BRPI0612944B1

BRPI0612944B1 - Method of production of target substance

Info

Publication number: BRPI0612944B1
Application number: BRPI0612944-7A
Authority: BR
Inventors: B. Dunson James; Tucker Melvin; Elander Richard; Hennessey Susan
Original assignee: E.I.Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 2005-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2017-11-28
Also published as: BRPI0612966A2; CA2603128C; WO2006110899A3; JP5118626B2; BRPI0612937A2; EP1885840B1; US20070031918A1; CN101155925B; EP1869202B1; CN101155928A; WO2006110891A3; WO2006110900A3; CA2604100A1; BRPI0612944A2; JP4991700B2; WO2006110899A2; JP2008537682A; WO2006110891A2; US7932063B2; BRPI0612939B1

Abstract

método de produção de substância alvo. substâncias alvo foram produzidas utilizando biocatalisadores que são capazes de fermentar açúcares derivados de biomassa tratada. os açúcares foram obtidos por meio do tratamento prévio de biomassa sob condições de altos sólidos e baixa amônia, seguida por sacarificação.

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA ALVO” |001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano nB 60/670437, depositado em doze de abril de 2005.

Declaração de Direitos Governamentais [002] A presente invenção foi realizada com apoio do governo dos Estados Unidos com base no Contrato nc 04-03-CA-70224 concedido pelo Departamento de Energia. O governo detém certos direitos na presente invenção.

Campo da Invenção [003] São fornecidos métodos de produção de substâncias alvo utilizando açúcares fermentáveis derivados do tratamento de biomassa. Especificamente, açúcares obtidos por meio do tratamento prévio de biomassa sob condições de alto teor de sólidos e baixa concentração de amônia, seguida por sacarificação, são utilizados em fermentação por biocatalisadores que produzem substâncias alvo.

Antecedentes da Invenção [004] Estoques de alimentação e resíduos celulósicos e lignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos florestais, lodo de fabricação de papel e resíduos sólidos municipais e industriais fornecem estoque de alimentação renovável potencialmente grande para a produção de substâncias, plásticos, combustíveis e alimentos. Estoques de alimentação e resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de polímeros de carboidrato que compreendem celulose, hemicelulose, glucanos e lignina são geral mente tratados por uma série de meios químicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente açúcares de hexose e pentose, que podem ser fermentados em seguida em produtos úteis.

[005] Métodos de tratamento prévio são utilizados para elaborar os polímeros de carboidrato de materiais celulósicos e lignocelulósicos mais facilmente disponíveis para enzimas de sacarificação. Os métodos de tratamento prévio historicamente utilizaram principalmente ácidos fortes sob altas temperaturas; devido aos altos custos de energia, altos custos de equipamento, altos custos de recuperação de catalisador de tratamento prévio e incompatibilidade com enzimas de sacarificação, entretanto, estão sendo desenvolvidos métodos alternativos, tais como tratamento prévio enzimático, ou o uso de ácido ou base sob temperaturas mais suaves, em que a redução da hidrólise de polímeros de carboidrato de biomassa ocorre durante o tratamento prévio, o que requer sistemas de enzimas aprimorados para sacarificar celulose e hemicelulose.

[006] Uma série de métodos de tratamento prévio utilizando bases foi proposta. Gould (Biotech. and Bioenger. (1984) 26: 46-52) descreve método de tratamento prévio para biomassa lignocelulósica utilizando peróxido de hidrogênio (H202). O tratamento é mais eficiente utilizando H202 em quantidade de pelo menos 0,25 peso/peso com relação ao substrato.

[007] Teixeira, L. et al (Appl. Biochem. and Biotech. (1999) 77-79: 19-34) descreveram uma série de tratamentos prévios de biomassa utilizando quantidades estequiométricas de hidróxido de sódio e hidróxido de amônio, com concentração de biomassa muito baixa. A razão entre a solução e a biomassa é de 14:1.

[008] Elshafei, A. et al (Bioresource Tech. (1991) 35: 73-80) examinaram o tratamento prévio de forragem de milho utilizando NaOH.

[009] Kim, T. e Y. Lee (Bioresource Technology (2005) 96: 2007-2013) relatam o uso de altas quantidades de amônia aquosa para o tratamento prévio de forragem de milho.

[010] O Pedido de Patente n- WO 2004/081185 discute métodos de hidrólise de lignocelulose, que compreendem o contato da lignocelulose com substância; a substância pode ser base, tal como carbonato de sódio ou hidróxido de potássio, sob pH de cerca de 9 a cerca de 14, sob condições moderadas de temperatura, pressão e pH.

[011] As Patentes Norte-Americanas nB 5.916.780 e 6.090.595 descrevem processo de tratamento prévio em que razão especificada entre arabinoxilan e o total de polissacarídeos não de amido (AX/NSP) é determinada e utilizada para selecionar o estoque de alimentação.

[012] Para que seja processo economicamente competitivo, processo comercial de produção de substâncias a partir de biomassa de recursos renováveis requer a hidrólise de carboidratos em biomassa lignocelulósica para fornecer altos rendimentos de açúcares em altas concentrações, utilizando baixas quantidades de substâncias, para produzir fonte de açúcares fermentáveis com baixa toxicidade que são utilizados por biocatal is adores que produzem substâncias alvo com valor agregado.

Descrição Resumida da Invenção [013] A presente invenção fornece métodos de produção de substâncias alvo que utilizam biomassa. O processo de acordo com a presente invenção envolve o tratamento prévio de biomassa, sob concentração relativamente alta, com baixa concentração de amônia com relação ao peso seco de biomassa. Após o tratamento prévio, a biomassa é tratada com associação de enzimas de sacarificação para produzir açúcares fermentáveis. Os açúcares são colocados em contato em seguida com biocatal is ado r que pode fermentar os açúcares e produzir substância alvo. Em uma realização da presente invenção, o método compreende: a. contato de biomassa com solução aquosa que compreende amônia, em que a amônia está presente em concentração pelo menos suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa e amônia aquosa, mas em que a mencionada amônia está presente em menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa e, adicionalmente, em que o peso seco de biomassa encontra-se em alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso com relação ao peso da mistura de biomassa e amônia aquosa; b. contato do produto da etapa (a) com uma associação de enzima de sacarificação sob condições apropriadas para produzir açúcares fermentãveís; e c. contato do produto da etapa (b) com pelo menos um biocatalisador apropriado para fermentar os açúcares para produzir a substância alvo sob condições de fermentação apropriadas.

Breve Descrição das Figuras [014] A Figura 1 exibe o crescimento de Zymomonas mobilis 8b (descrita no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n- 2003/0162271 A1, Exemplos IV, VI e XII) na presença ou ausência de acetamida e ácido acético.

Descricão Detalhada da Invenção [015] Os Depositantes incorporam especificamente o conteúdo integral de todas as referências mencionadas no presente relatório descritivo. Além disso, quando quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro for fornecido na forma de faixa, faixa preferida ou lista de valores preferíveis superiores e valores preferíveis inferiores, deve-se compreender isso como descrevendo especificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer par de limite de faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixa inferior ou valor preferido, independentemente de se as faixas são descritas separadamente- Quando uma série de valores numéricos for indicada no presente, a menos que informado em contrário, a faixa destina-se a incluir os seus pontos finais e todos os números inteiros e frações dentro da faixa. Não se pretende que o escopo da presente invenção seja limitado aos valores específicos indicados ao definir faixa.

[016] A presente invenção fornece métodos de produção de substâncias alvo que fazem uso de biomassa da forma a seguir: açúcares são derivados de biomassa, que são utilizados em seguida como fonte de carbono para o crescimento de microorganismos que podem elaborar substâncias alvo como produtos do seu metabolismo. Os açúcares são liberados da biomassa por meio de tratamento prévio da biomassa sob concentração relativamente alta, com concentração relativamente baixa de amônia com relação ao peso seco da biomassa. A biomassa tratada com amônia é digerida em seguida com associação de enzimas de sacarifícação para produzir açúcares fermentáveis. Os açúcares são utilizados como substrato de fermentação para o crescimento de microorganismo ou biocatalisador que seja capaz de produzir substância alvo.

Definições: [017] No presente relatório descritivo, é utilizada uma série de termos. São fornecidas as definições a seguir: [018] A expressão “açúcar fermentável” designa oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser utilizados como fonte de carbono por microorganismo em processo de fermentação.

[019] O termo lignocelulósico" designa composição que compreende lignina e celulose. Material lignocelulósico pode também compreender hemicelulose.

[020] O termo “celulósico” designa composição que compreende celulose.

[021] Por "peso seco” de biomassa, indica-se o peso da biomassa que possui toda ou essencialmente toda a água removida. Peso seco é tipicamente medido de acordo com o Padrão E1756-01 da Sociedade Norte-Americana de Testes e Materiais (ASTM) (Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass) ou o Padrão T-412 om-02 da Technical Association of the Pulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) (Moisture in Pulp, Paper and Paperboard).

[022] A expressão “substância alvo” indica substância produzida por meio de fermentação. Substância é utilizada em sentido amplo e inclui moléculas tais como proteínas, incluindo, por exemplo, peptídeos, enzimas e anticorpos.

[023] Substância alvo que é “derivável de biomassa” é substância alvo produzida por processo por meio do qual biomassa é hidrolisada para liberar açúcares fermentáveis e os açúcares fermentáveis são fermentados utilizando pelo menos um biocatalisador para produzir substância alvo desejada.

[024] As expressões “plastificante” e “agente de amolecimento” designam materiais que causam redução das forças intermoleculares coesivas ao longo das cadeias de polímeros ou entre elas. Esses materiais podem agir, por exemplo, para reduzir a cristalinidade ou romper uniões entre fibras de carboidrato de lignina e não de lignina (tais como celulose ou hemicelulose).

[025] O termo “sacarificação” designa a produção de açúcares fermentáveis a partir de polissacarídeos.

[026] “Condições apropriadas de produção de açúcares fermentáveis” designa condições tais como pH, composição de meio e temperatura sob as quais as enzimas de sacarificação são ativas.

[027] “Condições de fermentação apropriadas” designa condições que sustentam o crescimento e a produção de substâncias alvo por biocatalisador. Estas condições podem incluir pH, nutrientes e outros componentes de meios, temperatura, atmosfera e outros fatores.

[028] A expressão “biomassa previamente tratada” indica biomassa que tenha sido submetida a tratamento prévio antes da sacarificação.

[029] “Biomassa” indica qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose, compreendendo ainda opcionalmente hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. Biomassa pode também compreender componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Segundo o método do presente, biomassa pode ser derivada de uma única fonte, ou biomassa pode compreender mistura derivada de mais de uma fonte; biomassa poderá compreender, por exemplo, mistura de espigas de milho e forragem de milho ou mistura de grama e folhas. Biomassa inclui, mas sem limitar-se a safras bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólido industrial, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardins, resíduos de madeira e de florestas. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se a grãos de milho, espigas de milho, resíduos de safras tais como cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, brotos de grama, resíduos de papel, bagaço de cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamento de cereais, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutas, flores e esterco animal. Em uma realização, biomassa que é útil para o método do presente inclui biomassa que possui valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente densa e/ou de coleta, transporte, armazenagem e/ou manipulação relativamente fácil. Em uma realização da presente invenção, biomassa que é útil inclui espigas de milho, forragem de milho e bagaço de cana de açúcar.

[030] Para os propósitos da presente invenção, “solução aquosa que compreende amônia” designa o uso de gás amônia (NH3), compostos que compreendem íons de amônio (NH4+) tais como hidróxido de amônio ou sulfato de amônio, compostos que liberam amônia mediante degradação tais como uréia e suas combinações em meio aquoso.

[031] A concentração de amônia utilizada no método do presente é concentração mínima suficiente para manter o pH da mistura de biomassa e amônia aquosa alcalina e no máximo menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Esta baixa concentração de amônia é suficiente para tratamento prévio e a baixa concentração pode também ser de menos de cerca de 10% em peso com relação ao peso seco de biomassa. Concentração muito baixa de 6% de amônia com relação ao peso seco de biomassa, ou menos, pode também ser utilizada para tratamento prévio. Por alcalino, indica-se pH de mais de 7,0. Particularmente apropriado é pH da mistura de biomassa e amônia aquosa que é maior que 8. Em uma realização, amônia está presente em menos de cerca de 10% em peso com relação ao peso seco de biomassa. É particularmente apropriada amônia a menos de cerca de 6% em peso com relação ao peso seco de biomassa.

[032] Amônia, da forma utilizada no processo do presente, fornece vantagens sobre outras bases. Amônia particiona-se em fase líquida e fase de vapor. Amônia gasosa pode difundir-se mais facilmente através da biomassa que base líquida, resultando em tratamento prévio mais eficaz em concentrações mais baixas. Amônia também é conhecida no presente no Exemplo 11 por competir com a hidrólise, por meio de amonólise, de acetil ésteres em biomassa para formar acetamida. Acetamida é menos tóxica que acetato a certos organismos de fermentação, tais como Zymomonas mobilis (conforme demonstrado no presente no Exemplo 12). Desta forma, a conversão de acetil ésteres em acetamida em vez de ácido acético reduz a necessidade de remoção de ácido acético. O uso de amônia também reduz a necessidade de suplemento de meio de crescimento utilizado durante a fermentação com fonte de nitrogênio. Além disso, amônia é material de baixo custo e, desta forma, fornece processo econômico. Amônia pode também ser reciclada para o reator de tratamento prévio durante o tratamento prévio ou após o tratamento prévio, de forma a permitir processo mais econômico. Após o tratamento prévio, por exemplo, à medida que a temperatura é reduzida à apropriada para sacarificação, gás amônia pode ser liberada, opcionalmente na presença de vácuo, e pode ser reciclada. Em processo contínuo, amônia pode ser reciclada continuamente.

[033] Segundo o método do presente, a solução aquosa que compreende amônia pode compreender opcionalmente pelo menos uma base adicional, tal como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. A pelo menos uma base adicional pode ser adicionada em quantidade que é combinada com amônio para formar quantidade de base total que é de menos de cerca de 20% em peso com relação ao peso de biomassa. Preferencialmente, o total de segunda base mais amônia encontra-se em quantidade que é de menos de cerca de 15% em peso. Pode(m) ser utilizada(s) base(s) adicional(is), por exemplo, para neutralizar ácidos em biomassa, fornecer íons metálicos para as enzimas de sacarificação ou fornecer íons metálicos para o meio de crescimento de fermentação.

[034] No método do presente, o peso seco de biomassa encontra-se em concentração inicial de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80% do peso da mistura de biomassa e amônia aquosa. Mais adequadamente, o peso seco de biomassa encontra-se em concentração de cerca de 15% a cerca de 60% do peso da mistura de biomassa e amônia aquosa. O percentual de biomassa na mistura de biomassa e amônia aquosa é mantido alto para minimizar a necessidade de concentração de açúcares resultantes da sacarificação da biomassa previamente tratada, para uso em fermentação. A alta concentração de biomassa também reduz o volume total de material de tratamento prévio, tornando o processo mais econômico.

[035] A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme obtido da fonte, ou pode-se aplicar energia à biomassa para reduzir o tamanho, aumentar a extensão exposta e/ou aumentar a disponibilidade de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa para amônia e para enzimas de sacarificação utilizadas na segunda etapa do método. Meios de energia úteis para reduzir o tamanho, aumentar a extensão exposta e/ou aumentar a disponibilidade de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa para amônia e para enzimas de sacarificação incluem, mas sem limitar-se a moagem, fragmentação, quebra, retalhamento, corte, refino em disco, ultrassom e microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrer antes ou durante o tratamento prévio, antes ou durante a sacarificação, ou qualquer de suas combinações.

[036] O tratamento prévio de biomassa com solução de amônio é conduzido em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente, o recipiente pode suportar pressão, possui mecanismo de aquecimento e possui mecanismo de mistura do conteúdo. Os recipientes disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, o reator Zipperclave® (Autoclave Engineers, Erie, PA), o reator Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ) e reator de pistola de vapor (descrito em Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA). Reatores em escala muito maior com capacidades similares podem ser utilizados. Alternativamente, a solução de amônia e biomassa pode ser combinada em um recipiente e transferida em seguida para outro reator. Além disso, biomassa pode ser previamente tratada em um recipiente e processada adicionalmente em seguida em outro reator, tal como reator de pistola de vapor (descrito em Métodos Gerais, Autoclave Engineers, Erie, PA).

[037] Antes do contato da biomassa com solução aquosa que compreende amônia, pode-se aplicar vácuo ao recipiente que contém a biomassa. Ao evacuar ar dos poros da biomassa, pode-se atingir melhor penetração da amônia na biomassa. O período de tempo para aplicação de vácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada à biomassa dependerá do tipo de biomassa e pode ser determinado empiricamente, de forma a atingir o tratamento prévio ideal da biomassa (conforme medido pela produção de açúcares fermentáveis após a sacarificação).

[038] O contato da biomassa com solução aquosa que compreende amônia é conduzido sob uma temperatura de cerca de 4 SC a cerca de 200 SC. Concluiu-se que contato inicial da biomassa com amônia a 4 SC, permitindo a impregnação a esta temperatura, aumenta a eficiência de sacarificação sobre biomassa nativa não tratada previamente. Em outra realização, o mencionado contato da biomassa é conduzido sob uma temperatura de cerca de 75 QC a cerca de 150 -C. Em ainda outra realização, o mencionado contato da biomassa é conduzido sob uma temperatura de mais de 90 QC a cerca de 150 QC.

[039] O contato da biomassa com solução aquosa que compreende amônia é conduzido por período de tempo de até cerca de vinte e cinco horas. Períodos mais longos de tratamento prévio são possíveis, mas período de tempo curto pode ser preferível por razões econômicas práticas. Tipicamente, período de tratamento por contato de amônia é de cerca de oito horas ou menos. Períodos mais longos podem fornecer o benefício de redução da necessidade de aplicação de energia para romper a biomassa, portanto, período de tempo de até cerca de 25 horas pode ser preferível.

[040] Em uma realização, o processo de tratamento prévio pode ser realizado sob temperatura relativamente alta por período de tempo relativamente curto, tal como temperatura relativamente alta por período de tempo relativamente curto, tal como cerca de 100 SC a cerca de 150 QC por cerca de cinco minutos a cerca de duas horas. Em outra realização, o processo de tratamento prévio pode ser realizado sob temperatura mais baixa por período de tempo relativamente longo, tal como cerca de 75 SC a cerca de 100 QC por cerca de duas horas a cerca de oito horas. Em ainda outra realização, o processo de tratamento prévio pode ser realizado à temperatura ambiente (cerca de 22 a 26 QC) por período de tempo ainda mais longo de cerca de 24 horas. Outras combinações de tempo e temperatura intermediárias a estas podem também ser utilizadas.

[041] Para o processo de tratamento prévio, a temperatura, tempo de tratamento prévio, concentração de amônia, concentração de uma ou mais bases adicionais, concentração de biomassa, tipo de biomassa e tamanho de partículas de biomassa são relatados; estas variáveis podem ser ajustadas conforme o necessário, portanto, para obter produto ideal a ser colocado em contato com associação de enzimas de sacarificação.

[042] Plastificante, agente de amolecimento ou sua combinação, tais como polióis (por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres de polióis (por exemplo, monoacetato de glicerol), glicol éteres (por exemplo, dietileno glicol), acetamida, etanol e etanolaminas, podem ser adicionados no processo de tratamento prévio (ou seja, etapa (a)). Plastificante pode ser adicionado como componente da solução de amônia aquosa, como solução separada ou como componente seco.

[043] A reação de tratamento prévio pode ser realizada em qualquer veículo apropriado, tal como reator em bateladas ou reator contínuo. Os técnicos no assunto reconhecerão que, sob temperaturas mais altas (acima de 100 -C), é necessário recipiente sob pressão. O recipiente apropriado pode ser equipado com meios, tais como impulsores, para agitar a mistura de biomassa e amônia aquosa. Projetos de reator são discutidos em Lin, K.-H. e Van Ness, H. C. (em Perry, R. H. e Chilton, C. H. (eds.), Chemical Engineer’s Handbook, quinta edição (1973), Capítulo 4, McGraw-Hiil, NY). A reação de tratamento prévio pode ser conduzida na forma de processo em bateladas ou processo contínuo.

[044] Os técnicos no assunto sabem bem que é necessário fonte de nitrogênio para o crescimento de microorganismos durante a fermentação; desta forma, o uso de amônia durante o tratamento prévio fornece fonte de nitrogênio e reduz ou elimina a necessidade de suplemento do meio de crescimento utilizado durante a fermentação com fonte de nitrogênio. Caso o pH do produto de tratamento prévio exceda aquele em que as enzimas de sacarificação são ativas, ou exceda a faixa apropriada para crescimento microbiano em fermentação, podem ser utilizados ácidos para reduzir o pH. A quantidade de ácido utilizada para atingir o pH desejado pode resultar na formação de sais em concentrações que são inibidoras das enzimas de sacarificação ou do crescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade de ácido necessária para atingir o pH desejado e reduzir o custo de matéria prima de NH3 no processo de tratamento prévio do presente, gás amônia pode ser evacuado do reator de tratamento prévio e reciclado. Tipicamente, pelo menos uma parte da amônia é removida, o que reduz o pH mas deixa algum nitrogênio que fornece esse nutriente para uso em fermentação subseqüente.

[045] A fim de obter quantidades suficientes de açúcares de biomassa, a biomassa pode ser previamente tratada com solução de amônia aquosa uma vez ou mais de uma vez. De forma similar, reação de sacarificação pode ser realizada uma ou mais vezes. Os dois processos de tratamento prévio e de sacarificação podem ser repetidos se desejado para obter rendimentos de açúcares mais altos. Para determinar o desempenho dos processos de tratamento prévio e sacarificação, separadamente ou juntos, o rendimento teórico de açúcares que podem ser derivados da biomassa inicial pode ser determinado e comparado com rendimentos medidos.

Sacarificacão: [046] Após o tratamento prévio, o produto compreende mistura de amônia, biomassa parcialmente degradada e açúcares fermentáveís. Antes do processamento adicional, amônia pode ser removida da biomassa previa mente tratada por meio de aplicação de vácuo, A remoção de amônia reduz o pH e, desta forma, menos ácido neutralizante é utilizado para obter o pH desejado para sacarificação e fermentação. Isso resulta em carga de sal mais baixa na mistura de tratamento prévio. Tipicamente, alguma amônia permanece, o que é desejado para fornecer fonte de nitrogênio para fermentação.

[047] A mistura de tratamento prévio é hidrolisada em seguida na presença de uma associação de enzimas de sacarificação para liberar oligossacarídeos e/ou monossacarídeos em hidrolisado. Enzimas de sacarificação e métodos de tratamento de biomassa são analisados em Lynd, L. R, et al (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506-577). Em realização preferida, toda a mistura de tratamento prévio que compreende frações solúveis e insolúveis é utilizada na reação de sacarificação.

[048] Em outra realização, antes da sacarificação, a fração aquosa que compreende amônia e açúcares solubilizados pode ser separada de particulados insolúveis restantes na mistura. Métodos de separação das frações solúveis das insolúveis incluem, mas sem limitar-se a decantação e filtragem. Os particulados insolúveis podem ser reciclados para o reator de tratamento prévio. Os particulados insolúveis podem ser opcionalmente lavados com solvente aquoso (tal como água) para remover açúcares adsorvidos antes da reciclagem para o reator de tratamento prévio. A fração insolúvel pode ser submetida em seguida a tratamento adicional com solução de amônia aquosa conforme descrito acima para tratamento prévio, seguida por sacarificação com associação de enzimas de sacarificação. A fração solúvel pode também ser concentrada antes da sacarificação utilizando processo apropriado, tal como evaporação.

[049] Antes da sacarificação, o produto de tratamento prévio pode ser tratado para alterar o pH, a composição ou a temperatura, de tal forma que as enzimas da associação de enzimas de sacarificação sejam ativas, de forma a fornecer condições apropriadas para produzir açúcares fermentáveis. O pH pode ser alterado por meio da adição de ácidos em forma sólida ou líquida. Alternativamente, dióxido de carbono (C02), que pode ser recuperado da fermentação, pode ser utilizado para reduzir o pH. C02 pode ser recolhido, por exemplo, de fermentador e alimentado, tal como por meio de borbulhamento, para o produto de tratamento prévio ao mesmo tempo em que o pH é monitorado, até atingir-se o pH desejado. A temperatura pode ser trazida para uma temperatura que seja compatível com a atividade de enzimas de sacarificação, conforme indicado abaixo. Quaisquer cofatores necessários para a atividade de enzimas utilizadas em sacarificação podem ser adicionados.

[050] A associação de enzimas de sacarificação compreende uma ou mais enzimas selecionadas principal mas não exclusivamente a partir do grupo de "glicosidases" que hidrolisam as ligações éter de di, oligo e polissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com o Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 (em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1-5, Eur. J. Biochem. (1995) 232: 1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1-5, Eur. J. Biochem. (1997) 250: 1-6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264: 610-650, respectivamente)) do grupo geral “hidrolases” (EC 3). As glicosidases úteis no método do presente podem ser categorizadas pelo componente de biomassa que hidrolisam. As glicosidases úteis para o método do presente incluem glicosases hidrolisantes de celulose (tais como celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glicosidases), glucosidases hidrolisantes de hemicelulose (tais como xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilodases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases) e glicosidases hidrolisantes de amido (tais como amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso, pode ser útil adicionar outros aditivos à associação de enzimas de sacarificação tais como peptidases (EC 3.4.x.y), lípases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), ligninases (EC 1.11.1.x) e esterases de feruloíla (EC 3.1.1.73) para ajudar a liberar polissacarídeos de outros componentes da biomassa. Sabe-se bem na técnica que microorganismos que produzem enzimas hidrolisantes de polissacarídeos exibem freqüentemente atividade, tal como degradação de celulose, que é catalisada por várias enzimas ou um grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Desta forma, “celulase” de microorganismo pode compreender grupo de enzimas, todas as quais podem contribuir com a atividade degradante de celulose. Preparações de enzimas comerciais ou não comerciais, tais como celulase, podem compreender numerosas enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Desta forma, a associação de enzimas de sacarificação de acordo com o método do presente pode compreender atividade enzimática, tal como “celulase”, mas reconhece-se que esta atividade pode ser catalisada por mais de uma enzima.

[051] Enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, tais como celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) e xilanase Multifect® (Genencor). Além disso, enzimas de sacarificação podem ser produzidas biologicamente, incluindo utilizando microorganismos recombinantes.

[052] Os técnicos no assunto saberíam como determinar a quantidade eficaz de enzimas para uso na associação e ajustar condições para atividade enzimática ideal. Os técnicos no assunto também saberíam como otimizar as classes de atividades enzimáticas necessárias na associação para obter sacarificação ideal de um dado produto de tratamento prévio sob as condições selecionadas.

[053] Preferencialmente, a reação de sacarificação é realizada à temperatura ou pH ideais para as enzimas de sacarificação ou perto deles. A temperatura ideal utilizada com a associação de enzimas de sacarificação no método do presente varia de cerca de 15 SC a cerca de 100 QC. Em outra realização, a temperatura ideal varia de cerca de 20 -C a cerca de 80 QC. O pH ideal pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em outra realização, o pH ideal utilizado com a associação de enzimas de sacarificação no método do presente varia de cerca de 4 a cerca de 10.

[054] A sacarificação pode ser realizada por tempo de cerca de vários minutos a cerca de 120 horas e, preferencialmente, de cerca de vários minutos a cerca de 48 horas. O tempo da reação dependerá da concentração de enzimas e da atividade específica, bem como do substrato utilizado e das condições ambientais, tais como temperatura e pH. Os técnicos no assunto podem determinar facilmente condições ideais de temperatura, pH e tempo a serem utilizadas com substrato específico e associação de enzima(s) de sacarificação.

[055] A sacarificação pode ser realizada em bateladas ou como processo contínuo. A sacarificação pode também ser realizada em uma etapa ou em uma série de etapas. Enzimas diferentes necessárias para sacarificação, por exemplo, podem exibir diferentes pHs ou temperaturas ideais. Tratamento primário pode ser realizado com enzima(s) em uma temperatura e pH, seguido por tratamentos secundário ou terciário (ou mais) com diferente(s) enzima(s) em diferentes temperaturas e/ou pH. Além disso, tratamento com enzimas diferentes em etapas seqüenciais pode ocorrer ao mesmo pH e/ou temperatura, ou diferentes pHs e temperaturas, tais como utilizando semicelulases estáveis e mais ativas sob pHs e temperaturas mais altas, seguido por celulases que são ativas em pHs e temperaturas mais baixas.

[056] O grau de solubilização de açúcares a partir de biomassa após a sacarificação pode ser monitorado medindo-se a liberação de monossacarídeos e oligossacarídeos. Métodos de medição de monossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos na técnica. A concentração de açúcares redutores, por exemplo, pode ser determinada utilizando o teste de ácido 1,3-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, G. L., Anal. Chem. (1959) 31: 426-428). Alternativamente, açúcares podem ser medidos por meio de HPLC utilizando coluna apropriada conforme descrito no presente no capítulo Métodos Gerais.

[057] Açúcares fermentáveis liberados de biomassa podem ser utilizados por microorganismos apropriados para produzir substâncias alvo. Após a sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura de sacarificação pode ser concentrada por meio de evaporação, tal como para aumentar a concentração de açúcares fermentáveis. Opcionalmente, líquido no produto de sacarificação pode ser separado de sólidos em método contínuo ou de bateladas. Opcionalmente, o líquido ou todo o produto de sacarificação pode ser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s) microorganismo(s) utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durante a sacarificação, o pH pode ser ajustado ao apropriado para fermentação. Além disso, a mistura de sacarificação pode ser suplementada com nutrientes adicionais necessários para crescimento microbiano. Os suplementos podem incluir, por exemplo, extrato de levedura, aminoácidos específicos, fosfato, fontes de nitrogênio, sais e traços de elementos. Podem também ser incluídos componentes necessários para a fabricação de produto específico elaborado por biocatalisador específico, tal como antibiótico para manter plasmídeo ou cofator necessário em reação catalisada por enzimas. Além disso, açúcares adicionais podem ser incluídos para aumentar a concentração total de açúcar. A mistura de sacarificação pode ser utilizada como componente de caldo de fermentação, por exemplo, compondo cerca de 100% a cerca de 10% do meio final. Condições de fermentação apropriadas são atingidas por meio de ajuste desses tipos de fatores para o crescimento e produção de substâncias alvo por biocatalisador.

[058] Temperatura e/ou gás no espaço superior podem também ser ajustados, dependendo de condições úteis para o(s) microorganismo(s) de fermentação. A fermentação pode ser aeróbica ou anaeróbica. A fermentação pode ocorrer após a sacarificação, ou pode ocorrer simultaneamente com a sacarificação por meio de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). SSF pode manter baixos os níveis de açúcar produzidos por meio de sacarificação, de forma a reduzir a potencial inibição de produto das enzimas de sacarificação, reduzir a disponibilidade de açúcar para microorganismos contaminantes e aumento da conversão de biomassa previamente tratada em monossacarídeos e/ou oligossacarídeos.

[059] Substâncias alvo que podem ser produzidas por meio de fermentação incluem, por exemplo, ácidos, álcoois, alcanos, alquenos, aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Álcoois incluem, mas sem limitar-se a metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etileno glicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidos incluem ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico e ácido levulínico. Os aminoácidos incluem ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Substâncias alvo adicionais incluem metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

[060] A fermentação de açúcares em substâncias alvo pode ser conduzida por um ou mais biocatalisadores apropriados em fermentações de etapa única ou múltiplas. Biocatalisadores podem ser microorganismos selecionados a partir de bactérias, fungos filamentosos e leveduras. Biocatalisadores podem ser microorganismos do tipo selvagem ou microorganismos recombinantes e incluem Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Em outra realização, biocatalisadores podem ser selecionados a partir do grupo que consiste de Escherichia coli recombinante, Zymomonas mobilis, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitis.

[061] Muitos biocatalisadores utilizados em fermentação para produzir substâncias alvo foram descritos e outros podem ser descobertos, produzidos por meio de mutação ou elaborados por meios recombinantes. Qualquer biocatalisador que utiliza açúcares fermentáveis produzidos no método do presente pode ser utilizado para elaborar a(s) substância(s) alvo cuja produção seja conhecida, por meio de fermentação no método do presente.

[062] A fermentação de carboidratos em acetona, butanol e etanol (fermentação ABE) por Clostridia solventogênico é bem conhecida (Jones e Woods (1986), Microbiol. Rev. 50: 484-524). Processo de fermentação para a produção de altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, utilizando linhagem mutante de Clostridium acetobutylicum, é descrito em US 5.192.673. O uso de linhagem mutante de Clostridium beijerinckii para produzir altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, é descrito em US 6.358.717. Linhagens geneticamente modificadas de E. coli também vêm sendo utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwood et al (2002), Appl. Environ. Microbiol. 68: 6263-6272). Linhagem geneticamente modificada de Zymomonas mobilis que possui produção aprimorada de etanol é descrita em US 2003/0162271 A1.

[063] Ácido láctico foi produzido em fermentações por linhagens recombinantes de E. coli (Zhou et al (2003), Appl. Environ. Microbiol. 69: 399-407), linhagens naturais de Bacillus (US 20050250192) e Rhizopus oryzae (Tay e Yang (2002), Biotechnol. Bioeng. 80: 1-12). Linhagens recombinantes de E. coli vêm sendo utilizadas como biocatalisadores em fermentação para produzir 1,3-propanodiol (US 6.013.494, US 6.514.733) e ácido adípico (Niu et al (2002), Biotechnol. Prog. 18: 201-211). Ácido acético foi fabricado por meio de fermentação utilizando Clostridia recombinante (Cheryan et al (1997), Adv. Appl. Microbiol. 43: 1-33) e linhagens de levedura recém identificadas (Freer (2002), World J. Microbiol. Biotechnol. 18: 271-275). A produção de ácido succínico por E. coli recombinante e outras bactérias é descrita em US 6.159.738 e por E. coli recombinante mutante em Lin et al (2005), Metab. Eng. 7: 116-127). Ácido pirúvico foi produzido por levedura Torulopsis glabrata mutante (Li et al (2001), Appl. Microbiol. Technol. 55: 680-685) e por E. coli mutante (Yokota et al (1994), Biosci. Biotech. Biochem. 58: 2164-2167). Linhagens recombinantes de E. coli vêm sendo utilizadas como biocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmico (US 20030170834) e ácido quínico (US 20060003429).

[064] Mutante de Propionibacterium acidipropionici vem sendo utilizado em fermentação para produzir ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2005), Biotechnol. Bioeng. 91: 325-337) e ácido butírico foi elaborado por Clostridium tyrobutyricum (Wu e Yang (2003), Biotechnol. Bioeng. 82: 93-102). Propionato e propanol foram elaborados por meio de fermentação a partir de treonina por Clostridium sp. linhagem 17cr1 (Janssen (2004), Arch. Microbiol. 182: 482-486). Aureobasidium pullulans similar a levedura foi utilizado para elaborar ácido glucônico (Anantassiadis et al (2005), Biotechnol. Bioeng. 91: 494-501) por mutante de Aspergillus niger (Singh et al (2001), Indian J. Exp. Biol. 39: 1136-43). Ácido 5-ceto-D-glucônico foi elaborado por mutante de Gluconobacter oxydans (Elfari et al (2005), Appl. Microbiol. Biotech. 66: 668-674), ácido itacônico foi produzido por mutantes de Aspergillus terreus (Reddy e Singh (2002), Bioresour. Technol. 85: 69-71), ácido cítrico foi produzido por linhagem mutante de Aspergillus niger (Ikram-UI-Haq et al (2005), Bioresour. Technol. 96: 645-648) e xilitol foi produzido por Candida guilliermondii FTI 20037 (Mussatto e Roberto (2003), J. Appl. Microbiol. 95: 331-337). Biopoliésteres que contêm 4-hidroxivalerato, também contendo quantidades significativas de ácido 3-hidroxibutírico e ácido 3-hidroxivalérico, foram produzidos por Pseudomonas putida e Ralstonia eutropha recombinantes (Gorenflo et al (2001), Biomacromolecules 2: 45-57). L-2,3-butanodiol foi elaborado por E. coli recombinante (Ui et al (2004), Lett. Appl. Microbiol. 39: 533-537).

[065] A produção de aminoácidos por meio de fermentação foi realizada utilizando linhagens auxotróficas e linhagens resistentes a análogos de aminoácidos de Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. A produção de histidina utilizando linhagem resistente a análogo de histidina, por exemplo, é descrita na Patente Japonesa Publicada ns 8596/81 e utilizando linhagem recombinante é descrita em EP 136.359. A produção de triptofan utilizando linhagem resistente a análogo de triptofan é descrita nas Patentes Japonesas Publicadas nQ 4505/72 e 1937/76. A produção de isoleucina utilizando linhagem resistente a análogo de isoleucina é descrita nas Patentes Japonesas Publicadas n5 38995/72, 6237/76 e 32070/79. A produção de fenilalanina utilizando linhagem resistente a análogo de fenilalanina é descrita na Patente Japonesa Publicada ns 10035/81. A produção de tirosina utilizando linhagem que requer fenilalanina para crescimento, resistente a tirosina (Agr. Chem. Soc. Japan 50 (1) R79-R87 (1976) ou linhagem recombinante (EP 263515, EP 332234) e a produção de arginina utilizando linhagem resistente a análogo de L-arginina (Agr. Biol. Chem. (1972) 36: 1675-1684, Patentes Japonesas Publicadas nQ 37235/79 e 150381/82) foram descritas. Fenilalanina também foi produzida por meio de fermentação em Escherichia coli linhagens ATCC 31882, 31883 e 31884. A produção de ácido glutâmico em bactéria corineforme recombinante é descrita em US 6.962.805. A produção de treonina por linhagem mutante de E. coli é descrita em Okamoto e Ikeda (2000), J. Biosci. Bioeng. 89: 87-79. Metionina foi produzida por linhagem mutante de Corynebacterium lilium (Kumar et ai (2005), Bioresour. Technol. 96: 287-294).

[066] Peptídeos, enzimas e outras proteínas úteis também foram elaborados por biocatalisadores (por exemplo em US 6.861.237, US 6.777.207, US 6.228.630).

[067] O tratamento prévio e sacarificação de biomassa em açúcares fermentáveis, seguido por fermentação dos açúcares em substância alvo, é exemplificado no Exemplo 9 do presente para a produção de etanol a partir de espigas de milho previamente tratadas utilizando Z. mobilis como biocatalisador para a fermentação de açúcares em etanol. O método do presente pode também ser utilizado para a produção de 1,3-propanodiol a partir de biomassa. A biomassa sofre tratamento prévio e sacarificação de acordo com o método do presente; após (ou durante) a sacarificação, E. coli é utilizado para produzir 1,3-propanodiol conforme descrito no Exemplo 10 do presente.

[068] Substâncias alvo produzidas em fermentação por biocatalisadores podem ser recuperadas utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Os produtos podem ser separados de outros componentes de fermentação por meio de centrifugação, filtragem, microfiltragem e nanofiltragem. Os produtos podem ser extraídos por meio de troca de íons, extração com solvente ou eletrodiálise. Agentes floculantes podem ser utilizados para auxiliar na separação de produtos. Como exemplo específico, 1-butanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação utilizando métodos conhecidos na técnica para fermentações de ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639-648 (1998), Groot et ai, Process. Biochem. 27: 61-75 (1992) e suas referências). Sólidos, por exemplo, podem ser removidos do meio de fermentação por meio de centrifugação, filtragem, decantação ou similares. Em seguida, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentação utilizando métodos tais como destilação, destilação azeotrópica, extração de líquidos em líquidos, adsorção, extração de gás, evaporação de membrana ou pervaporação. A purificação de 1,3-propanodiol a partir de meios de fermentação pode ser realizada, por exemplo, submetendo-se a mistura de reação a extração com solvente orgânico, destilação e cromatografia de coluna (US 5.356.812). Solvente orgânico particularmente bom para este processo é ciclohexano (US 5.008.473). Aminoácidos podem ser recolhidos do meio de fermentação por meio de métodos tais como adsorção de resina de troca de íons e/ou cristalização.

Exemplos Métodos gerais e materiais: [069] São utilizadas as abreviações a seguir: [070] “HPLC” é Cromatografia de Líquidos de Alto Desempenho, ”C” é centígrado, “kPa” é quiloPascal, “m” é metro, “mm” é milímetro, “kW” é quilowatt, “μιη” é micrômetro, “μΙ” é microlitro, “ml” é mililitro, “I” é litro, “min” é minuto, “mM” é milimolar, “cm” é centímetro, “g” é grama, “kg” é quilograma, “wt” é peso, “h” é hora, “temp.” ou “T" é temperatura, "teór." é teórico, "pretreat” é tratamento prévio, "DWB" é peso seco de biomassa.

[071] Ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida, extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato de potássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidos por meio da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reatores de tratamento prévio: [072] Reator Zipperclave®: [073] O reator Zipperclave® de quatro litros (Autoclave Engineers, Erie, PA) é recipiente sob pressão de bateladas equipado com balde Hastelloy® de 2,5 litros para a carga de biomassa e agitador para misturar a biomassa. O recipiente do reator é circulado por aquecedor elétrico controlado na temperatura de tratamento prévio desejada. Injeção de vapor direto também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa até a temperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento prévio desejada. Condensado de vapor formado por meio de aquecimento da placa superior do reator Zipperclave®, recipiente e fora do balde é drenado para reservatório formado entre o balde e a parede interna do reator para evitar diluição excessiva da calda previamente tratada.

Reator Jaygo: [074] O reator Jaygo é reator do tipo pás horizontais de 130 litros (cerca de 51 cm de diâmetro por 91 cm de comprimento) (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ) fabricado com liga Hastelloy® C-22. O reator é equipado com camisa de vapor capaz de aquecimento até cerca de 177 QC (862 kPa). Injeção de vapor direto também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa para a temperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento prévio desejada. Numerosas portas permitem a injeção de outros solventes e líquidos quentes.

Sistema de digestão em bateladas de reator de pistola de vapor: [075] O reator de pistola de vapor de quatro litros {Autoclave Engineers, Erie, PA) é reator de camisa de vapor que consiste de cano de Hastelloy® com comprimento de 102 mm programação 80 fechado por duas válvulas de bolas. Aquecedores elétricos adicionais são colocados sobre todas as superfícies expostas sem camisas do reator e controlados até a temperatura de ponto de ajuste de tratamento prévio, A injeção de vapor direto também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa para a temperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento prévio desejada. O fundo do reator é estreitado para 51 mm. Todo o material tratado previamente sai através de molde substituível no fundo do reator e é recolhido em saco de nylon (Hotfill®) de 0,21 m3 sustentado em tanque de ignição pesado com paredes, com camisa e resfriado.

Refinapor de disco: [076] O refinador de disco é refinador de 30,5 cm modelo Sprout Waldron (Andrítz, Inc., Muncy, PA) equipado com motor elétrico de 11 kW. O espaço entre as placas estacionárias e giratórias é variável, A velocidade do trado de alimentação também é variável, de 0 a 88 rpm. A entrada do refinador foi modificada com seis portas de injeção para permitir a introdução de vapor, água quente ou outros gases varridos e líquidos pouco à frente da placa refinadora giratória. O refinador foi equipado com placas (Durametal, Corp,, Tulatin, OR) em qualquer padrão D2A5Ü6 em Ni-Hard ou padrão 18034-A em Ni-Hard.

Tratamento prévio e reator de hidròlise enzimática (PEHRL

[077] O reator PEHR 9L (construído na NREL, Golden, CO; vide o pedido de patente norte-americano co-pendente ne CL 3447) possui recipiente de reação de aço inoxidável de 15 cm x 51 cm com lança de injeção para introdução de reagentes de processamento. A lança de injeção é conectada utilizando junta giratória a porta em cobertura sobre uma extremidade do recipiente, que possuí porta adicional para acesso ao recipiente. Quatro membranas correm pelo comprimento da parede do recipiente e são fixadas perpendícu Ia rmente à parede. As membranas e 22 cilindros de meios de atrito cerâmicos de 3,2 cm x 3,2 cm (E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH), livre flutuação no veículo, aplicação de mistura mecânica de biomassa e reagente à medida que o recipiente é girado, promovendo a assimilação de reage nte à biomassa O reator PEHR é colocado sobre Aparelho Rolante de Produção Celular Bellco (Bellco Technology, Vineland, NJ) que fornece mecanismo de rotação e o reator com aparelho rolante é abrigado em câmara com temperatura controlada que fornece calor. Pode-se aplicar vácuo e pressão ao recipiente de reação fixando-se fontes externas à porta conectada a lança na tampa. Métodos analíticos: Quantificação de celulose: [078] A quantidade de celulose em cada amostra de biomassa inicial foi determinada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, tais como ASTM E1758-01, Standard Method for the Determination of Carbohydrates by HPLC.

[079] Medição do teor de açúcar, acetamida, ácido láctico e ácido acético: [080] Açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose, arabinose e manose), acetamida, ácido láctico e ácido acético em líquido de sacarificação foram medidos por meio de HPLC (Agilent Modelo 1100, Agilent Technologies, Paio Alto, CA) utilizando colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas de guarda apropriadas. O pH da amostra foi medido e ajustado em 5-6 com ácido sulfúrico se necessário. A amostra passou em seguida através de filtro de seringa de 0,2 μιτι diretamente para ampola de HPLC. As condições de condução de HPLC foram as seguintes: Biorad Aminex HPX-87P (para carboidratos): Volume de injeção: 10 a 50 μΙ, dependendo da concentração e dos limites do detector;

Fase móvel: HPLC grau água, 0,2 μιτι filtrado e com gases retirados;

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto;

Temperatura da coluna: 80-85 -C, temperatura da coluna de guarda < 60 QC;

Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura da coluna principal;

Detector: índice de refração;

Tempo de condução: 35 minutos de coleta de dados mais quinze minutos após a condução (com possível ajuste para compostos eluentes posteriores).

Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, acetamida, ácido láctico, ácido acético e etanol): Volume de injeção: 5 a 10 μΙ, dependendo da concentração e dos limites do detector;

Fase móvel: 0,01 N ácido sulfúrico, 0,2 μιτι filtrado e seus gases retirados;

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto;

Temperatura da coluna: 55 5C;

Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura da coluna;

Detector: índice de refração;

Tempo de condução: 25 a 75 minutos de coleta de dados.

[081] Após a condução, as concentrações da amostra foram determinadas a partir de curvas padrão para cada um dos compostos.

Exemplo 1 Tratamento Prévío de Forragem em Alta Concentração de Biomassa, Alta Temperatura e Comparação de Concentrações de Amônia [082] O recipiente do reator Zipperclave® e a placa superior foram previamente aquecidos à temperatura de tratamento prévio alvo antes da introdução da carga de biomassa por meio de ciclização de vapor no reator e ventilação por várias vezes. O condensado formado durante o aquecimento prévio foi removido por meio de aspiração a vácuo antes do tratamento prévio. O balde de Hastelloy® foi carregado com forragem moída a 0,635 cm (100 g, com base em peso seco) e inserido no reator previamente aquecido. O agitador do reator foi ajustado em 20 rpm mediante aplicação de vácuo (cerca de 85 kPa) ao interior do recipiente e carga de bíomiassa. Solução de hidróxido de amônio com a resistência necessária para gerar peso seco de concentração de biomassa de 30% em peso com relação ao peso da mistura de biomassa e amônia aquosa, bem como a concentração de amônia desejada relacionada na Tabela 1, foi injetada perto do fundo do recipiente com bocal do tipo pulverização. Amostras de teste possuíam concentração final de amônia de 12% com relação ao peso seco de biomassa, enquanto amostras com concentração final de amônia de 35% com relação ao peso seco de biomassa foram utilizadas como comparação. Quando a temperatura da carga de biomassa atingiu 50 -C, introduziu-se vapor perto do fundo do reator para fluidificar e elevar a temperatura da carga de biomassa para 140 SC ou 170 9C, Ao final do tratamento prévio, o reator foi despressurizado por meio de condensador de ventilação e aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) por três minutos para reduzir a temperatura e remover amônia adicional da calda previamente tratada antes da abertura do reator e recuperação da biomassa previamente tratada.

[083] Calda de tratamento prévio integral não lavada contendo 0,5 g de celulose (com base na composição de estoque de alimentação inicial) foi adicionada em volume final de 50 ml a frasco de agitação de 125 mL Adicionou-se ácido acético (10 a 100 μΙ) para titular o pH da biomassa previamente tratada com amônia em 5,0 antes da adição de enzima devido à sensibilidade das enzimas a ambientes com alto pH. O pH foi controlado em 5,0 durante a sacarificaçâo por meio da adição de 50 mM de tampão de citrato e a temperatura foi mantida a 50 -C, Celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) foi adicionada à concentração relacionada para cada amostra na Tabela 1. O teor de açúcar do líquido de sacarificaçâo resultante foi determinado após 96 horas de sacarificaçâo de acordo com o protocolo de medição de açúcar descrito nos Métodos Gerais. A liberação de açúcar após 96 horas é exibida na Tabela 2. Controles para este experimento foram 1) forragem de milho não tratada, que gerou 23% do rendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg de celulase por grama de celulose) e 2) forragem de milho previamente tratada com vapor (140 SC), que gerou 40% do rendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg de celulase por grama de celulose); xilose não foi medida para os controles.

Tabela 1 Liberação de Açúcar de Forragem de Milho Previamente Tratada com Sacarificaçâo por 96 Horas [084] DWB: peso seco de biomassa.

[085] Estes resultados indicam que tratamento prévio utilizando amônia a 12% por quinze minutos a 140 eC, seguido por sacarificação, libera mais glicose e xiiose que ao utilizar-se tratamento prévio com 35% de amônia por cinco minutos a 140 SC. Desta forma, as vantagens do uso de amônia inferior podem ser incorporadas por pequeno aumento do tempo de tratamento prévio.

Exemplo 2 Tratamento Prévio em Alta Concentração oe Biomassa, Baixa Temperatura e Amônia Muito Baixa [086] O reator Jaygo foi carregado com forragem moída a 0,635 cm (13 kg, base de peso seco). Aplicou-se vácuo (67,7 kPa) ao recipiente e injetou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 6,2 g de amônia por 100 g de peso seco de biomassa e peso seco de concentração de biomassas 30% em peso com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa. O vácuo foi liberado e aplicou-se vapor à camisa para aquecer a forragem a 100 5C. A forragem embebida foi mantida sob uma temperatura por oito horas com mistura constante a 32 rpm e mantida em seguida em resfriamento por uma noite com mistura contínua da calda resultante.

[087] Calda de tratamento prévio não lavada integral contendo 0,5 g de celulose (com base na composição de estoque de alimentação inicial) foi adicionada em volume final de 50 ml a frasco de agitação de 125 ml. Adicionou-se ácido acético (10 a 100 μΙ), se necessário, para titular o pH da biomassa previamente tratada com amônia em 5,0 antes da adição de enzimas devido à sensibilidade das enzimas a ambientes com alto pH. O pH foi controlado em 5,0 durante a sacarificação por meio da adição de 50 mM de tampão de citrato e a temperatura foi mantida a 50 -C, Celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) foi adicionada a 56 mg/g de celulose. O teor de açúcar do líquido de sacarificação resultante foi determinado após 96 horas de sacarificação de acordo com o protocolo de medição de açúcar descrito nos Métodos Gerais e é exibido na Tabela 2.

Tabela 2 Liberação de Acúcar de Forragem de Milho Previamente tratada Após 96 ________________________________Horas_______________________________ [088] Os resultados indicam que estas concentrações de amônia muito baixas e condições de tratamento prévio sob baixa temperatura (por período de oito horas) são tão eficazes quanto o uso de 12% de amônia a 140 SC por quinze minutos.

Exemplo 3 Tratamento Prévio de Espigas com Alta Concentração de Biomassa. Baixa Temperatura e Concentração de Amônia Muito Baixa Seguido por Sacarificação com Alta Concentração de Biomassa [089] Espigas de milho inteiras ou fraturadas (cerca de 13 kg, com base em peso seco) foram carregadas no reator Jaygo. Espigas foram fraturadas por meio de passagem através do refinador de disco (General Methods) equipado com placas 02975. As espigas fraturadas resultantes foram passadas através de peneira de 1,27 cm. Quaisquer pedaços retidos passaram novamente através do refinador de disco com espaço menor de 0,5 cm. Aplicou-se vácuo ao reator e injetou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerar a concentração de amônia final desejada (2% ou 6%) e concentração de biomassa seca (30% ou 40%), conforme fornecido na Tabela 3. O vácuo foi liberado e aplicou-se vapor à camisa para aquecer as espigas mediante embebimento até uma temperatura de 93 QC para a amostra de espiga inteira e 85 QC para amostras de espiga fraturadas. Curtos períodos de velocidade de agitador mais alta (até 96 rpm) foram aplicados em esforço para aumentar a velocidade de aquecimento. As espigas embebidas foram mantidas sob uma temperatura por quatro ou oito horas com mistura constante a 32 rpm e mantidas em resfriamento em seguida por uma noite com mistura contínua.

[090] Antes da remoção da biomassa previamente tratada do reator, o reator foi colocado a vácuo a 90 QC para extrair amônia da biomassa previamente tratada. Antes da sacarificação, o pH da biomassa de espiga previamente tratada foi ajustado em 5,5 com ácido cítrico sólido. Cerca de 10 kg de espiga inteira previamente tratada foram sacarificados no reator Jaygo a 50 -C. Cerca de 1400 g de espiga fraturada previamente tratada foram adicionados ao reator PEHR, junto com 22 cilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm x comprimento de 3,2 cm; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) para sacarificação. Mistura de enzimas de 28 mg de Spezyme CP®/g de celulose em forragem não tratada mais 28 mg/g de celulose Multifect Xylanase® foi utilizada para cada reação de sacarificação. O peso seco final de concentração de biomassa no início de cada sacarificação foi de 30% com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada. O reator PEHR girou axialmente a 19 rpm, mantendo, ao mesmo tempo, uma temperatura de 50 eC. O teor de açúcar do líquido de sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo de medição de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação de açúcar após 96 horas é exibida na Tabela 3.

Tabela 3 Liberação de Acúcar de Espigas de Milho Tratadas Previamente Utilizando Alta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante a Sacaríficacão [091] DWB: peso seco de biomassa (o percentual é calculado com relação ao peso total da mistura).

Exemplo 4 Tratamento Prévio de Espigas com Alta Concentração de Biomassa, Alta Temperatura e Concentração de Amônia Murro Baixa Seguido por Sacaríficacão com Alta Concentração de Biomassa [092] Espigas de milho fraturadas (13 kg, base seca) foram carregadas no reator Jaygo. Após puxar vácuo sobre o reator, solução de hidróxido de amônio com a resistência adequada para gerar 2% de amônia e 30% de peso seco de concentração de biomassa foi bombeada no reator com mistura a 32 rpm à temperatura ambiente. O conteúdo do reator foi aquecido em seguida a 95 SC utilizando vapor de camisa sob baixa pressão. Após o reator atingir 95 -C, injeção de vapor direto foi utilizada para aquecer o conteúdo do reator a 145 -C. Quando o reator atingiu 145 SC, o conteúdo do reator foi mantido naquela temperatura por vinte minutos utilizando vapor de camisa e alguma injeção de vapor direto. Após vinte minutos, vácuo foi puxado sobre a ventilação para o reator e o motor retalhador foi ligado por cinco minutos. Após uma hora, a água de resfriamento para a camisa foi ligada. O conteúdo do reator Jaygo foi resfriado a 33 SC até 37 eG; em seguida, utilizou-se C02 para pressurizar o reator a 138 kPa. A atmosfera de C02 pressurizado foi mantida por trinta minutos. A temperatura final do conteúdo do reator foi de 27 -C a 31 eC. O pH da biomassa em bebida/pre viam ente tratada foi de cerca de 7,5.

[093] Biomassa previamente tratada foi removida do reator Jaygo e transferida para o reator PEHR para sacarificação em peso seco final de concentração de biomassa no início para sacarificação de 30% com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada, O pH foi ajustado em seguida em 5,5 com ácido cítrico sólido e o material digerido com 28 mg de Spezyme CP®/g de celulose e 28 mg de Multifect Xylanase@/g de celulose em espiga não tratada conforme descrito no Exemplo 3. O teor de açúcar do líquido de sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo de medição de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação de açúcar após 96 horas de digestão é exibida na Tabela 4.

Tabela 4 Liberação de Acúcar de Espigas de Milho Tratadas P revi amente Utilizando Alta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante a Sacarificação Exemplo 5 Tratamento Prévio com Adição de Plastificante [094] Espiga inteira foi previamente tratada conforme descrito no Exemplo 3 em peso seco de concentração de biomassa de cerca de 30% com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa, 2% em peso de amônia com relação ao peso seco de biomassa, 100 eC, por oito horas no reator Jaygo com 3% em peso com relação ao peso seco de biomassa de glicerol adicionada para agir como plastificante. Após o tratamento prévio, o pH do material resultante foi ajustado em 5 com ácido cítrico sólido. Espiga previamente tratada foi digerida em seguida conforme descrito no Exemplo 3. Utilizou-se mistura de enzimas de 28 mg de Spezyme CP®/g de celulose em forragem não tratada mais 28 mg/g de celulose Multifect Xylanase® em espiga não tratada. Após 96 horas de digestão, a concentração de glicose foi de 92,3 g/l e a concentração de xilose foi de 54,4 g/l.

Exemplo 6 refino de Disco de Biomassa Previamente tratada [095] Forragem foi previamente tratada da forma descrita no Exemplo 1, com amostras diferentes que possuem baixas concentrações de amônia (12%) ou amônia comparativa (35%) e temperatura, tempo e condições de enzima conforme relacionado na Tabela 5. Espiga inteira foi previamente tratada conforme descrito no Exemplo 3 com diferentes amostras que contêm amônia muito baixa (3% ou 6%) e outras condições conforme relacionado na Tabela 5. Após o tratamento prévio, as amostras passaram através de refinador de disco Sprout Waldron O espaço entre a placa estacionária e a placa giratória foi definido em 0,254 mm e a velocidade do trado de alimentação em 7 rpm. Material refinado foi sacarificado conforme descrito no Exemplo 2 e o teor de açúcar do líquido de sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo de medição de açúcar nos Métodos Gerais, Os resultados da sacarificação após 96 horas são exibidos na Tabela 5, Os resultados demonstraram que, com refino de disco antes da sacarificação, atingiu-se melhor digestibilidade ou o uso de concentrações mais baixas de enzimas foi eficaz.

Tabelas DlGESTiBILIPAPE DE MATERIAL TRATADO PREVIAMENTE QUE FOl REFINADO COM

Disco Antes da Sacarificação Exemplo 7 Tratamemto de Biomassa Previamente tratada com Pistola de Vapor [096] Forragem foi previamente tratada conforme descrito no Exemplo 1 utilizando condições de 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total de biomassa e mistura de amônia aquosa, 6% em peso de amônia com relação a DWB, 100 fiC, oito horas, no reator Jaygo. Espiga foi previamente tratada conforme descrito no Exemplo 3 utilizando condições de 40% em peso seco de biomassa com relação ao peso total de mistura de biomassa e amônia aquosa, 6% em peso de amônia com relação a DWB, 93 SC, oito horas, no reator Jaygo, Amostras de cada biomassa previamente tratada foram carregadas separadamente em reator de pistola de vapor de quatro litros. Material tratado previamente foi submetido a 170 SC por cinco minutos, ou 140 9C por vinte minutos antes da liberação através de molde. O material resultante foi sacarificado conforme descrito no Exemplo 2, Os resultados são fornecidos na Tabela 6 abaixo. Os resultados demonstraram que o tratamento com pistola de vapor antes da sacarificação aumentou a liberação de glicose.

Tabela 6 PlGESTIBILIDADE DE MATERIAL TRATADO PREVIAMENTE APÓS TRATAMENTO COM _______ Pistola de Vapor __________ Exemplo 8 Modelo de Tratamento Prévio com Reciclagem de Amônia [097] Vantagens da reciclagem de amônia foram examinadas com modelos Aspen (Aspen Technologies, Cambridge, MA, versão 12.1) para dois esquemas de tratamento prévio: baixa temperatura (85 -C), longo tempo de permanência (quatro horas) e alta temperatura (130 ÔC), curto tempo de permanência (vinte minutos). Em cada modelo, houve uma série de três tanques de ignição operando sob pressões sucessivamente mais baixas após o reator previamente determinado para fornecer meios de reciclagem de amônia. À medida que o fluxo de alimentação entrava em cada tanque, ele se dividia em frações de vapor e líquido devido à redução da pressão. A fração de vapor foi reciclada para tratamento prévio, enquanto a fração líquida seguiu para a fase seguinte no processo. Considerando 2% em peso de amônia com relação a DWB e cerca de 27% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa em tratamento prévio, amônia fornecida fresca e dos fluxos de reciclagem para cada processo é exibida na Tabela 7. Nos dois modelos, os tanques de ignição operaram de forma similar, de forma que a reciclagem de amônia foi similar. Para os dois cenários, mais da metade da amônia necessária foi fornecida por meio de reciclagem, reduzindo a necessidade e o custo da amônia fresca.

Tabela 7 Reciclagem de Amônia em Tratamento Prévio ____________ Resultados do Modelo de Aspen_________________________ Exemplo 9 Produção de Et amo l a Partir de Biomassa de Milho Previamente tratada com Baixa Amônia e Sacarificada e Comparação com Forragem Previamente tratada com Alta Amônia e Sacarificada [098] Hidrolisado de espiga foi gerado por meio de tratamento prévio de espigas inteiras no reator Jaygo por oito horas a 93 -C com 6% em peso de amônia com relação ao peso seco de biomassa em peso seco de concentração de biomassa de 40% em peso com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa, conforme descrito no Exemplo 3. Após o tratamento prévio, amônia foi removida por meio de aquecimento do reator a 90 °C a vácuo. O pH da biomassa previamente tratada foi ajustado em seguida em 5 com ácido sulfúríco. A biomassa previamente tratada foi sacarificada no reator Jaygo a 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa tratada previamente com 28 mg/g de celulase Spezyme® de celulose e 28 mg/g de xilanase Multifect® de celulose por 168 horas a 50 SC e pH 5. O hidrolisado resultante foi utilizado para fermentação de Zymomonas mobilis 8b em fermentadores Sixfors (INFORS AG, Suíça). Zymomonas mobilis 8b é linhagem de Zymomonas mobilis que foi geneticamente elaborada para promover a produção de etanol aprimorada sobre o tipo selvagem e é descrita no Pedido de Patente Norte-Americano publicado ns 2003/0162271 A1 (Exemplos IV, VI e XII). O hidrolisado de espiga compreendeu 78 g/l de glicose, 51 g/l de xilose, 6 g/l de acetamida e 7 g/l de ácido acético. O hidrolisado de espiga foi utilizado a 40% e 80% de resistência, em que o saldo do meio é meio aquoso concentrado que consiste de extrato de levedura e KH2P04 em quantidades tais que as suas concentrações na calda final fossem de cerca de 5 g/l e 2 g/l, respectivamente. Além disso, na calda de hidrolisado a 40%, glicose e xilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer as suas concentrações para os mesmos níveis da calda de hidrolisado a 80%. A fermentação foi conduzida a 37 -C. A agitação nos fermentadores foi de 100 rpm e o pH foi mantido em 5,5 por meio da adição de 2 N KOH. Os resultados são exibidos na Tabela 8. Açúcares e etanol foram analisados conforme descrito nos Métodos Gerais.

[099] Para comparação, hidrolisado de forragem foi gerado por meio do tratamento prévio de forragem com 35% em peso de amônia com relação ao peso seco de biomassa em peso seco de concentração de biomassa de cerca de 30% em peso com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa a 170 QC por cinco minutos no reator Zipperclave®, conforme descrito no Exemplo 1. A biomassa previamente tratada foi digerida enzimaticamente a 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada com 224 mg/g de celulase Spezyme CP® de celulose a 50 eC e pH 5 para gerar hidrolisado com alta concentração de açúcar para testes de fermentação. O hidrolisado resultante compreendeu 88 g/l de glicose, 52 g/l de xilose, 9 g/l de ácido acético e 15 g/l de ácido láctico. Para a produção de etanol, Zymomonas mobilis 8b foi fermentado sobre calda de hidrolisado a 40% ou 80% (v/v). O volume restante foi composto de meio aquoso concentrado que consiste de extrato de levedura, KH2P04 e tampão MES em quantidades tais que as suas concentrações na calda final seriam de cerca de 10 g/l, 2 g/l e 0,1 M, respectivamente. Além disso, na calda de hidrolisado a 40%, glicose e xilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer as suas concentrações para os mesmos níveis da calda de hidrolisado a 80%. A fermentação foi realizada a 30 5C e pH 6 em frascos de agitação de 25 ml com volume de trabalho de 20 ml. A agitação foi mantida a 150 rpm. Análise foi realizada para a amostra de fermentação de hidrolisado de espiga e os resultados são fornecidos na Tabela 8.

Tabela 8 Utilização oe Acúcar e Rendimentos de Etanol em Fermentação Sobre Espiga e Hidrolisados de Forragem [0100] Estes resultados demonstraram que a fermentação para produzir etanol a partir de hidrolisado de espiga previamente tratado com baixa amônia foi mais eficiente que de forragem previa mente tratada com alta amônía.

Exemplo 10 Produção de 1 .3-Propanooiol a Partir de Biomassa de Espiga Sacarificada e Pr e vi amente Tratada com Muito Baixa Amônia [0101] Hidrolisado gerado a partir do tratamento prévio e sacarificação de espiga foi fermentado para produzir 1,3-propanodíol. Hidrolisado foi gerado por meio de tratamento prévio de pedaços de espiga no reator de pistola de vapor. Primeira biomassa de espiga foi carregada no reator PEHR (descrito em Métodos Gerais), aplicou-se vácuo e solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada para gerar concentração de amônia de 4 g de amônia/100 g de biomassa em peso seco e peso seco de concentração de biomassa de 30 g de peso seco de biomassa/100 g de mistura de biomassa e amônia aquosa total. O recipiente do reator carregado com amônia e espiga foi girado a 4 SC por trinta minutos. O conteúdo foi transferido para o reator de pistola de vapor (descrito em Métodos Gerais}, a temperatura aumentou para 145 QC e a mistura foi mantida sob uma temperatura por vinte minutos. O material da pistola de vapor foi descarregado em tanque de ignição e manteve-se vácuo sobre o tanque de ignição para auxiliar na remoção de amônia. Após o ajuste do pH, a biomassa previamente tratada foi sacarificada a 30 g de peso seco de biomassa/100 g de mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP® de celulose e 10,1 mg de proteína ativa por grama de associação de enzimas de celulose que consiste de β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase por 72 horas a 50 QC e pH 5,5. O hidrolisado resultante foi utilizado como fonte de açúcar fermentável para conversão em 1,3-propanodíol por E. coli recombinante linhagem RJ8n pBE93-k1. A construção de linhagem RJ8n pBE93-k1 é descrita em detalhes no Pedido PCT nQ WO 2004/018645 (Exemplo 7) e é derivado da linhagem RJ8n, descrita em US 6.358.716. O hidrolisado foi utilizado a 10% com o saldo sendo meio aquoso que consiste de 7,5 g/l de KH2P04, 2,0 g/l de ácido cítrico*H20, 4,0 ml/l de 28% NH40H, 3,0 g/l de (NH4)2S04, 2,0 g/l de MgS04*7H20, 0,2 g/l de CaCI2*2H20, 0,33 g/l de citrato de amônio férrico, 0,5 g/l de extrato de levedura, 0,1 mg/l de vitamina B12, 1,0 mg/l de FeS04*7H20, 1 mg/l de ZnS04*7H20, 0,1 g/l de CuS04*5H20, 1 mg/l de CoCI2*6H20, 0,3 mg/l de MnS04*7H20, 0,1 g/l de H3B04, 0,10 g/l de NaMo04*2H20, 10 mg/l de NaCI com o pH final ajustado em 6,8. Os cultivos foram iniciados a partir de estoques congelados (15% glicerol como crioprotetor) em 50 ml de meio em frasco com membrana de 250 ml. Os cultivos foram incubados a 34 5C e 300 rpm de agitação por 24 horas. A quantidade de 1,3-propanodiol produzida foi medida por meio de HPLC sob as condições a seguir: Coluna: Showdex SH1011;

Volume de amostra: 20 μΙ;

Fase móvel: 0,01 N H2SO4;

Velocidade de fluxo: 0,5 ml/min;

Temperatura da coluna: 50 QC;

Detector: conjunto de fotodiodos Waters 996;

Temperatura do detector: 40 QC;

Tempo de condução: 40 minutos.

[0102] Os resultados são exibidos na Tabela 9 abaixo. Produtos de fermentação de glicose pela linhagem RJ8n pBE93-k1 de E. coli incluem glicerol (metabólito intermediário) e 1,3-propanodiol. Foram conduzidos experimentos em frascos duplicados e testados após 24 horas. Neste sistema, glicose no hidrolisado foi convertida em glicerol e 1,3-propanodiol.

Tabela 9 Utilização de Substrato e Formação de Prodüto por Meio de Fermentação com E. cou Exemplo 11 Formação de Acetamida Durante o Tratamento Prévio [0103] Amostras derivadas de espigas tratadas previamente de acordo com os processos descritos no Exemplo 3 e no Exemplo 4 foram analisadas para determinar o destino dos grupos acetila na biomassa. Os líquidos do tratamento prévio (mistura de tratamento prévio com sólidos insolúveis removidos) foram testados para determinar o teor de ácido acético e acetamida conforme segue. O pH de cada amostra foi ajustado em cerca de 3 com H2S04 (72%). Para a medição de acetamida, a amostra passou através de filtro de 0,2 pm e foi analisada por meio de HPLC de acordo com as condições relacionadas abaixo. Para medição de acetato total (inclui acetato presente na forma de ácido acético e acetamida), a amostra acidifiçada foi colocada em autoclave por uma hora a 121 -C; acetamida foi convertida quantitativamente em ácido acético durante esta etapa. Após o autoclave, a amostra foi mantida em resfriamento. A amostra foi passada em seguida através de filtro de 0,2 pm para recipiente de amostra e analisada de acordo com as condições relacionadas abaixo. As concentrações de ácido acético e acetamida foram determinadas a partir de curvas padrão geradas para cada um.

[0104] Fase móvel: 0,01 N H2S04, 0,2 pm filtrado e com gases retirados.

[0105] Velocidade de fluxo: 0,6 ml/min.

[0106] Temperatura da coluna: 55 a 65 SG.

[0107] Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura da coluna.

[0108] Detector: índice de refração.

[0109] Tempo de condução: 60 minutos.

[0110] Coluna: coluna Biorad Aminex HPX-87H com coluna de guarda correspondente.

[0111] Os resultados das três condições de tratamento prévio diferentes testadas são exibidos na Tabela 10. Em cada caso, todos os grupos acetila foram solubilizados em ácido acético ou acetamida.

Tabela 10 Conversão de Grupos Acetila em Biqmassa em Acetamida Durante o Tratamento Prévio [0112] DWB, peso seco de biomassa (o percentual é calculado com relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa).

[0113] Utilizando concentração de amônia de 6%, cerca da metade dos grupos acetila foi convertida em acetamida, que não é inibidora para o crescimento de biocatalisador conforme exibido no Exemplo 12, Exemplo 12 Efeito de Acetamida e Ácido Acético Sobre o Crescimento de Zymomonas [0114] Para testar a toxicidade de acetamida e ácido acético, Z. mobilis linhagem 8b (descrita no Exemplo 9) foi cultivado em meio de fermentação sob pH 6,0 com e sem acetamida ou ácido acético. O meio de fermentação era composto de 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2P04, 70 g/l de glicose, 40 g/l de xilose e 0,1 M tampão MES. Z. mobilis 8b foi cultivado em frascos de agitação Erlenmeyer com membrana de 25 ml girando a 150 rpm a 30 SC em meio não suplementado (controle), meio suplementado com 6 g/l de acetamida ou meio suplementado com 7,2 g/l de ácido acético. Conforme exibido na Figura 1, a presença de acetamida não apresentou influência sobre a velocidade de crescimento ou densidade final de Z. mobilis, enquanto a presença de ácido acético resultou em redução da velocidade de crescimento e rendimento celular mais baixo (conforme medido pela massa de células secas).

Exemplo 13 Tratamento Prévio de Bagaço em Alta Concentração de Biomassa. Alta Temperatura e Amônia Murro Baixa e Sacarificacão em Alta e Baixa Concentração [0115] O reator PEHR (descrito em Métodos Gerais), sem meios de atrito, foi carregado com bagaço moído a 1,27 cm (370 g, base de peso seco). Este bagaço de cana de açúcar foi o Material de Referência NIST RM8491, a partir do clone de cana de açúcar H65-7052, obtido originalmente por meio da Associação de Plantadores de Açúcar do Havaí, subestação de Kunía, Oahu, Hl. Ele foi moído em moinho Wiley para passar através de tela de 2 mm, com os finos (+74 mesh) removidos. O recipiente do reator PEHR foi resfriado a 4 eC por meio de rotação em contato com gelo sobre a superfície externa. Aplicou-se vácuo ao recipiente do reator e solução diluída de hidróxido de amônio, que foi resfriada previamente em quarto frio a 4 9C e passada através de tubulação imersa em banho de água com gelo, foi injetada para gerar concentração de amônia de 4 g/100 g de peso seco de biomassa e peso seco de concentração de biomassa de 45 g/100 g de mistura de biomassa e amônia aquosa total. O recipiente do reator carregado com amônia e bagaço foi resfriado a 4 ?C por meio da aplicação de gelo à superfície do recipiente de reator giratório e girado a 4 QC por trinta minutos. Nesse momento, o conteúdo foi transferido para o reator de pistola de vapor que é descrito nos Métodos Gerais. Após o carregamento do reator de pistola de vapor com a mistura de bagaço e amônia, a temperatura aumentou para 145 9C e a mistura foi mantida nessa temperatura por vinte minutos. Ao final do tempo de tratamento prévio, o bagaço foi descarregado do reator de pistola de vapor através de molde circular de 2,54 cm em tanque de ignição. Amostra de bagaço previamente tratado foi sacarificada em seguida em frasco de agitação e outra amostra (cerca de 163 g de peso seco) foi sacarificada no reator PEHR. A sacarificação do frasco de agitação foi conduzida a 5% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada, enquanto a sacarificação do reator PEHR foi conduzida a 30% de peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada. A temperatura foi mantida em 50 QC.

[0116] Para a sacarificação do reator PEHR, cerca de 476 g (cerca de 136 g de peso seco) de biomassa previamente tratada e 22 cilindros de atrito cerâmicos foram adicionados ao recipiente do reator. O pH foi ajustado em 5,0-5,5 com ácido cítrico sólido. O recipiente do reator foi mantido no interior de câmara incubadora controlada a 50 9C e girada axialmente a 19 rpm. Bagaço não tratado previamente também foi sacarificado a 5% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada em frasco de agitação. Todas as sacaríficações foram realizadas com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP® de celulose e 28,4 mg/g de xilanase Multifect® de celulose a 50 SC e pH 5,5 por 96 horas. Os rendimentos fornecidos na Tabela 11 abaixo são a liberação na forma de percentual de rendimento teórico.

Tabela 11 Rendimentos Após o Tratamento Prévio e Sacarificação de Bagaço ND: não determinado.

[0117] Os resultados demonstram que o tratamento prévio de bagaço com amônía muito baixa permite liberação substancial de açúcar em comparação com o controle não tratado previamente e que sacarificação em alta concentração de biomassa seca no reator PEHR é muito eficaz na liberação de açúcares.

Exemplo 14 Tratamento Prévio de Serragem de Álamo Amarelo com Alta Concentração de Biomassa. Alta Temperatura e Amônía Muito Baixa e Sacarificação em Concentração Baixa e Alta [0118) 0 reator PEHR, sem meios de atrito, foi carregado com serragem de álamo amarelo (596 gt base de peso seco; adquirido da Sawmiller, Inc., Haydenville, OH). Aplicou-se vácuo ao recipiente do reator e injetou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 6 g/100 g de peso seco de biomassa e peso seco de concentração de biomassa de 44 g/100 g de mistura total de biomassa e amônia aquosa. O recipiente do reator carregado com amônia e serragem de álamo amarelo foi trazido para 4 QC conforme descrito no Exemplo 13 e girado a 4 SC por trinta minutos. Nesse momento, o conteúdo foi transferido para o reator de pistola de vapor. Após o carregamento do reator de pistola de vapor com a mistura de álamo e amônia, a temperatura aumentou para 145 -C e a mistura foi mantida sob uma temperatura por vinte minutos. Ao final do tempo de tratamento prévio, a serragem de álamo amarelo foi descarregada do reator de pistola de vapor através de molde circular de 2,54 cm em tanque de ignição. Amostra de serragem de álamo amarelo previamente tratada foi sacarificada em seguida conforme descrito no Exemplo 13 em frasco de agitação e outra amostra foi sacarificada no reator PEHR. A sacarificação do frasco de agitação foi conduzida a 5% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação e biomassa previamente tratada (utilizando cerca de 279 g em peso seco de serragem previamente tratada) foi conduzida a 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada. Serragem de álamo amarelo não tratada previamente também foi sacarificada a 5% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamente tratada em frasco com agitação. Todas as sacarificações foram realizadas com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP® de celulose e 28,4 mg/g de xilanase Multifect® de celulose a 50 -C e pH 5,5 por 96 horas. Os rendimentos fornecidos na Tabela 12 abaixo são a liberação ou cada açúcar como percentual de rendimento teórico.

Tabela 12 Rendimentos Após o Tratamemto Prévio e Sacarificacão de Serragem de Álamo Amarelo ND: não determinado.

[0119] Os resultados demonstram que o tratamento prévio de serragem de álamo amarelo com amônia muito baixa permite liberação substancial de açúcar em comparação com o controle não tratado previamente e que a sacaríficação em peso seco alto de biomassa no reator PEHR é mais eficaz na liberação de açúcares que o frasco de agitação.

Exemplo 15 Produção de Etanol por Meio de Fermentação de Levedura Sobre Hidrousado de Biomassa de Espigas Sacarificapas e Tratadas Previamente com Amônia Murro Baixa [0120] O mesmo hidrolisado utilizado para produzir 1 s3-propanodiol no Exemplo 10 também foi utilizado para produzir etanol por meio de fermentação de levedura. Este hidrolisado foi utilizado como fonte de açúcar fermentável para conversão em etanol por Saccharomyces cerevísiae do tipo selvagem em frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado em resistência de 10% (v/v), em que o saldo é meio aquoso que consiste de 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. Levedura foi cultivada em 50 ml de meios em frasco com membrana de 250 ml. Os cultivos foram incubados a 30 -C com agitação a 250 rpm por 24 horas. A quantidade de etanol produzida foi medida por meio de HPLC conforme descrito no Exemplo 9 e os resultados de frascos duplicados encontram-se relacionados na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13 Utilização de Substrato e Formação de Produtos por Meio de Fermentação com Levedura Exemplo 16 Produção de Ácido Láctíco por Meio da Fermentação de Lactobacilos Sobre Hidrolisado e Biomassa de Espigas Sacarificadas e Previamente Tratadas com Amònia Muito baixa [0121] O mesmo hidrolisado utilizado para a produção de 1,3-propanodiol no Exemplo 10 também foi empregado para produzir ácido láctíco por meio de fermentação com Lactobacilius brevis em frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado a 10% (v/v), em que o saldo é meio aquoso que consiste de 5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 2 g/l de citrato de amônio, 5 g/l de acetato de sódio, 0,1 g/l de MgS04, 0,05 g/l de MnSÜ4 e 2 g/l de K2HPO4 e 1 g/l de Tween, Os lactobacilos foram cultivados em 50 ml de caldo em frascos com membrana de 250 ml. Cultivos duplicados foram incubados a 34 eC com agitação a 150 rpm por 24 horas. A quantidade de ácido láctíco produzida foi medida por meio de HPLC conforme descrito no Exemplo 10 e encontra-se relacionada na Tabela 14. As duas amostras do Frasco 2 são testes duplicados do mesmo cultivo.

Tabela 14 Utilização de Substrato e Formação de Produto por Meio de Fermentação COM LaCTOBACILLUS BREVfS

Exemplo 17 Tratamento Prévio de Espigas em Concentração de Biomassa Seca Mais Alta com Amónia Muito Baixa [0122] Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor de mordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordente de cerca de 0,95 cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Ire., Livingston, NJ), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 805 g de espigas fraturadas foram carregadas no reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. A atmosfera no recipiente do reator recebeu fluxo por cinco vezes com nitrogênio antes do carregamento, O reator, sem meios de atrito, foi aquecido previa mente a 75 SC antes do início do experimento, sem rotação. Quando a temperatura no interior do recipiente do reator estabilizou-se a 75 °C, o mecanismo de rolamento no incubador foi ligado e a rotação ajustada em 19 rpm. A quantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentração de amónia de 6 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa e concentração de sólidos de 50 g de peso seco de biomassa/100 g de peso seco de mistura de biomassa e amónia foi bombeada em seguida para o reator. Etanol a 1 g/100 g de peso seco de biomassa também foi adicionado à solução. A solução de amónia foi bombeada através de circuito aquecido em banho de água aquecido a cerca de 75 QC, fabricado utilizando reator Parr de dois galões. A solução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lança de injeção no recipiente do reator e pulverizada sobre as espigas fraturadas em rotação e tombamento no reator. O reator foi mantido a 75 -C por duas horas mediante rotação a 19 rpm. Ao final daquele período, aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator por trinta minutos para remover amônia e reduzir a temperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 SC. Dióxido de carbono foi injetado em seguida no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado até pressão medida de CO2 de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50 SC.

[0123] Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e foram adicionados meios de atrito. O pH do conteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio de injeção de 1 M tampão ácido cítrico sob pH 4,8 utilizando a lança de injeção, para aumentar a resistência de tampão ácido cítrico para cerca de 75 mM, mais adição de monoidrato de ácido cítrico. Nem toda a amônia foi extraída na etapa de vácuo nem neutralizada com CO2. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reator após aquecimento a 50 QC e, em seguida, permitiu-se 0 equilíbrio do conteúdo por meio de incubação do reator a 50 QC e 19 rpm por uma hora. A injeção do tampão de ácido cítrico ao girar 0 reator utilizando a lança de injeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampão sobre as partículas de milho tratado previamente. O reator foi removido do incubador, aberto e 0 pH de amostra foi determinado. Caso 0 pH fosse de mais de 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e 0 reator foi incubado com mistura a 50 QC por uma hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Ao atingir-se 0 pH desejado, 12,9 mg/g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação de enzimas de celulose que consiste de β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. O reator permaneceu no incubador a 50 eC e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio e sacaríficação, o rendimento de glicose de monômero foi de 62,0% e o rendimento de xilose de monômero foi de 31,0%. O rendimento de glicose total foi de 75,2% e xilose total foi de 80,3%.

Exemplo 18 Tratamento Prévio de Espigas em Concentração de Sólidos Mais Alta com Amônia Muito Baixa e Condições Alternadas [0124] Espigas de milho inteiras foram processadas com moinho martelo {moinho martelo de 25,4 cm, Glen Mills Inc., Clifton, NH) para passar através de tela de 1,27 cm. Cerca de 805 g de espigas fraturadas foram carregados no reator PEHR, O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. Vinte e dois cilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm x comprimento de 3,2 cm; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) também foram adicionados ao reator. O reator foi previamente aquecido a 95 9C antes do início do experimento, sem rotação. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes do início e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura no interior do recipiente do reator estabilizou-se em 95 aC, o mecanismo de rolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. A quantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 6 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa e concentração de sólidos de 50 g de peso seco de biomassa/100 g de peso total de mistura de biomassa e amônia foi bombeada em seguida para o reator. A solução de amônia foi bombeada através de circuito aquecido em banho de água fervente fabricado utilizando reator Parr de dois galões, A solução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lança de injeção no recipiente do reator e pulverizada sobre as espigas fraturadas em rotação e tombamento no reator. O reator foi mantido em 95 ÇC por duas horas enquanto gira a 19 rpm. Ao final daquele tempo, apiicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator por trinta minutos para remover amônia e reduzir a temperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 QC. Dióxido de carbono foi injetado em seguida no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado até pressão medida de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50 SC.

[0125] Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH do conteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio da injeção de 1 M tampão de ácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-se monoidrato de ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reator após aquecimento a 50 SC e, em seguida, permitiu-se que o conteúdo se equilibrasse por meio de incubação do reator a 50 aC e 19 rpm por uma hora. Injeção do tampão de ácido cítrico mediante rotação do reator utilizando a lança de injeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampão sobre as partículas de espigas previamente tratadas. O reator foi removido do incubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de mais de 5,5, agregou-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foi incubado com mistura a 50 QC por uma hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 12,9 mg/g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação de enzimas de celulose que consiste de β-glicosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. O reator permaneceu no incubador a 50 -C e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de 50,7% e o rendimento de xilose de monômero foi de 35,7%. Os rendimentos totais de glicose e xilose foram de 71,7% e 89,8%, respectivamente.

Exemplo 19 Tratamento Prévio de Espigas com Amônia Muito Baixa e Base Adicional [0126] Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor de mordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordentes de cerca de 0,95 cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 460 g de espigas fraturadas foram carregadas no reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. O reator foi aquecido previamente a 95 SC antes do início do experimento, sem rotação. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes do início e o recipiente foi lacrado. Quando a temperatura no interior do recipiente se reestabilizou em 95 SC, o mecanismo de rolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 3,2 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa e NaOH para gerar concentração de 1,9 g de NaOH/100 g de peso seco de biomassa, mantendo ao mesmo tempo concentração de sólidos de 30 g de peso seco de biomassa/100 g de peso total de mistura de biomassa e amônia foram bombeados em seguida no reator. A amônia e solução base adicional foi bombeada através de circuito aquecido em banho de água fervente fabricado utilizando reator Parr de dois galões. A solução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lança de injeção para o recipiente o reator e pulverizada sobre as espigas fraturadas em rotação e tombamento no reator. Após a injeção, o vácuo sobre o recipiente foi liberado até pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95 5C por trinta minutos e, em seguida, a temperatura foi reduzida para 85 5C, que foi mantida por quatro horas. Ao final desse período, aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator por trinta minutos para remover amônia e reduzir a temperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 SC. Injetou-se em seguida dióxido de carbono no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado até pressão medida de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50 SC.

[0127] Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH do conteúdo foi ajustado a cerca de 5,5 por meio de injeção de cerca de 75 ml de 1 M tampão de ácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-se monoidrato de ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reator após aquecimento a 50 QC e o conteúdo foi mantido em seguida até o equilíbrio por meio de incubação do reator a 50 eC e 19 rpm por uma hora. Injeção do tampão de ácido cítrico mediante rotação do reator utilizando a lança de injeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampão sobre as partículas de espigas previamente tratadas. O reator foi removido do incubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de mais de 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foi incubado com mistura a 50 QC por uma hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 28,4 mg/g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 28,4 mg/g de celulose Multifect foram carregados no reator. O reator permaneceu no incubador a 50 eC e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de 56,1% e o rendimento de xilose de monômero foi de 39,5%. Os rendimentos de glicose e xilose total foram de 82,8% e 84,2%, respectivamente. Estes valores são as médias de dois experimentos.

Exemplo 20 Tratamento Prévio à Temperatura Ambiente e com Amônia Muito Baixa [0128] Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor de mordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordentes de cerca de 1 cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 460 g de espigas fraturadas foram carregados no reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. Vinte e dois cilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm x comprimento de 3,2 cm; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) também foram adicionados ao reator. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes do início e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura no interior do reator reestabilizou-se à temperatura ambiente (22 a 26 QC), o mecanismo de rolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. A quantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 4 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa, mantendo ao mesmo tempo concentração de sólidos de 30 g de peso seco de biomassa/peso total de mistura de biomassa e amônia foi bombeada em seguida para o reator. A solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada por meio de lança de injeção para o recipiente do reator e pulverizada sobre as espigas fraturadas em rotação e tombamento no reator. Após a injeção, o vácuo sobre cada recipiente foi liberado até a pressão atmosférica. O reator foi mantido à temperatura ambiente (22-26 QC) por 24 horas. Ao final daquele período, aplicou-se vácuo (cerca de 81 kPa) ao recipiente de reação por trinta minutos para remover amônia. Dióxido de carbono foi injetado em seguida no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado até pressão medida de 103 kPa com CO2 e mantido sob pressão por trinta minutos à temperatura ambiente.

[0129] Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH do conteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio da adição de monoidrato de ácido cítrico após aquecimento a 50 SC e mantido em seguida em equilíbrio por meio de incubação do reator a 50 SC e 19 rpm. O reator foi removido do incubador, aberto e 0 pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de mais de 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foi incubado com mistura a 50 SC. Este processo foi repetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 12,9 mg por grama de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação de enzimas de celulose que consiste de β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. O reator permaneceu no incubador a 50 eC e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de 41,7% e o rendimento de xilose de monômero foi de 25,4%. Os rendimentos totais de glicose e xilose foram de 50,1% e 53,2%, respectivamente. Estes valores foram as médias de dois experimentos.

Reivindicações

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA ALVO, derivável de biomassa, caracterizado pelo fato de que compreende: a. contato de biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia, em que a amônia está presente em uma concentração para manter o pH alcalino da mistura de biomassa e amônia aquosa, mas em que a mencionada amônia está presente em menos de 12% em peso com relação ao peso seco de biomassa e, adicionalmente, em que o peso seco de biomassa encontra-se em alta concentração de sólidos de pelo menos 15% em peso com relação ao peso da mistura de biomassa e amônia aquosa; b. contato do produto da etapa (a) com uma associação de enzimas de sacarificação que compreende uma glicosidase hidrolisante de celulose e uma glicosidase hidrolisante de hemicelulose sob condições apropriadas para produzir açúcares fermentáveis; e c. contato do produto da etapa (b) com pelo menos um biocatalisador capaz de fermentar os açúcares para produzir a substância alvo sob condições de fermentação apropriadas,

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é selecionada a partir do grupo que consiste de ácidos, álcoois, alcanos, alquenos, aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos,

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é selecionada a partir do grupo que consiste de metanol, etanol, propanol, isopropanoi, butanol, etileno glicol, propanodiol, butanodioi, g li cerol, erítritol, xilitol, sorbitol, ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido levulínico, ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina, tirosina, metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é ácido láctico, propanodiol ou etanol.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é etanol.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do mencionado biocatalisador é selecionado a partir do grupo que consiste de bactérias, fungos filamentos e levedura.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do mencionado biocatalisador é selecionado a partir do grupo que consiste de Escherichia, Zymomonas, Candida, Saccharomyces, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium do tipo selvagem, mutante ou recombinante.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do mencionado biocatalisador é selecionado a partir do grupo que consiste de Escherichia coli, Zymomonas mobiiis, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitis recombinante.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o mencionado biocatalisador é Zymomonas mobiiis recombinante.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da mistura de biomassa e amônia aquosa é de mais de 8.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que vácuo é aplicado à biomassa antes do contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mencionado peso seco de biomassa encontra-se em alta concentração de sólidos de pelo menos 15% a 80%.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o mencionado peso seco de biomassa encontra-se em alta concentração de sólidos de pelo menos 15% a 60%.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mencionada amônia está presente em menos de 10% em peso com relação ao peso seco de biomassa.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a mencionada amônia está presente em 6% ou menos em peso com relação ao peso seco de biomassa.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste de safras de bioenergia, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólido industrial, resíduos de jardim, resíduos de madeira e florestais.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste de brotos de grama, resíduos de papel, lodo de fabricação de papel, grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamento de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutas, flores e esterco animal.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste de espigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço de cana de açúcar, serragem, brotos de grama, palha de trigo, feno, palha de cevada, palha de arroz e gramas.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste de espigas de milho, forragem de milho, serragem e bagaço de cana de açúcar.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amônia é selecionada a partir do grupo que consiste de gás amônia, hidróxido de amônio, uréia e suas combinações.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) é conduzida sob uma temperatura de 4 QC a 200 5C.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que (a) é conduzida sob uma temperatura de 75 5C a 150 QC.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que (a) é conduzida sob uma temperatura de mais de 90 5C a 150 QC.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) é conduzida por um período de tempo de até 25 horas.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que (a) é conduzida por um período de tempo de até oito horas.

27. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da amônia de (a) é removida antes de (b).

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a amônia de (a) é reciclada.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato de (b) é a um peso seco de concentração de biomassa de pelo menos 15%.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a), (b) ou (a) e (b) são repetidos pelo menos uma vez.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição, em (a), de pelo menos um plastificante, agente de amolecimento ou sua combinação.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o mencionado pelo menos um plastificante, agente de amolecimento ou sua combinação é selecionado a partir do grupo que consiste de polióis, ésteres de polióis, glicol éteres, acetamida, etanol e etanolaminas.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a aplicação de energia antes ou durante (a), antes ou durante (b), ou sua combinação.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a mencionada energia é selecionada a partir do grupo que consiste de moagem, fragmentação, quebra, retalhamento, corte, refino em disco, ultrassom e microondas.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dióxido de carbono da fermentação é utilizado para ajustar o pH da mistura de tratamento prévio antes da sacarificação.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mencionada associação de enzimas de sacarificação compreende ainda pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em glicosidases hidrolisantes de amido, peptidases, lipases, ligninases e feruloil esterases.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mencionada associação de enzimas de sacarificação compreende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β- glucosidases, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases, amilases, a-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases e isoamilases.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b) é realizado sob uma temperatura de 15 QC a 100 QC e sob um pH de 2 a 11.