ES2317680T3 - Molecula monocadena con multiples sitios de union para antigenos, su preparacion y su utilizacion. - Google Patents
Molecula monocadena con multiples sitios de union para antigenos, su preparacion y su utilizacion. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UNA MOLECULA MONOCATENARIA, DE UNION A ANTIGENOS MULTIPLES, CON DIFERENTES DOMINIOS VARIABLES DE UNA CADENA PESADA O LIGERA DE UNA INMUNOGLOBULINA, QUE ESTAN UNIDOS EN FORMA DE UNA ESTRUCTURA VH - VL, QUE A SU VEZ SE UNEN ENTRE SI MEDIANTE UN PEPTIDO, ASI COMO SU PREPARACION Y UTILIZACION COMO MEDICAMENTO O COMPUESTO DE DIAGNOSTICO.
Description
Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos, su preparación y su utilización.
La presente descripción se refiere a una
molécula monocadena, con múltiples sitios de unión para antígeno y
que comprende distintos dominios variables de una cadena pesada o
ligera de una inmunoglobulina, que están unidos entre sí en forma
de constructos VH-VL, que, por su parte, están
unidos entre sí a través de un péptido, así como a su preparación y
utilización como medicamento o diagnóstico.
Los anticuerpos biespecíficos que reconocen dos
antígenos diferentes, por ejemplo un antígeno de la superficie de
una célula tumoral y una molécula de un efector, se utilizan
ampliamente en la inmunoterapia experimental (Fanger et al.,
Crit. Rev. Inmunol. 12, 101-124 (1992); van de
Winkel et al., Immunol. Today 18, 562-564
(1997)). Entre las funciones del efector que son reclutadas por los
anticuerpos biespecíficos, se incluyen entre otras las que ocurren
naturalmente en el organismo, tales como por ejemplo las células
citotóxicas y fagocitantes, componentes complementarios, citoquinas
y enzimas trombolíticas y fibrinolíticas y también moléculas de
efector exógenas, tales como por ejemplo toxinas, enzimas que
convierten los profármacos y radionúclidos. Así, por ejemplo, la
inyección de antígenos biespecíficos contra el antígeno asociado al
tumor de Hodgkin y los antígenos de las células T CD3 y CD28 en
tumores xeno-trasplantados provocó el reclutamiento
y estimulación de células T citotóxicas y la inducción de una
actividad tumoricida (Renner et al., Science 264, 833,
1994). En otro planteamiento, un anticuerpo biespecífico contra CD30
y fosfatasa alcalina se utilizó para reclutar la enzima en el punto
del tumor y con ello convertir el precursor no tóxico de un
principio activo en un principio activo tóxico (Sahin et
al., Cancer Res. 50, 6944-6948, 1990).
Una alternativa a la inyección del anticuerpo
biespecífico purificado es la expresión y secreción de dichos
anticuerpos biespecíficos por células transfectadas in vitro
o in vivo. La ventaja de esta estrategia radica en que la
producción del anticuerpo biespecífico para la célula transducida
tiene lugar in vivo, lo cual no hace necesaria una
producción y purificación complicadas del anticuerpo biespecífico
antes de su inyección. Además, la expresión del anticuerpo
biespecífico puede controlarse localmente, en órganos o en un tumor
o también sistémicamente, seleccionando sistemas de expresión
adecuados.
Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden
prepararse por reticulación química (Nisonoff et al., Nature
194, 355, 1962). En la reticulación química de moléculas de
anticuerpos monoclonales o policlonales de origen animal, es
posible desactivar un porcentaje no insustancial. Adicionalmente, se
forman tanto hetero- como homodímeros. Los homodímeros deben
separarse de los heterodímeros deseados, utilizando métodos
complicados. Las células hybridomas, que producen anticuerpos
biespecíficos, los denominados hibridomas híbridos, son
relativamente difíciles de preparar, puesto que en este caso deben
fusionarse entre sí dos hibridomas distintos (Milstein et
al., Nature 305, 537, 1983). El porcentaje de heterodímeros
funcionales es relativamente bajo, teóricamente sólo de un 10%,
puesto que las cadenas pesadas y ligeras de las dos moléculas de
anticuerpo pueden asociarse entre sí de cualquier forma. El
material de partida utilizado son anticuerpos murinos monoclonales,
que, por su parte, son inmunogénicos para el ser humano.
Varias moléculas de anticuerpo bivalentes o
biespecíficos pueden prepararse también como especies recombinantes
y expresarse en bacterias o células eucariotas (WO 93/06217). Todas
las moléculas de anticuerpo recombinantes tienen en común que, para
su preparación, pueden utilizarse moléculas de partida tanto murinas
como humanas. Se han desarrollado métodos distintos para poder
preparar las moléculas de anticuerpo recombinantes biespecíficas de
la manera la más eficaz posible. Dichos métodos permiten preparar
grupos de moléculas distintos.
En un grupo de moléculas, las partes variables
de los anticuerpos se fusionan con dominios de inmunoglobulina
constantes (Fc, CH3, CL), con el fin de conseguir una dimerización
(Hu et al., Cancer Res. 56, 3055-3061
(1994); Hayden et al., Ther. Immunol. 1, 3-15
(1994)). Sin embargo, en dicha fusión no tiene lugar una selección
para las moléculas heterodiméricas, con lo cual se forman
mayoritariamente homodímeros bivalentes. Además, la expresión de
dichas moléculas en su forma funcional se limita a las células
eucariotas.
En otro grupo de moléculas, se fusionan las
partes variables de los anticuerpos con péptidos o dominios de
proteínas procedentes de otras proteínas, para preparar moléculas
bivalentes o biespecíficas (Plückthun y Pack, Immunotechnol. 3,
83-105 (1997)). En este caso, también se forman
normalmente homo- y heterodímeros a causa de su asociación al azar.
Adicionalmente, una parte de dichas moléculas contiene un porcentaje
considerable de secuencias ajenas, por lo cual es de esperar una
clara inmunogenicidad.
En un tercer grupo de moléculas, se utilizan
ligeras modificaciones de fragmentos Fv recombinantes, normalmente
fragmentos Fv monocadena (scFv), para la preparación de moléculas
bivalentes o biespecíficas (Holliger y Winter, Curr. Opin.
Biotechnol. 4, 446-449 (1993)). Entre estos, se
incluyen la dimerización por medio de cisteínas adicionales en el
extremo C-terminal de las cadenas scFv (MacCartney
et al., Protein Engin. 8, 301-314 (1994)).
Sin embargo, esto conduce a la formación tanto de homo- como de
heterodímeros, y la expresión en células bacterianas produce
agregados no funcionales. Moléculas scFv en tándem de la estructura
scFv(A)-ligador-scFv(B)
(Mallender y Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206,
1994; Gruber et al., J. Immunol. 1994, 152:5368) pueden
expresarse tanto en bacterias como en células eucariotas. Sin
embargo, esto puede dar lugar también a algunas asociaciones no
funcionales de los cuatro dominios variables.
\newpage
La tecnología de anticuerpos recombinante ha
conducido al desarrollo de nuevos fragmentos de anticuerpo
bivalentes o biespecíficos pequeños durante los últimos años. Las
moléculas de este tipo son por ejemplo "diabodies" (Holliger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
6444-6448, 1993). Se trata de dominios VH y VL
variables de las inmunoglobulinas unidas entre sí por un ligador
muy corto. Dicho ligador es demasiado corto como para efectuar una
asociación de los dominios VH y VL de una cadena, tal como ocurre
por ejemplo con los fragmentos Fv monocadena. Por tanto, los
dominios VH y VL de dos cadenas se combinan para dar un dímero, con
lo cual se forman moléculas con dos sitios de unión (Perisic et
al., Structure 2, 1217-1226, 1994). Los
"diabodies" biespecíficos se forman por expresión de dos
cadenas de las estructuras VH(A)-VL(B)
y VH(B)-VL(A) dentro de una célula.
VL es el dominio variable (V) de la cadena ligera (L) y VH el
dominio variable (V) de la cadena pesada (H) de una
inmunoglobulina, uniéndose dichos dominios variables al antígeno (A)
y (B), respectivamente. La combinación de las partes VH con las
partes VL produce fragmentos heterodiméricos con sitios de unión
funcionalmente activos. "Diabodies" biespecíficos expresados
en bacterias ya han sido utilizados con éxito para el reclutamiento
de varias moléculas de efectores, inmunoglobulinas, C1q o enzimas o
células de efectores, tales como por ejemplo linfocitos T
citotóxicos (Kontermann et al., Nature Biotechnol. 15, 629
(1997); Holliger et al., Protein Engin. 9, 299 (1996);
Nature Biotechnol. 15, 632 (1997), Zhu et al., Biotechnol.
14, 192 (1996); FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221
(1997); Krebs et al., J. Biol. Chem. 273, 2858 (1998)).
Sin embargo, los "diabodies" adolecen de
los siguientes inconvenientes:
Puesto que las dos cadenas de
VH(A)-VL(B) y
VH(B)-VL(A) no están unidas
físicamente entre sí, pueden formarse tanto homo- como
heterodímeros, lo cual hace necesario un procedimiento de
purificación muy complicado para los heterodímeros. Además, se
produce una disociación de los dímeros, tal como ya se ha podido
demostrar para los fragmentos scFv (Glockshuber et al.,
Biochem. 29, 1362-1367 (1990)). Para solucionar este
problema, "diabodies" estabilizados con disulfuro (FitzGerald
et al., Protein Engin. 10, 1221-1225, 1997) o
"knob-into-hole diabodies"
(Zhu et al., Protein Sci. 6, 781-788, 1997)
han sido desarrollados. Sin embargo, su preparación está asociada a
grandes gastos. Además, la expresión de un "diabody"
biespecífico por ingeniería génica necesita una secuencia señal y
un sitio de unión ribosomal para cada cadena, lo cual resulta muy
complicado. Además de esto, es posible que se expresen cantidades
no equimolares de los dominios variables, aumentando la proporción
de los homodímeros no funcionales.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es encontrar moléculas monocadena con múltiples sitios de unión
para antígeno que no adolezcan de los inconvenientes descritos de
los denominados "Diabodies" y que puedan prepararse en su
mayoría de forma homogénea y de manera sencilla.
Por tanto, un objetivo de la presente invención
es proporcionar una molécula monocadena, con múltiples sitios de
unión para antígeno que contiene los siguientes componentes:
- a)
- un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una primera especificidad (A) y partes funcionales de la misma,
- b)
- un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con una segunda especificidad (B) y partes funcionales de la misma,
- c)
- un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con la especificidad (B) y partes funcionales de la misma
- d)
- un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con la especificidad (A) y partes funcionales de la misma,
estando unidos los dominios VH y VL
en forma de un constructo VH-VL o un constructo
VL-VH y estando unidos los constructos
VH-VL o constructos VL-VH a través
de dominios de la misma especificidad, caracterizada porque los dos
constructos VH-VL están unidos entre sí a través de
un péptido (P), y siendo las especificidades de (A) y (B)
distintas.
En otra forma de realización, la molécula según
la invención contiene más de dos de los constructos
VH-VL citados. Esto permite obtener moléculas que
contienen una pluralidad de especificidades (A), (B), (C), etc.
Una estructura particularmente preferida de una
molécula según la invención se ha representada en la Fig. 1.
En una forma de realización preferida, los
dominios VH y VL están unidos a través de un ligador peptídico (L)
en forma de un constructo VH-L-VL o
un constructo VL-L-VH. Por lo
general, dicho ligador debería ser lo más corto posible,
preferentemente entre aproximadamente 1 y 20 aminoácidos, en
particular 1-5 aminoácidos. Se prefieren en
particular los ligadores con la secuencia GGGGS.
Al contrario del ligador (L), el péptido de
unión (P) puede presentar cualquier longitud. Sin embargo, se
prefiere un péptido (P) con entre aproximadamente 12 y 40
aminoácidos, en particular con entre 12 y 20 aminoácidos,
especialmente con aproximadamente 14 aminoácidos. Se prefiere en
particular un péptido (P) que contiene la secuencia de aminoácidos
GGGGSGGRASGGGS o GGGGSGGRASGGGGS y en particular un péptido (P)
constituido por la secuencia de aminoácidos citada.
En otra forma de realización preferida, la
molécula según la invención contiene como componente adicional un
efector (E). Dicho efector puede estar unido a la molécula según la
invención directamente o a través de un elemento de unión (B). De
forma particularmente preferida, el elemento de unión (B) contiene
una secuencia segmentada por proteasa, preferentemente una
secuencia segmentada por PSA (antígeno específico para la próstata),
catepsina, plasminogéno y/o activadora de plasminógeno.
La secuencia segmentada por proteasa es
particularmente preferida porque permite separar el efector de la
molécula según la invención por medio de una proteasa. Dicha
separación es particularmente preferida cuando la unión directa o
indirecta mediada por el elemento de unión del efector a la molécula
según la invención inhibe la actividad del efector.
Puesto que las proteasas están presentes en
particular en las regiones de inflamaciones o en tumores, los
efectores inactivados preferentemente por su unión a la molécula
según la invención a través de una secuencia segmentada por
proteasa serán liberados allí localmente en mayor grado. Además, una
concentración de la molécula según la invención junto con el
efector en la región por ejemplo de una inflamación o de un tumor
puede conseguirse seleccionando estructuras diana para la molécula
según la invención, por ejemplo con una especificidad para
antígenos contra células tumorales, para antígenos contra células
endoteliales asociadas a un tumor o para antígenos contra células
de inflamación, tales como por ejemplo linfocitos o macrófagos.
Según la presente invención, también es posible
que varios efectores estén unidos a la molécula según la invención
directa o indirectamente.
Las proteasas o las secuencias de segmentación
asociadas se han indicado detalladamente por ejemplo en el documento
DE 19704301.1.
Un ejemplo de una molécula según la invención
preferida con un efector unido a la molécula a través de un
elemento de unión se ha representado esquemáticamente en la Fig.
2.
La selección de los componentes individuales de
la molécula según la invención depende, por lo general, del campo de
aplicación.
Si se quiere utilizar la molécula según la
invención como diagnóstico, la primera especificidad (A) está
dirigida, por ejemplo en otra forma de realización, contra una
molécula a analizar y la segunda especificidad (B) está dirigida
directa o indirectamente contra un analito. Por ejemplo, el analito
puede ser una molécula radiactiva, una molécula fluorescente o una
enzima que convierte un precursor de un analito en un analito activo
en virtud de su actividad enzimática.
En otra forma de realización preferida, la
primera especificidad (A) está dirigida contra una molécula a
analizar, la segunda especificidad (B) está dirigida contra otra
molécula a analizar y el efector (E) es un analito, por ejemplo una
molécula radiactiva, una molécula fluorescente y/o una enzima, tal
como se ha ilustrado ya anteriormente de forma detallada.
Sin embargo, la molécula según la invención
puede utilizarse también como ligando para la unión específica para
una célula diana de un vector viral o no viral. En una forma de
realización particular, la molécula según la invención puede
utilizarse como un denominado ligando multifuncional. A tal fin, es
ventajoso si el péptido (P) y/o el efector (E) contiene un péptido
fusiogénico. El ligando multifuncional sirve para la transferencia
específica para una célula diana de secuencias de nucleótidos y es
por lo general una proteína que contiene un ligando específico para
una célula diana, un ligando específico para un constructo de gen y
un péptido fusiogénico. Este tipo de ligandos multifuncionales
permite unir constructos de genes, es decir, constructos de ácido
nucleico, específicamente a una célula diana, mientras que el
péptido fusiogénico permite al constructo de ácido nucleico
penetrar por la membrana celular y llegar al núcleo celular y por
tanto también ser liberado del endosoma.
Al utilizarse la molécula según la invención
como ligando para un vector o como ligando multifuncional, resulta
ventajoso si la primera especificidad (A) está dirigida contra una
célula diana y la segunda especificidad (B) contra un vector. Por
lo general, el vector es un ácido nucleico, un péptido o proteína
catiónico, un lípido catiónico, un polímero catiónico o una
porfirina catiónica. En una forma de realización particular de la
presente invención, el vector es un vector viral derivado por
ejemplo de adenovirus (AdV), virus asociados a adeno (AAV), virus
vacunal, RSV, HSV, virus de influenza o lentivirus.
Ejemplos de ligandos específicos para una célula
diana, de estructuras de membrana en la célula diana, de ligandos
específicos para una célula diana y de ligandos específicos para
constructos de genes derivados de inmunoglobulinas, es decir, que
contienen dominios VH y VL, así como de péptidos con características
fusiogénicas se han descrito detalladamente en el documento DE
19649645.4.
La molécula según la invención es apta también
para la profilaxis y/o como agente terapéutico.
Con tal fin, la primera especificidad (A) está
dirigida por ejemplo contra una membrana celular, tal como por
ejemplo contra linfocitos, macrófagos, monocitos, granulocitos,
células hematopoyéticas, células endoteliales, células musculares
lisas, células musculares estriadas, células epiteliales, células de
hígado, células renales, células de la glía, células del tejido de
soporte, células tumorales o células de leucemia, o contra proteínas
de la matriz extracelular, del sistema complementaria, del sistema
de coagulación, del sistema quinina, del plasma sanguíneo, del
tejido de soporte, o contra citoquinas o quimioquinas, o contra
toxinas endógenas o exógenas o contra medicamentos, por ejemplo
digital, y/o contra agentes infecciosos, tales como por ejemplo
agentes infecciosos bacterianos, virales y/o parasitarios.
La segunda especificidad (B) puede estar
dirigida por ejemplo contra una membrana celular de por ejemplo
linfocitos, macrófagos, monocitos o granulocitos, con el resultado
de que su reticulación con una célula diana puede provocar allí
procesos citotóxicos, inmunomoduladores o inflamatorios.
Puede estar dirigida asimismo contra citoquinas,
quimioquinas o factores de crecimiento, con el resultado de que su
reticulación con una estructura diana puede iniciar allí procesos
inmunomoduladores o proliferativos. Puede estar dirigida también
contra proteínas del sistema complementario que inician, refuerzan o
inhiben su activación. La reticulación de una proteína de este tipo
con una estructura diana puede disparar allí reacciones
inflamatorias y citotóxicas o antiinflamatorias y citoprotectoras
según la proteína seleccionada. Puede estar dirigida también contra
proteínas del sistema de coagulación que inician, refuerzan o
inhiben su activación. La reticulación de una proteína de este tipo
con una estructura diana puede inducir o impedir trombosis según la
proteína seleccionada. Además, puede estar dirigida contra proteínas
fibrinolíticas que efectúan la disolución de una coagulación de
fibrina en la estructura diana, contra enzimas que son capaces de
convertir el precursor inactivo de un principio activo en un
principio activo, por ejemplo citotóxico, contra hormonas peptídicas
o hormonas esteroides, contra la parte constante de una
inmunoglobulina, contra un mediador, tal como por ejemplo
histamina, serotonina, leucotrieno, prostaciclina o quinina, contra
agentes infecciosos, tales como por ejemplo agentes infecciosos
bacterianos, virales y/o parasitarios o contra células
tumorales.
Citoquinas como estructuras diana o monocitos,
macrófagos y/o linfocitos como estructuras diana pueden ser
reticulados por la molécula según la invención con antígenos
infecciosos o tumorales, disparando de esta forma una reacción
inmune in vivo reforzada contra el antígeno. En dicho
proceso, resulta ventajoso adicionar a la molécula según la
invención el antígeno adecuado del agente infeccioso o del tumor y,
si se desea, también la citoquina y administrar el complejo
reticulado localmente o inyectarlo.
La segunda especificidad (B) puede estar
dirigida asimismo contra toxinas endógenas o exógneas, lo cual
permite efectuar o bien una neutralización de la toxina y una
fagocitosis o bien una reacción tóxica contra la estructura diana.
Además, puede estar dirigida contra medicamentos, tales como por
ejemplo digital, lo cual permite efectuar la formación de un
complejo con el medicamento y su eliminación.
En otra forma de realización preferida, la
molécula según la invención permite junto con el efector una
reticulación de dos estructuras diana idénticas o distintas con uno
o más efectores.
Entre los ejemplos de efectores aptos, se
incluyen un dominio transmembrana, un ancla de glicofosfolípido, la
parte de un receptor que se une al ligando; el ligando para un
receptor o la secuencia parcial del ligando que se une al receptor;
una hormona peptídica; una citoquina; un factor de crecimiento; un
inhibidor de un factor de crecimiento; una quimioquina; un
interferón; un mediador; un péptido activo para la circulación; una
enzima que convierte el precursor inactivo de un principio activo en
un principio activo; una proteína que activa o inhibe la
coagulación; una proteína que activa o inhibe la fibrinólisis; una
proteína que activa o inhibe el sistema complementario; uno o más
dominios constantes de una inmunoglobulina; un péptido citotóxico;
otra molécula monocadena con uno o múltiples sitios para antígeno,
en particular para dos antígenos, un antígeno tumoral o un antígeno
de un agente infeccioso, tal como por ejemplo un antígeno bacteriano
o un antígeno antiviral; un péptido que contiene cisteína para la
preparación de dímeros de la molécula según la invención y/o un
péptido de di- o multimerización (Plückthun y Pack, Innunotechnol.
3, 83-105 (1997)).
La presente invención se refiere también a un
ácido nucleico que codifica para una molécula según la invención.
El ácido nucleico es por lo general un ADN o ARN, preferentemente un
ADN de dos hebras.
Para la secreción opcionalmente deseada del
producto de expresión según la invención, el ácido nucleico según
la invención contiene una secuencia de nucleótidos en el extremo 5'
que codifica para una secuencia señal o transmembrana (ver por
ejemplo el documento DE 19639103.2 o DE 19651443.6). Un ejemplo de
secuencias señal o transmembranas es la secuencia señal para
inmunoglobulina (posición de ADN \leq 63 a \geq 107) la
secuencia señal para el CEA (posición de ADN \leq 33 a \geq 134)
o la secuencia señal del "Human Respiratory Syncytial Virus
Glycoprotein" (ADNc de las secuencias de aminoácidos \leq 38 a
\geq 50 ó 48 a 65).
En otra forma de realización preferida, el ácido
nucleico contiene un promotor y/o activador en el extremo 5'.
Preferentemente, el activador puede ser activado o suprimido
específicamente según la célula, específicamente según el ciclo
celular, específicamente según el metabolismo y/o por un principio
activo. Secuencias de activadores de este tipo, incluidas sus
combinaciones, se han descrito en los documentos EP97101507.8,
DE19617851.7, DE19639103.2, DE19651443.6, DE19704301.1,
EP97102547.3 y DE19710643.9. Constructos de ácidos nucleicos
particularmente preferidos según la invención se han representado
esquemáticamente en las Figs. 3 y 4.
\newpage
En una forma de realización preferida, el ácido
nucleico según la invención contiene la secuencia GCCACC o GCCGCC
en el extremo 5' del codón de iniciación, que puede producir un
refuerzo de la translación.
Otra forma de realización de la presente
invención se refiere a un vector que contiene el ácido nucleico
según la invención. Dicho vector puede ser un vector viral o no
viral, preferentemente un vector no viral, seleccionado en
particular de un lípido catiónico, un polímero catiónico, un péptido
catiónico o una porfirina catiónica.
Para la preparación de las moléculas según la
invención, se clona el ácido nucleico descrito en un vector de
expresión, por ejemplo en un plásmido adecuado, se introduce en una
célula adecuada, por ejemplo en una célula de bacteria, levadura,
insecto o mamífero, la célula así transformada y transfectada se
cultiva y el producto de expresión se aísla, si se desea. Los
métodos son conocidos por los expertos en la materia y se han
descrito por ejemplo en Sambrook J. et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Handbook 2ª Edición, Cold Spring Harbor
Laboratoy Press, 1989 con mayor detalle.
En una forma de realización particular de la
presente invención, dichas células expresan una molécula según la
invención por medio de un efector, siendo dicho efector
preferentemente un dominio transmembrana.
De este modo, por ejemplo, la secuencia de ADN
que codifica para la secuencia transmembrana del factor estimulador
de colonias de macrófagos humanos (posiciones de ADN \leq 1485 a
\geq 1554) o la secuencia de ADN que codifica para la región
señal y transmembrana del "Human Respiratory Syncytial Virus (RSV)
Glycoprotein G" (aminoácidos 1 a 63 o su secuencia parcial de
los aminoácidos 38 a 63) o la secuencia de ADN que codifica para la
región señal y transmembrana de la neuraminidasa del virus de
influenza (aminoácidos 7 a 35 o su secuencia parcial de los
aminoácidos 7 a 27) puede ser incluida entre la secuencia de
promotor y la secuencia de ADN de la molécula según la invención o
también en el extremo 3' del gen.
Sin embargo, para anclar el principio activo en
la membrana celular de las células que expresan la molécula según
la invención, puede incorporarse en el constructro del ácido
nucleico también una secuencia de nucleótidos que codifica para un
ancla de glicofosfolípido.
La incorporación de un ancla de glicofosfolípido
se lleva a cabo por lo general en el extremo 3' de la secuencia de
nucleótidos que codifica para la molécula según la invención y puede
llevarse a cabo además de la incorporación de una secuencia
señal.
Las anclas de glicofosolípidos se han descrito
por ejemplo para CEA, N-CAM y para otras proteínas
de membrana, tales como por ejemplo thi-1.
A través de dicha región transmembrana, la
célula correspondiente expresa la molécula según la invención en la
membrana celular, obteniendo de esta manera un "receptor" que
es específico para las estructuras diana y de efector reconocidas
por las partes con sitios de unión para antígeno de la molécula
según la invención.
Otro receptor preferido es el dominio de un
receptor que transduce la región transmembrana o la señal, por
ejemplo el receptor de células T o el receptor
M-CSF. Esto permite a la célula que expresa la
molécula según la invención en la membrana celular, por medio de su
unión con las estructuras diana, de activar funciones específicas.
Las funciones específicas de este tipo son por ejemplo reacciones
citotóxicas de linfocitos T, reacciones de fagocitosis de
macrófagos y granulocitos o reacciones exocitósicas de granulocitos,
monocitos y macrófagos.
Por tanto, la presente invención se refiere
asimismo a una célula que contiene un ácido nucleico según la
invención o un vector según la invención, en particular una célula
de bacteria, insecto, levadura o mamífero. Entre las células de
mamífero que son aptas, se incluyen, además de las células
generalmente conocidos para la expresión de ácidos nucleicos, tales
como por ejemplo las células CHO o BHK, también linfocitos,
macrófagos, células de la glía, células epiteliales, células de
hígado, células renales, células de la médula oséa, células
endoteliales, células musculares lisas y estriadas o
fibroplastos.
Estas últimas células son particularmente aptas
para una aplicación por terapia génica, puesto que dichas células,
que contienen el constructo de ácido nucleico, pueden inyectarse en
un paciente local o parenteralmente, por ejemplo por vía
intravenosa, intraarterial, en una cavidad corporal, en un órgano o
por vía subcutánea, para servir de esta forma como profilaxis o
terapia de una enfermedad.
Sin embargo, para el tratamiento de una
enfermedad por terapia génica, los constructos de ácido nucleico
pueden administrarse también directamente a un paciente por vía
local, a una cavidad corporal, a un órgano, al sistema de vasos
sanguíneos, por vía subcutánea o intramuscular.
Por tanto, la presente invención se refiere
asimismo a un medicamento que contiene una molécula según la
invención, un ácido nucleico según la invención, un vector según la
invención, o una célula según la invención así como a un
diagnóstico que contiene una molécula según la invención, que puede
estar dirigida también contra un analito, tal como ya se ha
descrito con mayor detalle anteriormente.
\newpage
Por tanto, la molécula según la invención, el
ácido nucleico según la invención, el vector según la invención o
la célula según la invención son aptos para la terapia, profilaxis o
diagnóstico de por ejemplo enfermedades tumorales, enfermedades
autoinmunes, enfermedades de inflamación, enfermedades de la sangre,
en particular del sistema de coagulación sanguínea y/o circulación
sanguínea, enfermedades del sistema nervioso y/o enfermedades
infecciosas.
La selección de los componentes individuales
depende por lo general de la utilización de los objetos de la
invención. A continuación, los componentes individuales y su
utilización general se describirán con mayor detalle haciendo
referencia a ejemplos.
Para la preparación de un objeto según la
invención, puede unirse el constructo de ácido nucleico según la
invención, tal como ya se ha representado a título de ejemplo en las
Figuras 3 y 4, por su extremo 5' al extremo 3' de un ácido nucleico
que codifica para una secuencia señal, y éste puede unirse por su
extremo 5' al extremo 3' de una secuencia de promotor.
Entre los ejemplos de las secuencias de promotor
que se deben seleccionar, se incluyen secuencias de promotores y
activadores que son activables sin restricción, tales como por
ejemplo el promotor de la polimerasa III de ARN, el promotor de la
polimerasa II de ARN, le promotor y/o mejorador CMV, el promotor
SV40, o secuencias de promotor y activador virales, tales como por
ejemplo HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, VIH.
Al utilizar el promotor VIH, se prefiere
utilizar, como promotor específico del virus, la secuencia de LTR
entera, incluida la secuencia de TAR [posiciones \leq -453 a
\geq -80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)].
Entre los ejemplos de otras secuencias de
promotores a seleccionar, se incluyen secuencias de promotor y
mejorador, tales como por ejemplo mejoradores inducibles por
hipoxia, promotores activables específicamente para el ciclo
celular, tales como por ejemplo el promotor del gen cdc25C, del gen
cdc25B, del gen de ciclina A, del gen cdc2, del gen
B-myb, del gen DHFR o del gen E2F-1
o, alternativamente, secuencias de unión para factores de
transcripción que ocurren o son activados específicamente del ciclo
celular. Entre los ejemplos de dichas secuencias de unión, se
incluyen las para las proteínas c-myc. Entre dichas
secuencias de unión, se incluyen monómeros o multímeros de la
secuencia de nucleótidos
[5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3']
denominada Myc E-Box.
Otros ejemplos de secuencias de promotores que
se deben seleccionar son promotores activables por tetraciclina,
tales como por ejemplo el operador de tetraciclina en combinación
con un represor correspondiente o promotores quimeras. Un promotor
quimera representa la combinación de una secuencia de activador
situada corriente arriba y activable específicamente para células,
el metabolismo o los virus con un módulo de promotor situado
corriente abajo que contiene la secuencia de nucleótidos
CDE-CHR o E2FBS-CHR, al cual están
unidas proteínas supresoras, que son capaces de inhibir de esta
forma la activación con la secuencia de activador situada corriente
arriba en las fases G_{0} y G_{1} del ciclo celular (WO
96/06943; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).
Entre los ejemplos de otras secuencias de
promotor que se debe seleccionar, se incluyen promotores activables
específicamente de células, tales como preferentemente promotores o
secuencias de activadores procedentes de promotores o mejoradores
de genes que codifican para proteínas formadas preferentemente en
células seleccionadas.
Por ejemplo, para los fines de la invención,
deben utilizarse en las siguientes células preferentemente
promotores para las siguientes proteínas:
Secuencias de promotores y activadores activadas
en células endoteliales son secuencias reguladoras de genes que
proceden de genes que codifican por ejemplo para las siguientes
proteínas: transportador de glucosa-1 endotelial,
específico del cerebro, endoglina, el receptor
VEGF-1 (flt-1), el receptor
VEGF-2 (flk-1, KDR),
til-1 o til-2, el receptor B61
(receptor ECK), B61, endotelina, específicamente
endotelina-B o endotelina-1,
receptores de endotelina, en particular el receptor de
endotelina-B, reecptores de
manosa-6-fosfato, del factor
Willebrand, el receptor IL-1\alpha,
IL-1\beta, el receptor de IL-1,
"Vascular Cell Adhesion Molecule" (VCAM-1) o
secuencias de activadores sintéticas constituidas por sitios de
unión oligomerizados para factores de transcripción, que son
activos preferentemente o selectivamente en células endoteliales. Un
ejemplo de éstos es el factor de transcripción
GATA-2, cuyo sitio de unión en el gen de
endotelina-1 es
5'-TTATCT-3'.
Los promotores o secuencias de activadores que
son activados en células en la proximidad de células endoteliales
son secuencias reguladoras de genes que proceden de genes que
codifican por ejemplo para las siguientes proteínas: VEGF, en las
que las secuencias reguladoras del gen para el gen VEGF son la
región que flanquea 5', la región que flanquea 3', el gen
c-Src o el gen v-Src, o receptores
de hormonas esteroides y sus elementos de promotor, en particular el
promotor del virus del tumor de mama murino.
Los promotores o secuencias de activadores que
son activados en células musculares, en particular en células
musculares lisos, son secuencias reguladoras de genes que proceden
de genes que codifican por ejemplo para las siguientes proteínas:
tropomiosina, \alpha-actina,
\alpha-miosina, el receptor para PDGF, el receptor
para FGF, MRF-4, fosfofructoquinasa A,
fosfogliceratomutasa, troponina C, miogenes, receptores para
endotelina A, desmina, VEGF (ver anteriormente), promotores
"artificiales" o promotores de factores de transcripción
específicos de músculos, tales como los factores de la familia
"Helix-Loop-Helix" (HLH) (MyoD,
Myf-5, miogenes, MRF4) o la proteína para dedos de
cinc GATA-4.
Las proteínas HLH así como
GATA-4 presentan una transcripción específica para
los músculos no sólo con los promotores de genes específicos para
músculos, sino también en un contexto heterólogo, por ejemplo
también con los promotores artificiales. Los promotores
artificiales de este tipo son por ejemplo copias múltiples del
sitio de unión (de ADN) para las proteínas HLH específicas para
músculos, tal como el "E-Box (Myo D)" (por
ejemplo 4x AG
CAGGTGTTGGGAGGC) o copias múltiples del sitio de unión de ADN para GATA-4 del "\alpha-Myosin Heavy Chain Gene" (por ejemplo 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3').
CAGGTGTTGGGAGGC) o copias múltiples del sitio de unión de ADN para GATA-4 del "\alpha-Myosin Heavy Chain Gene" (por ejemplo 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3').
Los promotores y secuencias de activadores que
son activados en las células de la glía son por ejemplo secuencias
reguladoras de genes que codifican por ejemplo para las siguientes
proteínas: la proteína periaxina especifica para las células de
Schwann, glutaminsintetasa, la proteína específica para las células
de la glía (Glial fibrillary acid protein = GFAP), la proteínas de
las células de la glía S100b, IL-6, CNTF, receptores
de 5-HT, TNF\alpha, IL-10,
"Insulin-like Growth Factor I and II" o VEGF
(ver arriba).
Los promotores o secuencias de activadores que
son activados en células formadoras de sangre son por ejemplo
secuencias de promotores para los genes de una citoquina o de su
receptor que son expresadas en células hematopoyéticas o en células
adyacentes, tales como, por ejemplo, el estroma.
Entre estos, se incluyen secuencias de
promotores que proceden de genes que codifican por ejemplo para las
siguientes citoquinas y sus receptores: "Stern Cell Factor
Receptor", "Stern Cell Factor",
IL-1\alpha, receptor de IL-1,
IL-3, receptor de IL-3
(\alpha-subunit), receptor de IL-3
(\beta-subunit), IL-6, receptor de
IL-6, GM-CSF, receptor de
GM-CSF (cadena \alpha), "Interferon Regulatory
Factor 1" (IRF-1), siendo activado el promotor
de IRF-1 por IL-6 igual que por
IFN\gamma o IFN\beta, eritropoyetina o el receptor de
eritropoyetina.
Los promotores y secuencias de promotores que
son activados en linfocitos y/o macrófagos son por ejemplo las
secuencias de promotores y activadores de genes que codifican para
citoquinas, receptores de citoquinas y moléculas de adhesión y
receptores para el fragmento Fc de anticuerpos, tales como por
ejemplo receptor de IL-1,
IL-1\alpha, IL-1\beta,
IL-2, receptor de IL-2,
IL-3, receptor de IL-3
(\alpha-subunit), receptor de
IL-3 (\beta-subunit),
IL-4, el receptor de IL-4,
IL-5, IL-6, el receptor de
IL-6, "Interferon Regulatory Factor 1"
(IRF-1), siendo activado el promotor de
IRF-1 por IL-6 igual que por
IFN\gamma o IFN\beta, IFN\gamma Responsive Promotor,
IL-7, IL-8, IL-10,
IL-11, IFN\gamma, GM-CSF, el
receptor de GM-CSF (cadena \alpha),
IL-13, LIF, el receptor de "Macrophage Colony
Stimulating Factor" (M-CSF), receptores del
"Macrophage Scavenger" tipos I y II, MAC-1
(antígeno de la función de leucocitos),
LFA-1\alpha (antígeno de la función de
leucocitos), o p150,95 (antígeno de la función de leucocitos).
Los promotores y secuencias de activadores que
son activados en células sinoviales son por ejemplo las secuencias
de promotores de genes que codifican para metaloproteinasas de
matriz (MMP), tales como por ejemplo MMP-1
(colagenasa intersticial), MMP-3
(estromelisina/transina) o "Tissue Inhibitors of
Metalloproteinases" (TIMP), tales como TIMP-1,
TIMP-2, TIMP-3.
Los promotores y secuencias de activadores que
son activados en células leucémicas son por ejemplo los promotores
de genes que codifican para las siguientes proteínas:
HSP-70, bcl-1/ciclina
D-1, bcl-2, IL-6,
IL-10, TNF\alpha, TNF\beta,
HOX-11, BCR-Abl,
E2A-PBX-1, PML-RAR
("Promyelocytic Leucemia - Retinoic Acid Receptor") o proteínas
c-myc, uniéndose las proteínas myc a multímeros de
la secuencia de nucleótidos denominada "Myc
E-Box"
(5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3')
activándolos.
Los promotores o secuencias de activadores que
son activados en células tumorales son, por ejemplo, secuencias de
nucleótidos reguladoras de genes utilizadas para formar factores de
transcripción o para interactuar con los mismos activamente en
células tumorales.
Para los fines de la invención, entre los
promotores o secuencias de activadores preferidos, se incluyen
secuencias reguladoras de genes o elementos de genes que codifican
en particular para proteínas formadas en células cancerígenas o
células de sarcoma. De este modo, para los carcinomas bronquiales de
células pequeñas, se utiliza preferentemente el promotor de la
proteína N-CAM, mientras que para los carcinomas
ováricos se utiliza preferentemente el promotor del receptor
"Hepatitis growth factor" o de la L-plastina y
para los carcinomas pancreáticos el promotor de la
L-plastina o de la mucina polimorfa epitelial
(PEM).
Una ventaja esencial de la presente invención
radica en que la unión de los componentes individuales favorece una
asociación heterodimérica, con lo cual se forman predominantemente
moléculas monocadena con múltiples sitios de unión para antígeno.
Además, se reduce la disociación de los dímeros, tal como ya se ha
podido demostrar para los fragmentos scFv (ver por ejemplo
Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367
1990). Por lo tanto, las moléculas según la invención pueden
prepararse de forma menos complicada y en forma más homogénea que
los denominados "Diabodies", incluso cuando estos últimos se
han estabilizados por uniones de disulfuro o están presentes en
forma de "knob-into-hole
diabodies".
Además, para la preparación de la molécula según
la invención se necesita solamente una secuencia señal y un sitio
de unión ribosomal (RBS). Al contrario de esto, para los
"Diabodies" según la invención, se necesitan una secuencia
señal y un RBS para cada cadena. Otra ventaja de la invención
consiste en que con las moléculas según la invención se expresan
cantidades equimolares de los dominios variables, mientras que en la
expresión de las dos cadenas de los "Diabodies" no pueden
formarse cantidades equimolares, por lo cual se aumenta la
proporción de los homodímeros no funcionales.
Otra ventaja de la molécula según la invención
radica en que la molécula según la invención puede expresarse de
forma sencilla y funcional tanto en bacterias como en levaduras,
baculovirus así como en células eucariotas. A esto se añade que,
además de la secreción de las moléculas según la invención, existe
la posibilidad de expresarlas también de forma intracelular o
intramembrana (ver, por ejemplo, Biocca & Cattaneo, Trends Cell
Biol. 5, 248-252 (1995)).
Otra ventaja de la molécula según la invención
consiste en que puede utilizarse ampliamente no sólo como
diagnóstico sino también como principio activo para la profilaxis
y/o terapia de una enfermedad, igual que los anticuerpos
biespecíficos.
Los genes de efectores y secuencias de
promotores deben seleccionarse en vistas de la aplicación deseada y
teniendo en cuenta la célula diana a transducir. Por ejemplo, en las
siguientes enfermedades, deben seleccionarse las siguientes
combinaciones de secuencias de promotores y genes para los
efectores:
Para la terapia de tumores, las células que
sirven de células diana son, por ejemplo, células endoteliales de
proliferación o células estromáticas adyacentes a la célula
endotelial y células musculares o células tumorales o células
leucemias y los promotores son por ejemplo promotores específicos
para células endoteliales y específicos para el ciclo celular, o no
específicos para células o específicos para células musculares y
específicos para el ciclo celular o específicos para células
tumorales (tumores sólidos, leucemias) y específicos para el ciclo
celular, y los genes que sirven de efectores son por ejemplo los
siguientes:
Genes de inhibidores de la proliferación de
células son por ejemplo los de la proteína de retinoblastoma
(pRb=p110) o las proteínas relacionadas p107 y p130. La proteína de
retinoblastoma (pRb/p110) y las proteínas relacionadas p107 y p130
son desactivadas por fosforilación. Los genes utilizados
preferentemente son los de inhibidores del ciclo celular que
presentan mutaciones para los sitios de desactivación de las
proteínas expresadas, sin que por ello los mismos queden
perjudicados en su función. Ejemplos de dichas mutaciones se han
descrito para la proteína p110. De forma análoga, se muta la
secuencia de ADN para la proteína p107 o la proteína p130. Otro gen
apto es el de la proteína p53. La proteína p53 se desactiva dentro
de la célula o bien por unión a proteínas especiales, tal como por
ejemplo MDM2, o por oligomerización de la proteína p53 a través de
la serina desfosforilada en el extremo C-terminal.
Por tanto, preferentemente se utilizará una secuencia de ADN para
la proteína p53 que se ha acortado en el extremo
C-terminal por la serina 392. Otros genes aptos son
el gen de p21 (WAF-1), de la proteína p16, de otros
inhibidores cdk, de la proteína GADD45 o de la proteína bak.
Entre los ejemplos de los genes de los factores
que inducen la coagulación e inhibidores de la angiogénesis, se
incluyen los del inhibidor 1 del activador de plasminógeno
(PAI-1), PAI-2,
PAI-3, angioestatina, interferones (IFN\alpha,
IFN\beta o IFN\gamma), platelet factor 4, IL-12,
TIMP-1, TIMP-2,
TIMP-3, "Leukemia Inhibitory Factor" (LIF) o
"Tissue Factor" (TF) y sus fragmentos coaguloactivos.
Entre los ejemplos de los genes de proteínas
citoestáticas y citotóxicas, se incluyen los de perforina, grancima,
IL-2, IL-4, IL-12,
interferones, tales como por ejemplo IFN\alpha, IFN\beta o
IFN\gamma, TNF, tales como TNF\alpha o TNF\beta, oncoestatina
M, sfingomielinasa o magainina y derivados de magainina.
Entre los ejemplos de los genes de inductores de
inflamación, se incluyen IL-1,
IL-2, RANTES (MCP-2) monocyte
chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8,
macrophage inflammatory protein 1 (MIP-1\alpha,
-\beta), neutrophil activating protein-2
(NAP-2), IL-3, IL-5,
human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-7,
IL-11, IL-13,
GM-CSF, G-CSF,
M-CSF, Cobra venom factor (CVF) o secuencias
parciales de CVF que corresponden funcionalmente al factor
complementario humano C3b, es decir, las que son capaces de unirse
al factor complementario B y, tras ser segmentado por el factor D,
representa una convertasa C3, el factor complementario humano C3 o
su secuencia parcial C3b, los de productos de segmentación del
factor complementario humano C3, que se parecen funcional y
estructuralmente al CVF, o los de proteínas bacterianas que activan
el complemento o iniciar inflamaciones, tales como por ejemplo las
porinas de salmonella typhimurium, factores "clumping"
de staphylococcus aureus, modulinas, en particular las de
bacterias gram-negativas, "Major outer membrane
protein" de legionelas o de Haemophilus influenzae tipo B
o de Klebsielas o moléculas M de grupo G estreptococci.
Entre los ejemplos de los genes de enzimas para
la activación de los precursores de citoestáticos, se incluyen
enzimas que segmentan los precursores inactivos
(prodrugs=profármacos) en citoestáticos activos. Las sustancias de
este tipo y los profármacos y fármacos asociados a las mismas ya han
sido descritos por Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786
(1994)), Mullen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) y Harris et
al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) de forma sinóptica. Por ejemplo,
la secuencia de ADN de una de las siguientes enzimas puede
utilizarse: timidinquinasa del virus de Herpes Simplex,
timidinquinasa del virus de varicela-zoster,
nitroreductasa bacteriana, \beta-glucuronidasa
bacteriana, \beta-glucuronidasa vegetal procedente
de Secale cereale (centeno),
\beta-glucuronidasa humana, carboxipeptidasa
humana (CB), por ejemplo CB-A de mastocitos,
CB-B del páncreas o carboxipeptidasa bacteriana,
\beta-lactamasa bacteriana, citosindeaminasa
bacteriana, catalasa o peroxidasa humana, fosfatasa, en particular
fosfatasa alcalina humana, fosfatasa ácida prostática humana o tipo
5 fosfatasa humana, oxidasa, en particular lisiloxidasa humana o
D-aminoácido oxidasa humana, en particular
glutatión peroxidasa humana, peroxidasa eosinófila humana o
peroxidasa tiroide humana, \beta-galactosidasa o
\alpha-galactosidasa. Para la conversión del
profármaco
daunomicina-\beta-D-galactopiranósido
en el citoestático daunomicina es particularmente preferida una
\beta-galactosidasa.
Entre los ejemplos de células diana que sirven
para la terapia de las enfermedades autoinmunes e inflamaciones se
incluyen células endoteliales de proliferación o macrófagos y/o
linfocitos o células sinoviales, entre los ejemplos de promotores,
se incluyen promotores específicos para células endoteliales y
específicos para el ciclo celular, o específicos para macrófagos
y/o linfocitos y/o específicos para el ciclo celular o específicos
para células sinoviales y/o específicos para el ciclo celular y
entre los ejemplos de genes, se incluyen los siguientes genes:
Genes para la terapia de alergias, por ejemplo
IFN\beta, IFN\gamma, IL-10, anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos contra IL-4, receptores
de IL-4 solubles, IL-12 o
TGF\beta.
Genes para la prevención y represión de órganos
trasplantados, por ejemplo IL-10, TGF \beta,
receptores de IL-1 solubles, receptores de
IL-2 solubles, antagonistas de receptores de
IL-1 o receptores de IL-6
solubles.
Genes para la terapia de enfermedades
autoinmunes mediadas por anticuerpos, por ejemplo los de TGF\beta,
IFN\alpha, IFN\beta, IFN\gamma, IL-12,
receptores de IL-4 solubles, receptores de
IL-6 solubles, anticuerpos inmunosupresivos o sus
fragmentos que contienen V_{H} y V_{L}.
Genes para la terapia de enfermedades
autoinmunes mediadas por células, por ejemplo los de
IL-6, IL-9, IL-10,
IL-13, TNF\alpha o TNF\beta,
IL-13, anticuerpos inmunosupresivos o sus fragmentos
que contienen V_{H} y V_{L}.
Los genes de los inhibidores de la proliferación
celular, proteínas citoestáticas y citotóxicas y enzimas de los
precursores de citoestáticos ya han sido descritos con mayor detalle
anteriormente.
Genes para la terapia de la artritis, por
ejemplo genes estructurales cuya proteína expresada inhibe la
inflamación por ejemplo en las articulaciones directa o
indirectamente y/o promociona la reconstitución de la matriz
extracelular (cartílago, tejido conjuntivo) en la articulación.
Entre estos, se incluyen por ejemplo el
antagonista del receptor de IL-1
(IL-1-RA), puesto que
IL-1-RA inhibe la unión de
IL-1\alpha, \beta; el receptor de
IL-1 soluble, puesto que el receptor de
IL-1 soluble se une a IL-1 y lo
desactiva; IL-6, puesto que IL-6
aumenta la secreción de TIMP y superóxidos y disminuye la secreción
de IL-1 y TNF\alpha por las células sinoviales y
los condrocitos; el receptor de TNF soluble, puesto que el receptor
de TNF soluble se une a TNF y lo desactiva; IL-4,
puesto que IL-4 inhibe la formación y secreción de
IL-1, TNF\alpha y MMP; IL-10,
puesto que IL-10 inhibe la formación y secreción de
IL-1, TNF\propto y MMP y aumenta la secreción de
TIMP; insulin-like growth factor
(IGF-1), puesto que IGF-1 estimula
la síntesis de la matriz extracelular; TGF\beta, especialmente
TGF\beta1 y TGF\beta2, puesto que TGF\beta estimula la
síntesis de la matriz extracelular; superóxidodismutasa o TIMP,
especialmente TIMP-1, TIMP-2 o
TIMP-3.
Para la terapia de una formación deficiente de
células sanguíneas, entre los ejemplos de células que sirven de
células diana, se incluyen células inmaduras de proliferación del
sistema hematopoyético o células estromáticas adyacentes a las
células hematopoyéticas, entre los ejemplos de promotores se
incluyen unos promotores específicos para células hematopoyéticas
y/o específicos para el ciclo celular, o no específicas para células
y específicos para el ciclo celular, y, entre los ejemplos de genes
que sirven de efectores, se incluyen los siguientes genes: genes
para la terapia de anemia, por ejemplo genes de eritropoyetina.
Genes para la terapia de leucopenia, por ejemplo
genes de G-CSF, GM-CSF o
M-CSF.
Genes para la terapia de trombocitopenia, por
ejemplo genes de IL-3, Leukemia Inhibitory Factor
(LIF), IL-11 o trombopoyetina.
Para la terapia de daños del sistema nervioso,
se incluyen, entre los ejemplos de células que sirven de células
diana, células de la glía o células endoteliales de proliferación,
entre los ejemplos de promotores, se incluyen promotores
específicos para células de la glía y específicos para el ciclo
celular, o específicos para células endoteliales y específicos para
el ciclo celular, o no específicas y específicos para el ciclo
celular, y, entre los ejemplos de genes que sirven de efectores, se
incluyen los siguientes genes:
Genes para los factores de crecimiento
neuronales, por ejemplo genes de FGF, Nerve growth factor (NGF),
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF),
neurotropina-3 (NT-3),
neurotropina-4 (NT-4) o Ciliary
neurotrophic factor (CNTF).
Genes para enzimas, por ejemplo genes de
tirosinhidroxilasa o dopadecarhoxilasa.
Genes para citoquinas y sus inhibidores que
inhiben o neutralizan la acción neurotóxica de TNF\alpha, por
ejemplo TGF\beta; genes de receptores de TNF solubles, puesto que
los receptores de TNF neutralizan TNF\alpha; genes de
IL-10, puesto que IL-10 inhibe la
formación de IFN\gamma, TNF\alpha, IL-2 y
IL-4; genes de receptores de IL-1
solubles, tal como el receptor de IL-1 I o el
receptor de IL-1 II, puesto que los receptores de
IL-1 solubles neutralizan la actividad de
IL-1; genes del antagonista de receptores de
IL-1 solubles o de receptores de
IL-6 solubles.
Para la terapia de disfunciones del sistema de
coagulación y circulación sanguíneos, se incluyen, entre los
ejemplos de células que sirven de células diana, células
endoteliales, células endoteliales de proliferación, células
somáticas adyacentes a células endoteliales y células musculares
lisas o macrófagos, entre los ejemplos de promotores, se incluyen
promotores no específicos para células y específicos para el ciclo
celular, o específicos para células endoteliales, células
musculares lisas o macrófagos y específicos para el ciclo celular,
y, entre los ejemplos de genes que sirven de efectores, se incluyen
los siguientes genes:
Genes para la inhibición de la coagulación o
para la promoción de la fibrinólisis, por ejemplo genes del Tissue
Plasminogen Activator (tPA), "Urokinase-type
Plasminogen Activator" (uPA); genes de híbridos de tPA y uPA, de
la proteína C, hirudina, de inhibidores de serinproteinasa
(serpinas), tales como por ejemplo el inhibidor de
C-1S, \alpha1-antitripsina o
antitrombina III, o del Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI).
Genes para la promoción de la coagulación, por
ejemplo genes de F VIII, F IX, de Willebrand factor, F XIII,
PAI-1, PAI-2 o "Tissue Factor"
y fragmentos del mismo.
Genes para factores de angiogénesis, por ejemplo
genes de VEGF o FGF.
Genes para disminuir la tensión sanguínea, por
ejemplo genes de kalikreina o "nitric oxide synthase" de
células endoteliales.
Genes para la inhibición de la proliferación de
las células musculares lisas tras lesiones de la capa endotelial,
por ejemplo genes de una proteína antiproliferativa, citoestática o
citotóxica o de una enzima para la segmentación de precursores de
citoestáticos en citoestáticos, tales como las que ya se han citado
anteriormente, o de una proteína de fusión de uno de dichos
principios activos con un ligando, por ejemplo un anticuerpo o
fragmentos de un anticuerpo específico para células musculares.
Genes para otras proteínas del plasma sanguíneo,
por ejemplo genes de albúmina, desactivador de C1, colinesterasa de
suero, transferina o 1-antitripsina.
Entre los ejemplos de células que sirven de
células diana para vacunaciones, se incluyen células musculares o
macrófagos y/o linfocitos, entre los ejemplos de promotores, se
incluyen promotores no específicos y específicos para el ciclo
celular o específicos para células diana y específicos para el ciclo
celular, y, entre los ejemplos de efectores, se incluyen genes para
la profilaxis de enfermedades infecciosas.
El principio activo seleccionado es por lo
general el ADN de una proteína formada por el agente infeccioso, lo
cual, como resultado de una reacción inmune, es decir, la unión con
anticuerpos, y/o por medio de linfocitos T citotóxicos, conduce a
la neutralización o eliminación del agente infeccioso. Los
denominados antígenos de neutralización de este tipo ya se están
utilizando como antígenos de vacunación (ver por ejemplo Ellis, Adv.
Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Para los fines de la invención, se prefiere un
ácido nucleico que codifica para los antígenos de neutralización de
los siguientes agentes infecciosos: virus de influenza A, VIH, virus
de la rabia, HSV (Herpes Simplex Virus), RSV (Respiratory Syncytial
Virus), virus de parainfluenza, rotavirus, VZV (virus de la
varicela-zoster), CMV (citomegalovirus), virus del
sarampión, HPV (virus de papiloma humano), HBV (virus de hepatitis
B), HCV (virus de hepatitis C), HDV (virus de hepatitis D), HEV
(virus de hepatitis E), HAV (virus de hepatitis A), antígeno del
Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori o
antígeno de la malaria.
Entre los principios activos de este tipo para
los fines de la invención, se encuentra también el ADN de un
anticuerpo antiidiotípico o de sus fragmentos con sitios de unión
para antígeno, cuyas estructuras de unión a antígenos
("complementary determining regions") representan copias de la
estructura de proteína o carbohidrato del antígeno de
neutralización del agente infeccioso (ver arriba).
Los anticuerpos antiidiotípicos de este tipo y
sus productos de segmentación pueden reemplazar en particular
antígenos de carbohidrato en los agentes infecciosos bacterianos y
se han descrito de forma sinóptica por ejemplo en Hawkins et
al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) y en Westerink y Apicella
(Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)).
Entre los ejemplos de otros efectores, se
incluyen los genes de "vacunas antitumorales". Incluyen
antígenos contra células tumorales, tal como han sido representados
de forma sinóptica por ejemplo por Sedlacek et al., Contrib.
to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43,
Karger Verlag, Munich (1992).
Otros ejemplos son los genes de los siguientes
antígenos o de los siguientes anticuerpos antiidiotípicos: Sialyl
Lewis; péptidos contra tumores reconocidos por células T; proteínas
expresadas por oncogenes; antígenos de grupos sanguíneos y sus
precursores; antígenos contra mucina polimorfa epitelial; o
antígenos contra Heat Shock Proteins.
Entre los ejemplos de células que sirven de
células diana para la terapia de enfermedades infecciosas crónicas,
se incluyen células del hígado, linfocitos y/o macrófagos, células
epiteliales o células endoteliales, entre los ejemplos de
promotores, se incluyen promotores específicos para virus o
específicos para células y específicos para el ciclo celular, y,
entre los ejemplos de efectores, se incluyen los siguientes
genes:
Genes que codifican para una proteína que
presenta efectos citoestáticos, apoptóticos o citotóxicos o que
codifican para una enzima que segmenta un precursor de una sustancia
antiviral o citotóxica en la sustancia activa.
Genes que codifican para proteínas, tales como
citoquinas de acción antiviral, y factores del crecimiento, tales
como por ejemplo IFN\alpha, IFN\beta, IFN\gamma, TNF\beta,
TNF\alpha, IL-1 o TGF\beta, anticuerpos de una
especificidad que desactiva el virus correspondiente o sus
fragmentos que contienen V_{H} y V_{L} o sus fragmentos V_{H}
y V_{L} unidos a través de un ligador, tal como ya se ha descrito.
Entre los ejemplos anticuerpos contra antígenos virales, se
incluyen: anti-HBV, anti-HCV,
anti-HSV, anti-HPV,
anti-VIH, anti-EBV,
anti-HTLV, anticuerpos contra el virus Coxsackie o
anticuerpos contra el virus Hantaan.
Otra proteína que presenta una acción antiviral
es una proteína que se une a Rev. Dichas proteínas se unen al
Rev-ARN e inhiben etapas de postranscripción de la
expresión de genes retrovirales dependientes de Rev. Entre los
ejemplos de proteínas que se unen a Rev, se incluyen:
RBP9-27, RBP1-8U,
RBP1-8D o pseudogenes de RBP1-8.
Genes que codifican para proteínas
antibacterianas, tales como por ejemplo anticuerpos que neutralizan
toxinas bacterianas u opsonizan bacterias. Entre los ejemplos de
éstos, se incluyen anticuerpos contra los meningococci C o B, E.
coli, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylori o
Staphylococcus aureus.
Las siguientes figuras y ejemplos sirven para
ilustrar la invención con mayor detalle, sin limitarla a los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
la Fig. 1 describe esquemáticamente la
estructura de una molécula monocadena con dos sitios de unión para
antígeno
la Fig. 2 describe esquemáticamente la
estructura de una molécula monocadena con dos sitios de unión para
antígeno junto con un efector
las Figs. 3 y 5 describen esquemáticamente
constructos de ácidos nucleicos que codifican para una molécula
monocadena con dos sitios de unión para antígeno
la Fig. 4 describe esquemáticamente constructos
de ácidos nucleicos que codifican para una molécula monocadena con
dos sitios de unión para antígeno junto con un efector
la Fig. 6 muestra el reclutamiento de
\beta-galactosidasa en CEA unido a plástico por la
proteína monocadena según la invención, con dos sitios de unión
para antígeno (scDb-CEAGal) en comparación con
diabodies contra CEA y \beta-galactosidasa de
E. coli (CEAGal). Como control negativo, se recubrió una
placa microtítulo con BSA.
la Fig. 7 muestra el reclutamiento de
\beta-galactosidasa por
scDb-CEAGal, que fue secretado por células de
mamífero, utilizándose cantidades distintas de
scDb-CEAGal y \beta-galactosidasa
en placas microtítulo recubiertas con CEA. El substrato utilizado
era
o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido.
Como control negativo, se recubrió una placa microtítulo con
BSA.
la Fig. 8a muestra la muerte de células LoVo en
presencia de la proteína monocadena según la invención, con dos
sitios de unión para antígeno (scDbl),
\beta-galactosidasa (\beta-gal),
daunomicina-\beta-D-galactopiranósido
(profármaco) y/o daunomicina (fármaco).
la Fig. 8B muestra experimentos de control con
una línea celular CEA-negativa (A549).
La preparación de una proteína monocadena, con
dos sitios de unión para antígeno se representa tomando, a título
de ejemplo, una proteína que reconoce los antígenos
"Carcinoembryonic Antigen" (CEA) y E. coli
\beta-galactosidasa:
Las siguientes secuencias de ADN se juntaron en
la dirección de 5' a 3' de la siguiente manera:
- -
- Promotor LacZ
- -
- Estructura de unión ribosomal bacteriana (AAGGAG)
- -
- Secuencia señal bacteriana pelB (Power et al., Gene 113, 95-99 (1992))
- -
- VH-anti-CEA (Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137 (1997))
- -
- Ligador GGGS (Kontermann et al., (1997))
- -
- VL-anti-\beta-galactosidasa (Kontermann et al., (1997))
- -
- Péptido conector GGGGSGGRASGGGGS
- -
- VH-anti-\beta-galactosidasa (Kontermann et al., (1997))
- -
- Ligador GGGGS
- -
- VL-anti-CEA(Kontermann et al., (1997))
- -
- Epítope myc para el anticuerpo 9E10 EQKLISEEDLN (Munro & Pelham, Cell 46, 291-300 (1986))
- -
- Polihistidina HHHHHH para la purificación con IMAC (Kontermann et al., (1997))
\vskip1.000000\baselineskip
La unión del constructo era posible a través de
sitios de restricción adecuados que se llevaron en adelante por
amplificación PCR en los términos de las secuencias de ADN distintas
(Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137 (1997)).
La unión se realizó por medio de las enzimas y
ligasas de ADN especificas para los sitios de restricción y
conocidas por los expertos en la materia. Las enzimas pueden
comprarse. El constructo se clonó en el vector de expresión pAB1
(Kontermann et al., (1997)).
Para la clonación, se utilizaron los cebadores
de oligonucleótidos LMB2 y LMB3 (Kontermann R.E., (1997),
supra) así como
y
Con este fin, se amplificaron los fragmentos
VHB-VLA (fragmento 1) y VHA-VLB
(fragmento 2) a partir del "Diabody" CEAGAL (Kontermann R.E.,
(1997)) con la ayuda de los cebadores LMB2 y LMB3, y los productos
amplificados se purificaron por gel. A continuación, el fragmento 1
se amplificó con los cebadores VK-NotFor y
scDb-AscBack, con el fin de incorporar un sitio
AscI y 7 aminoácidos del ligador. El fragmento 2 se amplificó con
los cebadores LMB3 y scDb-AscFor\lambda, con el
fin de incorporar un sitio AscI y 8 aminoácidos del ligador. Los
fragmentos se hidrolizaron con AscI y NotI (fragmento 1) y Sfil y
AscI (fragmento 2) y se clonaron en el vector de expresión
bacteriana pAB1 (Kontermann R.E., (1997)). El inserto resultante
codifica para un polipéptido monocadena en el que
VHA-VLB está unido a VHB-VLA a
través de un ligador de 15 aminoácidos con la secuencia
GGGGSGGRASGGGGS.
A continuación, el plásmido se incorporó en
bacterias TG1, las cuales se cultivaron con métodos conocidos por
los expertos en la materia (Kontermann et al., (1997)).
Las bacterias se digirieron, y la proteína
monocadena con dos sitios de unión para antígeno se purificó a
partir de la preparación periplasmática por cromatografía de
afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC) (Hochuli et
al., Bio/Techn. 6, 1321-1325 (1988). Los
detalles de dicho método han sido descritos por Kontermann et
al.
(1997)).
(1997)).
La proteína purificada presenta un peso
molecular de 60 kDa, tal como ha podido demostrarse por
electroforesis por gel de SDS-poliacrilamida y
filtración en gel. Aproximadamente 200-300 \mug de
dicha molécula por litro de cultivo bacteriano podían purificarse.
La proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno
obtenida por expresión bacteriana reaccionó en ELISA con CEA así
como \beta-galactosidasa y era capaz de reclutar
la enzima para CEA unido a plástico, tal como ha podido demostrarse
por medio de la conversión de
o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(Fig. 6). Además, dicha proteína monocadena con dos sitios de unión
para antígeno era capaz de colorear células LoVo tanto vivas como
fijas que expresan CEA por reclutamiento de
\beta-galactosidasa y reacción del substrato
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
(X-Gal). A tal fin, se incubaron las células LoVo
con 10 \mug/ml de la proteína correspondiente con sitios de unión
para antígeno con 10 \mug/ml de
\beta-galactosidasa y X-Gal (0,8
mg/ml en PBS, ferricianuro (III) potásico 3 mM/ferrocianuro (II) de
potasio 3 mM). No ha podido observarse cualquier coloración con
varias células de control (A549, HEK293) o con un "Diabody"
contra lisozima de huevo de gallina y
\beta-galactosidasa (HELGal; Kontermann et
al. (1997)).
Para la expresión en células eucariotas, se
clonó la región codificadora de la proteína monocadena con dos
sitios de unión para antígeno en un vector de expresión eucariota
(pSecTagA, Invitrogen), en la que la secuencia señal bacteriana fue
reemplazada por la secuencia señal Ig-\kappa.
Con este fin, se amplificó el constructo
monocadena con los cebadores LMB2 y pelB-Metminus,
lo cual reemplazó metionina del pelB-Leader
(posición 21) por treonina. A continuación, el producto se hidrolizó
con SfiI y EcoRI y se clonó en el vector pSecTagÄ. La proteína
madura monocadena con sitios de unión para antígeno contiene 7
aminoácidos adicionales (AAQPATA) en el extremo
N-terminal del dominio VHA.
El plásmido se sometió a una transfección
transitoria con lipofectamina (Gibco) en células HEP 293 eucariotas.
Células estables se seleccionaron en presencia de zeocina.
Utilizando dichas células, era posible detectar una coloración del
retículo endoplasmático ER y del aparato de Golgi en experimentos de
inmunofluorescencia. Además, era posible detectar la secreción de
la proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno por
inmunoprecipitación de una proteína de 60 kDa a partir del
sobrenadante de células marcados con 35 S-Met así
como por purificación por medio de cromatografía de afinidad por
iones metálicos inmovilizados (IMAC). La proteína purificada
presenta una actividad funcional en la unión de
\beta-galactosidasa placas microtítulo
recubiertas con CEA o el reclutamiento de
\beta-galactosidasa para CEA unido a plástico
(Fig. 7).
Se investigó el reclutamiento in vitro
por medio de células HEK 293 y células LoVo
CEA-positivas que producen la proteína monocadena
con dos sitios de unión para antígeno. Con este fin, se cultivaron
en primer lugar las células que producen la proteína monocadena con
dos sitios de unión para antígeno con las células LoVo en placas de
cultivo celular "Transwell" (Costar), en las que los dos
cultivos están separados por medio de una membrana. Tras dos días,
se adicionó \beta-galactosidasa (10 \mug/ml), y
el reclutamiento se detectó por adición del substrato
X-Gal. Una coloración específica ha podido
detectarse en el co-cultivo con las células que
producen la proteína monocadena con dos sitios de unión para
antígeno, mientras que los experimentos de control con células HEK
293 no transfectadas no presentaban coloración alguna.
Los experimentos en los que las células LoVo
fueron reemplazadas con células A549 (CEA-negativas)
o los experimentos en los que las células que producen la proteína
monocadena con dos sitios de unión para antígeno se incubaron con
enzima y substrato eran también negativos. Este último resultado
ilustra que las células que producen proteína monocadena con dos
sitios de unión para antígeno no son capaces ellas mismas de unirse
a la enzima.
En otro experimento, las células HEK 293 que
secretan la proteína monocadena con dos sitios de unión para
antígeno y las células LoVo se co-cultivaron
directamente a una relación de inoculación comprendida entre 1:4 y
1:24. Para distinguir las células HEK 293 de las células LoVo, las
primeras se colorearon con CM-DIL (Molecular
Probes) (fluorescencia roja) antes de la adición de las células
LoVo. Tras dos días, se adicionó
\beta-galactosidasa, y se detectó la unión a las
células por adición de X-Gal (10 \mug/ml) o por
inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo
anti-\beta-galactosidasa
(Biotrend). En dichos experimentos, se mostró también un
reclutamiento de la enzima para las células LoVo, mientras que las
células HEK 293 no resultaron coloreadas. Los experimentos de
control con células HEK 293 no transfectadas eran negativos. Estos
experimentos demuestran que la proteína monocadena con dos sitios
de unión para antígeno reconoce células tumorales específica y
selectivamente.
En experimentos adicionales, se investigó la
conversión de
daunomicina-\beta-D-galactopiranósido
no tóxico en daunomicina citotóxica. La incubación de células LoVo
con la proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno
purificada (10 \mug/ml) durante una hora, seguida de la incubación
a 37º durante una hora con \beta-galactosidasa
(1 \mug/ml) y
daunomicina-\beta-D-galactopiranósido
(2 \muM) permitió detectar una localización nuclear específica de
la daunomicina resultante por medio de autofluorescencia de la
sustancia, comparable a la coloración por incubación directa con
daunomicina. No se ha podido detectar coloración nuclear alguna en
ausencia de la proteína monocadena con dos sitios de unión para
antígeno o de \beta-galactosidasa así como con
células de control (HEK 293; células HEK 293 que producen la
proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno). Dichos
experimentos prueban que la proteína monocadena con dos sitios de
unión para antígeno es capaz de reclutar una enzima para una célula
tumoral y que dicha enzima puede utilizarse para la conversión de
un precursor no tóxico en una sustancia tóxica.
En experimentos adicionales, puede utilizarse
este efecto para matar células tumorales específicamente.
Con este fin, células LoVo se incubaron en
placas de 96 pozos con la proteína monocadena con dos sitios de
unión para antígeno (10 \mug/ml) y luego con
daunomicina-\beta-D-galactopiranósido
(5 \muM) a 37ºC durante una hora. La muerte de las células
analizó tras dos días por medio de un ensayo WST (Boehringer,
Mannheim) (Fig. 8). En este caso, la muerte de las células durante
la conversión del profármaco en el fármaco era aproximadamente tan
eficaz como en presencia del fármaco (Fig. 8A). En ausencia de un
componente o presencia de células A549
CEA-negativas, se observó sustancialmente ningún
efecto (Fig. 8B).
Para la expresión intracelular de una proteína
monocadena con dos sitios de unión para antígeno, se amplifica el
ADN del gen para la proteína monocadena con dos sitios de unión para
antígeno con cebadores distintos:
- -
- proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno transmembrana (TM-scDAP). Para esto, se utiliza un cebador que incorpora el dominio transmembrana de PDGFR en el extremo 3' del gen.
- -
- (LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)
- -
- Proteína monocadena (single-chain) con dos sitios de unión para antígeno (double antigen-binding) localisada en el retículo endoplasmático (ER-scDAP). Para esto, se utiliza un cebador que incorpora una señal de retención ER (SEKDEL) en el extremo 3' del gen.
- -
- Proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno localisada en el retículo citoplasmático (cyto-scDAP). Para esto, se utilizó un cebador que, para una iniciación de translación óptima, reemplaza la secuencia señal en el extremo 5' por una metionina y una secuencia Kozak.
- -
- Proteína monocadena con dos sitios de unión para antígeno localisada en el núcleo (nuc-scDb). Para esto, se utilizaron cebadores que, para una iniciación de translación óptima, reemplazan la secuencia señal en el extremo 5' por una metionina y una secuencia Kozak y incorporan una secuencia de loacalización nuclear (PKKKRKVGGGT; se ha sobrelineado la secuencia de localización nuclear) en el extremo 3' del gen.
Estos fragmentos se clonan en vectores de
expresión eucariota adecuados (pSecTagA o pcDNA3; Invitrogen). A
continuación, los constructos resultantes (TM-scDAP,
ER-scDAP, cyto-scDAP,
nuc-DAP así como sec-scDAP
(= proteína secretada; ver Ejemplo 2) se sometieron a una transfección transitioria en células eucariotas (3T3), y se investigó la localización de la proteína expresada por inmunofluorescencia con ayuda de un anticuerpo de epítope anti-myc. Para los constructos sec-scDAP, ER-scDAP y TM-scDAP, ha podido detectarse una coloración, tal como es típica de la ruta de secreción, mientras que cyto-scDAP muestra una localización difusa en el citoplasma y nuc-scDAP una localización nuclear.
(= proteína secretada; ver Ejemplo 2) se sometieron a una transfección transitioria en células eucariotas (3T3), y se investigó la localización de la proteína expresada por inmunofluorescencia con ayuda de un anticuerpo de epítope anti-myc. Para los constructos sec-scDAP, ER-scDAP y TM-scDAP, ha podido detectarse una coloración, tal como es típica de la ruta de secreción, mientras que cyto-scDAP muestra una localización difusa en el citoplasma y nuc-scDAP una localización nuclear.
Claims (35)
1. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos que contiene los siguientes componentes:
- a)
- un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una primera especificidad (A) y partes funcionales de la misma,
- b)
- un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con una segunda especificidad (B) y partes funcionales de la misma,
- c)
- un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con la especificidad (B) y partes funcionales de la misma, así como
- d)
- un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con la especificidad (A) y partes funcionales de la misma,
estando unidos los dominios VH y VL en forma de
un constructo VH-VL o un constructo
VL-VH y estando unidos los constructos
VH-VL o constructos VL-VH a través
de dominios de la misma especificidad, caracterizada porque
los dos constructos VH-VL o VL-VH
están unidos a través de un péptido (P), y siendo las
especificidades de (A) y (B) distintas.
2. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 1, caracterizada
porque contiene más de dos constructos VH-VL o
VL-VH.
3. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 y 2,
caracterizada porque los dominios VH y VL están unidos a
través de un ligador de péptido (L) en forma de un constructo
VH-L-VL o
VL-L-VH.
4. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 3, caracterizada
porque el ligador (L) presenta una longitud de aproximadamente 1 a
20 aminoácidos, preferentemente de aproximadamente 1 a 5
aminoácidos.
5. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 3, caracterizada
porque el ligador (L) presenta la secuencia de aminoácidos
GGGGS.
6. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizada porque el péptido (P) presenta una longitud de
aproximadamente 12 a 40 aminoácidos, preferentemente de
aproximadamente 12 a 20 aminoácidos, en particular aproximadamente
14 aminoácidos.
7. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 6, caracterizada
porque el péptido (P) presenta la secuencia de aminoácidos
GGGGSGGRASGGGS o GGGGSGGRASGGGGS.
8. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizada porque la molécula citada contiene como
componente adicional uno o más efectores (E).
9. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 8, caracterizada
porque el efector (E) está unido a la molécula citada a través de
un elemento de unión (B).
10. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 9, caracterizada
porque el elemento de unión (B) contiene una secuencia segmentada
por proteasa, preferentemente una secuencia segmentada por PSA,
catepsina, plasminógeno o activador de plasminógeno.
11. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizada porque la primera especificidad (A) está
dirigida contra una molécula que se debe analizar y la segunda
especificidad (B) está dirigida contra un analito.
12. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 11,
caracterizada porque el analito es una molécula radiactiva,
una molécula fluorescente y/o una enzima.
13. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 8 a 10,
caracterizada porque la primera especificidad (A) está
dirigida contra una molécula que se debe analizar, la segunda
especificidad (B) está dirigida contra otra molécula que se debe
analizar y el efector (E) es un analito.
14. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 13,
caracterizada porque el analito es una molécula radiactiva,
una molécula fluorescente y/o una enzima.
\newpage
15. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizada porque el péptido (P) y/o el efector (E) es un
péptido fusiogénico.
16. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 15,
caracterizada porque la primera especificidad (A) está
dirigida contra una célula diana y la segunda especificidad (B)
contra un vector.
17. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según la reivindicación 16,
caracterizada porque el vector es un ácido nucleico, un
péptido o proteína catiónico, un lípido catiónico, un polímero
catiónico, una porfirina catiónica o un vector viral seleccionado
de entre el grupo constituido por un vector del virus AdV, AAV,
vacunal, RSV, HSV, influenza o lentivirus.
18. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizada porque la primera especificidad (A) está
dirigida contra una membrana celular, en particular contra
linfocitos, macrófagos, monocitos, granulocitos, células
hematopoyéticas, células endoteliales, células musculares lisas,
células musculares estriadas, células epiteliales, células de
hígado, células renales, células de la glía, células del tejido de
soporte, células tumorales o células de leucemia, o contra proteínas
de la matriz extracelular, del sistema complementario, del sistema
de coagulación, del sistema quinina, del plasma sanguíneo, del
tejido de soporte, o contra citoquinas o quimioquinas, o contra
toxinas endógenas o exógenas o contra medicamentos, en particular
digital, y/o contra agentes infecciosos, tales como en particular
agentes infecciosos bacterianos, virales y/o parasitarios.
19. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 10 y 18,
caracterizada porque la segunda especificidad (B) está
dirigida contra una membrana celular, en particular contra
linfocitos, macrófagos, monocitos o granulocitos, contra citoquinas,
quimioquinas o factores del crecimiento, contra proteínas del
sistema complementario, contra proteínas del sistema de coagulación,
contra proteínas fibrinolíticas, contra enzimas que son capaces de
convertir el precursor inactivo de un principio activo en un
principio activo, en particular citotóxico, en la estructura diana,
contra hormonas peptídicas u hormonas esteroides, contra la parte
constante de una inmunoglobulina, contra un mediador, tal como en
particular histamina, serotonina, leucotrieno, prostaciclina o
quinina, contra agentes infecciosos, contra toxinas endógenas o
exógenas, contra medicamentos, en particular
digital.
digital.
20. Molécula monocadena con múltiples sitios de
unión para antígenos según una de las reivindicaciones 1 a 10, 18 y
19, caracterizada porque el efector (E) se selecciona de
entre un dominio transmembrana, un ancla de un glicofosfolípido, la
parte de un receptor que se une al ligando, un ligando para un
receptor o la secuencia parcial del ligando que se une al receptor,
una hormona peptídica, una citoquina, un factor de crecimiento, un
inhibidor de un factor de crecimiento, una quimioquina, un
interferón, un mediador, un péptido activo para la circulación, una
enzima que convierte el precursor inactivo de un principio activo en
un principio activo; una proteína que activa o inhibe la
coagulación; una proteína que activa o inhibe la fibrinólisis; una
proteína que activa o inhibe el sistema complementario; uno o más
dominios constantes de una inmunoglobulina; un péptido citotóxico;
otra molécula monocadena con uno o múltiples sitios de unión para
antígeno, en particular dos antígenos; un antígeno tumoral o un
antígeno de un agente infeccioso, tal como, por ejemplo, un antígeno
bacteriano o un antígeno antiviral; un péptido que contiene
cisteína y/o un péptido de di- o multimerización.
21. Ácido nucleico que codifica para una
molécula monocadena con múltiples sitios de unión para antígenos
según una de las reivindicaciones 1 a 20.
22. Ácido nucleico según la reivindicación 21,
caracterizado porque el ácido nucleico citado contiene en el
extremo 5' una secuencia de nucleótidos que codifica para una
secuencia señal o transmembrana.
23. Ácido nucleico según la reivindicación 21 ó
22, caracterizado porque el ácido nucleico citado contiene
en el extremo 5' un promotor y/o activador.
24. Ácido nucleico según la reivindicación 23,
caracterizado porque el activador puede ser activado o
suprimido específicamente según la célula, específicamente según el
ciclo celular, específicamente según el metabolismo y/o por un
principio activo.
25. Ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 21 a 24, caracterizada porque el ácido
nucleico citado contiene en el extremo 5' del codón de iniciación
la secuencia GCCACC o GCCGCC.
26. Vector que contiene un ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 21 a 25.
27. Vector según la reivindicación 26,
caracterizado porque el vector es un vector viral o no
viral.
28. Vector según la reivindicación 27,
caracterizado porque el vector no viral se selecciona de
entre un lípido catiónico, un polímero catiónico, un péptido
catiónico o una porfirina catiónica.
29. Célula que contiene un ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 21 a 25 o un vector según la
reivindicación 26 ó 27.
30. Célula según la reivindicación 29,
caracterizada porque la célula es una célula de bacteria, de
levadura, de insecto o de mamífero.
31. Célula según la reivindicación 30,
caracterizada porque la célula de mamífero es un linfocito,
un macrófago, una célula de la glía, una célula epitelial, una
célula de hígado, una célula renal, una célula de la médula ósea,
una célula endotelial, una célula muscular lisa o estriada o un
fibroplasto.
32. Procedimiento para la preparación de una
molécula monocadena, con múltiples sitios de unión para antígeno,
caracterizado porque se cultiva una célula según la
reivindicación 29 ó 30 y, si se desea, se aísla el producto de
expresión.
33. Medicamento que contiene una molécula
monocadena, con múltiples sitios de unión para antígeno según una
de las reivindicaciones 1 a 10 y 15 a 20, un ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 21 a 27, un vector según una de las
reivindicaciones 26 a 28 o una célula según una de las
reivindicaciones 29 a 31.
34. Diagnóstico que contiene una molécula
monocadena, con múltiples sitios de unión para antígeno según una
de las reivindicaciones 11 a 14.
35. Utilización de una molécula monocadena, con
múltiples sitios de unión para antígeno según una de las
reivindicaciones 1 a 20, de un ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 21 a 25, de un vector según una de las
reivindicaciones 26 a 28 o de una célula según una de las
reivindicaciones 29 a 31 para la preparación de un medicamento
destinado a la terapia, profilaxis o diagnóstico de enfermedades
tumorales, enfermedades autoinmunes, enfermedades de inflamación,
enfermedades de la sangre, en particular del sistema de la
coagulación sanguínea y/o circulación sanguínea, enfermedades del
sistema nervioso y/o enfermedades infecciosas.
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