ES2316963T3

ES2316963T3 - Genes delta-entotoxino y los metodos para su uso.

Info

Publication number: ES2316963T3
Application number: ES04713453T
Authority: ES
Inventors: Nadine Carozzi; Tracy Hargiss; Michael G. Koziel; Nicholas B. Duck; Brian Carr
Original assignee: Athenix Corp
Current assignee: Athenix Corp
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: EP1947184B1; CA2843744A1; EP1594966A2; NZ567340A; CN102586285A; EP1947184A2; AU2004213873A1; CN100413966C; WO2004074462A3; NZ541929A; AU2009201315B2; NZ588825A; AU2004213873B8; CA2516349A1; EP1594966B1; AU2004213873C1; WO2004074462A2; ATE503835T1; AU2004213873B2; CN101328484B

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No:1, 2 o 4; b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del nucleótido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia con la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, en donde dicha secuencia del nucleótido codifica un polipétido que tiene actividad de pesticida; c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipétido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5; d) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del nucleótido que codifica un polipétido que tiene al menos 95% de identidad del aminoácido de la secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5 en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida; y, e) un complemento de cualquiera de a)-d).

Description

Genes delta-endotoxina y los métodos para su uso.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con el campo de biología molecular. Se proporcionan genes novedosos que codifican proteínas de pesticidas. Estas proteínas y las secuencias del ácido nucleico que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones de pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Antecedentes de la invención

Bacillus thuringiensis es una espora Gram-positiva que forma las bacterias del suelo, caracterizada por su capacidad de producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertas órdenes y especies de insectos, pero son innocuas a las plantas y otros organismos no-blancos. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas del Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas se pueden utilizar como insecticidas ecológicamente aceptables para controlar las plagas de insectos o vectores de insectos agrícolas de una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas (delta-endotoxinas) Cristal (Cry) a partir del Bacillus thuringiensis tienen potente actividad insecticida contra predominantemente Lepidópteros, Dipteros, y Larvas de coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, y Órdenes de la plaga de ácaros, así como otras órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhehninthes, y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas se clasificaron originalmente como CryI a CryV basándose en primer lugar en su actividad insecticida. Las principales clases fueron Lepidoptera-específica (I), Lepidoptera y Diptera-específica (II), Coleoptera-específica (II), Diptera-específica (IV), y Nemátodo-específica (V) y (VI). Las proteínas además se clasificaron en subfamilias; proteínas relacionadas más altamente dentro de cada familia se señalaron con letras divisionales tales como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. A las proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les dieron nombres tales como Cry1C1, Cry1C2, etc. US 6177615 describe una proteína Cry1C recombinante modificada genéticamente, designada como Cry 1C*.

Recientemente se describió, una nueva nomenclatura para los genes Cry sobre la base de la homología de la secuencia de aminoácido mejor que la especificidad del insecto blanco (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre único, incorporando un rango primario (un número arábigo), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula), y un rango cuaternario (otro número arábigo). En la nueva clasificación, los números Romanos han sido intercambiados por números Arábigos en el rango primario. Las proteínas con menos del 45% de identidad de la secuencia tienen diferentes rangos primarios, y el criterio para rangos secundarios y terciarios son 78% y 95%, respectivamente. Como un ejemplo, Kalman et al., (Appl Environ Microbial. 1993, 59(4): 1131-7) describe el gen cryIC(b).

La proteína de cristal no muestra actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizado en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida se hidroliza por las proteasas en el tracto digestivo del insecto a una molécula tóxica activa. (Höfte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores del borde ciliado apical en el intestino medio de la larva blanco y se inserta en la membrana apical creando canales iónicos o poros, resultando en la muerte larval.

Las Delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencias conservados, y tres dominios estructurales conservados (ver, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste de siete hélices alfa y se involucra en la inserción de la membrana y formación del poro. El dominio II consiste de tres hojas beta organizadas en una configuración de llave Griega, y dominio III consiste de dos hojas-beta antiparalelas en formación "rollo de gelatina" (de Maagd et al. (2001) supra). Los dominios II y III se involucran en el reconocimiento y enlace del receptor, y por consiguiente se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir, existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de las delta-endotoxinas del Bacillus thuringiensis.

Resumen de la invención

Se proporcionan, las composiciones y métodos para conferir resistencia pesticida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos, y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las secuencias para polipéptidos delta-endotoxina, vectores que comprenden aquellas moléculas de ácido nucleico, y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen secuencias de polipéptido aisladas o recombinantes de la endotoxina, las composiciones que comprenden estos polipéptidos, y anticuerpos con aquellos polipéptidos. Las secuencias del nucleótido se pueden utilizar en construcciones de ADN o cassettes de expresión para la transformación y expresión en organismos, que incluyen microorganismos y plantas. Las secuencias del nucleótido o aminoácido pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para la expresión óptima en un organismo, que incluyen, pero no limitan a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos, y semillas transformadas.

En particular, la presente invención proporciona las moléculas de ácido nucleico aisladas que contienen una secuencia del nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID No:3 o 5, o una secuencia del nucleótido publicada en la SEQ ID No:1, 2 o 4, así como las variantes y los fragmentos de esta. Las secuencias del nucleótido que son complementarias con una secuencia del nucleótido de la invención, o que hibridizan a una secuencia de la invención, también se abarcan.

Se proporcionan los métodos para producir los polipéptidos de la invención, y para utilizar aquellos polipéptidos para controlar o matar un insecto lepidóptero o coleóptero.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con resistencia pesticida, específicamente bacterias y plantas. Estos organismos y composiciones derivados de ellos son deseables para propósitos agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas delta-endotoxina alteradas o mejoradas que tienen actividad de pesticida, o para detectar la presencia de proteínas delta-endotoxina o ácidos nucleicos en productos u organismos.

Descripción de figuras

Figura 1 muestra una alineación de AXMI-004 (SEQ ID No:3) con crylAc (SEQ ID No:31), cry1Ca (SEQ ID No:32), cry2Aa (SEQ ID No:34), cry3Aa1 (SEQ ID No:35), cry1Ia (SEQ ID No:33), y cry7Aa (SEQ ID No:41). Las toxinas que tienen dominios no-tóxicos C-terminal se truncaron artificialmente como se muestra. La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y los residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris. El grupo conservado 1 se encuentra de aproximadamente 174 a aproximadamente 196 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:3. El grupo conservado 2 se encuentra de aproximadamente 250 a aproximadamente 292 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:3. El grupo conservado 3 se encuentra de aproximadamente 476 a aproximadamente 521 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:3. El grupo conservado 4 se encuentra de aproximadamente 542 a aproximadamente 552 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:3. El grupo conser-
vado 5 se encuentra de aproximadamente 618 a aproximadamente 628 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:3.

Figuras 2A, B, y C muestran una alineación de AXMI-006 (SEQ ID No:7) con cry1Aa (SEQ ID No:30), cry1Ac (SEQ ID No:31), cry1Ia (SEQ ID No:33), cry3Aa1 (SEQ ID No:35), cry3Ba (SEQ ID No:36), cry 4Aa (SEQ ID No:38), cry6Aa (SEQ ID No:40), cry7Aa (SEQ ID No:41), cry8Aa (SEQ ID No:42), cry10Aa (SEQ ID No:43), cry16Aa (SEQ ID No:44), cry19Ba (SEQ ID No:45), y cry24Aa (SEQ ID No:47). Como se muestra, las toxinas que tienen dominios no-tóxicos C-terminal se truncaron artificialmente. La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris. El grupo conservado 1 se encuentra de aproximadamente 218 a aproximadamente 239 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:7. El grupo conservado 2 se encuentra de aproximadamente 300 a aproximadamente 350 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:7. El grupo conservado 3 se encuentra de aproximadamente 547 a aproximadamente 592 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:7. El grupo conservado 4 se encuentra de aproximadamente 611 a aproximadamente 621 residuos de aminoácido de la SEQ ID No: 7. El grupo conservado 5 se encuentra de aproximadamente 694 a aproximadamente 704 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:7.

Figuras 3A, B, y C muestran una alineación de AXMI-007 (SEQ ID No:9) con cry1Aa (SEQ ID No:30), crylAc (SEQ ID No:31), cry1Ia (SEQ ID No:33), cry3Aa1 (SEQ ID No:35), cry3Ba (SEQ ID No:36), cry 4Aa (SEQ ID No:38), cry6Aa (SEQ ID No:40), cry7Aa (SEQ ID No:41), cry8Aa (SEQ ID No:42), cry10Aa (SEQ ID No:43), cry16Aa (SEQ ID No:44), cry19Ba (SEQ ID No:45), y cry24Aa (SEQ ID No:47). Como se muestra, las toxinas que tienen dominios no-tóxicos C-terminales se truncaron artificialmente. La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris. El grupo conservado 1 se encuentra de aproximadamente 217 a aproximadamente 238 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:9. El grupo conservado 2 se encuentra de aproximadamente 299 a aproximadamente 347 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:9. El grupo conservado 3 se encuentra de aproximadamente 445 a aproximadamente 590 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:9. El grupo conservado 4 se encuentra de aproximadamente 609 a aproximadamente 619 residuos de aminoácido de la SEQ ID No: 9. El grupo conservado 5 se encuentra de aproximadamente 692 a aproximadamente 702 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:9.

Figuras 4A, B, y C muestran una alineación de AXMI-008 (SEQ ID No:14) con cry1Aa (SEQ ID No:30), crylAc (SEQ ID No:31), cry1Ia (SEQ ID No:33), cry2Aa (SEQ ID No:34), cry3Aa1 (SEQ ID No:35), cry3Bb (SEQ ID No:37), cry4Aa (SEQ ID No:38), cry4Ba (SEQ ID No:39), cry6Aa (SEQ ID No:40), cry7Aa (SEQ ID No:41), cry8Aa (SEQ ID No:42), cry10Aa (SEQ ID No:43), cry16Aa (SEQ ID No:44), cry19Ba (SEQ ID No:45), cry24Aa (SEQ ID No:47), cry25Aa (SEQ ID No:48), cry39Aa1 (SEQ ID No:49), y cry40Aa1 (SEQ ID No:51). Como se muestra, las toxinas que tienen dominios no-tóxicos C-terminal se truncaron artificialmente. La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris. El grupo conservado 1 se encuentra de aproximadamente 185 a aproximadamente 206 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:14. El grupo conservado 2 se encuentra de aproximadamente 276 a aproximadamente 318 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:14. El grupo conservado 3 se encuentra de aproximadamente 497 a aproximadamente 547 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:14. El grupo conservado 4 se encuentra de aproximadamente 576 a aproximadamente 586 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:14. El grupo conservado 5 se encuentra de aproximadamente 657 a aproximadamente 667 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:14.

Figuras 5A y B muestran una alineación de AXMI-008orf2 (SEQ ID No:18) con cry19Aa-orf2 (SEQ ID No:46), crybun2-orf2 (SEQ ID No:50), crybun3-orf2 (SEQ ID No:52), cry4Aa (SEQ ID No:38), y cry4Ba (SEQ ID No:39). La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y los residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris.

Figuras 6A, B, y C muestran una alineación de AXMI-009 (SEQ ID No:20) con cry1Aa (SEQ ID No:30), cry1Ac (SEQID No:31), cry1Ca (SEQ ID No:32), cry1Ia (SEQ ID No:33), cry3Aa1 (SEQ ID No:35), cry3Ba (SEQ ID No:36), cry3Bb (SEQ ID No:37), cry4Aa (SEQ ID No:38), cry6Aa (SEQ ID No:40), cry7Aa (SEQ ID No:41), cry8Aa (SEQ ID No:42), cry10Aa (SEQ ID No:43), cry16Aa (SEQ ID No:44), cry19Ba (SEQ ID No:45), cry24Aa (SEQ ID No:47), cry25Aa (SEQ ID No:48), cry40Aa1 (SEQ ID No:51). Como se muestra, las toxinas que tienen dominios no-tóxicos C-terminal se truncaron artificialmente. La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y los residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris. El grupo conservado 1 se encuentra de aproximadamente 196 a aproximadamente 217 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:20. El grupo conservado 2 se encuentra de aproximadamente 269 a aproximadamente 311 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:20. El grupo conservado 3 se encuentra de aproximadamente 514 a aproximadamente 556 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:20. El grupo conservado 4 se encuentra de aproximadamente 574 a aproximadamente 584 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:20. El grupo conservado 5 se encuentra de aproximadamente 651 a aproximadamente 661 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:20.

Figuras 7A, B, y C muestran una alineación de AXMI-014 (SEQ ID No:27) con cry1Aa (SEQ ID No:30), cry1Ac (SEQ ID No:31), cry1Ia (SEQ ID No:33), cry2Aa (SEQ ID No:34), cry3Aa1 (SEQ ID No:35), cry3Bb (SEQ ID No:37), cry4Aa (SEQ ID No:38), cry4Ba (SEQ ID No:39), cry6Aa (SEQ ID No:40), cry7Aa (SEQ ID No:41), cry8Aa (SEQ ID No:42), cry10Aa (SEQ ID No:43), cry16Aa (SEQ ID No:44), cry19Ba (SEQ ID No:45), cry24Aa (SEQ ID No:47), cry25Aa (SEQ ID No:48), cry39Aa1 (SEQ ID No:49), y cry40Aa1 (SEQ ID No:51). Como se muestra, las toxinas que tienen dominios no-tóxicos C-terminal se truncaron artificialmente. La alineación muestra los residuos de aminoácido más altamente conservados destacados en negro, y los residuos de aminoácido altamente conservados destacados en gris. El grupo conservado 1 se encuentra de aproximadamente 177 a aproximadamente 188 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:27. El grupo conservado 2 se encuentra de aproximadamente 251 a aproximadamente 293 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:27. El grupo conservado 3 se encuentra de aproximadamente 483 a aproximadamente 533 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:27. El grupo conservado 4 se encuentra de aproximadamente 552 a aproximadamente 562 residuos de aminoácido de la SEQ ID No:27.

Figura 8 muestra una fotografía de un gel de acrilamida SDS de gradiente 4-20%. Las sendas 1-4 contienen diversas concentraciones de cultivo celular Bacillus esporulado que expresa la proteína AXMI-004 de 69 kD. Las sendas 5-8 contienen diversas concentraciones de BSA. La senda 9 contiene un marcador de tamaño. Una flecha indica la banda de 69 kD.

Descripción detallada

La presente invención se señala para las composiciones y métodos que regulan la resistencia de plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Los métodos involucran la transformación de los organismos con una secuencia del nucleótido que codifica una proteína delta-endotoxina o delta-endotoxina-asociada de la invención. En particular, las secuencias del nucleótido de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad de pesticida. De esta manera, se proporcionan bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas delta-endotoxina o delta-endotoxina-asociada de Bacillus thuringiensis. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la posterior transformación en los organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes delta-endotoxina o delta-endotoxina-asociados, y para la generación de proteínas de pesticidas alteradas por métodos conocidos en el oficio, tales como intercambio del dominio o transposición de ADN. Las proteínas encuentran uso en controlar o matar poblaciones de insectos lepidópteros o coleópteros y para producir composiciones con actividad de pesticida.

Definiciones

Por "delta-endotoxina" se entiende una toxina del Bacillus thuringiensis que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, que incluyen, pero no limitan a, miembros de las órdenes Lepidoptera, Diptera, y Coleoptera. En algunos casos, las proteínas delta-endotoxina han sido aisladas a partir de otros organismos, que incluyen Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas delta-endotoxina incluyen secuencias de aminoácido deducidas de las secuencias de cuerpo entero del nucleótido revelado aquí, y secuencias de aminoácido que son más pequeñas que las secuencias de cuerpo entero, ya sea debido al uso de una sitio inicial en dirección 3' alterno, o debido a que producen una proteína más pequeña que tiene actividad de pesticida. El procedimiento puede ocurrir en el organismo de la proteína en la que se expresa, o en la plaga después de la ingestión de la proteína. Las delta-endotoxinas incluyen proteínas identificadas como cry1 a cry43, cyt1 y cyt2, y Cyt-como toxina. Existen actualmente más de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con un amplio rango de especificidad y toxicidad. Para una lista extensa, ver Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y para actualizaciones regulares ver Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," at www.biols.susx.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/index.

Los genes bacterianos, tales como los genes AXMI, a menudo poseen múltiples codones de iniciación de la metionina en proximidad con el inicio del marco de lectura abierto. Con frecuencia, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones iniciales conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones iniciales pueden incluir los codones ATG. Sin embargo, las bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón inicial, y las proteínas que inicien la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Adicionalmente, no se determina con frecuencia a priori que de estos codones se utilizan naturalmente en las bacterias. De esta manera, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternos también, puede conducir a la generación de proteínas delta-endotoxina que codifican la actividad de pesticida. Por ejemplo, un sitio inicial alterno para una proteína delta-endotoxina AXMI-004 de la invención tiene en el par de base 385 de la SEQ ID No:1. La traducción a partir de este sitio inicial alterno resulta en la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:5. Un sitio inicial alterno para una proteína delta-endotoxina AXMI-007 puede estar en el par de base 151 de la SEQ ID No:8. La traducción a partir de este sitio inicial alterno resulta en la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:11. Un sitio inicial alterno para una proteína delta-endotoxina AXMI-008 puede estar en el nucleótido 177 de la SEQ ID No:12. La traducción a partir de este sitio inicial alterno resulta en la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:16. Un sitio inicial alterno para una proteína delta-endotoxina AXMI-009 puede estar en el nucleótido 34 de la SEQ ID No:19. La traducción a partir de este sitio inicial alterno resulta en la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:22. Un sitio inicial alterno adicional para una proteína delta-endotoxina AXMI-009 puede estar en el nucleótido 64 de la SEQ ID No:1. La traducción a partir de este sitio inicial alterno resulta en la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:24. Un sitio inicial alterno para una proteína delta-endotoxina AXMI-014 puede estar en el par de base 136 de la SEQ ID No:25. La traducción a partir de este sitio inicial alterno resulta en la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:29. Las proteínas delta-endotoxina AXMI-004 se abarcan en la presente invención y se pueden utilizar en los métodos de la presente invención.

Además, pueden tener uno o más marcos de lectura abiertos adicionales en las secuencias reveladas del nucleótido que codifican una o más proteínas delta-endotoxina-asociadas. Por "proteína delta-endotoxina-asociada" se entiende una proteína codificada por una secuencia del nucleótido revelada aquí, que utiliza un marco de lectura abierto, alterno de aquel utilizado por las delta-endotoxinas de la presente invención. Las proteínas tales como estas, son conocidas en el oficio como proteínas auxiliares, secuencias estabilizantes, o proteínas delta-endotoxina-asociadas. Estas proteínas delta-endotoxina-asociadas pueden tener actividad de pesticida, o pueden ser importantes para facilitar la expresión de proteínas delta-endotoxina. Los métodos son conocidas en el oficio por medición de la actividad de pesticida y determinando los efectos de las proteínas delta-endotoxina-asociadas sobre la expresión de proteína delta-endotoxina y formación del cristal (ver, por ejemplo, Park et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 181:319-327; Ge et al. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 165:35-41; Rosso and Delecluse (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4449-4455). Estas proteínas delta-endotoxina-asociadas se pueden utilizar en los métodos revelados aquí, en combinación con las proteínas delta-endotoxina de la invención. En una modalidad, la proteína delta-endotoxina-asociada tiene la secuencia de aminoácido encontrada en la SEQ ID No:18 y se codifica por la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No:17.

Por "célula vegetal" se entiende todas las formas conocidas de la planta, que incluyen tejido sin diferencias (por ejemplo, callos), células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíz, células de floema, semillas de plantas, polen, propágulos, embriones y similares. Por "cassette de expresión de la planta" se entiende un constructor de ADN que es capaz de resultar en la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Usualmente estas contienen un promotor y una secuencia codificante. Con frecuencia, tales construcciones también contendrán una región sin traducir 3'. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte co-traduccional o pos-traduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plastidio), retículo endoplasmático, o aparato de Golgi.

Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se conoce o sospecha que resulta en transporte de un péptido co-traduccional o pos-traduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto normalmente involucra la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que cuando se traduce, resulta en una secuencia de aminoácido suficiente para activar transporte co-traduccional de la cadena peptídicas con un organelo sub-celular. De esta manera, este incluye transporte dirigido de secuencias líder y/o glicosilación por pasaje en el retículo endoplasmático, pasaje a vacuolas, plastidios que incluyen cloroplastos, mitocondrias, y similares.

Por "vector de transformación de plantas" se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Tal molécula puede consistir de uno o más cassettes de expresión de plantas, y se pueden organizar en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no-continuos para codificar todos los requisitos de las funciones cis- y trans- que actúan para la transformación de células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a un constructor de ácido nucleico diseñado para transferir entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar las secuencias o fragmentos de ADN heterólogo en una célula foránea.

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o " plantas o células o tejidos transformados establemente" se refiere a plantas que tienen secuencias del ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenas incorporados o integrados en la célula vegetal. Estas secuencias del ácido nucleico incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal sin transformar, así como aquellas que pueden ser endógenas, o están presentes en la célula vegetal sin transformar. "Heterólogas" generalmente se refieren a las secuencias del ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo, en las cuales están presentes, y han sido adicionadas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similares.

"Promotor" se refiere a un secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante en dirección 3'. El promotor junto con otras secuencias del ácido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales (también denominadas "secuencias control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Se proporcionan aquí las novedosas secuencias aisladas del nucleótido que confieren actividad de pesticida. También se proporcionan aquí, las secuencias de aminoácido para las proteínas delta-endotoxina y delta-endotoxina-asociadas. La proteína resultante a partir de la traducción de este gen permite que las células controlen o exterminen las plagas, que la ingieren.

Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o porción biológicamente activa de esta, es sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es libre de secuencias (preferiblemente una proteína que codifica secuencias) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (i.e., secuencias localizadas en los terminales 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual el ácido nucleico se deriva. Para propósitos de la invención, cuando se utiliza "aislado" para referirse a las moléculas de ácido nucleico excluye los cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico delta-endotoxina o que codifica la delta-endotoxina-asociada, puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de la secuencia del nucleótido que flanquea naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual el ácido nucleico se deriva. Una proteína delta-endotoxina o delta-endotoxina-asociada que es sustancialmente libre del material celular incluye preparaciones de proteínas que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína no-delta-endotoxina o no- delta-endotoxina-asociada (también se refiere aquí como una "proteína contaminante"). Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes
subsecciones.

Moléculas de Ácidos Nucleicos Aisladas, y Variantes y Fragmentos de estas

Un aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico aisladas, que comprenden secuencias del nucleótido que codifican las proteínas delta-endotoxina y polipéptidos o porciones biológicamente activas de estas, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para utilizar como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican la delta-endotoxina. Como se utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" se entiende que incluye moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado, utilizando los análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

Las secuencias del nucleótido, que codifican las proteínas de la presente invención incluyen, las secuencias publicadas en la SEQ ID NOS:1, 2 y 4, y los complementos de estas. Por "complemento" se entiende una secuencia del nucleótido que es suficientemente complementaria a una secuencia dada del nucleótido de tal manera que puede hibridizar a la secuencia dada del nucleótido para formar por consiguiente, un dúplex estable. Las secuencias correspondientes de aminoácido para las proteínas delta-endotoxina codificadas por estas secuencias del nucleótido, se publican en la SEQ ID NOS:3 y 5.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias del nucleótido que codifican la proteína delta-endotoxina, también se abarcan por la presente invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia del nucleótido que codifica una proteína delta-endotoxina. Un fragmento de una secuencia del nucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina, o puede ser un fragmento que se puede utilizar como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos revelados a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia del nucleótido delta-endotoxina comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia de cuerpo entero del nucleótido que codifica la proteína delta-endotoxina, revelada aquí (por ejemplo, 2190 nucleótidos para la SEQ ID No:1, 1890 para la SEQ ID No:2, etc.), dependiendo del uso pretendido.

Los fragmentos de las secuencias del nucleótido de la presente invención codificaran fragmentos de proteínas que retengan la actividad biológica de la proteína delta endotoxina y, por consiguiente, retengan la actividad de pesticida. Por "actividad de la delta-endotoxina" se entiende actividad de pesticida. Por "actividad retenida" se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de la actividad de la proteína delta-endotoxina. Los métodos para medir la actividad de pesticida son bien conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente U.S. No. 5,743,477.

Un fragmento de una secuencia del nucleótido que codifica una proteína delta-endotoxina, que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificara al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, o 650 aminoácidos continuos, o hasta el número total de aminoácidos presente en una proteína de cuerpo entero delta-endotoxina de la invención (por ejemplo, 629 aminoácidos para la SEQ ID No:3, 601 aminoácidos para la SEQ ID No:5, etc.).

Las proteínas delta-endotoxina preferidas, de la presente invención, se codifican por una secuencia del nucleótido suficientemente idéntica a las secuencias del nucleótido en SEQ ID No: 3 o 5. Por "suficientemente idéntica" se entiende un aminoácido o secuencia del nucleótido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia comparado con una secuencia referencia, utilizando uno de los programas de alineación descritos aquí, utilizando parámetros estándar. Alguien de habilidad en el oficio reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente, para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias del nucleótido, teniendo en cuenta la degeneración del codón, afinidad del aminoácido, posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (i.e., porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar utilizando técnicas similares a aquellas descritas a continuación, con o sin que se permitan huecos. En el cálculo del porcentaje de identidad, correspondencias normalmente exactas se enumeran.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no-limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado en Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN and BLASTX of Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las investigaciones de nucleótido BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias del nucleótido homólogas a las moléculas delta-endotoxina o delta-endotoxina-asociada de ácido nucleico de la invención. Las investigaciones de proteína BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácido homólogas con las moléculas de la proteína delta-endotoxina de la invención. Para obtener alineaciones incompletas para propósitos de comparación, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. De manera alterna, se puede utilizar PSI-Blast para realizar una investigación repetida que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver, Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSIBlast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Ver, www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no-limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara las secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácido o ADN, y de esta manera puede proporcionar datos aproximadamente de la conservación de la secuencia total de aminoácido. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácido, disponibles comercialmente, tales como el módulo ALIGNX del vector NTi Program Suite (Informax, Inc). Después de la alineación de secuencias de aminoácido con ClustalW, el porcentaje de identidad de aminoácido se puede evaluar. Un ejemplo no-limitante de un programa de software útil para el análisis de alineaciones ClustalW es GeneDoc^{TM}. Genedoc^{TM} (Karl Nicholas) permite la valoración de similitud e identidad del aminoácido (o ADN) entre proteínas múltiples. Otro ejemplo no-limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software alineación de la secuencia GCG (disponible de Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, California, USA). Cuando se utiliza el programa ALIGN para la comparación de las secuencias de aminoácido, una tabla de residuo en peso PAM120, una penalización de la longitud del hueco de 12, y una penalización del hueco de 4 se pueden utilizar.

La invención también abarca variantes de moléculas de ácido nucleico. "Variantes" de las secuencias del nucleótido que codifican la proteína delta-endotoxina, incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas delta-endotoxina reveladas aquí pero que difieren conservadoramente debido a la degeneración del código genético así como aquellas que son suficientemente idénticas como se discute anteriormente. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se esquematizan a continuación. La variante de las secuencias del nucleótido también incluyen derivados sintéticamente de las secuencias del nucleótido que han sido generadas, por ejemplo, utilizando mutagénesis de sitio dirigida pero que aún codifican las proteínas delta-endotoxina reveladas en la presente invención como se discute abajo. Las variantes de las proteínas abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir que siguen teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, que retienen la actividad de pesticida. Por "actividad retenida" se entiende que la variante tendrá al menos aproximadamente 30%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de la actividad de la proteína delta-endotoxina. Los métodos para medir la actividad de pesticida son bien conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 8:290-293; y Patente U.S. No. 5,743,477.

La invención también abarca variantes de moléculas de ácido nucleico. "Variantes" de las secuencias del nucleótido que codifican la delta-endotoxina- incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas delta-endotoxina reveladas aquí, pero que difieren conservadoramente debido a la degeneración del código genético así como aquellas que son suficientemente idénticas como se discute anteriormente. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se esquematizan a continuación. Las variantes de las secuencias del nucleótido también incluyen sintéticamente derivadas de las secuencias del nucleótido que han sido generadas, por ejemplo, utilizando mutagénesis de sitio dirigida pero que aún codifican las proteínas delta-endotoxina reveladas en la presente invención como se discute abajo.

El artesano experto además apreciará que los cambios se pueden introducir por mutación en las secuencias del nucleótido de la invención lo que daría lugar a cambios en la secuencia de aminoácido de las proteínas delta-endotoxina codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De esta manera, la variante de las moléculas de ácido nucleico aisladas se puede crear, introduciendo una o más sustituciones, adiciones, o deleciones del nucleótido en la correspondiente secuencia del nucleótido revelada aquí, de tal forma que una o más sustituciones, adiciones o deleciones del aminoácido se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir por técnicas estándar, tales como mutagénesis de sitio dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Dicha variante de las secuencias del nucleótido también se abarcan por la presente invención.

Por ejemplo, preferiblemente, las sustituciones de aminoácido conservadoras se pueden hacer en uno o más residuos de aminoácido pronosticados, preferiblemente no-esenciales. Un residuo de aminoácido "no-esencial" es un residuo que se puede alterar a partir de la secuencia de tipo salvaje de una proteína delta-endotoxina sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el oficio. Estos familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no-polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Por lo general, cinco regiones altamente conservadas entre las proteínas delta-endotoxina, concentradas en su mayor parte en el centro del dominio o en el empalme entre dominios (Rajamohan et al. (1998) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 60:1 -23). Los bloques de aminoácidos conservados para varias delta-endotoxinas así como secuencias consenso se pueden encontrar en Schnepf et al. (1998) Microbio. Mol. Biol. Rev. 62:775-806 and Lereclus et al. (1989) Role, Structure, and Molecular Organization of the Genes Coding for the Parasporal d-endotoxinas of Bacillus thuringiensis. In Regulation of Procaryotic Development. Issar Smit, Slepecky, R.A., Setlow, P. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 20006. Se ha propuesto que las delta-endotoxinas que tienen estas regiones conservadas pueden compartir una estructura similar, que consiste de tres dominios (Li et al. (1991) Nature 353: 815-821). El dominio I tiene la más alta similitud entre las delta-endotoxinas (Bravo (1997) J. Bacteriol. 179:2793-2801).

Las sustituciones del aminoácido se pueden hacer en regiones no-conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no se deberían hacer para residuos de aminoácido conservados, o para residuos de aminoácido que residen dentro de una fracción conservada, donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Ejemplos de residuos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en las alineaciones proporcionadas. Ejemplos de residuos que se conservan pero que pueden permitir conservadoras sustituciones de aminoácido y no obstante retienen la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que tienen solo sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en las alineaciones proporcionadas. Sin embargo, alguien de habilidad en el oficio debería entender que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menos conservadas o no-conservadas en los residuos
conservados.

De manera alterna, la variante de las secuencias del nucleótido se puede hacer introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis por saturación, y las mutantes resultantes se pueden seleccionar por la capacidad de conferir actividad delta-endotoxina para identificar mutantes que retienen actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada recombinantemente, y la actividad de la proteína se puede determinar utilizando técnicas de ensayos estándar.

Utilizando métodos tales como PCR, hibridación, y similares se pueden identificar las correspondientes secuencias de delta-endotoxina, tales secuencias que tienen sustancial identidad con las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook J., and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia del nucleótido delta-endotoxina se puede utilizar para seleccionar bibliotecas de cADN o genómicas. Los métodos para la construcción de tales bibliotecas de cADN o genómicas, generalmente se conocen en el oficio y se revelan en Sambrook and Russell, 2001. Las así llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de cADN, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable tal como ^{32}P, o cualquier otro marcador detectable, tales como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. Las sondas para hibridación se pueden hacer por marcación de oligonucleótidos sintéticos basándose en la conocida secuencia delta-endotoxina codificante del nucleótido revelada aquí. Los cebadores degenerados diseñados con la base de nucleótidos conservados o residuos de aminoácido en la secuencia del nucleótido o secuencia codificada de aminoácido adicionalmente se pueden utilizar. La sonda normalmente comprende una región de secuencia del nucleótido que hibridiza bajo condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia del nucleótido que codifica la delta-endotoxina de la invención o un fragmento o variante de esta. La preparación de sondas para la hibridación generalmente se conoce en el oficio y se revela en Sambrook and Russell, 2001, se incorporan aquí por referencia.

En técnicas de hibridación, toda o parte de una conocida secuencia del nucleótido, se utiliza como una sonda que selectivamente hibridiza con otras secuencias correspondientes del nucleótido presentes en una población de fragmentos de ADN o fragmentos de cADN genómicos clonados (i.e., bibliotecas genómicas o de cADN) a partir de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos genómicos de ADN, fragmentos de cADN, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable tal como ^{32}P, o cualquier otro marcador detectable. De esta manera, por ejemplo, sondas para la hibridación se pueden hacer por marcación de oligonucleótidos sintéticos basándose en la secuencia delta-endotoxina de la invención. Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de bibliotecas de cADN o genómicas generalmente se conocen en el oficio y se revelan en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por ejemplo, la secuencia delta-endotoxina total revelada aquí, o una o más porciones de esta, se pueden utilizar como una sonda capaz de hibridizar específicamente con las correspondientes secuencias como delta-endotoxina y ARNs mensajero. Para lograr la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar las correspondientes secuencias delta-endotoxina a partir de un organismo seleccionado por PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar adicionales secuencias codificantes a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen selección por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (tanto en placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo, bajo condiciones rigurosas. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se entiende condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará con su secuencia diana, con un mayor grado detectablemente que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2-veces más de fondo). Las condiciones rigurosas son secuencia-dependiente y serán diferentes en circunstancias diferentes. Para controlar la severidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, las secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda, se pueden identificar (sondeo homólogo). De manera alterna, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir que algún desequilibrio en secuencias de modo que se detectan grados más bajos de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Usualmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menos de aproximadamente 1.5M de ion de Na, normalmente una concentración cerca de 0.01 a 1.0M de ion de Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, más grandes de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como la formamida. Ejemplares condiciones de severidad bajas incluyen hibridación con una solución reguladora de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS (sodio dodecil sulfato) a 37ºC, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de sodio 0.3 M) entre 50 a 55ºC. Ejemplares condiciones de severidad moderadas incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, NaCl 1.0 M, 1% de SDS a 37ºC, y un lavado en 0.5X a 1X SSC entre 55 a 60ºC. Ejemplares condiciones de severidad altas, incluyen hibridación en 50% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37ºC, y un lavado en 0.1X SSC entre 60 a 65ºC. Opcionalmente, las soluciones reguladoras de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1% de SDS. La duración de hibridación generalmente es menos de aproximadamente 24 horas, a menudo cerca de 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad normalmente es la función de los lavados pos-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y temperatura de la solución final de lavado. Para los hibridos ADN-ADN, la T_{m} puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_{m} = 81.5ºC + 16.6 (log M) + 0.41 (% de GC) - 0.61 (% forma) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en par de bases. La T_{m} es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en la cual 50% de una secuencia diana complementaria hibridiza con una sonda coincidente perfectamente. T_{m} se reduce por aproximadamente 1ºC por cada 1% de desequilibrio; de esta manera, las condiciones T_{m}, hibridación, y/o lavado se pueden ajustar para hibridizar con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan las secuencias con \geq90% de identidad, la T_{m} se puede disminuir 10ºC. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5ºC más bajo que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, condiciones rigurosas se severidad se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4ºC más bajo que el punto de fusión térmico (T_{m}); condiciones rigurosas moderadas se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10ºC por debajo del punto de fusión térmico (T_{m}); condiciones de severidad bajas se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20ºC por debajo del punto de fusión térmico (T_{m}). Utilizando las composiciones de la ecuación, hibridación y lavado, y T_{m} deseada, aquellos de ordinaria habilidad entenderán que las variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado se describen intrínsecamente. Si el grado deseado de desequilibrio resulta en una T_{m} de menos de 45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución de formamida), se prefiere para incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una temperatura superior. Una amplia guía con la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Proteínas aisladas y Variantes y Fragmentos de estas

Las proteínas delta-endotoxina también se abarcan dentro de la presente invención. Por "proteína delta-endotoxina" se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácido publicada en la SEQ ID No:3 o 5. Los fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes de esta también se proporcionan, y se pueden utilizar para practicar los métodos de la presente invención.

"Los fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipétido que comprenden una porción de una secuencia de aminoácido que codifica una proteína delta-endotoxina como se publica en la SEQ ID No:3 o 5, y que retienen actividad delta-endotoxina. Una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina puede ser un polipétido es decir, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas se pueden preparar por técnicas recombinantes y se evalúan por la actividad delta-endotoxina, Los métodos para medir la actividad de pesticida son bien conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente U.S. No. 5,743,477. Como se utiliza aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos continuos de la SEQ ID No:3 o 5. La invención abarca otros fragmentos, sin embargo, tal como cualquier fragmento en la proteína más grande de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, y 650 de aminoácidos.

Por "variantes" se entiende proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido es decir al menos aproximadamente 60%, 65%, preferiblemente aproximadamente 70%, 75%, más preferiblemente aproximadamente 80%, 85%, más preferiblemente aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5. Las variantes también incluyen polipeptidasa codificada por una molécula de ácido nucleico que hibridiza a la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, o un complemento de esta, bajo condiciones rigurosas. Tales variantes generalmente retienen la actividad delta-endotoxina. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácido debido a la mutagénesis. Las proteínas de la variante abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir siguen teniendo la deseada actividad biológica de la proteína nativa, es decir, que retienen la actividad de pesticida. Los métodos para medir la actividad de pesticida son bien conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente U.S. No. 5,743,477.

Variantes Alteradas o Mejoradas

Se reconoce que las secuencias de ADN de una proteína delta-endotoxina pueden ser alteradas por diversos métodos, y que estas alteraciones pueden resultar en proteínas que codifican secuencias de ADN con secuencias de aminoácido diferentes de aquellas codificadas por la proteína delta-endotoxina de la presente invención. Esta proteína se puede alterar de varias formas, incluyendo sustituciones de aminoácido, deleciones, truncamientos, e inserciones. Los métodos para tales manipulaciones generalmente se conocen en el oficio. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácido de la proteína delta-endotoxina se pueden preparar por mutaciones en el ADN. Esto también se puede lograr por una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácido no afectaran sustancialmente la función de la proteína. Tales variantes poseerán la deseada actividad de pesticida. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína delta-endotoxina para conferir actividad de pesticida, se puede mejorar por el uso de tales técnicas en las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se puede expresar la proteína delta-endotoxina en células huésped que muestran índices altos de base misincorporación durante la replicación de ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene). Después de la propagación en tales cepas, se puede aislar el ADN de delta-endotoxina (por ejemplo preparando ADN del plásmido, o por amplificación por PCR y clonación del fragmento de PCR resultante en un vector), cultivo de las mutaciones de delta-endotoxina en una cepa no-mutagénica, e identificar los genes delta-endotoxina mutados con actividad de pesticida, por ejemplo realizando un ensayo para examinar la actividad de pesticida. Generalmente, la proteína se mezcla y utiliza en pruebas de alimentación. Ver, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales pruebas pueden incluir el contacto de las plantas con una o más plagas y la determinación de la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Ejemplos de mutaciones que resultan en el incremento de la toxicidad se encontraron en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

De manera alterna, las alteraciones se pueden hacer con la secuencia de la proteína de muchas proteínas en el terminal amino o carboxi sin afectar sustancialmente la actividad. Esta puede incluir inserciones, deleciones, o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, tales como PCR, que incluyen amplificaciones de PCR que alteran o extienden la secuencia de la proteína codificante en virtud de la inclusión del aminoácido que codifica las secuencias en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación de PCR. De manera alterna, la secuencia de las proteínas adicionadas puede incluir secuencias de proteínas-codificantes totales, tales como aquellas utilizadas comúnmente en el arte de generar fusiones de proteínas. Tales fusiones de proteínas son con frecuencia utilizadas en (1) incremento de la expresión de una proteína de interés (2) introducción de un dominio enlace, actividad enzimática, o un epitope para facilitar tanto la purificación de la proteína, detección de la proteína, como otro uso experimental conocido en el oficio (3) secreción dirigida o traducción de una proteína a un organelo subcelular, tal como el espacio periplásmico de las bacterias Gram-negativas, o el retículo endoplasmático de células eucarióticas, el último de los cuales con frecuencia resulta en la glicosilación de la proteína.

La variante del nucleótido y las secuencias de aminoácido de la presente invención también abarca secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinantes tales como transposición de ADN. Con dicho procedimiento, una o más diferentes proteínas delta-endotoxina que codifican regiones se pueden utilizar para crear una nueva proteína delta-endotoxina que posee las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen identidad sustancial de la secuencia y pueden ser recombinadas homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando esta estrategia, las fracciones de secuencia que codifican un dominio de interés se pueden desordenar entre el gen delta-endotoxina de la invención y otros conocidos genes delta-endotoxina para obtener un nuevo gen codificante para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tales como una actividad insecticida incrementada. Las estrategias para tal transposición de ADN son conocidas en el oficio. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y Patente U.S. Nos. 5,605,793 y 5,837,458.

El intercambio o transposición del dominio es otro mecanismo para generar proteínas delta-endotoxina o delta-endotoxinas asociadas alteradas. Los dominios II y III se pueden intercambiar entre las proteínas delta-endotoxina, resultando en toxinas híbridas o quiméricas con actividad mejorada de pesticida o espectro diana. Los métodos para generar proteínas recombinantes y sus pruebas para la actividad de pesticida son bien conocidos en el oficio (ver, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67: 5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Micriobiol. 65: 2918-2925).

Transformación de la Planta

La transformación de las células vegetales se puede lograr, mediante una de varias técnicas conocidas en el oficio. En primer lugar, se diseña el gen delta-endotoxina de una manera que permita su expresión en células vegetales. Usualmente un constructor que expresa dicha proteína podría contener un promotor para conducir la transcripción del gen, así como una región 3' sin traducir para permitir la terminación de la transcripción y poliadenilación. La organización de tales construcciones es bien conocida en el oficio. En algunos casos, puede ser útil diseñar el gen de tal manera que el péptido resultante se secrete, o de otra manera se dirija dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede ser diseñado para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. También puede ser preferible diseñar el cassette de expresión de la planta para contener un intrón, de tal manera que el proceso del ARNm del intrón se necesite para la expresión.

Usualmente este "cassette de expresión de la planta" será insertado en un "vector de transformación de plantas". Este vector de transformación de plantas se puede comprender de uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en el oficio utilizar vectores de transformación de plantas que se comprenden de más de un segmento de ADN continuo. Estos vectores son con frecuencia referidos en el oficio como "vectores binarios". Los vectores binarios así como vectores con plásmidos auxiliares son más utilizados con frecuencia para la transformación Agrobacterium-mediada, donde el tamaño y complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr que la transformación eficiente sea más grande, y es ventajoso separar las funciones sobre las moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios normalmente contienen un plásmido vector que contiene las secuencias cis-que actúan necesarias para la transferencia de T-ADN (tales como borde izquierdo y borde derecho), un marcador genético es decir diseñado para ser capaz de expresar en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresar en una célula vegetal para la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este plásmido vector las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias cis-que actúan son organizadas de una manera para permitir la transferencia eficiente en células vegetales y la expresión en estas. Por ejemplo, el del marcador genético y el gen de interés se localizan entre los bordee izquierdo y derecho. Con frecuencia un segundo plásmido vector contiene los factores trans-que actúan que media la transferencia del T-ADN del Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido con frecuencia contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permitan la infección de células vegetales por Agrobacterium, y transferencia de ADN por división en las secuencias de bordes y transferencia de ADN mediada vir, como en el sobreentendido en el oficio (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) se pueden utilizar para la transformación de la planta. El segundo plásmido vector no es necesario para la transformación de las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación de la planta involucran la transferencia de ADN heterólogo en las células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.), seguido por la aplicación un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador genético) para recuperar las células vegetales transformadas a partir de un grupo de masa celular no-transformada. Los explantes normalmente se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultiva rutinariamente. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después se colocan en medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes luego se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar brote enraizado o plántula. La plántula transgénica luego crece en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Los explantes normalmente se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plántulas transgénicas se encuentra en Ayres and Park, 1994 (Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239) y Bommineni and Jauhar, 1997 (Maydica 42: 107-120). Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier segmento de callos diana o tejido o grupo de células sometidos. La capacidad para matar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen resulta en cultivos de plantas transformadas. Con frecuencia, la capacidad para remover células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células vegetales transformadas y generación exitosa de plantas transgénicas.

La generación de plantas transgénicas se pueden desarrollar por uno de varios métodos, que incluyen pero no limitan a la introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en las células vegetales (transformación mediada del Agrobacterium), el bombardeo de células vegetales con ADN foráneo heterólogo, adheridas a las partículas, y diversos otros métodos directo-mediado sin partícula (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750; Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120) para la transferencia de ADN.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir las secuencias del nucleótido en las plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, i.e., monocotolidónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos apropiados para introducir las secuencias del nucleótido en células vegetales y posterior inserción en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada del Agrobacterium- (Patente U.S. No. 5,563,055; Patente U.S. No. 5,981,840), transferencia de gen directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de partículas balísticas (ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,945,050; Patente U.S. No. 5,879,918; Patente U.S. No. 5,886,244; Patente U.S. No. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct ADN Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); aerosol beam transformation (U.S. Published Application No. 20010026941; Patente U.S. No. 4,945,050; International Publication No. WO 91/00915; U.S. Published Application No. 2002015066); and Lec1 transformation (WO 00/28058). También ver Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674; McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926; Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740; Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; Patente U.S. No. 5,240,855; Patente U.S. Nos. 5,322,783 y 5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct ADN Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444; Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Patente U.S. No. 5,736,369; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209; Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413; Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750.

Después de la integración de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, entonces se aplica un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no-transformadas y separar y proliferar las células transformadas putativamente que sobreviven a partir de este tratamiento de selección por transferencia regularmente a un medio fresco. Mediante pasaje y desafío continuo con selección apropiada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el plásmido vector. A continuación los métodos moleculares y bioquímicos serán utilizados para confirmar la presencia del gen de interés heterólogo integrado en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas, se pueden cultivar en plantas de acuerdo con modos convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estos plantas luego se pueden cultivar, y la polinización con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de las identificadas características fenotípicas deseadas. Dos o más generaciones se pueden cultivar para asegurar que la expresión de las características fenotípicas deseadas se mantiene establemente y se heredan y luego las semillas se cosechan para asegurar que la expresión de las características fenotípicas deseadas se ha logrado. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también referidas como "semilla transgénica") que tiene un constructor nucleótido de la invención, por ejemplo, un cassette de expresión de la invención, establemente incorporada en su genoma.

Las secuencias delta-endotoxina de la invención se pueden incorporar en cassettes de expresión para la expresión en la planta de interés. El cassette incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operablemente a una secuencia de la invención. Por "ligado operablemente" se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotor inicia y media la transcripción de la secuencia del ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, ligado operablemente significa que las secuencias del ácido nucleico que se unen están continuas y, donde se necesita unir dos proteínas que codifican las regiones, continuas y en el mismo marco de lectura. El cassette adicionalmente puede contener al menos un gen adicional para ser cotransformados en el organismo. De manera alterna, el gen adicional(s) puede ser proporcionado sobre múltiples cassettes de expresión.

Tal cassette de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia delta-endotoxina para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El cassette de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación transcripcional y traduccional (i.e., un promotor), una secuencia del ADN de la invención, y una región de terminación transcripcional y traduccional (i.e., región de terminación) funcional en las plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o foráneo o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia del ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Dónde el promotor es "nativo" u "homólogo" a la planta huésped, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa en la cual el promotor se introduce. Dónde el promotor es "foráneo" o "heterólogo" a la secuencia del ADN de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o que ocurre naturalmente para la secuencia del ADN, ligada operablemente, de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia ligada operablemente del ADN de interés, puede ser nativa con la planta huésped, o puede ser derivada a partir de otra fuente (i.e., foráneo o heterólogo al promotor, la secuencia del ADN de interés, la planta huésped, o cualquier combinación de esta). Las regiones de terminación convenientes son disponibles del Ti-plásmido de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el gen(s) se puede optimizar para incrementar la expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes se pueden sintetizar utilizando codones preferidos de célula huésped, para mejorar la expresión, o se pueden sintetizar utilizando codones en un codón preferido huésped usado con frecuencia. Ver, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para una discusión del uso del codón huésped preferido. Los métodos son conocidos en el oficio para la síntesis de los genes preferidos de la planta. Ver, por ejemplo, Patente U.S. Nos. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; y 5,436,391, U.S. Published Application Nos. 20040005600 y 20010003849, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una modalidad, los ácidos nucleicos de interés se dirigen al cloroplasto para la expresión. De esta manera, donde el ácido nucleico de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el cassette de expresión adicionalmente contendrá un ácido nucleico que codifica un péptido de transito para dirigir el producto génico de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de transito son conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la entrega de la pistola genética del ADN que contiene un marcador genético y la orientación del ADN con el genoma del plastidio a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación del plastidio se puede lograr por la trans-activación de un transgen plastidio-transmitido silencioso por la expresión preferida del tejido de una polimerasa codificada nuclear y de ARN plastidio-dirigido. Tal sistema ha sido reportado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:7301-7305.

Los ácidos nucleicos de interés para ser dirigidos al cloroplasto, se pueden optimizar para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y este organelo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés se pueden sintetizar utilizando cloroplasto-codones preferidos. Ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,380,831.

Evaluación de la Transformación de la Planta

Después de la introducción del ADN foráneo heterólogo en las células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma por diversos métodos tales como análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

Análisis de PCR: Análisis de PCR es un método rápido para seleccionar células transformadas, tejido o brotes para la presencia del gen incorporado en la etapa más primaria antes del transplante en el suelo (Sambrook and Russell, 2001). PCR se realiza utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos al gen de interés o fondo del vector Agrobacterium, etc.

Análisis Southern: La transformación de la planta se confirma por análisis Southern blot de ADN genómico (Sambrook and Russell, 2001). En general, el ADN total se extrae a partir del transformante, digerido con enzimas de restricción apropiadas, fraccionadas en un gel de agarosa y transferida a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. La membrana o "transferencia " luego se prueba con, por ejemplo, fragmento de ADN diana radiomarcado ^{32}P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook and Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Análisis Northern: ARN se aísla a partir de tejidos específicos de transformante, fraccionados en un gel de agarosa formaldehido, transferido sobre un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos estándar que rutinariamente se utilizan en el oficio (Sambrook, J., and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La expresión del ARN codificado por la delta-endotoxina luego se prueba por hibridación del filtro con una sonda radioactiva derivada a partir de una proteína delta-endotoxina, por métodos conocidos en el oficio (Sambrook and Russell, 2001).

Western blot y Pruebas bioquímicas: Western blot y Pruebas bioquímicas y similares se pueden llevar a cabo sobre las plantas transgénicas para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen delta-endotoxina, mediante procedimientos estándar (Sambrook, J., and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) utilizando anticuerpos que se unen a uno o más epitopes presentes sobre la proteína delta-endotoxina.

Actividad de pesticida en plantas

En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresan proteínas delta-endotoxina, que tienen actividad de pesticida. Los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo se pueden emplear para generar plantas transgénicas, pero la manera en la cual, las células de la planta transgénica se generan no es crítica para esta invención. Los métodos conocidos o descritos en el oficio, tales como transformación mediada del Agrobacterium, haz de aerosol, transformación biolística, y métodos mediados sin partícula, se pueden utilizar en la discreción del investigador. Las plantas que expresan proteínas delta-endotoxina se pueden aislar por métodos comunes descritos en el oficio, por ejemplo por transformación de callos, selección de callos transformados, y regeneración de plantas fértiles a partir de tales callos transgénicos. En dicho proceso, se puede utilizar cualquier gen como un marcador genético con la condición que su expresión en células vegetales confiera capacidad para identificar o seleccionar las células transformadas.

Un número de marcadores han sido desarrollados para utilizar con células vegetales, tales como resistencia al cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican un producto involucrado en el metabolismo del cloroplasto, también se pueden utilizar como marcadores genéticos. Por ejemplo, genes que proporcionan resistencia a herbicidas de la planta tales como glifosato, bromoxinil, o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Tales genes se han reportado (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (bromoxinil resistance
nitrilase gene); y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 2188 (AHAS imidazolinone resistance gene).

Las plantas fértiles que expresan una proteína delta-endotoxina, se pueden probar para la actividad de pesticida, y las plantas que muestran actividad óptima seleccionada para otros cultivos. Los métodos son disponibles en el oficio para probar la actividad de la plaga. Generalmente, la proteína se mezcla y utiliza en pruebas de alimentación. Ver, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 8: 290-293.

Uso en Control Pesticida

Los métodos generales, para emplear las cepas de la invención en el control pesticida o en el diseño de otros organismos como agentes pesticidas son conocidos en el oficio. Ver, por ejemplo Patente U.S. No. 5,039,523 y EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus de la invención o los microorganismos que han sido alterados genéticamente para contener el gen y la proteína de pesticida, se pueden utilizar para proteger cosechas y productos agrícolas a partir de plagas. En un aspecto de la invención, en su totalidad, i.e., las células, no lisadas de una toxina (pesticida)-que producen un organismo se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula, cuando la célula se aplica al ambiente de la plaga(s) diana.

De manera alterna, el pesticida se produce introduciendo un gen heterólogo dentro de un huésped celular. La expresión del gen heterólogo resulta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y mantenimiento del pesticida. En un aspecto de esta invención, estas células luego se tratan bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula, cuando la célula se aplica al ambiente de la plaga(s) diana. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas encapsulados naturalmente luego se pueden formular de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación al ambiente que hospeda una plaga diana, por ejemplo, suelo, agua, y follaje de la plantas. Ver, por ejemplo EPA 0192319, y las referencias citadas en estas. De manera alterna, se pueden formular las células que expresan los genes de esta invención tales como para permitir la aplicación del material resultante como un pesticida.

Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en la forma de composiciones y se pueden aplicar a la planta o área de la cosecha que se trata, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, exterminadores de maleza, crioprotectores, agentes tensoactivos, detergentes, jabones de pesticidas, aceites inactivos, polímeros, y/o excipiente de formulaciones de tiempo de liberación o biodegradable, que permiten una dosificación a largo plazo de un área objetivo, después de una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusocidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros excipientes agrícolamente aceptables, agentes tensoactivos o adyuvantes que promueven la aplicación habitualmente empleadas en el oficio de formulación. Los excipientes y adyuvantes apropiados pueden ser sólidos o líquidos y corresponder a las sustancias empleadas habitualmente en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales regeneradas o naturales, solventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. Así mismo, las formulaciones se pueden preparar en "cebos" comestibles o en forma de "trampas" plaga, para permitir la alimentación o ingestión por una plaga diana de la formulación del
pesticida.

Los métodos preferidos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas de pesticidas producida por las cepas bacterianas de la presente invención son, la aplicación en hojas, recubrimiento de la semilla y aplicación en el suelo. El número de aplicaciones y la velocidad de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La composición se puede formular como un polvo, pulverizado, pella, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, solución, o similares, y se pueden preparar por medios convencionales como deshidratación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprende el polipétido. En todas las composiciones que contienen al menos uno de estos citados polipétidos pesticidas, el polipétido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso.

Las plagas de lepidópteros o coleópteros se pueden matar o reducir en número, en un área determinada por los métodos de la invención, o se pueden aplicar profilácticamente a un área ambiental, para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente la plaga ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad efectiva como pesticida del polipétido. Por "cantidad efectiva como pesticida" se entiende una cantidad del pesticida que es capaz de provocar la muerte a al menos una plaga, o reducir notablemente el crecimiento de la plaga, alimentación, o desarrollo fisiológico normal. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas diana específicas que se controlan, el ambiente específico, localización, planta, cosecha, o sitio agrícola que se trata, las condiciones ambientales, y el método, velocidad, concentración, estabilidad, y cantidad de aplicación de la composición del polipéptido, efectiva como pesticida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales, y/o frecuencia de aplicación y/o severidad de infestación de plagas.

Las composiciones de pesticidas descritas se pueden hacer por la formulación, ya sea la célula bacteriana, suspensión de cristal y/o espora, o componente de la proteína aislada con el deseado excipiente agrícolamente aceptable. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, secado por congelación, deshidratado, o en un excipiente acuoso, medio o diluente apropiado, tal como solución salina u otra solución reguladora. Las composiciones formuladas pueden ser en la forma de un polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o emulsiones agua o aceite/agua, o como un polvo mojable, o en combinación con cualquier otro material portador apropiado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas apropiados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en el oficio. El término "portador agrícolamente-aceptable" abarca todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, agentes tensoactivos, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc. que se utilizan habitualmente en la tecnología de formulación de pesticidas; estos son bien conocidos por aquellos de habilidad en la formulación de pesticidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y preparar por diversos medios, por ejemplo, por mezcla homogénea, homogenización y/o molienda de la composición de pesticidas con adyuvantes apropiados utilizando técnicas convencionales de formulación. Las formulaciones y métodos de aplicación apropiados, se describen en la Patente U.S. No. 6,468,523.

"Plaga" incluye pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, ácaros, garrapatas, y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de las órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera, y Diptera.

Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera y Lepidoptera. Las plagas de insectos de la invención para las principales cosechas incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador Europeo; Agrotis ipsilon, gusano negro; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea grandiosella, gusano barrenedor del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Diatraea saccharalis, gusano minador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz; Diabrotica longicornis barberi, tortuguilla de la raíz; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, raedor enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, raedor enmascarado del sur (gusano blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón verde del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, mosca de la semilla; Agromyza parvicornis, minador de las hojas del maíz; Anaphothrips obscrurus, thrips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Feltia subterranea, gusano trozador; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos de alambre; Oulema melanopus, criocero de los cereales; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón verde del maíz; Sipha flava, pulgón de la caña de azúcar amarillo; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña roja del clarel; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano cogollero; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Agrotis orthogonia, oruga podadera del oeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano picador de la hoja; Oulema melanopus, criocero de los cereales; Hypera punctata, gorgojo del trebol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Pulgón Ruso del trigo; Schizaphis graminum, greenbug; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, Mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, mosca del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca gris del trigo; Frankliniella fusca, piojillo del tabaco; Cephus cinctus, cefo del trigo; Aceria tulipae, ácaro blanco del bulbo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de la yema del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla del girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano bellotero del algodón; Helicoverpa zea, oruga del algodón; Spodoptera exigua, gardama de la remolacha; Pectinophora gossypiella, oruga rosada del algodón; Anthonomus grandis, picudo del algodonero; Aphis gossypii, piojo del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulguilla del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosquita blanca; Lygus lineolaris, chinche ligus; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, piojillo del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña roja del clarel; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, salta hojas el arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Soja: Pseudoplusia includens, orugas medidoras de la soja; Anticarsia gemmatalis, langosta del maní; Plathypena scabra, gusano verde del trebol; Ostrinia nubilalis, gusano barrenador Europeo; Agrotis ipsilon, gusano negro; Spodoptera exigua, gardama de la remolacha; Heliothis virescens, gusano bellotero del algodón; Helicoverpa zea, oruga del algodón; Epilachna varivestis, conchuela del fríjol; Myzus persicae, pilgón verde del duraznero; Empoasca fabae, salta hojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Melanoplus femurrubrum, saltamontes rojo; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, mosca de la semilla; Sericothrips variabilis, soja thrips; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, arañueka roja de la fresa; Tetranychus urticae, arañita bimaculada; Cebada: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador Europeo; Agrotis ipsilon, gusano negro; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Euschistus servus, chinche marrón apestoso; Delia platura, mosca de la semilla; Mayetiola destructor, Mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro marrón del trigo; Aceite de colza: Brevicoryne brassicae, pulgón del repollo; Phyllotreta cruciferae, Pulguilla; Mamestra configurata, Gusano de las crucíferas; Plutella xylostella, palomilla de dorso de diamante; Delia ssp., Gusano de la semilla.

Los nemátodos incluyen nemátodos parásitos tales como root-knot, cyst, y nemátodos de la lesión, que incluyen Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente miembros de los nemátodos cyst, que incluyen, pero no limitan a, Heterodera glycines (heterodera de la soja); Heterodera schachtii (heterodera de la remolacha); Heterodera avenae (heterodera del cereal); y Globodera rostochiensis y Globoderapailida (nematodo del quiste de la patata). Los nemátodos de la lesión incluyen Pratylenchus spp.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Experimental Ejemplo 1 Extracción del ADN del plásmido

El ADN del plásmido a partir de cepas ATX 13026 o ATX 13002 se prepararon de la siguiente manera. Un cultivo puro de la cepa ATX13026 o cepa ATX13002 se cultivó en grandes cantidades de medio rico. El cultivo se centrifugó para cosechar el pella celular. El pella celular a continuación se preparó, por el tratamiento con SDS por métodos conocidos en el oficio, resultando en el rompimiento de la pared celular y liberación del ADN. Las proteínas y ADN genómico extenso luego se precipitó, mediante una alta concentración de sal. El ADN del plásmido se precipitó por precipitación estándar con etanol. El ADN del plásmido se separó a partir de cualquier ADN cromosomal remanente, por centrifugación de alta velocidad a través de un gradiente de cloruro de cesio. El ADN se visualizó en el gradiente por luz UV y la banda de densidad inferior (i.e. la banda inferior) se extrajo utilizando una jeringa. Esta banda contenía el ADN del plásmido a partir de la cepa (tanto ATX 13026 como ATX 13002). La calidad del ADN se comprobó por visualización sobre un gel de agarosa por métodos conocidos en el oficio.

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Ejemplo 2 Clonación de Genes

El ADN del plásmido purificado se cizalló en fragmentos del tamaño de 5-10 kb y la cadena sencilla 5' y 3' saliente reparada utilizando T4 ADN polimerasa y fragmento Klenow en la presencia de los cuatro dNTPs, según se conoce en el oficio. Luego los fosfatos se conectaron a los terminales 5' por tratamiento con T4 polinucleótido quinasa, según se conoce en el oficio. Los fragmentos reparados de ADN se ligaron durante la noche dentro de un vector de copia alta estándar (i.e. pBluescript SK+), convenientemente preparado para aceptar los insertos, según se conoce en el oficio (por ejemplo, por digestión con una enzima de restricción que produce terminales romos).

La calidad de la biblioteca se analizó por digestión de un subconjunto de clones con una enzima de restricción conocida que tiene un sitio de división que flanquea el sitio de clonación. Un alto porcentaje de clones se determinó para contener insertos, con un tamaño de inserto medio de 5-6 kb.

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Ejemplo 3 Secuenciación de Alto rendimiento de Placas de Biblioteca

Las bibliotecas preparadas por los métodos anteriores se colocaron en placas sobre un medio rico que contiene el antibiótico apropiado para mantener los clones de plásmidos, y las colonias se escogieron individualmente en un bloque 96-pozos que contiene 2 mililitros de medio que contiene el antibiótico apropiado. Estos bloques se cosecharon durante la noche a 37ºC a una velocidad de agitación de 350 rpm. Los bloques se centrifugaron para cosechar las células en el fondo del bloque. El ADN del plásmido se aisló a partir de estos cultivos por lisis alquilina estándar prep, en un formato de alto rendimiento.

Las secuencias terminales de los clones a partir de esta biblioteca se determinaron por un gran número de clones a partir de cada bloque de la siguiente manera: La secuencia del ADN de cada clon seleccionado para análisis, se determinó utilizando la técnica de secuenciación con terminador fluorescente (Applied Biosystems) y cebadores estándar que flanquean cada lado del sitio de clonación. Una vez las reacciones se han llevado a cabo en el termociclador, el ADN se precipitó utilizando precipitación con etanol estándar. El ADN se resuspendió en agua y se cargó en un equipo de secuenciación capilar. Cada placa de la biblioteca de ADN se secuenció a partir del terminal del sitio de clonación, produciendo dos lecturas por placa sobre cada inserto.

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Ejemplo 4 Ensamble y Selección de los Datos de Secuenciación

Las secuencias de ADN obtenidas se recopilaron dentro de un proyecto de ensamblaje y alienación en conjunto, para formar clones solapados. Esto se puede hacer eficientemente utilizando un programa de ordenador, tal como Vector NTi, o alternativamente utilizando los programas Pred/Phrap suite de alineación de ADN y de análisis. Estos clones solapados, junto con cualquier lectura individual que no haya sido adicionada a un clon solapado, se compararon con una base de datos recopilada de todas las clases de genes de pesticidas conocidos. Los clones solapados o las lecturas individuales identificadas por tener la identidad con una endotoxina o gen de pesticida conocido, adicionalmente se analizaron. Entre las secuencias obtenidas, los clones pAX004, pAX006, pAX007, pAX008, pAX009, y pAX014 contenían ADN identificado por tener homología con los genes de endotoxina conocidos. Por consiguiente, estos clones se seleccionaron para una secuenciación posterior.

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Ejemplo 5 Secuenciación e Identificación de Genes Delta-Endotoxina

Los cebadores se diseñaron para hibridizar a las secuencias con homología a los genes endotoxina, de tal manera que las secuencias de ADN generadas a partir de dichos cebadores deberían superponer la secuencia del ADN existente del o los clones. Este proceso, conocido como "oligo walking", es bien conocido en el oficio. Este proceso se utilizó para determinar la secuencia del ADN total de la región que muestra homología con un gen endotoxina conocido. En el caso de los clones mencionados anteriormente, este proceso se utilizó para determinar la secuencia del ADN del clon total, resultando en una única secuencia del nucleótido por cada gen. La secuencia del ADN completa se coloca de nuevo dentro del ensamblaje original grande para otra validación. Esto permite la incorporación de más lecturas de la secuencia del ADN dentro del clon solapado, resultando en múltiples lecturas de alcance sobre la región total.

El análisis de la secuencia del ADN de cada región con homología a un gen endotoxina conocido identificó un marco de lectura abierto con homología a un gen delta-endotoxina conocido. El marco de lectura abierto identificado a partir de pAX004 se designa como AXMI-004. El marco de lectura abierto identificado a partir de pAX006 se designa como AXMI-006. El marco de lectura abierto identificado a partir de pAX007 se designa como AXMI-007. El marco de lectura abierto identificado a partir de pAX008 se designa como AXMI-008. El marco de lectura abierto identificado a partir de pAX009 se designa como AXMI-009. El marco de lectura abierto identificado a partir de pAX014 se designa como AXMI-014. La secuencia del ADN de AXMI-004 se proporciona como la SEQ ID NOS:1 y 2, y la secuencia de aminoácido de la proteína AMXI-004 pronosticada se proporciona como la SEQ ID No:3. Un sitio inicial alterno para AXMI-004 en el nucleótido 385 de la SEQ ID No:1 genera la secuencia de aminoácido proporcionada como la SEQ ID No:5. La secuencia del ADN de AXMI-006 se proporciona como la SEQ ID No:6, y la secuencia de aminoácido de la proteína AMXI-006 pronosticada se proporciona en la SEQ ID No:7. La secuencia del ADN de AXMI-007 se proporciona como la SEQ ID No:8, y la secuencia de aminoácido de la proteína AMXI-007 pronosticada se proporciona en la SEQ ID No:9. Un sitio inicial alterno para AXMI-007 en el nucleótido 151 de la SEQ ID No:8 genera la secuencia de aminoácido proporcionada como la SEQ ID No:11. La secuencia del ADN de AXMI-008 se proporciona como la SEQ ID NOS:12 y 13, y la secuencia de aminoácido de la proteína AMXI-008 pronosticada se proporciona en la SEQ ID No:14. Un sitio inicial alterno para AXMI-008 en el nucleótido 177 de la SEQ ID No:12 genera la secuencia de aminoácido proporcionada como la SEQ ID No:16. Otro análisis identificó un marco de lectura abierto inmediatamente 3' en el terminal del marco de lectura abierto de AXMI-008. Esta secuencia de aminoácido pronosticada de este orf, se refiere aquí como AXMI-008orf2, se proporciona en la SEQ ID No:18. La secuencia del ADN de AXMI-009 se proporciona como la SEQ ID No:19, y la secuencia de aminoácido de la proteína AMXI-009 pronosticada se proporciona en la SEQ ID No:20. Un sitio inicial alterno para AXMI-009 en el nucleótido 34 de la SEQ ID No: 19 genera la secuencia de aminoácido proporcionada como la SEQ ID No:22. Otro sitio inicial alterno para AXMI-009 en el nucleótido 64 de la SEQ ID No:19 genera la secuencia de aminoácido proporcionada como la SEQ ID No:24. La secuencia del ADN de AXMI-014 se proporciona como la SEQ ID NOS:25 y 26, y la secuencia de aminoácido de la proteína AMXI-008 pronosticada se proporciona como la SEQ ID No:27. Un sitio inicial alterno para AXMI-014 en el nucleótido 136 de la SEQ ID No:25 genera la secuencia de aminoácido proporcionada como la SEQ ID No:29.

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Ejemplo 6 Homología de Genes Aislados con Genes Endotoxina Conocidos

Investigaciones de bases de datos de ADN y proteína con estas secuencias de ADN y secuencias de aminoácido, revelan que estas secuencias son homólogas con endotoxinas conocidas.

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AXMI-004

La Figura 1 muestra una alineación de AXMI-004 con varias endotoxinas. Las investigaciones Blast identifican cry1Ca por tener el bloque más fuerte de homología, con una identidad de la secuencia completa en el dominio tóxico del 43% (ver Tabla 1).

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TABLA 1 Identidad del Aminoácido de AXMI-004 con Ejemplares Clases de Endotoxinas

1

AXMI-006

La Figura 2 muestra una alineación de AXMI-006 con varias endotoxinas. Las investigaciones Blast identifican cry4Aa por tener el más fuerte bloque de homología, aunque la alineación de proteína AMXI-006 (SEQ ID No:7) con un gran conjunto de proteínas endotoxina, muestra que la proteína más homóloga es cry10Aa. La identidad de aminoácido completa de cry10Aa con AXMI-006 es 25% (ver Tabla 2). La inspección de la secuencia de aminoácido de AXMI-006 sugiere que esta no contiene un dominio no-tóxico C-terminal según este presente en varias familias de endotoxina. Para extraer esta proteína C-terminal de las toxinas a partir de la alineación, la alineación refleja la identidad de aminoácido esta presente solamente en los dominios toxina (ver Tabla 2, columna tres). Esta alineación "recortada" se muestra en la Figura 2.

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TABLA 2 Identidad del Aminoácido de AXMI-006 con Ejemplares Clases de Endotoxinas

2

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AXMI-007

Las investigaciones Blast identifican cry4Aa por tener el más fuerte bloque de homología con AXMI-007, aunque la alineación de la proteína AMXI-007 (SEQ ID No:9) con un gran conjunto de proteínas endotoxina muestra que la proteína más homóloga es cry10Aa. La identidad de aminoácido completa de cry10Aa con AXMI-007 es 25% (ver Tabla 3). La inspección de la secuencia de aminoácido de AXMI-007 sugiere que esta no contiene un dominio no-tóxico C-terminal, según este presente en varias familias de endotoxina. Para extraer esta proteína C-terminal de las toxinas a partir de la alineación, la alineación refleja que la identidad del aminoácido esta presente solamente en los dominios toxina (ver Tabla 3, columna tres). Esta alineación "recortada" se muestra en la Figura 3.

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TABLA 3 Identidad del Aminoácido de AXMI-007 con Ejemplares Clases de Endotoxinas

4

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AXMI-008

Las investigaciones Blast identifican cry40Aa por tener el más fuerte bloque de homología con AXMI-008, y la alineación de la proteína AMXI-008 (SEQ ID No:14) con un gran conjunto de proteínas endotoxina muestra que la proteína más homóloga es cry40Aa. La identidad de aminoácido completa de cry40Aa con AXMI-008 es 66% (ver Tabla 4). La inspección de la secuencia de aminoácido de AXMI-008 sugiere que esta no contiene un dominio no-tóxico C-terminal según este presente en varias familias de endotoxina. Extrayendo esta proteína C-terminal de las toxinas a partir de la alineación, la alineación refleja que el aminoácido identificado esta presente solamente en los dominios toxina (ver Tabla 4, columna tres). Esta alineación "recortada" se muestra en la Figura 4.

TABLA 4 Identidad del Aminoácido de AXMI-008 con Ejemplares Clases de Endotoxinas

5

El marco de lectura abierto inmediatamente en dirección 3' (3') con la región codificante AXMI-008 tiene homología con las conocidas proteínas endotoxina-relacionadas. Las investigaciones Blast identifican crybun3orf2 (la orf en dirección 3' de cry40Aa) por tener el más fuerte bloque de homología. Varios otros orf-2 como proteínas están presentes en bases de datos, y una alineación de la proteína AMXI-008-orf2 (SEQ ID No:18) con un conjunto de estas proteínas se muestra en la Figura 5. Estas proteínas también comparten la homología con el dominio no-tóxico C-terminal de cry4Aa y cry4Ba. La identidad de aminoácido completa de AXMI-8-orf2 a cry40Aaorf2 es 86% (ver Tabla 5).

TABLA 5 Identidad del Aminoácido de AXMI-008-orf2 con las proteínas relacionadas

6

AXMI-0 09

Las investigaciones Blast identifican cryBAa por tener el más fuerte bloque de homología con AXMI-009, y alineación de la proteína AMXI- 009 (SEQ ID No:20) con un gran conjunto de proteínas endotoxina muestra que la proteína más homólogas son cry3Ba y cry16Aa. La identidad de aminoácido completa de cry3Ba y cry16Aa con AXMI-009 es 26% (ver Tabla 6). La inspección de la secuencia de aminoácido de AXMI-009 sugiere que esta no contiene un dominio no-tóxico C-terminal según este presente en varias familias de endotoxina. Para extraer esta proteína C-terminal de las toxinas a partir de la alineación, la alineación refleja la identidad del aminoácido esta presente solamente en los dominios toxina (ver Tabla 6, columna tres). Esta alineación "recortada" se muestra en la Figura 6.

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TABLA 6 Identidad del Aminoácido de AXMI-009 con Ejemplares Clases de Endotoxinas

7

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(Tabla pasa a página siguiente)

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AXMI-014

Las investigaciones Blast identifican cry40Aa por tener el bloque más fuerte de homología con AXMI-014, y la alineación de la proteína AMXI-0014 (SEQ ID No:27) con un gran conjunto de proteínas endotoxina muestra que la proteína más homóloga es cry40Aa. La identidad de aminoácido completa de cry40Aa con AXMI-014 es 55% (ver Tabla 7). La inspección de la secuencia de aminoácido de AXMI-014 sugiere que esta no contiene un dominio no-tóxico C-terminal según este presente en varias familias de endotoxina. Para extraer esta proteína C-terminal de las toxinas a partir de la alineación, la alineación refleja que la identidad del aminoácido esta presente solamente en los dominios toxina (ver Tabla 7, columna tres). Esta alineación "recortada" se muestra en la Figura 7.

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TABLA 7 Identidad del Aminoácido de AXMI-014 con Ejemplares Clases de Endotoxinas

8

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Ejemplo 7 Homología entre AXMI-006 y AXMI-007

La comparación de las secuencias de aminoácido de AXMI-007 con AXMI-006 muestra que las dos toxinas comparten significante homología de aminoácido. La alineación de la secuencia el aminoácido de AXMI-006 (SEQ ID No:7) y AXMI-007 (SEQ ID No: 9) muestra que las proteínas son 85% idénticas al nivel del aminoácido. De esta manera AXMI-006 y AXMI-007 constituyen una nueva clase de endotoxinas relacionadas.

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Ejemplo 8 Ensayos para la Actividad como Pesticida

La capacidad de una proteína de pesticida, para actuar como un pesticida sobre una plaga con frecuencia se ensaya en un número de formas. Una forma bien conocida en el oficio es realizar un ensayo de alimentación. En tal ensayo de alimentación, se expone la plaga a una muestra que contiene ya sea compuestos para probarse como muestras control. Con frecuencia esto se desarrolla, colocando el material que se prueba, o una dilución apropiada de tal material, sobre un material que la plaga ingerirá, tal como una dieta artificial. El material que se prueba puede estar compuesto de un líquido, sólido, o suspensión. El material que se prueba se puede colocar sobre la superficie y a continuación se deja secar. De manera alterna, el material que se prueba se puede mezclar con una dieta artificial derretida, luego se dispensa dentro de la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato, o un pozo de una placa de microtitulación.

Ensayos para plagas chupadoras (por ejemplo, pulgones) pueden involucrar la separación del material de prueba a partir del insecto por una partición, idealmente una porción que puede ser perforada por la parte bucal de succión del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba. Con frecuencia, el material de prueba se mezcla con un estimulante de alimentación, tal como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de pruebas pueden incluir microinyección del material de prueba en la boca, o intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido por pruebas de la capacidad de la plaga para alimentarse de la planta transgénica. La prueba de la planta, puede involucrar el aislamiento de las partes de la planta normalmente consumidas, por ejemplo, jaulas pequeñas unidas a una hoja, o aislamiento de las plantas totales en jaulas que contiene insectos.

Otros métodos y enfoques para probar las plagas son conocidas en el oficio, y se pueden encontrar, por ejemplo en Robertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FL. De manera alterna, comúnmente se describen pruebas en las publicaciones "Arthropod Management Tests" y "Journal of Economic Entomology" o por medio de la discusión con miembros de Entomological Society of America (ESA).

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Ejemplo 9 Clonación de AXMI-006 para la Expresión de la Proteína

AXMI-006 se clonó en un vector para la expresión de E. coli de la siguiente manera. pAX480 contiene el gen de resistencia de la kanamicina para la selección de transformantes, y el promotor tac el cual es inducible por IPTG para la expresión de la proteína regulada. pAX480 se modificó por la inserción de un segmento de ADN que codifica una región 6xHis-tag inmediatamente secuencia arriba del inserto de la región de clonación, de tal manera que los clones resultantes contienen una 6xHis-tag en el N-terminal de la proteína expresada. Los métodos para la expresión de proteínas con fusiones 6xHis-tag, y su uso para la purificación y análisis de la expresión de la proteína son bien conocidos en el oficio.

La secuencia codificante para AXMI-006 fue PCR-amplificada utilizando PfuUltra^{TM} Polimerasa de ADN de Alta-Fidelidad (Stratagene). Los cebadores de oligonucleótidos se diseñaron de tal manera que el producto de PCR resultante contenía los deseados sitios de restricción cerca a cada terminal, para facilitar la clonación. El producto de PCR resultante (aproximadamente 2.2 kb) se digirió con la apropiada enzima de restricción, y se subclonó en el pAX480 modificado. Los clones que contienen el inserto, se identificaron por análisis de restricción. El clon resultante, pAX906, contenía el marco de lectura abierto AXMI-006 fundido al sexto de su etiqueta, de tal manera la transcripción y traducción resulta en la producción de una "proteína fusión" con un segmento de seis histidinas. La secuencia del ADN de pAX906 se confirmó por análisis de secuencia del ADN y posteriormente transformada en el componente químicamente E. Coli BL21, según lo descrito por el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA).

Una colonia única de pAX906 en BL21 se inoculó dentro del medio LB suplementado con kanamicina y se cultivó por varias horas a 37ºC con agitación vigorosa. Estos cultivos se cosecharon en un OD600 que oscila entre 0.6-0.8; luego la producción de la proteína se indujo por la adición de IPTG 0.1 mM. Los cultivos se cosecharon bajo condiciones de inducción por 3 horas, y luego las células se peletizaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS. Las células se sometieron a ultrasonido utilizando un Misonix Sonicator 3000 por un total de 30 segundos utilizando intervalos de sonicación de 10-segundos e incubación sobre hielo por un minuto.

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Ejemplo 10 Bioensayo de Actividad de AXMI-006 sobre Heliothis virescens y Spodoptera frugiperda

Los bioensayos de los cultivos pAX906 sonicados se realizaron utilizando dieta artificial (Multiple Species Diet, Southland Products, Lake Village, Arkansas). Los bioensayos se llevaron a cabo mediante la aplicación de células pAX906 sonicadas, o células de la cepa E. coli como un control, a la superficie de la dieta y permitiendo la superficie de la dieta para secar. Los bioensayos se realizaron en placas de cultivo de tejido de 24-pozos. Los bioensayos se mantuvieron en la oscuridad a 25ºC y 65% de humedad relativa. Las bandejas se sellaron con Breathe Easy Sealing Tape (Diversified Biotech, Boston, MA). Los resultados se registraron a los 5 días.

TABLA 8 Bioensayo de AXMI-006 sobre Spodoptera frugiperda

9

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TABLA 9 Bioensayo de AXMI-006 sobre Heliothis virescens

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El crecimiento reducido se define como tamaño de insecto reducido, y respectivamente alimentación larval reducida. El crecimiento reducido de los insectos también poder demostrar la evasión de la dieta tratada comparada con la dieta sin tratar.

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Ejemplo 11 Actividad como Pesticida de AXMI-008, AXMI-009, y AXMI-014 sobre Trichoplusia ni (Lagarta del Girasol)

Las cepas de Escherichia coli que contienen tanto pAX008, pAX009 o pAX-014, así como un cultivo de Escherichia coli sin transformar se cosecharon en 2 ml de Caldo LB (Luria-Bertani Broth, Becton Dickinson & Company, Sparks, Md.) por 24 horas a 37ºC con agitación a 250 rpm. Las cepas que contienen plásmidos se cosecharon en el cultivo en LB que contiene el antibiótico apropiado para seleccionar el mantenimiento del plásmido en E. coli.

Los bioensayos se realizaron utilizando dieta artificial (Multiple Species Diet, Southland Products, Lake Village, Arkansas) en placas de cultivo de tejido de 24 pozos. Los bioensayos se llevaron a cabo, mediante la aplicación del cultivo de Escherichia coli que contiene pAX-014 en la superficie de la dieta y permitiendo que la superficie de la dieta se seque. Las cepas se aplicaron como cultivos completos a la dieta en una concentración de 40 \mul de cultivo por pozo. Los bioensayos se mantuvieron en la oscuridad a 25ºC y 65% de humedad relativa. Las bandejas se sellaron con Breathe Easy Sealing Tape (Diversified Biotech, Boston, MA). Los resultados se registraron a los 5 días.

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TABLA 10 Actividad como Pesticida sobre T. ni

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Ejemplo 12 Expresión de Genes Delta-Endotoxina en Bacillus

AXMI-004, AXMI-006, AXMI-007, AXMI-008, y AXMI-009 se amplificaron por PCR a partir de los clones del Ejemplo 4, y se clonaron en el Vector de expresión del Bacillus pAX916, por métodos bien conocidos en el oficio. Para AXMI-004 el clon resultante se designó pAX920. Para AXMI-006 el clon resultante se designó pAX921. Para AXMI-007 el clon resultante se designó pAX919. Para AXMI-008 el clon resultante se designó pAX922. Para AXMI-009 el clon resultante se designó pAX917. Los clones resultantes expresaron la proteína relevante cuando se transforman en células de una cepa cry(-) Bacillus thuringiensis. Las cepas Bacillus que contienen genes delta-endotoxina y que expresan las proteínas delta-endotoxina se puedan cultivar sobre una variedad de medios de cultivo convencionales. Una cepa Bacillus que contiene el gen deseado se cultivó en medio CYS (10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/l de KH_{2}PO_{4}; 14 g/l de K_{2}HPO_{4}; 0.5 mM de MgSO_{4}; 0.05 mM de MnCl_{2}; 0.05 mM de FeSO_{4}), hasta que la esporulación fue evidente por análisis microscópico. Las muestras se prepararon, y las proteínas delta-endotoxina se examinaron para actividad insecticida en bioensayos contra importantes plagas de insectos.

Métodos

Para preparar el medio CYS: 10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/l de KH_{2}PO_{4}; 14 g/l de K_{2}HPO_{4}; 0.5 mM de MgSO_{4}; 0.05 mM de MnCl_{2}; 0.05 mM de FeSO_{4}. La mezcla CYS tendría pH 7, si es necesario se ajusta. El NaOH o HCl se prefieren. El medio luego se somete a autoclave y se adicionan 100 ml de 10X glucosa filtrada después del autoclave. Si la solución resultante es turbia, se puede agitar a temperatura ambiente para aclarar.

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Ejemplo 13 Secuencia de Aminoácido N-terminal de AXMI-004 Expresado en Bacillus

El análisis de AXMI-004 expresado en Bacillus sugirió que el producto de la proteína detectada en estos cultivos, se puede reducir en tamaño relativo a la proteína AXMI-004 de cuerpo entero. Dado que muchas proteínas endotoxina se dividen en el N-terminal después de la expresión en Bacillus, se determinó que el N-terminal de la proteína AXMI-004 resultante de la expresión del Bacillus. Las muestras de proteínas a partir de AXMI-004 se separaron sobre geles PAGE, y la proteína transferida a la membrana PVDF por métodos conocidos en el oficio. La banda de la proteína correspondiente con AXMI-004 se retiró por incisión. La secuencia de aminoácido N-terminal de esta proteína se determinó, mediante la degradación de Edman serial, según se conoce en el oficio. La secuencia obtenida fue de la siguiente manera:

ERFDKNDALE

La comparación de esta secuencia de aminoácido con la secuencia de AXMI-004 de cuerpo entero (SEQ ID No:3) demuestra que esta secuencia amino resulta de la división interna de la AXMI-004 después de la expresión en Bacillus, resultando en una proteína con un N-terminal correspondiente con el aminoácido 28 de la SEQ ID No:3 (revelada como SEQ ID No:5).

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Ejemplo 14 Bioensayo de AXMI-004 sobre Plagas de Insectos

La actividad insecticida de AXMI-004 se estableció utilizando procedimientos de bioensayos aceptados, utilizando un cultivo celular de Bacillus esporulado lisado que expresa AXMI-004. El cultivo de Bacillus se cultivó en 50 ml de medio CYS para tanto el bioensayo estándar como bioensayos LC_{50}. Los cultivos luego se cultivaron por 2 a 3 días a 30ºC, 250 rpm hasta que las células se esporularon. La esporulación se determinó examinando microscópicamente para la presencia de esporas. Las muestras de proteína AXMI-004 se prepararon por centrifugación de los cultivos esporulados a 12,000 x g por 10 min. El pella se recolectó y se resuspendió en 4 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8.0. La suspensión se sometió a ultrasonido por 20 segundos (en el poder superior utilizando una micro sonda) mientras se coloca el tubo sobre hielo. La concentración de la proteína de la muestra se determinó por electroforesis sobre un gradiente SDS 4-20% en gel acrilamida, junto con una cantidad conocida de albúmina de suero de bovino (BSA) (Figura 8). La concentración de AXMI-004 se determinó que era 0.4 \mug/ul.

La actividad insecticida de AXMI-004 se probó utilizando un bioensayo de tratamiento de la superficie con dieta artificial (Multiple Species diet, Southland Products, Lake Village, Arkansas) preparado según se conoce en el oficio. Los bioensayos se llevaron a cabo, mediante la aplicación del cultivo de Bacillus que expresa AXMI-004 con la superficie de la dieta y permitiendo que la superficie se seque al ambiente. Los bioensayos estándar utilizaron cinco huevos por pozo y los bioensayos LC_{50} utilizaron diez larvas de insectos neonatos por pozo. Los huevos o larvas se aplicaron utilizando un pincel de punta fina. Los bioensayos de superficie estándar se llevaron a cabo en placas de cultivo de tejido de 24 pozos. 40 \mul de cada muestra se aplicó a cada pozo. Dado que cada pozo tiene un área superficial de 2 cm^{2} (placa fuente), una muestra de 40 \mul de célula lisada contenía aproximadamente 0.4 \mug/ul de AXMI-004. Los bioensayos donde la LC_{50} se determinó se hicieron en placas de cultivo de tejido de 48 pozos, cada pozo representa un área superficial de 1 cm^{2} (fuente) utilizando aproximadamente 20 \mul de 0.4 \mug/ul de AXMI-004 por pozo. La cantidad final de la proteína AXMI-004 en cada bioensayo fue aproximadamente 8 \mug/cm^{2}. Las bandejas del bioensayo se sellaron con Breathe Easy Sealing Tape (Diversified Biotech, Boston MA). Las muestras control incluyeron muestras de medio solo, y los pozos que no se trataron con muestras. Los bioensayos luego se mantuvieron por cinco días en la oscuridad a 25ºC y 65% de humedad relativa y los resultados se registraron.

TABLA 11 Actividad Insecticida de AXMI-004

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AXMI-004 mostró fuerte actividad insecticida (100% de mortalidad) contra Ostrinia nubilalis y Heliothis virescens. AXMI-004 también mostró una actividad insecticida de 50-75% de mortalidad contra Pectinophora gossypiella. Una concentración de 43 \mug/cm^{2} de AXMI-004 dio un 70% de mortalidad contra Pectinophora gossypiella. AXMI-004 crecimiento reducido severamente del cultivo de Agrotis ipsilon, Heliothis zea, y Spodoptera frugiperda.

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Ejemplo 15 Cuantificación de la Actividad Insecticida de AXMI-004 contra Heliothis virescens y Ostrinia nubilalis

La LC_{50} de la proteína AXMI-004 sobre larvas Ostrinia nubilalis y Heliothis virescens se determinó por pruebas de un rango de concentraciones de la proteína AXMI-004 en bioensayos de insectos, y la aplicación de estas muestras de proteínas en la superficie de la dieta del insecto. La mortalidad se registro en cada concentración de la proteína y se analizó utilizando un programa de análisis Probit. Los resultados fueron significantes en el 95% de intervalo de seguridad. Dado que las pruebas se realizaron por contaminación de la superficie, Las LC_{50}s se determinaron asumiendo entonces que la muestra de proteína total permanece en la superficie durante el ensayo, con poca difusión debajo del nivel ingerido por los insectos. De esta manera, los valores determinados pueden subestimar un poco la toxicidad de la proteína AXMI-004 en los insectos de la prueba.

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TABLA 12 LC_{50} de AXMI-004 sobre Ostrinia nubilalis

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TABLA 13 LC_{50} de AXMI-004 sobre Heliothis virescens

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Ejemplo 16 Cuantificación de la Actividad Insecticida de AXMI-004, AXMI-006, AXMI-007, y AXMI-009 contra Lygus lineolaris

Los lisados bacterianos se prepararon por cultivo del Bacillus en 50 ml de medio CYS por 60 horas. El cultivo de Bacillus luego se centrifugó a 12,000 rpm por diez minutos y el sobrenadante se descartó. El pella se resuspendió en 5 ml de Tris HCl 20 mM a pH 8.

Los bioensayos se realizaron por corte de ambos la punta y la tapa de un tubo Eppendorf para formar una cámara de alimentación. La proteína insecticida o control se presentó en el insecto en una solución que se vertió en la tapa y se cubre con parafilm (Pechiney Plastic Packaging, Chicago IL) que el insecto podría perforar para alimentarse. El tubo Eppendorf se coloca de nuevo en la tapa arriba y abajo y 1º o 2º instar Lygus nymphs se colocaron en la cámara del Eppendorf con un pincel de punta fina. El corte de la punta del tubo del Eppendorf se selló con parafilm creando una cámara de ensayo. La cámara de ensayo resultante se incubó a temperatura ambiente la tapa hacia abajo. Las proteínas insecticidas se probaron en una solución de 15% de glucosa en una concentración de 6.6 ug/ml.

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TABLA 14 Actividad Insecticida sobre Lygus lineolaris

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Ejemplo 17 Bioensayo de AXMI-008 sobre Tenebrio molitor

Las muestras de cultivos de Bacillus que expresan AXMI-008 se prepararon y se probaron para la actividad de pesticida sobre Tenebrio molitor. Cuando pAX 922 se prepara como una fracción insoluble a pH 4.0 mostró actividad contra el comúnmente llamado gusano de la harina.

Las muestras de AXMI-008 se prepararon a partir de un cultivo de una cepa de Bacillus que contiene pAX 922. La muestra del bioensayo se preparó por la siembra de un cultivo en medio CYS por 4 días, hasta la esporulación. La muestra se centrifugó a 10,000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se descartó. El pella se lavó en Tris 20 mM pH 8 y se centrifugó a 10,000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se descartó y el pella se resuspendió en 3 mls de Citrato de Sodio 50 mM y Cloruro de Sodio 25 mM con DTT 2 mM a pH 4. La muestra se incubó a 37ºC por 1 hora. Después de incubar la muestra se centrifugó a 13,000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se descartó. El pella se resuspendió en Citrato de Sodio 50 mM y Cloruro de Sodio 25 mM a pH 4.

Los bioensayos de muestras sobre Tenebrio molitor se realizaron sobre una dieta artificial (Southern Corn Rootworm Diet, Bioserv, Frenchtown, NJ, #F9757B) en placas de cultivo de tejido de 24 pozos. La muestra se aplicó como un tratamiento de superficie con una concentración de Axmi008 a 8 ug/cm^{2} y se deja secar al ambiente. Los insectos se aplicaron utilizando un pincel de punta fina. Las bandejas del bioensayo se sellaron con Breathe Easy Sealing Tape (Diversified Biotech, Boston, MA) y se incubaron sin luz a 65% de humedad relativa, 25ºC. por siete días y los resultados se registraron.

TABLA 15

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Ejemplo 18 Bioensayo de AXMI-009 Proteína en Plagas de Coleópteros

Los bioensayos de las preparaciones de la proteína AXMI-009 se realizaron, pipeteando 40 \mul de la fracción insoluble sobre una superficie de 2 cm^{2} de la dieta para una concentración de la proteína total final de 8 \mug/cm^{2}. Diabrotica virgifera virgifera y Diabrotica undecimpunctata se probaron utilizando Southern Corn Rootworm Diet (Bioserv, Frenchtown, NJ, #F9757B). Los bioensayos se llevaron a cabo, mediante la aplicación del cultivo Bacillus que expresa AXMI-009 en la superficie de la dieta y permitiendo que la superficie de la dieta se seque. Los bioensayos se realizaron en placas de cultivo de tejido de 24 pozos. Los bioensayos estándar utilizaron 25 huevos por pozo. Los huevos se aplicaron en una solución que contiene 0.1% de agar y 30 ug/ml nistatina. Las bandejas se sellaron con Breathe Easy Sealing Tape (Diversified Biotech, Boston, MA) y las tapas se colocaron otra vez sobre las bandejas. Los bioensayos se incubaron sin luz a 65% de Humedad Relativa (RH), 25ºC por siete días. La actividad se vio con la fracción insoluble para ambos Diabrotica virgifera virgifera y Diabrotica undecimpunctata. Los controles fueron únicamente medio, solución reguladora de Tris 1 mM a pH 10.5, y el vector de expresión del Bacillus pAX916.

TABLA 16 Gusano de la Raíz del Maíz (Diabrotica vinrifera virgifera)

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TABLA 17 Gusano de la Raíz del Maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata)

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Ejemplo 19 Vectorización de la Expresión de la Planta

El ADN de la región codificante delta-endotoxina se conecta operablemente con apropiadas secuencias promotor y de terminación para la expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en el oficio y pueden incluir el promotor actina del arroz o promotor de la ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 o promotor 35S CaMV de Arabidopsis para la expresión en dicotiledóneas, y las terminadoras nos o PinII. También las técnicas para producir y confirmar las construcciones promotor - gen -terminador son bien conocidas en el oficio.

Los cassettes de expresión de plantas descritos anteriormente se combinan con un marcador genético de la planta apropiado, para ayudar en la selección de células y tejidos transformados, y se ligan en vectores de transformación de plantas. Estos pueden incluir vectores binarios a partir de la transformación mediada del Agrobacterium o vectores plásmido simples para transformación aerosol o biolística.

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Ejemplo 20 Transformación de las Células del Maíz

Las espigas del maíz se recolectaron 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislaron a partir de las espigas, y aquellos embriones 0.8-1.5 mm en tamaño se utilizaron para la transformación. Los embriones se colocaron en placas escutelo cara-arriba en un medio de incubación apropiado, tales como medio DN62A5S (3.98 g/L de Sales N6; 1 mL/L (de 1000x Stock) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparigina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1.4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L Casaminoacidos; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (de 1 mg/mL de Stock) 2,4-D), y se incubaron durante la noche a 25ºC en la oscuridad.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren sobre medio osmótico por 30-45 minutos, luego se transfiere a una placa de irradiación (ver, por ejemplo, PCT Publication No. WO/0138514 y Patente U.S. No. 5,240,842).

Las construcciones de ADN diseñadas para expresar la delta-endotoxina en células vegetales se aceleran en tejidos de plantas empleando un acelerador de haz de aerosol, utilizando condiciones esencialmente como se describe en PCT Publication No. WO/0138514. Después de la radiación, los embriones se incubaron por 30 min sobre el medio osmótico, luego se colocaron en el medio de incubación durante la noche a 25ºC en la oscuridad. Para evitar dañar excesivamente los explantes irradiados, se incubaron por al menos 24 horas antes de la transferencia a medios de recuperación. Los embriones luego se diseminaron sobre el medio de período de recuperación, por 5 días, 25ºC en la oscuridad, luego se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incubaron en medio de selección por hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere al medio de maduración del embrión, hasta que se observa, la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos resultantes maduros, luego se colocan bajo una luz baja, y el proceso de regeneración se inicia por métodos conocidos en el oficio. Los brotes resultantes se dejan enraizar sobre medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de criadero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

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Ajustar el pH de la solución a pH 5.8 con KOH 1N/KCl 1N, adicionar Gelrite (Sigma) a 3 g/L, y autoclavar. Después se enfría a 50ºC, adicionar 2 ml/L de una solución stock 5 mg/ml de Nitrato de Plata (Phytotechnology Labs). La fórmula produce aproximadamente 20 placas.

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Ejemplo 21 Transformación en Células de la planta por Transformación Mediada del Agrobacterium

Las espigas se recolectaron 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislaron a partir de las espigas, y aquellos embriones con un tamaño 0.8-1.5 mm se utilizaron para la transformación. Los embriones se colocaron en placas escutelo cara-arriba en un medio de incubación apropiado, y se incubaron durante la noche a 25ºC en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para la transferencia mediada Ti plásmido por 5-10 min, y luego se plantan sobre medio de co-cultivación por 3 días (25ºC en la oscuridad). Después de la co-cultivación, los explantes se transfieren al medio del periodo de recuperación por cinco días (a 25ºC en la oscuridad). Los explantes se incubaron en medio de selección por hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere al medio de maduración del embrión, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos resultantes maduros luego se colocan bajo una luz baja, y el proceso de regeneración se inicia según se conoce en el oficio. Los brotes resultantes se dejan enraizar sobre el medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de criadero y se propagan como plantas transgénicas.

Conclusiones

Las proteínas delta-endotoxina de la presente invención tienen actividad contra numerosas plagas, como se muestra en los ejemplos anteriores. AXMI-004 tiene actividad de pesticida contra las plagas que incluyen Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis zea, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Pectinophora gossypiella, Manduca Sexta, Trichoplasia ni, y Lygus lineolaris.

Aunque la invención precedente ha sido descrita con detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será evidente que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Delta-Endotoxin Genes and Methods for Their Use

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 045600/274379

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/448,632

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<151> 2003-02-20

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<150> 60/448,633

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<151> 2003-02-20

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<150> 60/448,797

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<151> 2003-02-20

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/448,806

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-02-20

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/448,810

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-02-20

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/448,812

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<151> 2003-02-20

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<160> 52

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 2190

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 1

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21

22

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<210> 2

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<211> 1890

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1890)

\newpage

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<400> 2

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23

24

25

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<210> 3

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<211> 629

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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26

27

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<210> 4

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<211> 1806

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1806)

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<400> 4

28

29

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 601

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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31

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 2208

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2208)

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<400> 6

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33

34

35

36

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<210> 7

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<211> 735

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 7

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37

38

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<210> 8

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<211> 2235

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2235)

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<400> 8

39

40

41

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<210> 9

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<211> 774

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 9

42

43

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<210> 10

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<211> 2085

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2085)

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<400> 10

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44

45

46

47

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<210> 11

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<211> 694

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 11

48

49

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<210> 12

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<211> 5980

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 12

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50

51

52

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<210> 13

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<211> 2082

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2082)

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<400> 13

53

54

55

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<210> 14

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<211> 693

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 14

56

57

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<210> 15

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<211> 2073

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2073)

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<400> 15

58

59

60

61

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<210> 16

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<211> 690

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 16

62

63

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<210> 17

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<211> 1686

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1686)

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<400> 17

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64

65

66

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<210> 18

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<211> 561

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 18

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67

68

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<210> 19

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<211> 2049

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2049)

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<400> 19

69

70

71

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<210> 20

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<211> 682

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 20

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72

73

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<210> 21

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<211> 2016

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<212> DNA

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2016)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1986

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1986)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

79

80

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 661

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2019

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2019)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

87

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 672

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

89

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2019

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2010)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

91

92

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 669

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

97

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

100

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1189

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

103

104

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 719

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

106

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 633

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

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111

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 659

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

113

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

115

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

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<211> 1180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

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117

118

119

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

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<211> 1136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

120

121

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 475

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

124

125

126

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

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<211> 1157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

128

129

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 675

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

131

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

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<211> 648

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 682

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

135

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

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<211> 529

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

137

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

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<211> 674

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

139

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 675

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 659

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

143

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

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145

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 666

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

147

148

149

\newpage

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<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

150

151

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No:1, 2 o 4;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del nucleótido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia con la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, en donde dicha secuencia del nucleótido codifica un polipétido que tiene actividad de pesticida;

c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipétido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5;

d) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del nucleótido que codifica un polipétido que tiene al menos 95% de identidad del aminoácido de la secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5 en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida; y,

e) un complemento de cualquiera de a)-d).

2. Una molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia del nucleótido es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde dicha secuencia sintética tiene un contenido de GC aumentado, relativo al contenido de GC de la SEQ ID No: 1, 2 o 4.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 4.

6. La célula huésped de la reivindicación 5 es decir una célula huésped bacteriana.

7. La célula huésped de la reivindicación 5 es decir una célula vegetal.

8. Una planta transgénica que comprende la célula huésped de la reivindicación 7.

9. La planta transgénica de la reivindicación 8, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza.

10. Semilla transgénica de una planta de la reivindicación 8.

11. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipétido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No: 3 o 5.

b) un polipétido codificado por la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida;

c) un polipétido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5, en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida; y,

d) un polipétido que se codifica por una secuencia del nucleótido es decir al menos 95% idéntica con la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida.

12. El polipéptido de la reivindicación 11, que además comprende una secuencia de aminoácidos heterólogos.

13. Un anticuerpo que se une selectivamente a un polipétido de la reivindicación 11.

14. Una composición que comprende el polipétido de la reivindicación 11.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde dicha composición se selecciona del grupo que consiste de un polvo, pulverizado, pella, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución.

16. Un método para preparar la composición de la reivindicación 14 por deshidratación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis.

17. La composición de la reivindicación 14, en donde dicha composición se prepara por deshidratación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis.

18. La composición de la reivindicación 14, que comprende de 1% a 99% en peso de dicho polipétido.

19. Un método para producir un polipétido con actividad de pesticida, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 5, bajo condiciones en las cuales, se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica el polipétido, dicho polipétido que se selecciona del grupo que consiste de:

a) un polipétido que comprende el aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5;

c) un polipétido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5,

en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida; y,

d) un polipétido que se codifica por una secuencia del nucleótido es decir al menos 95% idéntica a una secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida.

20. Un método para controlar una población de insectos lepidóptero o coleóptero que comprende el contacto de dicha población con una cantidad efectiva como pesticida de un polipétido de la reivindicación 11.

21. Un método para matar un insecto lepidóptero o coleóptero, que comprende el contacto de dicha plaga con, o la alimentación con dicha plaga, una cantidad efectiva como pesticida de un polipétido de la reivindicación 11.

22. Una planta que tiene incorporado establemente en su genoma un constructor de ADN que comprende una secuencia del nucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de pesticida, en donde dicha secuencia del nucleótido se selecciona del grupo que consiste de:

a) una secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4;

b) una secuencia del nucleótido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia con una secuencia del nucleótido de la SEQ ID No: 1, 2 o 4, en donde dicha secuencia del nucleótido codifica un polipétido que tiene actividad de pesticida;

c) una secuencia del nucleótido que codifica un polipétido que comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5; y,

d) una secuencia del nucleótido que codifica un polipétido que tiene al menos 95% de identidad de aminoácido de la secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No:3 o 5,

en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida;

en donde dicha secuencia del nucleótido se liga operablemente a un promotor que conduce la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.

23. La planta de la reivindicación 22, en donde dicha planta además comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No:17.

24. Una célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma un constructor de ADN que comprende una secuencia del nucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de pesticida, en donde dicha secuencia del nucleótido se selecciona del grupo que consiste de:

a) una secuencia del nucleótido de la SEQ ID No:1, 2 o 4;

en donde dicho polipétido tiene actividad de pesticida;

25. La célula vegetal de la reivindicación 24, en donde dicha célula vegetal además comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID No:17.