ejemplo, las xilanasas pueden ser usadas para reducir la viscosidad de un producto alimentario conteniendo xilano, para promover el tratamiento de xilano viscoso conteniendo un material como en la separación de trigo, y para reducir la viscosidad en el proceso de elaboración de cerveza.
La invención está descrita también en los dibujos anexos en los que
la Fig. 1 es un mapa de restricción de plásmido pYHD17,
la Fig. 2 una mapa de restricción de plásmido pHD 414,
la Fig. 3 representa los pH óptimos para Xyl I, Xyl II y Xyl III,
la Fig. 4 es la temperatura óptima para Xyl I, Xyl II y Xyl III,
la Fig. 5 es el cromatograma de filtración en gel para una degradación de 1% de arabinoxilano de trigo degradado Xyl I,
la Fig. 6 es el cromatograma de filtración en gel para una degradación del 5% WIP por Xyl I,
la Fig. 7 es el cromatograma de filtración en gel para una degradación del 1% de arabinoxilano de trigo por Xyl II,
la Fig. 8 es el cromatograma de filtración en gel para una degradación del 5% de WIP por Xyl II,
la Fig. 9 es el cromatograma de filtración en gel para una degradación del 1% de arabinoxilano de trigo por Xyl III,
la Fig. 10 es el cromatograma de filtración en gel para una degradación del 5% de WIP por Xyl III.
La invención está descrita con más detalle en los ejemplos siguientes los cuales, no están en ningún modo destinados a limitar el campo de la invención tal y como está reivindicado.
Ejemplos Materiales y métodos
Organismo donante: el ARNm fue aislado del Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, cultivado en un medio de fermentación conteniendo soja bajo agitación para asegurar una aireación suficiente. Unos micelios fueron recogidos después de 3-5 días de cultivo, congelados inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC.
Cepas de levadura: la cepa de Saccharomyces cerevisiae usada fue yNG231 (MAT alpha, leu2, ura3-52, his4-539, pep4-delta 1, cir+) o JG169 (MAT\alpha; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-113; prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).
Construcción de un plásmido de expresión: el plásmido disponible comercialmente pYES II (Invitrogen) fue cortado con Spel, llenado con ADN polimerasa Klenow + dNTP y cortado con ClaI. El ADN era fraccionado por tamaño en un gel de agarosa, y un fragmento de aproximadamente 2000 pares de bases era purificado por electroelución. El mismo plásmido fue cortado con ClaI/PvuII, y un fragmento de aproximadamente 3400 pares de bases fue purificado por electroelución. Los dos fragmentos fueron ligados en un fragmento SphI/EcoRI de extremidades redondeadas conteniendo el promotor TPI de levadura. Este fragmento fue aislado de un plásmido donde el promotor TPI de S. cerevisiae (cf. T. Albers y G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1, 1982, páginas 419-434) fue modificado ligeramente: un sitio SphI interno fue suprimido mediante eliminación de los cuatro pares de bases constituyendo el núcleo de este sitio. Además, unas secuencias redundantes hacia arriba del promotor fueron eliminadas por un tratamiento con exonucleasa BaII seguido de la adición de un enlazador SphI. Finalmente, un enlazador EcoRI fue añadido en la posición -10. Después de estas modificaciones, el promotor está incluido en un fragmento SphI-EcoRI. Su eficiencia en comparación con el promotor original no se ve afectada por las modificaciones. El plásmido resultante pYHD17 está mostrado en la Fig. 1.
Preparación de vidrio de laboratorio, boquillas y soluciones sin ribonucleasa: Todo vidrio de laboratorio utilizado en aislamientos de ARN fue horneado a + 220ºC durante al menos 12 h. Tubos Eppendorf, boquillas de pipeta y columnas de plástico fueron tratados en un 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC) en EtOH durante 12 h, y autoclaveados. Todos los tampones y el agua (excepto tampones conteniendo Tris) fueron tratados con el 0,1% de DEPC durante 12 h a 37ºC, y autoclaveados.
Extracción de ARN total: el ARN total fue preparado por extracción con tiocianato de guanidino seguido de un ultracentrifugado a través de un tampón de 5,7 M de CsCl (Chirgwin et al., 1979) usando las modificaciones siguientes. Los micelios congelados fueron triturados en N_{2} líquido hasta un polvo fino con un mortero y un triturador, seguido de una molienda en un molinillo de café preenfriado, y se suspendieron inmediatamente en 5 volúmenes de tampón de extracción de ARN (4 M de GuSCN, 0,5% de Na-laurilsarcosina, 25 mM de Nacitrato, pH 7.0, 0,1 M de (\beta-mercaptoetanol). La mezcla fue agitada durante 30 min. a temperatura ambiente y centrifugada (30 min., a 5000 rpm, temperatura ambiente, Heraeus Megafuge 1.0 R) para triturar los residuos de células. El sobrenadante fue recogido, estratificado cuidadosamente sobre un tampón de 5,7 M de CsCl (5,7 M de CsCl, 0,1 M de EDTA, pH 7.5, 0,1% de DEPC; autoclaveado antes del uso) usando 26,5 ml de sobrenadante por 12,0 ml de tampón de CsCl, y centrifugado para obtener el ARN total (Beckman, SW 28 rotor, 25000 rpm, temperatura ambiente, 24 h). Después del centrifugado, el sobrenadante fue eliminado cuidadosamente y el fondo del tubo conteniendo el ARN granulado fue cortado y enjuagado con 70% de EtOH. Todo el granulado de ARN fue transferido al interior de un tubo Eppendorf, suspendido en 500 \mul de TE, pH 7.6 (en caso de dificultad, ocasionalmente calentado durante 5 min a 65ºC), el fenol fue extraído y precipitado con etanol durante 12 h a - 200ºC (2.5 volúmenes de EtOH, 0.1 volumen de 3M de NaAc, pH 5.2). El ARN fue recogido por centrifugado, lavado en un 70% de EtOH, y resuspendido en un volumen mínimo de DEPC-DIW. La concentración de ARN fue determinada por medición de OD_{260/280}.
Aislamiento de ARN poli(A)^{+}: los ARNs poli(A)^{+} fueron aislados por cromatografía de afinidad en oligo(dT)-celulosa (Aviv & Leder, 1972). Típicamente, 0,2 g de oligo(dT) celulosa (Boehringer Mannheim) fue preaumentada en 10 ml de tampón de carga en columna 1 x (20 mM de Tris-Cl, pH 7.6, 0,5 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de SDS), cargado sobre una columna de plástico tapada tratada con DEPC (Poly Prep Chromatography Column, Bio Rad), y equilibrada con 20 ml de tampón de carga 1 x. El ARN total fue calentado a 65ºC durante 8 min., enfriado en hielo durante 5 min., y después de la adición de 1 volumen de tampón de carga en columna 2 x a la muestra de ARN cargada sobre la columna. El eluato fue recogido y de nuevo cargado 2-3 veces mediante un calentamiento de la muestra tal y como se ha mencionado más arriba y un enfriamiento rápido en hielo antes de cada carga. La columna oligo (dT) fue lavada con 10 volúmenes de tampón de carga 1 x, luego con 3 volúmenes de tampón de medio salino (20 mM de Tris-Cl, pH 7.6, 0,1 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de SDS), seguido de una elución del ARN poli(A)+ con 3 volúmenes de tampón de elución (10 mM de Tris-Cl, pH 7.6, 1 mM de EDTA, 0,05% de SDS) precalentados a + 65ºC, mediante la recogida de fracciones de 500 \mul. El OD260 fue leído para cada fracción recogida, y las fracciones conteniendo el ARNm fueron agrupadas y el etanol precipitado a -20ºC durante 12 h. El ARN poli(A)^{+} fue recogido por centrifugado, resuspendido en DEPC-DIW y almacenado en partes alícuotas de 5-10 \mug a - 80ºC.
Análisis por transferencia de Northern: los ARNs poli(A)^{+} (muestra de 5 \mug) de varios micelios fueron curados por electroforesis en geles de 1.2 agarosa -2.2 M formaldehido (Sambrook et al., 1989) y transferidos en membranas de nilón (Hybond-N, Amersham) con 10 x SSC (Sambrook et al., 1989) en forma de tampón de transferencia. Tres sondas de ADNc marcadas en ^{32}P cebadas aleatoriamente (Feinberg & Vogelstein, 1983) fueron usadas en hibridaciones individuales: 1) un fragmento Not I-Spe I de 1.3 kb para la poligalacturonasa I de A. aculeatus (descrito en la solicitud de patente danesa DK 1545/92), 2) un fragmento Not I-Spe I de 1.3 kb de codificación de endoglucanasa I de A. aculeatus (descrito en DK 0419/92) y 3) un fragmento Eag I de 1.2 kb para la galactanasa I de A. aculeatus (descrito en WO 92/13945). Hibridaciones de Northern fueron realizadas en 5 x SSC (Sambrook et al., 1989), solución de Denhardt 5 x (Sambrook et al., 1989), 0,5% de SDS (p/v) y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado con una concentración de sonda de aproximadamente 2 ng/ml durante 16 horas a 65ºC seguido de lavados en 5 x SSC a 65ºC (2 x 15 min.), 2 x SSC, 0.5% de SDS (1 x 30 min.), 0.2 x SSC, 0.5% de SDS (1 x 30 min.), y 5 x SSC (2 x 15 min.). Después de una autorradiografia a - 80ºC durante 12 horas, la sonda # 1 fue eliminada del filtro según las instrucciones del fabricante y rehibridada con una sonda #2, y finalmente con una sonda #3. La escala de ARN de Bethesda Research Laboratories fue usada en forma de marcador de tamaño.
Síntesis de ADNc
Síntesis de la primera cadena: El ADNc bicatenario fue sintetizado a partir de 5 \mug de ARN poli(A)^{+} de A. aculeatus por el método con RNasa H (Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989) usando la modificación en horquilla. El ARN poli(A)^{+} (5 \mug en 5 \mul de DEPC-tratado en agua) fue calentado a 70ºC durante 8 min., enfriado en hielo, y combinado en un volumen final de 50 \mul con un tampón de transcriptasa inversa (50 mM de Tris-Cl, pH 8.3, 75 mM de KCI, 3 mM de MgCl_{2}, 10 mM de DTT, Bethesda Research Laboratories) conteniendo 1 mM de cada dNTP (Pharmacia), 40 unidades de inhibidor de ribonucleasa de placenta humana (RNasin, Promega), 10 pg de cebador (Pharmacia) oligo(dT)_{12-18} y 1000 unidades de transcriptasa inversa RNasa H SuperScript II (Bethesda Research Laboratories). El ADNc de la primera cadena fue sintetizado por incubación de la mezcla reactiva a 45ºC durante 1 hora.
Síntesis de la segunda cadena: Después de la síntesis de 30 \mul de 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM de EDTA fue añadido, y el ARNm: los híbridos de ADNc eran precipitados en etanol durante 12 horas a -20ºC por adición de 40 \mug de portador de glicógeno (Boehringer Mannheim) 0,2 volúmenes de 10 M de NH_{4}Ac y 2,5 volúmenes de EtOH al 96%. Los híbridos fueron recuperados por centrifugado, lavados en un 70% de EtOH, secados al aire y resuspendidos en 250 \mul de tampón de la segunda cadena (20 mM de Tris-Cl, pH 7.4, 90 mM de KCI, 4,6 mM de MgCl_{2}, 10 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 16 \muM \betaNAD^{+}) conteniendo 100 \muM por cada dNTP, 44 unidades de ADN polimerasa I de E. coli (Amersham), 6,25 unidades de RNasa H (Bethesda Research Laboratories) y 10,5 unidades de ADN ligasa de E. coli (New England Biolabs). La síntesis de ADNc de la segunda cadena fue realizada mediante la incubación del tubo de reacción a 16ºC durante 3 horas, y la reacción fue detenida por la adición de EDTA en una concentración final de 20 mM seguido de una extracción de fenol.
Tratamiento de la nucleasa de judía Mung: el ADNc bicatenario (ds) fue precipitado con etanol a -20ºC durante 12 horas por adición de 2 volúmenes de EtOH al 96%, 0,1 volumen de 3 M de NaAc, pH 5.2, recuperado por centrifugado, lavado en un 70% de EtOH, secado (Speedvac), y resuspendido en 30 \mul de tampón de nucleasa de judía Mung (30 mM de NaAc, pH 4.6, 300 mM de NaCl, 1 mM de ZnSO_{4}, 0.35 mM de DTT, 2% de glicerol) conteniendo 36 unidades de nucleasa de judía Mung (Bethesda Research Laboratories). El ADN monocatenario en horquilla fue recortado por incubación de la reacción a 30ºC durante 30 min., seguido de la adición de 70 \mul de 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM de EDTA, extracción de fenol, y precipitación de etanol con 2 volúmenes de EtOH al 96% y 0,1 volumen de NaAc 3M, pH 5.2 a -20ºC durante 12 horas.
Extremidad redondeada con ADN polimerasa T4: el ADNc ds fue terminado en forma redondeada con ADN polimerasa T4 en 50 \mul de tampón de ADN polimerasa T4 (20 mM de Tris-acetato, pH 7.9, 10 mM de MgAc, 50 mM de KAc, 1 mM de DTT) conteniendo 0,5 mM cada dNTP y 7,5 unidades de ADN polimerasa T4 (Invitrogen) por incubación de la mezcla reactiva a +37ºC durante 15 min. La reacción fue detenida por adición de EDTA a 20 mM de concentración final, seguido de una extracción de fenol y una precipitación de etanol.
Ligadura de adaptadores y selección de tamaño: Después de la reacción de relleno, el ADNc fue ligado a unos adaptadores BstX I no palindrómicos (1 \mug/\mul, Invitrogen) en 30 \mul de tampón de ligadura (50 mM de Tris-Cl, pH 7.8, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 25 \mug/ml de albúmina de suero bovino) conteniendo 600 pmol de adaptadores BstX I y 5 unidades de ligasa T4 (Invitrogen) por incubación de la mezcla de reacción a +16ºC durante 12 h. La reacción fue detenida por un calentamiento a +70ºC durante 5 min., y el ADNc adaptado fue fraccionado por tamaños mediante una electroforesis en gel de agarosa (0,8% de HSB-agarosa, FMC) para separar los adaptadores no ligados y ADNcs pequeños. El ADNc fue seleccionado por tamaños con un corte a 0,7 kb, y el ADNc fue electropurificado a partir del gel de agarosa en 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM de EDTA durante 1 hora a 100 voltios, el fenol fue extraído y el etanol precipitado a -20ºC durante 12 horas según se ha mencionado más arriba.
Construcción de bibliotecas de ADNc: el ADNc ds adaptado fue recuperado por centrifugado, lavado en un 70% de EtOH y resuspendido en 25 ml de DIW. Antes de la ligadura de bibliotecas a gran escala, cuatro ligaduras de prueba fueron realizadas en 10 \mul de tampón de ligadura (el mismo que el susodicho) cada uno conteniendo 1 \mul de ADNc ds (tubos de reacción #1-#3), 2 unidades de ligasa T4 (Invitrogen) y 50 ng (tubo #1), 100 ng (tubo #2) y 200 ng (tubos #3 y #4) de vector de expresión de levadura dividido con Bst XI (vector pYES 2.0 Invitrogen o bien yHD13). Las reacciones de ligadura fueron realizadas por incubación a +16ºC durante 12 horas, calentadas a 70ºC durante 5 min, y 1 \mul de cada ligadura sometida a una electroporación (200 \Omega, 2.5 kV, 25 \muF) para 40 \mul del 1061 células E. coli competentes (OD600 = 0.9 en 1 litro de caldo LB, lavado dos veces en DIW frío, una vez en 20 ml de 10% de glicerol, resuspendido en 2 ml de glicerol al 10%). Después de una adición de 1 ml de SOC en cada mezcla de transformación, las células fueron cultivadas a 37ºC durante 1 hora, 50 \mul chapadas en placas de ampicilina LB + (100 \mug/ml) y cultivadas a 37ºC durante 12 h.
En condiciones óptimas, una ligadura a gran escala fue configurada en 40 \mul de tampón de ligadura conteniendo 9 unidades de ligasa T4, y la reacción fue incubada a 16ºC durante 12 horas. La reacción de ligadura fue detenida por calentamiento a 70ºC durante 5 min, el etanol precipitado a -20ºC durante 12 horas, recuperado por centrifugado y resuspendido en 10 \mul de DIW. Partes alícuotas de un \mul fueron transformadas en 1061 células de E. coli electrocompetentes mediante el uso de las mismas condiciones de electroporación mencionadas anteriormente, y las células transformadas fueron tituladas y la biblioteca colocada en placas en LB + ampicilina con 5000-7000 c.f.u./placa. A cada placa se añadieron 3 ml del medio. Las bacterias fueron raspadas, 1 ml de glicerol fue añadido y almacenado a -80ºC en forma de depósitos. Los 2 ml restantes fueron usados para el aislamiento del ADN. Si la cantidad de ADN era insuficiente para proporcionar el número requerido de levaduras transformantes, el ADN a gran escala se obtuvo a partir de 500 ml de medio (TB) inoculado con 50 \mul de materia prima bacteriana a -80ºC propagada durante toda la noche.
Construcción de bibliotecas de levadura: para asegurarse de que todos los clones bacterianos eran probados en levadura, un número de transformantes de levadura 5 veces superior al número de clones bacterianos en los depósitos originales estuvo fijado como el límite.
Partes alícuotas de un \mul de ADN plásmido purificado (100 ng/\mul) de depósitos individuales fueron electroporadas (200 \Omega, 1.5 kV, 25 \muF) en 40 \mul de células competentes de S. cerevisiae JG 169 (OD600 = 1.5 en 500 ml de YPD, lavadas dos veces en DIW frío, una vez en 1 M de sorbitol frío, resuspendido en 0,5 ml de sorbitol 1 M, Becker & Guarante, 1991). Después de la adición de 1 ml de sorbitol frío 1 M, 80 \mul de partes alícuotas fueron colocadas en placas en SC + glucosa - uracilo para proporcionar 250-400 c.f.u./placa e incubadas a 30ºC durante 3-5 días.
Construcción de un vector de expresión Aspergillus : el vector pHD414 es un derivado del plásmido p775 (descrito en EP 238 023). A diferencia de este plásmido, el pHD 414 tiene una serie de sitios de restricción únicos entre el promotor y el terminador. El plásmido fue construido por eliminación de un fragmento largo de aproximadamente 200 pares de bases (incluyendo sitios de RE indeseables) en el extremo 3' del terminador, y una eliminación posterior de un fragmento largo de aproximadamente 250 pares de bases en el extremo 5' del promotor, incluyendo también sitios indeseables. La región de 200 pares de bases fue eliminada por división con Narl (situado en el vector pUC) y XbaI (precisamente 3' en el terminador), un relleno posterior en los extremos generados con ADN polimerasa Klenow + dNTP, purificación del fragmento de vector en gel y religadura del fragmento de vector. Este plásmido era llamado pHD413. El pHD413 fue cortado con Stul (situado en el extremo 5' del promotor) y PvuII (en el vector pUC), fraccionado en gel y religado. El plásmido pHD 414 está mostrado en la Fig. 2.
Medios
YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, H_{2}O en 810 ml. Autoclaveados, 90 ml de glucosa al 20% (filtrada estéril) añadidos.
Sal basal 10 x: 66,8 g de base nitrogenada de levadura, 100 g de ácido succínico, 60 g de NaOH, H_{2}O hasta 1000 ml, filtrada estéril.
SC-URA: 90 ml de sal basal 10 x, 22,5 ml de 20% de casamino ácidos, 9 ml de triptófano al 1%, H_{2}O hasta 806 ml, autoclaveados, 3,6 ml de treonina al 5% y 90 ml de glucosa al 20% o de galactosa al 20% añadidos.
Caldo SC-H: 7,5 g/I de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11,3 g/l de ácido succínico, 6,8 g/l de NaOH, 5,6 g/l de casamino ácidos sin vitaminas, 0,1 g/l de triptófano. Autoclaveados durante 20 min a 121ºC. Después de la autoclave, 10 ml de una solución de galactosa al 30%, 5 ml de una solución de glucosa al 30% y 0,4 ml de una solución de treonina al 5% fueron añadidos por 100 ml de medio.
Agar SC-H: 7,5 g/l de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11,3 g/l de ácido succínico, 6,8 g/l de NaOH, 5,6 g/l de casamino ácidos sin vitaminas, 0.1 g/l de triptófano, y 20 g/l de agar (Bacto). Autoclaveado durante 20 min. a 121ºC. Después de la autoclave, 55 ml de una solución de galactosa al 22% y 1,8 ml de una solución de treonina al 5% fueron añadidos por 450 ml de agar.
Agar YNB-1: 3,3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 16,7 g/l de agar, pH fijado a 7. Autoclaveado durante 20 min. a 121ºC. Después de la autoclave, 25 ml de una base nitrogenada de levadura al 13.6% sin aminoácidos, 25 ml de una solución de glucosa al 40%, 1,5 ml de una solución de L-leucina al 1% y 1,5 ml de una solución de histidina al 1% fueron añadidos por 450 ml de agar.
Caldo YNB-1: composición similar al agar YNB-1, pero sin el agar.
Xilano AZCL: xilano de madera de abedul o de cascarilla de avena disponible en Megazyme, Australia.
4-metil-umbeliferil-\alpha-arabinopiranósido: disponible en Sigma.
Transformación de Aspergillus oryzae o Aspergillus Niger (procedimiento general)
100 ml de YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) son inoculados con esporas de A. oryzae o A. nigere incubados con una agitación a 37ºC durante aproximadamente 2 días. El micelio es recogido por filtración a través de miracloth y lavado con 200 ml de MgSO_{4} 0,6 M. El micelio es suspendido en 15 ml de MgSO_{4} 1,2 M. 10 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH = 5.8. La suspensión es enfriada en hielo y 1 ml de tampón conteniendo 120 mg de Novozym® 234, lote 1687 es añadido. Después de 5 minutos, 1 ml de 12 mg/ml de BSA (Sigma tipo H25) es añadido y una incubación con una agitación suave continuó durante 1,5-2,5 horas a 37ºC hasta visualizar una gran cantidad de protoplastos en una muestra controlada por microscopio.
La suspensión es filtrada a través de miracloth, el filtrado transferido a un tubo estéril y recubierto con 5 ml de sorbitol 0,6 M, 100 mM de tris-HCl, pH = 7.0. El centrifugado es realizado durante 15 minutos en 100 g y los protoplastos son recogidos desde la parte superior del tampón de MgSO_{4}. 2 volúmenes de STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de tris-HCl, pH = 7.5. 10 mM de CaCl_{2}) son añadidos a la suspensión de protoplastos y la mezcla es centrifugada durante 5 minutos en 1000 g. El granulado de protoplastos es resuspendido en 3 ml de STC y regranulado. Esto se repite. Finalmente los protoplastos son resuspendidos en 0,2-1 ml de STC.
100 \mul de suspensión de protoplastos son mezclados con 5-25 \mug del ADN apropiado en 10 \mul de STC. Los protoplastos son mezclados con p3SR2 (un plásmido portador del gen amdS de A. nidulans). La mezcla es dejada a temperatura ambiente durante 25 minutos. 0,2 ml de PEG 4000 al 60% (BDH 29576). 10 mM de CaCl_{2} y 10 mM de tris-HCl, pH = 7.5 son añadidos y mezclados cuidadosamente (dos veces) y finalmente 0,85 ml de la misma solución es añadido y mezclado cuidadosamente. La mezcla es dejada a temperatura ambiente durante 25 minutos, centrifugada en 2500 g durante 15 minutos y el granulado es resuspendido en 2 ml de sorbitol 1,2 M. Después de una sedimentación adicional, los protoplastos son extendidos en placas apropiadas. Los protoplastos son extendidos en placas mínimas (Cove Biochem.Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) conteniendo 1,0 M de sacarosa, pH = 7.0, 10 mM de acetamida como fuente de nitrógeno y 20 mM de CsCl para inhibir el crecimiento residual. Después de la incubación durante 4-7 días a 37ºC unas esporas son seleccionadas y extendidas en colonias individuales. Este procedimiento se repite y las esporas de una colonia individual después del segundo reaislamiento son almacenadas en forma de transformante definido.
Fermentación con flujo discontinuo
La fermentación con flujo discontinuo se realizó en un medio comprendiendo maltodextrina en forma de fuente de carbono, la urea en forma de fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación con flujo discontinuo se realizó por inoculación de un cultivo en un frasco de agitación de las células huéspedes en cuestión de A. oryzae en un medio comprendiendo el 3,5% de fuente de carbono y el 0.5% de fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de cultivo con un pH 5.0 y a 34ºC, los suministros continuos de fuentes de nitrógeno y de carbono adicionales fueron iniciados. La fuente de carbono fue mantenida como el factor de limitación y se garantizaba la presencia del oxígeno en exceso. El cultivo en flujo discontinuo continuó durante 4 días, después de los cuales las enzimas podían ser recuperadas por centrifugado, ultrafiltración, filtración clara y filtración de germen. Para los experimentos de la aplicación, la actividad amilasa se redujo hasta un nivel insignificante por métodos de purificación conocidos en la técnica. Para una caracterización, las enzimas fueron purificadas completamente por métodos cromatográficos de intercambio aniónico conocidos en la técnica.
Caracterización de una enzima de la invención
Electroforesis en SDS-PAGE: La electroforesis en SDS-PAGE se realizó en una unidad de electroforesis 4 Mini-Leak (Kem-En-Tec, Copenhagen) como una versión modificada del procedimiento de Laemli (Laemmli, 1970; Christgau, 1991). En resumen, el gel de separación fue vertido con 12% de acrilamida; 0,2% de acrilamida BIS; 0,1% de SDS; 0,375 M de Tris pH 8.8. 0,04% de APS (persulfato de amonio) & 0,04% de TEMED. Después de 6-15 horas de polimerización, el gel de apilamiento fue añadido con 4,5% en p/p de acrilamida; 0,075% de acrilamida BIS; 0,1% de SDS; 66,5 mM de Tris pH 6.8. 0,4% en p/p de APS (persulfato de amonio) & 0,4% de TEMED. Las cámaras de electrodo son rellenadas con un tampón formado: 25 mM de Tris-base; 0,192 M de glicina & 0,05% de SDS, donde después las muestras conteniendo un tampón de muestra son cargadas, y el gel es formado en 2-4 mA/gel para una formación toda la noche y 10-30 mA/gel para una formación rápida. El gel es posteriormente eliminado y teñido con tinte commassie o de plata.
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Isoelectroenfoque: El isoelectroenfoque es realizado en placas de placas PAG de Ampholine pH 3.5-9.5 (Pharmacia, Upsala) en una unidad de electroforesis Multiphor según las instrucciones de fabricación. Después de la electroforesis, el gel es sea teñido con commassie o bien con plata.
Tinción con commassie y plata: el gel es eliminado cuidadosamente de las placas de vidrio e incubado en una mesa de agitación de rotación lenta en aproximadamente 100 ml de las soluciones siguientes:
Tinción con Coomassie
1)
30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v
2)
30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v + 0,1% de commassie R250
3)
Decoloración en 30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v hasta que el fondo se haya reducido suficientemente.
4)
Finalmente el gel es incubado en una solución de conservación. 5% de ácido acético en v/v; 10% de etanol en v/v; 5% de glicerol en v/v y secado al aire entre dos placas de membrana de celofán.
Tinción con plata
1) 30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v
2) 20 min en 10% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v
3) 20 min en 0.0057% en p/v de APS (0.25 mM)
4) 60 min en 0.1% en p/v de AgNO_{3}
5) Para su desarrollo, el gel es sumergido en un revelador: 0,015% de formaldehído; 2% de Na_{2}CO_{3} en p/v durante 30-60 seg.
El gel es incubado después en una segunda vuelta de revelador hasta obtener una tinción satisfactoria de las proteínas (5-15 min.). Finalmente el gel es incubado en una solución conservadora: 5% de ácido acético en v/v; 10% de etanol en v/v; 5% de glicerol en v/v y secado al aire entre dos placas de membrana de celofán.
Las actividades de las enzimas son medidas sea mediante la liberación de azúcares de reducción de xilano de abedul (disponibles en Roth, Karlsruhe, Alemania) o mediante la liberación de un color azul de xilano de abedul AZCL de MegaZyme.
0,5 ml de una suspensión de sustrato-AZCL al 0,4% se mezcla con 0,5 ml de 0,1 M de tampón de citrato/fosfato de pH óptimo y 10 \mul de una solución enzimática diluida adecuadamente son añadidos. Las incubaciones son realizadas en termomezcladores Eppendorf durante 15 minutos a 30°C (si no se especifica lo contrario) antes de una inactivación por calentamiento durante 20 minutos a 95ºC. Unas incubaciones enzimáticas son realizadas por triplicado. Un blanco es producido donde la enzima es añadida pero inactivada inmediatamente. Después del centrifugado, la absorbencia del sobrenadante es medida en placas de microtitulación a 620 nm y el blanco es sustraído.
Unas soluciones del 0,5% de xilano de abedul (Roth) han sido producidas en 0,1 M de citrato/fosfato del pH óptimo, (si no se especifica lo contrario) 10 \mul de soluciones enzimáticas diluidas adecuadamente son añadidos a 1 ml de sustrato, las incubaciones son realizadas a 30ºC durante 15 minutos antes de una inactivación por calentamiento tal y como se ha mencionado anteriormente. Unos azúcares de reducción son determinados por reacción, en placas de microtitulación, con un agente reactivo PHBAH comprendiendo 0,15 g de hidracida de ácido para hidroxi benzoico (Sigma H-9882), 0,50 g de tartrato de sodio y potasio (Merck 8087) y 2% de solución de NaOH hasta 10,0 ml. Los resultados de los blancos son sustraídos. La xilosa es empleada como un estándar.
Un pH y temperatura óptimos son medidos en los sustratos mencionados anteriormente. 0,1 M de tampones de citrato/fosfato de pH variable son empleados para una determinación del pH óptimo. Tampones de citrato/fosfato 0,1 M del pH óptimo son utilizados para una reacción a temperaturas diferentes durante 15 min. con el fin de determinar la temperatura óptima.
La Km y actividad específica son medidas mediante la realización de incubaciones en concentraciones de sustrato (S) que varían del 0,025 al 1,5% (xilano de abedul), medida del ritmo de reacción (v), imagen S/v como función de S, realización del análisis de regresión lineal, determinación de la inclinación (=1/Vmax) y de la interceptación (Km/Vmax) y cálculo de Km y de la actividad específica (=Vmax/E), donde E es la cantidad de enzima añadida.
Para una cromatografía por filtración en gel, un 1% de soluciones de arabinoxilano de trigo (Megazyme) o un 5% de suspensiones de pentosano insoluble procedentes del trigo (WIP, producido tal y como está descrito más abajo), respectivamente, están hechos en 0,1 M de tampón acetato pH 5.5.
Para 1,5 ml de estos sustratos 30 pl de las siguientes soluciones enzimáticas (concentración final) son añadidos: xilanasa I (0,1 mg/ml), xilanasa II (0,1 mg/ml) y xilanasa III (0,07 mg/ml).
Unas incubaciones son realizadas a 30ºC durante 0, 10, 30, 60 y 120 minutos antes de la inactivación por calentamiento a 95ºC durante 20 min. El centrifugado es realizado y los sobrenadantes son analizados por inyección en tres columnas TSK en fila (PW G4000, PW G3000, PW G2500) y unos sacáridos son eluidos con 0,4 M de tampón acetato pH 3.0 a 0,8 ml/min. Los sacáridos de elución son determinados por un detector Shimadzu RI y los datos son recogidos y procesados mediante el software Dionex. Los dextranos (de Serva) son usados como estándares de peso molecular. La recogida de datos es iniciada 15 minutos después de la inyección.
Producción de pentosano insoluble (WIP) a partir de harina de trigo
150 kg de harina de trigo común fueron suspendidos en 450 kg de agua fría. La suspensión fue calentada a 60ºC y 600 g de Termamyl 120L® fueron añadidos. Después del calentamiento a 95ºC produciendo una gelatinización de la fracción de almidón, la suspensión fue enfriada a 60ºC con una hidrólisis continua durante 180 min. Después de un ajuste del pH a 8.0 usando NaOH, 300 g de Alcalase 2.4L® fueron añadidos. Durante la hidrólisis de proteína en agitación constante, el pH fue mantenido entre 7.5 y 8.0 de titulación con NaOH. La hidrólisis continuó durante 120 min. El precipitado fue recuperado después del centrifugado, lavado con agua una vez y lavado también después en una criba de 35 pm con agua fría para eliminar todo el material soluble residual. Al material insoluble resultante fueron añadidos hasta 20 l de agua, se calentó a 60ºC y después de un ajuste del pH a 8.0 con NaOH se añadieron 100 g de Alcalase 2.4L®. La hidrólisis y la titulación con NaOH continuaron hasta que no se observó ninguna caída más del pH. El material fue lavado después de nuevo en una criba de 35 p.m hasta eliminar todo el material soluble y, finalmente, liofilizarlo.
Determinación de FXU (actividad endoxilanasa)
La actividad endoxilanasa es determinada por un ensayo, en el que la muestra de xilanasa es incubada con un sustrato de remazol-xilano (4-0-metil-D-glucurono-D-xilano teñido con azul brillante de Remazol R, Fluka), pH 6.0. La incubación es realizada a 50ºC durante 30 min. El fondo de sustrato teñido no degradado es precipitado por etanol. El color azul restante en el sobrenadante es determinado espectrofotométricamente a 585 nm y es proporcional a la actividad endoxilanasa. La actividad endoxilanasa de la muestra es determinada con respecto a un estándar de enzima. El ensayo está descrito también en la publicación AF 293.6/1-GB, disponible bajo pedido en Novo Nordisk NS, Dinamarca.
Ejemplo 1
Una biblioteca de A. aculeatus consistiendo en aprox. 1,5 X 10^{6} clones individuales en 150 depósitos fue construida. El ADN fue aislado de 20 clones individuales de la biblioteca y expuesto a un análisis para la inserción de ADNc. La frecuencia de inserción resultó ser >90% y el tamaño de inserto medio fue de aproximadamente 1400 bp.
El ADN de algunos de los depósitos se transformó en levadura, y 50-100 placas conteniendo 200-500 colonias de levadura fueron obtenidas a partir de cada depósito. Después de 3-5 días de crecimiento, las placas de agar fueron replicadas en placas sobre varios grupos de placas de agar. Un grupo de placas conteniendo 0,1% de xilano AZCL (Megazyme, Australia) fue incubado después durante 3-5 días a 30ºC para detectar la actividad xilanasa. Unas colonias positivas fueron identificadas como colonias rodeadas por un halo azul. De forma alternativa, un grupo de placas fue incubado después durante 3-5 días a 30ºC antes del revestimiento con un gel de revestimiento de xilano conteniendo 0,1% de xilano AZCL y 1% de agarosa en un tampón con un pH apropiado. Tras la incubación durante 1-2 días a 30ºC, unas colonias positivas fueron identificadas como colonias rodeadas por un halo azul. De manera inesperada, se descubrió que las colonias de levadura en xilanasa II degradaban 4-metilumbelliferil-\alpha-arabinopiranoside en una sobrecapa con 0,1 M de tampón de citrato, pH 5.0, y 1% de agarosa produciendo una zona fluorescente. Este es el primer informe de una xilanasa que posee una actividad \alpha-arabinopiranosidasa.
Las células de colonias positivas enzimáticas fueron expandidas para un aislamiento de colonia individual en agar, y una colonia individual de producción de enzimas fue seleccionada para cada una de las colonias de producción de xilanasa identificadas.
Caracterización de clones positivos: los clones positivos fueron obtenidos en forma de colonias individuales, los insertos de ADNc fueron amplificados directamente desde la colonia de levadura usando cebadores de polienlazadores biotinilados, purificados por un sistema de perlas magnéticas (Dynabead M-280, Dynal) y caracterizados individualmente por secuenciación del extremo 5' de cada clon de ADNc usando el método de terminación de cadena (Sanger et al., 1977) y el sistema Sequenasa (United States Biochemical). Las secuencias de ADN de los genes de enzima están mostradas en las SEC ID Nº 1, 5 y 8, respectivamente.
Aislamiento de un gen de ADNc para la expresión en Aspergillus: para evitar errores de la PCR en el gen que debe ser clonado, el ADNc fue aislado de los plásmidos de levadura por procedimientos estándar tal y como está descrito más abajo.
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Una o más de las colonias de producción de xilanasa fueron inoculadas en 20 ml de caldo YNB-1 en un tubo de ensayo de vidrio de 50 ml. El tubo fue agitado durante 2 días a 30ºC. Las células fueron recogidas por centrifugado durante 10 min. a 3000 rpm.
Las células fueron resuspendidas en 1 ml de sorbitol 0,9 M, 0.1 M de EDTA, pH 7.5. El granulado fue transferido a un tubo Eppendorf, y centrifugado durante 30 segundos a máxima velocidad. Las células fueron resuspendidas en 0.4 ml de sorbitol 0,9 M, 0.1 M de EDTA, 14 mM de (\beta-mercaptoetanol. 100 \mul por 2 mg/ml de Zimolasa fueron añadidos, y la suspensión fue incubada a 37ºC durante 30 minutos y centrifugada durante 30 segundos. El granulado (esferoplastos) fue resuspendido en 0,4 ml de TE. 90 \mul de (1,5 ml de EDTA 0,5 M pH 8.0, 0,6 ml de Tris-Cl 2 M, pH 8.0, 0,6 ml de SDS al 10%) fueron añadidos, y la suspensión fue incubada a 65ºC durante 30 minutos. 80 \mul de 5 M de KOAc fueron añadidos, y la suspensión fue incubada en hielo durante al menos 60 minutos y centrifugada durante 15 minutos a máxima velocidad. El sobrenadante fue transferido a un tubo fresco que fue llenado con EtOH (a temperatura ambiente) seguido de una mezcla rigurosa pero suave y una rotación durante 30 segundos. El granulado fue lavado con ETON al 70% frío, centrifugado durante 30 segundos y secado a temperatura ambiente. El granulado fue resuspendido en 50 \mul de TE y centrifugado durante 15 minutos. El sobrenadante fue transferido a un tubo fresco. 2,5 \mul por 10 mg/ml de ribonucleasa fueron añadidos, seguido de una incubación a 37ºC durante 30 minutos y de la adición de 500 \mul de isopropanol con una mezcla suave. La mezcla fue centrifugada durante 30 segundos, y el sobrenadante fue eliminado. El granulado fue enjuagado con EtOH al 96% frío y secado a temperatura ambiente. El ADN fue disuelto en 50 \mul de agua hasta una concentración final de aproximadamente
100 \mul/ml.
El ADN fue transformado en E. coli. mediante unos procedimientos estándar. Dos colonias de E. coli fueron aisladas de cada una de las transformaciones y analizadas con las enzimas de restricción HindIII y XbaI que cortaban el inserto de ADN. El ADN de uno de estos clones fue retransformado en una cepa de levadura JG169.
Las secuencias de ADN de diferentes clones positivos fueron determinadas parcialmente. Las secuencias de ADN de tres xilanasas diferentes (xyl I, xyl II y xyl III) están mostradas en las SEC ID Nº. 1, 5 y 8 respectivamente. Las secuencias mostradas en esta identificación de secuencia comprenden una cola poli-A, la posición de posibles codones de parada está indicada en las secuencias de aminoácidos respectivas mostradas en las SEC ID nº. 2, 6 y 9.
Ejemplo 2 Expresión de xilanasa
Para expresar los genes en Aspergillus, el ADNc es aislado a partir de uno o más representantes de cada familia por digestión con HindIII/XbaI u otras enzimas de restricción apropiadas, fraccionamiento de tamaño en un gel y purificación y posteriormente ligados a pHD414, produciendo los plásmidos pXY-I, pXY-II y pXY-III. Después de una amplificación en E. coli, los plásmidos son transformados en A. oryzae o A. niger según el procedimiento general descrito en la sección Materiales y Métodos más arriba.
Prueba de transformantes de A. oryzae
Cada uno de los transformantes fue inoculado en agar FG-4 en el centro de un plato Petri. Después de 5 días de incubación a 30ºC, tapones de 4 mm de diámetro fueron eliminados por medio de un sacacorchos. Los tapones fueron sumergidos en un gel de sobrecapa de xilano, conteniendo un 0,1% de xilano AZCL y un 1% de agarosa en un tampón con un pH apropiado, e incubados durante toda la noche a 40ºC. La actividad de xilanasa fue identificada como se ha descrito anteriormente. Algunos de los transformantes tuvieron halos que eran significativamente más grandes que aquellos de origen Aspergillus oryzae. Esto demuestra una expresión eficaz de la xilanasa en Aspergillus oryzae. Los 8 transformantes con la mayor actividad de xilanasa fueron seleccionados, inoculados y mantenidos en
agar YPG.
Cada uno de los 8 transformantes seleccionados fueron inoculados de las inclinaciones de agar YPG en un frasco de agitación de 500 ml con medios FG-4 y MDU-2. Después de 3-5 días de fermentación con una agitación suficiente para asegurar una buena aireación, los caldos de cultivo fueron centrifugados durante 10 minutos en 2000 g y los sobrenadantes fueron analizados.
Un volumen de 15 \mul de cada sobrenadante fue aplicado en agujeros de 4 mm de diámetro fijados en 0,1% de gel de sobrecapa de xilano AZCL (25 ml en un plato Petri de 13 cm de diámetro). La actividad de xilanasa fue identificada por la formación de un halo azul en incubación.
Posteriormente, Xyl I, Xyl II y Xyl III, respectivamente, fueron producidos por fermentación con flujo discontinuo de A. oryzae expresando las enzimas tal y como se ha descrito anteriormente en Materiales y métodos.
Ejemplo 3 Purificación de xilanasa I, II & III Purificación de xilanasa I
El sobrenadante de cultivo de la fermentación de Aspergillus oryzae expresando la enzima recombinante es centrifugado y filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum para eliminar los micelios. 35-50 ml del sobrenadante filtrado (30-60 mg de xilanasa I) es ultrafiltrado en un Filtron ultracette o dispositivo de ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa para conseguir una concentración de 10 pliegues. Este concentrado es diluido 100 veces en 25 mM de tris pH 8.0 en dos ciclos sucesivos de ultrafiltración en el mismo dispositivo. Esta muestra ultrafiltrada es cargada en 1,5 ml/min sobre un intercambiador aniónico de Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q Sepharose equilibrado en 25 mM de Tris pH 8.0. Después de aplicar la muestra, la columna es lavada con dos volúmenes de columna de 25 mM de Tris pH 8.0, y las proteínas enlazadas son eluidas con un gradiente de NaCl de aumento lineal de 0 a 0,5 M de NaCl en 25 mM de Tris pH 8.0. La xilanasa I no está enlazada a la columna y por consiguiente está presente en la fracción de lavado. La mayoría de todas las impurezas son enlazadas a la columna, de esta manera la xilanasa I de la fracción de producto filtrado/lavado tiene una pureza superior al 95%.
Purificación de xilanasa II
El sobrenadante del cultivo de la fermentación de Aspergillus oryzae expresando la enzima recombinante es centrifugado y filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum para eliminar los micelios. 35-50 ml del sobrenadante filtrado (30-60 mg de xilanasa II) es ultrafiltrado en un Filtron ultracette o dispositivo de ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa para conseguir una concentración de 10 pliegues. Este concentrado es diluido 100 veces en 20 mM de Tris pH 8.0 en dos ciclos de ultrafiltración sucesivos en el mismo dispositivo. Esta muestra ultrafiltrada es cargada en 1,5 ml/min en un intercambiador aniónico Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q Sepharose equilibrado en 20 mM de Tris pH 8.0. Después de haber aplicado la muestra, la columna es lavada con dos volúmenes de columna de 20 mM de tris pH 8.0, y las proteínas enlazadas son eluidas con un gradiente de NaCl de aumento lineal de 0 a 0,6 M de NaCl en 20 mM de tris pH 8.0. La xilanasa II se eluye en dos valores picos diferentes en aproximadamente 0,2 & 0,3 M de NaCl. La enzima en estas dos fracciones tiene puntos isoeléctricos ligeramente diferentes (respectivamente pl 4.65 y pl 4.5 para el primero y el último valor pico eluido), pero ninguna diferencia de las propiedades enzimáticas fue observada entre las dos fracciones de xilanasa II.
Purificación de xilanasa III
El sobrenadante del cultivo de la fermentación de Aspergillus oryzae expresando la enzima recombinante es centrifugado y filtrado a través de un filtro de 0,2 pm para eliminar los micelios. 35-50 ml del sobrenadante filtrado (30-60 mg de xilanasa III) son ultrafiltrados en un Filtron ultracette o dispositivo de ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa para conseguir una concentración de 10 pliegues. Este concentrado es diluido 100 veces en 25 mM de Tris pH 8.0 en dos ciclos de ultrafiltración sucesivos en el mismo dispositivo. Esta muestra ultrafiltrada es cargada en 1,5 ml/min en un intercambiador aniónico de Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q Sepharose equilibrado en 25 mM de Tris pH 8.0. Después de aplicar la muestra, la columna es lavada con dos volúmenes de columna de 25 mM de tris pH 8.0, y las proteínas enlazadas son eluidas con un gradiente de NaCl de aumento lineal de 0 a 0,6 M de NaCl en 25 mM de Tris pH 8.0. La xilanasa III en esta fracción no es completamente pura. De esta manera, la xilanasa III conteniendo fracciones fue concentrada por ultrafiltración en un dispositivo de ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa hasta un volumen de 4,5 ml y aplicada a una columna de filtración en gel HR 26/60 Sefacril S200 en 0,25 M de acetato amónico pH 5.5 en un flujo constante de 1 ml/min. La xilanasa III es eluida como un valor pico diferente con una pureza superior al 95%.
Ejemplo 4 Caracterización de las xilanasas I, II, III
Las xilanasas fueron caracterizadas tal y como están descritas en Materiales y métodos y los resultados principales son aparentes en la tabla siguiente:
2
pH y temperatura óptimos
Los pH óptimos de las diferentes enzimas pueden ser vistos en las Fig. 3 y 4, respectivamente. Se puede observar que todas las xilanasas tienen un pH óptimo en la gama de pH 4-6, la xilanasa II siendo la más acídica y la xilanasa I la más alcalina. La xilanasa II está caracterizada por el hecho de tener una temperatura óptima elevada (70ºC) en comparación con las otras enzimas.
La Km y actividad específica de xilanasa I, II y III fueron determinadas tal y como está descrito en la sección Materiales y métodos más arriba. Las desviaciones estándar en 1/Vmax y Km/Vmax obtenidas a partir del análisis de regresión lineal fueron utilizadas para calcular los intervalos para las enzimas aparentes de la tabla anterior.
Es evidente que las xilanasas presentan actividades específicas en la gama de 50-250 \mumol/min/mg de proteína enzimática, la xilanasa II presentando la mayor actividad.
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Análisis de la filtración en gel
Los cromatogramas de la filtración en gel obtenidos para las xilanasas I, II y III, respectivamente, (usando el método descrito en la sección Materiales y métodos más arriba) están mostrados en las Figs. 5-11.
Si los perfiles de degradación son ordenados después de reducir la extensión de degradación de arabinoxilano soluble después de 10 minutos de incubación, se obtiene el orden siguiente: xilanasa II, xilanasa I y xilanasa III.
En cambio, si la cantidad de arabinoxilano insoluble solubilizado (considerada a partir del área de los cromatogramas) es considerada después de 10 minutos el orden es: xilanasa I, xilanasa III, xilanasa II.
Además, las enzimas pueden ser divididas en enzimas que continúan la degradación de xilano y las enzimas que detienen su degradación después de cierto tiempo. La xilanasa II detiene la degradación en arabinoxilano soluble, mientras que las xilanasas II y III la continúan (la xilanasa I creando grandes cantidades de monómero y dímero y la xilanasa III siendo más restringida en su modelo de degradación).
En arabinoxilano soluble, la xilanasa I no detiene la degradación, mientras que las xilanasa II y xilanasa III lo hacen. La xilanasa II es especial en la medida en que es muy lenta respecto al ataque al sustrato insoluble.
Según los resultados se sugiere que las enzimas están divididas en diferentes clases. La Xyl2 actúa muy rápidamente sobre el arabinoxilano soluble y muy lentamente sobre el arabinoxilano insoluble y la degradación se detiene después de un tiempo. La Xyl3 es rápida con respecto a la degradación de arabinoxilano insoluble, pero no degrada el material liberado de manera extensiva. La Xyl1 se caracteriza por una degradación extensiva de ambos arabinoxilanos soluble e insoluble en oligómeros.
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Ejemplo 5 Reducción de la viscosidad de la harina de trigo
Las diferentes xilanasas fueron probadas para determinar su capacidad de reducción de la viscosidad en la harina de trigo denominada harina Fakta ("Luksus hvedemel", una harina comercial de tipo no especifico, disponible en Dagligvaregruppen, DK-7100 Vejle, Dinamarca). La harina tiene la composición siguiente:
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3
4
Las xilanasas probadas fueron
-
\vtcortauna Spezyme CP disponible en Genencor, EEUU
-
\vtcortauna una xilanasa de H.insolens (producida tal y como se describe en el ejemplo 2 de WO 92/17573
-
\vtcortauna Xilanasa I (producida tal y como se describe en el Ejemplo 2 y 3)
-
\vtcortauna Xilanasa II (producida tal y como se describe en el Ejemplo 2 y 3).
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La reducción de la viscosidad fue medida por el método siguiente:
100 g de harina son pesados con precisión. A 120 ml de agua desionizada mantenida a 35ºC, fueron añadidas las enzimas mencionadas anteriormente. Las enzimas son dosificadas como a continuación:
Spezyme CP:
8.5 FXU (correspondientes a 3.4 mg de proteína)
Xilanasa I:
28.3 FXU (correspondientes a 0.236 mg de proteína enzimática y 4.2 mg de proteína)
Xilanasa II:
7.5 FXU (correspondientes a 0.19 mg de proteína enzimática y 0.25 mg de proteína)
Xilanasa de H. insolens:
82.2 FXU (correspondientes a 2.2 mg de proteína enzimática y 22.3 mg de proteína).
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Una muestra blanca es usada como control (ninguna enzima añadida). La harina y el agua son agitadas durante 30 segundos y luego mezcladas durante 30 segundos precisamente en una mezcladora (Warring, Commercial laboratory blender, Struers, Adjustments OFF 1-7, rotor en fondo (4 cuchillas)) a 7 (máxima velocidad). Se tarda 30 segundos en verter el líquido en el tubo de medición en el viscosímetro (reómetro programable, modelo DV-111, Brookfield, Spindel 25, el tubo de medición siendo termostatado a 38ºC). La viscosidad a 40 rpm es medida cada 15 seg durante 4 minutos. La viscosidad específica expresada como viscosidad media de la viscosidad de la muestra/media del blanco en porcentajes es usada en forma de medida de la reducción de viscosidad. La viscosidad media es una media del nivel alcanzado después de 60 segundos y hasta el final de las mediciones.
La viscosidad relativa mínima fue determinada mediante el uso de xilanasa II. Se descubrió que otras xilanasas reducían la viscosidad relativa (xilanasa I, Spezyme CP) aunque en una extensión menor. Se descubrió que la xilanasa de H. insolens aumentaba la viscosidad en esa dosificación. Como ejemplo, las dosificaciones mencionadas anteriormente obtenidas en una viscosidad específica de la "harina Fakta" del 69% para la xilanasa II, del 78% para la xilanasa I, del 87% para Spezyme CP y del 107% para la xilanasa de H. insolens en porcentaje de viscosidad del blanco.
Ejemplo 6 Separación de trigo
La capacidad de separación del trigo de las enzimas mencionadas en el Ejemplo 5 fue determinada por una prueba de centrifugado. La prueba se realizó con la harina mencionada en el Ejemplo 5.
La harina y el agua fueron mezcladas según el procedimiento descrito en el Ejemplo 5. Después de la mezcla 10 ml de suspensión fueron centrifugados (Megafuge 1.0 Heraeus Sepatech) a 4332 g durante 5 minutos. El almidón fue encontrado en la capa de fondo, seguido del gluten, de residuos y de la capa efluente en la parte superior. La separación es expresada como un porcentaje efluente. Cuanto más elevado es el porcentaje mejor es la separación.
Se confirmó que la xilanasa II funcionaba mejor. Como ejemplo, el efluente de "Harina Fakta" era del 14% para una muestra blanca, del 21% para Spezyme CP, del 22% para la xilanasa I y del 23% para la xilanasa II.
Ejemplo 9 Materiales y métodos Enzimas
Lipasa A: La lipasa de Humicola lanuginosa descrita en EP 305 216 y producida por técnicas de ADN recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en EP 305 216. La lipasa tiene una actividad específica de 4.452.000 LU/g y de una FAU/g inferior a 0,6.
Xilanasa A: una xilanasa producida por la cepa de Humicola insolens DSM 1800 disponible en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH y también descrita en EP 507 723.
Fungamyl: una preparación fúngica de a-amilasa comercialmente disponible en Novo Nordisk NS; Dinamarca.
Pentopan: una preparación de xilanasa comercialmente disponible en Novo Nordisk NS, Dinamarca.
LU/g (Unidades/g de lipasa), FAU/g (Unidades/g de alfa-amilasa fúngica) y FXU (unidades/g de xilanasa) fueron determinadas por los ensayos siguientes:
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LU - unidades de lipasas
La actividad de lipasa fue probada usando tributirato de glicerina como un sustrato y una goma arábiga como emulsionante. 1 LU (unidad de lipasa) es la cantidad de enzima que libera 1 \mumol de ácido butírico titulable por minuto a 30ºC, pH 7.0. La actividad lipasa fue probada por un pH-stat usando un radiómetro titulador Radiometer VIT90, Copenhage. Otros detalles del ensayo son proporcionados en un método analítico Novo AF 95/5, disponible bajo pedido.
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FAU - Unidades de alfa-amilana fúngica
1 Unidad FA (FAU) es la cantidad de enzima que, a 37ºC y pH 4.7, rompe 5260 mg de almidón sólido por hora. Otros detalles del ensayo son proporcionados en el método analítico Novo AF 9.1/3, disponible bajo pedido.
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FXU - actividad de xilanasa
Se determinó tal y como se ha descrito anteriormente.
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Preparación de pan
El pan blanco fue preparado a partir de la siguiente receta básica:
5
La harina de trigo era del tipo denominado "Manitoba" provista por "Valsemøllerne", Dinamarca, octubre 1993.
Procedimiento
1. Mezcla de masa (mezclador Spiral)
2 min. a 700 rpm
7 min. a 1400 rpm
el tiempo de mezcla fue determinado y ajustado por unos panaderos profesionales para obtener una consistencia de masa óptima en las condiciones usadas de la prueba.
2. Primera prueba: 30ºC - 80% RH, 16 min.
3. Puesta en escala y conformación;
4. Prueba final: 32ºC - 80% RH, 35 min.;
5. Cocción: 225ºC, 20 min. para panecillos y 30 min. para una barra de pan.
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Evaluación de masa y de productos cocidos al horno
Las propiedades de la masa y de los productos cocidos al horno fueron determinadas tal y como se indica a continuación:
Volumen específico de panecillo: el volumen de 20 panecillos es medido usando el método de semilla de colza tradicional. El volumen específico es calculado como volumen en ml por g de pan. El volumen específico del control (sin enzima) es definido como 100. El índice de volumen específico relativo es calculado como:
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6 
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Volumen específico de barra de pan: el valor medio de 4 volúmenes de barras de pan es medido usando los mismos métodos tal y como se han descrito anteriormente.
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La pegajosidad de la masa y la estructura de la miga son determinadas visualmente según la escala siguiente:
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7
8 
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La blandura de la miga de pan es medida por un analizador de textura SMS. Un palpador con un diámetro de 20 mm es prensado en el centro de una rebanada de pan de 20 mm de grosor, la fuerza necesaria para que el palpador aplaste la miga de 5 mm con una velocidad de 2,0 mm/s es registrada y es expresada como la firmeza de miga. Cuanto más bajo es el valor, más blanda es la miga. Cuatro rebanadas de cada pan son medidas y el valor medio es
usado.
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Xilanasa I
La enzima usada fue la xilanasa I, una xilanasa recombinante de A. aculeatus producida en A. oryzae tal y como se describe en los Ejemplos 2 y 3 más arriba. El efecto de esta xilanasa fue comparado con la xilanasa A de H. insolens y una pentosanasa disponible comercialmente, Pentopan. Las enzimas fueron añadidas directamente a la mezcla de ingredientes de la industria panadera o bien dispersadas en agua antes de ser añadidas a la mezcla. Todas las pruebas fueron realizadas al menos por duplicado y los resultados promedio fueron usados. Los resultados obtenidos están mostrados en la tabla 5.
Es aparente según la tabla 5 que la adición de xilanasa I aumenta significativamente el volumen de los panecillos y/o barras de pan y el efecto es mayor al obtenido con la xilanasa A y Pentopan de la técnica anterior. En la dosificación óptima, es decir la dosificación que proporciona el aumento de volumen específico máximo sin obtener una masa demasiado pegajosa, de la pentosanasa (Pentopan) y xilanasa conocidas (xilanasa A), el aumento de volumen máximo es de aproximadamente 10-16%. En la dosificación óptima de xilanasa I (aproximadamente 350-750 FXU por kg de harina) un volumen en aumento del 29-41% puede ser obtenido sin producir una masa demasiado pegajosa. Con un tiempo de impermeabilización más largo al 80% de RH y 32ºC, puede ser obtenido un volumen aún mayor. Además, la estructura de la miga y la blandura de la miga durante el almacenamiento son también mejoradas.
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(Tabla pasa a página siguiente)
10 
\newpage
Referencias
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
Documentos de patente citados en la descripción
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11
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En las SEQ ID Nº 4-6, "*" indica la posición correspondiente a un codón de parada.
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LISTADO DE SECUENCIAS 
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> Novozymes A/S
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<120> Enzima con actividad xilanasa de Aspergillus aculeatus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3954.215-EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patente 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (68)..(1273)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\hskip1cm
19 
\hskip1cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>2
\hskip1cm
21 
\hskip1cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (4)..(1326)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
25 
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26 
\hskip1cm
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
28 
\hskip1cm
29 
\hskip1cm
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 927
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<212> ADN
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<213> Aspergillus aculeatus 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (31)..(927)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
32 
\hskip1cm
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
34 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 41
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<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip1cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
36 
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (193)..(193)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido producido naturalmente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
38 
\hskip1cm
39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
41 
\hskip1cm
42 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 303
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
43

Claims (31)

1. Enzima que presenta actividad xilanasa, dicha enzima es codificada por una secuencia de ADN:
a) comprendida en o comprendiendo la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1, o
b) una secuencia de codificación de un polipéptido que presenta una actividad xilanasa que es al menos idéntica a 70% sobre toda la longitud a una xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1.
2. Enzima según las reivindicaciones 1, dicha enzima es codificada por una secuencia de ADN comprendiendo la secuencia parcial siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\vskip1.000000\baselineskip
o una secuencia idéntica al 70% a ésta sobre toda la longitud de codificación de un polipéptido con actividad xilanasa.
3. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que posee una masa molecular de aproximadamente 32,3 kDa.
4. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que posee un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,8.
5. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que posee una Km comprendida en la gama situada entre aproximadamente 0,32 a 0,48.
6. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que puede ser derivada de un microorganismo.
7. Enzima según las reivindicaciones 6, que puede ser derivada de un hongo filamentoso o de una levadura.
8. Enzima según la reivindicación 7, que puede ser derivada de una cepa de Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium o de Humicola.
9. Enzima según las reivindicaciones 8, dicha enzima puede ser derivada de una cepa de Aspergillus.
10. Enzima según la reivindicación 9, dicha enzima puede ser derivada de una cepa de Aspergillus aculeatus, Aspergillus Níger o de Aspergillus oryzae.
11. Enzima según la reivindicación 9, que es codificada por la secuencia de ADN aislada de una biblioteca de ADN preparada a partir de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43.
12. Constructo de ADN comprendiendo una secuencia de ADN de codificación de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Vector de expresión recombinante comprendiendo una secuencia de ADN de codificación de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14. Célula comprendiendo un vector de expresión recombinante según la reivindicación 13, teniendo en cuenta que la célula no forma parte de un animal o de un humano.
15. Célula según la reivindicación 14, que es una célula eucariota.
16. Célula según la reivindicación 15, en la que la eucariota es una célula fúngica, una célula de levadura o una célula fúngica filamentoso.
17. Célula según la reivindicación 16, en la que la célula pertenece a una cepa de Aspergillus.
18. Célula según la reivindicación 17, en la que la célula pertenece a una cepa de Aspergillus niger o de Aspergillus oryzae.
\newpage
19. Método de producción de una enzima que presenta actividad xilanasa, este método consistiendo en poner en cultivo una célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en condiciones permitiendo la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
20. Preparación enzimática, dicha preparación siendo enriquecida con una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
21. Preparación enzimática según la reivindicación 20, que incluye una o varias actividades celulolíticas, xilanolíticas o pectolíticas.
22. Preparación según la reivindicación 21, que comprende además una pectina liasa, una pectato liasa, una glucanasa, una xilosidasa, una arabinosidasa, una acetil xilano esterasa o una pectina metilesterasa.
23. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 en la producción de masas o de productos cocidos al horno.
24. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 en la preparación de piensos o alimentos.
25. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 en la preparación de pulpa o de papel.
26. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 para la separación de componentes de cereales.
27. Uso según la reivindicación 26, donde el cereal es trigo.
28. Uso según las reivindicaciones 26 o 27, donde el componente de cereales es trigo, que debe ser separado en gluten y en almidón.
29. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 para reducir la viscosidad de un material derivado de una pared celular vegetal.
30. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 para la producción de cerveza o la modificación de subproductos procedentes de un proceso de elaboración de cerveza.
31. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las reivindicaciones 20 a 22 para la producción de vino o de zumo.
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