ES2318251T3 - Analisis y tipificacion de proteinas monoclonales mediante electroforesis capilar e inmunodesplazamiento. - Google Patents
Analisis y tipificacion de proteinas monoclonales mediante electroforesis capilar e inmunodesplazamiento. Download PDFInfo
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Abstract
Método para el análisis electroforético capilar de una muestra biológica, que comprende la utilización de anticuerpos modificados sobrecargados negativamente de tal manera que migran a una zona situada fuera de la zona de migración de las globulinas de la muestra biológica cuando éstas se separan durante la electroforesis, presentando dichos anticuerpos una especificidad antigénica para unas proteínas dianas monoclonales determinadas y siendo obtenidos mediante la reacción con (i) el ácido melítico, en presencia de EDCl (hidrocloruro de 1(3-dimetilaminopropil)- 3-etilcarbodiimida) o (ii) un anhídrido que comprende por lo menos una función ácido carboxílico.
Description
Análisis y tipificación de proteínas
monoclonales mediante electroforesis capilar e
inmunodesplazamiento.
La invención se refiere al campo del análisis de
muestras biológicas mediante electroforesis capilar e
inmunodesplazamiento.
La invención tiene en particular por objeto un
método de análisis de muestras biológicas mediante electroforesis
capilar en el que la separación electroforética de los
constituyentes de la muestra se acompaña de un tratamiento de la
muestra mediante una técnica inmunológica. En el marco de la
presente solicitud, el término "inmunosustracción" designa la
supresión del pico de ciertas proteínas en el perfil
electroforético, mediante inmunodesplazamiento de este pico proteico
a otra posición del perfil.
La invención tiene en particular por objeto un
método aplicable a unos protocolos de diagnóstico, y se refiere en
particular a la búsqueda y a la tipificación en unas muestras
biológicas de proteínas de control de afecciones monoclonales,
también denominadas gammapatías monoclonales o paraproteinemias.
El desarrollo normal de los linfocitos B conduce
a la producción, en la superficie de los linfocitos B maduros, de
inmunoglobulinas de isotipos M y G, que tienen inicialmente unos
idiotipos comunes. Los desórdenes plasmocitarios que están en el
origen de las afecciones monoclonales resultan de un fallo de
control del proceso de maduración celular hacia unas células
segregadoras de anticuerpos después de la exposición a un antígeno
específico de la inmunoglobulina de superficie. En esta situación,
unas inmunoglobulinas que tienen una afinidad para un antígeno al
que el hospedante ha sido expuesto, continúan siendo segregadas
después de la desaparición del antígeno. De manera general, las
inmunoglobulinas de una especie determinada se reparten en
diferentes clases de anticuerpos, siendo cada clase identificada
con la ayuda de un isotipo, siendo los diferentes isotipos
identificados en el seno de una especie, comunes a todos los
individuos normales de esta especie. Las inmunoglobulinas están
constituidas generalmente por cadenas pesadas (2 cadenas pesadas) y
por cadenas ligeras (2 cadenas ligeras). En base a esta estructura
de cuatro cadenas, se han identificado cinco isotipos de cadenas
pesadas (isotipos M, G, A, D, E), y dos isotipos de cadenas ligeras
(isotipos kappa y lambda). Además de su isotipo, las
inmunoglobulinas se caracterizan por unos determinantes que
corresponden a unas diferencias entre los individuos de una misma
especie, denominados alotipos así como por su idiotipo que
corresponde a una parte de la molécula de inmunoglobulina que liga
el antígeno. Por lo tanto, el idiotipo es característico de las
moléculas producidas por un clon determinado de células productoras
de anticuerpos.
Las enfermedades plasmocitarias están por lo
tanto caracterizadas en particular por la alteración de la
producción de ciertas inmunoglobulinas o de ciertas cadenas de
inmunoglobulinas, y la detección y la caracterización de esta
alteración tiene un interés clínico manifiesto.
El análisis mediante electroforesis de una
muestra biológica permite la identificación de las proteínas séricas
y la determinación de la cantidad de estas proteínas, en particular
de las inmunoglobulinas. En un campo eléctrico, las proteínas
migran en función de su tamaño y de su carga, formando un perfil de
electroforesis que comprende una serie de picos (asimismo
denominados fracciones), correspondiendo cada uno de ellos a una o a
varias proteínas. La fracción denominada gamma está formada en
particular por inmunoglobulinas, principalmente de tipo G. En unos
pacientes que padecen enfermedades plasmocitarias que conducen a la
secreción de proteínas monoclonales (también denominadas proteínas
Mc), la cantidad de inmunoglobulinas que corresponde a uno de los
isotipos conocidos se puede aumentar de manera significativa con
relación a la normal, conduciendo a una modificación del perfil
electroforético mediante la modificación de uno o varios picos de
las proteínas separadas de una muestra de suero.
La detección de las proteínas monoclonales, en
particular la detección de un aumento de la producción de un
isotipo particular de inmunoglobulina, presenta por lo tanto un
interés manifiesto para la investigación de enfermedades
plasmocitarias pero también para el seguimiento de pacientes que
padecen paraproteinemias. Se ha observado por ejemplo que la
cantidad de una proteína Mc sérica puede según los casos, en
particular durante el desarrollo tumoral, estar directamente
relacionada con la progresión de la afección. Así, una proteína Mc
puede constituir un marcador tumoral que,
cuando se correlaciona con otros síntomas, puede ser tenido en cuenta en el establecimiento de un diagnóstico.
cuando se correlaciona con otros síntomas, puede ser tenido en cuenta en el establecimiento de un diagnóstico.
Las enfermedades plasmocitarias no están
únicamente implicadas por la producción anormal de proteínas Mc;
entre los desórdenes patológicos asociados a la producción de
proteínas Mc, se citarán los neoplasmas linfoides, tales como la
leucemia linfoide crónica o los linfomas de origen linfocitario B o
T, ciertas proliferaciones no linfoides tales como la leucemia
mieloide crónica, los cánceres de mama o de colon.
Unas proteínas Mc monoclonales pueden también
ser producidas en ciertas patologías no malignas tales como la
cirrosis, la sarcoidosis, unas parasitosis o la enfermedad de
Gaucher. Se detecta asimismo la producción de proteínas
monoclonales en unas afecciones auto-inmunes, tales
como la poliartritis reumatoide, la miastenia, o la enfermedad de
las aglutininas frías.
La electroforesis sobre gel de agarosa y la
electroforesis capilar, que permiten detectar la presencia de
proteínas monoclonales en unas muestras biológicas y seguir en el
tiempo la evolución de las proteínas monoclonales detectadas,
constituyen por lo tanto unos métodos de calidad de cara al
establecimiento de un diagnóstico o del seguimiento de
pacientes.
Según las patologías implicadas, la proteína Mc
es de naturaleza diferente, constituida por una molécula de
anticuerpo intacta, o bien por un fragmento de anticuerpo. Así, se
pueden producir solas unas cadenas pesadas o unas cadenas ligeras.
Es el caso, por ejemplo, de las proteínas de Bence Jones, segregadas
en las orinas de los pacientes que padecen mielomas y que se
presentan en forma de las únicas cadenas ligeras.
Los isotipos determinados de las
inmunoglobulinas permiten tipificar las proteínas Mc, en función de
la naturaleza de su cadena pesada y/o en función de la naturaleza
de su cadena ligera. La técnica usada para la tipificación de las
inmunoglobulinas permitirá así determinar el tipo de cadenas pesada
y/o ligera asociadas de cada proteína monoclonal presente en una
muestra biológica.
Además de la detección de la presencia de estas
proteínas Mc, ha parecido importante tipificarlas, para permitir
caracterizar la patología asociada a ellas. Para ello, ya se han
propuesto diferentes enfoques, tales como la cromatografía sobre
columna, la electroforesis sobre gel de agarosa o también la
electroforesis capilar. En unos métodos que usan la electroforesis
sobre gel de agarosa, las proteínas de la muestra biológica se
separan mediante electroforesis en forma de un perfil de
electroforesis en el que las proteínas y en particular las
globulinas, se revelan en forma de picos o de bandas susceptibles de
incluir una proteína monoclonal, cuya naturaleza se debe confirmar
después, por ejemplo mediante la técnica de inmunofijación sobre gel
de agarosa. Esta técnica combina dos etapas usando una
electroforesis sobre gel de agarosa y después una
inmunoprecipitación. Varias alícuotas de una misma muestra
biológica se depositan en paralelo sobre un gel de agarosa, y
después la aplicación de un campo eléctrico permite la separación
de las proteínas, y en particular de las inmunoglobulinas. Se
incuba a continuación cada pista con un tipo de anticuerpos
específicos de los tipos de inmunoglobulinas buscadas (IgG, IgA,
IgM, kappa y lambda, y eventualmente kappa libre, lambda libre, IgD
e IgE), conduciendo a la formación de inmunocomplejos entre las
inmunoglobulinas de la muestra y los anticuerpos. Después de un
lavado del gel que permite eliminar las proteínas que no han
precipitado, una etapa de coloración permite revelar la posición de
los inmunocomplejos: en el caso de la ausencia de proteínas
monoclonales, sólo aparece un fondo coloreado difuso (que
corresponde a la multitud de anticuerpos monoclonales que
constituyen el "fondo policlonal"); en el caso de la presencia
de proteínas monoclonales, unas bandas coloreadas se revelan en unas
regiones específicas del gel. Usando una pista de referencia (sin
antisuero), se puede así tipificar cada banda monoclonal visible
sobre el gel.
Una técnica de tipificación usada en
electroforesis capilar es la inmunosustracción tal como se describe
en la patente US nº 5.228.960. Esta técnica consiste en incubar
unas alícuotas de una muestra biológica con unos anticuerpos
específicos capaces de sustraer un constituyente dado (por ejemplo
unas inmunoglobulinas) de dicha muestra. Este constituyente sigue
siendo adsorbido sobre la fase sólida sobre la cual se ha fijado el
anticuerpo: por lo tanto, ya no está presente en la muestra
analizada mediante electroforesis capilar. Las diferentes alícuotas
tratadas en las que se han sustraído ciertas inmunoglobulinas según
la especificidad de los anticuerpos usados se inyectan entonces en
el capilar, y después las proteínas contenidas en las alícuotas se
separan mediante la aplicación de un campo eléctrico en los bornes
del capilar. Los perfiles obtenidos se comparan con un perfil de
una alícuota no tratada.
Se han propuesto otras técnicas de
identificación de las proteínas monoclonales, separadas mediante
electroforesis capilar a partir de una muestra, por ejemplo en la
patente EP 0 690 988 (B1). La patente europea en cuestión describe
la asociación con la separación electroforética capilar, de una
etapa de inmunosustracción, con el objetivo de facilitar la
clasificación de las proteínas Mc. Según esta patente, la
inmunosustracción se realiza "on-capilar"
según un método que comprende una etapa de separación
electroforética de una primera parte de la muestra en sus
diferentes constituyentes, y la detección de estos constituyentes, y
después la mezcla de una segunda parte de la muestra con por lo
menos una pareja capaz de ligar específicamente un analito
predeterminado contenido en la muestra, entendiéndose que la pareja
específica para esta unión tiene una movilidad electroforética
diferente de la de dicho analito. La segunda parte de la muestra se
separa a continuación en sus diferentes constituyentes mediante
electroforesis capilar y se detectan los constituyentes. Una etapa
de comparación de los constituyentes separados se realiza a
continuación con los constituyentes separados sin la presencia de
las parejas específicas que ligan un analito buscado.
La patente europea EP 0 690 988 precisa que la
pareja destinada a unir los analitos es una molécula modificada, en
particular un anticuerpo anti-proteína Mc, que ha
sufrido una modificación química de manera que su tiempo de
migración en electroforesis capilar, la conduzca fuera de la región
gamma del perfil electroforético. Una modificación química
propuesta de los anticuerpos es la que consiste en hacer que
reaccionen con el anhídrido succínico para aportarles unas
funciones carboxílicas suplementarias, negativas a pH alcalino. En
las condiciones de análisis descritas (pH 10), la carga negativa
global de los anticuerpos está por lo tanto aumentada.
Las condiciones descritas para realizar la
modificación de los anticuerpos, según la patente europea EP 0 690
988, así como los resultados experimentales reportados, que se
refieren únicamente al análisis y a la separación de
inmunoglobulinas G purificadas y no al análisis de un suero,
permiten dudar de la pertinencia del método propuesto con el
objetivo de buscar unas proteínas monoclonales en una muestra
biológica "real", por ejemplo en un
suero.
suero.
El documento WO 96/33412 describe unas
composiciones, unos procedimientos y unos dispositivos para realizar
unas dosificaciones ultrarrápidas por unión, preferentemente
mediante electroforesis capilar. En un modo de realización, una
primera pareja de unión presenta una etiqueta detectable y se
modifica una segunda pareja de unión (por ejemplo un anticuerpo)
para ser fuertemente cargada.
Se proporcionan unos ejemplos de compuestos
cargados. Algunos de ellos aportan una o varias cargas negativas
para cada función química modificada del anticuerpo. Existen entre
ellos unos polímeros que poseen varias funciones ácidos
carboxílicos y que están unidos mediante un agente de
acoplamiento.
La combinación de una muestra que contiene un
analito con el que las dos parejas de unión pueden interactuar y
sobre el que se pueden fijar provoca la formación de un complejo de
tres elementos. La diferencia de movilidad electroforética entre
las formas libre y unida al complejo de la primera pareja de unión
marcado es tal que permite la electroseparación y la detección
ulterior de un analito. Las composiciones, los procedimientos y los
dispositivos descritos en este documento permiten determinar
cuantitativamente la concentración de un analito en una muestra.
Este analito puede ser un anticuerpo monoclonal. Se describen
asimismo unos kits/estuches.
La presente invención propone un método
alternativo aplicable eficazmente sobre una muestra biológica, que
asocia la realización de una electroforesis capilar para la
separación de los constituyentes de una muestra biológica y la
inmunosustracción para permitir la tipificación de las proteínas Mc
eventualmente presentes en la muestra biológica analizada.
Una de las ventajas del método de la invención
es permitir un desplazamiento, fuera de la zona que corresponde al
perfil de migración de las proteínas de la muestra, en particular
fuera de la zona de migración de las globulinas, del pico de
electroforesis que corresponde a una proteína Mc cuando está
presente en una muestra biológica y que ha sido separada mediante
electroforesis capilar. Este desplazamiento sustrae el pico que
representa la proteína Mc separada, de su posición esperada al final
de la etapa de migración sin interferir con la separación de las
demás proteínas de la muestra. Al contrario del método descrito en
la patente US nº 5.228.960, la proteína monoclonal reconocida por
el anticuerpo está presente en la muestra inyectada para realizar
la electroforesis capilar. Se sustrae simplemente del perfil puesto
que se desplaza de su posición inicial. Por consiguiente, este
método permite una lectura fiable de los resultados del análisis,
disipando cualquier eventual confusión entre unos picos cercanos
que corresponden a las proteínas separadas de la muestra.
La invención se refiere asimismo a unos
anticuerpos modificados químicamente para aportarles unas funciones
químicas, suplementarias, negativas a pH alcalino (en este caso unas
funciones carboxílicas), mediante la reacción de ciertas funciones
químicas del anticuerpo con un agente modificador: cada una de las
funciones químicas modificadas aporta así varias cargas negativas
suplementarias al anticuerpo. Estos anticuerpos se usan después
para la inmnosustracción/inmunodesplazamiento específico de los
picos que corresponden a unas proteínas Mc de una muestra
biológica.
Los anticuerpos así preparados en el marco de la
invención, presentan con relación a los anticuerpos de partida ya
cargados negativamente cuando tienen un pH alcalino, un suplemento
de cargas negativas cuando tienen un pH alcalino, debido a la
adquisición de funciones tales como unas funciones ácidos
carboxílicos suplementarias. Estos anticuerpos se designan a
continuación mediante la expresión "anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente" o también mediante los términos
"anticuerpos modificados".
La invención tiene asimismo por objeto unos kits
para la realización de una separación de las proteínas de una
muestra biológica mediante electroforesis capilar y para la
detección mediante inmunosustracción con el fin de identificarlas
y, llegado el caso, cuantificarlas, de unas proteínas monoclonales
susceptibles de estar contenidas en la muestra biológica
ensayada.
La invención se refiere asimismo a un método de
preparación de anticuerpos modificados químicamente para injertarles
unas cargas negativas suplementarias a pH alcalino (anticuerpos
modificados sobrecargados negativamente), en unas condiciones que
permiten su uso en una inmunosustracción.
La invención se refiere por lo tanto a un método
para el análisis electroforético capilar de una muestra biológica,
que comprende el uso de anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente de tal manera que migran a una zona situada fuera de
la zona de migración de las proteínas de la muestra biológica cuando
se separan durante la electroforesis, presentando dichos
anticuerpos una especificidad antigénica para una proteína
monoclonal determinada.
La invención se define mediante las
reivindicaciones.
Durante la separación de las proteínas de una
muestra biológica, en un capilar lleno de un electrolito, las
proteínas migran bajo el efecto de un campo eléctrico: las proteínas
son así arrastradas en una migración del ánodo hacia el cátodo. La
diferencia entre velocidad electroforética propia (relacionada con
la carga de la proteína) y flujo electroosmótico (relacionado con
la carga de la superficie interna del capilar) permite la
separación de las proteínas a detectar.
Las proteínas de una muestra inyectada en el
capilar definen por lo tanto un perfil de migración electroforético
que se puede dividir en varias zonas, ilustradas en las figuras de
la presente solicitud, y que corresponden a las zonas gamma (la más
cercana del cátodo), beta2, beta1, alfa2, alfa1 y albúmina (siendo
esta última zona la más cercada del ánodo). Las inmunoglobulinas
contenidas en una muestra biológica migran de la zona alfa1 a la
zona gamma, incluyendo las proteínas Mc.
Con el objetivo en particular de permitir la
separación electroforética de proteínas monoclonales contenidas en
una muestra biológica así como su tipificación fiable, por medio de
una reacción de inmunosustracción, los inventores han puesto a
punto unas condiciones de realización de la inmunosustracción que
permiten la sustracción del pico que corresponde a una proteína
monoclonal, del perfil de migración de las proteínas de la muestra
(y en particular del perfil de migración de las globulinas) y su
desplazamiento fuera de la región comprendida entre la zona gamma a
la zona alfa 1.
Más precisamente, la proteína monoclonal buscada
en la muestra no se sustrae del medio analizado sino que se
desplaza bajo el efecto de su unión con un anticuerpo modificado
sobrecargado negativamente que la reconoce específicamente, en unas
condiciones tales que el complejo formado entre dicha proteína
monoclonal y dicho anticuerpo modificado se desplaza fuera del
perfil de migración de las globulinas de la muestra (las globulinas
corresponden a las fracciones electroforéticas gammas,
beta-2, beta-1,
alfa-2 y alfa-1 en el perfil
electroforético).
Más precisamente todavía, el complejo proteína
Mc-anticuerpo cargado negativamente a pH alcalino se
encuentra después de la etapa de migración electroforética, en la
zona más anódica del perfil de las proteínas separadas.
El complejo anticuerpo
modificado-proteína Mc es por lo tanto visible fuera
del perfil así definido por las inmunoglobulinas separadas, y está
en particular alejado de la zona gamma hacia la albúmina, siendo
eventualmente visible en la proximidad de la albúmina y de
alfa-1, sin que ello moleste la eventual detección
de una proteína monoclonal anódica (es decir, que migra a
alfa-1/alfa-2) puesto que el
complejo tiene una movilidad intermedia entre la de la proteína
monoclonal y la del anticuerpo modificado.
El anticuerpo modificado es en principio
aportado en exceso para la reacción y la fracción de anticuerpo que
no ha reaccionado es visible hacia el ánodo más allá del pico que
corresponde a la albúmina (es decir, de migración más anódica que
la albúmina).
Un primer método según la invención para el
análisis electroforético capilar de una muestra biológica y la
inmunosustracción, comprende las siguientes etapas:
- a)
- separar los constituyentes de una primera parte alícuota de la muestra biológica mediante electroforesis capilar, en presencia de anticuerpos modificados sobrecargados negativamente que presentan una especificidad antigénica determinada y susceptibles de formar un complejo de tipo antígeno-anticuerpo con una proteína monoclonal eventualmente presente en la muestra biológica, y detectar los constituyentes separados de la muestra biológica;
- b)
- comparar el perfil electroforético obtenido en la etapa a) con un perfil electroforético de los constituyentes de otra parte alícuota de la misma muestra separada mediante electroforesis capilar en ausencia de dichos anticuerpos modificados sobrecargados negativamente de especificidad antigénica determinada.
Se observará que las muestras biológicas
comprenden normalmente una fracción de inmunoglobulinas policlonales
que constituyen un "fondo policlonal" situado en la región
gamma (o próxima a esta última) del perfil electroforético. Estas
inmunoglobulinas policlonales aparecen en forma de un pico más
amplio que el de las inmunoglobulinas Mc (puesto que contienen un
gran número de inmunoglobulinas de movilidades muy parecidas), en
las condiciones de realización de una electroforesis capilar
propias de la separación de proteínas Mc; este fondo policlonal se
puede disminuir durante la puesta en contacto de la muestra con los
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente, según el tipo
de inmunoglobulinas que lo constituyen (G, A, M, kappa o lambda). La
distinción entre pico monoclonal y fondo poli-
clonal se realiza en este caso localizando el pico Mc focalizado a detectar con relación al pico ancho policlonal.
clonal se realiza en este caso localizando el pico Mc focalizado a detectar con relación al pico ancho policlonal.
En un modo de realización preferido de la
invención, se realiza paralelamente la puesta en contacto de partes
alícuotas de una muestra biológica determinada con diferentes
anticuerpos, formando una gama de anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente, presentando cada tipo de anticuerpo de
esta gama una especificidad antigénica determinada para un isotipo
de inmunoglobulinas.
Así, se puede realizar paralelamente el análisis
de una misma muestra biológica con dichos anticuerpos modificados
de especificidad diferente, siendo la especificidad antigénica de
estos anticuerpos elegida en función de las proteínas monoclonales
buscadas que serían reconocidas por estos anticuerpos y en función
del número de capilares en paralelo sobre el aparato de
electroforesis.
Según otro modo de realización particular de la
invención, en uno de los métodos descritos anteriormente, la
muestra biológica se divide en por lo menos dos partes alícuotas, y
el método comprende las siguientes etapas, previas a la separación
de los constituyentes de la muestra biológica mediante
electroforesis:
- 1)
- poner en contacto un medio que contiene unos anticuerpos modificados sobrecargados negativamente que presentan una especificidad antigénica determinada con una parte alícuota de la muestra biológica, en unas condiciones de incubación que permiten la reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y una proteína diana específicamente reconocida por dichos anticuerpos, cuando ésta está presente en la muestra biológica, y poner en contacto otra parte alícuota de la muestra biológica con dicho medio desprovisto sin embargo de los anticuerpos modificados,
- 2)
- inyectar en el capilar de electroforesis, unas partes alícuotas de la muestra biológica incubadas según la etapa 1).
En otro modo de realización particular de la
invención, el método de análisis electroforético capilar comprende
las siguientes etapas, previas a la separación de los constituyentes
de la muestra biológica mediante electroforesis:
- 1)
- inyectar un medio que contiene unos anticuerpos modificados sobrecargados negativamente que presentan una especificidad antigénica determinada, en el capilar de electroforesis, e inyectar dicho medio desprovisto sin embargo de dichos anticuerpos modificados en otro capilar de electroforesis;
- 2)
- inyectar la muestra biológica en los capilares de electroforesis tratados según la etapa 1), en unas condiciones que permiten la reacción inmunológica entre los anticuerpos y la o las proteína(s) diana(s) cuando está(n) presente(s) en la muestra biológica.
Para el análisis de una muestra biológica,
cuando la gama de anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente comprende n tipos de anticuerpos de especificidad
diferente determinada, se separará la muestra biológica en por lo
menos n+1 alícuotas.
Los anticuerpos usados para preparar los
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente son unas
inmunoglobulinas seleccionadas de entre unos anticuerpos
anti-IgG, anti-IgA,
anti-IgM, anti-IgE,
anti-IgD, anti-kappa,
anti-lambda, anti-kappa libre y anti-lambda libre.
anti-lambda, anti-kappa libre y anti-lambda libre.
De manera preferida, los anticuerpos se
seleccionan de entre los anticuerpos anti-IgG,
anti-IgA, anti-IgM,
anti-kappa y anti-lambda. Según un
modo de realización particular de la invención, se usa una gama de
anticuerpos que comprende estos 5 anticuerpos. Según otro modo de
realización de la invención, se usa una mezcla de la totalidad o
parte de estos anticuerpos, por ejemplo una mezcla de 5 anticuerpos
(antisuero pentavalente) o una mezcla de 3 anticuerpos (antisuero
trivalente) por ejemplo que contiene unos anticuerpos
anti-cadenas pesadas IgG, IgA, IgM.
También se puede limitar la realización del
método de la invención al uso de sólo ciertos anticuerpos
identificados anteriormente.
Para obtener unos anticuerpos sobrecargados
negativamente, se realiza una reacción de los anticuerpos que
presentan la especificidad antigénica elegida con un compuesto que
aporta unas cargas suplementarias negativas a pH alcalino, por
ejemplo un anhídrido cargado negativamente. Se hacen reaccionar por
ejemplo unas funciones aminas de los anticuerpos con un anhídrido,
de lo cual resulta la formación de una función ácido carboxílico
suplementaria sobre el anticuerpo (y por lo tanto de una carga
negativa suplementaria a pH alcalino) para cada función amina
modificada.
En el marco de la presente invención, el
anhídrido comprende por lo menos una función ácido carboxílico.
Para la realización de estos anticuerpos
modificados sobrecargados negativamente, el anhídrido usado es
ventajosamente un anhídrido benceno tricarboxílico. Este anhídrido
aporta dos funciones ácido carboxílico (y por lo tanto dos cargas
negativas suplementarias a pH alcalino) para cada función amina
modificada: una primera función gracias a la reacción del anhídrido
con la función amina, una segunda función debido a su estructura. El
anhídrido se denominará así anhídrido cargado negativamente, puesto
que es portador de por lo menos una función ácido carboxílico
cargada negativamente a pH alcalino.
Se puede obtener un anticuerpo suficientemente
modificado y por lo tanto suficientemente cargado negativamente a
pH alcalino efectuando la reacción del anticuerpo con el anhídrido
cargado negativamente, mediante la disolución extemporánea del
anhídrido, en particular del anhídrido benceno tricarboxílico, en
dimetilformamida (DMF) y la puesta en contacto del anhídrido
disuelto con el anticuerpo en disolución para permitir la aportación
de cargas negativas al anticuerpo, siendo dicha reacción efectuada
a 37ºC en unas condiciones que permiten el injerto de funciones
ácido carboxílico sobre el anticuerpo.
El injerto del anhídrido sobre el anticuerpo se
realiza con más eficacia por cuanto que la disolución de anhídrido
en la DMF se pone en el último momento en contacto con el anticuerpo
para obtener unos anticuerpos con unas funciones ácido carboxílico
suplementarias (y por lo tanto unas cargas negativas suplementarias
a pH alcalino), de manera que se previene la alteración del
anhídrido con el agua contenida en la disolución de anticuerpo.
Un método de preparación de los anticuerpos
modificados se describe con mayor detalle en la continuación de la
solicitud.
Para aportar unas funciones ácido carboxílico
suplementarias (y por lo tanto unas cargas negativas suplementarias
a pH alcalino) al anticuerpo, se puede, como variante, usar el ácido
melítico (que aporta las cargas negativas a pH alcalino) al que se
asocia el agente de acoplamiento EDCl o hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida).
El ácido melítico reacciona con las funciones aminas de los
anticuerpos en presencia del EDCl.
Los anticuerpos modificados usados en el método
de análisis electroforético capilar de la invención están
normalmente en exceso con relación a la proteína diana que reconocen
cuando ésta está presente en la muestra biológica.
Este exceso permite no sólo una desaparición
total de la proteína Mc diana del perfil proteico, sino también una
posición óptima del complejo anticuerpo
modificado-proteína Mc sobre el perfil: una relación
demasiado baja entre los anticuerpos modificados que presentan una
especificidad antigénica determinada y las proteínas dianas de la
muestra reconocidas por este anticuerpo no permitiría una
sustracción total del pico Mc y proporcionaría una migración más
catódica del complejo que cuando esta relación es más elevada.
En un modo de realización particular de la
invención, la concentración de anticuerpos cargados negativamente
de cada especificidad usados para la inmunosustracción es de
aproximadamente 10 g/l.
La invención tiene asimismo por objeto unos
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente, que son el
producto de la reacción de anticuerpos con un anhídrido que aporta
por lo menos 2 funciones ácido carboxílico, preferentemente el
anhídrido 1,2,4-benceno tricarboxílico.
Los anticuerpos usados en el método de análisis
mediante electroforesis capilar e inmunosustracción son así
ventajosamente el producto de la reacción del anticuerpo con un
anhídrido cargado negativamente, comprendiendo dicha reacción la
disolución extemporánea del anhídrido en dimetilformamida (DMF), y
la puesta en contacto del anhídrido disuelto con el anticuerpo en
disolución para permitir la reacción del anhídrido y del anticuerpo,
siendo dicha reacción efectuada a 37ºC en unas condiciones que
permiten el injerto de funciones químicas suplementarias sobre el
anticuerpo, en particular unas funciones ácidos carboxílico,
negativas a pH alcalino.
El método de análisis de muestras biológicas se
puede realizar sobre diferentes tipos de muestras biológicas, tales
como unas muestras de suero, de plasma, de orina o de líquido
cefalorraquídeo.
Según la naturaleza de la muestra biológica
usada y/o su origen (es decir, según el expediente médico del
paciente), la interpretación de los resultados procedentes de la
separación electroforética debe tener eventualmente en cuenta unas
interferencias que se pueden producir entre los anticuerpos
sobrecargados negativamente y las proteínas de la muestra. Dichas
interferencias son perceptibles y analizables por el experto en la
materia, y han sido observadas para las muestras que contienen un
fibrinógeno, es decir, las muestras de plasma o los sueros de
ciertos pacientes tratados con unos compuestos anticoagulantes. Los
inventores han observado que el fibrinógeno puede reaccionar,
mediante una reacción no específica, es decir, una reacción que no
es del tipo antígeno-anticuerpo, con los
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente de la invención.
En este caso, cuando un fibrinógeno está presente, lo que se
traduce sobre un perfil electroforético por la presencia de un pico
entre las zonas \beta y \gamma, este pico está suprimido de su
zona normal de migración después de que la muestra haya sido
tratada con los anticuerpos sobrecargados negativamente de la
invención, manifestándose esta supresión independientemente de la
especificidad de los anticuerpos sobrecargados negativamente usados.
En otras palabras, el pico que marca la presencia de fibrinógeno en
la muestra se revela únicamente en el perfil electroforético de
control (ELP) y desaparece del perfil de las proteínas sometidas a
las reacciones inmunológicas con los anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente (mediante inmunodesplazamiento en una
zona fuera de este perfil).
Las condiciones de realización de la
electroforesis capilar en vena líquida son las condiciones usadas
habitualmente por el experto en la materia para las etapas de
inyección de la muestra en el tubo capilar, de separación de los
constituyentes de la muestra mediante migración electroforética bajo
el efecto de una corriente de electroendosmosis. Estas etapas
comprenden en particular el uso de tampones de electroforesis tales
como los descritos en las solicitudes de patente WO 02/057736 y WO
02/057737, entendiéndose que los tampones de electroforesis se
eligen para permitir la separación de proteínas Mc en forma de
picos. Unas condiciones de realización de una electroforesis
capilar son, por ejemplo, las condiciones apropiadas para usar el
autómata Capillarys (SEBIA), incluyendo los tampones vendidos con
la denominación SEBIA CAPILLARYS B1B2+ y CAPILLARYS PROTEIN (E) 6 y
CAPILLARYS PROTEIN (E) 5.
Por ejemplo, el tampón de análisis usado para la
migración electroforética es ventajosamente un tampón alcalino,
cuyo pH está comprendido en el intervalo de 9 a 11, preferentemente
alrededor de 10, comprendiendo en particular un compuesto tampón y
por lo menos un aditivo susceptible de aumentar la fuerza iónica del
tampón de análisis.
El método de análisis electroforético capilar
descrito anteriormente permite, mediante el efecto de la
modificación química de la movilidad de los anticuerpos usados para
realizar la etapa de inmunosustracción, remediar las consecuencias
que podrían resultar de la co-migración de las
proteínas monoclonales con los constituyentes proteicos de la
muestra durante la etapa de separación electroforética. Así, el
método de la invención permite evitar las interferencias entre las
proteínas monoclonales reconocidas por los anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente y las demás proteínas que constituyen
la muestra biológica. Esta ventaja esencial para la detección
fiable de las proteínas monoclonales de una muestra biológica, es el
resultado en particular del hecho de que el complejo de proteína
Mc-anticuerpo modificado, migra después de las
globulinas y por lo tanto permite la tipificación de la proteína Mc
reconocida por el anticuerpo modificado sobrecargado negativamente
independientemente de la posición de la proteína monoclonal durante
la migración electroforética.
Además, la inmunosustracción del pico que
corresponde al complejo proteína Mc-anticuerpo
cargado negativamente es total en el sentido en el que el pico que
correspondería a la proteína monoclonal ya no se detecta en la zona
que corresponde al perfil de migración de las globulinas de la
muestra biológica.
Por consiguiente, el método de la invención es
ventajosamente aplicable a la detección y a la tipificación de
todos los tipos de inmunoglobulinas monoclonales IgG, IgA, IgM, IgD,
IgE y cadenas libres independientemente de su movilidad en la
medida en la que las zonas gammas, betas y alfas del perfil de
migración no interfieren con la zona de migración del anticuerpo
modificado sobrecargado negativamente y del complejo que forma con
las proteínas Mc cuando éstas están presentes en la muestra
biológica.
El método de la invención es por lo tanto
aplicable para el análisis electroforético capilar de proteínas
monoclonales en una muestra biológica.
Para la detección y la tipificación de proteínas
monoclonales en una muestra biológica, se efectúan ventajosamente
varios análisis capilares en paralelo, siendo la muestra biológica
dividida en diferentes partes alícuotas, y por lo menos en un
número de partes alícuotas igual o superior al número de tipos de
inmunoglobulinas usados para la búsqueda de las proteínas Mc.
Para la realización de la tipificación de las
proteínas Mc en una muestra biológica, se realizarán normalmente
por lo menos 6 análisis capilares paralelos.
Ventajosamente, los anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente son unas inmunoglobulinas cuya
especificidad antigénica se selecciona de entre las
inmunoglobulinas anti-IgG, anti-IgA,
anti-IgM, anti-kappa y
anti-lambda y/o anti-kappa libre
y/o anti-lambda libre.
Pueden añadirse unas inmunoglobulinas
anti-IgD, y/o anti-IgE.
Además del hecho de que la proteína Mc
eventualmente presente en la muestra biológica se pueda tipificar
mediante el método de la invención, dicha proteína Mc, cuando está
presente, se puede cuantificar. Para ello, se determina la
superficie del pico que corresponde a la proteína Mc que ha sido
sustraída del perfil.
El método de la invención se puede usar asimismo
para identificar otras proteínas (aparte de las inmunoglobulinas)
visibles sobre el perfil electroforético; se podrán usar, por
ejemplo, unos anticuerpos modificados de especificidad
anti-haptoglobina-humana, -alfa 1
antitripsina, -complemento C3, -complemento C4, -transferrina, -RBP,
\beta2-microglobulina,
-\alpha1-microglobulina, o unos anticuerpos de
otras especificidades. Gracias a estos anticuerpos, sería posible
así identificar las proteínas que constituyen una fracción de un
perfil electroforético, o bien localizar un fenotipo particular de
estas proteínas que tienen una movilidad diferente de la normal.
Las condiciones de realización de la invención
descritas en la presente solicitud, con vistas a detectar unas
proteínas distintas de inmunoglobulinas, se aplican por
analogía.
La invención tiene, por otro lado, por objeto un
procedimiento para la preparación de anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente, que comprende las etapas
siguientes:
- -
- disolver extemporáneamente un anhídrido que comprende por lo menos una función ácido carboxílico en dimetilformamida (DMF),
- -
- poner en contacto los anticuerpos con el anhídrido disuelto en unas condiciones que permiten la reacción del anhídrido y del anticuerpo con el fin de obtener un anticuerpo modificado sobrecargado negativamente a pH alcalino.
El anhídrido elegido para aportar unas cargas
suplementarias negativas a pH alcalino al anticuerpo es un anhídrido
que posee por lo menos una función ácido carboxílico.
El anhídrido elegido para aportar unas cargas
suplementarias negativas a pH alcalino al anticuerpo es
preferentemente el anhídrido benceno tricarboxílico.
La preparación de los anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente se describe en detalle en la parte
experimental.
Se subraya que para ser eficaz en lo que se
refiere a la aportación de cargas negativas, las etapas definidas
anteriormente comprenden ventajosamente la disolución del anhídrido
en dimetilformamida pura, y después la mezcla de esta disolución de
anhídrido en el momento del injerto con el anticuerpo, es decir,
tardíamente.
El respeto de estas condiciones permite evitar
una destrucción del anhídrido por el agua contenida en la disolución
de anticuerpos, puesto que dicha destrucción alteraría la eficacia
de la preparación de los anticuerpos cargados disminuyendo la
aportación de cargas negativas a pH alcalino.
De manera preferida, la reacción entre el
anhídrido y el anticuerpo, en particular entre el anhídrido benceno
tricarboxílico y el anticuerpo se efectúa a una temperatura de 37ºC,
o a una temperatura apropiada que permite aumentar el número de
moléculas de anhídridos injertados sobre el anticuerpo, por ejemplo
durante un tiempo de aproximadamente una hora.
Antes de ser puesto en contacto con el
anhídrido, el antisuero a injertar se dializa ventajosamente contra
una disolución de tampón PBS o de tampón fosfato. Además, cuando el
anticuerpo se pone en contacto con la disolución de anhídrido en la
DMF, se añade preferentemente sosa, lo que permite tamponar mejor
las funciones ácido carboxílico del anhídrido benceno
tricarboxílico ya presentes así como las que se forman a medida que
tiene lugar la reacción del anhídrido con el anticuerpo (de manera
que conserva un pH neutro en el medio de reacción, lo que permite
que continúe la reacción del anhídrido con las funciones aminas del
anticuerpo).
Según un modo de realización particularmente
preferido de la invención, durante la puesta en contacto con el
anhídrido en la DMF, el anticuerpo previamente dializado contra un
tampón PBS o un tampón fosfato a pH 7,4 se pone en contacto con
sosa 5N, y se añaden preferentemente tantos equivalentes de sosa
como funciones de ácido carboxílico (1) se han formado durante la
reacción y (2) aportadas por el anhídrido. Los anticuerpos
modificados se dializan a continuación en un medio que permite la
conservación de los anticuerpos, y después estas disoluciones
vuelven a la concentración adecuada de trabajo (aproximadamente 10
g/l) con el fin de situarse en unas condiciones en las que la
relación anticuerpo/antígeno sea óptima.
La invención tiene asimismo por objeto unos
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente, caracterizados
porque comprenden unas funciones ácido carboxílico injertadas de
manera que les confieren una capacidad de migración electroforética
fuera del perfil de migración de las inmunoglobulinas de una muestra
biológica separadas en las mismas condiciones de separación
mediante electroforesis capilar.
Los anticuerpos cargados negativamente pueden
ser unos anticuerpos monoclonales. Puede tratarse alternativamente
de anticuerpos policlonales.
El contacto entre el anticuerpo y las proteínas
antigénicas de la muestra se puede efectuar de dos maneras: una
mezcla de la disolución de anticuerpos modificada con la muestra
biológica, preferentemente diluida, en el soporte de muestras, por
ejemplo, en la probeta Capillarys, previamente a su inyección en el
capilar, o alternativamente las inyecciones sucesivas de la
disolución de anticuerpos modificada y después de la muestra
diluida en el capilar. Este segundo modo de realización de la etapa
de puesta en contacto permite una reacción antígeno/anticuerpo en
el interior del capilar ("in-capilar") tan
eficaz como el modo habitual de mezcla de las 2 disoluciones en la
probeta u otro soporte de muestras, y ha sido posible debido a las
diferencias de movilidad de los anticuerpos modificados con
relación a las proteínas de la muestra y del orden de inyección de
las 2 disoluciones: teniendo los anticuerpos modificados una
movilidad mucho más baja que las proteínas de la muestra (debido a
su carga negativa importante) y siendo inyectados en primer lugar,
la inyección de la muestra después de la de los anticuerpos
modificados provoca el paso de la muestra a través de la zona de
anticuerpos, y permite por lo tanto la sustracción del perfil
proteico de los antígenos reconocidos por los anticuerpos.
La invención se refiere asimismo a un kit de
detección de proteínas monoclonales en una muestra biológica, que
comprende unos anticuerpos según la invención y otros componentes,
por ejemplo el medio destinado a contener los anticuerpos, sin
embargo sin los anticuerpos (que permiten obtener el perfil de
referencia) y/o unos tampones de electroforesis y/o unas
disoluciones de lavado de los capilares y/o unas probetas de
dilución específicas para volúmenes reducidos y/o un diluyente de
la muestra a analizar, que permiten, por ejemplo, una buena
superposición de las diferentes curvas obtenidas durante los
diferentes análisis. Este kit comprende eventualmente unas
indicaciones de uso para realizar el análisis electroforético y el
inmunodesplazamiento de manera que se revelan y tipifican las
proteínas Mc.
De manera preferida, este kit contiene una gama
de anticuerpos de especificidad anti-IgG,
anti-IgA, anti-IgM,
anti-kappa y anti-lambda.
anti-kappa y anti-lambda.
Otro tipo de kit puede contener una mezcla de
anticuerpos de especificidad anti-IgG,
anti-IgA, anti-IgM,
anti-kappa y anti-lambda. Esta
mezcla, que se puede denominar antisuero pentavalente, permite
confirmar la naturaleza monoclonal de un pico aparecido sobre el
perfil electroforético o de una deformación de una fracción de este
perfil. Este kit es particularmente interesante puesto que las
inmunoglobulinas Mc pueden aparecer no sólo en la zona gamma, sino
también en las zonas beta y alfa, y pueden eventualmente estar
enmascaradas por las proteínas habituales de estas zonas sobre el
perfil obtenido en electroforesis capilar. En este modo de
realización de la invención, la muestra se ensaya sobre 2 pistas:
una pista de referencia (que contiene sólo el medio de los
anticuerpos, sin los anticuerpos) y una pista que permite revelar la
presencia de un pico monoclonal sobre el perfil electroforético
(con la ayuda del antisuero pentavalente).
Otro tipo de kit puede contener una mezcla de
anticuerpos de especificidad anti-cadenas pesadas
(\gamma, \alpha y \mu, anti-IgG,
anti-IgA, anti-IgM que se puede
denominar antisuero trivalente) y/o unos anticuerpos de
especificidades anticadenas ligeras kappa y lambda (libres y unidas)
y/o unos anticuerpos de especificidad anti-cadenas
ligeras libres kappa y lambda. Este kit permitiría la detección y la
identificación de proteínas de Bence Jones o cadenas ligeras libres
Mc (kappa o lambda) en la orina o en el suero humanos mediante
electroforesis capilar. En este modo de realización, cuando se usan
estos antisueros, la muestra se ensaya sobre 6 pistas: una pista de
referencia (que contiene sólo el medio de los anticuerpos, sin los
anticuerpos), 5 pistas que permiten caracterizar la o las
banda(s) Mc: presencia de cadenas pesadas con la ayuda del
antisuero trivalente, y tipo de cadena ligera (kappa o lambda;
libre o
unida).
unida).
Las mezclas de anticuerpos modificados se pueden
obtener mediante la modificación de una mezcla de anticuerpos en
bruto, o mediante la mezcla de anticuerpos previamente modificados
por tipo de anticuerpo. En el marco de la invención, se prefiere
realizar una mezcla de anticuerpos previamente modificados para ser
sobrecargados negativamente.
En el marco de la realización de la invención,
la presentación de los resultados de la separación electroforética
se puede realizar tal como se ilustra en los ejemplos, en forma de
perfiles electroforéticos cuyo pico que corresponde a la proteína
identificada mediante una reacción inmunológica específica con los
anticuerpos sobrecargados negativamente ha desaparecido del
perfil.
Alternativamente, estos resultados se pueden
presentar en forma de perfiles electroforéticos que hacen aparecer
sólo el pico que corresponde a la proteína identificada mediante una
reacción inmunológica específica con los anticuerpos sobrecargados
negativamente. En el marco de la realización del procedimiento de la
invención, este pico desaparece del perfil de las proteínas
separadas. Los resultados son, sin embargo, tratados para hacer
aparecer sólo este pico.
Para ello, mediante unas técnicas apropiadas de
tratamiento de datos, se sustrae cada perfil electroforético de una
parte alícuota de la muestra considerada tratada mediante un
anticuerpo modificado sobrecargado negativamente, del perfil de una
parte alícuota no tratada, de la misma muestra. La sustracción de
todos los perfiles de las partes alícuotas tratadas conduce a una
imagen de tipo de las que se obtienen en una inmunofijación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1 a 13 ilustran unos ejemplos de
detección de proteínas monoclonales en diferentes muestras
biológicas y la tipificación de estas proteínas monoclonales, y
mejoran así el pronóstico y el tratamiento de estas patologías. En
las figuras 2 a 13, la superficie gris del perfil representa las
proteínas séricas separadas en presencia de los anticuerpos de la
invención; el perfil de las proteínas séricas separadas fuera de la
presencia de los anticuerpos aparece asimismo según un trazo más
fino. El perfil de las proteínas separadas no tratadas con los
anticuerpos de la invención aparece asimismo solo en cada figura,
con la denominación ELP.
La electroforesis capilar de muestras clínicas
se realiza en un aparato de EC equipado con 8 capilares de sílice
fundida de diámetro interior de 25 micrones (CAPILLARYS, Sebia). La
detección se realiza a 200 nm. Las muestras se disponen en el
pasador de muestras del aparato y se inyectan automáticamente
mediante inyección hidrodinámica. La separación de las muestras se
realiza en menos de 5 minutos aplicando un campo eléctrico de
aproximadamente 400 V/cm. El capilar se lava antes de cada análisis
mediante sosa 0,25 M, y después mediante el tampón de
análisis.
análisis.
- a)
- Se han dializado 10 ml del antisuero a injertar (anti-human IgG, A, M, anti-kappa o lambda DAKO Dinamarca) a 10 g/l contra una disolución tampón fosfato 100 mM pH 7,4.
- b)
- Se ha preparado una disolución de anhídrido de 1,2,4-bencenotricarboxílico a 100 mM en DMF.
- c)
- Se ha mezclado entonces la disolución dializada de anticuerpos con sosa 5N y después con la disolución de anhídrido en la DMF (213 \mul de sosa 5N + 10 ml de disolución de anticuerpos + 5,33 ml de anhídrido en la DMF).
- d)
- Entonces, se ha dispuesto el medio de reacción bajo agitación suave sobre un péndulo durante una hora a 37ºC.
- e)
- La mezcla se ha dializado entonces contra la disolución tampón fosfato 100 mM pH 7,4 con varios cambios de baño de diálisis.
- f)
- Una vez terminada la diálisis, se ha dispuesto el cilindro en PEG 6000 en polvo durante 1 h.
- g)
- Una vez terminada la concentración, se ha dializado entonces este último contra fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/l de azida de sodio.
- h)
- El volumen del cilindro ha vuelto a 10 ml mediante una disolución de fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/l de azida de sodio.
- i)
- La disolución obtenida se ha filtrado sobre una membrana de porosidad 0,45 \mum y después se ha conservado a 4ºC. Se puede usar cualquier otro medio de conservación con la condición de que su fuerza iónica sea suficiente para asegurar la conservación de los anticuerpos (es decir, próxima a la del agua fisiológica).
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- Se han dializado 10 ml del antisuero a injertar (anti-human IgG, A, M, anti kappa o lambda DAKO Dinamarca) a 10 g/l contra una disolución tampón PBS 40 mM pH 7,4.
- b)
- Se han añadido 50 \mul/ml de sosa 5N.
- c)
- Se han añadido 18 mg/ml de ácido melítico y después 50 mg/ml de EDCl.
- d)
- Entonces, el medio de reacción se ha puesto bajo agitación suave sobre un péndulo durante una hora a 37ºC.
- e)
- Se ha dializado entonces la mezcla contra la disolución tampón fosfato 100 mM pH 7,4 con varios cambios del baño de diálisis.
- f)
- Una vez terminada la diálisis, se ha dispuesto el cilindro en PEG 6000 en polvo durante 1 h.
- g)
- Una vez terminada la concentración, se ha dializado entonces este último contra fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/l de azida de sodio.
- h)
- El volumen del cilindro ha vuelto a 10 ml mediante una disolución de fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/l de azida de sodio.
- i)
- La disolución obtenida se ha filtrado sobre una membrana de porosidad 0,45 \mum y se ha conservado el conjunto a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El Capillarys (SEBIA) es un aparato que efectúa
8 análisis capilares en paralelo. La probeta de inmunotipificación
es una probeta CAPILLARYS específica para la tipificación
constituida por 6 pocillos de 100 \mul y por un doble pocillo de
400 \mul. Contiene 60 \mul de fosfato 100 mM en el pocillo 1, 60
\mul de anti-IgG modificado en el pocillo 2, de
anti-IgA modificado en el pocillo 3, de
anti-IgM modificado en el pocillo 4, de
anti-kappa modificado en el pocillo 5, de
anti-lambda modificado en el pocillo 6, conteniendo
el doble pocillo 7/8 380 \mul de diluyente de inmunotipificación
(alcohol bencílico 0,02 M) en el tampón de análisis Sebia usado.
- a)
- Se ha depositado el tubo de suero a tipificar en la posición 1 sobre el portador CAPILLARYS sobre el que se ha dispuesto una probeta de "inmunotipificación".
- b)
- El portador ha sido introducido en el aparato: el autómata ha realizado entonces una dilución 1/20 del suero en el doble pocillo 7/8, se ha homogeneizado el doble pocillo y se han repartido 40 \mul en cada uno de los pocillos 1 a 6, homogeneizando cada uno de estos pocillos.
- c)
- Se ha efectuado a continuación el análisis capilar en las siguientes condiciones:
- El tampón de análisis puede ser el tampón Sebia Capillarys B1B2+ o el tampón Sebia Capillarys Protein:
- Tampón B1B2+: Temperatura 32ºC, tensión de migración 7 kV, ventana de adquisición 100-235s, inyección 250 mbares * 5s;
- Tampón Sebia Capillarys Protein (e): Temperatura 37ºC, tensión de migración 6,5 kV, ventana de adquisición 110-275s, inyección 250 mbares * 5s;
- d)
- El análisis capilar obtenido en el pocillo 1 ha sido comparado con el de los cinco pocillos siguientes con el fin de tipificar el suero analizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Si el suero posee una fracción gama baja, la
dilución en el diluyente en b) está a 1/10ª. La fracción gama se
considerará como baja si su análisis sobre Capillarys en tampón
B1B2+ da un valor inferior a las normales definidas para esta
fracción con este tampón, es decir aproximadamente inferior a 10% (o
<7,5 g/l).
Si el suero posee una fracción gama superior a
aproximadamente 20 g/l, la dilución en el diluyente en b) está a
1/40ª.
En este caso, se usan 2 probetas:
1 probeta constituida por 6 pocillos que
contienen: 100 \mul de fosfato 100 mM en el pocillo 1, 100 \mul
de anti-IgG modificado en el pocillo 2, de
anti-IgA modificado en el pocillo 3, de
anti-IgM modificado en el pocillo 4, de
anti-kappa modificado en el pocillo 5, de
anti-lambda modificado en el pocillo 6;
1 probeta para la dilución del suero constituida
por 7 pocillos que contienen: 380 \mul de diluyente de
inmunotipificación (alcohol bencílico 0,02 M en el tampón Sebia
Capillarys B1B2+) en el doble pocillo 7/8;
- a)
- Se ha introducido un primer portador que contiene la probeta de antisueros en el aparato: el autómata ha efectuado entonces una inyección de estos anticuerpos en los capilares (250 mbares * 5s).
- b)
- Se han introducido a continuación un segundo portador que contiene la probeta para la dilución de suero y un tubo de suero en posición 1 en el aparato: el autómata ha realizado entonces una dilución 1/20ª en el doble pocillo 7/8, se ha homogeneizado el doble pocillo y se ha repartido en los pocillos 1 a 6 (40 \mul de suero a 1/20ª + 60 \mul de tampón de análisis por pocillo); los sueros diluidos se inyectan entonces en los capilares (250 mbares * 5s).
- c)
- El tampón de análisis puede ser el tampón Sebia Capillarys B1B2+ o el tampón Sebia Capillarys Protein (e):
- Tampón B1B2+: Temperatura 32ºC, tensión de migración 7 kV, ventana de adquisición 100-235s;
- Tampón Sebia Capillarys Protein (e): Temperatura 37ºC, tensión de migración 6,5 kV, ventana de adquisición 110-275s;
- d)
- El análisis capilar obtenido en el pocillo 1 ha sido comparado con el de los cinco pocillos siguientes con el fin de tipificar el suero.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
1
Análisis de un anti-human IgG
DAKO antes y después de la modificación por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico sobre Capillarys con el
tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición
105-350s); la modificación del anticuerpo permite
retrasar fuertemente su migración: su tiempo de migración pasa de
122 a 267 s (Figuras 1a y 1b).
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
2
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo Alambda que migra a
beta-2 sobre Capillarys con el tampón Sebia
Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición 100-235s):
se han mezclado 6 alícuotas de este suero con 5 anticuerpos
modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa,
-lambda) y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 2), se observa claramente la desaparición del pico monoclonal en beta-2 para las alícuotas tratadas mediante los anti-IgA y anti-lambda. En las demás pistas, únicamente se observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que facilita la superposición de los perfiles.
-lambda) y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 2), se observa claramente la desaparición del pico monoclonal en beta-2 para las alícuotas tratadas mediante los anti-IgA y anti-lambda. En las demás pistas, únicamente se observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
3
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo G lambda que migra a
beta-1 sobre Capillarys con el tampón Sebia
Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición 100-235s):
se han mezclado 6 alícuotas de este suero con 5 anticuerpos
modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa,
-lambda) y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 3), se observa claramente la desaparición del pico monoclonal en beta-1 para las alícuotas tratadas mediante los anti-IgG y anti-lambda. En las demás pistas, únicamente se observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que facilita la superposición de los perfiles.
-lambda) y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 3), se observa claramente la desaparición del pico monoclonal en beta-1 para las alícuotas tratadas mediante los anti-IgG y anti-lambda. En las demás pistas, únicamente se observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que facilita la superposición de los perfiles.
\newpage
\bullet Ejemplo
4
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo A kappa que migra entre
beta-1 y alfa-2 sobre Capillarys con
el tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición
100-235s): se han mezclado 6 alícuotas de este
suero con 5 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) y con el
medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por
comparación con la pista ELP (en negro; Figura 4), se observa
claramente la desaparición del pico monoclonal en
beta-1/alfa-2 para las alícuotas
tratadas mediante los anti-IgA y
anti-kappa. En las demás pistas, únicamente se
observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo
la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los
anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico
que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que
facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
5
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo G lambda que migra a gamma sobre
Capillarys con el tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de
adquisición 100-235s): se han mezclado 6 alícuotas
de este suero con 5 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) y con el
medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por
comparación con la pista ELP (en negro; Figura 5), se observa
claramente la desaparición del pico monoclonal en gamma para las
alícuotas tratadas mediante los anti-IgG y
anti-lambda. En las demás pistas, únicamente se
observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo
la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los
anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico
que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que
facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
6
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo A lambda que migra entre
beta-2 y beta-1 sobre Capillarys con
el tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición
100-235s): se han mezclado 6 alícuotas de este
suero con 5 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) y con el
medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por
comparación con la pista ELP (en negro; Figura 6), se observa
claramente la desaparición del pico monoclonal en
beta-1/beta-2 para las alícuotas
tratadas mediante los anti-IgA y
anti-lambda. En las demás pistas, únicamente se
observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo
la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los
anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico
que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que
facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
7
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo M kappa que migra a gamma sobre
Capillarys con el tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de
adquisición 100-235s): se han mezclado 6 alícuotas
de este suero con 5 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) y con el
medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por
comparación con la pista ELP (en negro; Figura 7), se observa
claramente la desaparición del pico monoclonal en gamma para las
alícuotas tratadas mediante los anti-IgM y
anti-kappa. En las demás pistas, únicamente se
observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo
la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los
anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico
que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que
facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
8
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína monoclonal de tipo lambda libre que migra a gamma sobre
Capillarys con el tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de
adquisición 100-235s): se han mezclado 8 alícuotas
de este suero con 7 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda, -kappa
libre, -lambda libre) y con el medio de estos anticuerpos (sin
anticuerpos; pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en
negro; Figura 8), se observa claramente la desaparición del pico
monoclonal en gamma para las alícuotas tratadas mediante los
anti-lambda y anti-lambda libre. En
las demás pistas, únicamente se observa la disminución del fondo
policlonal. Se observará asimismo la ausencia de interferencia de
los inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la
migración de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas
es un marcador de inyección que facilita la superposición de los
perfiles.
\newpage
\bullet Ejemplo
9
Comparación de la inmunotipificación obtenida
con un anticuerpo anti-human IgG modificado por el
anhídrido 1,2,4-bencenotricarboxílico o por el ácido
melítico/EDCl sobre un suero que contiene una proteína monoclonal
de tipo Gkappa que migra a gamma sobre Capillarys con el tampón
Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición
100-235s): se han mezclado 3 alícuotas de este suero
con 2 anti-human IgG modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico y por el ácido
melítico/EDCl y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos;
pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 9),
se observa claramente la desaparición del pico monoclonal en gamma
para las alícuotas tratadas mediante los 2 anticuerpos modificados.
Se observará asimismo en los 2 casos la ausencia de interferencia
de los inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la
migración de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas es
un marcador de inyección que facilita la superposición de los
perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
10
Inmunotipificación in-capilar de
un suero que contiene una proteína monoclonal de tipo G kappa que
migra a gamma sobre Capillarys con el tampón Sebia Capillarys B1B2+
(ventana de adquisición 100-235s): se han dispuesto
en una 1ª probeta el medio de los anticuerpos (sin anticuerpos) y 5
anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda), se han
diluido 6 alícuotas de este suero en el tampón Sebia Capillarys
B1B2+ que contiene el marcador de inyección (probeta 2). Se han
inyectado los anticuerpos y después las alícuotas, y se han
realizado las 6 migraciones. Por comparación con la pista ELP (en
negro; Figura 10), se observa claramente la desaparición del pico
monoclonal en gamma para las alícuotas tratadas mediante los
anti-IgG y anti-kappa. En las demás
pistas, únicamente se observa la disminución del fondo policlonal.
Se observará asimismo la ausencia de interferencia de los
inmunocomplejos y de los anticuerpos modificados con la migración
de las globulinas. El pico que migra antes de las gamas es un
marcador de inyección que facilita la superposición de los
perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
11
Uso del antisuero pentavalente (mezcla de
anticuerpos anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa y -lambda
modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico) con el fin de verificar
la naturaleza Mc de un pico respaldado sobre beta-1
en un suero mediante análisis sobre Capillarys con el tampón Sebia
Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición 100-235s):
se han mezclado 2 alícuotas de este suero con el antisuero
pentavalente y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos;
pista ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 11),
se observa claramente la desaparición del pico respaldado sobre
beta-1 sobre la pista tratada con el antisuero
pentavalente, indicando la naturaleza Mc de este pico (proteína Mc
de tipo M kappa). Se observará asimismo la desaparición del fondo
policlonal, la ausencia de fracción beta-2 para este
suero así como la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos
y de los anticuerpos modificados con la migración de las
globulinas. El pico que migra antes de las gamas es un marcador de
inyección que facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
12
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína Mc de tipo lambda libre que migra a gamma sobre Capillarys
con el tampón Sebia Capillarys B1B2+ (ventana de adquisición
100-235s): se han mezclado 6 alícuotas de este
suero con 5 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico (antisuero trivalente
(mezcla de los anticuerpos anti-IgG, -IgA, -IgM),
anti-kappa, anti-lambda,
anti-kappa libre, anti-lambda
libre) y con el medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista
ELP). Por comparación con la pista ELP (en negro; Figura 12), se
observa claramente la desaparición del fondo policlonal, pero no del
pico Mc sobre la pista tratada con el antisuero trivalente. Se
observa en paralelo la desaparición del pico Mc sobre las pistas
anti-lambda y anti-lambda libre.
Sobre las pistas anti-kappa y
anti-kappa libre, únicamente se observa la
disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo la ausencia
de fracción beta-2 para este suero así como la
ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los
anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico
que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que
facilita la superposición de los perfiles.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Ejemplo
13
Inmunotipificación de un suero que contiene una
proteína Mc de tipo M kappa que migra a gamma sobre Capillarys con
el tampón Sebia Capillarys Protein (e) (ventana de adquisición
110-275s): se han mezclado 6 alícuotas de este
suero con 5 anticuerpos modificados por el anhídrido
1,2,4-bencenotricarboxílico
(anti-IgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) y con el
medio de estos anticuerpos (sin anticuerpos; pista ELP). Por
comparación con la pista ELP (en negro; Figura 13), se observa
claramente la desaparición del pico Mc en gamma sobre las alícuotas
tratadas con los anti-IgM y
anti-kappa. Sobre la demás pistas, únicamente se
observa la disminución del fondo policlonal. Se observará asimismo
la ausencia de interferencia de los inmunocomplejos y de los
anticuerpos modificados con la migración de las globulinas. El pico
que migra antes de las gamas es un marcador de inyección que
facilita la superposición de los perfiles.
Claims (28)
1. Método para el análisis electroforético
capilar de una muestra biológica, que comprende la utilización de
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente de tal manera
que migran a una zona situada fuera de la zona de migración de las
globulinas de la muestra biológica cuando éstas se separan durante
la electroforesis, presentando dichos anticuerpos una especificidad
antigénica para unas proteínas dianas monoclonales determinadas y
siendo obtenidos mediante la reacción con (i) el ácido melítico, en
presencia de EDCl (hidrocloruro de
1(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida)
o (ii) un anhídrido que comprende por lo menos una función ácido
carboxílico.
2. Método según la reivindicación 1, para el
análisis electroforético capilar de una muestra biológica, que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- separar los constituyentes de una primera parte alícuota de la muestra biológica mediante electroforesis capilar, en presencia de anticuerpos modificados sobrecargados negativamente que presentan una especificidad antigénica determinada y susceptibles de formar un complejo de tipo antígeno-anticuerpo con una proteína monoclonal eventualmente presente en la muestra biológica, y detectar los constituyentes separados de la muestra biológica;
- b)
- comparar el perfil electroforético obtenido en la etapa a) con un perfil electroforético de los constituyentes de otra parte alícuota de la misma muestra separada mediante electroforesis capilar en ausencia de dichos anticuerpos modificados sobrecargados negativamente de especificidad antigénica determinada.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que se usan unos anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente, formando una gama de anticuerpos que presentan unas
especificidades antigénicas diferentes, puestos en contacto con una
misma parte alícuota de la muestra biológica, para realizar la
separación mediante electroforesis capilar de los constituyentes de
la muestra.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
cada tipo de anticuerpo de dicha gama de anticuerpos presenta una
especificidad antigénica determinada para un isotipo de
inmunoglobulinas.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, para el análisis electroforético capilar de
una muestra biológica dividida en por lo menos 2 partes alícuotas,
que comprende las siguientes etapas, previas a la separación de los
constituyentes de la muestra biológica mediante electroforesis:
- 1)
- poner en contacto un medio que contiene unos anticuerpos modificados sobrecargados negativamente que presentan una especificidad antigénica determinada con una parte alícuota de la muestra biológica, en unas condiciones de incubación que permiten la reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y una proteína monoclonal diana específicamente reconocida por dichos anticuerpos, cuando ésta está presente en la muestra biológica, y poner en contacto otra parte alícuota de la muestra biológica con dicho medio desprovisto sin embargo de los anticuerpos modificados,
- 2)
- inyectar en el capilar de electroforesis las partes alícuotas de la muestra biológica incubadas según la etapa 1).
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, para el análisis electroforético capilar de
una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas, previas
a la separación de los constituyentes de la muestra biológica
mediante electroforesis:
- 1)
- inyectar un medio que contiene unos anticuerpos modificados sobrecargados negativamente que presentan una especificidad antigénica determinada, en el capilar de electroforesis, e inyectar dicho medio desprovisto sin embargo de dichos anticuerpos modificados en otro capilar de electroforesis;
- 2)
- inyectar la muestra biológica en los capilares de electroforesis tratados según la etapa 1), en unas condiciones que permiten la reacción inmunológica entre los anticuerpos y la o las proteína(s) monoclonal(es) diana(s) cuando ésta(s) está(n) presente(s) en la muestra biológica.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra biológica se divide en
por lo menos n+1 partes alícuotas cuando la gama de anticuerpos
modificados sobrecargados negativamente comprende n tipos de
anticuerpos de especificidades diferentes determinadas.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los anticuerpos
se seleccionan de entre los anticuerpos anti-IgG,
anti-IgA, anti-IgM,
anti-kappa y anti-lambda.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se usan unos
anticuerpos anti-IgG, unos anticuerpos
anti-IgA, unos anticuerpos anti-IgM,
unos anticuerpos anti-kappa, unos anticuerpos
anti-lambda, unos anticuerpos
anti-kappa libre y unos anticuerpos
anti-lambda libre.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo modificado
sobrecargado negativamente está en exceso con relación a la o a las
proteína(s) monoclonal(es) diana(s) que
reconocen cuando ésta(s) está(n) presente(s) en la
muestra biológica.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que los anticuerpos modificados
sobrecargados negativamente son el producto de la reacción con el
anhídrido 1,2,4-bencenotricarboxílico.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo sobrecargado
negativamente es el producto de la reacción del anticuerpo con un
anhídrido que comprende por lo menos una función ácido carboxílico,
comprendiendo dicha reacción la disolución extemporánea del
anhídrido en dimetilformamida (DMF) y la puesta en contacto del
anhídrido disuelto con el anticuerpo en disolución para permitir la
reacción del anhídrido y del anticuerpo, siendo dicha reacción
efectuada a 37ºC en unas condiciones que permiten el injerto de
cargas negativas sobre el anticuerpo.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la electroforesis capilar se
realiza en un tampón alcalino, a un pH comprendido entre 9 y 11,
que contiene un compuesto tampón y por lo menos un aditivo
susceptible de aumentar la fuerza iónica del tampón de análisis.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la muestra biológica se
selecciona de entre unas muestras de plasma, de orina o de líquido
cefalorraquídeo.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la muestra biológica es una
muestra de suero.
16. Método para la búsqueda y la tipificación de
proteínas monoclonales denominadas proteínas Mc en una muestra
biológica, que comprende el análisis electroforético capilar según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 de diferentes partes
alícuotas de la muestra biológica, estando cada una de las partes
alícuotas puesta en contacto con anticuerpos seleccionados
respectivamente de entre las inmunoglobulinas
anti-IgG, anti-IgA,
anti-IgM, anti-kappa,
anti-lambda, anti-kappa libre y
anti-lambda libre modificadas para ser sobrecargadas
negativamente.
17. Método para la búsqueda y la tipificación de
proteínas monoclonales (proteínas Mc) en una muestra biológica, en
el que la presencia de una proteína Mc en la muestra biológica se
detecta mediante inmunosustracción del pico que corresponde a dicha
proteína Mc, en el perfil electroforético de las proteínas de la
muestra biológica, efectuándose la migración del complejo
anticuerpo modificado sobrecargado
negativamente-proteína Mc fuera del perfil
electroforético de las globulinas de la muestra biológica, siendo
dicho anticuerpo sobrecargado negativamente obtenido mediante la
reacción con (i) el ácido melítico, en presencia de EDCl
(hidrocloruro de
1(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida)
o (ii) un anhídrido que comprende por lo menos una función ácido
carboxílico.
18. Procedimiento para la preparación de
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente, que comprende
las etapas siguientes:
- -
- disolver extemporáneamente un anhídrido que comprende por lo menos una función ácido carboxílico en dimetilformamida (DMF),
- -
- poner en contacto los anticuerpos con el anhídrido disuelto en unas condiciones que permiten la reacción del anhídrido y del anticuerpo con el fin de obtener un anticuerpo modificado sobrecargado negativamente a pH alcalino.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que el anhídrido es el anhídrido bencenotricarboxílico.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 18 ó 19, en el que el anhídrido está disuelto de
forma extemporánea en DMF pura.
21. Anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente, caracterizados porque se injertan unas
funciones ácido sobre los anticuerpos de manera que les confieren
una capacidad de migración electroforética fuera del perfil de
migración de las inmunoglobulinas de tipo IgG, IgA, IgM, IgE e IgD,
separadas en las mismas condiciones de separación por
electroforesis capilar, siendo dichas funciones ácido injertadas
sobre dichos anticuerpos mediante la reacción con (i) el ácido
melítico, en presencia de EDCl (hidrocloruro de
1(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida)
o (ii) un anhídrido que comprende por lo menos una función ácido
carboxílico.
22. Anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente según la reivindicación 21, tales como los obtenidos
mediante la realización de un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20.
23. Anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22,
seleccionados de entre las inmunoglobulinas
anti-IgG, anti-IgA,
anti-IgM, anti-kappa,
anti-lambda, anti-kappa libre y
anti-lambda libre.
24. Anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22,
mezclados en forma de un antisuero pentavalente que contiene dichos
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente
anti-IgG, anti-IgA,
anti-IgM, anti-kappa y
anti-lambda, o en forma de un antisuero trivalente
que contiene dichos anticuerpos sobrecargados negativamente
anti-IgG, anti-IgA y
anti-IgM.
25. Anticuerpos modificados sobrecargados
negativamente según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24,
caracterizados porque se trata de anticuerpos
policlonales.
26. Kit para la detección y la tipificación de
proteínas monoclonales en una muestra biológica, que comprende unos
anticuerpos modificados sobrecargados negativamente según cualquiera
de las reivindicaciones 21 a 25, y un diluyente apropiado.
27. Uso de anticuerpos según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, para la detección mediante electroforesis
capilar e inmunodesplazamiento de proteínas monoclonales presentes
en una muestra biológica.
28. Uso de anticuerpos según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, para la tipificación de proteínas
monoclonales presentes en una muestra biológica.
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