ES2318131T3 - Metodos de modulacion de la actividad tubulina desacetilasa. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para identificar un agente que modula la actividad enzimática de una tubulina desacetilasa dependiente de NAD humana, comprendiendo el método: poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD con un agente de prueba en una mezcla de ensayo que comprende NAD y un péptido de tubulina acetilado; y determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa dependiente de NAD.

Description

Métodos de modulación de la actividad tubulina desacetilasa.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de las enzimas desacetilasas y de las enzimas que modifican la tubulina.

Antecedentes de la invención

La acetilación reversible de las histonas se encuentra bajo el control de actividades enzimáticas opuestas de dos categorías de enzimas: las histona desacetilasas (HDAC) y las histona acetiltransferasas (HAT). La desacetilación de restos de lisina en colas N-terminales de histonas por HDAC generalmente está asociada con el silenciamiento transcripcional, mientras que la acetilación de los mismos restos de lisina está asociada con la activación de la transcripción. Además de las histonas, una cantidad que está creciendo rápidamente de otras proteínas no histonas experimentan la modificación postraduccional de la acetilación en restos de lisina. Un ejemplo de algunas de estas proteínas incluye HMG-14 y 17, HMGI(Y), p53, E2F1, NF-\kappaB y la proteína Tat de VIH-1. Las HDAC se separan en tres clases distintas basándose en su homología con represores de la transcripción de levaduras. Las desacetilasas de clase I y de clase II son homólogos de las proteínas Rpd3p y Hdalp, respectivamente. Las HDAC de clase III se definen basándose en su homología con el represor de la transcripción de levaduras Sir2p.

La familia de genes reguladores de la información de silenciamiento (SIR) se identificó inicialmente basándose en su papel en la regulación de la expresión génica en los loci HM en S. cerevisiae. Ciertos estudios posteriores definieron adicionalmente el papel de las proteínas SIR en el silenciamiento transcripcional en varios loci adicionales en el genoma de levadura, incluyendo telómeros, el locus de ADNr y en sitios de lesiones en el ADN. El silenciamiento en los telómeros y en los loci HM está mediado por un complejo multiproteína que incluye Sir2p, Sir3p y Sir4p, estando implicada Sir1p en el silenciamiento de loci HM únicamente. De manera interesante, el silenciamiento y la represión de la recombinación en el locus de ADNr se consigue por Sir2p en asociación con el complejo RENT, que contiene Net1, Nan1 y cdc14, y se ha asociado con el envejecimiento en S. cerevisiae. El reciente descubrimiento de que SIR2 codifica una histona desacetilasa dependiente de NAD ha validado la sospecha mantenida durante mucho tiempo de que esta proteína regulaba el nivel de acetilación de las histonas.

La familia de genes SIR2 está conservada desde las arqueobacterias a los eucariotas. En S cerevisiae, esta familia consiste en Sir2 y cuatro genes muy relacionados (HST1-4). Aunque Sir2p y HST1p se localizan principalmente en el núcleo, Hst2p es exclusivamente citoplásmica. Los seres humanos tienen siete proteínas con homología con Sir2p de S. cerevisiae, que se han denominado Sirtuínas o SIRT. La SIRT1 humana y la Sir2\alpha de ratón, que son los homólogos más parecidos a Sir2p y HST1p, presentan una actividad proteína desacetilasa con especificidad por la proteína del factor de transcripción p53. La desacetilación de p53 por SIRT1 reprime la apoptosis dependiente de p53 en respuesta a las lesiones en el ADN. La proteína SIRT2 humana, que es la relacionada más estrechamente con Hst2p, también se localiza en el citoplasma. De manera interesante, tanto SIRT2 como Hst2p regulan el silenciamiento del ADNr y telomérico indirectamente desde su localización citoplásmica.

La red de microtúbulos se forma por la polimerización de heterodímeros de \alpha/\beta tubulina y juega un papel importante en la regulación de la forma celular, el transporte intracelular, la motilidad celular y la división celular. Las subunidades de \alpha y \beta tubulina se someten a numerosas modificaciones postraduccionales incluyendo tirosinación, fosforilación, poliglutaminación, poliglicilación y acetilación. La tubulina representa una de las proteínas citoplásmicas acetiladas principales. La acetilación de la tubulina tiene lugar en la lisina-40 de la \alpha-tubulina que, basándose en la estructura cristalina del heterodímero de tubulina, se predice que está dentro del lado luminal del microtúbulo polimerizado.

Se ha notificado que una diversidad de señales fisiológicas modulan el nivel de acetilación de tubulina. Éstas incluyen el fármaco anticanceroso paclitaxel, así como la asociación de MAP1 y 2C, tau y la proteína VP22 codificada por el virus del herpes simple. De forma similar, los microtúbulos asociados con estructuras estables tales como los cilios, contienen \alpha-tubulina relativamente hiperacetilada. Estas observaciones han respaldado la opinión de que los microtúbulos estabilizados llegan a estar hiperacetilados. Sin embargo, no se han identificado las enzimas responsables de la acetilación reversible de la tubulina. Esta falta de reactivos ha impedido un análisis minucioso del papel biológico de la acetilación de tubulina en la dinámica de los microtúbulos, la estabilidad y las funciones fisiológicas del citoesqueleto.

Grozinger et al (J. Biol. Chem., 2001, 276:38837-38843) mencionan la identificación de una clase de inhibidores de molécula pequeña de la familia de desacetilasas dependientes de NAD conocidas como sirtuínas por selección fenotípica. Maruta et al (J. Cell. Biol, 1986, 103:571-579) mencionan la acetilación de la alfa-tubulina y su relación con el ensamblaje y desensamblaje de los microtúbulos. El documento WO 89/06132 se refiere a un inhibidor de transcriptasa inversa tal como 3'-azido-3'-desoxitimidina para el tratamiento o profilaxis de un carcinoma asociado con retrovirus tal como un cáncer de mama en un ser humano.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos para identificar agentes que modulan el nivel o la actividad del polipéptido tubulina desacetilasa, así como agentes identificados por los métodos. La invención, además proporciona métodos para modular la actividad tubulina desacetilasa en una célula. La invención también proporciona métodos para modular la proliferación celular por medio de la modulación de la actividad de la tubulina desacetilasa.

Características de la invención

La invención se refiere a un método in vitro para identificar un agente que modula una actividad enzimática de una tubulina desacetilasa humana, por ejemplo la SIRT2 humana. El método comprende, en general, poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa con un agente de ensayo en una mezcla de ensayo que comprende dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) y un péptido de tubulina acetilado y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa. En algunas realizaciones, el polipéptido de tubulina desacetilasa comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID Nº: 02. En algunas realizaciones, el péptido de tubulina acetilado comprende la secuencia NH_{2}-MPSD(AcK)TIGG-CO_{2} (SEC ID Nº: 08). En algunas realizaciones, el péptido de tubulina acetilado contiene un grupo acetilo marcado con ^{14}C en una lisina correspondiente a la Lys-40 de la tubulina nativa, y la determinación del efecto del agente sobre la enzima se realiza midiendo la liberación del grupo acetilo radiactivo. En algunas realizaciones, el efecto del agente sobre la actividad de la enzima se mide detectando la unión de un anticuerpo específico para la tubulina
acetilada.

La presente invención se refiere además a un método in vitro para identificar un agente que modula el nivel de tubulina desacetilasa en una célula. El método generalmente implica poner en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre el nivel de tubulina desacetilasa. En algunas realizaciones, la determinación del efecto del agente implica determinar el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa en la célula. En otras realizaciones, la determinación del efecto del agente implica determinar el nivel de polipéptido de tubulina desacetilasa en la célula.

La invención también proporciona el uso de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa dependiente de NAD para la fabricación de un medicamento para tratar cánceres en un individuo, donde el agente es ribavirina, y donde la ribavirina es para la administración en una dosis de 30 mg a 1200 mg al día por administración oral. La invención también proporciona ribavirina para uso en un método de tratamiento de cánceres en un individuo, donde el uso comprende la administración oral de ribavirina en una dosis de 30 mg a 1200 mg al día.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-D representan la desacetilación dependiente de NAD de un péptido de histona por SIRT2 humana.

Las figuras 2A-C representan la inactivación de la actividad histona desacetilasa de SIRT2 por mutaciones puntuales dentro del dominio catalítico de SIRT2.

Las figuras 3A-E representan que SIRT2 desacetila la tubulina ex vivo.

Las figuras 4A-D representan la preferencia de sustrato para SIRT2.

Las figuras 5A y 5B representan la regulación de la distribución subcelular de MIZ-1 por medio de tubulina acetilada.

Las figuras 6A y 6B representan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente, de SIRT2 humana (SEC ID Nº: 01 y 02, respectivamente).

La figura 7 representa la inhibición por ribavirina de SIRT2.

Definiciones

Los términos "polipéptido" y "proteína", usados en el presente documento de forma indistinta, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente y polipéptidos que tienen estructuras peptídicas modificadas. El término incluye proteínas de fusión, incluyendo pero sin limitación proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heterólogos, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin restos de metionina N-terminales; proteínas marcadas inmunológicamente; y similares.

Un polipéptido "aislado sustancialmente" o "aislado" es uno que carece sustancialmente de las macromoléculas con las que está asociado en la naturaleza. Por carece sustancialmente se entiende que carece de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80% e incluso más preferiblemente al menos el 90% de los materiales con los que está asociado en la naturaleza.

Una "muestra biológica" incluye una diversidad de tipos de muestras obtenidos a partir de un individuo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. La definición incluye sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos tales como muestras de biopsia o cultivos de tejidos o células procedentes de las mismas y su descendencia. La definición también incluye muestras que se han manipulado de cualquier manera después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento en ciertos componentes tales como polinucleótidos. La expresión "muestra biológica" incluye una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejidos.

Los términos "cáncer", "neoplasma", "tumor" y "carcinoma" se usan en el presente documento de forma indistinta para hacer referencia a células que presentan un crecimiento relativamente autónomo, de forma que presentan un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. Las células cancerosas pueden ser benignas o malignas.

Como se usan en este documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particular en un ser humano, e incluye: (a) la prevención de que aparezca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero en el que aún no se ha diagnosticado; (b) la inhibición de la enfermedad, es decir, la detención de su desarrollo; y (c) el alivio de la enfermedad, es decir, la regresión de la enfermedad.

Antes de describir adicionalmente la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas ya que éstas, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene los fines de describir realizaciones particulares únicamente y no debe considerarse limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, debe entenderse que dentro de la invención está incluido cada valor intermedio, hasta el decimal de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen dentro de la invención, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o los dos límites, también se incluyen en la invención intervalos que excluyen uno cualquiera o los dos límites incluidos.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se incorporan como referencia para describir y analizar los métodos y/o materiales en relación con los que se citan en las publicaciones.

Debe indicarse que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" o "una", y "la" o "el" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una tubulina desacetilasa" incluye una pluralidad de dichas desacetilasas y la referencia al "agente" incluye la referencia a uno o más agentes y equivalentes de los mismos conocidos por los especialistas en la técnica, y similares.

Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe considerarse una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a dichas publicaciones en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de la publicación reales que pueden necesitar confirmarse de forma independiente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para identificar un agente que modula el nivel o la actividad de la tubulina desacetilasa; agentes identificados por los métodos; y métodos terapéuticos, incluyendo métodos para estabilizar microtúbulos, métodos para controlar la proliferación celular indeseada y métodos para tratar trastornos asociados o producidos por una proliferación celular indeseada.

La invención se basa, en parte, en la observación de que la SIRT2 humana es una tubulina desacetilasa dependiente de NAD. La enzima SIRT2 humana es una proteína citoplásmica que está muy relacionada con la proteína Hst2P de Saccharomyces cerevisiae, que no desacetila la tubulina; y es un ortólogo de la proteína 2 reguladora de la información de silenciamiento de S. cerevisiae (Sir2p), una histona desacetilasa que interviene en el silenciamiento transcripcional. La SIRT2 humana retira un grupo acetilo de la lisina-40 de la \alpha-tubulina. La desacetilación de la tubulina también produce una reducción en la interacción específica de la tubulina con el factor de transcripción-1 de dedo de cinc de interacción con myc-1 ("MIZ-1").

La identificación de SIRT2 humana como una tubulina desacetilasa permitió el desarrollo de ensayos para identificar agentes que modulan la actividad de esta enzima. Los agentes que modulan el nivel o la actividad enzimática de la SIRT2 humana son útiles para modular la proliferación celular y, por lo tanto, son útiles, por ejemplo, como agentes anticancerosos.

Métodos de selección

La invención proporciona métodos in vitro para identificar un agente que modula el nivel o la actividad de una tubulina desacetilasa. Los métodos generalmente implican poner contacto una proteína tubulina desacetilasa, o una célula que produce una proteína tubulina desacetilasa, con un agente de ensayo, y determinar el efecto, si lo hay, sobre el nivel o la actividad de la proteína tubulina desacetilasa.

En algunas realizaciones, los métodos son métodos sin células. Los métodos sin células generalmente implican poner en contacto una tubulina desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa.

En otras realizaciones, los métodos son métodos basados en células. Los métodos basados en células implican, en general, poner en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa o proteína tubulina desacetilasa en la célula. En algunas realizaciones, los métodos basados en células implican poner en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre la unión de una proteína a tubulina.

Como se usa en el presente documento, el término "determinar" se refiere a determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas y como tal, el término "determinar" se usa indistintamente en el presente documento con "ensayar", "medir" y similares.

La expresión "polipéptido de tubulina desacetilasa" incluye proteínas tubulina desacetilasas humanas (por ejemplo, proteínas SIRT2 humanas) que tienen las secuencias de aminoácidos indicadas en cualquiera de los números de acceso del GenBank NM_012237; AF083107; y NM_030593, o se representan en la Figura 6B, donde el polipéptido es una proteína citoplásmica y presenta actividad tubulina desacetilasa dependiente de NAD. El término incluye variantes que tienen inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan a la capacidad de la proteína para desacetilar \alpha-tubulina que tiene una lisina acetilada en la posición 40. En algunas realizaciones, la tubulina desacetilasa es recombinante, por ejemplo, se produce en una célula transfectada con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la tubulina desacetilasa.

La expresión "polipéptido de tubulina desacetilasa" incluye además proteínas de fusión que comprenden una tubulina desacetilasa y un polipéptido heterólogo ("compañeros de fusión"), donde los compañeros de fusión adecuados incluyen marcadores inmunológicos tales como marcadores de epítopos incluyendo, pero sin limitación, hemaglutinina, FLAG (véase, por ejemplo, Archives of Biochem and Biophys. 406: 209-221, 2002; J. Bio. Chem., 277(23): 20750-20755, 2002), y similares; proteínas que proporcionan una señal detectable incluyendo, pero sin limitación, proteínas fluorescentes (por ejemplo, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente de una especie de antozoo y similares), enzimas (por ejemplo \beta-galactosidasa, luciferasa, peroxidasa de rábano picante, etc.) y similares; polipéptidos que facilitan la purificación o aislamiento de la proteína de fusión, por ejemplo, polipéptidos de unión a iones metálicos tales como marcadores 6His (por ejemplo, tubulina desacetilasa/6His), glutatión-S-transferasa (GST) y similares. La expresión "polipéptido de tubulina desacetilasa" incluye además un polipéptido de tubulina desacetilasa modificado para incluir uno o más sitios de escisión específicos de proteasa.

Las actividades atribuidas a la tubulina desacetilasa incluyen acetilación de la Lys-40 de tubulina; control de la unión MIZ-1/tubulina y similares. De esta manera, una "actividad de tubulina desacetilasa" incluye la actividad directa, por ejemplo, acetilación de tubulina; y actividades indirectas, por ejemplo, una reducción en la unión de MIZ-1 a tubulina. Puede encontrarse una secuencia de aminoácidos de la proteína MIZ-1 con el número de acceso del GenBank Q 13105.

Cuando el ensayo es un ensayo sin células in vitro, los métodos generalmente implican poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa con un agente de ensayo. El polipéptido de tubulina desacetilasa puede purificarse, pero esto no es necesario. Por ejemplo, el polipéptido de tubulina desacetilasa puede estar en un lisado celular, o puede estar aislado o purificado parcialmente. De esta manera, el ensayo puede realizarse en presencia de componentes adicionales siempre que los componentes adicionales no afecten adversamente a la reacción en un grado inaceptable.

Cuando el ensayo es un ensayo basado en células in vitro, puede usarse cualquiera de una diversidad de células. Las células usadas en el ensayo normalmente son células eucariotas incluyendo, pero sin limitación, células de roedores, células humanas y células de levadura. Las células pueden ser cultivos celulares primarios o pueden ser líneas celulares inmortalizadas. Las células pueden ser "recombinantes", por ejemplo, la célula puede tener una construcción introducida de forma transitoria o estable (por ejemplo, un plásmido, un vector viral recombinante o cualquier otro vector adecuado) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de tubulina desacetilasa, o que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un promotor de tubulina desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador.

Las expresiones "agente candidato", "agente de ensayo", "agente", "sustancia" y "compuesto" se usan indistintamente en el presente documento. Los agentes candidatos incluyen numerosas clases químicas, típicamente moléculas orgánicas o inorgánicas sintéticas, semi-sintéticas o naturales. Los agentes candidatos incluyen los que se encuentran en grandes bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles en el mercado bibliotecas de compuestos sintéticos en Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), ComGenex (South San Francisco, CA) y MicroSource (New Milford, CT). En Aldrich (Milwaukee, Wis) está disponible una biblioteca química rara y también puede usarse. Como alternativa, están disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales en Pan Labs (Bothell, WA) o se pueden producir fácilmente.

Los agentes candidatos pueden ser compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños que tienen un peso molecular mayor de 50 y menor de aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes candidatos pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente formación de enlaces de hidrógeno, y pueden incluir al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender carbono cíclico o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También se encuentran agentes candidatos entre biomoléculas, incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Los ensayos de la invención incluyen controles, donde los controles adecuados incluyen una muestra (por ejemplo, una muestra que comprende proteína tubulina desacetilasa o una célula que sintetiza tubulina desacetilasa) en ausencia del agente de ensayo. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo se procesan en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección.

Cuando el ensayo de selección es un ensayo de unión (por ejemplo, unión a tubulina desacetilasa; unión de MIZ-1 a tubulina), una o más de las moléculas pueden unirse a un marcador, donde el marcador puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable. Diversos marcadores incluyen radioisótopos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, moléculas de unión específicas, partículas, por ejemplo, partículas magnéticas y similares. Las moléculas de unión específicas incluyen pares, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina etc. En el caso de los miembros de unión específicos, el miembro complementario normalmente se marcaría con una molécula que facilita la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos.

En el ensayo de selección pueden incluirse una diversidad de reactivos distintos. Éstos incluyen reactivos tales como sales, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc. que se usan para facilitar una unión óptima proteína-proteína y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. Pueden usarse reactivos que mejoran la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. Los componentes de la mezcla de ensayo se añaden en cualquier orden que proporcione la unión requerida u otra actividad. Las incubaciones se realizan a cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4\capC y 4\capC. Los periodos de incubación se seleccionan para conseguir una actividad óptima, pero también pueden optimizarse para facilitar una selección de alto rendimiento. Típicamente será suficiente un periodo comprendido entre 0,1 y 1 hora.

Los métodos de selección pueden diseñarse de varias formas diferentes, pudiendo emplearse una diversidad de configuraciones de ensayo y protocolos, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, uno de los componentes puede unirse a un soporte sólido y los demás componentes pueden ponerse en contacto con el componente unido al soporte. Los componentes anteriores del método pueden combinarse sustancialmente al mismo tiempo o en momentos diferentes.

Cuando el ensayo es un ensayo de unión, después de las etapas de contacto e incubación los métodos de la presente invención generalmente, aunque no necesariamente, incluirán además una etapa de lavado para retirar los componentes no unidos, donde dicha etapa de lavado generalmente se emplea cuando sea necesario para retirar el marcador que daría lugar a una señal de fondo durante la detección, tales como componentes unidos de forma no específica marcados con fluorescencia o radiactivos. Después de la etapa de lavado opcional, se detectará la presencia de complejos unidos.

Un agente de ensayo de interés es uno que reduce el nivel de proteína tubulina desacetilasa o inhibe la actividad tubulina desacetilasa al menos en aproximadamente un 10%, al menos en aproximadamente un 20%, al menos en aproximadamente un 25%, al menos en aproximadamente un 30%, al menos en aproximadamente un 35%, al menos en aproximadamente un 40%, al menos en aproximadamente un 45%, al menos en aproximadamente un 50%, al menos en aproximadamente un 55%, al menos en aproximadamente un 60%, al menos en aproximadamente un 65%, al menos en aproximadamente un 70%, al menos en aproximadamente un 80%, al menos en aproximadamente un 90% o más, en comparación con un control en ausencia de agente de ensayo.

Métodos para detectar agentes que modulan el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa y/o polipéptido de tubulina desacetilasa

Los presentes métodos de selección incluyen métodos para detectar un agente que modula el nivel de un ARNm de tubulina desacetilasa y/o un polipéptido de tubulina desacetilasa en una célula. En algunas realizaciones, los métodos implican poner en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa en la célula.

Un agente candidato se ensaya con respecto a cualquier actividad citotóxica que pueda presentar hacia la célula usada en el ensayo usando ensayos bien conocidos, tales como exclusión de colorante azul tripán, un ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio) y similares. Los agentes que no presentan actividad citotóxica se consideran agentes candidatos.

Para identificar agentes que reducen el nivel de tubulina desacetilasa en una célula eucariota, puede usarse una amplia diversidad de ensayos basados en células que usan, por ejemplo, una célula que normalmente produce ARNm de tubulina desacetilasa, una célula de mamífero transformada con una construcción que comprende un ADNc que codifica tubulina desacetilasa de tal forma que el ADNc se sobreexprese o, como alternativa, una construcción que comprende un promotor de tubulina desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para identificar un agente, particularmente un agente biológicamente activo, que reduce el nivel de expresión de tubulina desacetilasa en una célula, comprendiendo el método: combinar un agente candidato a ensayar con una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tubulina desacetilasa, o una construcción que comprende un promotor de tubulina desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador; y determinar el efecto de dicho agente sobre la expresión de tubulina desacetilasa. Una reducción de al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en el nivel (es decir, en la cantidad) de ARNm y/o polipéptido de tubulina desacetilasa después del contacto de la célula con un agente candidato a ensayar, en comparación con un control al que no se le ha añadido agente, es una indicación de que el agente modula la expresión de la tubulina desacetilasa.

El ARNm y/o el polipéptido de tubulina desacetilasa cuyos niveles se están midiendo pueden codificarse por un polinucleótido endógeno de tubulina desacetilasa, o el polinucleótido de tubulina desacetilasa puede ser uno comprendido dentro de un vector recombinante e introducido dentro de la célula, es decir, el ARNm y/o el polipéptido de tubulina desacetilasa puede codificarse por un polinucleótido exógeno de tubulina desacetilasa. Por ejemplo, un vector recombinante puede comprender una secuencia reguladora de la transcripción de tubulina desacetilasa aislada, tal como una secuencia de promotor, unida de forma funcional a un gen indicador (por ejemplo, \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, una proteína fluorescente, luciferasa u otro gen que puede ensayarse fácilmente con respecto a la expresión).

En estas realizaciones, el método para identificar un agente que modula el nivel de expresión de tubulina desacetilasa en una célula comprende: combinar un agente candidato a ensayar con una célula que comprende un ácido nucleico que comprende un elemento regulador de la transcripción del gen de tubulina desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador; y determinar el efecto de dicho agente sobre la expresión del gen indicador. Un vector recombinante puede comprender una secuencia reguladora de la transcripción de tubulina desacetilasa aislada, tal como una secuencia de promotor, unida de forma funcional a secuencias que codifican un polipéptido de tubulina desacetilasa; o las secuencias de control de la transcripción pueden unirse de forma funcional a secuencias codificantes de una proteína de fusión de tubulina desacetilasa que comprenden un polipéptido de tubulina desacetilasa fusionado a un polipéptido que facilita la detección. En estas realizaciones, el método comprende combinar un agente candidato a ensayar con una célula que comprende un ácido nucleico que comprende un elemento regulador de la transcripción del gen de tubulina desacetilasa unido de forma funcional a una secuencia codificante de un polipéptido de tubulina desacetilasa; y determinar el efecto de dicho agente sobre la expresión de la tubulina desacetilasa, pudiendo realizarse dicha determinación midiendo una cantidad de ARNm de tubulina desacetilasa, polipéptido de tubulina desacetilasa o polipéptido de fusión de tubulina desacetilasa producido por la célula.

Los ensayos basados en células generalmente comprenden las etapas de poner en contacto la célula con un agente a ensayar, formar una muestra de ensayo y, después de un periodo de tiempo adecuado, evaluar el efecto del agente sobre la expresión de la tubulina desacetilasa. Una muestra de control comprende la misma célula, sin el agente candidato añadido. Los niveles de expresión de tubulina desacetilasa se miden tanto en la muestra de ensayo como en la muestra de control. Se realiza una comparación entre el nivel de expresión de tubulina desacetilasa en la muestra de ensayo y la expresión de tubulina desacetilasa en la muestra de control puede evaluarse usando ensayos convencionales. Por ejemplo, cuando una línea celular de mamífero se transforma con una construcción que produce la expresión de la tubulina desacetilasa, pueden detectarse y medirse los niveles de ARNm de tubulina desacetilasa, o pueden detectarse y medirse los niveles de polipéptido de tubulina desacetilasa. Un periodo de tiempo adecuado para poner en contacto el agente con la célula puede determinarse empíricamente, y generalmente es un periodo de tiempo suficiente para permitir la entrada de la agente en la célula y permitir que el agente tenga un efecto medible sobre los niveles de ARNm y/o polipéptido de tubulina desacetilasa. Generalmente, un periodo de tiempo adecuado está comprendido entre 10 minutos y 24 horas, o es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 8 horas.

Los métodos para medir los niveles de ARNm de tubulina desacetilasa son conocidos en la técnica, habiéndose descrito anteriormente varios de ellos, y cualquiera de estos métodos puede usarse en los métodos de la presente invención para identificar un agente que modula el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa en una célula incluyendo, pero sin limitación, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como una PCR que emplea cebadores oligonucleotídicos marcados de forma detectable, y cualquiera de una diversidad de ensayos de hibridación.

De forma similar, los niveles de polipéptido de tubulina desacetilasa pueden medirse usando cualquier método convencional, habiéndose descrito en el presente documento varios de ellos incluyendo, pero sin limitación, un inmunoensayo tal como un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), por ejemplo un ELISA que emplea un anticuerpo marcado de forma detectable específico para un polipéptido de tubulina desacetilasa.

Los niveles de polipéptido de tubulina desacetilasa también pueden medirse en células que llevan una construcción recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de tubulina desacetilasa, donde el compañero de fusión proporciona una señal detectable o puede detectarse de otra manera. Por ejemplo, cuando el compañero de fusión proporciona un epítopo reconocible inmunológicamente (un "marcador de epítopo"), puede usarse un anticuerpo específico para un epítopo del compañero de fusión para detectar y cuantificar el nivel de tubulina desacetilasa. En algunas realizaciones, el compañero de fusión proporciona una señal detectable y en estas realizaciones el método de detección se elige basándose en el tipo de señal generada por el compañero de fusión. Por ejemplo, cuando el compañero de fusión es una proteína fluorescente, se mide la fluorescencia.

Las proteínas fluorescentes adecuadas para uso incluyen, pero sin limitación, una proteína fluorescente verde (GFP) incluyendo, pero sin limitación, una versión "humanizada" de una GFP, por ejemplo, donde los codones de la secuencia de nucleótidos natural se han cambiado por una preferencia codónica humana con una correspondencia más estrecha; una GFP derivada de Aequoria victoria o un derivado de la misma, por ejemplo, un derivado "humanizado" tal como una GFP mejorada, que está disponible en el mercado, por ejemplo, en Clontech, Inc.; una GFP de otra especie tal como Renilla reniformis, Renilla mulleri o Ptilosarcus guernyi, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/49019 and Peelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519; GFP recombinante "humanizada" (hrGFP) (Stratagene); cualquiera de una diversidad de proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de antozoos como se describe, por ejemplo, en Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973; y similares. Cuando el compañero de fusión es una enzima que produce un producto detectable, el producto puede detectarse usando un medio apropiado, por ejemplo, la \beta-galactosidasa, dependiendo del sustrato, puede producir un producto coloreado que se detecta espectrofotométricamente, o un producto fluorescente; la luciferasa puede producir un producto luminiscente detectable con un luminómetro; etc.

Se dispone de varios métodos para analizar ácidos nucleicos con respecto a la presencia y/o nivel de un ARNm específico en una célula. El ARNm puede ensayarse directamente o transcribirse de forma inversa en ADNc para el análisis. El ácido nucleico puede amplificarse por técnicas convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para proporcionar suficientes cantidades para el análisis. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki, et al. (1985), Science 239:487, y puede encontrarse una revisión de técnicas en Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, páginas 14.2-14.33. Como alternativa, en la técnica se conocen diversos métodos que utilizan ligamiento de oligonucleótidos como medio de detección de polimorfismos, por ejemplo, véase Riley et al. (1990), Nucl. Acids Res. 18:2887-2890; y Delahunty et al. (1996), Am. J. Hum. Genet. 58:1239-1246.

En una reacción de amplificación puede incluirse un marcador detectable. Los marcadores adecuados incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), marcadores radiactivos, por ejemplo, ^{32}P, ^{35}S, ^{3}H; etc. El marcador puede ser un sistema de dos fases, donde el ADN amplificado se conjuga con biotina, haptenos, etc. que tienen un compañero de unión de alta afinidad, por ejemplo, avidina, anticuerpos específicos, etc., donde el compañero de unión se conjuga con un marcador detectable. El marcador puede conjugarse con uno o con los dos cebadores. Como alternativa, el grupo de nucleótidos usados en la amplificación se marca para incorporar el marcador en el producto de amplificación.

Los especialistas en la técnica conocen una diversidad de métodos diferentes para determinar la abundancia de ácidos nucleicos en una muestra, incluyendo los métodos particulares de interés los descritos en: Pietu et al., Genome Res. (Junio de 1996) 6:492-503; Zhao et al., Gene (24 de abril de 1995) 156:207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (octubre de 1997) 8:542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (noviembre de 1994) 32:125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (1 de febrero de 1994) 216:299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (diciembre de 1996) 6:225-230; Hong et al. Bioscience Reports (1982) 2:907; y McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143:298. También son de interés los métodos descritos en el documento WO 97/27317, cuya descripción se incorpora en el presente documento como referencia.

Se dispone de varios métodos para determinar el nivel de expresión de un gen o proteína en una muestra particular. Por ejemplo, la detección puede utilizar tinción de células o secciones histológicas con anticuerpos marcados, realizada de acuerdo con métodos convencionales. Las células se permeabilizan para teñir moléculas citoplásmicas. Los anticuerpos de interés se añaden a la muestra de células y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión al epítopo, normalmente al menos aproximadamente 10 minutos. El anticuerpo puede marcarse con radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes u otros marcadores para la detección directa. Como alternativa, se usa un anticuerpo o reactivo de segunda etapa para amplificar la señal. Estos reactivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede conjugarse con biotina, añadiendo avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante como reactivo de segunda etapa. La detección final usa un sustrato que experimenta un cambio de color en presencia de la peroxidasa. Como alternativa, el anticuerpo secundario se conjuga con un compuesto fluorescente, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, etc. La ausencia o presencia de unión de anticuerpo puede determinarse por diversos métodos, incluyendo citometría de flujo de células disociadas, microscopía, radiografía, recuento de centelleo, etc.

Métodos para detectar agentes que modulan una actividad de un polipéptido de tubulina desacetilasa

Los métodos para detectar un agente que modula una actividad de un polipéptido de tubulina desacetilasa incluyen métodos sin células y métodos basados en células. Los métodos generalmente implican poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa.

En la técnica se conocen métodos de ensayo de la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa y puede usarse cualquier método conocido. Como ejemplo no limitante, se incuba un péptido de tubulina acetilado, junto con NAD, con la tubulina desacetilasa y un agente de ensayo, y se determina el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre la desacetilación del péptido de tubulina. Los péptidos de tubulina acetilados generalmente comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende la Lys-40 de la tubulina nativa más tres, cuatro, cinco, seis, siete o más aminoácidos en el lado NH_{2} terminal, y tres, cuatro, cinco, seis, siete o más aminoácidos en el lado del CO_{2} terminal de la Lys-40 de la tubulina nativa. Como ejemplo no limitante, un péptido de tubulina acetilado tiene la secuencia NH_{2}-MPSD(AcK)TIGG-CO_{2} (SEC ID Nº:08). Los especialistas en la técnica pueden diseñar fácilmente péptidos de tubulina acetilados adicionales: el péptido de tubulina acetilado está presente en la mezcla de ensayo a una concentración de aproximadamente 20 \muM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 30 \muM a aproximadamente 900 \muM, de aproximadamente 40 \muM a aproximadamente 700 \muM, de aproximadamente 50 \muM a aproximadamente 500 \muM, de aproximadamente 50 \muM a aproximadamente 300 \muM o de aproximadamente 60 \muM a aproximadamente 100 \muM. El NAD está presente en la mezcla de ensayo a una concentración de aproximadamente 1 mM. El grupo acetilo en el péptido de tubulina está radiomarcado, por ejemplo, se usa ^{14}C-acetilo. El ensayo entonces implica determinar la cantidad de ^{14}C-acetilo que se libera, típicamente por recuento de centelleo.

Otro método para detectar la actividad tubulina desacetilasa es controlar el estado de acetilación de la tubulina usando un anticuerpo específico para la tubulina acetilada. La falta de reactividad del anticuerpo anti-tubulina acetilada con el sustrato de tubulina indica que la tubulina se ha desacetilado. Un ejemplo de dicho anticuerpo es el anticuerpo 6-11B-1 como se describe en los ejemplos. De esta manera, en algunas realizaciones los métodos implican determinar la unión de un anticuerpo anti-tubulina acetilada con el sustrato de tubulina. La unión de anticuerpo anti-tubulina acetilada/tubulina puede determinarse usando cualquier tipo de ensayo inmunológico, incluyendo ensayos de inmunotransferencia, ensayos ELISA y similares.

En algunas realizaciones, el ensayo es un ensayo sin células, donde la tubulina desacetilasa se pone en contacto con el agente de ensayo, el sustrato (es decir tubulina acetilada) y otros componentes de la reacción (por ejemplo, NAD, tampones y similares), y se determina la actividad de la tubulina desacetilasa. En estas realizaciones, la tubulina desacetilasa puede purificarse, pero no necesariamente está purificada. La tubulina desacetilasa puede estar presente en un extracto celular; en un inmunoprecipitado de un extracto celular; o puede estar parcialmente purificada, por ejemplo, puede estar purificada en al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o más, por ejemplo, puede estar libre de otras macromoléculas presentes en la fuente de la tubulina desacetilasa. La tubulina desacetilasa puede ser recombinante o puede aislarse de una fuente natural, por ejemplo, una célula o tejido de mamífero que normalmente produce la enzima.

En otras realizaciones, el ensayo es un ensayo in vitro basado en células, donde la célula se pone en contacto con el agente de ensayo y se determina el efecto, si lo hay, del agente sobre la actividad de la tubulina desacetilasa. En estas realizaciones, el efecto del agente sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa se determina controlando el estado de acetilación de la tubulina en la célula. Los métodos implican poner contacto la célula con el agente de ensayo y, después de un periodo de tiempo adecuado, se extrae la tubulina de la célula y se determina el grado de acetilación. El grado de acetilación de tubulina puede determinarse usando cualquier método conocido incluyendo, por ejemplo, unión de un anticuerpo anti-tubulina acetilada a la tubulina extraída de la célula.

En algunas realizaciones, el método de ensayo implica determinar la unión de MIZ-1 a la tubulina acetilada. La unión de MIZ-1/tubulina puede medirse usando cualquier ensayo conocido, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína bien conocidos. Los métodos adecuados incluyen: un método doble híbrido de levadura; un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET); un ensayo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET); un ensayo de inactivación de fluorescencia; un ensayo de anisotropía de fluorescencia; un ensayo inmunológico; y un ensayo que implica la unión de una proteína marcada de manera detectable a una proteína inmovilizada.

En cualquier ensayo que implique la unión de MIZ-1 a la tubulina acetilada, puede usarse un fragmento de tubulina acetilada. Los fragmentos de tubulina acetilada se han descrito anteriormente e incluyen, pero sin limitación, un fragmento tal como el indicado en la SEC ID Nº:08. En cualquier ensayo que implique la unión de MIZ-1 a tubulina acetilada, puede usarse MIZ-1 como se indica en la SEC ID Nº:09 o un fragmento de unión a tubulina acetilada de MIZ-1. En algunas realizaciones, se marcan de forma detectable la tubulina acetilada o la proteína MIZ-1, o las
dos.

El FRET implica la transferencia de energía desde un fluoróforo donador en un estado excitado a un fluoróforo aceptor cercano. Para que tenga lugar esta transferencia, las moléculas donadoras y aceptoras deben estar muy cerca (por ejemplo, deben estar separadas por una distancia menor de 10 nanómetros, normalmente deben estar separadas por una distancia comprendida entre 10 y 100 \ring{A}), y los espectros de emisión del fluoróforo donador deben coincidir parcialmente con los espectros de excitación del fluoróforo aceptor.

En estas realizaciones, una proteína MIZ-1 marcada de forma fluorescente o una proteína de tubulina sirve como donador y/o aceptor en combinación con una segunda proteína fluorescente o colorante, por ejemplo, una proteína fluorescente como se describe en Matz et al., Nature Biotechnology (octubre de 1999) 17:969-973; una proteína fluorescente verde (GFP), incluyendo una GFP "humanizada"; una GFP de Aequoria victoria o un mutante fluorescente de la misma, por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº: 6.066.476; 6.020.192; 5.985.577; 5.976.796; 5.968.750; 5.968.738; 5.958.713; 5.919.445; y 5.874.304, cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como referencia; una GFP de otra especie tal como Renilla reniformis, Renilla mulleri o Ptilosarcus guernyi como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/49019 y Peelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519; GFP recombinante "humanizada" (hrGFP) (Stratagene); otros colorantes fluorescentes, por ejemplo cumarina y sus derivados, por ejemplo, 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina, colorantes bodipy tales como Bodipy FL, cascada azul (Cascade Blue), fluoresceína y sus derivados, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, verde Oregón, colorantes de rodamina, por ejemplo, rojo Texas, tetrametilrrodamina, eosinas y eritrosinas, colorantes de cianina, por ejemplo Cy3 y Cy5, quelatos macrocíclicos de iones de lantánidos, por ejemplo colorante quantum, etc., y colorantes quimioluminiscentes, por ejemplo, luciferasas.

BRET es un ensayo de interacción proteína-proteína basado en la transferencia de energía desde un donador bioluminiscente a una proteína aceptora fluorescente. La señal de BRET se mide por la cantidad de luz emitida por el aceptor con respecto a la cantidad de luz emitida por el donador. La relación entre estos dos valores aumenta según se acercan las dos proteínas. El ensayo BRET se ha descrito ampliamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.020.192; 5.968.750 y 5.874.304, y Xu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:151-156. Los ensayos de BRET pueden realizarse analizando la transferencia entre una proteína donadora bioluminiscente y proteínas aceptoras fluorescentes. La interacción entre las proteínas donadora y aceptora puede controlarse por un cambio en la relación de luz emitida por las proteínas bioluminiscente y fluorescente. En esta aplicación, la proteína MIZ-1 o la proteína tubulina sirve como proteína donadora y/o aceptora.

Agentes

La presente invención proporciona además agentes biológicamente activos identificados usando un método de la presente invención. Un agente biológicamente activo de la invención modula el nivel o la actividad de una tubulina desacetilasa. En algunas realizaciones, un agente que inhibe la tubulina desacetilasa es útil en un método para estabilizar la tubulina, reduciendo de esta manera la proliferación celular, y por lo tanto es útil para tratar cánceres.

En muchas realizaciones el agente es una molécula pequeña, por ejemplo un compuesto orgánico o inorgánico pequeño que tiene un peso molecular mayor de 50 y menor de aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente la formación de enlaces de hidrógeno, y pueden incluir al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes pueden comprender estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También pueden encontrarse agentes entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, un agente activo es un péptido. Los péptidos adecuados incluyen péptidos con una longitud de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 50, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 aminoácidos. Un péptido de interés inhibe la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa.

Los péptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. Los péptidos pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D-y L-aminoácidos, y diversos aminoácidos "de diseño" (por ejemplo, \beta-metil aminoácidos, C\alpha-metil aminoácidos y N\alpha-metil aminoácidos, etc.) para conferir propiedades especiales a los péptidos. Además, el péptido puede ser un péptido cíclico. Los péptidos pueden incluir aminoácidos no clásicos para introducir motivos conformacionales particulares. Puede usarse cualquier aminoácido no clásico conocido. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitación, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato; (2S,3S)-metilfenilalanina, (2S,3R)-metil-fenilalanina (2R,3S)-metilfenilalanina y (2R,3R)-metil-fenilalanina; ácido 2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico; hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato; \beta-carbolina (D y L); HIC (ácido histidina isoquinolina-carboxílico) y HIC-(histidina urea cíclica). En un péptido se pueden incorporar análogos de aminoácidos y peptidomiméticos para inducir o favorecer estructuras secundarias específicas incluyendo, pero sin limitación, LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), un análogo dipeptídico que induce giros \beta; análogos que inducen láminas \beta; análogos que inducen giros \beta; análogos que inducen hélices \alpha; análogos que inducen giros \gamma; análogos de giros Gly-Ala; isósteros de enlaces amida; tetrazol; y similares.

Un péptido puede ser un depsipéptido, que puede ser un depsipéptido lineal o cíclico. Kuisle et al. (1999) Tet. Letters 40:1203-1206. Los "depsipéptidos" son compuestos que contienen una secuencia de al menos dos aminoácidos alfa y al menos un ácido alfa-hidroxi carboxílico, que están unidos a través de al menos un enlace peptídico normal y enlaces éster, derivados de los ácidos hidroxi carboxílicos, donde los "depsipéptidos lineales" pueden comprender anillos formados a través de enlaces S-S, o a través de un grupo hidroxi o un grupo mercapto de un hidroxi- o mercapto-aminoácido y el grupo carboxilo de otro amino-o hidroxi-ácido pero no comprenden anillos formados únicamente a través de enlaces peptídicos o éster derivados de ácidos hidroxi carboxílicos. Los "depsipéptidos cíclicos" son péptidos que contienen al menos un anillo formado únicamente a través de enlaces peptídicos o éster, derivados de ácidos hidroxi carboxílicos.

Los péptidos pueden ser cíclicos o bicíclicos. Por ejemplo, puede inducirse la ciclación del grupo carboxilo C-terminal o un grupo éster C-terminal por desplazamiento interno del -OH del éster (-OR) del grupo carboxilo o éster, respectivamente, con el grupo amino N-terminal para formar un péptido cíclico. Por ejemplo, después de la síntesis y escisión para dar el ácido del péptido, el ácido libre se convierte en un éster activado por un activador de grupo carboxilo apropiado tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) en solución, por ejemplo, en mezclas de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y dimetilformamida (DMF). El péptido cíclico después se forma por desplazamiento interno del éster activado con la amina N-terminal. La ciclación interna en oposición a la polimerización puede mejorarse por medio del uso de soluciones muy diluidas. En la técnica se conocen bien métodos para obtener péptidos cíclicos.

El término "bicíclico" se refiere a un péptido en el que existen dos cierres de anillo. Los cierres de anillo se forman por enlaces covalentes entre aminoácidos presentes en el péptido. Un enlace covalente entre dos aminoácidos no adyacentes constituye un cierre de anillo, así como también un segundo enlace covalente entre un par de aminoácidos adyacentes que ya están unidos por un enlace peptídico covalente. Los enlaces covalentes que forman los cierres de anillo pueden ser enlaces amida, es decir, el enlace formado entre un grupo amino libre en un aminoácido y un carboxilo libre de un segundo aminoácido, o enlaces formados entre las cadenas laterales o grupos "R" de aminoácidos presentes en los péptidos. De esta manera, los péptidos bicíclicos pueden ser péptidos bicíclicos "verdaderos", es decir, péptidos ciclados por la formación de un enlace peptídico entre el extremo N y el extremo C del péptido, o pueden ser péptidos "depsi-bicíclicos", es decir, péptidos en los que los aminoácidos terminales están unidos de forma covalente a través de sus restos de cadena lateral.

En los extremos del péptido puede incorporarse un resto desamino o descarboxi, de forma que no haya ningún grupo amino o carboxi terminal, para reducir la susceptibilidad a proteasas o para restringir la conformación del péptido. Los grupos funcionales C-terminales incluyen amida, amida-alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi, y los derivados de éster inferior de los mismos, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Además de las modificaciones N-terminales y C-terminales anteriores, un péptido o peptidomimético puede modificarse o acoplarse covalentemente a uno o más de una diversidad de polímeros hidrófilos para aumentar la solubilidad y la vida media en circulación del péptido. Los polímeros hidrófilos no proteicos adecuados para el acoplamiento a un péptido incluyen, pero sin limitación, polialquiléteres ejemplificados por polietilenglicol y polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialquenos, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y derivados de dextrano, etc. En general, estos polímeros hidrófilos tienen un peso molecular medio que varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 100.000 daltons, de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 40.000 daltons, o de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 20.000 daltons. El péptido puede derivatizarse o acoplarse a dichos polímeros usando cualquiera de los métodos indicados en Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995); Patente de Estados Unidos Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; 4.179.337 o documento WO 95/34326.

Otro agente adecuado para reducir la actividad de la tubulina desacetilasa es un aptámero peptídico. Los aptámeros peptídicos son péptidos o polipéptidos pequeños que actúan como inhibidores dominantes de la función de las proteínas. Los aptámeros peptídicos específicamente se unen a proteínas diana, bloqueando su capacidad de funcionamiento. Kolonin y Finley, PNAS (1998) 95: 14266-14271. Debido a la naturaleza altamente selectiva de los aptámeros peptídicos, se pueden usar no sólo para dirigirse a una proteína específica, sino también para dirigirse a funciones específicas de una proteína dada (por ejemplo, una función de señalización). Además, los aptámeros peptídicos pueden expresarse de una forma controlada por medio del uso de promotores que regulan la expresión de una manera temporal, espacial o inducible. Los aptámeros peptídicos actúan de forma dominante; por lo tanto, pueden usarse para analizar proteínas para las que no se dispone de mutantes de pérdida de función.

Los aptámeros peptídicos que se unen con alta afinidad y especificidad a una proteína diana pueden aislarse por una diversidad de técnicas conocidas en este campo. Los aptámeros peptídicos pueden aislarse a partir de bibliotecas peptídicas aleatorias por medio de selecciones doble híbrido de levaduras (Xu et al., PNAS-(1997) 94:12473-12478). También pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos (Hoogenboom et al. Immunotechnology (1998) 4:1-20) o péptidos/bibliotecas generadas químicamente.

Los anticuerpos expresados intracelularmente, o intracuerpos, son moléculas de anticuerpos monocatenarios diseñadas para unirse específicamente e inactivar moléculas diana dentro de las células. Se han usado intracuerpos en ensayos celulares y en organismos enteros. Chen et al., Hum. Gen. Ther. (1994) 5:595-601; Hassanzadeh et al., Febs Lett. (1998) 16 (1,2): 75-80 y 81-86. Pueden construirse vectores de expresión inducibles con intracuerpos que reaccionan específicamente con la proteína tubulina desacetilasa. Estos vectores pueden introducirse en organismos modelo y estudiarse de la misma manera que se ha descrito anteriormente para los aptámeros.

En algunas de la invención, el agente activo es un agente que modula, en generalmente reduce o regula negativamente, la expresión del gen que codifica la tubulina desacetilasa en el hospedador. Estos agentes incluyen, pero sin limitación, ARN antisentido, ARN interferente, ribozimas y similares.

En algunas realizaciones, el agente activo es un ARN interferente (ARNi). El ARNi incluye ARN de interferencia bicatenario (ARNibc). El uso de ARNi para reducir el nivel de ARNm y/o proteína particular se basa en las propiedades de interferencia del ARN bicatenario procedente de las regiones codificantes del gen. En un ejemplo de este método, se sintetiza in vitro ARN con sentido y antisentido complementarios derivados de una parte sustancial del gen de la tubulina desacetilasa. Los ARN con sentido y antisentido resultantes se hibridan en un tampón de inyección, y el ARN bicatenario se inyecta o se introduce de otra manera en el sujeto (tal como en su alimento o sumergiéndolo en el tampón que contiene el ARN). Véase, por ejemplo, el documento W099/32619. En otra realización, se genera in vivo ARNbc derivado de un gen de tubulina desacetilasa por expresión simultánea tanto del ARN con sentido como del ARN antisentido a partir de promotores colocados de manera apropiada unidos de forma funcional a secuencias codificantes de la tubulina desacetilasa tanto en orientación con sentido como en orientación
antisentido.

Pueden usarse moléculas antisentido para regular negativamente la expresión del gen que codifica la tubulina desacetilasa en las células. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS) (oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión.

El reactivo antisentido puede ser oligonucleótidos antisentido (odn), particularmente odn sintéticos que tienen modificaciones químicas a partir de ácidos nucleicos nativos, o construcciones ácido nucleico que expresan dichas moléculas antisentido tales como ARN. La secuencia antisentido es complementaria al ARNm del gen diana, e inhibe la expresión de los productos del gen diana. Las moléculas antisentido inhiben la expresión del gen por medio de diversos mecanismos, por ejemplo, reduciendo la cantidad de ARNm disponible para la traducción, por medio de la activación de ARNsa H, o impedimento estérico. Puede administrarse una o una combinación de moléculas antisentido, donde una combinación puede comprender múltiples secuencias diferentes.

Las moléculas antisentido pueden producirse por expresión de todo o parte de secuencia del gen diana en un vector apropiado, donde la iniciación de la transcripción está orientada de tal manera que se produce una cadena antisentido como una molécula de ARN. Como alternativa, la molécula antisentido es un oligonucleótido sintético. Los oligonucleótidos antisentido generalmente tendrán una longitud de al menos aproximadamente 7, normalmente de al menos aproximadamente 12, más habitualmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos y no mayor de aproximadamente 500, normalmente no mayor de aproximadamente 50 y más habitualmente no mayor de aproximadamente 35 nucleótidos, controlándose la longitud por la eficacia de la inhibición, especificidad, incluyendo ausencia de reactividad cruzada, y similares. Se ha descubierto que ciertos oligonucleótidos cortos, de 7 a 8 de bases de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de la expresión génica (véase Wagner et al. (1996), Nature Biotechnol. 14:840-844). Como se conoce la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la tubulina desacetilasa humana (véase, por ejemplo, el Nº de acceso del GenBank NT 011109; y los Nº de acceso del GenBank NM_030593, NM_012237, AJ505014 y AF083107), los especialistas en la técnica pueden generar fácilmente ácidos nucleicos antisentido que reducen el nivel de un producto del gen de la tubulina desacetilasa humana en una célula.

Se elige una región o regiones específicas de la secuencia de ARNm de cadena con sentido endógena para que se complementen por la secuencia antisentido. La selección de una secuencia específica para el oligonucleótido puede usar un método empírico, donde se ensayan varias secuencias candidatas con respecto a la inhibición de la expresión del gen diana en un modelo animal o in vitro. También puede usarse una combinación de secuencias, donde varias regiones de la secuencia de ARNm se seleccionan para la complementación antisentido.

Los oligonucleótidos antisentido pueden sintetizarse químicamente por métodos conocidos en la técnica (véase Wagner et al., (1993), supra, y Milligan et al., supra.). Los oligonucleótidos preferidos se modifican químicamente a partir de la estructura de fosfodiéster nativa para aumentar su estabilidad intracelular y su afinidad de unión. En la bibliografía se han descrito varias de estas modificaciones, alterando dichas modificaciones la química de la estructura principal, azúcares o bases heterocíclicas.

Entre los cambios útiles en la química de la estructura principal se encuentran los fosforotioatos; fosforoditioatos, donde los dos oxígenos que no participan en los enlaces están sustituidos con azufre; fosforamiditas; alquil fosfotriésteres y boranofosfatos. Los derivados de fosfato aquirales incluyen 3'-O'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-O-fosforotioato, 3'-CH2-5'-O-fosfonato y 3'-NH-5'-O-fosforamidato. Los ácidos péptido nucleicos reemplazan la estructura principal entera de ribosa fosfodiéster con un enlace peptídico. También se usan modificaciones de azúcares para mejorar la estabilidad y la afinidad. Puede usarse el anómero \beta de desoxirribosa, donde la base está invertida con respecto al anómero \alpha natural. El 2'-OH del azúcar de ribosa puede alterarse para formar 2'-O-metil o 2'-O-alil azúcares, que proporcionan resistencia a la degradación sin comprometer la afinidad. La modificación de las bases heterocíclicas debe mantener un emparejamiento de bases apropiado. Algunas sustituciones útiles incluyen la sustitución de desoxitimidina por desoxiuridina; y desoxicitidina por 5-metil-2'-desoxicitidina y 5-bromo-2'-desoxicitidina. Se ha demostrado que la 5-propinil-2'-desoxiuridina y la 5-propinil-2'-desoxicitidina aumentan la afinidad y la actividad biológica cuando sustituyen a la desoxitimidina y desoxicitidina, respectivamente.

Las estructuras principales de oligonucleótidos modificados ilustrativos que no incluyen un átomo de fósforo del presente documento tienen estructuras principales que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de riboacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otros que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S y CH_{2}.

También pueden usarse oligonucleótidos que tienen una estructura principal de morfolino (Summerton, J. E. y Weller D. D. Patente de Estados Unidos Nº 5.034.506) o una estructura principal de ácido péptido nucleico (APN) (P. E. Nielson, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science 1991, 254: 1497). En la bibliografía se describen ampliamente oligonucleótidos antisentido con morfolino. Véase, por ejemplo, Partridge et al. (1996) Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 6:169-175, y Summerton (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489: 141-158.

Como alternativa a los inhibidores antisentido, pueden usarse compuestos de ácido nucleico catalíticos, por ejemplo ribozimas, conjugados antisentido etc., para inhibir la expresión génica. Las ribozimas pueden sintetizarse in vitro y administrarse al paciente, o pueden codificarse en un vector de expresión a partir del cual se sintetiza la ribozima en la célula diana (por ejemplo, véase la solicitud de patente internacional WO 9523225, y Beigelman et al. (1995), Nucl. Acids Res. 23:4434-42). En el documento WO 9506764 se describen ejemplos de oligonucleótidos con actividad catalítica. En Bashkin et al. (1995), Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56 se describen conjugados de ODN antisentido con un complejo metálico, por ejemplo, terpiridilCu(II), capaz de mediar la hidrólisis del ARNm.

Formulaciones, dosificaciones y vías de administración

La invención proporciona formulaciones, incluyendo formulaciones farmacéuticas, que comprenden un agente que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa. En general, una formulación comprende una cantidad eficaz de un agente que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa. Una "cantidad eficaz" significa una dosificación suficiente para producir un resultado deseado, por ejemplo, una reducción del nivel y/o actividad de la tubulina desacetilasa, estabilización de microtúbulos; una reducción en la desacetilación de tubulina; una reducción en la proliferación celular; y similares. En general, el resultado deseado es al menos una reducción en el nivel y/o actividad de la tubulina desacetilasa en comparación con un control.

Formulaciones

En los presentes métodos, el agente o agentes activos pueden administrarse al hospedador usando cualquier medio conveniente capaz de producir la reducción deseada en el nivel y/o actividad de la tubulina desacetilasa. De esta manera, el agente puede incorporarse en una diversidad de formulaciones para la administración terapéutica. Más particularmente, los agentes de la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas por combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados, y pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles.

En las formas de dosificación farmacéuticas, los agentes pueden administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también pueden usarse solos o en asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son simplemente ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse limitantes.

Para las preparaciones orales, los agentes pueden usarse solos o en combinación con aditivos apropiados para obtener comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes aromatizantes.

Los agentes pueden formularse en preparaciones para inyección por medio de su disolución, suspensión o emulsión en un disolvente acuoso o no acuoso tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.

Los agentes pueden utilizarse en una formulación de aerosol para administrarse por inhalación. Los compuestos de la presente invención pueden formularse en propulsores presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Además, los agentes pueden introducirse en supositorios por mezcla con una diversidad de bases tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía rectal a través de un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal y se solidifican a temperatura ambiente.

Pueden proporcionarse formas de dosificación unitarias para administración oral o rectal tales como jarabes, elixires y suspensiones donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más inhibidores. De forma similar, las formas de dosificación unitarias para inyección o administración intravenosa pueden comprender el inhibidor o inhibidores en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "forma de dosificación unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para la seres humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las nuevas formas de dosificación unitarias de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y del efecto a conseguir, y de la farmacodinámica asociada con cada compuesto en el hospedador.

Otros modos de administración también encontrarán utilidad con la presente invención. Por ejemplo, un agente de la invención puede formularse en supositorios y, en algunos casos, composiciones de aerosol e intranasales. En el caso de los supositorios, la composición de vehículo incluirá aglutinantes y vehículos tradicionales tales como polialquilenglicoles o triglicéridos. Estos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 10% (p/p), preferiblemente de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 2%.

Las formulaciones intranasales normalmente incluirán vehículos que no producen irritación en la mucosa nasal ni alteran significativamente la función ciliar. Con la presente invención pueden emplearse diluyentes tales como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tales como, pero sin limitación, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un tensioactivo para mejorar la absorción de las proteínas de la presente invención por la mucosa nasal.

Un agente de la invención puede administrarse como inyectables. Típicamente, las composiciones inyectables se preparan como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o el ingrediente activo puede encapsularse en vehículos de liposomas.

Son vehículos excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Se conocen métodos reales para preparar dichas formas de dosificación o serán evidentes para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17ª edición, 1985. La composición o formulación a administrar, en cualquier caso, contendrá una cantidad del agente adecuada para conseguir el estado deseado en el sujeto a tratar.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, soportes o diluyentes están disponibles fácilmente para el público. Además, están fácilmente disponibles para el público sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tales como agentes para ajustar el pH y tamponantes, agentes para ajustar la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares.

Dosificaciones

Aunque la dosificación usada variará dependiendo de los objetivos clínicos a conseguir, un intervalo de dosificación adecuado es uno que proporciona hasta aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1.000 \mug o aproximadamente 10.000 \mug de un agente que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa, que puede administrarse en una sola dosis. Como alternativa, una dosificación diana de un agente que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa puede considerarse aproximadamente en el intervalo de aproximadamente 0,1-1000 \muM, aproximadamente 0,5-500 \muM, aproximadamente 1-100 \muM, o aproximadamente 5-50 \muM en una muestra de sangre del hospedador extraída en las primeras 24-48 horas después de la administración del agente.

Los especialistas apreciarán fácilmente que los niveles de dosificación pueden variar en función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado se pueden determinar fácilmente por los especialistas en la técnica por una diversidad de medios.

Vías de administración

Un agente que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa se administra a un individuo usando cualquier método disponible y vía adecuada para la administración de fármacos, incluyendo métodos in vivo y ex vivo, así como vías de administración sistémicas y localizadas.

Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen las vías de administración intranasal, intramuscular, intratraqueal, intratumoral, subcutánea, intradérmica, tópica, intravenosa, rectal, nasal, oral y otras vías de administración parenterales. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea, o ajustarse dependiendo del

\hbox{agente y/o el efecto deseado. La composición puede
administrarse en  una sola dosis o en dosis múltiples.}

El agente puede administrarse a un hospedador usando cualquier método convencional disponible y vía adecuada para la administración de fármacos convencionales, incluyendo las vías sistémicas o localizadas. En general, las vías de administración contempladas por la invención incluyen, pero no necesariamente se limitan a las vías entérica, parenteral o por inhalación.

Las vías de administración parenterales distintas de la administración por inhalación incluyen, pero no necesariamente se limitan a las vías tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal e intravenosa, es decir, cualquier vía de administración distinta de la administración a través del canal alimentario. La administración parenteral puede realizarse para conseguir la liberación sistémica o local del agente. Cuando se desea la liberación sistémica, la administración típicamente implica la administración tópica o en la mucosa invasiva o absorbida sistémicamente de preparaciones farmacéuticas.

El agente también puede administrarse al sujeto por administración entérica. Las vías de administración entéricas incluyen, pero no necesariamente se limitan a la administración oral y rectal (por ejemplo usando un supositorio).

Los métodos de administración del agente a través de la piel o la mucosa incluyen, pero no se limitan necesariamente a la aplicación tópica de una preparación farmacéutica adecuada, transmisión transdérmica, inyección y administración epidérmica. Para la transmisión transdérmica, son métodos adecuados promotores de la absorción o iontoforesis. La transmisión iontoforética puede realizarse usando "parches" disponibles en el mercado que administran su producto continuamente por medio de pulsos eléctricos a través de la piel intacta durante periodos de varios días o más.

Por tratamiento se entiende al menos una mejoría de los síntomas asociados con la afección patológica que padece el hospedador, donde mejoría se usa en sentido amplio para hacer referencia a al menos una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, un síntoma asociado con la patología a tratar, tal como una hipersensibilidad alérgica. Como tal, el tratamiento también incluye situaciones en las que la patología, o al menos los síntomas asociados con ella, se inhiben completamente, por ejemplo se impide su aparición, o se detienen, por ejemplo se terminan, de tal forma que el hospedador ya no padece la patología, o al menos los síntomas que caracterizan la patología.

De acuerdo con los métodos de la presente invención se puede tratar a una diversidad de hospedadores (donde el término "hospedador" se usa indistintamente en el presente documento con los términos "sujeto" y "paciente"). Generalmente, estos hospedadores son "mamíferos" o de la clase "mammalia", donde estos términos se usan en sentido amplio para describir organismos que están dentro de la clase mammalia, incluyendo las órdenes carnívoro (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). En muchas realizaciones los hospedadores serán humanos.

Se proporcionan kits con dosis unitarias del agente activo, por ejemplo, en dosis orales o inyectables. En estos kits, además de los recipientes que contienen las dosis unitarias habrá un prospecto de información que describe el uso y los efectos beneficios asociados de los fármacos para tratar la patología de interés. Son compuestos preferidos y dosis unitarias los descritos en este documento anteriormente.

Terapias combinadas

La presente invención también proporciona métodos para tratar cánceres y métodos para reducir la proliferación celular indeseada, que implican administrar un agente que modula (por ejemplo inhibe) la tubulina desacetilasa; y un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente que inhibe la tubulina desacetilasa se administra como un adyuvante a una terapia convencional para el cáncer.

Las terapias convencionales para el cáncer incluyen cirugía (por ejemplo eliminación quirúrgica de tejido canceroso), radioterapia, trasplante de médula ósea, tratamiento quimioterapéutico, tratamiento modificador de la respuesta biológica y ciertas combinaciones de los anteriores.

La radioterapia incluye, pero sin limitación, rayos X o rayos gamma que se liberan desde una fuente aplicada externamente tal como un haz, o por implantación de fuentes radiactivas pequeñas.

Los agentes quimioterapéuticos son compuestos no peptídicos (es decir, no proteicos) que reducen la proliferación de las células cancerosas e incluyen agentes citotóxicos y agentes citostáticos. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, nitrosoureas, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides de plantas (vinca) y hormonas esteroideas.

En la técnica se conocen y se usan ampliamente agentes que actúan reduciendo la proliferación celular. Estos agentes incluyen agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos y triazenos incluyendo, pero sin limitación, mecloretamina, ciclofosfamida (Cytoxan^{TM}), melfalán (L-sarcolisina), carmustina-(BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU), estreptozocina, clorozotocina, mostaza de uracilo, clormetina, ifosfamida, clorambucilo, pipobroman, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, busulfán, dacarbazina y temozolomida.

Los agentes antimetabolito incluyen análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa incluyendo, pero sin limitación, citarabina (CYTOSAR-U), arabinósido de citosina, fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FudR), 6-tioguanina, 6-mercaptopurina (6-MP), pentostatina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato, 10-propargil-5,8-didesazafolato (PDDF, CB3717), ácido 5,8-didesazatetrahidrofólico (DDATHF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina.

Los productos naturales adecuados y sus derivados (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfoquinas y epipodofilotoxinas) incluyen, pero sin limitación, Ara-C, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, azatioprina; brequinar; alcaloides, por ejemplo vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por ejemplo, etopósido, tenipósido, etc.; antibióticos, por ejemplo antraciclina, clorhidrato de daunorubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidina), idarubicina, doxorubicina, epirubicina y derivados de morfolino, etc; bisciclopéptidos de fenoxizona, por ejemplo dactinomicina; glicopéptidos básicos, por ejemplo bleomicina; glicósidos de antraquinona, por ejemplo plicamicina (mitramicina); antracenodionas, por ejemplo mitoxantrona; azirinopirrolo indoldionas, por ejemplo mitomicina; inmunosupresores macrocíclicos, por ejemplo ciclosporina, FK-506 (tacrolimus, Prograf), rapamicina, etc., y similares.

Otros agentes citotóxicos antiproliferativos son navelbene, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafme, ciclofosfamida, ifosfamida y droloxafine.

También son adecuados para uso agentes que afectan a los microtúbulos y que tienen actividad antiproliferativa e incluyen, pero sin limitación, alocolchicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por ejemplo, NSC 33410 ), dolstatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®), derivados de Taxol®, docetaxel (Taxotere®), tiocolchicina (NSC 361792), tritil cisterina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, epotilonas naturales y sintéticas incluyendo, pero sin limitación, epotilona A, epotilona B, discodermolida; estramustina, nocodazol y similares.

Moduladores de hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos) que son adecuados para su uso incluyen, pero sin limitación, adrenocorticosteroides, por ejemplo prednisona, dexametasona, etc; estrógenos y progestinas, por ejemplo caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, estradiol, clomifeno, tamoxifeno, etc; y supresores adrenocorticales, por ejemplo aminoglutetimida; 17\alpha-etinilestradiol; dietilestilbestrol, testosterona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, metilprednisolona, metiltestosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, flutamida (Drogenil), toremifeno (Fareston) y Zoladex®. Los estrógenos estimulan la proliferación y diferenciación, por lo tanto, para bloquear esta actividad se usan compuestos que se unen al receptor de estrógenos. Los corticosteroides pueden inhibir la proliferación de células T.

Otros agentes quimioterapéuticos incluyen complejos metálicos, por ejemplo cisplatino (cis-DDP), carboplatino, etc.; ureas, por ejemplo, hidroxiurea; e hidrazinas, por ejemplo, N-metilhidrazina; epidofilotoxina; un inhibidor de topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur; etc. Otros agentes antiproliferativos de interés incluyen inmunosupresores, por ejemplo, ácido micofenólico, talidomida, desoxispergualina, azasporina, leflunomida, mizoribina, azaspirano (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metoxi-6-(3-(4-morfolinil)propoxi)quinazolina), etc.

"Taxanos" incluye paclitaxel, así como cualquier derivado de taxano activo o profármaco. El "paclitaxel" (que como debe entenderse en el presente documento incluye análogos, formulaciones y derivados tales como, por ejemplo, docetaxel, TAXOL^{TM}, TAXOTERE^{TM} (una formulación de docetaxel), 10-desacetil análogos de paclitaxel y 3'N-desbenzoil-3'N-t-butoxicarbonil análogos de paclitaxel) puede prepararse fácilmente utilizando técnicas conocidas por los especialistas en este campo (véanse también los documentos WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; Patentes de Estados Unidos Nº 5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534; 5.229.529; y EP 590.267), u obtenerse a partir de una diversidad de fuentes comerciales incluyendo, por ejemplo, Sigma Chemical Co., St Louis, Mo (T7402 de Taxus brevifolia; o T-1912 de Taxus yannanensis).

Debe entenderse que el paclitaxel se refiere no sólo a la forma común químicamente disponible de paclitaxel, sino también a análogos y derivados (por ejemplo, Taxotere^{TM} docetaxel, como se indicó anteriormente) y conjugados de paclitaxel (por ejemplo, paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano o paclitaxel-xilosa).

Dentro del término "taxano" también se incluyen una diversidad de derivados conocidos, incluyendo tanto derivados hidrófilos como derivados hidrófobos. Los derivados de taxano incluyen, pero sin limitación, derivados de galactosa y manosa descritos en la solicitud de patente internacional Nº WO 99/18113; derivados de piperazino y otros derivados descritos en el documento WO 99/14209; derivados de taxano descritos en los documentos WO 99/09021, WO 98/22451 y la patente de Estados Unidos Nº 5.869.680; 6-tio derivados descritos en el documento WO 98/28288; derivados de sulfenamida descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.821.263; y derivados de taxol descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.415.869. También incluye profármacos de paclitaxel incluyendo, pero sin limitación, los descritos en los documentos WO 98/58927, WO 98/13059, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.824.701.

Los modificadores de la respuesta biológica adecuados para uso en relación con los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación (1), inhibidores de la actividad tirosina quinasa (RTK); (2) inhibidores de la actividad serina/treonina quinasa; (3) antagonistas de antígenos asociados a tumores tales como anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno tumoral; (4) agonistas de receptores de apoptosis; (5) interleuquina-2; (6) IFN-\alpha; (7) IFN-\gamma; (8) factores estimuladores de colonias; (9) inhibidores de la angiogénesis; y (10) antagonistas del factor de necrosis tumoral.

Métodos terapeúticos

La presente invención proporciona métodos para modular la acetilación de tubulina; métodos para estabilizar los microtúbulos; métodos para reducir la proliferación celular indeseada; y métodos para tratar trastornos debidos a una proliferación celular indeseada. Los métodos generalmente implican administrar a un individuo una cantidad eficaz de un agente de la presente invención que modula (por ejemplo, inhibe) la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa (por ejemplo, SIRT2), en una cantidad eficaz para reducir la proliferación celular indeseada. Una cantidad eficaz de un agente de la presente invención reduce la proliferación celular y/o reduce la masa tumoral.

Un agente que inhibe la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa se administra a un paciente que lo necesita, por ejemplo un paciente que tiene cáncer.

En el contexto de la reducción de la proliferación celular indeseada, y la reducción de la masa tumoral, un cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa es una cantidad que reduce el nivel y/o la velocidad de proliferación celular y/o reduce la masa tumoral al menos en aproximadamente un 10%, al menos en aproximadamente un 20%, al menos en aproximadamente un 25%, al menos en aproximadamente un 30%, al menos en aproximadamente un 35%, al menos en aproximadamente un 40% al menos en aproximadamente un 45%, al menos en aproximadamente un 50%, al menos en aproximadamente un 55%, al menos en aproximadamente un 60%, al menos en aproximadamente un 65%, al menos en aproximadamente un 70%, al menos en aproximadamente un 80%, al menos en aproximadamente un 85%, o al menos en aproximadamente un 90% o más, en comparación con el nivel y/o velocidad de proliferación celular y/o masa tumoral en ausencia de tratamiento con un agente que inhibe la tubulina desacetilasa.

Puede determinarse si un agente particular reduce la velocidad y/o nivel de proliferación celular usando cualquier ensayo conocido. Por ejemplo, puede usarse un ensayo in vitro en el que se cultivan células (por ejemplo, células tumorales) en un medio de cultivo al que se le ha añadido un agente. La proliferación celular se determina usando cualquier ensayo conocido, por ejemplo, la incorporación de ^{3}H-timidina; o el recuento del número de células viables. El número de células viables puede contarse usando cualquier método conocido. Por ejemplo, se usa un método de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para determinar el número de células que se tiñen con un tinte de células viables (por ejemplo, di-O-acetato de fluoresceína, y similares), en comparación con el número de células teñidas con un colorante que normalmente no tiñe las células viables, tal como yoduro de propidio.

Puede determinarse si un régimen terapéutico particular de la invención es eficaz para reducir la proliferación celular indeseada, por ejemplo, en el contexto del tratamiento de cánceres, usando métodos convencionales. Por ejemplo, puede determinarse el número de células cancerosas en una muestra biológica (por ejemplo, sangre, una muestra de biopsia y similares). La masa tumoral puede determinarse usando métodos radiológicos convencionales.

Puede determinarse si una carga tumoral se ha reducido usando cualquier método conocido incluyendo, pero sin limitación, la medición de la masa tumoral sólida; el recuento del número de células tumorales usando ensayos citológicos; clasificación de células activadas por fluorescencia (por ejemplo, usando un anticuerpo específico para un antígeno asociado a tumores) para determinar el número de células que llevan un antígeno tumoral dado; exploración de tomografía computarizada, formación de imágenes de resonancia magnética y/o imágenes de rayos X del tumor para estimar y/o controlar el tamaño del tumor; medición de la cantidad de antígeno asociado a tumores en una muestra biológica, por ejemplo, sangre, suero, etc.; y similares.

Puede determinarse si se inhibe el crecimiento de un tumor usando cualquier método conocido incluyendo, pero sin limitación, un ensayo de proliferación celular in vitro (por ejemplo, recuento del número de células); un ensayo de captación de ^{3}H-timidina; y similares.

Un agente que inhibe la tubulina desacetilasa se administra por cualquier vía de administración. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen la vía intranasal, intramuscular, intratraqueal, intratumoral, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica, intravenosa, rectal, nasal, oral y otras vías de administración parenterales. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea, o ajustase dependiendo del agente y/o el efecto deseado.

El agente puede administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis. Por ejemplo, un agente que inhibe la tubulina desacetilasa se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, una semana sí y otra no (qow), una vez por semana (qw), dos veces por semana (biw), tres veces por semana (tiw), cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, un día sí y otro no (qod), diariamente (qd), dos veces al día (qid) o tres veces al día (tid), de una forma substancialmente continua o continua, durante un periodo de tiempo que varía de aproximadamente un día a aproximadamente una semana, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente cuatro semanas, de aproximadamente un mes a aproximadamente dos meses, de aproximadamente dos meses a aproximadamente cuatro meses, de aproximadamente cuatro meses a aproximadamente seis meses, de aproximadamente seis meses a aproximadamente ocho meses, de aproximadamente ocho meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 2 años, o de aproximadamente 2 años a aproximadamente 4 años o más.

En algunas realizaciones, un agente que inhibe una tubulina desacetilasa se administra como un adyuvante para una terapia convencional para el cáncer, como se ha descrito anteriormente.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un agente alquilante. En algunas realizaciones, el agente alquilante es una mostaza nitrogenada. En otras realizaciones, el agente alquilante es una etilenimina. En otras realizaciones, el agente alquilante es un alquilsulfonato. En otras realizaciones, el agente alquilante es un triazeno. En otras realizaciones, el agente alquilante es una nitrosourea.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un antimetabolito. En algunas realizaciones, el antimetabolito es un análogo de ácido fólico tal como metotrexato. En otras realizaciones, el antimetabolito es un análogo de purina tal como mercaptopurina, tioguanina y axatioprina. En otras realizaciones, el antimetabolito es un análogo de pirimidina tal como 5FU, UFT, capecitabina, gemcitabina y citarabina.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un alcaloide de la vinca. En algunas realizaciones, el alcaloide de la vinca es un taxano, tal como paclitaxel. En otras realizaciones, el alcaloide de la vinca es una podofilotoxina, tal como etopósido, tenipósido, ironotecan y topotecan.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un antibiótico antineoplásico. En algunas realizaciones, el antibiótico antineoplásico es
doxorubicina.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un complejo de platino. En algunas realizaciones, el complejo de platino es cisplatino. En otras realizaciones, el complejo de platino es carboplatino.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un inhibidor de tirosina quinasa. En algunas realizaciones, el inhibidor de tirosina quinasa es un inhibidor de una tirosina quinasa asociada a receptores (RTK), tal como inhibidores de tirosina quinasa asociada a receptores de tipo I (por ejemplo, inhibidores de receptores del factor de crecimiento epidérmico), inhibidores de tirosina quinasa asociada a receptores de tipo II (por ejemplo, inhibidores del receptor de insulina), inhibidores de tirosina quinasa asociada a receptores de tipo III (por ejemplo inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas) e inhibidores de tirosina quinasa asociada a receptores de tipo IV (por ejemplo, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos). En otras realizaciones, el inhibidor de tirosina quinasa es un inhibidor de tirosina quinasa no asociada a receptores tal como inhibidores de las quinasas src o las quinasas janus.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un inhibidor de una tirosina quinasa asociada a receptores implicada en una o más rutas de señalización de factores de crecimiento. En algunas realizaciones, el inhibidor es genisteína. En otras realizaciones, el inhibidor es un antagonista específico de tirosina quinasa asociada al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tal como gefitinib IRESSA^{TM}, erolotinib TARCEVA^{TM} o tirfostina AG1478 (4-(3-cloro-anilino)-6,7-dimetoxiquinazolina. En otras realizaciones, el inhibidor es cualquier antagonista de indolinona de la actividad tirosina quinasa de Flk-1/KDR (VEGF-R2). En otras realizaciones, el inhibidor es cualquiera de los siguientes: el antagonista 3-[(4,5,6,7-tetrahidro-1H-indol-2-il)metileno]-1,3-dihidroindol-2-ona sustituida de la actividad tirosina quinasa de Flk-1/KDR (VEGF-R2), FGF-R1 o PDGF-R. En realizaciones adicionales, el inhibidor es cualquier antagonista 3-[(3- o 4-carboxietilpirrol-2-il)metilidenil]indolin-2-ona sustituida de Flt-1 (VEGF-R1), Flk-1/KDR (VEGF-R2), FGF-R1 o PDGF-R.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un inhibidor de una tirosina quinasa no asociada a receptores implicada en una o más rutas de señalización de factores de crecimiento. En algunas realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la actividad tirosina quinasa de JAK2, tal como tirfostina AG490 (2-ciano-3-(3,4-dihidroxifenil)-N-(bencil)-2-propenamida). En otras realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la actividad tirosina quinasa de bcr-abl, tal como mesilato de imatinib
GLEEVEC^{TM}.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un inhibidor de serina/treonina quinasa. En algunas realizaciones, el inhibidor de serina/treonina quinasa es un inhibidor de serina/treonina quinasa asociada a receptores, tal como antagonistas de la actividad serina/treonina quinasa asociada al receptor de TGF-\beta. En otras realizaciones, el inhibidor de serina/treonina quinasa es un inhibidor de serina/treonina quinasa no asociado a receptores, tal como antagonistas de la actividad serina/treonina quinasa de las MAP quinasas, proteína quinasa C (PKC), proteína quinasa A (PKA), o las quinasas dependientes de ciclina (CDK).

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un inhibidor de una o más quinasas implicadas en la regulación del ciclo celular. En algunas realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la activación de CDK2, tal como trifostina AG490 (2-ciano-3-(3,4-dihidroxifenil)-N-(bencil)-2-propenamida). En otras realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la actividad CDK1/ciclina B, tal como alsterpaulona. En otras realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la actividad quinasa de CDK2 tal como indirubin-3'-monoxima.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de un taxano. En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de un taxano, y una cantidad eficaz de un complejo de platino. En algunas realizaciones, el taxano es paclitaxel y el complejo de platino es cisplatino o carboplatino.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un antagonista de antígeno asociado a tumores, tal como un anticuerpo antagonista. En algunas realizaciones que implican el tratamiento de tumores que expresan HER2, el antagonista de antígeno asociado a tumores es un anticuerpo monoclonal anti-HER2, tal como trastuzumab HERCEPTIN^{TM}. En algunas realizaciones que implican el tratamiento de tumores que expresan CD20, tales como linfomas de células B, el antagonista de antígeno asociado a tumores es un anticuerpo monoclonal anti-CD20, tal como rituximab RITUXAN^{TM}.

En algunas realizaciones, los métodos implican administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa, y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un antagonista de factor de crecimiento tumoral. En algunas realizaciones, el antagonista del factor de crecimiento tumoral es un antagonista del factor de crecimiento epidérmico (EGF), tal como un anticuerpo monoclonal anti-EGF. En otras realizaciones, el antagonista del factor de crecimiento tumoral es un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico erbB1 (EGFR), tal como un anticuerpo monoclonal anti-EGFR antagonista de la activación o transducción de señales de EGFR.

En algunas realizaciones, el agente que inhibe la tubulina desacetilasa es ribavirina o un derivado de ribavirina. La ribavirina, 1-\beta-D-ribofuranosil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida, disponible en ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif., se describe en el Merck Index, compuesto Nº 8199, decimoprimera edición. Su fabricación y formulación se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.211.771. La invención también contempla el uso de derivados de ribavirina (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.277.830). La ribavirina puede administrarse por vía oral en forma de cápsulas o de comprimidos. Por supuesto, se contemplan otros tipos de administración que están disponibles, tales como pulverización nasal, la vía transdérmica, intravenosa, por medio de supositorios, por una forma de dosificación de liberación sostenida, etc. Funcionará cualquier forma de administración siempre que se administren las dosificaciones apropiadas sin destruir el ingrediente activo.

La ribavirina generalmente se administra en una cantidad que varía de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 1200 mg al día, por ejemplo, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 125 mg, de aproximadamente 125 mg a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 600 mg, de aproximadamente 600 mg a aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1000 mg, o de aproximadamente 1000 mg a aproximadamente 1200 mg al día.

Son ejemplos no limitantes ilustrativos de terapias combinadas que incluyen tratamiento con radiación, agente inhibidor de tubulina desacetilasa o tratamiento con un agente quimioterapéutico y el agente inhibidor de tubulina desacetilasa, los siguientes:

1) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; y cisplatino en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 150 mg/m^{2};

2) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; y carboplatino en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 150 mg/m^{2};

3) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; y radiación en un intervalo de dosificación de aproximadamente 200 cGy a aproximadamente 8000 cGy;

4) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; y paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2};

5) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; y paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2}; y carboplatino en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 1000 mg/m^{2};

6) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; 5FU en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2}, y leucovorina en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente de 1000 mg/m^{2};

7) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; y trastuzumab en una dosis de carga inicial de 4 mg/kg y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg;

8) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; trastuzumab en una dosis de carga inicial de 4 mg/kg y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg; y paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2};

9) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2}; y fosfato de estramustina (Emcyte®) en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 1000 mg/m^{2};

10) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; cisplatino en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 150 mg/m^{2}, y 5FU en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2};

11) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; 5FU en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2}; y radiación en una dosis de aproximadamente 200 cGy a aproximadamente 8000 cGy; y

12) una dosificación de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa; 5FU en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2}; y paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2}.

En cualquiera de los ejemplos 1-12 de las terapias combinadas descritas anteriormente, puede administrarse al paciente por vía oral ribavirina en una dosis de aproximadamente 30 a aproximadamente 1200 mg/día.

Sujeto adecuado para el tratamiento

Un agente que reduce el nivel de tubulina desacetilasa y/o que inhibe la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa es útil para tratar cánceres en un paciente que tiene un cáncer. Los métodos son útiles para tratar una amplia diversidad de cánceres, incluyendo carcinomas, sarcomas, leucemias y linfomas. Un paciente que tiene cualquier cáncer es adecuado para el tratamiento con un método de la presente invención.

Los carcinomas que pueden tratarse usando un método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basales (una forma de cáncer de piel), carcinoma de células escamosas (diversos tejidos), carcinoma de vejiga, incluyendo carcinoma de células transicionales (un neoplasma maligno de la vejiga), carcinoma broncogénico, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma pulmonar, incluyendo carcinoma de células pequeñas y carcinoma de no microcítico de pulmón, carcinoma adrenocortical, carcinoma de tiroides, carcinoma de páncreas, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma de células renales, carcinoma ductal in situ o carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, carcinoma cervical, carcinoma uterino, carcinoma testicular, carcinoma osteogénico, carcinoma epitelial y carcinoma nasofaríngeo, etc.

Los sarcomas que pueden tratarse usando un método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, cordoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma y otros sarcomas de tejidos blandos.

Otros tumores sólidos que pueden tratarse usando un método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.

Las leucemias que pueden tratarse usando un método de la presente invención incluyen, pero sin limitación: a) síndromes mieloproliferativos crónicos (trastornos neoplásicos de células madre hematopoyéticas multipotenciales); b) leucemias mielógenas agudas (transformación neoplásica de una célula madre hematopoyéticas multipotencial o una célula hematopoyética de un potencial de linaje restringido; c) leucemias linfocíticas crónicas (CLL; proliferación clonal de linfocitos pequeños inmunológicamente inmaduros y funcionalmente incompetentes) incluyendo CLL de células B, CLL de células T, leucemia prolinfocítica y leucemia de células pilosas; y d) leucemias linfoblásticas agudas (caracterizadas por la acumulación de linfoblastos). Los linfomas que pueden tratarse usando un método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, linfomas de células B (por ejemplo, linfoma de Burkitt); linfoma de Hodgkin; y similares.

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Bibliografía para los ejemplos

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los especialistas habituales en la técnica una descripción y análisis completo de cómo realizar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden describir que los experimentos proporcionados a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es un peso molecular medio ponderal, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es la presión atmosférica o una presión cercana a ésta. Pueden usarse abreviaturas convencionales, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s, segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); y similares.

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Ejemplo 1

Caracterización de SIRT2 humana Procedimientos Experimentales Cultivo de tejidos

Se obtuvieron células HEK 293T y HeLa en la ATCC, se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gemini Bio-products, Woodland, CA) en presencia de penicilina, estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). HepG2 se obtuvo en la ATCC y se cultivó en el medio descrito anteriormente con la adición de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Plásmidos y mutagénesis

Para la SIRT2 recombinante, se alteró ADNc de SIRT2 humana en pHEX (una donación de R. Frye) para insertar un sitio de escisión de proteasa del factor Xa. Las construcciones SIRT1 y SIRT3 humanas también fueron una donación de R. Frye. Las SIRT4-7 humanas se clonaron a partir de bibliotecas de ADNc de testículo y de bazo (Clontech, Mountain View, CA) en el vector pcDNA3.1 (+) por estrategias basadas en PCR convencionales y se confirmaron por secuenciación. Todos los ADNc de SIRT se subclonaron para generar fusiones marcadas con FLAG en el extremo C en la estructura principal de pcDNA3.1(+) (In Vitrogen, Carlsbad, CA) y la SIRT2 humana de tipo silvestre se clonó en el vector pEGFP-C1 (Clontech, Mountain View, CA) por mutagénesis basada en PCR convencional. pEGFP-MIZ-1 fue una donación de J.E Wilson. La mutagénesis dirigida para las construcciones de SIRT2 se realizó usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) como describe el fabricante.

Purificación de SIRT2 recombinante

Se transformaron bacterias DH5\alphaF'IQ (Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) con el vector pHEX que contenía el ADNc de SIRT2 humana con el sitio de escisión del factor Xa y se indujeron con IPTG 0,1 mM a 37ºC durante 2 horas. La proteína marcada con His 6x resultante se purificó en condiciones nativas a 4ºC por Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA), desalificación con HiPrep 26/10 y cromatografías en Sepharose Q (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Se prepararon alícuotas de la proteína recombinante y se almacenaron a -20ºC.

Transfecciones transitorias e inmunoprecipitaciones

Se transfectaron células HEK 293T por el método de precipitación de ADN con fosfato cálcico y se lisaron 48 horas después de la transfección en tampón de lisis de baja rigurosidad (Tris-HC 50 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NP-40 al 0,5%, NaCl 150 mM) en presencia de cóctel inhibidor de proteasa (Complete, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Las proteínas marcadas con FLAG se inmunoprecipitaron con gel de afinidad de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma, St Louis, MO) y las proteínas marcadas con GFP se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal anti-GFP (Sigma, St Louis, MO) en presencia de proteína G Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) durante 2 horas a 4ºC. El material inmunoprecipitado se lavó 3 veces en tampón de lisis de baja rigurosidad y una vez en tampón de SIRT2 desacetilasa (Tris-HCI 50 mM, pH 9,0, MgCl_{2} 4 mM y ditiotreitol (DTT) 0,2 mM).

Extractos nucleares y citoplásmicos

Se transfectaron células HEK 293T como se ha descrito anteriormente y se sometieron a extracción nuclear y citoplásmica como se ha descrito previamente (Dignam et al., 1983) excepto por la adición de NP-40 al 1,0% al tampón C.

Ensayo de histona desacetilasa

Se resuspendieron material inmunoprecipitado y SIRT2 recombinante en 100 \mul de tampón de SIRT2 desacetilasa que contenía NAD (Sigma, St Louis, MO) y péptido H4 de histona acetilada [^{3}H] (a.a. 1-23) (Emiliani et al., 1998). Se resuspendió TSA (WACO BioProducts, Richmond, VA) en dimetil sulfóxido (DMSO), se diluyó adicionalmente en DMSO y se añadió a reacciones a la concentración deseada. Las reacciones se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se interrumpieron por la adición de 25 \mul de HCl 0,1 M y ácido acético 0,16 M. El acetato liberado se extrajo en 500 \mul de acetato de etilo y se sometió a agitación vorticial durante 15 minutos. Después de la centrifugación durante 5 minutos, se mezclaron 400 \mul de la fracción de acetato de etilo con 5 ml de líquido de centelleo y se contaron.

Transferencia de Western

Se separaron muestras en geles de dodecil sulfato sódico (SDS) al 10%-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Las membranas se bloquearon con reactivo de bloqueo al 5% (Bio-Rad, Hercules, CA) en TBS-Tween (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, y Tween-20 al 0,1%), se sondaron con anticuerpo anti-tubulina acetilada 6-11B-1, anti-tubulina B-5-1-2 o anti-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO), todos a una dilución 1:2000 o anticuerpo anti-péptido de colores vivos (Clontech, Mountain View, CA), anti-p65 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) o anti-Lamina A (Cell Signalling Technology, Inc., Beverly, MA) todos diluidos 1:1000. La detección secundaria se realizó usando IgG oveja anti-ratón acoplada a peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) o IgG de cabra anti-conejo (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), ambas diluidas 1:5000, y sistema de detección de transferencia de Western ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).

Inmunofluorescencia

Se transfectaron células HeLa cultivadas en cubreobjetos con reactivo LipofectAMINE (Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) durante 8 horas de acuerdo con el protocolo del fabricante o por el método de precipitación de ADN con fosfato cálcico. Las células transfectadas se incubaron durante 12 horas con TSA 400 nM (WACO BioProducts, Richmond, VA) 24 horas después de la transfección. Las células se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS y se fijaron durante 10 minutos en formaldehído al 4% (EMS, Ft. Washington, PA) seguido de permeabilización durante 10 minutos en Triton X-100 al 0,5% en PBS. Después de tres lavados durante 10 minutos en PBS, las células se incubaron durante 10 minutos BSA al 10% y se incubaron durante 1 hora con anti-tubulina acetilada 6-11B-1, anti-tubulina B-5-1-2 diluido 1:1000, o anti-FLAG M2 diluido 1:500 en detergente no iónico Tween-20^{TM} al 0,1%. Las células se lavaron tres veces en detergente no iónico Tween-20^{TM} al 0,1%, seguido de incubación con anticuerpo IgG conjugado con TRITC (con especificidad de Fc) de cabra anti-ratón. (Sigma, St. Louis) diluido 1:100 en detergente no iónico Tween-20^{TM} al 0,1%. Después de la incubación, las células se incubaron durante 5 minutos en 20 mg/ml de clorhidrato de 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez en ddH_{2}O y se montaron con Gel Mount (Biomeda Corp., Foster City, CA). Los portaobjetos se visualizaron en un sistema de microscopio Nikon E600 equipado con una cámara digital SPOT 2. Las imágenes confocales se adquirieron por microscopía de exploración láser confocal con un microscopio Olympus BX60 equipado con un sistema confocal Radiance 2000 (BioRad, Hercules, California).

Ensayo de desacetilación in vitro

Se resuspendieron inmunoprecipitaciones en 100 \mul de tampón de SIRT desacetilasa que contenía 50 \mug de lisado celular de células HEK 293T no transfectadas y NAD 1 mM. Las reacciones que contenían TSA 400 nM o nicotinamida 5 mM (Sigma, St. Louis, MO) se preincubaron a temperatura ambiente con todos los componentes de la reacción en ausencia de NAD durante 10 minutos. Después de la preincubación, las reacciones enzimáticas se iniciaron con la adición de NAD seguido de incubación durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación constante. Las reacciones se detuvieron por la adición de 50 \mul de tampón de electroforesis de SDS-gel de poliacrilamida (PAGE) 6x. Las perlas se sedimentaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos, se separaron 10 \mul de cada sobrenadante en geles de SDS-PAGE al 10% y se sometieron a transferencia de Western como se ha descrito anteriormente.

Cinética de péptidos de tubulina e histona H3 con Hst2p y SIRT2

Se hicieron reaccionar concentraciones crecientes de péptido de tubulina (20-900 \muM) y NAD 800 \muM en presencia de SIRT2 recombinante de 0,8 a 1 \muM en Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM y metanol al 10% a 37ºC. Para las reacciones de Hst2p, se hicieron reaccionar los péptidos de tubulina y NAD 500 \muM en presencia de Hst2p recombinante de 9 a 19 \muM en las mismas condiciones. Las reacciones se inactivaron con ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final del 1%. Se eligieron puntos de tiempo de tal forma que se observaran las condiciones de velocidad iniciales. Se inyectaron muestras en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una columna analítica Beckman C18. Después de la inyección, el sistema se hizo funcionar isocráticamente con disolvente A (TFA al 0,05% en H_{2}O), seguido de un gradiente de 0-10% de disolvente B (TFA al 0,02% en CH_{3}CN) durante 4 minutos y seguido de un gradiente de 10-23% de disolvente B durante 23 minutos. Los péptidos desacetilados y acetilados se eluyeron con CH_{3}CN al 16% y 18%, respectivamente. La elución de los sustratos y de los productos se controló midiendo la absorbencia a 214 nm, y los picos correspondientes se integraron usando el software Beckman System Gold Nouveau. La cantidad de producto se cuantificó calculando el porcentaje de péptido de tubulina desacetilado a partir del péptido de tubulina total basándose en sus valores de integración. Se ajustaron gráficos de velocidad frente concentraciones de péptido de tubulina a la ecuación de Michaelis-Menten para obtener los parámetros cinéticos de K_{m}, k_{cat} y V/K.

Como sustrato para Hst2p y SIRT2 se utilizaron el péptido de histona H3 monoacetilado ARTKQTARKSTGG(AcK)APRKQL (SEC ID Nº:03) (AcLys-14 H3). El péptido de H3 se marcó con ^{3}H usando la histona acetiltransferasa PCAF y se purificó como se ha descrito previamente (Tanner et al., 2000). Las mediciones de la velocidad utilizaron un ensayo de unión a carbón donde 70 \mul de reacciones HDAC se inactivaron en 10 \mul de suspensión de carbón (volumen de carbón frente a volumen de tampón glicina 1:3) que contenía glicina 2 M a pH 10,0. Los tiempos de reacción se eligieron (normalmente 2-5 minutos) de tal forma que se mantuvieran las velocidades iniciales en estado estacionario. Las muestras se calentaron inmediatamente durante \geq 20 minutos para liberar el acetato libre de la Ac-ADP ribosa antes de la centrifugación. El sobrenadante se trató con 10 \mul adicionales de suspensión de carbón antes de determinar el acetato libre total liberado (por recuento de centelleo de líquidos). Los datos se convirtieron en velocidades iniciales y se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten \nu_{0} = ([E]_{0}k_{cat} \cdot [S]/(K_{m}+[S]). Los experimentos de control indicaron que el péptido [^{3}H]-Ac-Lys H3 no se había hidrolizado de manera no enzimática. Además, la adición de carbón activado (a todos los valores de pH y temperaturas examinadas) detuvo inmediatamente la reacción enzimática. El calentamiento a alto pH sólo fue necesario para liberar el acetato de la Ac-ADP ribosa.

Histonas nucleares y proteínas de tubulina como sustratos

Se acetilaron histonas nucleares de timo de ternero (Calbiochem, San Diego, CA) usando 7,5-10 mg/ml de histonas de timo de ternero, AcCoA 100 \muM (\sim150 cpm/pmol, NEN), PCAF 10 \muM, en [DTT 5 mM, Tris 50 mM, pH 7,5] durante 1,5 h a 23ºC. La Acetil-CoA restante se retiró por exclusión molecular y las histonas marcadas se cuantificaron por recuento de centelleo de líquidos. Los ensayos de desacetilación se realizaron usando enzima 30-50 nM, NAD 500 \muM, histonas \sim1,2 \muM, pH 7,5 y 24 \pm 1ºC. La formación del producto se calculó a partir del ensayo de unión a carbón radiactivo.

Tratamientos con fármacos desestabilizadores de microtúbulos

Se trataron células HEK 293T, HeLa y HepG2 durante 6 horas con colchicinas 25 \muM (Sigma) y se lisaron en tapón de lisis de baja rigurosidad. Los lisados se equilibraron por concentración de proteína total, se separaron en geles de SDS-PAGE al 10% y se sometieron a transferencia de Western como se ha descrito anteriormente.

Resultados La proteína SIRT2 humana presenta actividad histona desacetilasa dependiente de NDA

Para determinar si SIRT2 contenía la actividad desacetilasa dependiente de NAD asociada con otras proteínas relacionadas con SIR2, se incubó SIRT2 recombinante purificada a partir de E. coli con concentraciones crecientes de NAD y un péptido correspondiente a la cola amino terminal de la histona H4 (a.a. 1-23) acetilado in vitro.

Las figuras 1A-D representan la desacetilación dependiente de NAD de un péptido de histona por SIRT2 humana. Figura 1A. Se midió la actividad enzimática de 6-His-SIRT2 recombinante sobre un péptido de histona H4 acetilado marcado con [^{3}H] (a.a. 1-23) en presencia de concentraciones crecientes de NAD. Se extrajo el acetato liberado y se midió por recuento de centelleo. Figura 1B. Se midió la actividad enzimática de proteína inmunoprecipitada procedente de células HEK 293T transfectadas con FLAG o SIRT2-FLAG en un péptido de histona H4 acetilado marcado con [^{3}H] (a.a. 1-23) en presencia de concentraciones crecientes de NAD. El 10% del material inmunoprecipitado introducido en la reacción enzimática se analizó por SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western con un anticuerpo anti-FLAG. Figura 1C. Reacción similar a la descrita en (B) con SIRT2-FLAG -/+ NAD o HDAC6-FLAG y concentraciones crecientes de TSA. SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western como se ha descrito en (B). Figura 1D. Reacción similar a la descrita en (B) con SIRT2-FLAG -/+ NAD y concentraciones crecientes de nicotinamida. SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western como se ha descrito en (B).

Se observó un aumento dependiente de la dosis en la actividad histona desacetilasa (HDAC) en respuesta a concentraciones crecientes de NAD (figura 1A). Un aumento adicional en la concentración de NAD a 10 mM produjo una reducción en la actividad desacetilasa (figura 1A). De manera similar, una proteína SIRT2 marcada con el epítopo FLAG (SIRT2-FLAG) se inmunoprecipitó después de la transfección de células HEK 293T. SIRT2-FLAG mostró un aumento similar en la actividad HDAC en respuesta a concentraciones crecientes de NAD desde 1 \muM a 1 mM (figura 1B). Sin embargo, esta actividad HDAC aumentó adicionalmente en respuesta a concentraciones de NAD de 10 mM (figura 1B). En cada reacción estaban presentes cantidades equivalentes de SIRT2-FLAG como se demuestra por el análisis de transferencia de Western (figura 1B).

Los resultados de los presentes solicitantes confirman que SIRT2 contiene actividad histona de desacetilasa dependiente de NAD como se ha descrito previamente (Tanner et al., 2000; Finnin et al., 2001). Además, la observación de que la SIRT2 recombinante es enzimáticamente activa indica que la actividad desacetilasa de SIRT2 no requiere factores asociados (figura 1A). Sin embargo, la presencia de factores asociados en lisados celulares podría jugar un papel en la mayor actividad observada en presencia de altas concentraciones de NAD (figura 1B).

A diferencia de las desacetilasas de clase I y de clase II, se ha notificado que las desacetilasas de clase III son insensibles al potente inhibidor de clase I y de clase II tricostatina A (TSA) (Yoshida et al., 1990; Furumai et al., 2001). Para confirmar que la actividad enzimática de SIRT2 es insensible a TSA, se midió la actividad enzimática de SIRT2-FLAG inmunoprecipitada con NAD 1 mM en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de TSA (100-1600 nM). No se midió ningún cambio en la actividad HDAC de SIRT2 en respuesta a concentraciones crecientes de TSA (figura 1C). Por el contrario, HDAC6-FLAG inmunoprecipitada a partir de células HEK-293T transfectadas se inhibió de forma potente por TSA 400 nM (figura 1C).

La nicotinamida representa el primer producto de la hidrólisis del enlace piridinio-N-glicosídico del NAD (Landry et al., 2000) y funciona como un inhibidor eficaz para la proteína SIRT1 relacionada (Luo et al., 2001). Para ensayar si SIRT2 también se inhibe por la nicotinamida, se incubó SIRT2-FLAG inmunoprecipitada procedente de lisados transfectados con concentraciones crecientes de nicotinamida. Se observó una reducción de la actividad HDAC dependiente de la dosis con concentraciones crecientes de nicotinamida que variaban de 156 \muM a 20 mM (figura 1D).

Las figuras 2A-C representan la inactivación de la actividad histona desacetilasa de SIRT2 por mutaciones puntuales dentro del dominio catalítico de SIRT2. Figura 2A. Diagrama esquemático de proteínas Sir2 procedentes de S. cerevisiae, C. elegans y Drosophila alineadas con SIRT2 humana dentro de una región del dominio Sir2 (esquema adaptado de (Frye, 1999)). Se destacan dos restos clave necesarios para la actividad histona desacetilasa (Finnin et al., 2001). Los números de acceso del Genbank de las proteínas descritas son: S. cerevisiae NP 010242, C. elegans NP 501912, D. melanogaster AAC79684 y SIRT2 humana NP 036369. Figura 2B. Se midió la actividad enzimática de la proteína inmunoprecipitada del vector FLAG y SIRT2-FLAG de tipo silvestre, N152A o células HEK 293T transfectadas con mutantes H187Y sobre un péptido de histona H4 acetilado marcado con [^{3}H] (a.a. 1-23) con o sin NAD. El 10% del material de inmunoprecipitación introducido en la reacción enzimática se analizó por SDS-PAGE y transferencia de Western con un anticuerpo anti-FLAG. Figura 2C. La actividad enzimática de la proteína inmunoprecipitada a partir de GFP o GFP-SIRT2 de tipo silvestre, N152A o mutantes H187Y se midió en el ensayo descrito en (B). SDS-PAGE y transferencia de Western como se describe en (B) usando un anticuerpo anti-GFP.

Las proteínas Sir2 contienen un dominio muy conservado, el dominio Sir2, asociado con la actividad enzimática. Se han identificado varios restos muy conservados dentro de este dominio que son necesarios para la actividad desacetilasa (destacados en la figura 2A) (Finnin et al., 2001). Para confirmar el papel de estos restos en la actividad desacetilasa, la asparagina 168 se sustituyó por una alanina y la histidina 187 por una tirosina dentro del contexto de SIRT2-FLAG y en una proteína de fusión entre GFP y el extremo N de SIRT2 (GFP-SIRT2). Se demostró que las dos proteínas inmunoprecipitadas con anti-FLAG o anti-GFP, respectivamente, contienen actividad dependiente de NAD (figura 2B, C). En las dos construcciones, las sustituciones N168A y H187Y anulaban esta actividad HDAC observada (figura 2B, C).

Distribución subcelular de SIRT2 humana

Aunque las HDAC de clase I permanecen exclusivamente en el núcleo, las HDAC de clase II se desplazan entre el núcleo y el citoplasma. El desplazamiento nucleocitoplásmico se regula por la fosforilación y representa un elemento en la regulación de su actividad enzimática (Fischle et al., 2001). De manera interesante, las HDAC de clase III presentan una distribución subcelular variable. Sir2\alpha de ratón y su homólogo humano SIRT1 se localizan principalmente en el núcleo (Vaziri et al., 2001; Luo et al., 2001). Por el contrario, la SIRT2 de ratón y humana se localizan principalmente en el citoplasma (Afshar y Murnane, 1999; Yang et al., 2000) y, de manera interesante, la proteína SIRT3 humana se localiza en las mitocondrias (Schwer et. al., presentado). La localización subcelular de SIRT2, como una proteína de fusión con GFP y como una proteína marcada con FLAG, se determinó por dos estrategias independientes. En primer lugar se purificaron extractos nucleares y citoplásmicos de células HEK 293T transfectadas y estos extractos se ensayaron por transferencia de Western con anticuerpos anti-GFP o anti-FLAG. GFP-SIRT2 era exclusivamente citoplásmica, mientras que SIRT2-FLAG era predominantemente citoplásmica con una pequeña fracción presente dentro del compartimento nuclear. El sondeo de las mismas fracciones para una proteína citoplásmica conocida, p65, y para una proteína nuclear conocida, Lamina A, confirmó la pureza de las fracciones citoplásmicas y nucleares de los presentes solicitantes.

En segundo lugar se usó microscopía de inmunofluorescencia para confirmar adicionalmente la localización subcelular de SIRT2. Después de la transfección de GFP-SIRT2 y SIRT2-FLAG en células HeLa, se observó una localización exclusivamente citoplásmica para las dos proteínas de fusión. Además, se detectó que SIRT2 estaba localmente más concentrada en un eje apolar del núcleo. Este patrón de localización coincidía con el aumento característico en la localización de tubulina en el centro de organización de los microtúbulos (MTOC), también localizado en un eje apolar del núcleo.

Desacetilación de tubulina por SIRT2 humana in vivo

La localización de SIRT2 en una región correspondiente al MTOC llevó a los presentes solicitantes a ensayar si SIRT2 puede desacetilar la tubulina. Después de la transfección de células HeLa con GFP-SIRT2, que se mantiene catalíticamente activa como una desacetilasa (figura 2C), las células se tiñeron con un antisuero específico para la \alpha-tubulina acetilada en la lisina-40 (Piperno et al., 1987). Se descubrió que las células que expresaban GFP-SIRT2 mostraban una notable reducción en la tubulina acetilada en comparación con células no transfectadas vecinas. Como control, las células transfectadas con un vector de expresión para GFP sola no presentaban ninguna alteración en el nivel de tubulina acetilada. Se consideraron dos posibilidades para explicar estos resultados. En primer lugar, SIRT2 podía ser una tubulina desacetilasa auténtica. En segundo lugar, la SIRT2 activa puede regular la dinámica de la polimerización de tubulina dando como resultado de esta manera microtúbulos polimerizados reducidos, lo cual puede afectar al estado de acetilación de la \alpha-tubulina. Para responder a esta cuestión, las células transfectadas con GFP-SIRT2 se tiñeron con un antisuero que reconoce la \alpha-tubulina independientemente del estado de acetilación. No se observó ningún cambio visible en la red de microtúbulos en células transfectadas con GFP-SIRT2 en comparación con las células no transfectadas. Estos resultados son coherentes con el modelo de que SIRT2 es una tubulina desacetilasa funcional.

Para verificar que la actividad desacetilasa de SIRT2 era necesaria para la desacetilación de la \alpha-tubulina, se introdujeron vectores de expresión de GFP-SIRT2 que contenían las mutaciones catalíticamente inactivas de los presentes solicitantes N168A y H187Y en células HeLa mediante transfección. Se observó que el mutante catalíticamente inactivo SIRT2 no tenía ningún efecto sobre el nivel de \alpha-tubulina acetilada. Estos resultados indican que la expresión de SIRT2 tipo silvestre in vivo conduce a la desacetilación de la lisina-40 en la \alpha-tubulina, mediada por la actividad desacetilasa de SIRT2.

La SIRT2 humana desacetila tubulina in vitro

Para ensayar directamente la capacidad de SIRT2 de desacetilar la \alpha-tubulina, se desarrolló un ensayo de desacetilación de tubulina ex vivo. En este ensayo, se transfectaron células HEK 293T con SIRT2-FLAG seguido de inmunoprecipitación de la proteína marcada con FLAG (figura 3A). El material inmunoprecipitado se separó en dos fracciones. La primera fracción se usó para medir la actividad HDAC usando el péptido de la histona H4 acetilado. La segunda fracción se usó para un ensayo de la actividad de desacetilación de tubulina (figura 3A) usando lisados celulares totales procedentes de células HEK 293T no transfectadas como sustrato para la \alpha-tubulina acetilada. El grado de acetilación/desacetilación de \alpha-tubulina se determinó por análisis de transferencia de Western usando un antisuero específico para la \alpha-tubulina acetilada. En primer lugar, se demostró que el material inmunoprecipitado después de la transfección de células HEK 293T con un vector FLAG vacío no tenía ningún efecto sobre la acetilación de tubulina (figura 3B, calle 1). Este resultado demuestra que ni el lisado utilizado como sustrato de \alpha-tubulina acetilada ni el procedimiento de inmunoprecipitación llevan niveles significativos de actividad tubulina desacetilasa. Por el contrario, la incubación del lisado celular con la proteína SIRT2-FLAG inmunoprecipitada desacetilaba la tubulina de una manera dependiente de NAD (figura 3B, calles 2 y 3). Además, se confirmó que los mutantes catalíticamente inactivos N168A y H187Y no desacetilan la \alpha-tubulina (figura 3B, calles 4 y 5).

Los seres humanos contienen siete proteínas muy conservadas con homología con Sir2p de S. cerevisiae (Frye, 1999; Frye, 2000). Para determinar si la actividad de desacetilación de la \alpha-tubulina se restringía a SIRT2, se expresaron las siete proteínas Sir2 humanas marcadas con FLAG en el extremo C en células HEK 293T y se inmunoprecipitaron. El material inmunoprecipitado se ensayó en el ensayo de desacetilación de tubulina ex vivo de los presentes solicitantes y en el ensayo de actividad HDAC usando el péptido de histona H4. De las siete proteínas SIRT, sólo SIRT1, 2 y 3 demostraron una actividad HDAC significativa sobre un péptido de histona H4 (figura 3C). SIRT4, 5, 6 y 7 no tuvieron actividad HDAC detectable (figura 3C). Por el contrario, sólo SIRT2 desacetilaba la tubulina in vitro (figura 3C). Estos resultados demuestran que SIRT2 es la única proteína desacetilasa de clase III capaz de desacetilar la tubulina.

El tratamiento de células con el inhibidor de HDAC de la clase I y de clase II TSA induce la hiperacetilación de la \alpha-tubulina (Grozinger et al., 2001). Este resultado sugiere que una HDAC de clase I o de clase II también puede desacetilar la \alpha-tubulina. Como las HDAC de clase I son exclusivamente nucleares, las HDAC de clase II, que se sabe que se desplazan entre el núcleo y el citoplasma, fueron el objetivo de este estudio. Las HDAC4, 5, 6 y 7 se marcaron con FLAG en el extremo C, se introdujeron por transfección en células HEK 293T, se inmunoprecipitaron y se ensayaron con respecto a la actividad HDAC y la actividad tubulina desacetilasa. Todas las HDAC de clase II mostraron una actividad desacetilasa abundante en el péptido H4 acetilado (figura 3D). Sin embargo, ninguna de las HDAC de clase II ensayadas contenían actividad tubulina desacetilasa (figura 3D).

La purificación de un complejo SET3 de S. cerevisiae ha identificado HDAC de clase I y de clase III presentes en el mismo complejo multiproteína (Pijnappel et al., 2001). Para confirmar que una proteína de tipo SIR2 es el único componente en la inmunoprecipitación responsable de la desacetilación de tubulina, se ensayó si la nicotinamida podía inhibir la actividad tubulina desacetilasa asociada con SIRT2. Se transfectaron células HEK 293T con SIRT2-FLAG o el vector vacío como control, seguido de inmunoprecipitación usando anti-FLAG. No se detectó desacetilación en ausencia de NAD (figura 3E, calle 2).La adición de NAD a la reacción SIRT2-FLAG condujo a la desacetilación completa de la tubulina. Esta reacción se inhibió completamente en presencia de nicotinamida 5 mM (figura 3E, calles 3 y 4). Como control, la tricostatina A, un potente inhibidor de las HDAC de clase I y de clase II, no tuvo ningún efecto sobre la desacetilación de tubulina por SIRT2 (figura 3E, calle 5). Estos resultados confirman que la única tubulina desacetilasa encontrada dentro del material de SIRT2 inmunoprecipitado es SIRT2.

Las figuras 3A-E demuestran que SIRT2 desacetila la tubulina ex vivo. Figura 3A. Diagrama esquemático del ensayo de desacetilación de tubulina ex vivo. Figura 3B. La proteína inmunoprecipitada correspondiente a SIRT2-FLAG de tipo silvestre, N168A o H187Y, se incubó con lisado celular in vitro. Los productos de reacción se separaron por SDS-PAGE y transferencia de Western usando antisuero específico para la tubulina acetilada, tubulina y FLAG. La mitad de la inmunoprecipitación se sometió a un ensayo de la actividad HDAC usando un péptido de histona H4 acetilado in vitro. Figura 3C. Ensayo de desacetilación de tubulina similar usando las siete HDAC de clase III, SIRT1-7-FLAG, como se ha descrito para (B). La mitad de la inmunoprecipitación se sometió al ensayo de actividad HDAC descrito para (B). Figura 3D. Ensayo de desacetilación de tubulina similar usando las HDAC de clase II descritas para (B). La mitad de la inmunoprecipitación se sometió al ensayo de actividad HDAC descrito para (B). Figura 3E. La inhibición de la desacetilación de la tubulina por SIRT2 se examinó usando el ensayo de desacetilación de tubulina similar con SIRT2-FLAG como en (B) incluyendo reacciones incubadas con nicotinamida 5 mM o TSA 400 nM.

Cinética enzimática de SIRT2 humana y Hst2p de levadura

Para analizar adicionalmente la desacetilación de tubulina por SIRT2, se realizó un análisis enzimático detallado. Con fines comparativos, se analizó la histona desacetilasa de levadura de alta actividad Hst2p paralelamente con la enzima humana. Hst2p muestra una fuerte selectividad por péptidos correspondientes a la histona H3 acetilada en la lisina-14 (Tanner et al., 2000; Landry et al., 2000). Se utilizó un péptido de \alpha-tubulina sintético de 9 aminoácidos (MPSD(AcK)TIGG; SEC ID Nº:08) acetilado en la lisina-40 y un péptido sintético de 20 aminoácidos de la histona H3 (ARTKQTARKSTGG(AcK)APRKQL; SEC ID Nº:03), acetilado en la lisina-14, para medir las velocidades iniciales de Hst2p y SIRT2 a diversas concentraciones de péptido de histona H3 o tubulina. Las curvas de saturación resultantes se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten, produciendo los parámetros cinéticos k_{cat}, K_{m} y V/K. El valor K_{cat} es la velocidad máxima de renovación de la enzima cuando los sustratos están en concentraciones de saturación. El valor de K_{m} es la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima. La constante más relevante desde el punto de vista fisiológico es el valor de V/K, ya que esta constante de segundo orden define la velocidad de la reacción cuando las concentraciones de sustrato no están a niveles de saturación, y refleja tanto la unión al sustrato como la catálisis. Como las reacciones enzimáticas celulares rara vez se producen en condiciones de velocidad máxima (es decir, niveles de sustrato de saturación), es probable que grandes diferencias en el valor de V/K de la enzima reflejen las consecuencias más relevantes in vivo.

Con péptidos de tubulina acetilados como sustrato, SIRT2 presentó una preferencia sorprendente por este sustrato en comparación con Hst2p de levadura (figura 4A). Esta diferencia fue de \sim60 veces y se reflejó tanto en los valores de K_{cat} como en los de V/K, que fueron de 0,144 \pm 0,005 s^{-1} y 894 \pm 100 M^{-1}s^{-1} para SIRT2 y de 0,00254 \pm 0,0003 s^{-1} y 14,9 M^{-1}s^{-1} para Hst2p, respectivamente. Por el contrario, cuando se empleó el péptido de H3 acetilado como sustrato, Hst2p demostró una preferencia \sim200 veces más fuerte por el péptido H3 con respecto a SIRT2 (figura 4B). Estas diferencias se reflejaron en los valores de V/K y K_{m}, que fueron de 3930 \pm 261 M^{-1}s^{-1} y 54,2 \pm 3,6 \muM para SIRT2, y de 717.900 \pm 35.900 M^{-1}s^{-1} y 0,280 \pm 0,014 \muM para Hst2p, respectivamente. Los valores de k_{m} (\sim0,2 s^{-1}) fueron similares entre las dos enzimas.

Estos resultados indican que la familia Sir2 de las desacetilasas dependientes de NAD presenta notables diferencias en la especificidad por el sustrato, y que la SIRT2 humana presenta una notable preferencia por el péptido de tubulina acetilado con respecto a la enzima Hst2p de levadura (figura 4A, C y D). Para proporcionar pruebas adicionales de que SIRT2 tiene una capacidad reducida para desacetilar histonas en comparación con Hst2p, se examinó la capacidad de SIRT2 y Hst2p para desacetilar histonas nucleares. Se incubaron histonas purificadas acetiladas in vitro por PCAF con cantidades catalíticas de SIRT2 o Hst2p, y se cuantificó la desacetilación (figura 4C). Se determinaron los valores de V/K aparentes y se compararon. De acuerdo con los resultados de péptidos, Hst2p presentó un valor de V/K 7 veces mayor que SIRT2.

Las figuras 4A-D representan la preferencia de substrato para SIRT2. Figura 4A. Velocidades iniciales medidas a concentraciones variables de péptido de tubulina, (MPSD(AcK)TIGG) para SIRT2 (círculos blancos) y para Hst2p (círculos negros) con las concentraciones y condiciones descritas en materiales y métodos. La curva con SIRT2 representa las velocidades medias de 3 experimentos diferentes. La curva de Hst2p es una serie de datos representativos de 1 de 3 experimentos distintos. Las concentraciones de NAD indicadas son saturantes con respecto a cada enzima.

Figura 4B. Velocidades iniciales para cada enzima medidas a diversas concentraciones de péptido H3 acetilado (ARTKQTARKSTGG(AcK)APRKQL; SEC ID Nº:03) para SIRT2 (círculos blancos) y para Hst2p (círculos negros) con las concentraciones y condiciones descritas en materiales y métodos. Las concentraciones de NAD indicadas son saturantes con respecto a cada enzima.

Figura 4C. Curvas de progreso cinético de desacetilación de histona por SIRT2 y Hst2p. SIRT2 (50 nM) o Hst2p (20 nM) se incubaron con histonas de núcleo de timo de ternero acetiladas con PCAF \sim1,2 \muM.

Figura 4D. La tabla que indica los resultados cuando los gráficos de (A) y (B) se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten para obtener los parámetros cinéticos de K_{m}, k_{cat} y V/K.

Regulación de la unión a microtúbulos de MIZ-1 por acetilación de \alpha-tubulina

Un informe reciente documentó la formación de complejos del factor de transcripción, dedo de zinc 1 de interacción con Myc (MIZ-1), por medio de la unión a tubulina en microtúbulos polimerizados (Ziegelbauer et al., 2001). En este informe, los autores sugieren que después de la despolimerización de la red de microtúbulos, MIZ-1 se libera por su unión a tubulina y es libre para translocarse al núcleo. De forma interesante, cuando se averiguó el estado de polimerización de tubulina por tratamiento con colchicina o nocodazol, se observó las desacetilación de tubulina en respuesta a la despolimerización por los dos tratamientos (figura 5A). Además, se observó que sólo los microtúbulos polimerizados pueden servir como sustrato para la acetilación de \alpha-tubulina por la tubulina acetiltransferasa aún no definida. En su informe, Ziegelbauer et al. demuestra que en la línea de células de carcinoma hepatocelular, HepG2, MIZ-1 tiene una localización predominantemente citoplásmica. De forma interesante, cuando se examinó la localización de GFP-MIZ-1 en células HeLa, que tienen un bajo nivel de \alpha-tubulina acetilada, se descubrió que está localizado predominantemente en el núcleo. Sin embargo, cuando estas células se trataron con TSA, lo cual conduce a una hiperacetilación de tubulina, se observó un claro desplazamiento en la localización de GFP-MIZ-1 desde el núcleo al citoplasma.

Para determinar si esta relocalización de MIZ-1 al citoplasma después del tratamiento de las células con TSA depende del estado de acetilación de la \alpha-tubulina, se utilizó la actividad desacetilasa de SIRT2. Después de la cotransfección de las células con GFP-MIZ-1 y el vector FLAG, SIRT2-FLAG de tipo silvestre o el mutante N168A catalíticamente inactivo de SIRT2-FLAG, se observó que en todos los casos GFP-MIZ-1 se localizaba predominantemente en el núcleo (figura 5B). Sin embargo, después del tratamiento de estas células con TSA, se observó una relocalización estadísticamente significativa de GFP-MIZ-1 en el citoplasma cuando GFP-MIZ-1 se cotransfectaba con el vector vacío FLAG o el SIRT2-FLAG N168A catalíticamente inactivo del 36,9% y del 35,3% respectivamente (figura 5B). Sin embargo, cuando el GFP-MIZ-1 se cotransfectaba con SIRT2-FLAG de tipo silvestre se observó una reducción significativa en el porcentaje de células con GFP-MIZ-1 localizado en el citoplasma hasta el 11,2% (figura 5B). En su informe, Ziegelbauer et al., demuestran la colocalización de MIZ-1 con la red de microtúbulos en células HepG2, donde MIZ-1 está localizado aparentemente de forma predominante en el citoplasma.

Como se ha demostrado anteriormente en células HeLa, GFP-MIZ-1 está localizado principalmente en el núcleo. Para descartar la posibilidad de que la versión marcada con GFP de MIZ-1 estuviera alterando la capacidad de MIZ-1 de unirse a tubulina, se ensayaron la localización subcitoplásmica en células cotransfectadas con GFP-MIZ-1 y vectores FLAG vacíos y tratadas con TSA. Se visualizó una colocalización de GFP-MIZ-1 con tubulina acetilada por microscopía confocal. Esta colocalización indica que GFP-MIZ-1 mantiene la capacidad de unirse a la tubulina e indica que después del tratamiento de células transfectadas con TSA, GFP-MIZ-1 se translocará desde el núcleo al citoplasma donde se unirá a la red de microtúbulos hiperacetilados. Estos datos sugieren que la distribución subcelular de MIZ-1 se regula no sólo por el estado de polimerización de la tubulina, sino también por el estado de acetilación de la \alpha-tubulina dentro de la red de microtúbulos.

Las figuras 5A y 5B representan la regulación de la distribución subcelular de MIZ-1 por la tubulina acetilada.

Figura 5A. Se trataron células HeLa, 293T y HepG2 con 10 \mug/ml de colchicina o 1 \mug/ml de nocodazol durante 6 horas. Las células se recogieron y los lisados se separaron por SDS-PAGE y transferencia de Western usando antisuero específico para tubulina acetilada y tubulina.

Figura 5B. Las células transfectadas se contaron como GFP-MIZ-1 localizado completamente en el núcleo o con una retención citoplásmica parcial. Los recuentos de células se obtuvieron por inspección de al menos 150 células transfectadas de seis campos microscópicos. Los resultados son medias de tres transfecciones distintas representando las barras de error la desviación típica entre cada transfección. La serie de datos es representativa de tres experimentos independientes.

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Ejemplo 2

Inhibición de SIRT2

Basándose en la dependencia de las proteínas SIRT del NAD, se ensayaron varias moléculas con homología de estructura con el NAD como posibles inhibidores de su actividad enzimática. La molécula caracterizada previamente de 1-\beta-D-Ribofuranosil-1-2-4-triazol-3-carboxamida (Ribavirina) se ha usado como un agente antiviral aprobado contra la hepatitis C y es un análogo de la parte de nicotinamida del NAD.

La actividad inhibidora de la ribavirina contra las proteínas SIRT2 y SIRT3 se ensayó usando proteínas SIRT2 recombinantes y un ensayo in vitro. Se incubó ribavirina con proteína recombinante sólo en tampón durante 10 minutos; y después se añadieron NAD y sustrato para iniciar la reacción. Las reacciones se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las reacciones se interrumpieron añadiendo 25 \mul de tampón de terminación (HCl 0,1 M, ácido acético 0,16 M) y agitando con vórtice brevemente. La extracción con acetato de etilo aisló todos los grupos acetilo liberados. Se añadió acetato de etilo (0,5 ml), la mezcla de agitó con vórtice durante 15 segundos y se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos. La fase superior (0,4 ml) se añadió a 5 ml de líquido de centelleo (Econofluor-2; Packard) y se contó.

Los resultados se muestran en la Figura 7. La ribavirina inhibió la actividad HDAC in vitro de la SIRT2 con una inhibición de aproximadamente el 50% a 25 \muM, pero no tuvo ningún efecto sobre la actividad HDAC in vitro de la SIRT3. Este experimento demuestra la identificación de un inhibidor nuevo y específico para SIRT2.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción

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Eric M. Verdin

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<120> Métodos para Modular la Actividad Tubulina Desacetilasa

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<130> UCAL-274WO

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<140> No cedido

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<141> 2003-05-20

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<160> 9

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1963

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 389

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido de histona H3 monoacetilado

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<221> ACETILACIÓN

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<222> (14)...(14)

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<223> Xaa = lisina acetilada

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<221> VARIANTE

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<222> 14

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<223> Xaa = Cualquier aminoácido

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<400> 3

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3

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<210> 4

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<211> 52

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<212> PRT

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<213> S. cerevisiae

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<400> 4

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4

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<210> 5

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> C. elegans

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<400> 5

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5

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<210> 6

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Drosophila

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<400> 6

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6

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<210> 7

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<211> 54

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<212> PRT

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<213> H. sapiens

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<400> 7

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\hskip0,7cm

7

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido sintético de a-tubulina

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<221> ACETILACIÓN

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<222> (5)...(5)

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<223> Xaa = lisina acetilada

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<221> VARIANTE

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<222> 5

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<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

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<400> 8

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\hskip1cm

8

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<210> 9

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<211> 803

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<212> PRT

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<213> H. sapiens

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<400> 9

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\hskip0,7cm

9

\hskip0,8cm

10

\hskip0,8cm

11

Claims (15)

1. Un método in vitro para identificar un agente que modula la actividad enzimática de una tubulina desacetilasa dependiente de NAD humana, comprendiendo el método:

poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD con un agente de prueba en una mezcla de ensayo que comprende NAD y un péptido de tubulina acetilado; y

determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa dependiente de NAD.

2. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID Nº:02.

3. El método de la reivindicación 1, donde el péptido de tubulina acetilado comprende la secuencia NH_{2}-MPSD(AcK)TIGG.CO_{2}(SEC ID Nº:08).

4. El método de la reivindicación 1, donde el péptido de tubulina acetilado contiene un grupo acetilo marcado con ^{14}C en una lisina correspondiente a la Lys-40 de la tubulina nativa, y dicha determinación se realiza midiendo la liberación del grupo acetilo radiactivo.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicha determinación se realiza detectando la unión de un anticuerpo específico para la tubulina acetilada.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicha determinación se realiza detectando la unión entre tubulina y la proteína Miz-1.

7. Un método in vitro para identificar un agente que modula el nivel de tubulina desacetilasa dependiente de NAD en una célula, comprendiendo el método:

poner en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa dependiente de NAD con un agente de prueba; y

determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre el nivel de tubulina desacetilasa dependiente de NAD.

8. El método de la reivindicación 7, donde dicha determinación comprende determinar el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa dependiente de NAD en la célula.

9. El método de la reivindicación 7, donde dicha determinación comprende determinar el nivel de polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD en la célula.

10. Un método para modular la proliferación celular, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un agente que inhibe la tubulina desacetilasa dependiente de NAD.

11. El método de la reivindicación 12, donde el agente es la ribavirina.

12. Uso de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa dependiente de NAD para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un individuo, donde el agente es ribavirina, y donde la ribavirina es para la administración en una dosis de 30 mg a 1200 mg al día por administración oral.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, donde el tratamiento comprende además administrar un segundo agente antineoplásico seleccionado de un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide de la vinca, un antibiótico antineoplásico, un complejo de platino, un inhibidor de tirosina quinasa, un taxano y un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno asociado a tumor.

14. Ribavirina para usar en un método de tratamiento de cáncer en un individuo, donde el uso comprende la administración oral de ribavirina en una dosis de 30 mg a 1200 mg al día.

15. Ribavirina para el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 14, donde el tratamiento comprende además administrar un segundo agente antineoplásico seleccionado de un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide de la vinca, un antibiótico antineoplásico, un complejo de platino, un inhibidor de tirosina quinasa, un taxano y un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno asociado a tumor.