ES2317643T3 - Receptor de galanina, acidos nucleicos, celulas transformadas y usos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD DE RECEPTOR DE GALANINA, PERMITIENDO EL MATERIAL GENETICO SU EXPRESION, CUALQUIER CELULA RECOMBINANTE QUE EXPRESA ESTOS POLIPEPTIDOS, Y SU UTILIZACION.
Description
Receptor de galanina, ácidos nucleicos, células
transformadas y usos.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos y al material genético que permite su expresión. Más
particularmente, se refiere a nuevos polipéptidos que poseen
actividad de receptor de galanina.
La galanina es un neuropéptido ubicuo de 29
aminoácidos en mamíferos (30 en el hombre) que controla funciones
biológicas variadas: (i) secreciones endocrinas (insulina,
somatostatina, glucagón, hormona del crecimiento...), (ii)
tonicidad muscular en el tracto digestivo, (iii) control del
comportamiento (ingesta alimenticia, nocicepción, aprendizaje,
memoria, dolor...) por efecto neuromodulador a nivel del sistema
nervioso central. Esta lista no exhaustiva de los efectos de la
galanina, puesta de manifiesto generalmente en animales, explica el
interés creciente de los farmacólogos por este neuropéptido.
Moléculas selectivas (agonista o antagonista de la galanina)
constituirían agentes farmacológicos potenciales en endocrinología,
neurología y psiquiatría (Bartfai et al., (1992) TIPS 13,
312-317).
El estudio del mecanismo de acción de la
galanina demuestra que actúa por medio de receptores membranarios
específicos. La caracterización bioquímica y molecular del receptor
(Chen et al., (1993) PNAS 90, 3845-3849,
Fisone et al., (1989) Eur. J. Biochem. 180,
269-276) indica que pertenece a una familia de
receptores acoplados a las proteínas G. Según los tejidos blanco,
el péptido inhibe la adenilato ciclasa, disminuye el calcio
intracelular, bloquea los canales cálcicos
voltaje-dependientes o activa los canales potásicos
ATP sensibles. Estudios sobre relaciones
estructura-actividad, con la ayuda de fragmentos C-
y N-terminales de la galanina y de péptidos
quiméricos, han demostrado que, (1) cualquiera que sea el tejido, no
es suficiente una secuencia parcial del péptido para obtener una
actividad total, (2) según los tejidos, los 2 primeros aminoácidos
N-terminales y el dominio
C-terminal 16-29 de la galanina no
son siempre esenciales para su actividad. Estas observaciones
sugieren la existencia de subtipos de receptores galaninérgicos.
La presente invención describe por primera vez
la clonación de un gen que codifica un receptor galaninérgico
humano. La presente invención describe igualmente por primera vez la
secuencia de receptores galaninérgicos y su expresión en las
células recombinantes. La presente invención permite así una mejor
comprensión de la estructura de los receptores galaninérgicos y
estudiar de manera más precisa su mecanismo de acción. La presente
invención permite igualmente obtener receptores galaninérgicos de
muy grande pureza y en cantidad elevada, permitiendo la realización
de estudios funcionales y farmacológicos, la fabricación de
anticuerpos, etc. La invención permite también preparar fragmentos
de receptores galaninérgicos de tamaño definido, así como toda
clase de derivados de los receptores galaninérgicos. La invención
proporciona también células recombinantes que expresan receptores
galaninérgicos o fragmentos de receptores galaninérgicos,
utilizables para el cribado de ligandos de estos receptores
(agonistas, antagonistas, moduladores, etc.). Las secuencias de ADN
de la invención permiten igualmente la realización de sondas,
capaces de detectar en muestras biológicas cualquier irregularidad
en la expresión de un receptor galaninérgico (no expresión,
mutación, polimorfismo, etc.). Estas sondas son también utilizables
para la clonación por hibridación de cualquier otro ADNc codificante
de un receptor galaninérgico, a partir de tejidos de orígenes
diversos, como se indica más adelante.
Un primer objeto de la invención reside, por
tanto, en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que posee actividad de receptor galaninérgico. En el sentido de la
invención, receptor galaninérgico comprende especialmente todos los
subtipos potenciales.
La secuencia de nucleótidos según la invención
se escoge entre:
- (a)
- toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1, y
- (b)
- las secuencias derivadas de las secuencias (a) debido a la degeneración del código genético.
\vskip1.000000\baselineskip
Un modo de realización especialmente particular
de la invención se representa por una secuencia nucleotídica que
comprende toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1.
Las diferentes secuencias nucleotídicas de la
invención pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de
secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de
secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas secuencias pueden
obtenerse, por ejemplo, mediante cribado de bancos de ADN (banco de
ADNc, banco de ADN genómico) por medio de sondas elaboradas sobre
la base de la secuencia SEQ ID nº 1. Tales bancos se pueden
preparar a partir de células de diferentes orígenes mediante
técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en
la materia. Las secuencias nucleotídicas de la invención se pueden
preparar igualmente por síntesis química, principalmente según el
método de las fosforamiditas, o también por métodos mixtos que
incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias
obtenidas mediante cribado de bancos.
Las secuencias nucleotídicas de la invención se
pueden utilizar para la producción de polipéptidos galaninérgicos.
La terminología polipéptido galaninérgico designa todo polipéptido
que posee actividad de receptor galaninérgico y todo fragmento o
derivado de dicho polipéptido. Para la producción de polipéptidos
galaninérgicos, la parte que codifica dicho polipéptido se coloca
generalmente bajo el control de señales que permiten su expresión
en un anfitrión celular. La elección de estas señales (promotores,
terminadores, etc.) puede variar en función del anfitrión celular
utilizado. A este efecto, las secuencias nucleotídicas de la
invención pueden formar parte de un vector, que puede ser de
replicación autónoma o integrador. Más particularmente, se pueden
preparar vectores de replicación autónoma utilizando secuencias de
replicación autónoma en el huésped elegido. Cuando se trata de
vectores integradores, éstos se pueden preparar, por ejemplo,
utilizando secuencias homólogas a ciertas regiones del genoma del
huésped, permitiendo, por recombinación homóloga, la integración del
vector. Los anfitriones celulares utilizables para la producción de
los polipéptidos galaninérgicos de la invención por vía
recombinante son tanto anfitriones eucarióticos como procarióticos.
Entre los anfitriones eucarióticos convenientes se pueden citar las
células animales, las levaduras o los hongos. En particular,
tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del
género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Cuando se trata de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como anfitriones procarióticos, se prefiere utilizar las bacterias siguientes: E. coli, Bacillus o Streptomyces.
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Cuando se trata de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como anfitriones procarióticos, se prefiere utilizar las bacterias siguientes: E. coli, Bacillus o Streptomyces.
Las secuencias nucleotídicas de la presente
invención son igualmente utilizables en el campo farmacéutico, bien
para la realización de secuencias antisentido utilizables en el
marco de una terapia génica, bien para la realización de sondas que
permiten la detección, mediante experiencias de hibridación, de la
expresión de receptores galaninérgicos en muestras biológicas y la
puesta de manifiesto de anomalías genéticas (polimorfismo,
mutaciones) o de expresiones aberrantes.
La inhibición de la expresión de ciertos genes
por secuencias antisentido ha demostrado ser una estrategia
prometedora en el control de la actividad de un gen. Las secuencias
antisentido son secuencias cuyo producto de transcripción es
complementario de la hebra codificante de un gen dado, siendo por
este hecho capaces de hibridarse específicamente con el ARNm
transcrito o con el gen, inhibiendo su transcripción o su traducción
en proteína. La invención tiene también como objeto las secuencias
antisentido capaces de inhibir al menos parcialmente la producción
de polipéptidos galaninérgicos tales como los definidos
anteriormente. Tales secuencias pueden estar constituidas por toda
o una parte de las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente.
Se trata generalmente de secuencias o de fragmentos de secuencias
complementarios de las secuencias codificadoras para los péptidos
de la invención. Tales secuencias se pueden obtener a partir de la
secuencia SEQ ID nº 1, por fragmentación, etc, o por síntesis
química.
Como se ha indicado anteriormente, la invención
permite también la realización de sondas nucleotídicas, sintéticas
o no, capaces de hibridarse con las secuencias nucleotídicas
definidas anteriormente que codifican polipéptidos galaninérgicos
de la invención, o con los ARNm correspondientes. Tales sondas se
pueden utilizar in vitro como herramienta de diagnóstico,
para la detección de la expresión de un receptor galaninérgico, o
todavía para la puesta de manifiesto de anomalías genéticas (corte
y empalme defectuosos, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc.).
Considerando las actividades múltiples de los ligandos endógenos de
los receptores galaninérgicos, las sondas de la invención pueden
así permitir identificar afecciones neurológicas, cardiovasculares,
endocrinológicas o psiquiátricas. Estas sondas pueden utilizarse
igualmente para la puesta de manifiesto y el aislamiento de
secuencias de ácidos nucleicos homólogos que codifican polipéptidos
galaninérgicos tales como los definidos anteriormente, a partir de
otras fuentes celulares y preferentemente de células de orígenes
humanos. Si bien la presente solicitud se ilustra más
particularmente mediante un clon designado GalR1, los estudios
bioquímicos e inmunológicos descritos en la literatura indican la
existencia de subtipos de receptores galaninérgicos. Las sondas de
la invención permiten aislar mediante técnicas conocidas por los
expertos en la materia (véase ejemplo 4) estos diferentes subtipos.
Las sondas de la invención contienen generalmente al menos 10. bases
y pueden contener hasta la totalidad de la secuencia SEQ ID nº 1 o
de su hebra complementaria. Preferentemente, estas sondas se marcan
antes de su utilización. Para ello se pueden emplear diferentes
técnicas conocidas por el experto en la materia (marcaje
radioactivo, enzimático, etc.). Las condiciones de hibridación en
las que se pueden utilizar estas sondas se indican en las técnicas
generales de clonación que se dan más adelante así como en los
ejemplos.
La invención tiene igualmente como objeto un
polipéptido que comprende toda o una parte de la secuencia peptídica
SEQ ID nº 2 o de un derivado de la misma modificada por mutación,
sustitución, supresión y/o modificación de uno o varios restos, y
que posee la capacidad de enlazar galanina o una variante de la
galanina, siendo dicho derivado tal que la galanina
2-29 y la galanina 1-16 inhiben
competitivamente el enlace de la
(^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que
la galanina 1-29, y que la galanina
2-29 inhibe competitivamente el enlace de la
(^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que
la galanina 1-16.
Tales derivados se pueden generar con objetivos
diferentes, tales como, especialmente, el de aumentar la afinidad
del péptido por su(s) ligando(s), el de mejorar sus
niveles de producción, el de aumentar su resistencia a las
proteasas, el de aumentar y/o modificar su actividad o el de
conferir nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas. Entre
los derivados resultantes de una adición, se pueden citar, por
ejemplo, los polipéptidos quiméricos que contienen una parte
heteróloga adicional unida a un extremo. El término derivado
comprende igualmente los polipéptidos homólogos del polipéptido SEQ
ID nº 1, procedentes de otras fuentes celulares y especialmente de
células de origen humano o de otros organismos, y que poseen una
actividad del mismo tipo. Tales polipéptidos homólogos comprenden
especialmente los diferentes subtipos de receptores galaninérgicos.
Dichos polipéptidos se pueden obtener en particular mediante
experiencias de hibridación como las descritas en los ejemplos.
Preferentemente, los polipéptidos de la
invención son polipéptidos que poseen la capacidad de enlazar
galanina o una variante de la galanina. Siempre según un modo
preferido, los polipéptidos de la invención son susceptibles de ser
reconocidos por anticuerpos que reconocen la secuencia peptídica SEQ
ID nº 1 completa. Tales anticuerpos se pueden generar mediante
cualquier técnica conocida por el experto en la materia, utilizando
como antígenos los polipéptidos descritos en la presente
solicitud.
Como se indica en los ejemplos, estos
polipéptidos se pueden expresar en diferentes tipos celulares para
formar receptores galaninérgicos funcionales.
Los polipéptidos de la invención se pueden
obtener por expresión en un anfitrión celular de una secuencia
nucleotídica tal como la descrita anteriormente por síntesis
química, sobre la base de la secuencia SEQ ID nº 1, utilizando las
técnicas conocidas por el experto en la materia, o bien por una
combinación de estas técnicas.
Otro objeto de la invención se refiere a las
células recombinadas capaces de expresar en su superficie un
polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico. Estas
células se pueden obtener por introducción de una secuencia
nucleotídica tal como se ha definido anteriormente y posterior
cultivo de dichas células en condiciones de expresión de dicha
secuencia.
Las células recombinadas según la invención
pueden ser también tanto células eucarióticas como procarióticas.
Entre las células eucarióticas convenientes, se pueden citar las
células animales, las levaduras o los hongos. En particular,
tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces
o Hansenula. Cuando se trata de células animales, se pueden
citar las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc.
Entre los hongos, se pueden citar más particularmente Aspergillus
ssp. o Trichoderma ssp. Como células procarióticas, se
prefiere utilizar las bacterias siguientes: E. coli,
Bacillus o Streptomyces. Las células así obtenidas se
pueden utilizar para medir la capacidad de diferentes moléculas de
comportarse como ligando o como modulador de la actividad de los
receptores galaninérgicos. Más particularmente, dichas células
pueden así utilizarse en un procedimiento de puesta de manifiesto y
de aislamiento de ligandos o de modulador de la actividad de los
receptores galaninérgicos y, más preferentemente, de agonistas y de
antagonistas.
Otro objeto de la invención se refiere, en
consecuencia, a un procedimiento de puesta de manifiesto y/o de
aislamiento de ligandos de los receptores galaninérgicos, según el
cual se realizan las etapas siguientes:
- -
- se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada tal como la descrita anteriormente, que expresa en su superficie un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y dicha molécula en el caso en que ésta posee una afinidad por dicho polipéptido, y,
- -
- se detectan y/o se aíslan las moléculas enlazadas a dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
En un modo particular, este procedimiento de la
invención se adapta a la puesta de manifiesto y/o al aislamiento de
agonistas y de antagonistas de la galanina hacia los receptores
galaninérgicos.
Otro objeto de la invención se refiere a un
procedimiento de puesta de manifiesto y/o de aislamiento de
moduladores de los receptores galaninérgicos, según el cual se
realizan las etapas siguientes:
- -
- se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada tal como la descrita anteriormente, que expresa en su superficie un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico, en presencia del ligando endógeno de dicho receptor, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y su ligando, y,
- -
- se detectan y/o se aíslan las moléculas capaces de modular la actividad del ligando sobre dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
En un modo particular, este procedimiento de la
invención se adapta a la puesta de manifiesto y/o al aislamiento de
moduladores de la actividad de la galanina sobre los receptores
galaninérgicos.
Otro objeto de la invención se refiere a la
utilización como medicamento de un ligando o de un modulador
identificado y/o obtenido según el procedimiento aquí descrito
anteriormente. Tales ligandos o moduladores pueden permitir, en
efecto, tratar ciertas afecciones relacionadas con los receptores
galaninérgicos. En particular, dado que los receptores
galaninérgicos son los mediadores de un efecto analgésico, los
agonistas de estos receptores pueden utilizarse para disminuir las
sensaciones de dolor. En la introducción se han mencionado otras
actividades de los receptores galaninérgicos.
La invención se refiere igualmente a todo
medicamento que comprende como principio activo al menos una
molécula que actúa sobre un receptor de la invención.
Preferentemente, la molécula es un ligando o un modulador
identificado y/o aislado según el procedimiento anteriormente
descrito.
Otras ventajas de la presente invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, que deben ser
considerados como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: Saturación de los receptores de
galanina por galanina de cerdo sobre las membranas de células Cos1
transfectadas por el clon GalR1. El recuadro representa la
transformación de Scatchard de los datos de la curva de enlace (Los
valores presentados corresponden a una experiencia representativa en
la que cada punto se ha determinado por triplicado).
Figura 2: Desplazamientos por péptidos del
enlace específico de la
(^{125}I)-galanina a las membranas de las células
Cos1 transfectadas por el clon GalR1 (Los valores presentados
corresponden a una experiencia representativa en la que cada punto
se ha determinado por triplicado).
Figura 3: Inhibición por galanina de la
estimulación de la producción de AMPc en células Cos1 transfectadas
por el clon GalR1 (Los valores presentados corresponden a una
experiencia representativa en la que cada punto se ha determinado
por duplicado).
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos utilizados tradicionalmente en
biología molecular, tales como extracciones preparativas de ADN
plasmídico, centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro
de cesio, electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida,
purificación de fragmentos de ADN mediante electroelución,
extracciones de proteínas con fenol o con
fenol-cloroformo, precipitación de ADN en medio
salino con etanol o isopropanol, transformación en Escherichia
coli, etc. son muy conocidos por el experto en la materia y
están descritos ampliamente en la bibliografía [Maniatis T. et
al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M.
et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].
Para las uniones, los fragmentos de ADN se
separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa
o de acrilamida, se extraen con fenol o con una mezcla de
fenol/cloroformo, se precipitan con etanol y después se incuban en
presencia de la ADN ligasa del fago T4 según las recomendaciones del
proveedor.
El relleno de los extremos 5' prominentes se
realiza mediante el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I de
E. coli según las especificaciones del proveedor. La
destrucción de los extremos 3' prominentes se realiza en presencia
de la ADN Polimerasa del fago T4 utilizada según las recomendaciones
del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se
efectúa mediante un tratamiento moderado con la nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por
oligodesoxinucleótidos sintéticos se realiza según el método
desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985)
8749-8764].
La amplificación enzimática de los fragmentos de
ADN se realiza mediante la técnica mencionada de PCR
[Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K.
et al., Science 230 (1985) 1350-1354;
Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987)
335-350].
La verificación de las secuencias nucleotídicas
se realiza mediante el método desarrollado por Sanger et al.
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
5463-5467].
Para las experiencias de hibridación, las
condiciones de estringencia se basan en la obra de Maniatis T. et
al., anteriormente citada.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe el aislamiento del clon
GalRI que codifica el receptor de galanina humano mediante cribado
por expresión de un banco de ADNc.
Se ha realizado un banco de ADNc a partir del
linaje melanocítico humano Bowes (ATCC CRL 9607), utilizando el
vector de expresión transitorio de mamífero pcDNA1. Después de la
extracción de los ARN totales, los ARN poliA^{+} se purifican en
columna de oligodT celulosa. La síntesis de ADNc se efectúa en
presencia de una mezcla de iniciadores (oligodT y oligonucleótidos
se hibridan al azar). Después de un fraccionamiento por tamaño
(>1100 pares de bases), se ha construido el banco mediante la
ligadura de los ADNc en el vector pcDNA1 (sitios de clonación
Bstx1) y transformación en E. coli (MC 1061/P3). Se han
obtenido y amplificado 10^{6} clones independientes. Se han
cultivado entonces aproximadamente 720000 clones bacterianos en
medio sólido selectivo con una densidad de 8000 colonias por caja.
Se han preparado mediante lisis alcalina 90 lotes de ADN
plasmídico, cada uno de ellos correspondiente a 8000 colonias.
Se ha transfectado el ADN plasmídico de cada
lote independientemente en las células Cos1 (ATCC CRL 1650) por
electroporación según el protocolo siguiente: 32 mg de ADN, 8
10^{6} células en 500 mL de medio DMEM (Dulbecco Modified Eagle
Medium) suplementado con 10% de suero de vaca fetal, glutamina 6 mM,
100 UI/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina bajo CO_{2}
al 5%, 960 mFarad, 250 Volts, electroporador Biorad. Después de la
electroporación, se han cultivado las células en monocapa en cajas
de cultivo (Nunc) de 16 cm de diámetro durante 72 horas. En estas
condiciones se transfectan una media de 30% de células.
Las células transfectadas se han ensayado con
respecto a su capacidad para enlazar
(^{125}I)-galanina. Las células se han trasladado
48 horas después de la transfección. El día de la unión, se han
puesto en presencia de DMEM durante 1 hora, lavándose a
continuación con 10 mL de tampón 1 (Tris HCl 25 mM pH: 7,5,
MgCl_{2} 10 mM, BSA 2%). Seguidamente, las células se han
incubado durante 5 horas a una temperatura de 20ºC en presencia de
tampón 2 (tampón 1 que contiene un cóctel de inhibidores de
proteasas: 10 mg/mL de aprotinina, 1mg/mL de bacitracina, 10 mg/mL
de pepstatina A y fluoruro de fenilmetilsulfonilo
10^{-5} M) que contiene
(^{125}I)-galanina 10^{-10} M (NEN, galanina
1-29 de cerdo, AS: 2200 curie/mmol). Después del
lavado (5x15 mL de tampón 1), las cajas se han secado y expuesto en
autorradiografía (film Amersham hyperscreen MP) durante 15 días a
una temperatura de -80ºC.
Sobre los 720000 clones bacterianos ensayados,
se ha identificado un lote de 8000 colonias que da una señal
específica en autorradiografía (es decir, (i) que sobrepasa el ruido
de fondo, (ii) que desaparece en presencia de galanina fría
10^{-6} M ). Este lote se ha dividido a continuación en 48 lotes
de 700 clones cada uno. Después de la transfección, las células se
han ensayado con respecto a su capacidad para enlazar
(^{125}I)-galanina. Tres lotes produjeron una
señal específica en autorradiografía. Uno de ellos se ha subdividido
2 veces (25 lotes de 30 clones y después 60 clones
individuales),
conduciendo a 2 clones que confieren a las células Cos1 una fuerte capacidad para enlazarse a la (^{125}I)-galanina.
conduciendo a 2 clones que confieren a las células Cos1 una fuerte capacidad para enlazarse a la (^{125}I)-galanina.
Los 2 clones aislados en el ejemplo 1 contienen
un inserto idéntico de 3,1 kb. Se ha determinado la secuencia de
uno de los dos clones en las 2 hebras, mediante la técnica
fluorescente (Applied Biosystems) derivada del método de Sanger,
utilizando Taq Polimerasa y didesoxinucleótidos fluorescentes.
La secuencia obtenida corresponde a la secuencia
SEQ ID nº 1. Dicha secuencia lleva una fase abierta de lectura de
1053 pares de bases: el sitio de iniciación de la traducción se
atribuye al codón ATG en posición 787 de la secuencia SEQ ID nº
1.
La fase abierta de lectura así definida codifica
una proteína de 349 aminoácidos (SEQ ID nº 1) de peso molecular
calculado de 38897 Daltons. El análisis del perfil de hidropaticidad
de la secuencia de aminoácidos sugiere que el receptor posee 7
segmentos constituidos por aminoácidos mayoritariamente hidrófobos,
formando globalmente segmentos transmembranarios (STM), punto común
de los miembros de la familia de los receptores acoplados a las
proteínas G. El receptor está organizado de la manera siguiente:
MET1-ASN33, segmento N-terminal;
PHE34-LEU58, STM I; ALA59-ASN71,
bucle intracelular I; LEU72-LEU98, STM II;
PRO99-LYS109, bucle extracelular I;
PHE110-ASP132, STM III;
ARG133-ASN151, bucle intracelular II;
ALA152-VAL170, STM IV;
ALA171-ALA199, bucle extracelular II;
TYR200-VAL223, STMV; LEU224-LYS244,
bucle intracelular III; THR245-LEU268, STM VI;
TRP269-PRO279, bucle extracelular III;
ALA280-SER307, STMVII;
GLU308-VAL349, segmento
C-terminal.
Además, ciertos aminoácidos conservados en el
seno de los miembros de la familia de los receptores acoplados a
las proteínas G están presentes en la secuencia proteica del
receptor GALR1. En particular, se notan (1) 2 sitios de
N-glicosilación (ASN7 y ASN12), (2) 1 sitio de
fosforilación por la proteína quinasa cAMP o cGMP dependiente
(SER143), (3) 1 sitio de famesilación (CYS340), (4) 2 cisteínas
(CYS187 y 308), (5) 4 prolinas (PRO169, 212, 262 y 300), (6) el
motivo GLY.ASN.X.X.VAL (50-54), (7) el motivo
ASP.ARG.TYR (132-134), (8) el motivo
ASN.PRO.ILE.X.TYR (299-303). Finalmente, se ha
comparado la secuencia de la proteína de la presente invención con
las secuencias de las proteínas de la familia de los receptores
acoplados a las proteínas G (banco de datos Swissprot data). La
homología más importante (33,8%, incluyendo 3 brechas) se observa
con el receptor de somastostaina de tipo 4.
Se ha preparado el ADN plasmídico del clon GalR1
mediante técnicas de biología molecular clásicas para transfectar
células Cos1. Las membranas de las células transfectadas se han
utilizado a continuación para estimar los parámetros de enlace en
el equilibrio de la galanina 1-29 y de fragmentos de
galanina. El ADN plasmídico (90 mg/8 10^{6} células Cos1) se ha
transfectado por electroporación como se ha descrito anteriormente
(1b). 72 horas después de la transfección, se han recogido y
sedimentado las células recombinantes. Las membranas se han
preparado entonces de la manera siguiente: a una temperatura de 4ºC,
se pone el sedimento celular en presencia de 10 mL de tampón 3
(Hepes 5 mM, pH 7,5) durante 20 minutos; después de centrifugación a
13000 g durante 15 minutos, se vuelve a suspender el sedimento en
el tampón 3 y se conserva a una temperatura de -80ºC hasta su
utilización.
Se han realizado en las membranas experiencias
de enlace en el equilibrio (saturación y competición), en presencia
de (^{125}I)-galanina y de diferentes péptidos en
las condiciones experimentales siguientes: las membranas (10 mg de
proteína) se han incubado durante 30 minutos a una temperatura de
20ºC con (^{125}I)-galanina 5 10^{-11} M en
ausencia o en presencia de concentraciones crecientes de galanina
1-29, galanina 2-29, galanina
3-29 o galanina 1-16 (10^{-11} M -
10^{-6} M) en un volumen final de 0,25 mL de tampón 2 (1c).
Seguidamente, se ha parado la reacción mediante la adición de 0,25
mL de tampón 1 (1c) y centrifugación durante 15 minutos a 13000 g.
El sedimento obtenido se ha lavado tres veces con 0,2 mL de tampón
tris 25 mM (pH: 7,5) frío que contiene 10% de sacarosa y
seguidamente se ha medido la radioactividad con un contador de
centelleo gamma. El enlace no específico se ha medido en presencia
de galanina 1-29 de cerdo 10^{-7} M.
Los valores de las constantes de afinidad (Ki) se han obtenido
siguiendo la ecuación de Cheng y Prussof: Ki = IC50/ (1 + L/Kd).
En las condiciones experimentales anteriormente
descritas en este documento, se han observado los resultados
siguientes: contrariamente a las células Cos1 no transfectadas, o
transfectadas por un plásmido de control, las células Cos1
transfectadas por el clon GalR1 presentan un enlace específico de la
galanina yodada. El análisis de los resultados por el método de
Scatchard demuestra la existencia de una única clase de sitios de
alta afinidad, con una constante de disociación aparente (Kd) = 0,8
nM, y de alta capacidad, con un número máximo de sitios de fijación
(Bmax) = 2,8 pmoles/mg proteínas. Teniendo en cuenta la eficacia de
la transfección (aproximadamente 30%, 1b), el nivel de expresión de
receptores galaninérgicos de la invención en las células Cos1 se
estima en 5 10^{5} sitios/célula.
Las galaninas de rata, de cerdo y humana inhiben
de forma competitiva el enlace de la
(^{125}I)-Galanina a las membranas de las células
transfectadas, con una Ki = 0,3, 0,2 y 0,8 nM respectivamente. La
galanina 2-29 (Ki = 115 nM) y la galanina
1-16 (Ki = 5 nM) inhiben competitivamente el enlace
de la (^{125}I)-galanina con una afinidad más
débil que la galanina 1-29. Este clon no posee
afinidad por la galanina 3-29.
El orden de eficacia de estas moléculas
diferentes confirma la especificidad del receptor GalR1 como
receptor galaninérgico. Estos resultados demuestran, por otra
parte, que las células Cos1 de la presente invención son capaces de
expresar el receptor de galanina que tiene características de enlace
comparables a las del receptor natural.
Se ha estimado el acoplamiento del receptor
Galanina a la adenilato ciclasa por medio de la capacidad de la
galanina de inhibir la producción de AMPc en las células Cos1
transfectadas por el clon GalR1. Para este estudio, se han sembrado
10^{5} células transfectadas en las condiciones descritas
anteriormente en este documento en placas de cultivo multipocillo
(1,5 cm de diámetro) y las experiencias de AMPc se han realizado 72
horas después de la transfección (el medio de cultivo se ha
renovado la víspera de la experiencia). Después de una
preincubación de 1 hora a una temperatura de 37ºC en medio DMEM, las
células se han lavado con DMEM que contiene 2% de BSA. Dichas
células se han cultivado entonces durante 30 minutos a una
temperatura de 37ºC en este mismo medio conteniendo 2 10^{-4} M
de isobutilmetilxantina, en ausencia y en presencia de forscolina
(10^{-4} M) y/o de galanina humana (10^{-11} M - 10^{-6} M).
Después de tres lavados de las células en medio DMEM, se extrae el
AMPc intracelular por adición de etanol al 70%. Después de efectuar
una liofilización, se mide el AMPc mediante radioinmunología (Kit
AMPc, Amersham).
Los resultados demuestran que en las células
Cos1 transfectadas por el clon GalR1, la galanina inhibe fuertemente
la producción de AMPc intracelular inducida por la forscolina (la
producción inducida es del orden de 2 pmol/10^{5} células, es
decir, 10 veces la basal). Este efecto no se observa en condiciones
basales. La semiinhibición y la inhibición máxima de la producción
de AMPc son inducidas por galanina humana 10^{-9} M y 10^{-6}
M respectivamente. En presencia de galanina 10^{-6} M, la
producción de AMPc intracelular inducida por forscolina disminuye
un 50%.
La inhibición por galanina de la producción de
AMPc intracelular inducida por forscolina confirma la especificidad
del receptor GalR1 como receptor galaninérgico. Estos resultados
demuestran, por otra parte, que las células Cos1 de la presente
invención son capaces de expresar el receptor de galanina que tiene
características funcionales comparables a las del receptor
natural.
Este ejemplo demuestra que la secuencia
nucleotídica SEQ ID nº 1 o fragmentos de ésta se pueden utilizar
para poner de manifiesto secuencias homólogas, especialmente
subtipos, a partir de otros tejidos. Para ello, son utilizables
diferentes técnicas, tales como PCR, hibridación in situ,
transferencia de Northern, etc.
Más particularmente, para la búsqueda por PCR,
se preparan los ARN totales de los diferentes tejidos estudiados y
se someten a continuación a transcripción inversa y a una
amplificación, en presencia de transcriptasa inversa, de Taq
polimerasa y de los iniciadores apropiados derivados de la secuencia
SEQ ID nº 1. Los productos así obtenidos se transfieren a
continuación a filtros de nitrocelulosa y se hibridan en condiciones
de estringencia variables. Las secuencias homólogas puestas de
manifiesto durante estas experiencias pueden seguidamente aislarse
y/o amplificarse mediante las técnicas clásicas de biología
molecular.
<110> Aventis Pharma S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptor galanina, ácidos nucleicos,
células transformadas y utilizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ST94008
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3083
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (787)..(1836)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /producto = "receptor galanina
humano"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (15)
1. Secuencia nucleotídica que codifica un
polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico,
caracterizada porque se escoge entre:
(a) toda o parte de la secuencia nucleotídica
SEQ ID nº 1, y
(b) las secuencias derivadas de las secuencias
(a) debido a la degeneración del código genético.
2. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 1, caracterizada porque codifica un receptor
galaninérgico humano.
3. Secuencia nucleotídica caracterizada
porque comprende la secuencia SEQ ID nº 1 o su hebra
complementaria.
4. Secuencia nucleotídica según las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se escoge entre
las secuencias de ADN genómico, ADNc, ARN, las secuencias híbridas
o las secuencias sintéticas o semisintéticas.
5. Secuencia nucleotídica según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la parte que
codifica dicho polipéptido está situada bajo el control de señales
que permiten su expresión en un anfitrión celular.
6. Polipéptido que posee actividad de receptor
galaninérgico resultante de la expresión de una secuencia
nucleotídica, escogiéndose dicha secuencia entre:
a) toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ
ID nº 1, y
b) las secuencias derivadas de las secuencias
(a) debido a la degeneración del código genético.
7. Polipéptido que comprende toda o una parte de
la secuencia peptídica SEQ ID nº 2 o de un derivado de la misma,
modificada por mutación, sustitución, supresión y/o modificación de
uno o varios restos, y que posee la capacidad de enlazar la
galanina o una variante de la galanina, siendo dicho derivado tal
que la galanina 2-29 y la galanina
1-16 inhiben competitivamente el enlace de la
(^{125}I)-galanina con una afinidad más
débil que la galanina 1-29, y que la galanina
2-29 inhibe competitivamente el enlace de la
(^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que
la galanina
1-16.
1-16.
8. Secuencia antisentido capaz de inhibir al
menos parcialmente la producción de un polipéptido según una de las
reivindicaciones 6 ó 7.
9. Célula recombinada que expresa en su
superficie un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 ó 7,
obtenida por introducción de una secuencia según la reivindicación
5.
10. Célula según la reivindicación 9,
caracterizada porque se escoge entre las células eucarióticas
o las procarióticas.
11. Procedimiento de puesta de manifiesto y/o de
aislamiento de ligandos de los receptores galaninérgicos,
caracterizado porque se realiza en las etapas siguientes:
- se pone en contacto una molécula o una mezcla
que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas,
con una célula recombinada según la reivindicación 9 que expresa en
su superficie un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 y
7, en condiciones que permiten la interacción entre dicho
polipéptido y dicha molécula en el caso en que ésta posee una
afinidad por dicho polipéptido, y,
- se detectan y/o se aíslan las moléculas
enlazadas a dicho polipéptido.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
para la puesta de manifiesto y/o el aislamiento de agonistas y/o de
antagonistas de los receptores galaninérgicos.
13. Procedimiento de puesta de manifiesto y/o de
aislamiento de ligandos moduladores de los receptores
galaninérgicos, caracterizado porque se realiza en las
etapas siguientes:
- se pone en contacto una molécula o una mezcla
que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas,
con una célula recombinada según la reivindicación 9 que expresa en
su superficie un polipéptido, según una de las reivindicaciones 6 y
7, que posee actividad de receptor galaninérgico, en presencia de un
ligando de dicho receptor, en condiciones que permiten la
interacción entre dicho polipéptido y el ligando, y,
- se detectan y/o se aíslan las moléculas
capaces de modular la actividad del ligando sobre dicho
polipéptido.
\newpage
14. Anticuerpos que reconocen un polipéptido
según la reivindicación 6.
15. Procedimiento de obtención de un polipéptido
según una de las reivindicaciones 6 y 7, que comprende la expresión
en una célula de una secuencia nucleotídica según una de las
reivindicaciones 1 a 5.
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