ES2911327T3 - Genes de toxinas y procedimientos para su uso - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:50; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:50, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111, en la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes de toxinas y procedimientos para su uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere el campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas Gram-positivas que se caracteriza por su capacidad de producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero que son inofensivas para las plantas y otros organismos no dirigidos. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas pueden utilizarse como insecticidas ambientalmente aceptables para controlar las plagas de insectos agrícolas o los insectos vectores de diversas enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristalinas (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida contra las larvas de lepidópteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra los órdenes de plagas Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga y Acari, así como otros órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhelminthes y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.) Estas proteínas se clasificaron originalmente como CryI a CryV con base principalmente en su actividad insecticida. Las principales clases eran específicas de lepidópteros (I), específicas de lepidópteros y dípteros (II), específicas de coleópteros (III), específicas de dípteros (IV) y específicas de nematodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron además en subfamilias; a las proteínas más relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras de división como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. Las proteínas aún más relacionadas dentro de cada división recibieron nombres como Cry1C1, Cry1C2, etc.

El documento WO 2005/066202 divulga ácidos nucleicos naturales y recombinantes obtenidos a partir de genes de la familia Cry9 de Bacillus thuringiensis, con un enfoque particular en la actividad de las pellas de cultivo de las colonias de Bacillus sobre las plagas del maíz.

Recientemente se ha descrito una nueva nomenclatura para los genes Cry con base en la homología de la secuencia de aminoácidos y no en la especificidad de los insectos (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre único que incorpora un rango primario (un número árabe), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula) y un rango cuaternario (otro número árabe). En la nueva clasificación, los números romanos se han cambiado por números arábigos en el rango primario. Las proteínas con menos de 45 % de identidad de secuencia tienen diferentes rangos primarios, y los criterios para los rangos secundarios y terciarios son 78 % y 95 %, respectivamente.

La proteína cristalina no muestra actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por las proteasas del tracto digestivo del insecto hasta convertirse en una molécula tóxica activa. (Hofte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores del borde en cepillo apical en el intestino medio de las larvas objetivo y se inserta en la membrana apical creando canales o poros iónicos, lo que provoca la muerte de las larvas.

Las delta-endotoxinas suelen tener cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa y participa en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de "rollo de gelatina" (de Maagd et al., 2001, supra). Los Dominios II y III participan en el reconocimiento y la unión de los receptores, por lo que se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

El uso intensivo de insecticidas con base en B. thuringiensis ya ha dado lugar a resistencias en poblaciones de campo de la polilla de la espalda del diamante, Plutella xylostella (Ferré y Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). El mecanismo más común de resistencia es la reducción de la unión de la toxina a su(s) receptor(es) específico(s) del intestino medio. Esto también puede conferir resistencia cruzada a otras toxinas que comparten el mismo receptor (Ferré y Van Rie (2002)).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan composiciones y procedimientos para conferir resistencia a las plagas a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos de delta-endotoxina, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias polipeptídicas de la endotoxina y los anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden utilizarse en construcciones de a Dn o en casetes de expresión para su transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para su expresión en un organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos y semillas.

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas correspondientes a secuencias de ácido nucleico de delta-endotoxina. Además, se incluyen las secuencias de aminoácidos correspondientes a los polinucleótidos. En particular, se divulgan en el presente documento moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO:61-121 y 133­ 141, o una secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-60 y 124-132, así como las variantes y fragmentos de las mismas. La invención se refiere más particularmente a una molécula de ácido nucleico definida por referencia a los números SEQ ID específicos, como se establece en las reivindicaciones 1 a 4. También se divulgan secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos como la divulgada en el presente documento, o que hibridan con una secuencia como la divulgada en el presente documento.

La invención también se refiere a un vector, una célula anfitriona o una planta establecida en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 o 15, o a un polipéptido aislado con actividad pesticida de acuerdo con la reivindicación 10, un anticuerpo o una composición de acuerdo con las reivindicaciones 11, 12 o 13.

Las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento son útiles para la producción de organismos con resistencia a los pesticidas, específicamente bacterias y plantas. Estos organismos y las composiciones derivadas de ellos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones descritas en el presente documento también son útiles para generar proteínas delta-endotoxina alteradas o mejoradas que tengan actividad pesticida, o para detectar la presencia de proteínas delta-endotoxina o ácidos nucleicos en productos u organismos. La invención también se refiere a los procedimientos establecidos en las reivindicaciones 14 y 16.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención y divulgación se refieren a composiciones y procedimientos para regular la resistencia a las plagas en los organismos, en particular las plantas o las células vegetales. Los procedimientos implican la transformación de organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta-endotoxina de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida. Así, se proporcionan bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas. Las composiciones son ácidos nucleicos de delta-endotoxina y proteínas de Bacillus thuringiensis. Las secuencias se utilizan en la construcción de vectores de expresión para su posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes de delta-endotoxina, y para la generación de proteínas pesticidas alteradas por procedimientos conocidos en la técnica, tal como el intercambio de dominios o la mezcla de ADN. Las proteínas se utilizan para controlar o matar poblaciones de lepidópteros, coleópteros y nematodos, y para producir composiciones con actividad pesticida.

Por "delta-endotoxina" se entiende una toxina de Bacillus thuringiensis que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, pero sin limitarse a, miembros de los órdenes Lepidoptera, Diptera y Coleóptera o miembros del filo Nematoda, o una proteína que tiene homología con dicha proteína. En algunos casos, se han aislado proteínas de delta-endotoxina de otros organismos, incluyendo Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas delta-endotoxina incluyen secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias nucleotídicas de longitud completa divulgadas en el presente documento, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de inicio alternativo corriente abajo, o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad pesticida. El procesamiento puede producirse en el organismo en el que se expresa la proteína o en la plaga tras la ingestión de la proteína.

Las delta-endotoxinas incluyen las proteínas identificadas como cryl a cry43, cytl y cyt2, y la toxina similar a Cyt. Actualmente se conocen más de 250 especies de delta-endotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Para una lista más amplia, véase Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y para actualizaciones regulares véase Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature", en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

Se proporcionan en el presente documento nuevas secuencias de nucleótidos aisladas que confieren actividad pesticida. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxina. La proteína resultante de la traducción de este gen permite a las células controlar o matar las plagas que la ingieren.

La invención se define más particularmente por el objeto comprendido en las reivindicaciones 1 a 16, dirigidas respectivamente a moléculas de ácido nucleico, vectores, células huésped, plantas, polipéptidos con actividad pesticida, anticuerpos, composiciones y procedimientos para controlar o matar una población de plagas de lepidópteros o coleópteros, o para proteger una planta de una plaga.

Moléculas de Ácido Nucleico Aisladas, y Fragmentos de las Mismas

Un aspecto descrito en el presente documento se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos de delta-endotoxina o porciones biológicamente activas de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican delta-endotoxina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados mediante análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, pero preferentemente es ADN bicatenario.

Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o del medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente secuencias codificadoras de proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. A efectos de la presente divulgación, "aislado" cuando se utiliza para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye a los cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica la delta-endotoxina puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Una proteína de delta-endotoxina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (por peso seco) de proteína no delta-endotoxina (también referida en el presente documento como una "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente divulgación incluyen la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1-60 y 124-132, y variantes, fragmentos y complementos de los mismos. Por "complemento" se entiende una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada, de manera que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos dada para formar un dúplex estable. La correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína delta-endotoxina codificada por esta secuencia de nucleótidos se establece en las SEQ ID NO:61-121 y 133-141.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican la deltaendotoxina también están comprendidas en la presente divulgación. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta-endotoxina. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina, o puede ser un fragmento que puede utilizarse como sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los procedimientos que se divulgan a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de deltaendotoxina comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200, 1.250, 1.300, 1.350, 1400, 1.450, 1.500, 1.550, 1.600, 1.650, 1700, 1750, 1.800, 1.850, 1.900, 1.950, 2000, 2050, 2100, 2.150, 2.200, 2.250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2.500, 2.550, 2.600, 2.650, 2.700, 2.750, 2.800, 2.850, 2.900, 2.950, 3.000, 3.050, 3.100, 3.150, 3.200, 3.250, 3.300, 3.350 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos codificantes de delta-endotoxina de longitud completa divulgada en el presente documento, dependiendo del uso previsto. Por nucleótidos "contiguos" se entiende los residuos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente divulgación codificarán fragmentos de proteína que conservan la actividad biológica de la proteína delta-endotoxina y, por tanto, conservan la actividad pesticida. Por "conserva la actividad" se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de la actividad pesticida de la proteína delta-endotoxina. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293y Patente de EE. UU. No. 5,743,477.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos codificadora de delta-endotoxina que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la divulgación codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína delta-endotoxina de longitud completa de la divulgación.

Las proteínas delta-endotoxina de la presente divulgación están codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-60 y 124-132. Las proteínas delta-endotoxina de la presente invención están codificadas por una molécula de ácido nucleico como se establece en las reivindicaciones 1 o 2. Por "suficientemente idéntica" se entiende una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60 % o 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente 70 % o 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente 80 % o 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos en el presente documento utilizando parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, etc.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para una comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra realización, la comparación es a través de la totalidad de la secuencia de referencia (por ejemplo, a través de la totalidad de uno de los SEQ ID NO: 1-60 y 124-132, o en la totalidad de una de las SEQ ID NO:61-121 y 133-141). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse mediante técnicas similares a las descritas a continuación, con o sin permitir brechas. Al calcular el porcentaje de identidad, se cuentan normalmente las coincidencias exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Este algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico similares a la delta-endotoxina de la invención. Se pueden realizar búsquedas de proteínas BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína delta-endotoxina de la invención. Para obtener alineaciones separadas con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast puede utilizarse para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre las moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede realizarse manualmente mediante una inspección.

Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, por lo que puede proporcionar datos sobre la conservación de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tal como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Tras la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de un programa de software útil para el análisis de los alineamientos de ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite evaluar la similitud de aminoácidos (o ADN) y la identidad entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software GCG Wisconsin Genetics, Version 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE. UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4.

A menos que se indique lo contrario, GAP Version 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453se utilizará para determinar la identidad o similitud de la secuencia utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un peso GAP de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un peso GAP de 8 y un peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También pueden utilizarse programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genere un alineamiento que tenga idénticas coincidencias de residuos de nucleótidos y un idéntico porcentaje de identidad de secuencia cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por GAP Versión 10. La invención también abarca las moléculas de ácido nucleico variantes. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican la deltaendotoxina incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas de la delta-endotoxina divulgadas en el presente documento pero que difieren de forma conservadora debido a la degeneración del código genético, así como las que son suficientemente idénticas, como se ha comentado anteriormente. Las variantes alélicas naturales se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación, como se describe a continuación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que se han generado, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican las proteínas delta-endotoxina divulgadas en la presente invención, como se discute a continuación. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservando la actividad pesticida. Por "conserva la actividad" se entiende que la variante tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 70 % o al menos aproximadamente 80 % de la actividad pesticida de la proteína nativa. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480­ 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293y Patente de EE. UU. No. 5,743,477.

El artesano experto apreciará además que se pueden introducir cambios mediante la mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención, dando lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxina codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Así, pueden crearse moléculas de ácido nucleico aisladas variantes introduciendo una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, de manera que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Dichas secuencias de nucleótidos variantes también se incluyen en la presente invención.

Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de tipo silvestre de una proteína delta-endotoxina sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas suelen tener cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa y participa en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de "rollo de gelatina" (de Maagd et al., 2001, supra). Los Dominios II y III participan en el reconocimiento y la unión de los receptores, por lo que se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que conservan la función. En general, estas sustituciones no se harían para los residuos de aminoácidos conservados, o para los residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, cuando dichos residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Entre los ejemplos de residuos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína se incluyen, por ejemplo, los residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la presente invención y las secuencias conocidas de deltaendotoxina. Entre los ejemplos de residuos que se conservan pero que pueden permitir sustituciones conservadoras de aminoácidos y seguir manteniendo la actividad se incluyen, por ejemplo, los residuos que sólo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la presente invención y las secuencias conocidas de delta-endotoxina. Sin embargo, un experto en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener pequeñas alteraciones conservadas o alteraciones no conservadas en los residuos conservados.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes pueden hacerse introduciendo mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser examinados para ver la capacidad de conferir la actividad de la delta-endotoxina para identificar los mutantes que retienen la actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse mediante técnicas de ensayo estándar.

Utilizando procedimientos tales como PCR, la hibridación y otros similares, pueden identificarse las correspondientes secuencias de delta-endotoxina, teniendo dichas secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un procedimiento de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de la delta-endotoxina puede utilizarse para cribar bibliotecas de ADNc o genómicas. Los procedimientos para la construcción de tales bibliotecas de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001, supra. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación pueden hacerse marcando oligonucleótidos sintéticos con base en la secuencia de nucleótidos codificantes de delta-endotoxina conocida que se divulga en el presente documento. También pueden utilizarse cebadores degenerados diseñados con base en nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos codificada. La sonda comprende típicamente una región de secuencia nucleotídica que hibrida bajo condiciones estrictas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica codificadora de la delta-endotoxina de la invención o un fragmento o variante de la misma. Los procedimientos para la preparación de sondas para la hibridación son generalmente conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001, supra en el presente documento.

Por ejemplo, una secuencia entera de delta-endotoxina divulgada en el presente documento, o una o más porciones de la misma, puede utilizarse como una sonda capaz de hibridar específicamente con las correspondientes secuencias similares a la delta-endotoxina y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y son preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden utilizarse para amplificar las correspondientes secuencias de delta-endotoxina de un organismo elegido mediante PCR. Esta técnica puede utilizarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el cribado de hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones estrictas. Por "condiciones estrictas" o "condiciones estrictas de hibridación" se entiende las condiciones en las que una sonda se hibrida con su secuencia objetivo en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces por encima del fondo). Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Controlando la rigurosidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo que son 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir cierto desajuste en las secuencias, de modo que se detecten grados de similitud más bajos (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1,000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizadores tal como la formamida. Las condiciones ejemplares de baja rigurosidad incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, 1 M de NaCl, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37 °C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trisódico) a 50 a 55 °C. Las condiciones ejemplares de rigor moderado incluyen la hibridación en 40 a 45 % de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0,5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones ejemplares de alta rigurosidad incluyen la hibridación en 50 % de formamida, 1 M de NaCl, 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.1X SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender aproximadamente 0,1 % a 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor a aproximadamente 24 horas, normalmente aproximadamente 4 y 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la T^m puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (% GC) - 0,61 (% forma) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T^m es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que 50 % de una secuencia objetivo complementaria se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. La T^m se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1 % de desajuste; así, la T^m, la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90 % de identidad, la T^m puede disminuirse 10 °C. Por lo general, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (T^m) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (T^m); las condiciones moderadamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (T^m); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (T^m). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y la T^m deseada, las personas con conocimientos ordinarios comprenderán que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o de lavado están inherentemente descritas. Si el grado de desajuste deseado da lugar a una T^m menor que 45 °C (solución acuosa) o a 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para poder utilizar una temperatura más elevada. Una extensa guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteínas Aisladas y Variantes y Fragmentos de las Mismas

Las proteínas delta-endotoxina también se incluyen en la presente divulgación o invención. Por "proteína deltaendotoxina" se entiende, de acuerdo con la divulgación, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:61-121 y 133-141. También se proporcionan fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de los mismos, que pueden utilizarse para practicar los procedimientos de la presente divulgación. La invención se refiere más particularmente a un polipéptido aislado como se define en la reivindicación 10.

Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos polipeptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:61-121 y 133-141 y que presentan actividad pesticida. Una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar su actividad pesticida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293y Patente de EE. UU. No. 5,743,477. Como se utiliza aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:61-121 y 133-141. Sin embargo, la divulgación abarca otros fragmentos, como cualquier fragmento de la proteína mayor de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200, 1.250 o 1.300 aminoácidos.

Por "variantes" se entienden las proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:61-121 y 133-141. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-60 y 124-132, o un complemento de los mismos, bajo condiciones estrictas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservando la actividad pesticida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293y Patente de EE. UU. No. 5,743,477.

Los genes bacterianos, como los genes axmi de la presente divulgación, a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en proximidad al comienzo del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, no suele determinarse a priori cuáles de estos codones se utilizan de forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede conducir a la generación de proteínas delta-endotoxina que codifican la actividad pesticida. Estas proteínas delta-endotoxina están incluidas en la presente divulgación y pueden utilizarse en los procedimientos descritos en el presente documento.

También se incluyen los anticuerpos contra los polipéptidos reivindicados. Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Patente de Ee . UU. No. 4,196,265).

Variantes Alteradas o Mejoradas

Se reconoce que las secuencias de ADN de una delta-endotoxina pueden ser alteradas por diversos procedimientos, y que estas alteraciones pueden dar lugar a secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por una delta-endotoxina de la presente invención o divulgación. Esta proteína puede alterarse de diversas maneras, incluyendo sustituciones de aminoácidos, supresiones, truncamientos e inserciones de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO:61-121 y 133-141, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130 o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos.

Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína delta-endotoxina mediante mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en la evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una delta-endotoxina para conferir actividad pesticida puede mejorarse mediante el uso de dichas técnicas en las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se puede expresar una delta-endotoxina en células huésped que presenten altas tasas de desincorporación de bases durante la replicación del ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene). Tras la propagación en dichas cepas, se puede aislar el ADN de la delta-endotoxina (por ejemplo, preparando ADN plasmídico, o amplificando por PCR y clonando el fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la delta-endotoxina en una cepa no mutagénica, e identificar los genes mutados de la delta-endotoxina con actividad pesticida, por ejemplo, realizando un ensayo para comprobar la actividad pesticida. Generalmente, la proteína se mezcla y se utiliza en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir el contacto de las plantas con una o más plagas y la determinación de la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Ejemplos de mutaciones que dan lugar a una mayor toxicidad se encuentran en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, se pueden realizar alteraciones en la secuencia proteica de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi sin afectar sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, supresiones o alteraciones introducidas por procedimientos moleculares modernos, tales como la PCR, incluyendo las amplificaciones de la PCR que alteran o amplían la secuencia de codificación de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias de codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación de la PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias enteras de codificación de proteínas, como las utilizadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Dichas proteínas de fusión se utilizan a menudo para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar la purificación de la proteína, la detección de la misma u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) dirigir la secreción o la traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas o el retículo endoplásmico de las células eucariotas, lo que a menudo da lugar a la glicosilación de la proteína.

Las secuencias variantes de nucleótidos y aminoácidos de la presente invención también abarcan las secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos, tales como la mezcla de ADN. Con este procedimiento, se pueden utilizar una o más regiones codificantes de la proteína delta-endotoxina para crear una nueva proteína delta-endotoxina que posea las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y que pueden recombinarse homológicamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden barajarse entre un gen de delta-endotoxina de la invención y otros genes de delta-endotoxina conocidos para obtener un nuevo gen que codifique una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como una mayor actividad insecticida. Las estrategias para este tipo de barajado de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 Stemmer (1994) Nature 370:389-391 Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291y Patentes de EE. UU. 5,605,793 y 5,837,458.

El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar proteínas delta-endotoxina alteradas. Los dominios II y III pueden intercambiarse entre las proteínas delta-endotoxina, lo que da lugar a toxinas híbridas o quiméricas con una actividad pesticida o un espectro objetivo mejorados. Los procedimientos para generar proteínas recombinantes y probar su actividad pesticida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores

Se puede proporcionar una secuencia de endotoxina delta de la invención en un casete de expresión para la expresión en una planta de interés. Por "casete de expresión vegetal" se entiende una construcción de ADN capaz de dar lugar a la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Normalmente contienen un promotor y una secuencia codificadora. A menudo, estas construcciones también contienen una región no traducida 3'. Dichas construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a determinadas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi.

Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da lugar al transporte cotranslacional o postraduccional del péptido a través de la membrana celular. En los eucariotas, esto implica normalmente la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que, cuando se traduce, da lugar a una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotranslacional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líderes dirigidas al transporte y/o glicosilación por el paso al retículo endoplásmico, el paso a las vacuolas, los plastos, incluyendo los cloroplastos, las mitocondrias, y similares.

Por "vector de transformación vegetal" se entiende una molécula de ADN necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión vegetal, y puede estar organizada en más de una molécula de ADN "vectorial". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de acción cis y trans necesarias para la transformación de las células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células anfitrionas. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. El casete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' enlazadas operativamente a una secuencia de la invención. Por "operativamente vinculado" se entiende una vinculación funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de a Dn correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener, además, al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el/los gen(es) adicional(es) puede(n) proporcionarse en múltiples casetes de expresión.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante posterior. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción (también denominadas "secuencias de control"), son necesarias para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Dicho casete de expresión está provisto con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de delta-endotoxina esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5'-3', una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención y una región traduccional y de terminación transcripcional (es decir, región de terminación ) funcional en las plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia de ADN de la invención. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" de la planta huésped, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN unida operativamente de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN unida operativamente de interés, puede ser nativa con la planta huésped o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, la planta huésped o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen etal. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627:9639

Cuando sea apropiado, el o los genes pueden ser optimizados para una mayor expresión en la célula anfitriona transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse utilizando codones preferidos por la célula anfitriona para mejorar la expresión, o pueden sintetizarse utilizando codones con una frecuencia de uso de codones preferida por el anfitrión. Por lo general, el contenido de GC del gen aumentará. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso de codones preferidos por el anfitrión. Existen procedimientos en la técnica para sintetizar los genes preferidos por las plantas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. Nos .5,380,831, y 5,436,391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477:498

En una realización, la delta-endotoxina se dirige al cloroplasto para su expresión. De este modo, cuando la deltaendotoxina no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá además un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la delta-endotoxina a los cloroplastos. Estos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550 Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968 Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen de la endotoxina delta que se dirige al cloroplasto puede optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse utilizando los codones preferidos por los cloroplastos. Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,380,831.

Transformación de Plantas

Los procedimientos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de tal manera que la construcción acceda al interior de una célula de la planta. Los procedimientos de la invención no requieren que se utilice un procedimiento particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, sólo que la construcción de nucleótidos acceda al interior de al menos una célula de la planta. Los procedimientos para introducir constructos de nucleótidos en las plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, procedimientos de transformación estable, procedimientos de transformación transitoria y procedimientos mediados por virus.

Por "planta" se entienden las plantas enteras, los órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), las semillas, las células vegetales, los propágulos, los embriones y la progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de la hoja, células de la raíz, células del floema, polen).

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "transformados de forma estable" se refiere a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácido nucleico exógeno o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen las que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como las que pueden ser endógenas, o estar presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólogo" se refiere generalmente a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y que han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares.

La transformación de las células vegetales puede llevarse a cabo mediante una de las diversas técnicas conocidas en la técnica. El gen de la delta-endotoxina de la invención puede modificarse para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Normalmente, una construcción que exprese una proteína de este tipo contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como una región no traducida en 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales construcciones es bien conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil diseñar el gen de manera que el péptido resultante sea secretado o dirigido de otra manera dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede ser diseñado para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferible diseñar el casete de expresión de la planta para que contenga un intrón, de manera que se requiera el procesamiento del ARNm del intrón para la expresión.

Típicamente, este "casete de expresión vegetal" se insertará en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que están compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores suelen denominarse en la técnica "vectores binarios". Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se utilizan con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficaz son bastante grandes, y resulta ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN distintas. Los vectores binarios suelen contener un vector plasmídico que contiene las secuencias de acción cis necesarias para la transferencia de ADN-T (TAL como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que está diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para la que se desea generar plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias de acción cis están dispuestas de forma que permitan una transferencia eficiente a las células vegetales y su expresión allí. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y la delta-endotoxina están situados entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo, un segundo vector plasmídico contiene los factores de acción trans que median la transferencia del ADN-T de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido suele contener las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias de frontera y la transferencia de ADN mediada por virus, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Se pueden utilizar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas por otros procedimientos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los procedimientos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a las células vegetales objetivo (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida de la aplicación de un nivel de umbral máximo de selección apropiado (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Los explantes se transfieren normalmente a un nuevo suministro del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en un medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. A continuación, los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar los brotes enraizados o las plántulas. La plántula transgénica se convierte entonces en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes se transfieren normalmente a un nuevo suministro del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y procedimientos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y en Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células, tanto las transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier trozo de callo o tejido objetivo sometido o grupo de células. La capacidad de matar a las células no transformadas y permitir la proliferación de las células transformadas da lugar a cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar las células no transformadas es una limitación para la rápida recuperación de las células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos de introducción de secuencias de nucleótidos en las plantas, pueden variar en función del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, a la que se dirige la transformación. La generación de plantas transgénicas puede llevarse a cabo mediante uno de varios procedimientos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en las células vegetales ( transformación mediada por Agrobacterium ), bombardeo de células vegetales con ADN extranjero heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas balísticas, transformación por haz de aerosol (Solicitud Publicada de EE. UU. No. 20010026941 Patente de EE. UU No. 4,945,050; Publicación Internacional No. WO 91/00915 Solicitud Publicada de EE. UU. No.2002015066), la transformación Lecl y diversos otros procedimientos no mediados por partículas para transferir ADN.

Los procedimientos de transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917 Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El procedimiento se basa en la entrega de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma de los plástidos a través de la recombinación homóloga. Además, la transformación plastidial puede llevarse a cabo mediante la transactivación de un transgén silencioso transportado por los plástidos mediante la expresión preferente en el tejido de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida por los plástidos. Tal sistema ha sido reportado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Tras la integración del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, se aplica un nivel máximo de selección apropiado en el medio para matar las células no transformadas y se separan y proliferan las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección transfiriéndolas regularmente a un medio fresco. Mediante el paso continuo y el desafío con la selección adecuada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. A continuación, se pueden utilizar procedimientos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo de interés integrado en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con las formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. A continuación, se pueden cultivar estas plantas y polinizarlas con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, e identificar el híbrido resultante con expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda, y luego se cosechan las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, también se divulga, pero no forma parte de la invención, una semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que tiene una construcción nucleotídica como la divulgada en el presente documento, por ejemplo, un casete de expresión como el divulgado en el presente documento, incorporado de forma estable en su genoma.

Evaluación de la Transformación de Plantas

Tras la introducción del ADN extranjero heterólogo en las células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos procedimientos, tales como el análisis de los ácidos nucleicos, las proteínas y los metabolitos asociados al gen integrado.

El análisis de PCR es un procedimiento rápido para examinar las células, tejidos o brotes transformados en busca de la presencia del gen incorporado en la etapa inicial antes de trasplantar al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, n Y). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores oligonucleótidos específicos del gen de interés o del fondo del vector Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede confirmarse mediante el análisis de transferencia Southern del ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con las enzimas de restricción adecuadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o de nailon. A continuación, la membrana o "transferencia" se sondea con, por ejemplo, un fragmento de ADN objetivo marcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con las técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aísla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído, y se coloca en un filtro de nailon de acuerdo con los procedimientos estándar que se utilizan rutinariamente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por la delta-endotoxina se comprueba entonces hibridando el filtro con una sonda radiactiva derivada de una deltaendotoxina, por procedimientos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En las plantas transgénicas se pueden realizar ensayos de transferencia Western, bioquímicos y similares para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen de la delta-endotoxina mediante procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra) utilizando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína de la delta-endotoxina.

Actividad Pesticida en las Plantas

En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresen una delta-endotoxina que tenga actividad pesticida. Los procedimientos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la forma en que se generen las células vegetales transgénicas no es crítica para esta invención. Los procedimientos conocidos o descritos en la técnica, tales como la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación biolística y los procedimientos no mediados por partículas, pueden utilizarse a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una delta-endotoxina pueden aislarse mediante procedimientos comunes descritos en la técnica, por ejemplo, mediante la transformación de callos, la selección de callos transformados y la regeneración de plantas fértiles a partir de dichos callos transgénicos. En dicho procedimiento, se puede utilizar cualquier gen como marcador seleccionable siempre que su expresión en las células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar las células transformadas.

Se han desarrollado varios marcadores para su uso con células vegetales, tales como la resistencia al cloranfenicol, al aminoglucósido G418, a la higromicina o similares. Otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo del cloroplasto también pueden utilizarse como marcadores seleccionables. Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a los herbicidas para plantas tales como glifosato, bromoxinil o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Se ha informado de estos genes (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de la nitrilasa resistente al bromoxinil); y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a la imidazolinona AHAS). Además, los genes divulgados en el presente documento son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los procedimientos para detectar la presencia de un transgén en una planta, un órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), una semilla, una célula vegetal, un propágulo, un embrión o una progenie del mismo son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgén se detecta mediante pruebas de actividad pesticida.

Las plantas fértiles que expresan una delta-endotoxina pueden someterse a pruebas de actividad pesticida, y las plantas que muestran una actividad óptima se seleccionan para su posterior reproducción. Hay procedimientos disponibles en la técnica para ensayar la actividad de la plaga. Generalmente, la proteína se mezcla y se utiliza en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede utilizarse para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, el trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp, alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, batata, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las verduras incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón y melón almizclero. Las plantas ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, poinsettia y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en el control de plagas

Los procedimientos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en el control de pesticidas o en el diseño de otros organismos como agentes pesticidas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU No. 5,039,523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente divulgación, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido alterados genéticamente para que contengan un gen y una proteína pesticida pueden utilizarse para proteger los cultivos y productos agrícolas de las plagas. En un aspecto de la divulgación, las células enteras, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (pesticida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando ésta se aplica al entorno de la(s) plaga(s) objetivo.

Alternativamente, el pesticida se produce introduciendo un gen de delta-endotoxina en un anfitrión celular. La expresión del gen de la delta-endotoxina da lugar, directa o indirectamente, a la producción intracelular y al mantenimiento del pesticida. En un aspecto de esta divulgación, estas células se tratan entonces bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando ésta se aplica al entorno de la(s) plaga(s) objetivo. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas encapsulados de forma natural pueden entonces formularse de acuerdo con las técnicas convencionales para su aplicación en el entorno que alberga una plaga objetivo, por ejemplo, el suelo, el agua y el follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319 y las referencias citadas en el mismo. Alternativamente, se pueden formular las células que expresan un gen de esta invención de manera que se pueda aplicar el material resultante como un pesticida.

Composiciones pesticidas

Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse a la zona de cultivo o planta que se van a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones pesticidas, aceites latentes, polímeros y/o formulaciones portadoras de liberación prolongada o biodegradables que permiten la dosificación a largo plazo de una zona objetivo tras una única aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varios de estas preparaciones, si se desea, junto con otros portadores agrícolamente aceptables, tensioactivos o adyuvantes promotores de la aplicación habitualmente empleados en la técnica de la formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias que se emplean habitualmente en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones pueden ser preparadas en forma de "cebos" comestibles o formadas en "trampas" para plagas para permitir la alimentación o la ingestión por parte de una plaga objetivo de la formulación pesticida.

Los procedimientos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o de una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen la aplicación foliar, el recubrimiento de semillas y la aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La composición puede formularse en forma de polvo, pella, aerosol, emulsión, coloide, solución o similares, y puede prepararse por medios convencionales tales como la desecación, la liofilización, la homogeneización, la extracción, la filtración, la centrifugación, la sedimentación o la concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen al menos aproximadamente polipéptido pesticida de este tipo, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso.

Las plagas de lepidópteros, coleópteros o nematodos pueden ser eliminadas o reducidas en número en un área determinada por los procedimientos de la invención, o pueden ser aplicadas profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente, la plaga ingiere, o entra en contacto con, una cantidad eficaz del polipéptido como pesticida. Por "cantidad eficaz del pesticida" se entiende una cantidad del pesticida capaz de provocar la muerte de al menos una plaga, o de reducir notablemente el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará en función de factores tales como, por ejemplo, las plagas objetivo específicas que deban controlarse, el entorno específico, la ubicación, la planta, el cultivo o el emplazamiento agrícola que deba tratarse, las condiciones ambientales y el procedimiento, la tasa, la concentración, la estabilidad y la cantidad de aplicación de la composición polipeptídica con eficacia pesticida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones ambientales, y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de la plaga.

Las composiciones pesticidas descritas pueden hacerse formulando la célula bacteriana, la suspensión de cristales y/o esporas, o el componente proteico aislado con el portador deseable aceptable para la agricultura. Las composiciones pueden formularse antes de su administración en un medio apropiado, tal como liofilizado, secado en frío, desecado, o en un portador acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden presentarse en forma de polvo o material granular, o en suspensión en aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones aceite/agua, o como polvo que se puede mojar, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para la aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "portador aceptable desde el punto de vista agrícola" abarca todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, adhesivos, aglutinantes, etc. que se utilizan normalmente en la tecnología de formulación de pesticidas; estos son bien conocidos por los expertos en formulación de pesticidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezclando, combinando y/o triturando homogéneamente la composición pesticida con los adyuvantes adecuados mediante técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y procedimientos de aplicación adecuados se describen en la Patente de EE. UU. No. 6,468,523.

"Plaga" incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera y Diptera.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Diptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae y Tineidae.

Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como los nudos de la raíz, los nematodos del quiste y los nematodos de la lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp, y Globodera spp.; en particular los miembros de los nematodos del quiste, incluidos, entre otros, Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globoderapailida (nematodos del quiste de la patata). Los nematodos de las lesiones incluyen a Pratylenchus spp.

Las plagas de insectos de la invención para los principales cultivos incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del suroeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del maíz; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz del oeste; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, abejorro enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, abejorro enmascarado del sur (gusano blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, gusano de la semilla de maíz; Agromyza parvicornis, minador de la hoja del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de las gramíneas; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Helicoverpa zea, gusano de la espiga del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Feltia subterranea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp, gusanos de alambre; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo de la pulga del maíz; Sphenophorus maidis, chinche del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña del carmín; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano militar; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Elasmopalpus l ignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Hypera punctata, gorgojo de la hoja del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, chinche verde; Macrosiphum avenae, pulgón inglés del grano; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro del rizado del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de la yema del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de las semillas de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Spodoptera exigua, gusano de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado de la cápsula; Anthonomus grandis, gorgojo de la cápsula; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulgón del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de las bandas; Lygus lineolaris, chinche de las plantas; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña del carmín; Tetranychus urticae, araña roja; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo del agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; Blissus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, gusano de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga del frijol terciopelo; Plathypena scabra, gusano del trébol verde; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano de la remolacha; Heliothis virescens, gusano del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mexicano de la judía; Myzus persicae, pulgón verde del melocotón; Empoascafabae, saltamontes de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña de la fresa; Tetranychus urticae, araña roja; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, chinche verde; Blissus leucopterus, chinche de las cosechas; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Euschistus servus, chinche apestosa marrón; Delia platura, gusano del maíz; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro marrón del trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo de la pulga; Mamestra configurata, gusano militar de Bertha; Plutella xylostella, polilla del dorso del diamante; Delia ssp., gusanos de la raíz.

Procedimientos para aumentar el rendimiento de las plantas

Se divulgan procedimientos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los procedimientos comprenden la introducción en una planta o célula vegetal de un polinucleótido que comprende una secuencia pesticida divulgada en el presente documento. Tal y como se define en el presente documento, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento de la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de las plantas tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de las hojas de las plantas puede aumentar el rendimiento de las verduras de hoja para el consumo humano o animal. Además, el aumento de la biomasa foliar puede utilizarse para incrementar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de las plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo, incluyendo, pero sin limitarse a, un aumento de al menos el 1 %, un aumento de al menos el 3 %, un aumento de al menos el 5 %, un aumento de al menos el 10 %, un aumento de al menos el 20 %, un aumento de al menos el 30 %, un aumento de al menos el 50 %, un aumento de al menos el 70 %, un aumento de al menos el 100 % o un aumento mayor del rendimiento en comparación con una planta que no exprese la secuencia pesticida.

En procedimientos específicos, el rendimiento de la planta se incrementa como resultado de la mejora de la resistencia a las plagas de una planta que expresa una proteína pesticida divulgada en el presente documento. La expresión de la proteína pesticida tiene como resultado la reducción de la capacidad de una plaga para infestar o alimentarse de la planta, mejorando así el rendimiento de la misma.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

EXPERIMENTAL

Ejemplo 1. Descubrimiento de un nuevo gen pesticida de B a c il lu s th u r in g ie n s is

Se identificaron nuevos genes pesticidas a partir de las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1 siguiendo los siguientes pasos:

• Preparación del ADN extracromosómico de la cepa, que incluye plásmidos que suelen albergar genes de deltaendotoxina

• Cizallamiento mecánico del ADN extracromosómico para generar fragmentos de tamaño distribuido

• Clonación de ~2 Kb a -fragmentos de 10 Kb de ADN extracromosómico

• Crecimiento de -1.500 clones del ADN extracromosómico

• Secuenciación parcial de los 1.500 clones utilizando cebadores específicos del vector de clonación (lecturas finales)

• Identificación de genes putativos de toxinas mediante el análisis de homología a través del enfoque MiDAS (como se describe en Publicación de Patente de EE. UU. No. 20040014091

• Acabado de la secuencia (caminar) de los clones que contienen fragmentos de los genes putativos de la toxina de interés

T l 1: Li n v n i l B ill h rin i n i

Ejemplo 2. Descubrimiento de nuevos genes pesticidas de B a c il lu s th u r in g ie n s is

Se identificaron nuevos genes pesticidas a partir de las cepas enumeradas en la Tabla 2 utilizando el enfoque MiDAS como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20040014091 utilizando los siguientes pasos:

• Preparación del ADN extracromosómico de la cepa.

El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes elementos: plásmidos de diversos tamaños; cromosomas de fagos; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas no caracterizadas.

Cizallamiento mecánico o enzimático del ADN extracromosómico para generar fragmentos de tamaño distribuido. Secuenciación del ADN fragmentado

Identificación de genes putativos de toxinas a través de la homología y/u otros análisis computacionales.

Cuando se requiera, el acabado de la secuencia del gen de interés mediante una de las diversas estrategias de PCR o clonación (por ejemplo, TAIL-PCR).

T l 2: Li n v n i l B ill h rin i n i

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Ejemplo 3. Descubrimiento de un nuevo gen de toxina Axmi068 de la cepa ATX13046 de B a c il lu s th u r in g ie n s is

La cepa que codifica axmi068 fue identificada como sigue:

• La información de las secuencias de los genes de las toxinas conocidas o sospechosas se utilizó para generar un alineamiento que representara las secuencias de ADN conservadas y parcialmente conservadas dentro de un grupo (familia) de toxinas.

• Se diseñaron cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar selectivamente uno o más miembros de la familia de toxinas con base en la secuencia alineada.

• El ADN aislado de las cepas bacterianas se analizó mediante PCR para identificar las cepas que contienen homólogos putativos de la familia de genes objetivo.

• Los productos de la PCR se secuenciaron para seleccionar una cepa que contenga un gen de interés.

La secuencia genética completa se identificó a partir de la cepa seleccionada mediante el enfoque genómico MiDAS (Publicación de Patente de EE. UU. No. 20040014091) como sigue:

• Preparación del ADN extracromosómico de la cepa.

El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes elementos: plásmidos de diversos tamaños; cromosomas de fagos; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas no caracterizadas.

• Cizallamiento mecánico o enzimático del ADN extracromosómico para generar fragmentos de tamaño distribuido.

• Clonación de los fragmentos de ADN extracromosómico en un vector plasmídico.

• Crecimiento y purificación del clon del ADN extracromosómico.

• Secuenciación parcial de los clones.

• Identificación de genes putativos de toxinas a través de la homología y/u otros análisis computacionales.

• Cuando se requiera, acabado de la secuencia (caminata) de los clones que contienen la secuencia de los genes putativos de la toxina de interés.

• La secuencia de nucleótidos para axmi068 se establece en SEQ ID NO: 16 y la secuencia de aminoácidos para AXMI068 se establece en SEQ ID NO:76.

Características de los genes y las proteínas

Longitud del gen, pares de bases de ADN: 1.791

Longitud de la proteína, residuos de aminoácidos: 597

Peso molecular estimado de la proteína, Da: 66.495

Homólogos conocidos y porcentaje aproximado de identidad Cry1Id1, 71,4 %

Ejemplo 4. Expresión en B a c il lu s

El gen insecticida aquí divulgado se amplifica por PCR, y el producto de PCR se clona en el vector de expresión de Bacillus pAX916, u otro vector adecuado, por procedimientos bien conocidos en el arte. La cepa de Bacillus resultante, que contiene el vector con el gen axmi, se cultiva en un medio de crecimiento convencional, como el medio CYS (10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/l de KH2PO4; 14 g/l de K2HPO4; 0,5 mM de MgSO4; 0,05 mM de MnCl2; 0,05 mM de FeSO4), hasta que la esporulación sea evidente mediante un examen microscópico. Se preparan muestras y se comprueba su actividad en bioensayos.

Ejemplo 5. Construcción de secuencias sintéticas

En un aspecto de la invención, se generaron secuencias axmi sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de ADN alterada en relación con la secuencia axmi madre, y codifican una proteína que es colineal con la proteína AXMI madre a la que corresponde, pero carece del "dominio cristalino" C-terminal presente en muchas proteínas delta-endotoxina. Los genes sintéticos se presentan en la Tabla 3.

Tabla 3:

continuación

continuación

continuación

En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de genes sintéticos de manera que el péptido resultante se dirige a un orgánulo de la planta, tal como el retículo endoplásmico o el apoplasto. Las secuencias peptídicas que se sabe que dan lugar a la orientación de las proteínas de fusión a los orgánulos de las plantas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del lupino blanco Lupinus albus (Genebank ID GI: 14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) es conocido en la técnica para dar lugar al direccionamiento del retículo endoplásmico de las proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención endoplásmica que comprende el péptido N-terminal-ácido lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEQ ID NO: 123) en el extremo C, la proteína de fusión se dirigirá al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia de orientación hacia el retículo endoplásmico en el extremo C, la proteína se dirigirá al retículo endoplásmico, pero finalmente será secuestrada en el apoplasto.

Ejemplo 6. Expresión de a x m i100 e n E . c o l i y B a c il lu s

El ORF completo de axmi100 (3,45kb que codifica una proteína de 1.156 aminoácidos de longitud) se clonó en un vector de expresión de E. coli con base en pRSF1b (para dar pAX5445) y en un vector de Bacillus con base en pAX916 (para dar pAX5444). Los clones resultantes se confirmaron mediante análisis de restricción y, finalmente, mediante la secuenciación completa del gen clonado.

Para la expresión en E. coli, se transformó BL21*DE3 con pAX5445. Se inoculó una sola colonia en LB suplementada con kanamicina y se cultivó durante la noche a 37oC. Al día siguiente, se inoculó medio fresco por duplicado con el 1 % del cultivo de la noche y se hizo crecer a 37oC hasta la fase logarítmica. Posteriormente, los cultivos se indujeron con ImM IPTG durante 3 horas a 37oC o toda la noche a 20oC. Cada pella de células se suspendió en tampón de carbonato sódico 50 mM, pH 10,5 suplementado con 1 mM de DTT y se sonicó. El análisis por SDS-PAGE detectó la expresión de una proteína de 130 kD correspondiente a Axmi100.

Para la expresión en Bacillus, se transformó Bacillus thuringiensis con pAX5444 y se cultivó una sola colonia en medio CYS-glu durante 3 días hasta la esporulación. A continuación, la pella de células se extrajo con tampón de carbonato sódico 50 mM, pH 10,5 complementado con 1 mM de DTT. La fracción soluble mostró la presencia de una proteína Axmi100 de 130 kD junto con varias bandas de proteínas de menor peso molecular debidas al procesamiento de Axmi100. La tripsinización de Axmi100 dio lugar a dos bandas proteicas distintas de aproximadamente 65 kD y 55 kD.

Ejemplo 7. Bioensayo de Axmi100

Preparación de las muestras:

Los extractos libres de células que expresan AXMI-100 se resuspendieron típicamente en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 10,5, típicamente con la inclusión de 1 mM DTT como agente reductor. Se prepararon muestras con y sin tripsina para las pruebas de bioensayo.

R e s u m e n d e la M e to d o lo g ía d e B io e n s a y o s :

Las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Corning) recibieron 1 ml de dieta multiespecífica (Bio-Serv) y se dejaron solidificar. Una vez solidificado, se colocaron 40 pl de muestra de proteína en la superficie de la dieta de cada pocillo y se dejó que se empapara/secara a temperatura ambiente. Dependiendo del experimento, se colocaron en cada pozo masas de huevos de ECB, diez larvas neonatas o una sola larva neonata. Las placas se sellaron con membranas permeables al gas (Research Products International) y se incubaron a 25 °C y 90 % de HR. Después de cinco o siete días (dependiendo del experimento), las muestras se puntuaron visualmente en comparación con un control de sólo tampón o de extracto no transformado.

Se observó una fuerte actividad de AXMI-100 sobre el barrenador europeo del maíz y el gusano del tabaco. La actividad sobre el gusano cortador negro se observó a altas concentraciones de proteínas. También se observó cierta actividad en concentraciones elevadas sobre la oruga de la judía de terciopelo, pero la actividad tanto del gusano cortador negro como de la oruga de la judía de terciopelo fue menos pronunciada y más variable que en el caso de los demás insectos analizados. La tripsinización de Axmi100 dio dos bandas de proteína distintas de aproximadamente 65 kD y 55 kD, y no parece ser necesaria para la actividad de AXMI-100.

Ejemplo 8. Ensayos adicionales para la actividad pesticida

La capacidad de una proteína pesticida para actuar como tal sobre una plaga suele evaluarse de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. En un ensayo de alimentación de este tipo, se expone a la plaga a una muestra que contiene los compuestos que se van a probar o muestras de control. A menudo esto se realiza colocando el material que se va a probar, o una dilución adecuada de dicho material, en un material que la plaga va a ingerir, tal como una dieta artificial. El material que se va a ensayar puede estar compuesto por un líquido, un sólido o una pasta. El material que se va a ensayar puede colocarse sobre la superficie y dejarse secar. Alternativamente, el material que se va a ensayar puede mezclarse con una dieta artificial fundida, y luego dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pozo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para plagas chupadoras (por ejemplo, los áfidos) pueden implicar la separación del material de prueba del insecto mediante un tabique, idealmente una porción que pueda ser perforada por las partes bucales chupadoras del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo, el material de prueba se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como la sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido de la prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse de la planta transgénica. Las pruebas en plantas pueden implicar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo, pequeñas jaulas unidas a una hoja, o el aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

Otros procedimientos y enfoques para ensayar plagas son conocidos en la técnica, y pueden encontrarse, por ejemplo, en Robertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Bioensayos de pesticidas con artrópodos. CRC, Boca Ratón, FL. Como alternativa, los ensayos se describen habitualmente en las revistas "Arthropod Management Tests" y "Journal of Economic Entomology" o mediante conversaciones con miembros de la Entomological Society of America (ESA).

Ejemplo 9. Bioensayo de Axmi079 y Axmi082

Expresión y Purificación de gGenes

• Las regiones de ADN que codifican los dominios de toxina de Axmi079 y Axmi082 se clonaron por separado en un vector de expresión de E. coli pMAL-C4x detrás del gen malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP). Estas fusiones dentro del marco dieron lugar a la expresión de proteínas de fusión MBP-Axmi en E. coli.

• Para la expresión en E. coli, se transformó BL21*DE3 con plásmidos individuales. Se inoculó una sola colonia en LB suplementada con carbenicilina y glucosa, y se cultivó durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se inoculó medio fresco con el 1 % del cultivo de la noche y se cultivó a 37 °C hasta la fase logarítmica. Posteriormente, los cultivos se indujeron con 0,3 mM de IPTG durante la noche a 20 °C. Cada pella celular se suspendió en tampón Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 200 mM NaCl+1 mM DTT+ inhibidores de la proteasa y se sonicó. El análisis por SDS-PAGE confirmó la expresión de las proteínas de fusión.

• Los extractos totales libres de células se pasaron por una columna de amilosa unida a FPLC para la purificación por afinidad de las proteínas de fusión MBP-axmi. La proteína de fusión unida se eludió de la resina con una solución de maltosa 10 mM. A continuación, las proteínas de fusión purificadas se escindieron con Factor Xa o tripsina para eliminar la etiqueta MBP aminoterminal de la proteína Axmi. El desdoblamiento y la solubilidad de las proteínas se determinaron mediante SDS-PAGE.

Bioensayos con Insectos

• Las proteínas escindidas se probaron en ensayos con insectos con controles apropiados. Una lectura de 5 días de las placas mostró las siguientes actividades de estas proteínas.

R l i i n l i n n in :

(continuación)

Ejemplo 10. Vectorización de los Genes Pesticidas de la Invención para la Expresión en Plantas

Cada una de las regiones codificantes de los genes de la invención está conectada independientemente con secuencias promotoras y terminadoras apropiadas para la expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en la técnica y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis o el promotor CaMV 35S para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinII. Las técnicas para producir y confirmar construcciones promotoras - gen - terminador también son bien conocidas en el arte.

Ejemplo 11. Transformación de los genes de la invención en células vegetales por transformación m e d ia d a p o r A g r o b a c te r iu m

Las orejas se recogen 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las orejas y se utilizan para la transformación los que tienen un tamaño de 0,8-1,5 mm. Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado y se incuban durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para la transferencia mediada por plásmidos Ti durante 5-10 minutos, y luego se chapan en medios de cocultivo durante 3 días (25 °C en la oscuridad). Tras el cocultivo, los explantes se transfieren a medios de período de recuperación durante cinco días (a 25 °C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medios de selección durante un máximo de ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. T ras el periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan bajo luz tenue y se inicia el procedimiento de regeneración tal y como se conoce en la técnica. Los brotes resultantes se dejan enraizar en medios de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Ejemplo 12. Transformación de células de maíz con los genes pesticidas de la invención

Las mazorcas de maíz se recogen entre 8 y 12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las orejas y se utilizan para la transformación los que tienen un tamaño de 0,8-1,5 mm. Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como el medio DN62A5S (3,98 g/L de Sales N6; 1 ml/L (de 1000x Stock) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarosa; 1 ml/L (de 1 mg/mL Stock) de 2,4-D), y se incuban durante la noche a 25 °C en la oscuridad.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a un medio osmótico durante 30-45 minutos, y luego se transfieren a una placa de haces (véase, por ejemplo, Publicación PCT No. WO/0138514 y Patente de EE. UU. No. 5,240842).

Las construcciones de ADN diseñadas para expresar los genes de la invención en las células vegetales se aceleran en el tejido vegetal mediante un acelerador de haz de aerosol, utilizando condiciones esencialmente como las descritas

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:50;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:50, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y,

d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111, en la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida.

2. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de nucleótido está operablemente unida a un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótido en una planta.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2, 3 o 4.

6. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. La célula huésped de la reivindicación 6 que es una célula anfitriona bacteriana o una célula vegetal.

8. Una planta transformada que comprende la célula anfitriona de la reivindicación 7.

9. La planta transformada de la reivindicación 8, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

10. Un polipéptido aislado con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111, en la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

c) un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs:50, 236, 237; y,

d) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 90 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:50, 236, 237, en la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida.

11. Un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido de la reivindicación 10 a) o c)

12. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 10.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, una pella, un gránulo, un aerosol, una emulsión, un coloide y una solución y se prepara por desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis .

14. Un procedimiento para controlar o matar una población de plagas de lepidópteros o coleópteros que comprende el contacto de dicha población con una cantidad eficaz de pesticida del polipéptido de la reivindicación 10.

15. Una planta que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad pesticida, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:50, 236, 237;

b) una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:50, 236, 237, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad pesticida;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y,

d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111, en la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

en la que dicha secuencia de nucleótidos está operablemente unida a un promotor que impulsa la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.

16. Un procedimiento para proteger una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma, al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, en el que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:50, 236, 237;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO:50, 236, 237, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y,

d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111, en la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida.