ES2397118T3

ES2397118T3 - AXMI-031, AXMI-039 ,AXMI-040 y AXMI-049, una familia de genes de endotoxina delta y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2397118T3
Application number: ES07812139T
Authority: ES
Inventors: Nadine Carozzi; Nicholas Duck; Theodore Kahn; Nalini Desai; Shruti Jain; Daniel John Tomso; Rong Guo; Julia Thissen
Original assignee: Athenix Corp
Current assignee: Athenix Corp
Priority date: 2006-06-14
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2013-03-04
Anticipated expiration: 2027-06-14
Also published as: AU2007260716B2; EP2032598A2; EP2032598B1; AR111197A2; NZ594744A; CN101501066B; WO2007147029A2; US20090181116A1; US20120167251A1; AU2007260716A1; DK2032598T3; WO2007147029A3; NZ573398A; BRPI0713646B1; US8147856B2; US7923602B2; HK1129396A1; AR061467A1; CN101501066A; PL2032598T3

Abstract

Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo queconsiste en: a) la secuencia de nucleotidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o uncomplemento de la misma; b) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia denucleotidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de lamisma, en donde dicha secuencia de nucleotidos codifica un polipeptido que tiene actividad plaguicidacontra un nematodo parasito de plantas; c) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidosde los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidosque tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de los SEQ ID NO: 2,8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25 , 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicha secuencia de nucleotidos codifica unpolipeptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parasito de plantas; y, e) la secuencia de nucleotidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plasmido depositado con el Num.de Acceso B-30935 o un complemento de la misma.

Description

AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040 y AXMI-049, una familia de genes de endotoxina delta y métodos para su uso

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Antecedentes de la invención

El Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas gram-positiva caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero son inofensivas para las plantas y otros organismos no elegidos como diana. Por esta razón, las composiciones incluyendo cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas se pueden utilizar como insecticidas aceptables desde el punto de vista medioambiental para controlar plagas de insectos agrícolas o vectores de insectos para una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen potente actividad insecticida predominantemente contra Lepidópteros, Dípteros, y larvas de Coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra órdenes de plagas de Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, y Acari, así como otras órdenes de invertebrados tales como Nematelmintos, Platelmintos, y Sarcomastigórfora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y). Estas proteínas se clasificaron originalmente como CryI a CryV basándose principalmente en su actividad insecticida. Las principales clases fueron específica de Lepidoptera (I), específica de Lepidoptera y Diptera (II), específica de Coleoptera (III), específica de Diptera (IV), y específica de nematodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron adicionalmente en subfamilias; a las proteínas más altamente relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras divisionales tales como CrylA, CrylB, CrylC, etc. A las proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les dieron nombres tales como CrylC1, CrylC2, etc.

Se describió recientemente una nueva nomenclatura para los genes Cry basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos en lugar de la especificidad del insecto diana (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre exclusivo que incorpora un rango primario (un número arábigo), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula), y un rango cuaternario (otro número arábigo). En la nueva clasificación, los números romanos han sido cambiados por números arábigos en el rango primario. Las proteínas con una identidad de secuencia menor de 45% tienen diferentes rangos primarios, y los criterios para los rangos secundario y terciario son 78% y 95%, respectivamente.

La proteína de cristal no muestra actividad insecticida hasta que se ha ingerido y se solubiliza en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo de insectos a una molécula tóxica activa. (Höfte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a receptores apicales del borde en cepillo del intestino medio de las larvas e insectos diana y se inserta en la membrana apical creando canales iónicos o poros, dando como resultado la muerte de las larvas.

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencias conservadas, y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de tipo remolino (de Maagd et al., 2001, supra). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor, y por tanto se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis.

Compendio de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia a las plagas a las bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de polipéptidos de delta-endotoxinas, los vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico, y células anfitrionas que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos de la endotoxina. Las secuencias de nucleótidos se pueden utilizar en constructos de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para su expresión en un organismo, incluyendo, pero no limitado a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformadas.

5 En particular, se proporcionan moléculas aisladas de ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias de ácidos nucleicos de las delta-endotoxinas. Adicionalmente, están incluidas las secuencias de aminoácidos correspondientes a los polinucleótidos. En particular, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, 8, 10,12,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, una secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, 7,

10 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, o las secuencias de nucleótidos de delta-endotoxinas depositadas en el anfitrión bacteriano con el Núm. de acceso B-30935. Secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de 15 nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de

20 nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38;

25 d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm.

30 de Acceso B-30935 o un complemento de la misma.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido recombinante con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en:

35 a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas;

40 c) un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; d) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos 95% a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, o 37, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, y,

45 e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935.

La invención también proporciona:

50 • un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención;

•: una célula anfitriona que contiene el vector; y

•: una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención también proporciona una composición que comprende el polipéptido de la invención, en donde

55 opcionalmente dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, espolvoreable, gránulo, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución, y en donde opcionalmente dicha composición se prepara mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis, y en donde dicha composición comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.

60 Se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención, y para el uso de esos polipéptidos para controlar o eliminar una plaga de lepidópteros o coleópteros. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula anfitriona de la invención en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido. También se hace

referencia a los métodos y kits para la detección de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Se proporcionan adicionalmente los métodos para controlar o eliminar una población de la plaga de nematodos. Los polipéptidos activos contra nematodos de la invención son útiles para controlar o eliminar los nematodos parásitos de plantas, en particular nemátodos enquistados. Por lo tanto, la invención proporciona un método para eliminar o controlar una población de plagas de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la invención.

La invención también proporciona un método para proteger una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o una célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935, o un complemento de la misma.

La invención proporciona adicionalmente un método para proteger una planta de una plaga de nematodos, que comprende:

a) proporcionar una planta o semilla de la misma que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, en donde dicho polipéptido plaguicida se selecciona entre el grupo que consiste en;

i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; iii) un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; iv) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos 95% a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, o 37; y, v) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935 o un complemento de la misma; y,

b) cultivar dicha planta o semilla en un campo que contiene nemátodos parásitos de plantas.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con resistencia a plaguicida, específicamente bacterias y plantas. Por lo tanto, la presente invención proporciona una planta o célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 , 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y,

e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935, o un complemento de la misma;

en donde dicha secuencia de nucleótidos está conectada operativamente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.

Estos organismos y composiciones derivadas de ellos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas delta-endotoxinas modificadas o alteradas que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas o ácidos nucleicos de delta-endotoxinas en los productos u organismos.

Descripción Detallada

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia a las plagas en los organismos, particularmente plantas o células vegetales. Los métodos implican la transformación de organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta-endotoxina de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para la preparación de plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. Por lo tanto, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas de delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes de delta-endotoxinas, y para la generación de proteínas plaguicidas alteradas mediante métodos conocidos en la técnica, tales como intercambio de dominios o mezcla de ADN. Las proteínas encuentran uso en el control o eliminación de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, y nematodos, y para la producción de composiciones con actividad plaguicida.

Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos de la invención se depositaron en la colección permanente de la Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos de América, el 09 de Junio 2006, y se les asignó el Núm. de Acceso NRRL B-30935 (para axmi-031). También se hace referencia a los depósitos NRRL B-30936 (para axmi-039), NRRL B-30937 (para axmi-040); y el 29 de Mayo de 2007 se asignó el Núm. de Acceso NRRL B50046 (axmi-049). Estos depósitos se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Estos depósitos se hicieron simplemente para comodidad de los expertos en la técnica y no son un reconocimiento de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C § 112.

Mediante "delta-endotoxina" se quiere significar una toxina de Bacillus thuringiensis que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, que incluyen, pero no se limitan a, miembros de los órdenes Lepidoptera, Diptera, y Coleoptera o miembros del Phylum Nematoda, o una proteína que tiene homología con dicha proteína. En algunos casos, las proteínas delta-endotoxinas se han aislado a partir de otros organismos, incluyendo Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas delta-endotoxinas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos completas descritas en la presente memoria, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias completas, ya sea por el uso de un sitio de inicio aguas abajo alternativo, o debido a un procesamiento que produce una proteína más corta que tienen actividad plaguicida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína. Las deltaendotoxinas incluyen proteínas identificadas como cry1 a cry43, cyt1 y cyt2, y toxina de tipo Cyt. Actualmente hay más de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Para ver una lista extensa véase Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol.. Rev 62:807-813 y para ver actualizaciones regulares véase Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

En la presente memoria se proporcionan nuevas secuencias de nucleótidos aislada que confieren actividad plaguicida. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxinas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite que las células controlen o eliminen las plagas que la ingieren.

Moléculas de Ácido Nucleico Aisladas, y Variantes y Fragmentos de las Mismas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos de delta-endotoxinas de la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "molécula de ácido nucleico" está destinado a incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, pero preferiblemente es ADN de cadena doble.

Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5 ' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se obtiene el ácido nucleico. Para los propósitos de la invención, "aislado" cuando se utiliza para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la deltaendotoxina aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se obtiene el ácido nucleico. Una proteína delta-endotoxina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína que no es delta-endotoxina (también referida en la presente memoria como una "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia expuesta en los SEQ ID NO: 1 y 37, las secuencias de nucleótidos de delta-endotoxina depositadas en anfitriones bacterianos con el Núm. de Acceso NRRL B-30935 y variantes, fragmentos, y complementos de las mismas (por ejemplo, los SEQ ID NO: 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, y 32). Las variantes y fragmentos deben tener al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30 y codificar un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de las plantas. Mediante "complemento" se quiere significar una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de manera que pueda hibridar con la secuencia de nucleótidos dada para formar de ese modo un dúplex estable. Las correspondientes secuencias de aminoácidos para la proteína delta-endotoxina codificada por esta secuencia de nucleótidos se exponen en los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30y 37.

También se hace referencia a las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-endotoxinas (por ejemplo, SEC ID NO: 9, 11, 14, 18, 20, 22, y 24). Mediante "fragmento" se quiere significar una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deltaendotoxina, en donde el fragmento debe tener al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16 , 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30 y codificar un polipéptido que tenga actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas. También se hace referencia a un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos descritos a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina a las que se hace referencia comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 , 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450 , 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina completa descrita en la presente memoria (por ejemplo, 3558 nucleótidos para el SEQ ID NO: 1, y 3669 nucleótidos para el SEQ ID NO: 34), dependiendo del uso pretendido. Mediante nucleótidos "contiguos" se quieren significar residuos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán fragmentos de proteínas que conservan la actividad biológica de la proteína delta-endotoxina y, por lo tanto, conservan la actividad plaguicida. Mediante "conserva actividad" se quiere significar que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95%

o más de la actividad plaguicida de la proteína delta-endotoxina. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477, todas las cuales se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica delta-endotoxina que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 , 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presente en una proteína delta-endotoxina completa de la invención (por ejemplo, 1185 aminoácidos para el SEQ ID NO: 2).

Las proteínas delta-endotoxinas preferidas de la presente invención están codificados por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37. mediante "suficientemente idéntica" se quiere significar una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineamiento descritos en la presente memoria utilizando los parámetros convencionales. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar

apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas a continuación, permitiendo o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, se cuentan típicamente emparejamientos exactos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de tipo delta-endotoxina de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína delta-endotoxina de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como describen Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-BLAST, se pueden emplear los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). El alineamiento también puede realizarse manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, y por lo tanto puede proporcionar datos acerca de la conservación de la secuencia de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de soporte lógico de análisis ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tales como el módulo AlignX del Grupo de programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después del alineamiento de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de soporte lógico útil para el análisis de alineamientos ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud y la identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del Paquete de Soporte Lógico Wisconsin Genetics GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE.UU.). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

A menos que se indique lo contrario, se podrá utilizar GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol.. 48 (3) :443-453, para determinar la identidad o similitud de secuencia utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso por Hueco de 50 y un Peso por Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un Peso por Hueco de 8 y un peso por longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden utilizar programas equivalentes. Mediante "programa equivalente" se quiere significar cualquier programa de comparación de secuencia que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera un alineamiento que tiene emparejamientos de residuos de nucleótidos idénticos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con el alineamiento correspondiente generado por GAP Versión 10. La invención también abarca variantes de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 o 37 que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas

o en donde la variante codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 38. Las "variantes" de las secuencias que codifican delta-endotoxinas incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas de deltaendotoxinas descritas en la presente memoria, pero que difieren conservativamente debido a la degeneración del código genético, pero que son suficientemente idénticas como se ha comentado anteriormente y tienen actividad plaguicida contra un nematodo de plantas. Las variantes alélicas de origen natural pueden ser identificadas mediante el uso de técnicas bien conocidas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como las indicadas a continuación. Las secuencias de nucleótidos

variantes también incluyen secuencias de nucleótidos obtenidas sintéticamente que se han generado, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifican las proteínas delta-endotoxinas descritas en la presente invención como se discute a continuación. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservan la actividad plaguicida. Mediante "conserva la actividad" se quiere significar que la variante tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%,, o al menos aproximadamente 80% de la actividad plaguicida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 24802485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477.

El experto en la técnica apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención que conduce de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxinas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas variantes se puede crear introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de nucleótidos correspondiente descrita en la presente memoria, de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias de nucleótidos variantes también están abarcadas por la presente invención, siempre que tengan la identidad de secuencia requerida y codifiquen un polipéptido que tenga actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas.

Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácido pronosticados no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado desde la secuencia de tipo salvaje de una proteína delta-endotoxina sin alterar la actividad biológica, mientras que residuo de aminoácido un "esencial" es requerido para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales alcalinas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales no cargadas polares (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina , cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas tienen generalmente cinco dominios de secuencias conservadas, y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste de tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos hojas láminas beta antiparalelas en una formación de tipo remolino (de Maagd et al., 2001, supra). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor, y por tanto se consideran determinantes de la especificidad toxina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que mantienen la función. En general, dichas sustituciones no se harían para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, en donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de los residuos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la presente invención y secuencias conocidas de delta-endotoxinas. Los ejemplos de los residuos que se conservan, pero que pueden permitir sustituciones conservativas de aminoácidos y todavía mantener la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que tienen sólo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la presente invención y secuencias de delta-endotoxinas conocidas. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que las variantes funcionales pueden tener alteraciones mínimas conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes se pueden elaborar mediante la introducción de mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser escrutados para determinar su capacidad para conferir actividad de delta-endotoxina para identificar mutantes que conservan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente, y la actividad de la proteína se puede determinar utilizando técnicas de análisis convencionales.

Utilizando métodos tales como PCR, hibridación, y similares se pueden identificar las correspondiente secuencias de delta-endotoxinas, teniendo dichas secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véanse,

por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York).

En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de la delta-endotoxina se puede utilizar para escrutar genotecas de ADNc o genómicas. Los métodos para la construcción de tales genotecas de de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica y son descritos por Sambrook y Russell, 2001, supra. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación se pueden elaborar mediante el marcaje de oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos que codifica la delta-endotoxina conocida descrita en la presente memoria. Adicionalmente se pueden utilizar los cebadores degenerados diseñados sobre la base de los nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificadas. La sonda comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica la deltaendotoxina de la invención o un fragmento o variante de la misma. Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación son generalmente conocidos en la técnica y son descritos por Sambrook y Russell, 2001, supra.

Por ejemplo, se pueden utilizar una secuencia de delta-endotoxina completa descrita en la presente memoria, o una

o más porciones de la misma, como una sonda capaz de hibridar específicamente con las correspondientes secuencias y ARN mensajeros de tipo delta-endotoxinas. Para conseguir una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias de delta-endotoxinas correspondientes a partir de un organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado o como análisis de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen escrutinio de por hibridación de genotecas de ADN cultivadas en placas (placas o colonias, véase por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.).

La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones restrictivas. Mediante "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" se quieren significar condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, las se pueden identificar secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondeo de homólogos). Alternativamente, las condiciones restrictivas se pueden ajustar para permitir algunos emparejamientos erróneos en las secuencias de manera que se detecten grados menores de similitud (sondeo de heterólogos). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las que la concentración de sal es una concentración de iones Na menor de aproximadamente 1,5 M, típicamente una concentración de iones Na (u otras sales) aproximadamente de 0,01 a 1,0 M a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones poco restrictivas ilustrativas incluyen hibridación con una solución tampón de formamida de 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato sódico) al 1% a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55°C. Las condiciones moderadamente restrictivas ilustrativas incluyen hibridación en formamida de 40a 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0,5 X a 1X SSC de 55 a 60°C. Las condiciones altamente restrictivas ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0,1 X SSC de 60 a 65°C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender SDS de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, normalmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm= 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) 0,61 (% de form.) -500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la cual 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada.

La Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de emparejamientos erróneos, por lo que la Tm,las condiciones hibridación y/o de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con identidad ≥ 90%, la Tm puede disminuir 10°C. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones poco restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y Tm deseada, los expertos entenderán que las variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de emparejamientos erróneos da como resultado una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que se pueda utilizar una temperatura más alta. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteína Aislada y Variantes y Fragmentos de la Misma

Las proteínas delta-endotoxinas también están abarcadas por la presente invención. Mediante "proteína deltaendotoxina" se quiere significar una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en los SEC ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38. También se hace referencia a los fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes de las mismas, y se pueden utilizar para poner en práctica los métodos de la presente invención.

Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en los SEC ID N º: 2, 8, 10, 12, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 27 , 29, 31, 33, o 38 y que presentan actividad plaguicida (por ejemplo, los SEQ ID NO: 15, 19, 21, 23, o 25). Una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas se pueden preparar por técnicas recombinantes y se puede evaluar su actividad plaguicida. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477. Según se utiliza en la presente memoria, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de los SEC ID N º: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38. Sin embargo, también se hace referencia a otros fragmentos, por ejemplo cualquier fragmento de la proteína mayor de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, o 1300 aminoácidos.

Mediante "variantes" se quieren significar proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 38 (por ejemplo, SEQ ID NO: 10, 12, 17, 19, 23, 25, 27, 29, 31, o 33). También se hace referencia a variantes que incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma, en condiciones restrictivas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservan la actividad plaguicida. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477.

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi-031, axmi-039, axmi-040, y axmi-049 de esta invención, muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en la proximidad del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, a menudo no se determina a priori cuál de estos codones se utiliza de forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede conducir a la generación de proteínas delta-endotoxina que codifican la actividad plaguicida. Estas proteínas delta-endotoxinas están abarcadas por la presente invención y pueden ser utilizadas en los métodos de la presente invención.

También se hace referencia a los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o para las variantes o fragmentos de los mismos. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.196.265).

Variantes Modificadas o Alteradas

Se reconoce que las secuencias de ADN de una delta-endotoxina pueden ser alteradas mediante diversos métodos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes que la codificada por una delta-endotoxina de la presente invención. Esta proteína se puede alterar de varias maneras incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos, e inserciones de aminoácidos de uno

o más aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, o 38, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30 , aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130 o más sustituciones deleciones o inserciones de aminoácidos,.

Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína delta-endotoxina por mutaciones en el ADN. Esto también se puede lograr por una de las varias formas de mutagénesis y/o de evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una deltaendotoxina para conferir actividad plaguicida puede mejorarse mediante el uso de tales técnicas sobre las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se puede expresar una delta-endotoxina en células anfitrionas que exhiben altas tasas de incorporación errónea de bases durante la replicación del ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene). Después de la propagación en tales cepas, se puede aislar el ADN de la delta-endotoxina (por ejemplo mediante la preparación de ADN plasmídico, o mediante la amplificación por PCR y clonación del fragmento de PCR resultante en un vector), el cultivo de las mutaciones de delta-endotoxina en una cepa no mutagénica, e identificar las genes delta-endotoxina mutados con actividad plaguicida, por ejemplo mediante la realización de un análisis para someter a ensayo la actividad plaguicida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en análisis de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales análisis pueden incluir poner en contacto las plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Los ejemplos de las mutaciones que dan como resultado un aumento de la toxicidad se encuentran en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, se pueden llevar a cabo alteraciones en la secuencia de la proteína de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi, sin afectar sustancialmente la actividad. Esto puede incluir inserciones, deleciones, o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones de PCR que alteran o prolongan la secuencia codificante de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias codificantes de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias codificantes de proteínas completas, tales como las utilizadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Tales proteínas de fusión se utilizan a menudo para

(1) incrementar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática, o epítopo para facilitar la purificación de la proteína, la detección de la proteína, u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) dirigir la secreción o traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de una bacteria Gram-negativa, o el retículo endoplásmico de células eucarióticas, el último de los cuales a menudo da como resultado la glicosilación de la proteína.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos variantes de la presente invención también incluyen secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como el barajado de ADN. Con dicho procedimiento, se pueden utilizar una o más regiones codificantes de proteínas delta-endotoxinas diferentes para crear una nueva proteína delta-endotoxina que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan genotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, se pueden barajar motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre un gen de delta-endotoxina de la invención y otros genes de delta-endotoxinas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como un aumento de la actividad insecticida. Las estrategias para tal barajado de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391;

Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol.. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.605.793 y 5.837.458.

El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar proteínas delta-endotoxinas alteradas. Los dominios II y III se pueden intercambiar entre las proteínas delta-endotoxinas, dando como resultado toxinas híbridas

o quimérica con una actividad o espectro diana plaguicida mejorados. Los métodos para generar proteínas recombinantes y someterlas a ensayo para determinar la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol.. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores

Se puede proporcionar una secuencia de delta-endotoxina de la invención en una casete de expresión para su expresión en una planta de interés. Mediante "casete de expresión vegetal" se quiere significar un constructo de ADN que es capaz de dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Normalmente, estas contienen un promotor y una secuencia codificante. A menudo, tales constructos también contendrán una región no traducida 3'. Tales constructos pueden contener una "secuencia señal" o una "secuencia líder" (es decir, los SEQ ID NO: 9, 11, 28, 30, y 32) para facilitar el transporte cotraduccional o post-traduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplásmico, o aparato de Golgi.

Mediante "secuencia señal" se quiere significar una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado el transporte de péptidos co-traduccional o post-traduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto implica típicamente la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Mediante "secuencia líder" se quiere significar cualquier secuencia que cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos (es decir, los SEQ ID NO: 10, 12, 29, 31, y 33) suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo sub-celular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen el transporte y/o la glicosilación mediante paso al retículo endoplásmico, paso a las vacuolas, plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondrias, y similares.

Mediante "vector de transformación vegetal" se quiere significar una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficaz de una célula vegetal. Tal molécula puede consistir de una o más casetes de expresión vegetales, y se puede organizar en más de una molécula de ADN "vectora". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de vegetales que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas funciones que actúan en cis y trans requisito para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" hace referencia a un constructo de ácido nucleico diseñado para la transferencia entre diferentes células anfitrionas. "Vector de expresión" hace referencia a un vector que tiene la habilidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una célula foránea. La casete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' conectadas operablemente a una secuencia de la invención. Mediante "unido operativamente" se quiere significar un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, conectado operablemente significa que las secuencias de ácido nucleico que están conectadas son contiguas y, donde es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. La casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el gen o los genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples casetes de expresión.

"Promotor" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción (también denominadas "secuencias de control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Tal casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de delta-endotoxina esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

La casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de inicio de la transcripción y de la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación de la traducción y de la transcripción (es decir, región de terminación) funcional en las plantas. El promotor puede ser nativo o análoga, o foráneo o heterólogo, con respecto al anfitrión vegetal y/o con respecto a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" con respecto al anfitrión vegetal, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "foráneo" o "heterólogo"

con respeto a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o de origen natural de la secuencia de ADN conectada operablemente de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN conectada operablemente de interés, puede ser nativa con el anfitrión vegetal, o puede obtenerse de otra fuente (es decir, foránea o heterólogo con respecto al promotor, la secuencia de ADN de interés, el anfitrión vegetal, o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y de la nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev.. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el gen o los genes pueden ser optimizados para aumentar la expresión en la célula anfitriona transformada. Es decir, los genes pueden ser sintetizados utilizando los codones preferidos por la célula anfitriona para mejorar la expresión, o pueden ser sintetizados utilizando los codones a una frecuencia de uso de codones preferida por el anfitrión. Generalmente, el contenido de GC del gen se incrementará. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión del uso de codones preferido por los anfitriones. Se encuentran disponibles en la técnica métodos para sintetizar genes preferidos por las plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.380.831, y 5.436.391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477

498.

En una realización, la delta-endotoxina es dirigida al cloroplasto para su expresión. De esta manera, cuando la deltaendotoxina no se insertado directamente en el cloroplasto, la casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la delta-endotoxina a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol.. Rep. 9:104126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen de la delta-endotoxina que se va a dirigir al cloroplasto puede ser optimizado para la expresión en el cloroplasto para significar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados utilizando loa codones preferidos por los cloroplastos. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.380.831.

Transformación Vegetal

Los métodos de la invención implican la introducción de un constructo de nucleótidos en una planta. Mediante "introducción" se quiere significar la presentación a la planta del constructo de nucleótido de tal manera que el constructo consiga acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se utilice un método particular para la introducción de un constructo de nucleótidos en una planta, solamente que el constructo de nucleótidos consiga acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir constructos de nucleótidos en las plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus.

Mediante "planta" se quieren significar plantas completas, órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de la misma. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (p. ej., callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíz, células de floema, polen).

Las "plantas transgénicas" o las "plantas transformadas" o las plantas o células o tejidos "transformados establemente" hacen referencia a plantas que han incorporado o han integrado secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en células vegetales no transformadas, así como aquellas que pueden ser endógenas, o están presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólogo" generalmente hace referencia a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes, y se han añadido a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similares.

La transformación de células vegetales se puede lograr por uno de varios mecanismos conocidos en la técnica. El gen de delta-endotoxina de la invención puede ser modificado para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Normalmente, un constructo que expresa dicha proteína contendría un promotor para dirigir la transcripción del gen, así como una región no traducida 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales constructos es bien conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil diseñar el gen de modo que el péptido resultante sea secretado, o de otro modo dirigido al interior de la célula

vegetal. Por ejemplo, el gen puede ser diseñado para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. También puede ser preferible diseñar la casete de expresión vegetal para que contenga un intrón, de manera que se requiere para la expresión el procesamiento del ARNm del intrón.

Típicamente esta "casete de expresión vegetal" se insertará en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación vegetal que se componen de más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores son referidos a menudo en la técnica como "vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos coadyuvantes son los más utilizados para la transformación mediada por Agrobacterium, en donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficaz son bastante grandes, y son ventajosos para separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios contienen típicamente un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia de ADN-T (tal como el límite izquierdo y el límite derecho), un marcador seleccionable que está diseñado para ser susceptible de expresión en una célula vegetal, y un gen "de interés" (un gen diseñado para ser susceptible de expresión en una célula vegetal para la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis se disponen de manera que permitan la transferencia eficaz en células vegetales y su expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y la delta-endotoxina se encuentran entre los límites izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plasmídico contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia de ADN-T a partir de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN mediante escisión en secuencias límite y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Se pueden utilizar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación vegetal. El segundo vector plasmídico no es necesario para la transformación de las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación vegetal implican la transferencia de ADN heterólogo a células vegetales diana (p. ej., embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas a partir de un grupo de masa de células no transformadas. Los explantes normalmente se transfieren a un suministro de nueva aportación del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocar en medio de regeneración con un suplemento de nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes son transferidos a continuación a un medio selectivo de enraizamiento para recuperar los brotes o plántulas enraizados. La plántula transgénica se convierte a continuación en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes normalmente se transfieren a un suministro de nueva aportación del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células; se encuentran presentes células tanto transformadas como no transformadas en cualquier porción de callo o tejido o grupo de células diana sometidos. La habilidad para eliminar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células vegetales transformadas y la generación satisfactoria de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, elegido como diana para la transformación. La generación de plantas transgénicas se puede realizar mediante uno de varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación Mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN foráneo heterólogo adherido a partículas, aceleración balística de partículas, transformación por haces de aerosol (Solicitud Publicada de los Estados Unidos Núm. 20010026941; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.945.050; Publicación Internacional Núm. WO 91/00915; Solicitud Publicada de los Estados Unidos Núm. 2002015066), transformación con LEC1, y otros diversos métodos para transferencia de ADN no mediados por partículas dirigidas.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la liberación con pistola de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y redireccionamiento del ADN al genoma del plástido mediante recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación de plástidos se puede lograr por transactivación de un transgen silencioso portado por un plástido mediante la expresión en el tejido preferido de una ARN polimerasa codificada en

el núcleo y dirigida al plástido. Tal sistema ha sido referido por McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:7301-7305.

Tras la integración de ADN heterólogo foráneo en células vegetales, a continuación se aplica un nivel de umbral máximo de selección apropiada en el medio para eliminar las células no transformadas y separar y hacer proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven de este tratamiento de selección mediante transferencia periódica a un medio de nueva aportación. Mediante el paso continuo y la sensibilización con la selección apropiada, se identifican y se hacen proliferar las células que son transformadas con el vector plasmídico. Los métodos moleculares y bioquímicos se pueden utilizar para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas se pueden cultivar en plantas de acuerdo con las formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden cultivar a continuación, y, polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, e identificar el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda de manera estable y después se cosechan las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también referidas como "semillas transgénicas") que tienen un constructo de nucleótidos de la invención, por ejemplo, una casete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

Evaluación de la Transformación Vegetal

Después de la introducción de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma por varios métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis de PCR es un método rápido para escrutar células, tejido o brotes transformados para determinar la presencia de un gen incorporado en la etapa temprana antes del transplante al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores oligonucleótidos específicos para el gen de interés o un fondo de vectores de Agrobacterium, etc.

La transformación vegetal se puede confirmar mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae a partir del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o "transferencia" se sondea, por ejemplo, con un fragmento de ADN diana radiomarcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aísla de los tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con procedimientos convencionales que se utilizan habitualmente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por la delta-endotoxina se analiza a continuación mediante hibridación del filtro con una sonda radioactiva derivada de una delta-endotoxina, mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001,supra).

La transferencia Western, los análisis bioquímicos y similares se pueden llevar a cabo en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen de la delta-endotoxina mediante procedimientos convencionales (Sambrook y Russell, 2001, supra) utilizando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína de delta-endotoxina.

Actividad plaguicida en las plantas

En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresan una delta-endotoxina que tiene actividad plaguicida. Se pueden utilizar los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo para generar plantas transgénicas, pero la manera en la que se generan las células vegetales transgénicas no es crítica para esta invención. Los métodos conocidos o descritos en la técnica, tales como la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación biolística, y los métodos no mediados por partículas se pueden usar a la discreción del experimentador. Las plantas que expresan una delta-endotoxina se pueden aislador mediante métodos comunes descritos en la técnica, por ejemplo mediante transformación de callo, selección de callo transformado, y regeneración de plantas fértiles a partir de tal callo transgénico. En tal procedimiento, se puede utilizar cualquier gen como marcador seleccionable siempre que su expresión en células vegetales confiera capacidad para identificar o seleccionar las células transformadas.

Se han desarrollado diversos marcadores para su uso con células vegetales, tales como resistencia a cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. También se pueden usar como marcadores seleccionables otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo del cloroplasto. Por ejemplo, pueden encontrar un uso particular los genes que proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tales como glifosato, bromoxinilo o imidazolinona. Tales genes han sido referidos (Stalker et al. (1985) J. Biol.. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa con resistencia a bromoxinilo), y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gen de AHAS con resistencia a imidazolinona). Además, los genes descritos en la presente memoria son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones o progenie de la misma son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgen se detecta sometiendo a ensayo la actividad plaguicida.

Las plantas fértiles que expresan una delta-endotoxina se pueden someter a ensayo para determinar la actividad plaguicida, y seleccionar las plantas que presentan una actividad óptima para la reproducción ulterior. Se dispone de métodos en la técnica para someter a ensayo la actividad de las plagas. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención se puede utilizar para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de las plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maíz (maíz), sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuete, batata, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las hortalizas incluyen, pero no están limitadas a, tomates, lechuga, judías verdes, frijol lima, guisantes, y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón cantalupo y melón. Las plantas ornamentales incluyen, pero no están limitadas a, azalea, hortensia, hibiscos, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemo. Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, etc.).

Uso en el Control de Plagas

Los métodos generales para emplear las cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en el control plaguicida o en el diseño de otros organismos como agentes plaguicidas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido alterados genéticamente para contener un gen plaguicida y la proteína pueden usarse para proteger de las plagas cultivos y productos agrícolas. En un aspecto de la invención, las células completas, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (plaguicida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la plaga o las plagas diana.

Alternativamente, el plaguicida se produce introduciendo un gen de delta-endotoxina en un anfitrión celular. La expresión del gen de la delta-endotoxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. En un aspecto de esta invención, estas células se tratan a continuación bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la plaga o las plagas diana. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos plaguicida encapsulados naturalmente se pueden formular de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación en el entorno de alojamiento una plaga diana, por ejemplo, suelo, agua y follaje de las plantas. Véase, por ejemplo el documento EPA 0192319, y las referencias allí citadas. Alternativamente, se pueden formular las células que expresan un gen de esta invención de manera que se permita la aplicación del material resultante como un plaguicida.

Control de Nematodos

Los nematodos parásitos de plantas, incluyendo los nematodos del quiste, los nemátodos del nudo de la raíz, y otros nematodos, causan miles de millones de dólares en daños a los cultivos cada año. Los nemátodos parásitos de plantas perforan las paredes de las células vegetales con su estilete, que está formado por ciertas partes de la boca y el esófago, y bombean la célula vegetal a su sistema digestivo. Numerosas publicaciones en la técnica concluyen que los nematodos parásitos de plantas sedentarios no ingieren moléculas más grandes que aproximadamente 2328 kDa in vivo. Esto ha conducido a la creencia generalizada de que el tubo de alimentación producido por estos

nematodos actúa como un tamiz molecular, restringiendo del tamaño de las moléculas que pueden ser ingeridas. Böckenhoff y Grundler ((1994) 109:249-254 Parasitología) Inyectaron dextranos marcados fluorescentemente en sincitios con los que estaban siendo alimentados Heterodera schachtii. Encontraron que los nematodos ingieren dextranos de 22 kDa, pero no dextranos de 40 kDa. Urwin et al. ((1998) Planta 204:472-479) encontraron que una proteína de fusión de 23 kDa expresada en plantas transgénicas Arabidopsis no pudo ser ingerida por H. schachtii, aunque pudo ingerir una proteína de aproximadamente 11 kDa. De un modo similar, Unwin et al. ((1997) Molecular Plant-Microbe Interactions 10:394-400) encontraron que la proteína verde fluorescente (GFP) de 28 kDa expresada en plantas transgénicas de Arabidopsisno no pudo ser ingerida por H. schachtii. Por lo tanto, no se había reconocido

o demostrado previamente que los nematodos se pudieran controlar mediante la expresión de una proteína mayor de 22 kDa en una planta ya que se pensaba que los nematodos no ingieren tal proteína.

En la presente memoria se proporcionan métodos y composiciones para conferir resistencia a los nematodos en las plantas. Los métodos comprenden la introducción en una planta de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido activo contra nematodos de la invención y el cultivo de la planta en un campo que contiene los nematodos. Mediante "polipéptido activo contra nematodos" se quiere significar un polipéptido que, cuando es ingerido por el nematodo, da como resultado la muerte o el retraso del crecimiento o la proliferación de al menos un nematodo. En una realización, el polipéptido activo contra nematodos tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 22 kDa, aproximadamente 23 kDa, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49 , aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80 kDa, o mayor.

En otra realización, el polipéptido activo contra nematodos tiene actividad contra nemátodos parásitos de plantas. La expresión del polipéptido activo contra nematodos en una planta reduce la capacidad de los nematodos para infestar

o alimentarse de raíces de la planta. Ejemplos de nemátodos parásitos de plantas sensibles a las composiciones de la presente invención incluyen los nematodos de nudo de raíz (Meloidogyne sp.), nematodos de estilete (Tylenchorhynchus sp.), nematodos de lanza (Hoplolaimus sp.), nematodos espiral (Helicotylenchus sp.), nematodo de la lesión (Pratylenchus sp.), nematodo del quiste (Heterodera sp. y Globodera sp.), y el nematodo de anillo (Criconema sp.).

Composiciones plaguicidas

Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse a la zona de cultivo o a la planta que se vayan a tratar, simultáneamente o sucesivamente, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, agentes tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites latentes, polímeros, y/o formulaciones portadoras de liberación controlada

o biodegradables que permiten una dosificación a largo plazo de una zona diana tras una única aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros portadores, tensioactivos o coadyuvantes que promueven la aplicación agrícolamente aceptables que se emplean comúnmente en la técnica de la formulación. Los portadores y coadyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las substancias empleadas habitualmente en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, taquificantes, aglutinantes o fertilizantes. Del mismo modo, las formulaciones se pueden preparar como "cebos" comestibles o en forma de "trampas" para plagas para permitir la alimentación o la ingestión por una plaga diana de la formulación plaguicida.

Los métodos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen la aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de infestación por la plaga correspondiente. La composición se puede formular como un polvo, espolvoreable, bolita, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, solución, o similares, y se puede preparar por medios convencionales tales como la desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen al menos uno de tales polipéptidos

plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso.

Mediante los métodos de la invención se pueden eliminar plagas de lepidópteros, coleópteros, o nematodos o se puede reducir su número en una zona determinada, o se pueden aplicar profilácticamente a una zona medioambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente, la plaga ingiere o se pone en contacto con, una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido. Mediante "cantidad eficaz como plaguicida" se quiere significar una cantidad del plaguicida que es capaz de provocar la muerte de al menos una plaga, o de reducir notablemente el crecimiento, la alimentación o desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas específicas a controlar, el entorno específico, la localización, la planta, el cultivo, o la localización agrícola a tratar, las condiciones ambientales, y el método, la tasa, la concentración, la estabilidad, y la cantidad de aplicación de la composición de polipéptido eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones ambientales, y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de la plaga.

Las composiciones plaguicidas descritas pueden elaborar formulando la célula bacteriana, el cristal y/o la suspensión de esporas, o el componente proteico aislado con el portador agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, secado por congelación, desecado, o en un portador, medio o diluyente adecuado acuosos, tal como tampón salino u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un material espolvoreable o granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones de aceite/agua, o en forma de un polvo mojable, o combinado con cualquier otro material portador adecuado para la aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "portador agrícolamente aceptable" cubre todos los coadyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes taquificantes, aglutinantes, etc., que se usan normalmente en la tecnología de formulación de plaguicidas, los cuales son bien conocidos por los expertos en la formulación de plaguicidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o más coadyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezclando, combinando y/o moliendo homogéneamente la composición plaguicida con coadyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y métodos de aplicación adecuados se describen en los Patente de los Estados Unidos Núm. 6.468.523.

"Plaga" incluye, pero no está limitado a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas, y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados entre los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera, y Diptera. Los polipéptidos de la invención tienen actividad plaguicida contra una nemátodos parásitos de plantas.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, y Curculionoidea. Lasuperfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae, y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Diptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera, y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las Divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae, y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, y Tineidae.

Las plagas de insectos para los cultivos principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, Barrenador Europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del suroeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo de maíz menor; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz occidental; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz de sur; Melanotus spp., gusano de alambre.; Cyclocephala borealis, escarabajo enmascarado del norte (larva blanca); Cyclocephala immaculata, escarabajo enmascarado del sur (larva blanca); Popillia Japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus Maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, áfido de la hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón radicular del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los cereales; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minador de la hoja del maíz; Anaphothrips Obscrurus, trips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, arañuela roja; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Elasmopalpus lignosellus, Barrenador del tallo de maíz menor; Feltia subterranea, gusano cortador pequeño; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus,y Eolo spp, gusanos de alambre.; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de los cereales; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga de maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis; áfido de la hoja del maíz; Sipha flava, afído amarillo de caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los cereales; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, Arañuela roja; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo de maíz menor; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo de maíz menor; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de los cereales; Hypera punctata, gorgojo de la hoja de trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, afido verde; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Sitodiplosis mosellana, mosquito rojo del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro de enrollamiento del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de los brotes del girasol; Homeosoma electellum, polilla del girasol; Zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano de las yemas del algodón; Helicoverpa zea, gusano bellotero del algodón; Spodoptera exigua, gardama de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado; Anthonomus grandis, gorgorjo del algodonero; Aphis gossypii, áfido del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltona del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca; Lygus lineolaris, chinche manchado; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, arañuela roja; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz; Helicoverpa zea, gusano del maíz; Colaspis brunnea, Colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo acuático del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los cereales; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, gusano de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga del frijol terciopelo; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Heliothis virescens, gusano cogollero del algodón; Helicoverpa zea, gusano bellotero del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mejicano de la judía; Myzus persicae, áfido verde del melocotonero; Empoasca fabae, Saltahojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña amarilla de la fresa; Tetranychus urticae, arañuela roja; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, áfido verde; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los cereales; Acrosternum hilare, chinche hedionda verde; Euschistus servus, chinche hedionda parda; Delia platura, gusano de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Petrobia latens, ácaro pardo del trigo; Colza de semilla oleaginosa: Brevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo pulga de la colza; Mamestra configurata, gusano soldado; Plutella xylostella, polilla dorso de diamante; Delia ssp., larvas de la raíz.

Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como los nematodos nudos de la raíz, del quiste y de la lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp., particularmente los miembros de los nematodos del quiste, incluyendo, pero no limitados a, Heterodera glycines (Nematodo de quiste de la soja); Heterodera schachtii (Nematodo de quiste de la remolacha); Heterodera avenae (Nematodo de quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (Nematodos del quiste de la patata). Los nemátodos de la lesión incluyen Pratylenchus spp.

Métodos para aumentar el rendimiento de la planta

Se hace referencia a los métodos para aumentar el rendimiento de la planta. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia plaguicida descrita en la presente memoria documento. Como se define en la presente memoria, el "rendimiento" de la planta hace referencia a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Mediante "biomasa" se quiere significar cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento de rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de hoja de la planta puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Adicionalmente, se puede utilizar el aumento de la biomasa de hoja para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo, incluyendo, pero no limitado a, al menos, un aumento de 1%, al menos un aumento de 3%, al menos un aumento de 5%, al menos un aumento de 10%, al menos un aumento de 20%, al menos 30%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 100% o un aumento de mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia de plaguicida.

En métodos específicos, rendimiento de la planta se incrementa como resultado de un aumento de resistencia a las plagas de una planta que expresa una proteína plaguicida descrita en la presente memoria. La expresión de la proteína plaguicida da como resultados una disminución de la capacidad de una plaga de infestar o alimentarse de la planta, mejorando así el rendimiento de la planta.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

Ejemplo 1. Crecimiento de ATX9387, y preparación de extractos.

La cepa ATX9387, identificada como un miembro del grupo de Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis mediante análisis de MIDI, se cultivó en medio T3 en 30 grados para tiempos que varían de 16 horas a 5 días. Los cultivos se centrifugaron y los sobrenadantes se pasaron a través de filtros de 0,2 micras, dando como resultado sobrenadantes estériles

Ejemplo 2. Bioanálisis de C. elegans.

Se criaron Caenorhabitis elegans ("C. elegans") hermafroditas como se conoce en la técnica, para generar poblaciones de animales sanos para el bioanálisis. Los procedimientos generales para el crecimiento, cultivo y manipulación genética de C. elegans incluyendo los medios de crecimiento, etc. se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo, en Wood, ed. (1988) The Nematode Caenorhabditis elegans (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Se sometieron a ensayo sobrenadantes estériles de la cepa ATX9387 para determinar la actividad en C. elegans. Los bioanálisis se realizaron en placas de 96 pocillos. Se añadieron de cinco a diez nematodos a 80 μl de medio S (Wood, supra) y se mezclaron con 20 μl de sobrenadante estéril, 0,5 μl de HB101 concentrado (preparado como se describe en Wood, supra) y rifampicina (concentración final de 0,1 μg/μl). Se dejó que los análisis prosiguieran a temperatura ambiente durante 3 días y se cuantificaron los nematodos. Las muestras de control negativo (medio T3

: o sobrenadantes estériles procedentes de cepas inactivas) contenían cientos de nematodos activos, mientras que las muestras de ensayo (que contenían sobrenadante de ATX9387) contenían de 5 a 10 nematodos que eran lentos

: o estaban muertos. Los resultados del bioanálisis de extractos de ATX9387 en C. elegans se muestran en la Tabla

1.

Tabla 1. Actividad de los extractos de ATX9387 en C. elegans

Tiempo de Crecimiento: ATX9387 Control

16 horas: - -

1 día: - -

2 días: - -

3 días: + + -

4 días: + + -

5 días: + + -

Ejemplo 3. Actividad de ATX9387 sobre nematodos del quiste de la soja.

Un sobrenadante estéril de un cultivo de 5 días de ATX9387 se concentró 40 veces y se utilizó como alimento de nematodos SCN J2. Se observó reproduciblemente que los nematodos que se alimentaron de sobrenadante estéril eran lentos, y mostraron una mayor motilidad que los nematodos alimentados con extracto de un control negativo concentrado en la misma medida.

Ejemplo 4. Anti-nematodos actividad de ATX9387 es conferida por una proteína.

Para identificar la actividad anti-nematodos en ATX9387, se llevaron a cabo los siguientes ensayos. En primer lugar, se sometió a ensayo la susceptibilidad de la actividad para ser destruida por calor mediante calentamiento de las muestras de sobrenadante estéril de ATX9387 a 100°C durante 10 minutos, a continuación, se sometió a ensayo el material calentado en un bioanálisis de nematodos. El tratamiento térmico de los sobrenadantes estériles de ATX9387 dio como resultado una pérdida de actividad anti-nematodos. A continuación, las muestras activas se trataron con pronasa para degradar las proteínas. Este tratamiento dio como resultado una pérdida de actividad. Los sobrenadantes estériles de ATX9387 se hicieron pasar por una unidad de concentración de peso molecular de corte ("MWCO") de 3 kDa. El ingrediente activo fue retenido por el filtro de MWCO de 3 kDa mientras que el flujo continuo no mostró actividad. Esto indica que la molécula activa era mayor de 3 kDa de tamaño.

Ejemplo 5. Fraccionamiento de la actividad de ATX9387

El sobrenadante estéril de un cultivo de 4 días de ATX9387 se fraccionó mediante cromatografía líquida en una columna de intercambio aniónico en Tris 20 mM de pH 8, usando un gradiente de NaCl de 0 M a 1 M. Estuvieron activas varias fracciones consecutivas. La fracción más activa se sometió a SDS-PAGE, y se observaron dos bandas prominentes de aproximadamente 70 kDa y aproximadamente 130 kd.

En otro experimento se cultivó la cepa ATX9387 durante 5 días en medio T3 a 30°C. El cultivo se centrifugó a 8.000 xg durante 10 minutos, y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,2 micras. El sobrenadante filtrado se dializó contra Tris 20 mM de pH 8 utilizando tubos de diálisis Spectra/Por 1 (MWCO 6-8.000), y a continuaciòn se fraccionó en una columna de intercambio aniónico (Mono Q) usando un gradiente de NaCl de 0 a 1 M de más de 20 volúmenes del lecho. Las fracciones se dializaron contra Tris 20 mM de pH 8 usando mini unidades de diálisis SlideA-Lyzer (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) (MWCO 7.000), y se sometieron a bioanálisis sobre C. elegans utilizando 20 μl de muestra en un volumen de bioanálisis de 100 μl, como se describe en la presente memoria. Se encontró que las fracciones 12 y 13 eran activas, y se reunieron y a continuación se concentraron 7 veces utilizando un concentrador Amicon Ultra-4 MWCO 5.000. El material concentrado se fraccionó en una columna de filtración en gel (Superdex 200) en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7. Las fracciones se concentraron 10 veces usando concentradores Centricon YM-3, y se sometieron a bioanálisis en C. elegans como antes. Las fracciones 5 y 6 fueron las más activas, y la fracción 7 era algo activa. La SDS-PAGE de las fracciones mostró que las fracciones 5-7 compartían varias proteínas: una proteína en alrededor de 130 kDa, un doblete a aproximadamente 75 kDa, y una proteína de aproximadamente 53 kDa. Las bandas más prominentes fueron sometidas a secuenciación de la proteína N-terminal mediante degradación de Edman. La proteína de 130 kDa y la proteína de 70 kDa tenían secuencias N-terminales muy similares (la cisteína no pudo ser detectada mediante el método utilizado), y por lo tanto es probable que deriven de la misma proteína inicial. Esta proteína se designa como AXMI-031 (SEQ ID NO: 2).

Tabla 2. Secuencia N-terminal de la proteína de 130kDa de ATX9387 Tabla 3. Secuencia N-terminal de la proteína de aproximadamente 70 kDa de ATX9387

1: A, S + S ', M

2: D, Q

3: ?, P, N

4: N

5: L

6: Q

7: S

8: Q

9: ?, Q

10: N

11: I

12: P

13: Y

14: N

15: V

1: A, G, S + S '

2: F

3: P

4: N

5: L

6: Q

7: V?

8: Q

9: ?

10: N?, V?

11: Yo

12: P

13: Y, Q

14: ?, N

15: ?, V

Una búsqueda de bases de datos de proteínas con las secuencias N-terminales de la proteína de 130kDa y la proteína de 70kDa demostró que los aminoácidos N-terminales de las proteínas AXMI-031 tienen una similitud 5 significativa con el extremo N de la endotoxina Cry14Aa (SEQ ID NO: 13).

La secuencia N-terminal de Cry14A: MDCNLQSQQNIPYNV (residuos de aminoácidos 1 a 15 del SEQ ID NO: 13).

Ejemplo 6. Clonación de la región codificante axmi-031 de ATX9387.

10 Se generó una genoteca de fragmentos al azar de ATX9387, y se identificó un clon de ADN (pAX031) que contiene la secuencia de ADN que codificaba el extremo N terminal de axmi-031. Se identificó un segundo clon, pAX032, que contenía el extremo C terminal de axmi-031. Los clones pAX031 y pAX032 se solapan sustancialmente, de manera que resulta evidente para un experto en la técnica que ambos clones juntos comprenden la totalidad de la región

15 codificante axmi-031.

Para confirmar la naturaleza de AXMI-031, se amplificó un clon genómico utilizando una polimerasa de alta fidelidad PFU ULTRA ™ (Stratagene) a partir de ADN total usando cebadores diseñados para los extremos del marco de lectura abierto de axmi-031. El producto de PCR resultante se clonó en el vector PCR-TOPOII-Blunt (Invitrogen) para 20 crear pAX980. Se determinó la secuencia de ADN de pAX980 y se encontró que contenía el mismo marco de lectura abierto que en los clones de la genoteca de fragmentos al azar pAX031 y pAX032. La traducción de este marco de lectura abierto genera una secuencia de proteínas coincidente con la secuencia N-terminal obtenida de la proteína AXMI-031 purificada. De este modo, este marco de lectura abierto fue designado axmi-031 (SEQ ID NO: 1). El clon del plásmido pAX2515, que contenía axmi-031f fue depositado el 9 de junio de 2006 y se le asignó el número de

25 acceso NRRL B-30935.

Ejemplo 7. Comparación de AXMI-031 con otras endotoxinas conocidas

Las búsquedas en las bases de datos utilizando la secuencia de la proteína AXMI-031 demuestran que AXMI-031 es 30 un miembro de la clase de delta-endotoxina de proteínas insecticidas. AXMI-031 es muy similar a la endotoxina cry14Aa1. La secuencia de aminoácidos de AXMI-031 es idéntica en 86,6% a CRY14Aa1 (SEQ ID NO: 13).

Ejemplo 8. Expresión del polipéptido AXMI-031 en E. coli

Para la expresión soluble en E. coli, se diseñaron cebadores que incluyeran los codones el inicio de la traducción y de parada del ORF de axmi-031. Los cebadores añadieron sitios de recombinación RBS y Gateway attB óptimos. Se utilizó polimerasa Pfu I de Stratagene para amplificar consistentemente el ORF de pAX980, y se recombinó con pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para crear el vector de entrada pAX2515 (según los protocolos de Invitrogen). El clon se secuenció para su verificación. Se realizó una recombinación adicional para introducir el ORF en pDEST17 que iba a ser expresado por el promotor de T7, produciendo pAX2530. La presencia y la orientación del fragmento axmi-031 insertado se verificó mediante digestión de restricción, y se transformó en células de E. coli BL21 (DE3). Este vector produce una fusión traduccional de 26 aminoácidos (3,17 kDa), incluyendo una etiqueta 6x His, en el extremo N-terminal de AXMI-031.

Se expresó His-AXMI-031 a partir pAX2530 en células BL21*(DE3) como sigue. Se hizo crecer durante la noche un cultivo iniciador de pAX2530 a 37°C en LB con 50 mg/ml de carbenicilina. El día siguiente, el cultivo saturado se diluyó a 1:100 en medio de nueva aportación, y el cultivo de nueva aportación se hizo crecer a 37°hasta una DO de 0,4, momento en el cual el cultivo se colocó a temperatura ambiente con sacudimiento durante la noche. Como control, se construyó un vector de expresión que llevaba el gen axmi-004 (pAX2530) como para axmi-031, yla proteína AXMI-004 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 10/782.020) se expresó a partir de pAX2504 en el mismo anfitrión de E. coli. Los cultivos se analizaron mediante SDS-PAGE. Los cultivos que contenían pAX2530 produjeron una banda de proteína prominente a aproximadamente 135 kDa, el tamaño esperado para la proteína His-AXMI-031, mientras que los cultivos que contenían pAX2504 no la produjeron.

Ejemplo 9. Anticuerpos contra AXMI-031

Para generar anti-anticuerpos AXMI-031, la proteína AXMI-031 purificada por afinidad (SEQ ID NO: 2) se inoculó en conejos, y se aislaron los antisueros para AXMI-031 y se titularon como se conoce en la técnica. Se encontró que los antisueros seleccionados reaccionaban también con la proteína SYNAXMI-031 (SEQ ID NO: 8).

Ejemplo 10. Actividad de AXMI-031 en C. elegans.

Se prepararon cultivos de E. coli que contenían pAX2530, y se encontró que producían una proteína de 135kDa no presente en las cepas de control, lo que sugirió la expresión de AXMI-031 en las cepas que contenían pAX2530. Estos cultivos se sometieron a ensayo para determinar la actividad en C. elegans y fueron activos contra C.elegans, mientras que los cultivos de control no mostraron actividad contra C. elegans.

Ejemplo 11. Expresión de AXMI-031 en Bacillus

El gen insecticida axmi-031 se amplifica mediante PCR a partir de pAX980, y el producto de PCR se clonó en el vector expresión de Bacillus pAX916, u otro vector adecuado, por métodos bien conocidos en la técnica. La cepa de Bacillus resultante, que contiene el vector con axmi-031 se cultiva en un medio de crecimiento convencional, tal como medio CYS (10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/l KH2PO4;14 g/l K2HPO4; MgSO4 0,5 mM; MnCl2 0,05 mM; FeSO4 0,05 mM), hasta que la esporulación resultó evidente mediante examen microscópico. Se preparan las muestras, y la proteína AXMI-031 se somete a ensayo para determinar en el bioanálisis frente a C. elegans, y se encuentra que tienen actividad.

Ejemplo 12. synaxmi-031, synaxmi-031 (apo) y synaxmi-031 (ER)

En un aspecto de la invención, se generan secuencias de axmi-031 sintéticas, por ejemplo synaxmi-031 (SEQ ID NO: 7). Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de ADN alterada con respecto a la secuencia de axmi-031, y codifican una proteína que es colineal con la proteínas AXMI-031 original, pero carece del "dominio cristal" Cterminal presente en AXMI-031. La secuencia del gen synaxmi-031 codifica la proteína SYNAXMI-031 (SEQ ID NO: 8), que comprende los primeros 685 aminoácidos de la proteína AXMI-031.

En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de synaxmi-031 de manera que el péptido resultante se dirija a un orgánulo vegetal, tal como el retículo endoplasmático o el apoplasto. Las secuencias de péptidos conocidas por dar como resultado el redireccionamiento de las proteínas de fusión a los orgánulos vegetales son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del Altramuz Blanco Lupinus albus (Genebank ID GI: 14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) es conocido en la técnica por producir el redireccionamiento al retículo endoplásmico de proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención endoplásmica que comprende el péptido extremo Nterminal-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEQ ID NO: 36) en el extremo Cterminal, la proteína de fusión se dirigirá hacia el retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia de redireccionamiento al retículo endoplásmico en el extremo C-terminal, la proteína se dirigirá hacia el retículo endoplasmático, pero en última instancia será secuestrada en el apoplasto.

Por lo tanto, el gen synaxmi-031ER (SEQ ID NO: 11) codifica una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos N-terminales del gen de la fosfatasa ácida del Altramuz Blanco Lupinus albus fusionados al extremo Nterminal de SYNAXMI-031, así como la secuencia KDEL en el extremo C-terminal. De este modo, se prevé que la proteína resultante AXMI-031ER (SEQ ID NO: 12), se dirija al retículo endoplásmico planta tras su expresión en una célula vegetal.

El gen synaxmi-031 (apo) (SEQ ID NO: 9) codifica una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos N-terminales del gen de la fosfatasa ácida del Altramuz Blanco Lupinus albus fusionados al extremo N-terminal de SYNAXMI-031, pero carece de la secuencia de KDEL en el extremo C-terminal. De este modo, se prevé que la proteína resultante AXMI-031 (APO) (SEQ ID NO: 10), se dirija al apoplasto vegetal tras su expresión en una célula vegetal.

Ejemplo 13. Truncamientos de synaxami-031 para producir proteínas AXMI-031 alternativas

Se desarrollaron y expresaron constructos de ADN que dieron como resultado la expresión de variantes de la proteína AXMI-031, además de secuencias sintéticas que codifican AXMI-031 y variantes y fragmentos de las mismos (SEQ ID NO :15-27). Se sometió a ensayo un subconjunto de estos genes para determinar la actividad de nematodos in vitro.

Tabla 4. Actividad nematicida de AXMI-031 variantes in vitro

Proteína: Nucleótidos SEQ ID NO: Aminoácidos SEQ ID NO: Activo en C. elegans?

Expresión bacteriana

: AXMI-031-truncada 14 15 Sí

: AXMI-031 (ml) 16 17 Sí

: AXMI-031 (ml) -truncada 18 19 Sí

: AXMI-031 (A-D) 20 21 Sí

: SYNAXMI-031 (A-D) 26 27 NA

: AXMI-031 (B-C) 22 23 Sí

AXMI-031 (B-D): 24 25 Sí

NA = no analizado

Ejemplo 14. Truncamientos y adición de dominio o dominios de redireccionamiento celular para su expresión en plantas

En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de secuencias synaxmi-031 de manera que el péptido resultante se dirija a un orgánulo vegetal, tal como el retículo endoplasmático o el apoplasto.

En otro aspecto de la invención, los genes se truncan de manera que el péptido resultante sea una versión truncada de AXMI-031, que puede ser modificado adicionalmente o no para dirigirse a orgánulos de plantas, tales como el apoplasto o el retículo endoplásmico.

En otro aspecto de la invención, se desarrollan versiones modificadas que dan como resultado la expresión de las variantes truncadas que contienen dominios diseñados para dirigir la proteína resultante a orgánulos de la planta.

Se diseñaron las siguientes secuencias de nucleótidos variantes:

aposynaxmi-031 (AD) (SEQ ID NO: 28) codifica la proteína APOAXMI-031 (AD) (SEQ ID NO: 29).

apoSyn2axmi-031 (AD) (SEQ ID NO: 30) codifica la proteína APOAXMI-031 (AD) (SEQ ID NO: 31).

aposynaxmi-031 (fl) (SEQ ID NO: 37) codifica la proteína APOSYNAXMI-031 (FL) (SEQ ID NO: 38).

Synaxmi031 (fl)-ER(SEQ ID NO: 32) codifica la proteína SYNAXMI-031 (FL)-ER (SEQ ID NO: 33).

Ejemplo 15. Extracción de ADN plasmídico de las cepas ATX16538, ATX16093 y ATX21049

Las cepas ATX16538, ATX16093, y ATX21049 se seleccionaron para su análisis. Se hicieron crecer cultivos puros de cada cepa en grandes cantidades de medios enriquecidos. Los cultivos se centrifugaron para recoger el sedimento celular. El sedimento celular se preparó a continuación mediante tratamiento con SDS por métodos conocidos en la técnica, lo que dio como resultado la rotura de la pared celular y la liberación de ADN. A continuación se hicieron precipitar las proteínas y el ADN genómico grande por medio de una alta concentración de sal. El ADN plasmídico se precipitó con etanol. En algunos casos, el ADN del plásmido se separó de cualquier ADN cromosómico restante por centrifugación a alta velocidad a través de un gradiente de cloruro de cesio.

Alternativamente, el ADN plasmídico se purificó mediante la unión a una resina, tal como se conoce en la técnica. Para cada cepa, la calidad del ADN fue verificada por visualización en un gel de agarosa mediante métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo 16. Clonación de genes de las cepas ATX16538, ATX16093 y ATX21049

Se prepararon genotecas de ADN a partir del ADN de plásmido o cada cepa. Esto se puede lograr de muchas maneras como se conoce en la técnica. Por ejemplo, el ADN plasmídico purificado se puede cortar en fragmentos de 5-10 kb de tamaño y reparar los salientes 5' y 3' de cadena sencilla usando ADN polimerasa de T4 y el fragmento de Klenow en presencia de los cuatro dNTP, como se conoce en la técnica. Los fosfatos se pueden unir a los extremos 5' mediante tratamiento con polinucleótido quinasa de T4, como se conoce en la técnica. Los fragmentos de ADN reparados se pueden ligar durante la noche en un vector de alto número de copias convencional (es decir, pBluescript® SK+), preparado adecuadamente para aceptar los insertos como se conoce en la técnica (por ejemplo mediante digestión con una enzima de restricción produciendo extremos romos).

Se analizó la calidad de las genotecas de ADN resultante mediante digestión de un subconjunto de clones con una enzima de restricción conocida por tener un sitio de escisión que flanquea el sitio de clonación. Se determinó que un alto porcentaje de los clones contenía insertos, generalmente con un tamaño de inserción promedio de 5-6 kb.

Ejemplo 17. Secuenciación de Alto Rendimiento de las Placas de la Genoteca

Una vez que se verificó y confirmó la calidad de la genoteca de ADN, las colonias se cultivaron en un caldo rico en bloques de 96 pocillos de 2 ml durante la noche a 37°C, típicamente a una velocidad de sacudimiento de 350 rpm. Los bloques se centrifugaron para recoger las células en la parte inferior del bloque. Los bloques se prepararon a continuación mediante lisis alcalina convencional en un formato de alto rendimiento.

Las secuencias terminales de los clones de esta genoteca se determinaron a continuación para un gran número de clones de cada bloque de la siguiente manera: Se determinó la secuencia de ADN de cada clon elegido para el análisis utilizando la técnica de secuenciación por terminador colorante fluorescente (Applied Biosystems), mediante métodos conocidos en la técnica utilizando una máquina de secuenciación de ADN automatica, y cebadores oligonucleotídicos convencionales que se recuecen con el vector plasmídico en la región que flanquea el inserto.

Ejemplo de Referencia 18. Ensamblaje y Proyección de los Datos de Secuenciación

Las secuencias de ADN obtenidas fueron compiladas en un proyecto de ensamblaje y se alinearon para formar cóntigos. Esto se puede realizar de manera eficiente usando un programa de ordenador, tal como Vector NTI, o alternativamente mediante el uso del conjunto Pred/Phrap de programas de alineamiento y análisis de ADN como se describe en este documento. Estos cóntigos, junto con cualquier lectura individual que no se haya añadido a un cóntigo, se compararon con una base de datos compilada de todas las clases de genes plaguicidas conocidos. Los cóntigos o lecturas individuales identificada por tener identidad con una endotoxina o gen plaguicida conocidos se analizaron adicionalmente.

A partir de la cepa ATX16538, se encontró que pAX2579 contenía un marco de lectura abierto con homología con delta-endotoxinas de tipo "cry". Este marco de lectura abierto se denominó axmi-039 (SEQ ID NO: 3), y la proteína codificada se denominó AXMI-039 (SEQ ID NO: 5). El ORF de axmi-039 y la secuencia flanqueante (151 pb aguas arriba del codón de inicio y 29 pb aguas abajo del codón de terminación) se amplificó mediante PCR, se clonaron en pRSF1B y se secuenciaron para producir pAX2579. pAX2579 se depositó en la ARS Patent Strain Collection el 9 de junio de 2006, y se le asignó NRRL B-30936. AXMI-039 tiene 43,9% de identidad de secuencia de aminoácidos con Cry5Ba1, que es el homólogo más cercano identificado.

A partir de la cepa ATX16093, se encontró que pAX4313 contenía un marco de lectura abierto con homología con delta-endotoxinas de tipo "cry". Este marco de lectura abierto se denominó axmi-040 (SEQ ID NO: 7), y la proteína codificada se denominó AXMI-040 (SEQ ID NO: 8). pAX4313 se depositó en la ARS Patent Strain Collection el 9 de junio de 2006, y se le asignó NRRL B-30937. AXMI-040 tiene 42,9% de identidad de secuencia de aminoácidos con Cry21Ba1, que es el homólogo más cercano identificado.

A partir de la cepa ATX21049, se identificó un marco de lectura abierta que mostró homología con delta-endotoxinas de tipo "cry". Este marco de lectura abierto de denominó axmi-049 (SEQ ID NO: 34), y la proteína codificada se denominó AXMI-049 (SEQ ID NO: 35). Este marco de lectura abierto fue amplificado mediante PCR y clonado en un vector para producir pAX5039. pAX5039 se depositó en la ARS Patent Strain Collection el 29 de mayo de 2007, y se le asignó NRRL B-50046. AXMI-049 tiene 46,1% de identidad de secuencia de aminoácidos con Cry21Ba1, que es el homólogo más cercano identificada.

Ejemplo 19. Vectorización de los genes plaguicidas de la invención para su expresión en plantas

Cada una de las regiones codificantes de los genes de la invención está conectada independientemente al promotor apropiado y secuencias de terminación para su expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en la técnica y pueden incluir el promotor de actina de arroz o promotor de ubicuitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis o el promotor 35S de CaMV para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinII. Los mecanismos para producir y confirmar los constructos de promotor -gen -terminador también son bien conocidos en la técnica.

Ejemplo 20. Transformación de los genes de la invención en Células Vegetales mediante Transformación

Mediada por Agrobacterium

Las mazorcas se recogen 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y los embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño se utilizan para la transformación. Los embriones se cultivan en placa con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, y se incuban durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para la transferencia mediada por el plásmido Ti durante 5-10 min, y a continuación se cultivan en placa en medios de co-cultivo durante 3 días (25°C en la oscuridad). Después del co-cultivo, los explantes se transfieren a medios para el período de recuperación durante cinco días (a 25°C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medio de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medio de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan a continuación bajo poca luz, y el proceso de regeneración se inicia como se conoce en la técnica. Se permite que los brotes resultantes enraícen en medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas y se propagan como plantas transgénicas.

Ejemplo 21. Plantas transgénicas que expresan AXMI-031 y variantes.

Los casetes de expresión vegetal descritas en la presente memoria se combinan con un marcador seleccionable vegetal apropiado para ayudar a la selección de células y tejidos transformados, y se ligan en vectores de transformación vegetales. Estos pueden incluir vectores binarios de transformación mediada por Agrobacterium o vectores plasmídicos sencillos para la transformación mediante aerosol o biolística. synaxmi-031(apo) se clonó en un vector de expresión vegetal, y este vector se introdujo en Agrobacterium tumefaciens como se conoce en la técnica. La región codificante de synaxmi-031(apo) bajo el control del promotor UBQ3 de Arabidopsis (Norris et al. (1993) J. Plant Mol. Biol. 21:895-906) se introdujo en Arabidopsis thaliana por medio del método de inmersión floral como se conoce en la técnica, y se seleccionaron las plantas transgénicas. La presencia de synaxmi-031(apo) en la población transgénica T1 se confirmó por análisis de PCR como se conoce en la técnica, utilizando cebadores oligonucleotídicos derivados de la secuencia de synaxmi-031, que también se recuecen con synaxmi-031 (apo).

Se preparó tejido de hoja y de raíz de plantas que contienen synaxmi-031(apo) transgénico y se separó en geles de poliacrilamida al lado de controles no transgénicos y diluciones de proteína AXMI-031, y se transfirió a una membrana como se conoce en la técnica. Las muestras se sometieron a ensayo para determinar la presencia del producto de expresión de synaxmi-031(apo) mediante análisis de transferencia Western como se conoce en la técnica, usando anticuerpos anti-AXMI-031 descritos en la presente memoria. El producto de expresión de synaxmi031(apo) del tamaño esperado se detectó en muestras de plantas que contienen synaxmi-031(apo) transgénico tanto de tejido de hoja como raíz, pero no detectó en controles no transgénicos.

Tabla 5. Detección de anticuerpos de SYNAXMI-031(APO) en plantas transgénicas

Fuente de tejido: Detección de SYNAXMI-031(APO)

Control no transformado: -

planta que contiene synaxmi-031 (apo) 'A': +++

planta que contiene synaxmi-031 (apo) 'B': + + +

Ejemplo 22. Reducción de la formación de quistes por plantas que expresan AXMI-031.

Se sometieron a ensayo las plantas transgénicas que expresan synaxmi-031 (apo) para determinar la capacidad de resistir la infestación por Heterodera schachtii en comparación con las plantas de control. Las plantas transgénicas, así como las plantas de control transformadas con el vector solo, se infestaron con aproximadamente 100 neonatos J2, y se midió el número de nematodos que entran en las raíces, así como el número de quiste formados. Se encontró que las plantas transgénicas que expresan SYNAXMI-031 (APO) tenían sistemáticamente un número reducido de nematodos que entran en las raíces, y un número reducido del número de quistes formados con respecto a los controles.

55 Tabla 6. Reducción de la formación de quistes en plantas que expresan AXMI-031

: Formación de quiste

Planta de control: + +

Plantas que expresan AXMI-031 (APO): +

Ejemplo 23. Ensayos adicionales para determinar la actividad plaguicida

La capacidad de una proteína plaguicida para actuar como plaguicida sobre una plaga se evalúa a menudo de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnica es llevar a cabo un análisis de alimentación. En tal análisis de alimentación, se expone la plaga a una muestra que contiene cualquier compuesto que se vaya a someter a ensayo,

o muestras de control. A menudo esto se realiza colocando el material que se va a someter a ensayo, o una dilución adecuada de dicho material, sobre un material que ingerirá la plaga, tal como una dieta artificial. El material que va a someter a ensayo puede estar compuesto de un líquido, un sólido, o una suspensión. El material que se va a someter a ensayo se puede colocar sobre la superficie y después se deja secar. Alternativamente, el material que se va a someter a ensayo se puede mezclar con una dieta artificial fundida, a continuación se distribuye en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato, o un pocillo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para las plagas de chupadores (áfidos por ejemplo) pueden implicar la separación del material de ensayo del insecto por un tabique, idealmente una porción que pueda ser perforada por las piezas chupadoras de la boca del insecto chupador, para permitir la ingestión de la sustancia de ensayo. A menudo, el material de ensayo se mezcla con un estimulante de la alimentación, tales como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de ensayo.

Otros tipos de análisis pueden incluir la microinyección del material de ensayo en la boca, o en el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido por la prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse de la planta transgénica. El ensayo de la planta puede implicar el aislamiento de las partes de la planta consumidas normalmente, por ejemplo, jaulas pequeñas unidas a una hoja, o el aislamiento de las plantas enteras en jaulas que contienen los insectos.

Otros métodos y enfoques para someter a ensayo las plagas son conocidos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Robertson, JL & Preisler HK. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, los ensayos se describen comúnmente en las revistas "Arthropod Management Tests" y "Journal of Economic Entomology" o mediante la discusión con los miembros de la Sociedad Entomológica de América (ESA).

Ejemplo 24. Transformación de Células de Maíz con los genes plaguicidas de la invención

Se recogen mazorcas de maíz 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y los embriones 0,8-1,5 mm de tamaño se utilizan para la transformación. Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como medio DN62A5S (Sales N6 3,98 g/L; 1 mL/L (de Provisión 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de casaminoácidos; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (Provisión de 1 mg/ml) de 2,4-D), y se incubaron durante la noche a 25°C en la oscuridad.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos durante 30-45 minutos, después se transfieren a una placa radiante (ver, por ejemplo, Publicación PCT Núm. WO/0138514 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.240.842).

Los constructos de ADN diseñados para expresar los genes de la invención en células vegetales son acelerados en el tejido vegetal usando un acelerador de haz de aerosol, usando las condiciones descritas esencialmente en la Publicación PCT Núm. WO/0138514. Después de la irradiación, los embriones se incuban durante 30 min en medios osmóticos, a continuación se colocan en medio de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar explantes irradiados con daño excesivo, estos se incubaron durante al menos 24 horas antes de la transferencia al medio de recuperación. Los embriones se esparcen sobre el medio para el período de recuperación, durante 5 días, 25°C en la oscuridad, a continuación se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medio de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere al medio de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan a continuación bajo poca luz, y el proceso de regeneración se inicia mediante métodos conocidos en la técnica. Se permite que los brotes resultantes enraícen en medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

Medio DN62A5S

Componentes: por litro Fuente

Mezcla de sales basales Chu N6 (Núm. de Prod. C 416): 3,98 g/L Phytotechnology Labs

Solución de vitamina Chu N6 (Núm. de Prod. C 149): 1 mL/L (de Provisión 1000x) Phytotechnology Labs

L-Asparagina: 800 mg/L Phytotechnology Labs

Mio-inositol: 100 mg/L Sigma

L-prolina: 1,4 g/L Phytotechnology Labs

Casaminoácidos: 100 mg/L Fisher Scientific

Sacarosa: 50 g/L Phytotechnology Labs

2,4-D (Núm. de Prod. D-7299): 1 mL/L (de Provisión de 1 mg/mL) Sigma

Ajustar el pH de la solución a pH a 5,8 con KOH 1N/KCl 1N, añadir Gelrita (Sigma) a 3 g/L, y someter a autoclave. 10 Después de enfriar a 50°C, añadir 2 ml/L de una solución de partida de 5 mg/ml de nitrato de plata (Phytotechnology Labs). La fórmula proporciona alrededor de 20 placas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de conocimiento práctico de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

15 Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, resultará evidente que se pueden poner en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Athenix Corporation Nadine Carozzi Nicholas Duck Theodore Kahn Nalini Desai Shruti Jain Daniel John Tomso Rong Guo Julia Thissen

5 <120> AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040 Y AXMI-049, UNA FAMILIA DE GENES DE DELTA-ENDOTOXINA NOVEDOSOS Y MÉTODOS PARA SU USO

<130> 45600/329694

<150> 60/813,774

<151> 2006-06-14 10 <160> 38

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 3558

<212>: ADN 15 <213> Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(3558)

<400> 1

<210> 2

<211> 1185

<212> PRT

<213> Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis

<400> 2

<210> 3

<211> 3984

<212>: ADN 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Aislado a partir de una muestra de suelo

<221> CDS

<222> (1)...(3984) 10 <400> 3

<210> 4

<211> 1327

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Aislado a partir de una muestra de suelo

<400> 4

<210> 5

<211> 3720

<212> ADN 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Aislado a partir de una muestra de suelo

<221> CDS

<222> (1)...(3720) 10 <400> 5

<210> 6

<211> 1239

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Aislado a partir de una muestra de suelo

<400> 6

<210> 7

<211> 2059 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> synaxmi-031

<221> CDS

<222> (1)...(2058) 10 <400> 7

<210> 8

<211> 685

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 54 <220>

<223> SYNAXMI-031

<400> 8

<210> 9

<211> 2148 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> synaxmi-031(apo)

<221> CDS

<222> (1)...(2148) 10 <400> 9

<210> 10

<211> 715

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> SYNAXMI-031(APO)

<400> 10

<210> 11

<211> 2160

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 60

<220>

<223> synaxmi-031(ER)

<221> CDS

<222> (1)...(2160)

<400> 11

<210> 12

<211> 719

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> SYNAXMI-031(ER)

<400> 12

<210> 13

<211> 1186

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 13

<210> 14

<211> 2190

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> axmi-031(truncada)

<221> CDS

<222> (1)...(2190)

<400> 14

<210> 15

<211> 729

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 70 <220>

<223> AXMI-031(TRUNCADA)

<400> 15

<210> 16

<211> 3558 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> axmi-031(ml)

<221> CDS

<222> (1)...(3558) 10 <400> 16

<210> 17

<211> 1185

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> AXMI-031(M1)

<400> 17

<210> 18

<211> 2112

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> axmi-031(m1)truncada

<221> CDS

<222> (1)...(2112) 10 <400> 18

<210> 19

<211> 703

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> AXMI-031(M1)TRUNCADA

<400> 19

<210> 20

<211> 2219 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> axmi-031(A-D)

<221> CDS

<222> (1)...(2216) 10 <400> 20

<210> 21

<211> 738

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> AXMI-031(A-D)

<400> 21

<210> 22

<211> 2015

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> axmi-031(B-C)

<221> CDS

<222> (1)...(2012)

<400> 22

<210> 23

<211> 670

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> AXMI-031(B-C)

<400> 23

<210> 24

<211> 2174 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> axmi-031(B-D)

<221> CDS

<222> (1)...(2171) 10 <400> 24

<210> 25

<211> 723

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> AXMI-031(B-D)

<400> 25 <210> 26

<211> 2226 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> synaxmi-031(A-D)

<221> CDS

<222> (1)...(2226) 10 <400> 26

<210> 27

<211> 741

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 100 <220>

<223> SYNAXMI-031(A-D)

<400> 27 <210> 28

<211> 2316 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> aposynaxmi-031(A-D)

<221> CDS

<222> (1) ... (2316) 10 <400> 28

<210> 29

<211> 771

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> APOSYNAXMI-031(A-D)

<400> 29

<210> 30

<211> 2307

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> aposyn2axmi-031(A-D)

<221> CDS

<222> (1)...(2307) 10 <400> 30

<210> 31

<211> 768

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> APOSYN2AXMI-031(A-D)

<400> 31

<210> 32

<211> 3570 <212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> synaxmi-031(fl)-ER

<221> CDS

<222> (1)...(3570) 10 <400> 32

<210> 33

<211> 1189

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> SYNAXMI-031(FL)-ER

<400> 33

<210> 34

<211> 3669

<212> ADN 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Aislado a partir de una muestra de suelo (AXMI-049)

<221> CDS

<222> (1)...(3669) 10 <400> 34

<210> 35

<211> 1223

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Aislado a partir de una muestra de suelo (AXMI-049)

<400> 35

<210> 36

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido diana

<400> 36

10 <210> 37

<211> 3657

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> aposynaxmi-031(fl)

<221> CDS

<222> (1)...(3657)

<400> 37

<210> 38

<211> 1218

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> APOSYNAXMI-031(FL)

<400> 38

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25 , 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935 o un complemento de la misma.
2.

La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos está conectada operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal.
3.

La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta.
4.

Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3.
5.

Un vector de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho vector comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.
6.

Una célula anfitriona que contiene el vector de la reivindicación 4.
7.

La célula anfitriona de la reivindicación 5 que es una célula anfitriona bacteriana o una célula anfitriona vegetal.
8.

Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3.
9.

Un polipéptido recombinante con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935.
10.

Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 9, en donde opcionalmente dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, espolvoreable, bolita, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución, y en donde opcionalmente dicha composición se prepara mediante la desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células Bacillus thuringiensis, y en donde dicha composición comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.
11.

Un método para eliminar o controlar una población de plagas de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la reivindicación 9.
12.

Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 5 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.
13.

Una planta o célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 , 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935, o un complemento de la misma;

en donde dicha secuencia de nucleótidos está conectada operablemente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.
14.

La planta o célula vegetal transgénica de la reivindicación 13, o la semilla transgénica de la reivindicación 8, en donde dicha planta o la semilla se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.
15.

Un método para proteger una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de acceso B-30935, o un complemento de la misma.
16.

Un método para proteger una planta de una plaga de nematodos, que comprende:

a) proporcionar una planta o semilla de la misma que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, en donde dicho polipéptido plaguicida se selecciona entre el grupo que consiste en; i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; iii) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; iv) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, o 37, y, v) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935 o un complemento de la misma, y, b) cultivar dicha planta o semilla en un campo que contenga nemátodos parásitos de plantas.
17.

El método de la reivindicación 15, donde dicho nematodo parásito de plantas es un nematodo del quiste y en el que opcionalmente dicho nematodo parásito de las plantas es Heterodera schactii.
18.

El método de la reivindicación 15, 16, o 17, en donde dicha planta tiene un mayor rendimiento en comparación con una planta que no expresa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido plaguicida.