ES2287927T3 - Peptidos que tienen una actividad de factor de intercambio del gdp, secuencias de acidos nucleicos que codifican estos peptidos, preparacion y utilizacion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PEPTIDOS CAPACES DE MODULAR LOS NIVELES DE INTERCAMBIO DEL GDP SOBRE COMPLEJOS P21-GDP, LAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN ESTOS PEPTIDOS, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS CONTIENEN.

Description

Péptidos que tienen una actividad de factor de intercambio de GDP, secuencias de ácidos nucleicos que codifican estos péptidos, preparación y utilización.

La presente invención se refiere a nuevas secuencias peptídicas y nucleotídicas y su utilización farmacéutica. Más en particular, la invención se refiere a péptidos capaces de modular los niveles de intercambio de GDP en los complejos p21-GDP.

Los productos de los genes ras, denominados generalmente proteínas p21, desempeñan un papel clave en el control de la división celular en todos los organismos eucariotas en los que se han investigado. Algunas modificaciones específicas de estas proteínas hacen que pierdan su control normal y las llevan a volverse oncogénicas. Así, se ha asociado un gran número de tumores humanos a la presencia de genes ras modificados. Del mismo modo, una sobreexpresión de estas proteínas p21 puede llevar a un desorden de la proliferación celular. La comprensión del papel exacto de estas proteínas p21 en las células, su modo de funcionamiento y sus características constituyen pues un objetivo principal para la comprensión y el enfoque terapéutico de la cancerogénesis.

In vivo, no se conoce aún la naturaleza exacta de los acontecimientos responsables de la activación de las proteínas p21. Se dice que ejercen sus funciones oscilando entre dos estados conformacionales: una forma inactiva unida a GDP y una forma activa unida a GTP, pero los factores efectivos en la transición entre estas dos formas no están identificados claramente. Los trabajos recientes se refieren a situaciones fisiológicas en las que aumenta la proporción de proteínas ras unidas a GTP en la célula. Se trata de la activación de los linfocitos T y la estimulación de los fibroblastos 3T3 por factores de crecimiento entre ellos EGF y PDGF (Downward et al., Nature 346 (1.990) 719; Gibbs et al., J. Biol. Chem. 265 (1.990) 20.437). El aumento de la proporción de p21-GTP se puede explicar al menos en parte por la acción de una proteína que desempeña un papel análogo al de un receptor para las proteínas G de transducción. Con respecto a esto, se han identificado ciertas proteínas capaces de promover el intercambio de GDP en las proteínas p21 a partir de cerebro de buey [West et al., FEBS Lett. 259 (1.990) 245] y de rata [Wolfman y Macara, Science 248 (1.990) 67]. La distinta localización celular de estos factores y las muy diferentes condiciones experimentales en las que se han obtenido permiten suponer que se trata de proteínas diferentes. Se activan tanto en proteínas ras normales como en las que son oncogénicas. Estas actividades se reagrupan en el término GEF: Factor de Intercambio de nucleótidos Guanídicos o GRF.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la actividad de GRF se ha atribuido al producto del gen CDC25 [Camonis et al., EMBO J. 5 (1.986) 375] y se han realizado estudios con el fin de comprender el medio de señalización que hace intervenir el producto de los genes CDC25, RAS1 y RAS2 de una parte y la adenilato ciclasa por otra parte, en la levadura Saccharomyces cerevisiae. En particular, numerosos trabajos se han enfocado en la caracterización del producto del gen CDC25 que era el elemento peor conocido de esta cadena. El producto del gen CDC25 constituye el elemento más arriba de la cascada de reacciones que conducen a la activación de la p21 en la levadura. Los trabajos realizados en este campo han contribuido a demostrar que el producto de este gen debe tratarse como factor de intercambio GDP -> GTP para activar las proteínas ras. Se ha aislado y se ha caracterizado un segundo gen de la levadura S. cerevisiae, SDC25, estructuralmente muy parecido a CDC25. El campo activo de SDC25 parece ser un factor de intercambio capaz de tratarse in vitro e in vivo en las proteínas ras. Este campo constituye el primer constituyente molecular descrito dotado de esta actividad.

Muy recientemente, se ha puesto igualmente de manifiesto en el ratón una proteína del tipo GRF [Vanoni y Martegani, J. Cell. Bioch. Suppl.16B (1.992) 220]. Se ha descrito la purificación de una proteína de origen bovino, denominada rho GDI (GDP Dissociation Inhibitor), que regula el intercambio de GDP-GTP de la proteína rho (Fukumoto et al. Oncogene (1.990), 5, págs. 1.321), así como la clonación de una proteína de origen bovino, denominada smg p25A GDI (GDP Dissociation Inhibitor), que regula el intercambio de GDP-GTP de la proteína smg p25A (Matsui et al. Molecular and Cellular Biology (Ag. 1.990) pág. 4.116-4.122).

Sin embargo, hasta hoy, no se ha aislado y caracterizado ninguna actividad GRF en el hombre. La presente invención resulta precisamente de la demostración por la solicitante de la existencia de un factor humano de intercambio de GDP. La presente invención resulta más en particular de la identificación del aislamiento y de la caracterización de péptidos y secuencias nucleotídicas de origen humano, denominadas hGRF y hSOS, capaces de modular el estado de activación de las proteínas p21.

Un primer aspecto de la invención consiste pues en péptidos utilizables farmacéuticamente. Más en particular, un objeto de la invención reside en los péptidos capaces de modular los niveles de intercambio de GDP en los complejos p21-GDP. Se entiende que p21 designa todo producto de expresión de un gen ras normal u oncogénico.

Más en particular, los péptidos de la invención se eligen entre todas o parte de las secuencias SEC ID nº 2, 3, 4, 6 u 8 o una derivada de las mismas.

En el sentido de la presente invención, el término derivado designa toda molécula obtenida por modificación de la naturaleza genética y/o química de estas secuencias y conservando la actividad investigada. Por modificación de naturaleza genética y/o química se debe entender cualquier mutación, sustitución, deleción, adición y/o modificación de uno o varios restos. Dichos derivados se pueden generar con finalidades diferentes, tales como especialmente la de aumentar la afinidad del péptido por su sitio de interacción, la de mejorar sus niveles de producción, la de aumentar su resistencia a las proteasas, la de aumentar su eficacia terapéutica o reducir sus efectos secundarios o la de conferirle nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas.

En un modo particular de la invención, los péptidos de la invención son los péptidos capaces de estimular el intercambio de GDP en el complejo p21-GDP.

En otro modo particular de la invención, los péptidos de la invención son los péptidos capaces de disminuir o inhibir el intercambio de GDP en el complejo p21-GDP. Dichos péptidos son preferentemente los péptidos capaces de antagonizar la interacción del factor de intercambio de GDP con el complejo p21-GDP. Se puede tratar pues de fragmentos de las secuencias indicadas anteriormente o de derivadas de las mismas. Dichos fragmentos se pueden generar de diferentes formas. En particular, se pueden sintetizar por vía química, en base a las secuencias dadas en la presente solicitud, utilizando los sintetizadores peptídicos conocidos por el experto en la materia. Igualmente se pueden sintetizar por vía genética, por expresión en un huésped celular de una secuencia nucleotídica que codifique el péptido investigado. En este caso, la secuencia nucleotídica se puede preparar químicamente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos, sobre la base de la secuencia peptídica dada en la presente solicitud y del código genético. La secuencia nucleotídica se puede preparar igualmente a partir de las secuencias dadas en la presente solicitud (SEC ID nº 1, 5 y 7), por cortes enzimáticos, ligadura, clonación, etc, según las técnicas conocidas por el experto en la materia o por cribado de bancos de ADN con las sondas elaboradas a partir de estas secuencias. Por otro lado, los péptidos de la invención capaces de disminuir o inhibir el intercambio de GDP en el complejo p21-GDP pueden ser igualmente péptidos que tengan una secuencia correspondiendo al sitio de interacción del factor de intercambio en el complejo p21-GDP.

Otro objeto de la invención reside en los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos policlonados o monoclonados dirigidos contra un péptido tal como se definió anteriormente. Dichos anticuerpos se pueden generar por los métodos conocidos por el experto en la materia, teniendo en cuenta las explicaciones dadas en la presente solicitud. En particular, estos anticuerpos se pueden preparar por inmunización de un animal contra un péptido de la invención, extracción de sangre y aislamiento de los anticuerpos. Estos anticuerpos se pueden generar igualmente por preparación de hibridomas según las técnicas conocidas por el experto en la materia.

Más preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención presentan la capacidad de inhibir al menos parcialmente la interacción del factor de intercambio con el complejo p21-GDP. Así se pueden utilizar para regular el estado de activación del producto de los genes ras.

Por otro lado, estos anticuerpos se pueden utilizar igualmente para detectar y/o dosificar el factor de intercambio de GDP humano en las muestras biológicas y de este hecho, para informar del estado de activación del producto de los genes ras.

La presente invención permite pues generar péptidos derivados de las secuencias SEC ID nº 2-4, 6 y 8, así como de los anticuerpos dirigidos contra estos péptidos, presentando propiedades biológicas interesantes con vistas a una utilización farmacéutica. La actividad biológica de los diferentes péptidos y anticuerpos de la invención en el intercambio de GDP se puede evaluar de diferentes maneras, así como se ilustra en los ejemplos.

La invención proporciona igualmente compuestos no peptídicos o no exclusivamente peptídicos utilizables farmacéuticamente. En efecto es posible a partir de los restos proteicos activos descritos en la presente solicitud, realizar moléculas inhibidoras de la vía de señalización dependiente de las proteínas ras no exclusivamente peptídicas y compatibles con una utilización farmacéutica. Respecto a esto, la invención se refiere a la utilización de un polipéptido de la invención tal como se describió anteriormente para la preparación de moléculas no peptídicas o no exclusivamente peptídicas, farmacológicamente activas en los niveles de intercambio de GDP, para la determinación de elementos estructurales de este polipéptido que son importantes para su actividad y reproducción de estos elementos por las estructuras no peptídicas o no exclusivamente peptídicas. La invención tiene también por objeto composiciones farmacéuticas que comprendan una o varias moléculas preparadas así.

La presente invención tiene por objeto igualmente toda secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido tal como se definió anteriormente. Más preferiblemente, se trata de una secuencia elegida entre:

(a)

todas o parte de las secuencias SEC ID nº 1, 5 ó 7 o de su cadena complementaria,

(b)

toda la secuencia que se hibrida con una secuencia (a) y que codifica un polipéptido según la invención y

(c)

las secuencias derivadas de las secuencias (a) y (b) debido a la degeneración del código genético.

Las diferentes secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Se puede tratar de secuencias genómicas, ADNc, ARN, secuencias híbridas o secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas secuencias se pueden obtener por ejemplo por cribado de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) al medio de sondas elaboradas sobre la base de las secuencias SEC ID nº 1, 5 ó 7. Tales bancos se pueden preparar a partir de células de diferentes orígenes por técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en la materia. Las secuencias nucleotídicas de la invención se pueden preparar igualmente por síntesis química, especialmente según el método de las fosforamiditas o también por métodos mixtos incluyendo la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas por cribado de bancos.

Estas secuencias nucleotídicas según la invención se pueden utilizar en el campo farmacéutico, bien para la producción in vitro de péptidos de la invención, bien para la realización de secuencias antisentido o para la producción de péptidos de la invención en el ámbito de una terapia génica, bien aún para la detección y el diagnóstico, para experiencias de hibridación, expresión o sobreexpresión de un factor de intercambio de GDP amplificado, mutado o reordenado en muestras biológicas o para el aislamiento de secuencias homólogas a partir de otras fuentes celulares.

Para la producción de péptidos de la invención, las secuencias nucléicas definidas anteriormente se colocan generalmente bajo el control de señales que permitan su expresión en un huésped celular. La elección de estas señales (promotores, terminadores, secuencia "líder" de secreción, etc.) puede variar en función del huésped celular utilizado. Preferentemente, estas secuencias nucleotídicas de la invención forman parte de un vector que puede ser una replicación autónoma o integradora. Más particularmente, se pueden preparar vectores de replicación autónoma utilizando secuencias de replicación autónoma en el huésped elegido. Cuando se trata de vectores integradores, éstos se pueden preparar por ejemplo utilizando secuencias homólogas de ciertas regiones del genoma del huésped, permitiendo, por recombinación homóloga, la integración del vector.

Los huéspedes celulares utilizables para la producción de péptidos de la invención son tanto huéspedes eucariotas como procariotas. Entre los huéspedes eucariotas que convienen, se pueden citar células animales, levaduras u hongos. En particular, tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del género: Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Tratándose de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente las especies Aspergillus o Trichoderma. Como huéspedes procariotas, se prefiere utilizar las siguientes bacterias: E. coli, Bacillus o Streptomyces.

Las secuencias de ácidos nucleicos según la invención pueden servir igualmente para la realización de oligonucleótidos antisentido o antisentidos genéticos utilizables como agentes farmacéuticos. Se ha probado que la inhibición de la expresión de ciertos oncogenes por secuencias antisentido es una estrategia útil en la comprensión del papel de estos oncogenes y un medio particularmente prometedor en la realización de un tratamiento anticanceroso. Las secuencias antisentido son de oligonucleótidos de pequeño tamaño, complementarios de la cadena que codifica un gen dado y por este hecho capaces de hibridarse específicamente con ARNm transcrito, inhibiendo su traducción en proteína. La invención tiene así por objeto las secuencias antisentido capaces de inhibir al menos parcialmente la producción de péptidos que estimulen el intercambio de GDP en los complejos p21-GDP. Dichas secuencias pueden estar constituidas por todas o parte de las secuencias nucleicas definidas anteriormente. Generalmente se trata de secuencias o fragmentos de secuencias complementarias de secuencias que codifican los péptidos que estimulan el intercambio de GDP. Dichos oligonucleótidos se pueden obtener a partir de las secuencias SEC ID nº 1, 5 ó 7, por fragmentación, etc, o por síntesis química. Dichas secuencias se pueden utilizar en el ámbito de terapias génicas para la transferencia y expresión in vivo de secuencias antisentido o de péptidos capaces de modular los niveles de intercambio de GDP en las proteínas ras. Con respecto a esto, las secuencias se pueden incorporar en vectores, especialmente de origen viral.

La invención se refiere igualmente, como secuencias nucleotídicas, sondas nucleotídicas, sintéticas o no, capaces de hibridarse con las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente que codifican un péptido de la invención o con el ARNm correspondiente. Dichas sondas se pueden utilizar in vitro como instrumento de diagnóstico, para la detección de la expresión del factor de intercambio de GDP o aún para poner de manifiesto anomalías genéticas (mala separación, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc). Tales sondas deben marcarse previamente y para ello el experto en la materia conoce diferentes técnicas. Las condiciones de hibridación en las que se pueden utilizar estas sondas son las condiciones normales de estringencia (véanse especialmente las técnicas generales de clonación a continuación así como los ejemplos). Estas sondas se pueden utilizar igualmente para poner de manifiesto y aislar secuencias de ácidos nucleicos homólogos que codifiquen un péptido de la invención, a partir de otras fuentes celulares así como se ilustra en los ejemplos.

La invención tiene también por objeto toda composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos un péptido tal como se definió anteriormente.

También tiene por objeto toda composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos un anticuerpo y/o un fragmento de anticuerpo tal como se definió anteriormente, así como toda composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos una secuencia nucleotídica tal como se definió anteriormente.

Por otro lado, también tiene por objeto las composiciones farmacéuticas en las que los péptidos, los anticuerpos y la secuencia nucleotídica definidos anteriormente se asocian entre sí o con otros principios activos.

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden utilizarse para modular la activación de las proteínas p21 y de este hecho modular la proliferación de ciertos tipos celulares. Más particularmente, estas composiciones farmacéuticas están destinadas al tratamiento de tumores malignos. Se han asociado en efecto numerosos tumores malignos a la presencia de proteínas ras oncogénicas. Entre los tumores malignos que esconden generalmente genes ras mutados, se pueden citar especialmente: adenocarcinomas de páncreas, de los que el 90% tiene un oncogén Ki-ras mutado en el duodécimo codón [Almoguera et al., Cell 53 (1.988) 549], adenocarcinomas de colon y tumores malignos
de tiroides (50%) o carcinomas de pulmón y leucemias mieloides [30%. Bos, J. L. Cancer Res. 49 (1.989) 4.682].

La invención tiene también por objeto la utilización de las moléculas descritas anteriormente para modular la actividad de las proteínas p21. En particular, la invención se refiere a la utilización de estas moléculas para inhibir al menos parcialmente la activación de las proteínas p21.

La invención proporciona igualmente un procedimiento de detección de la expresión y/o sobreexpresión de un gen ras en una muestra biológica. Dicho procedimiento comprende por ejemplo poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la invención, la revelación de los complejos antígeno-anticuerpo y la comparación de los resultados obtenidos con una muestra patrón. En dicho procedimiento, el anticuerpo puede estar en suspensión o previamente inmovilizado sobre un soporte. Este procedimiento puede comprender igualmente poner en contacto la muestra con una sonda nucleotídica según la invención, poner de manifiesto los híbridos obtenidos y la comparación con los obtenidos en el caso de una muestra patrón.

La presente invención se puede utilizar en el campo terapéutico: siendo los péptidos, los anticuerpos y las secuencias nucleotídicas de la invención capaces de modular la actividad de los genes ras, permitiéndoles en efecto intervenir en el proceso de desarrollo de los tumores malignos. Así como se ilustra en los ejemplos, las secuencias nucleotídicas de la invención permiten especialmente expresar péptidos capaces de complementar la termosensibilidad de las levaduras que portan una mutación cdc25. Permiten igualmente expresar péptidos capaces de suprimir una mutación dominante RAS2ts, demostrando una competición con el producto normal de expresión del gen CDC25 para la interacción con las proteínas p21. La invención se puede utilizar igualmente en el campo del diagnóstico y de la clasificación de los tumores malignos: los anticuerpos y las sondas nucleotídicas de la invención permiten en efecto la identificación de los tumores malignos en los que está implicado un gen ras así como el diagnóstico de tumores malignos unidos a la sobreexpresión de un gen ras normal u oncogénico.

Otras ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitantes.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Ensayo de transactivación: Esta figura presenta en ordenadas los niveles de actividad CAT (% con respecto a ruido de fondo) de cepas CHO recombinantes, en función de la secuencia de ADNc utilizada para la transformación.

Figura 2: Ensayo de actividad de intercambio de GTP: Esta figura presenta en ordenadas la relación de las formas p21-GDP/p21-GTP de cepas CHO recombinantes, en función de la secuencia de ADNc utilizada para la transformación.

Figura 3: Ensayo de actividad de intercambio de GDP in vitro : Esta figura muestra, en función del tiempo y para 2 concentraciones de un péptido de la invención, la disminución de la proporción de GDP restante unido a la proteína p21.

Técnicas generales de clonación

Los métodos utilizados clásicamente en biología molecular tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico, centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, purificación de fragmentos de ADN por electroelución, extracciones de proteínas en fenol o fenol - cloroformo, precipitación de ADN en medio salino en etanol o isopropanol, transformación en Escherichia coli, etc, son bien conocidos por el experto en la materia y se describen extensamente en la bibliografía [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1.982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1.987].

Las enzimas de restricción han sido proporcionadas por New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) o Amersham y se utilizan según las recomendaciones de los proveedores.

Los plásmidos del tipo pBR322, pUC, \lambdagt11, pGEX 2T y los fagos de la serie M13 son de origen comercial.

Para las ligaduras, los fragmentos de ADN se separan según su tamaño por electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, se extrae en fenol o en una mezcla de fenol/cloroformo, se precipita en etanol después se incuba en presencia de ADN ligasa de fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor.

El llenado de los extremos 5' prominentes se efectúa por el fragmento de Klenow de ADN Polimerasa I de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se efectúa en presencia de la ADN Polimerasa de fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se efectúa por un tratamiento de limpieza por la nucleasa S1.

La mutagénesis dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos se efectúa según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1.985) 8.749-8.764] utilizando el estuche distribuido por Amersham.

\newpage

La amplificación enzimática de fragmentos de ADN por la técnica mencionada de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1.985) 1.350-1.354; Mullis K. B. y Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1.987) 335-350] se efectúa utilizando un "secuenciador térmico de ADN" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante.

La verificación de las secuencias nucleotídicas se efectúa por el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1.977) 5.463-5.467] utilizando el estuche distribuido por Amersham.

Para las experiencias de hibridación, las condiciones de estringencia normales son generalmente las siguientes: hibridación : SCC 3 x en presencia de Denhart 5 x a 65ºC; lavado: SSC 0,5 x a 65ºC.

1. Aislamiento del gen del factor humano de intercambio de GDP (hGRF)

Se han cribado 5.10^{5} fagos de un banco de cerebro humano construido en el vector \lambdagt11 [Skolnik et al., Cell 65 (1.991) 83] según las técnicas descritas por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Molecular cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1.989).

La sonda utilizada para el cribado de este banco es un fragmento de ADNc humano de 137 pares de bases marcadas con ^{32}P. Esta sonda se ha preparado por PCR sobre el ADN total del banco mencionado previamente utilizando como cebos los siguientes oligonucleótidos degenerados:

1

para el oligonucléotido del extremo 3' del fragmento (SEC ID nº 11) y

2

para el oligonucléotido del extremo 5' del fragmento (SEC ID nº 12).

La sonda se ha marcado con ^{32}P por "random priming" según la técnica de Feinberg y Vogelstein [Anal. Biochem. 137 (1.984) 266] y la reacción de PCR se ha llevado a 40ºC aproximadamente en las condiciones descritas en las técnicas generales de clonación.

Entre los diferentes clones positivos obtenidos por hibridación con esta sonda, uno comprende la totalidad de una fase abierta que porta la actividad de intercambio con respecto a Ha-Ras.

Este clon de \lambdagt11 contiene un ADNc de 3 kb que se ha introducido en forma de fragmento EcoRI, en el sitio que corresponde a un vector M13mp18. Este ADNc se ha secuenciado después con ayuda de cebos comerciales "invertido" y "-20" así como con ayuda de oligonucleótidos específicos según la técnica de Sanger (Cf técnicas generales de clonación).

La secuencia nucleotídica del gen del factor humano de intercambio de GDP portada por el fragmento así obtenido está presente en la secuencia SEC ID nº 1, así como las secuencias peptídicas deducidas (SEC ID nº2, 3 y 4).

2. Preparación de subfragmentos

Se pueden preparar y utilizar diferentes derivados o fragmentos del gen así obtenido, especialmente para la expresión de péptidos de la invención. En particular, se han preparado los siguientes fragmentos por corte enzimático y se han separado por electroelución:

-

un fragmento PstI-EcoRI que comprende una parte de la región codificante del factor de intercambio (del nucleótido 936 hasta el codón de terminación) así como la región 3' no codificante del fragmento,

-

un fragmento EcoNI-EcoRI que comprende una parte de la región codificante del factor de intercambio (del nucleótido 910 hasta el codón de terminación) así como la región 3' no codificante del fragmento,

-

un fragmento EagI-EcoRI que comprende una parte de la región codificante del factor de intercambio (del nucleótido 638 hasta el codón de terminación) así como la región 3' no codificante del fragmento,

-

un fragmento BaII-EcoRI que comprende una parte de la región codificante del factor de intercambio (del nucleótido 88 hasta el codón de terminación) así como la región 3' no codificante del fragmento y

-

un fragmento NaeI-EcoRI que comprende una parte de la región codificante del factor de intercambio (del nucleótido 196 hasta el codón de terminación) así como la región 3' no codificante del fragmento,

Se entiende que la región 3' no codificante portada por estos fragmentos es accessoria y que se puede eliminar bien por digestión en el medio de una nucleasa bien por corte con una enzima habiendo un sitio próximo del codón de terminación, tal como especialmente SmaI, de la que el sitio está localizado aproximadamente 30 pb después del codón de terminación.

Se entiende igualmente que se pueden preparar otros fragmentos tales como especialmente los fragmentos que no contienen la región codificadora de la parte C-terminal entera, así como derivados de estos fragmentos, obtenidos por mutación, sustitución, adición o modificación de naturaleza química y/o genética.

3. Caracterización biológica

Se han ensayado las funcionalidades de los péptidos según la invención:

-

en células de mamíferos,

-

en la levadura Saccharomyces cerevisiae o también

-

in vitro en la proteína Ha-Ras recombinante.

3.1 Para la evaluación funcional en las células de mamífero, las secuencias de ADN codificadoras de los péptidos de la invención, tales como por ejemplo los descritos en el ejemplo 2, se pueden colocar bajo control del promotor precoz de SV40 en el vector pCym1 descrito por Camonis et al. [Gene 86 (1.990) 263].

En este ejemplo, los fragmentos PstI-EcoRI y EcoNI-EcoRI descritos en el ejemplo 2 se han insertado en este vector.

En los vectores así obtenidos se ha analizado la transfección transitoria en las células CHO según el protocolo descrito por Rey et al. [Oncogene 6 (1.991) 347].

Se han estudiado también dos criterios de funcionalidad:

-

la capacidad de los vectores para transactivar un promotor que gobierne la expresión de un gen indicador que sea aquí un gen bacteriano codificador para la cloranfenicol acetil transferasa (gen CAT),

-

su capacidad para promover la carga en GTP de las proteínas Ras de las células CHO transfectadas.

a)

Para los ensayos de transactivación, las células CHO al 50% de confluencia se han transfectado (véase por ejemplo el protocolo descrito por Schweighoffer et al. Science, In Press) por una parte con 0,5 \mug de un vector portador del gen CAT bajo el control de un promotor sintético compuesto de promotor murina del gen de la timidina cinasa y de 4 elementos PEA1 repetidos derivados del exaltador de polioma [Wasylyk et al., EMBO J. 7 (1.988) 2.475] y por otra parte con 4,5 \mug de un vector de expresión portador, bajo el control del promotor precoz de SV40, cualquier ADNc codificador (pista 1), el ADNc de Ha-Ras normal (pista 2), el ADNc de Ha-Ras activada en 12 (Val 12) (pista 3), el extremo 3' del cDNA de SDC25 descrito por Rey et al., mencionado previamente (pista 4) y el ADNc codificador de un péptido según la invención descrito anteriormente (pista 5).

Los resultados se presentan en la figura 1. La pista 1 que corresponde a la activación basal, la pista 3 (obtenida para el fragmento PstI-EcoRI: CDC hum.) muestra que la expresión de un péptido de la invención permite la transactivación del promotor sintético utilizado.

El mismo resultado cualitativo se ha obtenido para los otros fragmentos estudiados.

b)

Con el fin de verificar que esta transactivación implica bien una carga nucleotídica de las proteínas ras de las células CHO, se han realizado las mismas transfecciones transitorias, añadiéndose el medio de cultivo de ortofosfato marcado con ^{32}P.

Este protocolo de marcado así como el de la inmunoprecipitación de las proteínas ras celulares se describe por Rey et al., mencionado previamente. Los resultados obtenidos se presentan en la figura 2. Muestran que los péptidos de la invención son capaces de modular los niveles de intercambio de GDP en las proteínas ras puesto que algunos de ellos (péptido CDC Hum. expresado por el fragmento PstI-EcoRI descrito anteriormente) son capaces de promover la carga en GTP de las proteínas ras de células CHO inmunoprecipitadas por los anticuerpos Y 13-259.

3.2. Los péptidos de la invención se ensayan igualmente funcionalmente en la levadura S. cerevisiae cdc25^{-}. Para ello, los vectores descritos anteriormente (3.1.), que son los vectores transportadores, se han introducido en la cepa de levadura OL97-1-11B [Camonis et Jacquet, Mol. Cell. Biol. 8 (1.988) 2.980]. Los resultados obtenidos muestran que los fragmentos de ADNc según la invención codifican los péptidos que son capaces de complementar el defecto de crecimiento de esta cepa a 36ºC. Estos resultados muestran así cómo estos fragmentos codifican los péptidos funcionales in vivo en S. cerevisiae.

3.3. La capacidad de las secuencias de ADN de la invención para codificar los péptidos capaces de promover el intercambio de GDP en las proteínas Ha-Ras purificadas se ha demostrado igualmente in vitro según el protocolo descrito por Rey et al. Mol. Cell. Biol. 9 (1.989) 3.904].

Para ello las secuencias de la invención se expresan en la cepa de E. coli TG1 en forma de proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST) según la técnica descrita por Smith y Johnson [Gene 67 (1.988) 31]. Para ello, los diferentes fragmentos de ADN descritos en 3.1. anteriormente se han clonado en forma de fragmentos SmaI-EcoRI, en el vector pGEX 2T (Pharmacia), en 3' y en fase de un ADNc codificador para la GST. Los fragmentos SmaI-EcoRI se obtienen por adición de un adaptador al medio de una ligasa. Los vectores así obtenidos se utilizan después para transformar la cepa E. coli TG1. Las células así transformadas se cultivan previamente una noche, a 37ºC, diluidas al 1/10e en medio LB, añadido IPTG para inducir la expresión (2 horas, 25ºC), después se cultivan 21 horas aproximadamente a 25ºC. Las células se lisan después y se purifican las proteínas de fusión producidas por afinidad en columna Agarosa-GSH. Para ello, se incuba el lisado bacteriano en presencia de gel (preparado y equilibrado con el tampón de lisis) durante 15 minutos, a 4ºC. Después de 3 lavados con un tampón Tris-HCl pH 7,4, se eluyen las proteínas en presencia de un tampón Tris-HCl pH 7,7 conteniendo un exceso de GSH. Se recoge y se centrifuga el sobrenadante.

La actividad de intercambio de GDP de los péptidos de la invención en las proteínas Ha-Ras purificadas se ha demostrado después in vitro según el protocolo descrito por Rey et al. (Mol. Cell. Biol. mencionado previamente). Los resultados obtenidos se presentan en la figura 3. Muestran especialmente que el péptido de la invención que corresponde a la secuencia CDC hum expresada por el fragmento PstI-EcoRI descrito anteriormente estimula el intercambio de GDP.

4. Manifestación de secuencias homólogas

Las secuencias de ácidos nucleicos homólogas a la presentada en la figura 1 se han puesto de manifiesto por dos estrategias diferentes:

-

por PCR, en las condiciones descritas en las técnicas generales de clonación, en los ADNc neosintetizados a partir de ARNm de placenta, utilizando como cebos oligonucleótidos degenerados elegidos para recubrir las secuencias conservadas entre la secuencia SEC ID nº1 y la secuencia de la proteína SOS [Bonfini et al., Science 255 (1.992) 603].

-

Por cribado de un banco de ADNc de placenta con ayuda de una sonda constituida por la totalidad de la secuencia SEC ID nº1 marcada con ^{32}P. Este cribado se ha realizado en las condiciones de estringencia débil: hibridación a 50ºC en medio SSC 5 x, Denhart 5 x; después lavado a 50ºC en medio SSC 2 x.

Estas dos estrategias han permitido revelar las secuencias homólogas a la secuencia SEC ID nº1. Estas secuencias se pueden aislar y caracterizar fácilmente. Constituyen secuencias nucleicas en el sentido de la presente invención, las cuales codifican (o sus fragmentos o derivados) los péptidos capaces de modular los niveles de intercambio de GDP en los complejos p21-GDP.

En particular, esta estrategia ha permitido la identificación a partir de ARNm de placenta y utilizando los oligonucleótidos oligo 2449 (SEC ID nº 9) y oligo 2451 (SEC ID nº 10), de 2 ADNc codificadores de los factores designados hSOS1 y hSOS2, de los que las secuencias parciales se representan en las SEC ID nº 5 y SEC ID nº 7, respectivamente. Los ARNm que corresponden a estos factores se presentan en todos los tejidos en que se han investigado, contrariamente al factor descrito en el ejemplo 1 que parece localizado únicamente en el cerebro. La localización cromosómica de estos genes se ha efectuado y ha dado los siguientes resultados:

h-GRF: 15q2.4.

h-SOS1: 4q2.1.

h-SOS2: 14q2.2.

5. Investigación de factores de intercambio de tipo h-GRF en otros tejidos

Se ha preparado un anticuerpo anti h-GRF en el conejo, por inmunización con un antígeno que corresponde al fragmento de 280 aminoácidos localizados entre los restos 211 y 489 del factor h-GRF presentes en la SEC ID nº 4.

Este anticuerpo ha permitido la detección, por ELISA, en la corteza humana y células precursoras del cerebro, proteínas de pesos moleculares aparentes 30, 55, 75, 95 y 140 kDa. La diversidad de pesos moleculares sugiere la presencia de ADNc múltiples. La preincubación del anticuerpo anti h-GRF con h-GRF suprime la detección de las proteínas identificadas, lo que demuestra la especificidad de la señal.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 20, avenue Raymond ARON

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ANTONY

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 92165

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LAS PROTEÍNAS RAS, PREPARACIÓN Y UTILIZACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Cinta

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.652 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..2445

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 445..2445 (SEC ID NO 3)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 976..2445 (SEC ID NO 4)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

6

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 814 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 489 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.092 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..1.092

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 364 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.956 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..1.956

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 652 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATCGAAT TCCGIGTIYT IAAYGTIYTI MGICAYTGGG T

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTGAAT TCCKIMKYTT ISWRAARTTI AKTA

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCHGTNAGG TACATNCCHA GGTAKGGNAC ACA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNATHTTYC GNCTNAARAA RACNTGG

\hfill

27

Claims (17)

1. Péptido capaz de modular los niveles de intercambio de GDP en los complejos p21-GDP que comprenden las secuencias SEC ID nº 2, 3, 4, 6 u 8.

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque disminuye o inhibe el intercambio de GDP en el complejo p21-GDP.

3. Péptido de secuencia SEC ID nº 2, 3, 4, 6 u 8.

4. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra un péptido, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 4, caracterizado porque está dirigido contra la secuencia peptídica SEC ID nº 1.

6. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 5, caracterizado porque posee la capacidad de inhibir al menos parcialmente el intercambio de GDP en el complejo p21-GDP.

7. Secuencia nucleotídica que codifica un péptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 7, caracterizada porque se elige entre:

(a)

las secuencias SEC ID nº 1, 5 ó 7 y codifica un péptido capaz de modular los niveles de intercambio de GDP en los complejos p21-GDP,

(b)

la cadena complementaria de las secuencias (a),

(c)

las secuencias derivadas de las secuencias (a) y (b) debido a la degeneración del código genético.

9. Secuencia antisentido capaz de inhibir la producción de péptidos según la reivindicación 3 y derivadas de las secuencias SEC ID Nº1, SEC ID Nº5 o SEC ID Nº7 o de su cadena complementaria.

10. Utilización de una secuencia según la reivindicación 8(b) para la detección in vitro de la expresión del factor de intercambio de GDP o para poner de manifiesto anomalías genéticas (mala separación, polimorfismo, mutaciones puntuales).

11. Composición farmacéutica que comprende como principio activo al menos un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 3 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según una de las reivindicaciones 4 a 6 o una secuencia nucleotídica según la reivindicación 8.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, destinada a modular la activación de las proteínas p21.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, destinada a inhibir al menos parcialmente la activación de las proteínas p21.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, destinada al tratamiento de tumores malignos.

15. Utilización de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según una de las reivindicaciones 4 a 6 y/o una secuencia nucleotídica según la reivindicación 8(b) para la detección de la expresión y/o de una sobreexpresión de un factor de intercambio de GDP amplificado, mutado o reordenado en una muestra biológica.

16. Utilización de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según una de las reivindicaciones 4 a 6 y/o una secuencia nucleotídica según la reivindicación 8(b) para la clasificación de tumores malignos in vitro.

17. Procedimiento de preparación de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se cultiva una célula que contiene una secuencia nucleotídica según la reivindicación 7 en las condiciones de expresión de dicha secuencia y se recupera el péptido producto.