ES2318902T3

ES2318902T3 - Secretasa en la enfermedad del alzheimer.

Info

Publication number: ES2318902T3
Application number: ES99948189T
Authority: ES
Inventors: Mark E. Gurney; Michael Jerome Bienkowski; Robert Leroy Heinrikson; Luis A. Parodi; Riqiang Yan
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: AU2004203588A1; KR100691601B1; PL205294B1; SK3902001A3; CA2343004A1; IS5905A; ZA200102387B; CZ2001966A3; HK1042730A1; KR20010085837A; ATE420185T1; KR20060126626A; NZ510708A; HK1062187A1; NZ527053A; SG113454A1; AU772812B2; CN1502697A; KR100839284B1; JP2008113665A

Abstract

Un procedimiento para identificar un agente que modula la actividad de una proteasa implicada en el procesamiento de la proteína precursora del amiloide (PPA) en beta amiloide, que comprende las etapas de (a) poner en contacto la proteasa purificada y un sustrato de la PPA de la misma que comprende un sitio de procesamiento del beta amiloide en presencia y ausencia de un agente de ensayo, en el que la proteasa (i) comprende un fragmento de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 6, que incluye DTG y DSG; o (ii) está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complementario de SEC ID Nº 5 en las siguientes condiciones estrictas de hibridación: (1) hibridar a 42ºC durante aproximadamente 2,5 horas 6xSCC y 0,1% SDS, y (2) lavar a 65ºC en 1xSCC y 0,1% SDS, y (b) determinar y comparar las respectivas actividades de procesamiento de la PPA de la proteasa en presencia y ausencia del agente de ensayo, en donde un agente que es un inhibidor de Asp2 reduce la actividad de procesamiento de la PPA y un agente que es un agonista de Asp2 incrementa tal actividad.

Description

Secretasa en la enfermedad de Alzheimer.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la enfermedad de Alzheimer, PPA, péptido beta amiloide y aspartil proteasas humanas, así como a un procedimiento para la identificación de agentes que modulan la actividad de estos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) causa demencia progresiva con la consiguiente formación de placas de amiloide, marañas neurofibrilares, gliosis y pérdida de neuronas. La enfermedad se produce en formas genética y esporádica, cuyos cursos clínicos y características patológicas son bastante similares. Hasta la fecha se han descubierto tres genes que, cuando mutan producen una forma autosómica dominante de la enfermedad de Alzheimer. Estos codifican la proteína precursora del amiloide (PPA) y dos proteínas relacionadas, la presenilina-1 (PS1) y la presenilina-2 (PS2), que, como sugieren sus nombres, están ambas estructural y funcionalmente relacionadas. Las mutaciones en cualquiera de los tres potencian el procesamiento proteolítico de la PPA a través de una vía intracelular que produce péptido beta amiloide o el péptido A\beta (o, en el presente documento, en ocasiones Abeta), un péptido de 40-42 aminoácidos de longitud que es el componente principal de la placa de amiloide en la EA. La alteración en la regulación de las vías intracelulares para el procesamiento proteolítico puede ser crucial en la fisiopatología de la EA. En el caso de la formación de placas, las mutaciones en la PPA, la PS1 o la PS2 alteran de forma consecuente el procesamiento proteolítico de la PPA de modo que potencian la formación de A\beta 1-42, una forma del péptido A\beta que parece ser particularmente amiloidogénico y, por tanto, muy importante en la EA. El tamaño de diferentes formas de PPA varía de 695-770 aminoácidos, se localizan en la superficie celular u tienen un único dominio transmembrana en el extremo C. El péptido Abeta deriva de una región de la PPA adyacente y que contiene una porción del dominio transmembrana. Normalmente, el procesamiento de la APP en el sitio de la \alpha-secretasa escinde la región media de la secuencia A\beta adyacente a la membrana y libera el dominio extracelular soluble de la PPA de la superficie celular. Este procesamiento de la PPA en la \alpha-secretasa crea una PPA-\alpha soluble que es normal y no se piensa que contribuya a la EA.

El procesamiento patológico de la PPA en los sitios P y \gamma-secretasa produce un resultado muy diferente al procesamiento en el sitio \alpha. El procesamiento secuencial en los sitios \beta y \gamma secretasa libera el péptido A\beta, posiblemente un péptido muy importante en la patogenia de la EA. El procesamiento en los sitios \beta y \gamma secretasa se puede producir en el retículo endoplásmico (en las neuronas) y en la vía endosómica/lisosómica tras la reinternalización de la PPA de la superficie celular (en todas las células). A pesar de los intensos esfuerzos realizados durante más de 10 años para identificar las enzimas responsables del procesamiento de la PPA en los sitios \beta y \gamma, para producir el péptido A\beta, dichas proteasas han permanecido desconocidas hasta esta descripción.

El documento EP0855444A describe una aspartilo proteinasa y su implicación en la enfermedad de Alzheimer.

El documento WO94/13319 describe la identificación de varias proteasas del cerebro humano, que procesan la PPA a péptido \beta-amiloide, y su uso en la detección selectiva de inhibidores. En el ejemplo 9 se describe que la catepsina B produce péptido \beta-amiloide.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un procedimiento para identificar un agente que modula la actividad de una proteasa implicada en el procesamiento de la proteína precursora de amiloide (PPA) en beta amiloide, comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la proteasa purificada y un sustrato de la PPA de la misma, que comprende un sitio de procesamiento del beta amiloide en presencia y ausencia de un agente de ensayo, en el que la proteasa

(i): comprende un fragmento de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 6 que incluye DTG y DSG; o

(ii): está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con la complementaria de SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 5 en las siguientes estrictas condiciones de hibridación:

(1): hibridar a 42ºC durante aproximadamente 2,5 horas 6xSCC y 0,1% SDS, y

(2): lavar a 65ºC en 1xSCC y 0,1% SDS, y

(b) determinar y comparar las respectivas actividades de procesamiento de la PPA de la proteasa en presencia y ausencia del agente de ensayo, en donde un agente que es un inhibidor de Asp2 reduce la actividad de procesamiento de la PPA y un agente que es un agonista de Asp2 incrementa tal actividad.

En las reivindicaciones adjuntas se definen, respectivamente, formas de realización preferidas de la invención.

Breve descripción de los listados de secuencia

Secuencia ID Nº 1-Asp-1 Humana, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 2-Asp-1 Humana, secuencia de aminoácidos

Secuencia ID Nº 3-Asp-2 Humana (a), secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 4-Asp-2 Humana (a), secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 5-Asp-2 Humana (b), secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 6-Asp-2 Humana (b), secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 7Asp-2 Murina (a), secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 8-Asp-2 Murina (a), secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 9-Asp-1 Humana, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 10-APP695 Humana, secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 11-APP695 Humana-Sw, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 12-APP695 Humana-Sw, secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 13-APP695 Humana-VF, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 14-APP695 Humana-VF, secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 15-APP695 Humana-KK, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 16-APP695 Humana-KK, secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 17-APP695 Humana-Sw-KK, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 18-APP695 Humano-Sw-KK, secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 19-APP695 Humana-VF-KK, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 20-APP695 Humana-VF-KK, secuencia de aminoácidos predicha

Secuencia ID Nº 21-T7-Humana-pro-Asp-2(a)\DeltaTM, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 22-T7-Humana-pro-Asp-2(a)\DeltaTM, secuencia de aminoácidos

Secuencia ID Nº 23-T7-Caspasa-Humana-pro-Asp-2(a)\DeltaTM, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 24-T7-Caspasa-Humana-pro-Asp-2(a)\DeltaTM, secuencia de aminoácidos

Secuencia ID Nº 25- Humana-pro-Asp-2(a)\DeltaTM (GC bajo), secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 26- Humana-pro-Asp-2(a)\DeltaTM (GC bajo), secuencia de aminoácidos

Secuencia ID Nº 27-T7-Caspasa-Caspasa 8 escisión-humano-pro-Asp-2(a)\DeltaTM, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 28-T7-Caspasa-Caspasa 8 escisión-humano-pro-Asp-2(a)\DeltaTM, secuencia de aminoácidos

Secuencia ID Nº 29-Asp-Humana 2(a)-\DeltaTM, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 30-Asp-Humano 2(a)-\DeltaTM, secuencia de aminoácidos

Secuencia ID Nº 31-Asp-Humana 2(a)-\DeltaTM-(His)6, secuencia de nucleótidos

Secuencia ID Nº 32-Asp-Humana 2(a)-\DeltaTM-(His)6, secuencia de aminoácidos

Secuencias ID Nº 33-46-se describen más adelante en la Descripción Detallada de la Invención

Breve descripción de las figuras

Figura 1: La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 2) del Asp1 humano.

Figura 2: La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 5) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 6) del Asp2 humano (b).

Figura 3: La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 3) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 4) del Asp2 humano (a).

Figura 4: La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 7) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 8) del Assp2 humano (a).

Figura 5: La figura 5 muestra la mejor alineación de las secuencias de aminoácidos predichas de Asp2 humano (a) y el Asp2 murino (a).

Figura 6: La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 21) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 22) de Pro-Assp-2 humano (a)\DeltaTM.

Figura 7: La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 23) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 24) de Pro-Assp-2-caspasa humano (a)\DeltaTM.

Figura 8: La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 25) y de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 26) de Pro-Assp-2 humano (a)\DeltaTM (GC bajo).

Figura 9: Transferencia Western blot que muestra la reducción de la producción de CTF99 por las células HEK125.3 transfectadas con los oligómeros antisentido dirigidos a Hu-Asp2 Mrna.

Figura 10: Transferencia Western blot que muestra el incremento de la producción de CTF99 en células Neuro-2a de ratón co-transfectadas con PPA-KK con y sin Hu-Asp2 únicamente en las células co-transfectadas con Hu-Asp2. Se observa otro incremento en la producción de CTF99 en células co-transfectadas con PPA-Sw-KK con y sin Hu-Asp2 únicamente en las células co-transfectadas con Hu-Asp2

Figura 11: La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 30) de Asp2(a) humano\DeltaTM.

Figura 12: La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos predicha (SEC ID Nº 30) de Asp2(a) humano\DeltaTM(His)_{6}.

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Descripción detallada de la invención

A continuación se indican algunas definiciones usadas en esta invención, la mayoría de las definiciones que se van a usar son aquéllas que usaría un experto en la técnica.

Cuando se habla del péptido \beta-amiloide, cualquier péptido resultante de la escisión de la PPA por acción de la beta secretasa. Esto incluye péptidos de 40, 41, 42 y 43 aminoácidos, que se extienden desde el sitio de escisión de la \beta-secretasa hasta los aminoácidos 39, 40, 41, 42 y 43. El péptido \beta-amiloide también quiere decir las secuencias 1-6, SEC ID Nº 1-6 del documento US 5,750,349, concedido el 12 de mayo de 1998 (incorporado en este documento por referencia). Un fragmento de escisión de la \beta-secretasa descrito en el presente documento se denomina CTF-99, que se extiende desde el sitio de escisión de la \beta-secretasa hasta el extremo carboxi de la PPA.

Cuando se habla de una isoforma de la PPA, lo que se quiere decir es cualquier polipéptido de la PPA, incluidas las variantes de la PPA (incluidas las mutaciones) y los fragmentos de la PPA que existen en seres humanos, tales como los descritos e el documento 5.766.846, col. 7, líneas 45-67, incorporado en este documento por referencia y véase más adelante.

El término "proteína precursora del \beta-amiloide" (PPA) como se usa en la presente memoria descriptiva se define como un polipéptido que está codificado por un gen del mismo nombre localizado en los seres humanos en el brazo largo del cromosoma 21 y que incluye la "proteína \beta-amiloide" aquí "P\betaA", véase en lo que antecede, dentro de su tercer carboxilo. La PPA es una proteína glicosilada con un único dominio de membrana expresada en una amplia variedad de células en muchos tejidos de mamíferos. Ejemplos de isotipos específicos de la PPA que actualmente se sabe que existen en seres humanos son el polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang y col. (1987) Nature 325:733-736 que se denomina la PPA "normal"; el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte y col. (1988) Nature 331:525-527 (1988) y Tanzi y col. (1988) Nature 331:528-530; y el polipéptido de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi y col. (1988) Nature 331:530-532. Ejemplos de variantes específicas de la PPA incluyen la mutación puntual que puede diferir tanto en posición como en fenotipo (para una revisión de las variantes conocidas con mutaciones véase Hardy (1992) Nature Genet. 1:_233-234). Todas las referencias citadas se incorporan en el presente documento por referencia. El término "fragmentos de la PPA", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a fragmentos de PPA distintos a aquéllos que únicamente consiste en la P\betaA o fragmentos de P\betaA. Es decir, los fragmentos de la PPA incluirán secuencias de aminoácidos de la PPA además de los que forman la 3AP intacta o un fragmento de la P\betaA.

Cuando se usa el término "cualquier aminoácido", los aminoácidos a los que se hace referencia se seleccionarán de las siguientes abreviaturas de tres letras y a continuación se proporcionan abreviaturas de una única letra, que también se pueden usar:

Alanina, Ala, A; Arginina, Arg, R; Asparagina, Asn, N; Ácido aspártico, Asp, D; Cisteína, Cys, C; Glutamina, Gln, Q; lu; E-Ácido glutámico, Glu, E; Glicina, Gly, G; Histidina, His, H; Isoleucina, Ile, I; Leucina, Leu, L; Lisina, Lys, K; Metionina, Met, M; Fenilalanina, Phe, F; Prolina, Pro, P; Serina, Ser, S; Treonina, Thr, T; Triptófano, Trp, W; Tirosina, Tyr, Y; Valina, Val, V; Ácido aspártico o Asparagina, Asx, B; Ácido glutámico o Glutamina, Glx, Z; Cualquier aminoácido, Xaa, X.

La presente invención describe un procedimiento para explorar bases de datos de genes para el motivo de sitio activo sencillo característico de las aspartil proteasas. Las aspartil proteasas eucarióticas tales como la pepsina y la renina poseen una estructura de dos dominios que se pliega para acercar dos residuos de aspartilo dentro del sitio activo. Estas están incluidas en el motivo tripeptídico corto DTG o, más rara vez, DSG. La mayoría de las aspartil proteasas se producen en forma de proenzima cuyo extremo N debe escindirse para su activación. El motivo de sitio activo DTG o DGS aparece en aproximadamente el residuo 65-70 en la proenzima (prorenina, pepsinógeno), pero en aproximadamente el residuo 25-30 en la enzima activa tras la escisión del predominio del extremo N. La limitada longitud del motivo del sitio activo dificulta la búsqueda en colecciones de marcadores cortos de secuencias expresadas (EST) para nuevas aspartil proteasas. Las secuencias de EST normalmente tienen una media de 250 nucleótidos o menos y codificarían 80-90 residuos de aminoácidos o menos. Esta sería una secuencia demasiado corta para extenderse en los dos motivos de sitio activo. El procedimiento preferido es explorar bases de datos de secuencias codificadoras de proteínas hipotéticas o ensambladas. La presente invención describe un procedimiento informático para identificar aspartil proteasas candidatas en las bases de datos de secuencias proteicas. El procedimiento se usó para identificar siete secuencias aspartil proteasas candidatas en el genoma de Caenorhabditis elegans. Estas secuencias se usaron para identificar mediante búsqueda de homología Hu-Asp1 y dos variantes alternativas de corte y empalme de Hu-Asp2, designadas en la presente memoria descriptiva Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b).

En un aspecto principal de la invención descrito en el presente documento, los autores proporcionan información nueva sobre el procesamiento de la PPA. El procesamiento patogenético de la proteína precursora del amiloide (PPA) a través de la vía del \betaA requiere la acción secuencial de dos proteasas denominadas \beta-secretasa y \gamma-secretasa. La escisión de la PPA por acción de la \beta-secretasa y de la \gamma-secretasa genera el extremo N y el extremo C del péptido \betaA, respectivamente. Debido a la superproducción del péptido \betaA, particularmente el \betaA_{1-42}, se ha implicado en el inicio de la enfermedad de Alzheimer, los inhibidores de la \beta-secretasa y/o de la \gamma-secretasa tienen potencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. A pesar de la importancia de la \beta3-secretasa y/o de la \gamma-secretasa en el procesamiento patogenético de la PPA, hasta la fecha no se ha conseguido la definición molecular de estas enzimas. Es decir, no se sabía qué enzimas eran necesarias para la escisión en el sitio de escisión de la \beta-secretasa o de la \gamma-secretasa. Los propios sitios se conocían porque se conocía la PPA y porque se conocía el péptido A\beta_{1-42}, véanse los documentos US 5.766.846 y US 5.837.672 (incorporado por referencia, con la excepción de la referencia a péptidos "solubles"). Pero no se conocía qué enzima estaba implicada en la producción del péptido A\beta_{1-42}.

La presente invención implica la definición molecular de varias aspartil proteasas humanas nuevas y una de estas, denominada Hu-Asp-2(a) y Hu-Asp2(b), se ha caracterizado con detalle. Se han descrito formas previas de asp 1 y asp 2, véanse los documentos EP 0848062 A2 y EP 0855444A2, inventores David Powel y col., asignados a Smith Kline Beecham Corp. (incorporados por referencia). En la presente memoria descriptiva se describen formas antiguas y nuevas de la Hu-Asp2. Por primera vez se expresan en forma activa, se describen sus sustratos y se describe su especificidad. Antes de esta descripción se requerían células o extractos celulares para escindir el sitio de la \beta-secretasa, ahora en los ensayos se puede usar proteína purificada, lo que también se describe en el presente documento. Sobre la base de los resultados de (1) experimentos defectivos en antisentido, (2) transfecciones transitorias defectivas en experimentos y (3) experimentos bioquímicos usando Hu-Asp-2 recombinante purificada, los inventores demuestran que la Hu-Asp-2 es la \beta-secretasa implicada en el procesamiento de la PPA. Aunque se han publicado las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha de Hu-Asp-2(a), véase en lo que antecede, véanse los documentos EP 0848062 A2 y EP 0855444A2, no se ha descrito ninguna caracterización funcional de la enzima. En este documento, los autores caracterizan la enzima Hu-Asp-2 y son capaces de explicar por qué es una enzima crucial y esencial requerida en la formación del péptido A\beta_{1-42} y una posible etapa crucial en el desarrollo de la EA.

En otra forma de realización, la presente invención también describe una nueva variante de corte y empalme de Hu-Asp2, denominada Hu-Asp-2(b), que nunca se ha descrito antes.

En otra forma de realización, la invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo compuesto por la aspartil proteasa humana 1 (Hu-Asp1) y dos variantes alternativas de corte y empalme de la aspartil proteasa humana 2 (Hu-Asp2), designadas en la presente memoria descriptiva Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b). Como se usa en la presente memoria descriptiva, debe entenderse que todas las referencias a "Hu-Asp2" se refieren tanto a Hu-Asp2(a) como Hu-Asp2(b). La Hu-Asp1 se expresa con mayor abundancia en el páncreas y los tejidos prostáticos, mientras que la Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b) se expresan con mayor abundancia en el páncreas y los tejidos cerebrales. La invención también proporciona polipéptidos de Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b), así como fragmentos de los mismos, que exhiben actividad de aspartil proteasa.

Las secuencias de aminoácidos predichas de Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b) comparten una significativa homología con las aspartil proteasas de mamífero anteriormente identificadas, tales como pepsinógeno A, pepsinógeno B, catepsina D, catepsina E y renina. P.B.Szecs, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 52:(Suppl. 210 5-22 (1992)). Estas enzimas se caracterizan por la presencia de un motivo duplicado de la secuencia DTG/DSG. Los polipéptidos de Hu-Asp1 y Hu-Asp2 descritos en la presente memoria descriptiva también exhiben una homología extremadamente elevada con el motivo consenso de Prosita para las aspartil proteasas extraídas de la base de datos SwissProt.

La secuencia de nucleótidos proporcionada como los residuos 1-1554 de la SEC ID Nº 1 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica Hu-Asp1, la secuencia de nucleótidos proporcionada como los residuos 1-1503 de la SEC ID Nº 3 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica Hu-Asp2(a) y la secuencia de nucleótidos proporcionada como los residuos 1-1428 de la SEC ID Nº 5 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica Hu-Asp2(b). El aislamiento y secuenciación del ADN que codifica Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b) se describe más adelante en los Ejemplos 1 y 2.

Como se describe en los Ejemplos 1 y 2 se usaron procedimientos de secuenciación automática para obtener la secuencia de nucleótidos de Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b). Las secuencias de nucleótidos de Hu-Asp de la presente invención se obtuvieron para ambas hebras de ADN y se cree que tienen una exactitud del 100%. No obstante, como se conoce en la técnica, la secuencia de nucleótidos obtenida mediante dichos procedimientos automáticos puede contener algunos errores. Normalmente, las secuencias de nucleótidos determinadas mediante automatización tienen una identidad de al menos aproximadamente un 95% a al menos aproximadamente un 99,9% con la secuencia de nucleótidos real de una molécula de ácido nucleico dada. La secuencia real se puede determinar con más precisión usando procedimientos de secuenciación manual, que son bien conocidos en la técnica. Un error en la secuencia que tenga como resultado una inserción o deleción de uno o más nucleótidos puede temer como resultado un desplazamiento del marco en la traducción de modo que la secuencia de aminoácidos predica difiera de la que se habría predicho a partir de la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ácido nucleido, comenzando en el punto de la mutación. El ADN de la Hu-Asp de la presente invención incluye ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado mediante PCR, ADN genómico y combinaciones de los mismos. El ADN genómico de Hu-Asp puede obtenerse mediante detección selectiva en una biblioteca genómica con el ADNc de la Hu-Asp2 descrita en la presente memoria descriptiva, usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica, o con oligonucleótidos elegidos de la secuencia de Hu-Asp2 que cebará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ARN transcito a partir del ADN de Hu-Asp también entra dentro de la presente invención.

Debido a la degeneración del código genético, dos secuencias de ADN pueden diferir y seguir codificando secuencias de aminoácidos idénticas. Por tanto, la presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que tienen una secuencia polinucleotídica que codifica cualquiera de los polipéptidos de Hu-Asp de la invención, en la que dicha secuencia polinucleotídica codifica un polipéptido de Hu-Asp que tiene la secuencia de aminoácidos completa de las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 6, o fragmentos de las mismas.

En la presente memoria descriptiva también se proporcionan polipéptidos de Hu-Asp purificados, tanto recombinantes como no recombinantes. Más importante es el hecho de que se proporcionan procedimientos para producir polipéptidos de Hu-Asp2 en forma activa. Estos incluyen la producción de polipéptidos de Hu-Asp2 y variantes de los mismos en células bacterianas, células de insectos y células de mamíferos, También en formas que permiten la secreción del polipéptido de Hu-Asp2 de células bacterianas, de insectos o de mamíferos en el medio de cultivo, así como procedimientos para producir variantes del polipéptido de Hu-Asp2 que incorpora marcadores aminoácidos que facilitan la posterior purificación. En una forma de realización preferida de la invención, el polipéptido de Hu-Asp2 se convierte en una forma proteolíticamente activa bien en células transformadas o tras la purificación y escisión mediante una segunda proteasa en un sistema sin células, tal como formas activas del polipéptido de Hu-Asp2, comenzando en la secuencia del extremo N TQHGIR o ETDEEP. Variantes y derivados, incluidos fragmentos de las proteínas Hu-Asp que tienen las secuencias de aminoácidos nativas que se indican en las SEC ID Nº 2, 4 y 6 que retienen todas las actividades biológicas de Hu-Asp también entran dentro del alcance de la presente invención. Por supuesto, un experto en la técnica podrá determinar con facilidad si un variante, derivado o fragmento de una proteína Hu-Asp muestra actividad Hu-Asp sometiendo la variante, derivado o fragmento a un ensayo convencional de aspartil proteasa. Los fragmentos de Hu-Asp dentro del alcance de esta invención incluyen aquéllos que contienen el dominio del sitio activo que contiene la secuencia de aminoácidos DTG, fragmentos que contienen la secuencia de aminoácidos DSG del dominio del sitio activo, fragmentos que contienen la secuencias de sitio activo tanto DTG como DSG, fragmentos en los que se ha alargado el espacio de las secuencias de sitio activo DTG y DSG, fragmentos en los que el espacio se ha acortado. También dentro del alcance de la invención se encuentra los fragmentos de Hu-Asp en los que se ha eliminado el dominio transmembrana para permitir la producción de Hu-Asp2 en una forma soluble. En otra forma de realización de la invención, se pueden producir de forma independiente las dos mitades de Hu-Asp2, en la que cada una contiene una única secuencia DTG o DGS de sitio activo como polipéptidos recombinantes, después se combinan en solución en la que reconstituyen una proteasa activa.

Se pueden obtener variantes de Hu-Asp mediante mutación de las secuencias nucleotídicas nativas que codifican, por ejemplo, Hu-Asp. Una variante de Hu-Asp, como se denomina en la presente memoria descriptiva, es un polipéptido sustancialmente homólogo al polipéptido de Hu-Asp nativa pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de la Hu-Asp nativa por una o más deleciones, inserciones o sustituciones en la secuencia de aminoácidos. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de la variante tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, más preferentemente una identidad de al menos aproximadamente un 90% y, más preferentemente, una identidad de al menos aproximadamente un 95%, con la secuencia de la Hu-Asp nativa. Por tanto, una secuencia de nucleótidos variante que contiene, por ejemplo, 5 mutaciones puntuales por cada cien nucleótidos, en comparación con un gen de la Hu-Asp nativa, será un 95% idéntica a la proteína nativa. El porcentaje de identidad de secuencia, también denominada homología, entre una secuencia nativa y variante de la Hu-Asp también se puede determinar mediante, por ejemplo, comparación de las dos secuencias usando cualquiera de los programas informáticos de uso habitual para ese propósito, tal como el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2 482-489 (1981)).

Se pueden conseguir alteraciones de la secuencia nativa de aminoácidos mediante una serie de técnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en lugares concretos mediante procedimientos bien conocidos para el experto en la técnica, tal como mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, descrita por Walder y col. (Gene 42:133 (1986)); Bauer y col. (Gene 37:73 (1985)); Craik (BioTechniques, Enero 1985, pág. 12 19); Smith y col. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981)); y las patentes de EE.UU. Nº 4.518.584 y 4.737.462.

Las variantes de la Hu-Asp dentro del alcance de la invención pueden comprender secuencias con sustituciones conservadoras, lo que significa que uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido de Hu-Asp son sustituidos por diferentes residuos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria del polipéptido de Hu-Asp. Tales sustituciones pueden incluir la sustitución de un aminoácido por un residuo que tenga similares propiedades fisicoquímicas, tales como la sustitución de un residuo alifático (Ile, Val, Leu o Ala) por otro o la sustitución entre residuos básicos Lys y Arg, residuos ácidos Glu y Asp, residuos de amida Gln y Asn, residuos hidroxilo Ser y Tyr, o residuos aromáticos Phe y Tyr. En Bowie y col., Science 247:1306-1310 (1990) se puede encontrar más información sobre la realización de intercambios de aminoácidos fenotípicamente silentes. Otras variantes de Hu-Asp que podrían conservar sustancialmente las actividades biológicas de Hu-Asp son aquéllas en las que se han realizado sustituciones de aminoácidos en áreas fuera de las regiones funcionales de la proteína.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con una porción de las moléculas de ácido nucleico descritas en lo que antecede, por ejemplo con al menos aproximadamente 15 nucleótidos, preferentemente con al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más preferentemente con al menos aproximadamente 30 nucleótidos y todavía más preferentemente con al menos aproximadamente de 20 a al menos aproximadamente 100 nucleótidos, de una de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. Dichas porciones de moléculas de ácido nucleico que tienen las longitudes descritas se refieren a, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de la molécula de ácido nucleico de referencia. Por condiciones de hibridación estrictas se quiere decir incubación durante la noche a aproximadamente 42ºC durante aproximadamente 2,5 horas en 6 X SSC/0,1% de SDS, seguido por lavado de los filtros en 1,0 X SSC a 65ºC, 0,1% de SDS.

Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico que codifican la Hu-Asp descritas en la presente memoria descriptiva, así como polinucleótidos capaces de hibridar con dichas moléculas de ácido nucleico se pueden usar como sonda o como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dichas sondas se pueden usar para, por ejemplo, detectar la presencia de ácidos nucleicos de Hu-Asp en ensayos in vitro, así como en transferencias de tipo Southern y Northern. También se pueden identificar tipos celulares que expresa Hu-Asp mediante el uso de dichas sondas. Dichos procedimientos son bien conocidos y el experto en la técnica podrá escoger una sonda de una longitud adecuada a la aplicación concreta. Para PCR, para aislar y amplificar dicha secuencia usando técnicas convencionales se emplean cebadores en 5' y 3' correspondientes a los extremos de una molécula de ácido nucleico de Hu-Asp deseada.

Otros fragmentos útiles de las moléculas de ácido nucleido de Hu-Asp son oligonucleótidos antisentido y sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenario capaz de unirse a un ARNm diana de Hu-Asp (usando una hebra sentido) o una secuencia de ADN de Hu-Asp (usando una hebra antisentido). En una forma de realización preferida de la invención, estos oligonucleótidos antisentido de Hu-Asp reducen el ARNm de Hu-Asp y la consiguiente producción de polipéptidos de Hu-Asp.

En otro aspecto, la invención incluye polipéptidos de Hu-Asp con o sin glicosilación del patrón nativo asociada. Tanto Hu-Asp1 como Hu-Asp2 tienen sitios aceptores canónicos pata azúcares unidos a Asn, en los que Hu-Asp1 tiene dos de dichos sitios y Hu-Asp2 tiene cuatro. La Hu-Asp expresada en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos (tratados más adelante) puede ser similar o significativamente diferente de un polipéptido de la Hu-Asp nativa en cuando a peso molecular y patrón de glicosilación. La expresión de Hu-Asp en sistemas de expresión bacterianos proporcionará una Hu-Aso no glicosilada.

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan, preferentemente, en una forma aislada y, preferentemente, están sustancialmente purificados. Los polipéptidos de Hu-Asp se pueden recuperar y purificar a partir de tejidos, células cultivadas o cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos, incluida la precipitación en sulfato amónico o etanol, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatito, cromatografía en lectina y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En una forma de realización preferida, al polipéptido de Hu-Asp se añade un marcador aminoácido usando técnicas de ingeniería genética que son bien conocidas para los que practican la técnica, que incluyen la adición de seis residuos del aminoácido histidina para permitir la purificación mediante unión a níquel inmovilizado en un soporte adecuado, epítopos para anticuerpos policlonales o monoclonales, incluido, entre otros, el epítopo T7, el epítopo myc y el epítopo V5a, y la fusión de Hu-Asp2 con parejas proteicas adecuadas, incluidas, entre otras, la glutation-S-transferasa o la proteína de unión a maltosa. En una forma de realización preferida, estas secuencias de aminoácidos adicionales se añaden al extremo c de la Hu-Asp, pero se pueden añadir al extremo N o en posiciones intermedias dentro del polipéptido Hus-Asp2.

La presente invención también se refiere a vectores que comprenden las moléculas polinucleotídicas de la invención, así como células huésped transformadas con tales vectores. Cualquiera de las moléculas polinucleotídicas de la invención se pueden unir en un vector, que, generalmente, incluye un marcador seleccionable y un origen de replicación, para su propagación en un huésped. Dado que la invención también proporciona polipéptidos de Hu-Asp expresados a partir de las moléculas polinucleotídicas descritas en lo que antecede, se prefieren los vectores para la expresión de Hu-Asp. Los vectores incluyen ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos de Hu-Asp descritos en lo que antecede o más adelante unido operablemente a secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción o de la traducción, tales como las derivadas de un gen de mamífero, microbiano, vírico o de insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o potenciadotes de la transcripción, sitios de unión al ribosoma del ARNm y secuencias adecuadas que controlan la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están unidas operablemente cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con el ADN que codifica la Hu-Asp. Por tanto, una secuencia nucleotídica promotora está unida operablemente a una secuencia de ADN de Hu-Asp si la secuencia nucleotídica promotora dirige la transcripción de la secuencia de Hu-Asp.

La selección de vectores adecuados para usar para la clonación de moléculas polinucleotídicas que codifican la Hu-Asp o para la expresión de polipéptidos de Hu-Asp dependerá, por supuesto, de la célula huésped en la que se va a transformar el vector y, cuando sea aplicable, la célula huésped de la que se ha de expresar el polipéptido de Hu-Asp. Entre las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de Hu-Asp se incluyen células procariotas, de levaduras y eucarióticas superiores, cada una de las cuales se trata más adelante.

Los polipéptidos de Hu-Aspe que se han de expresar en tales células huésped también pueden ser proteínas de fusión que incluyen regiones de las proteínas heterólogas. Estas regiones se pueden incluir para permitir, por ejemplo, la secreción, mejora de la estabilidad o facilitación de la purificación del polipéptido. Por ejemplo, en los vectores de expresión se puede incorporar una secuencia que codifique un péptido señal adecuado. Una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretora) se pueden condensar dentro del marco con la secuencia de Hus-Asp de modo que Hu-Asp se traduzca como proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en la célula huésped destinada para ello estimula la secreción extracelular del polipéptido de Hu-Asp. Preferentemente, la secuencia señal se escindirá del polipéptido de Hu-Asp tras la secreción de Hu-Asp de la célula. Ejemplos no limitantes de las secuencias señal que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen el factor I de levaduras y la líder de melatina de abeja en células de insecto sf9.

En una forma de realización preferida, el polipéptido de Hu-Asp será una proteína de fusión que incluya una región heteróloga usada para facilitar la purificación del polipéptido. Muchos de los péptidos disponibles usados para tal función permiten la unión selectiva de la proteína de fusión a una pareja de unión. Por ejemplo, el polipéptido de Hu-Asp se puede modificar para comprender un péptido para formar una proteína de fusión que se une específicamente a una pareja de unión o marcador peptídico. Ejemplos no limitantes de tales marcadores peptídicos incluyen el marcador 6-His, el marcador tioredoxina, el marcador hemaglutinina, el marcador GST y el marcador de secuencia señal OmpA. Como un experto en la técnica entenderá, la pareja de unión que reconoce y se une al péptido puede ser cualquier molécula o compuesto que incluya iones metálicos (p. ej., columnas de afinidad metálica), anticuerpos, o fragmentos de los mismos, y cualquier proteína o péptido que se une al péptido, tal como el marcador FLAG.

Entre las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de Hu-Asp se incluyen células procariotas, de levaduras y eucarióticas superiores. Entre los huéspedes procarióticos adecuados que se van a usar para la expresión de Hu-Asp se incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus, y Salmonella, así como miembros de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Para la expresión en, por ejemplo, E.coli, un polipéptido de Hu-Asp puede incluir un residuo de metionina en el extremo N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en una célula procariótica. La Met del extremo N puede escindirse opcionalmente del polipéptido de Hu-Asp expresado. Se pueden añadir otros residuos de aminoácidos en el extremo N al polipéptido de Hu-Asp para facilitar la expresión en Escherichia coli, incluidas, entre otras, la secuencia líder T7, la secuencia líder T7-caspasa 8, así como otras líderes, incluidos los marcadores de purificación tales como el marcador 6-His (Ejemplo 9). Los polipéptidos de Hu-Asp expresados en E. coli se pueden acortar mediante la eliminación de la cola citoplasmática, el dominio transmembrana o la región proximal a la membrana. Los polipéptidos de Hu-Asp expresados en E. coli se pueden obtener en forma soluble o en forma insoluble que puede o no estar presente como cuerpo de inclusión. El polipéptido insoluble puede convertirse en soluble mediante HCl guanidina, urea u otros desnaturalizantes proteicos, y después se puede volver a plegar en una forma soluble antes o después de la purificación mediante dilución o diálisis en un tampón acuoso adecuado. Si la pro forma inactiva de la Hu-Asp se produjo usando procedimientos recombinantes, puede convertirse en activa mediante escisión del prosegmento con una segunda proteasa adecuada tal como la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana.

Los vectores de expresión para usar en huéspedes procarióticos comprenden, generalmente, uno o más genes marcadores fenotípicos seleccionables. Normalmente tales genes codifican, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requisito auxotrófico. Una amplia variedad de tales vectores están disponibles con facilidad en fuentes comerciales. Entre los ejemplos se incluyen vectores pSPORT, vectores pGEM (Promega), vectores pPROEX (LTI, Bethesda, MD), vectores Bluescript (Stratagene), vectores pET (Novagen) y vectores pQE v(Qiagen).

La Hu-Asp también se puede expresar en células huésped de levaduras de los géneros, entre otros, Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces. Levaduras huéspedes preferidas son S. cerevisiae y P. pastoris. Los vectores levaduras a menudo contendrán una secuencia origen de replicación de un plásmido de levadura 2T, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. También se pueden usar vectores replicables en levaduras y en E. coli (denominados vectores lanzadera). Además de las características mencionadas en lo que antecede de los vectores levaduras, un vector lanzadera también incluirá secuencias para la replicación y la selección en E. coli. La secreción directa de polipéptidos de Hu-Asp expresados en levaduras huéspedes puede conseguirse mediante la inclusión de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder del factor I de levaduras en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica Hu-Asp.

Para la expresión de los polipéptidos de Hu-Asp también se pueden usar sistemas de cultivo celular en huéspedes insectos. En una forma de realización preferida, los polipéptidos de Hu-Asp de la invención se expresan usando un sistema de expresión en células de insectos (véase el ejemplo 10). Además, se puede usar un sistema de expresión en baculovirus para la expresión en células de insectos, tal y como han revisado Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

En otra forma de realización preferida, el polipéptido de Hu-Asp se expresa en células huésped de mamíferos. Entre los ejemplos no limitantes de líneas de células de mamífero adecuadas se incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (Gluzman y col., Cell 23:175 (1981)), la línea 293 de células renales embrionarias humanas y células de ovario de hámster chino (CHO). Preferentemente, para la expresión de las proteínas Hu-Asp se usan las células de ovario de hámster chino (Ejemplo 11).

La elección de un vector de expresión adecuado para la expresión de los polipéptidos de Hu-Asp de la invención dependerá, por supuesto, de la célula huésped de mamífero específica que se va a usar y está dentro de las capacidades del experto en la técnica. Entre los ejemplos de vectores de expresión adecuados se incluyen pcDNA3 (Invitrogen) y pSVL (Pharmacia Biotech). Un vector preferido para la expresión de polipéptidos de Hu-Asp es pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Los vectores de expresión para usar en células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de la transcripción y la traducción derivadas de genomas virales. Entre las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras de uso habitual que pueden usarse en la presente invención se incluyen las derivadas de citomegalovirus humano (CMV), adenovirus 2, el virus del polioma y el virus simio 40 (SV40). Procedimientos para la construcción de vectores de expresión en mamíferos se describen en, por ejemplo, Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)); Cosman y col. (Mol. Immunol. 23:935 (1986)); Cosman y col. (Nature 312:768 (1984)); el documento EP-A-0367566; y el documento WO 91/18982.

Los polipéptidos de la presente invención también se pueden usar para aumentar los anticuerpos policlonales y monoclonales, que son útiles en los ensayos diagnósticos para detectar la expresión del polipéptido de Hu-Asp. Dichos anticuerpos se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet y col. (eds.), Plenum Press, New York (1980). También se pueden usar péptidos sintéticos que comprenden porciones de Hu-Asp que contienen de 5 a 20 aminoácidos, para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales tras la unión a una proteína transportadora adecuada, incluidas, entre otras, hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina de pollo o seroalbúmina bovina, usando varios reactivos de sobrecruzamiento, incluidas carboimidas, glutaraldehído o, si el péptido contiene una cisteína, N-metilmaleimida. Un péptido preferido para inmunización cuando se conjuga con KLH contiene el extremo C de Hu-Asp1 o Hu-Asp2, que comprende QRRPRDPEVVNDESSLVRHRWK o LRQQHDDFADDISLLK, respectivamente.

Las moléculas de ácido nucleico de Hu-Asp de la presente invención también son valiosas para la identificación cromosómica, ya que pueden hibridar con un lugar específico de un cromosoma humano. La Hu-Asp1 se ha localizado en el cromosoma 21, mientras que la Hu-Asp2 se ha localizado en el cromosoma 11q23.3-24.1. Existe la necesidad actual de identificar sitios concretos en el cromosoma, ya que actualmente se dispone de pocos reactivos marcadores en cromosoma basados en los datos reales de la secuencia (polimorfismos de repetición) para marcar la localización en el cromosoma. Una vez que se ha mapeado una secuencia hasta un lugar cromosómico preciso, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. La relación entre genes y enfermedades que se han mapeado en la misma región del cromosoma se puede identificar mediante análisis de la unión, en el que la se determina la co-herencia de genes físicamente adyacentes. Si un gen que parece estar relacionado con una enfermedad concreta es de hecho la causa de la enfermedad se puede determinar mediante comparación de la secuencia de ácido nucleico entre individuos afectados y no afectados. En otra forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento de análisis de la función de Hu-Asp, específicamente la función de Hu-Asp que implica incubar en solución el polipéptido de Hu-Asp con un sustrato adecuado, incluidos, entre otros, un péptido sintético que contiene el sitio de escisión de la PPA por la \beta-secretasa, preferentemente uno que contenga la mutación encontrada en un gemelo sueco con EA heredada en el que KM cambia a NL, en el que dicho péptido comprende la secuencia SEVNLDAEFR en una solución tampón ácida, preferentemente una solución tampón ácida de pH 5,5 (véase el ejemplo 12) usando la escisión del péptido monitorizada mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento como medida de la actividad proteolítica de Hu-Asp. Los ensayos preferidos para la actividad proteolítica utilizan sustratos de ensayo de péptidos inactivados internamente. Entre dichos sustratos adecuados se incluyen péptidos que tienen unidos un fluoróforo y un inactivador en pareja, incluidos, entre otros, cumarina y dinitrofenol, respectivamente, de modo que la escisión del péptido por la Hu-Asp tenga como resultado un incremento de la fluorescencia debido a la separación física del fluoróforo y el inactivador. Los ensayos colorimétricos preferidos de la actividad proteolítica de Hu-Asp utilizan otros sustratos adecuados que incluyen los aminoácidos P2 y P1 que comprenden el sitio de reconocimiento para la escisión unido al o-nitrofenol a través de un enlace amida, de modo que la escisión por la Hu-Asp tenga como resultado un incremento en la densidad óptica tras alterar el tampón de ensayo hasta un pH alcalino.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento para la identificación de un agente que incrementa la actividad de un polipéptido de Hu-Asp seleccionado del grupo compuesto por Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b), comprendiendo el procedimiento

(a) determinar la actividad de dicho polipéptido de Hu-Asp en presencia de un agente de ensayo y en ausencia de un agente de ensayo

(b) comparar la actividad de dicho polipéptido de Hu-Asp determinada en presencia de dicho agente de ensayo con la actividad de dicho polipéptido de Hu-Asp determinada en ausencia de un agente de ensayo;

en el que un nivel mayor de actividad en presencia de dicho agente de ensayo que en ausencia de dicho agente de ensayo indica que dicho agente de ensayo ha incrementado la actividad de dicho polipéptido de Hu-Asp. Dichos análisis se pueden realizar con el polipéptido de Hu-Asp en un sistema sin células y con células cultivadas que expresan Hu-Asp, así como sus variantes o isoformas.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento para la identificación de un agente que disminuye la actividad de un polipéptido de Hu-Asp seleccionado del grupo compuesto por Hu-Asp1, Hu-Asp2(a) y Hu-Asp2(b), comprendiendo el procedimiento

en el que un nivel menor de actividad en presencia de dicho agente de ensayo que en ausencia de dicho agente de ensayo indica que dicho agente de ensayo ha disminuido la actividad de dicho polipéptido de Hu-Asp. Dichos análisis se pueden realizar con el polipéptido de Hu-Asp en un sistema sin células y con células cultivadas que expresan Hu-Asp, así como sus variantes o isoformas.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una línea celular nueva (células HEK125.3) para medir el procesamiento del péptido \beta amiloide (\betaA) desde la proteína precursora del amiloide (PPA). Las células son transformantes estables de células 293 renales embrionarias humanas (KEK293) con un vector bicistrónico derivado de pIRES-EGFP (Clontech) que contiene un ADNc de PPA humano modificado, un sitio interno de entrada en el ribosoma y un ADNc potenciado de proteína fluorescente verde (EGFP) en el segundo cistrón. El ADN de la PPA se modificó mediante la adición de dos codones de lisina al extremo carboxilo de la secuencia codificadora de la PPA. Esto multiplica por 2-4 el procesamiento del péptido \betaA de la PPA humana. Este nivel de procesamiento de péptido \betaA es 60 veces superior al observado en las células HEK293 no transformadas. Las células HEK125.3 serán útiles para los ensayos de compuestos que inhiben el procesamiento del péptido \betaA. Esta invención también incluye la adición de dos residuos de lisina al extremo C de otras isoformas de PPA, Incluidas las isoformas de 751 Y 770 aminoácidos, a isoformas de la PPA que tienen mutaciones que se encuentran en la EA humana, incluidas las mutaciones Swedish KM\rightarrowNL y V717\rightarrowF, a fragmentos del extremo C de la PPA, tales como los que comienzan con el sitio de escisión de la \beta-secretasa, a fragmentos del extremo C de la PPA que contiene el sitio de escisión de la \beta-secretasa que están unidos operablemente a un péptido señal en el extremo N para la inserción en la membrana y la secreción, y a fragmentos en el extremo C de la PPA que se han unido operablemente a un péptido señal en el extremo N para la inserción en la membrana y la secreción, y una secuencia indicadora que incluye, entre otras, la proteína fluorescente verde o la fosfatasa alcalina, de modo que la escisión producida por la \beta-secretasa libera la proteína indicadora de la superficie de las células que expresan el polipéptido.

Habiendo descrito generalmente la invención, la misma se entenderá con más facilidad haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Desarrollo de un algoritmo de búsqueda útil para la identificación de aspartil proteasas y la identificación de genes de aspartil proteasa de C. elegans en Wormpep 12 Materiales y procedimientos

Las aspartil proteasas clásicas tales como la pepsina y la renina poseen una estructura de dos dominios que se pliega para acercar dos residuos de aspartilo dentro del sitio activo. Estas están incluidas en el motivo tripeptídico corto DTG o, más rara vez, DSG. El motivo del sitio activo DTG o DSG aparece en aproximadamente el residuo 25-30 en la enzima, pero en aproximadamente el residuo 65-70 en la proenzima (prorenina, pepsinógeno). Este motivo aparece de nuevo aproximadamente 150-200 residuos en dirección 5'. La proenzima se activa mediante la escisión del predominio en el extremo N. Este patrón ejemplifica la estructura de doble dominio de las enzimas aspartilo actuales que aparentemente han surgido mediante duplicación y divergencia génica. Por tanto,

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en la que X indica el comienzo de la enzima, tras el prodominio del extremo N, e Y indica el centro de la molécula en el que la repetición del gen comienza de nuevo.

En el caso de las enzimas retrovirales, tales como la proteasa del VIH, sólo representan una mitad de las estructuras de dos dominios de enzimas bien conocidas como pepsina, catepsina D, renina etc. No tienen prosegmento, pero están forjadas a partir de una poliproteína precursora que contiene las proteínas gag y pol del virus. Pueden estar representados por:

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Este "monómero" solo tiene aproximadamente 100 aa, por lo que es extremadamente parsimonioso en comparación con los otros dímeros de aspartil proteasa, que tienen del orden de 330 aminoácidos más o menos, sin contar el prodominio del extremo N.

La limitada longitud del motivo del sitio activo de la aspartil proteasa eucariótica dificulta la búsqueda en colecciones de EST de secuencias nuevas. Las secuencias EST normalmente tienen una media de 250 nucleótidos, por lo que en este caso sería improbable atravesar ambos motivos de sitio activo de la aspartil proteasa. En su lugar, los inventores se han vuelto hacia el genoma de C. elegans. Se ha estimado que el genoma de C. elegans contiene alrededor de 13.000 genes. De estos, se han secuenciado aproximadamente 12.000 y el correspondiente hipotético marco de lectura abierto (ORF) se ha introducido en la base de datos Wormpep12. Los inventores han usado esta base de datos como base para una exploración completa del genoma por un eucariota superior para nuevas aspartil proteasas usando un algoritmo que hemos desarrollado para este fin. Para la búsqueda se usó el siguiente lenguaje AWK para localizar proteínas que contienen dos motivos de DTG o DSG, que se repitió cuatro veces para recuperar todas las combinaciones pareadas del motivo aspartilo.

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El lenguaje AWK mostrado en lo que antecede se usó para buscar en Wormpep12, que se descargó de ftp.sanger.
ac.uk/pub/_databases/_wormpep, las entradas de secuencias que contienen al menos dos motivos DTG o DGS. El uso de AWK limitó cada registro a 3000 caracteres o menos. Por tanto, manualmente se eliminaron 35 registros más grandes más o menos de Wormpep 12, dado que, en cualquier caso, era improbable que codificara aspartil proteasas.

Resultados y discusión

La base de datos Wormpep 12 contiene 12.178 entradas, aunque algunas de estas (<10%) representan alternativamente transcritos de corte y empalme del mismo gen. Estimaciones del número de genes codificados en el genoma de C. elegans es del orden de 13.000 genes, por lo que se puede estimar que la Wormpep 12 cubre más del 90% del genoma de C. elegans.

Las aspartil proteasas eucarióticas contienen una estructura de dos dominios, probablemente a causa de una duplicación génica ancestral. Cada dominio contiene el motivo de sitio activo D(S/T)G localizado de 20-25 residuos de aminoácidos en cada dominio. Las proteasas retrovirales (p. ej., proteasa del VIH) o de retrotrasposones son homodímeros de subunidades que son homólogas a un único dominio de aspartil proteasa eucariótica. Para la búsqueda en la base de datos Wormpep12 de proteínas en las que se producía el motivo D(S/T)G al menos dos veces se usó un lenguaje AWK. Esto se identificó > 60 proteínas con dos motivos DTG o DSG. Se usó inspección visual para seleccionar proteínas en las que la posición de los dominios de aspartilo hacía pensar en una estructura de dos dominios que cumple los criterios que se describen en lo que antecede.

Además se usó el patrón PS00141 del sitio activo de la aspartil proteasa viral y eucariótica PROSITE para buscar en Wormpep 12 candidatos a aspartil proteasas. (Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., The PROSITE database: its status in 1997, Nucleic Acids Res. 24:217-221(1997)). Esto ha generado un grupo de superposición de secuencias de Wormpep12. De estas, siete secuencias contenían dos motivos DTG o DSG y el patrón de sitio activo de aspartil proteasa PROSITE. De estas siete tres se encontraron en el mismo clon cósmico (F21F8.3, F21F8.4 y F21F8.7), lo que sugiere que representan una familia de proteínas que surgió mediante duplicación génica ancestral. En el mismo cluster génico hay otros dos ORF con una extensa homología con F21F8.3, F21F8.4 y F21F8.7 (F21F8.2 y F21F8.6), no obstante, estos sólo contienen un único motivo DTG. Exhaustivas búsquedas en BLAST con estas siete secuencias frente a Wormpep 12 no pudo revelar candidatos adicionales a aspartil proteasas en el genoma de C. elegans que contuvieran dos repeticiones del motivo DTG o DGS.

La búsqueda en BLASTX con cada secuencia de C. elegans contra SWISS-PROT, GenPep y TREMBL reveló que R12H7.2 era el gusano más cercano homólogo a las aspartil proteasas de mamífero conocidas y que T18H9.2 estaba relacionado algo más lejano, mientras que CEASP1, F21F8.3, F21F8.4, y F21F8.7 formaban un subcluster que tenía la menor homología de secuencia con las secuencias de mamífero.

Discusión

La PPA, las presenilinas y el p35, el activador de cdk5, todos sufren procesamiento proteolítico intracelular en los sitios que configuran la especificidad de sustrato de la proteasa del VIH. Por tanto, la alteración de la regulación de una aspartil proteasa celular con la misma especificidad de sustrato podría proporcionar un mecanismo unificador para la producción de las patologías con placas y marañas en la EA. En consecuencia, los inventores buscan identificar nuevas aspartil proteasas. Una búsqueda en el genoma completo de C. elegans identificó siete marcos de lectura abiertos que cumplen el perfil de aspartil proteasa que los inventores habían identificado. Probablemente estas siete aspartil proteasas comprendan todo el complementario de dichas proteasas en un eucariota simple multicelular. Estas incluyen cuatro aspartil proteasas estrechamente relacionadas únicas de C. elegans que probablemente surgieron por duplicación de un gen ancestral. Se encontró que las otras tres candidatas a aspartil proteasas (T18H9.2, R12H7.2 y C11D2.2) tenían homología con las secuencias génicas de mamífero.

Ejemplo 2 Identificación de nuevas aspartil proteasas humanas usando extracción de datos mediante transferencia de genoma Materiales y procedimientos Análisis asistido por ordenador de bases de datos de EST, ADNc y secuencias polipeptídicas predichas

Mediante exhaustivas búsquedas de homología en bases de datos de EST con las secuencias CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 y F21F8.7 no se pudo revelar ningún nuevo homólogo de mamífero. Las búsquedas TBLASTN con R12H7.2 mostraron homología con catepsina D, catepsina E, pepsinógeno A, pepsinógeno C y renina, en particular alrededor del motivo DTG dentro del sitio activo, pero tampoco pudieron identificar ninguna nueva aspartil proteasa de mamífero adicional. Esto indica que el genoma de C. elegans probablemente contenga únicamente una única aspartil proteasa lisosómica que, en mamíferos, está representada por una familia génica que surgió a través de la duplicación y posterior modificación de un gen ancestral.

Mediante búsquedas TBLASTN con T18H9.2, la secuencia de C. elegans restante, se identificaron varias EST que se ensamblaban en un cóntigo codificador de una nueva aspartil proteasa humana (Hu-ASP1). Como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1, la búsqueda BLASTX con el cóntigo de Hu-ASP1 contra SWISS-PROT reveló que los motivos del sitio activo en la secuencia alineada con los sitios activos de otras aspartil proteasas. Varias rondas exhaustivas de búsquedas BLASTN contra LifeSeq, LifeSeqFL y las colecciones públicas de EST identificaron 102 EST de múltiples bibliotecas de ADNc ensambladas en un cóntigo único. Las 51 secuencias en este cóntigo encontradas en las colecciones públicas de EST también han sido ensambladas en un cóntigo único (THC213329) por el Institute for Genome Research (TIGR). La anotación TIGR indica que no pudieron encontrar ninguna coincidencia en la base de datos para el cóntigo. Obsérvese que el cóntigo TIGR es el complementario inverso del cóntigo LifeSeq que ensamblaron los inventores. La búsqueda BLASTN de Hu-ASP1 frente a las secuencias EST de rata y ratón en ZooSeq reveló un EST homólogo en cada base de datos (Incyte clon 700311523 y IMAGE clon 313341, número de registro en GenBank 10530, respectivamente).

Mediante búsquedas TBLASTN con la secuencia de ADN ensamblada para Hu-ASP1 frente a las bases de datos LifeSeqFL y pública de EST se identificó una segunda secuencia humana relacionada (Hu-Asp2) representada por un único EST (2696295). La traducción de esta secuencia parcial de ADNc revela un único motivo DTG que tiene homología con el motivo de sitio activo de una aspartil proteasa bovina, NM1.

Se realizaron búsquedas BLAST, ensamblajes de cóntigos y múltiples alineaciones de secuencia usando las herramientas de bioinformática proporcionadas con las bases de datos LifeSeqFL y LifeSeq Assembled de Incyte. Se identificaron motivos proteicos predichos usando el diccionario Prosita (motivos en GCG 9) o la base de datos Pfam.

Clonación del ADNc de longitud completa de Hu-Asp1

El marco de lectura abierto del gen T18H9.2CE de C. elegans se usó para la búsqueda en las bases de datos LifeSeq y LifeSeq-FL de Incyte y se detectó un único ensamblaje electrónico denominado 1863920CE1. El clon de ADNc más en 5' en este cóntigo, 1863920, se obtuvo de Incyte y se secuenciaron completamente ambas hebras. La traducción del marco de lectura abierto contenido dentro de este clon 1863920 reveló la presencia del motivo de sitio activo duplicado de aspartil proteasa (DTG/DGS), pero el extremo 5' estaba incompleto. El resto de la secuencia codificadora Hu-Asp1 Se determinó mediante análisis 5' Marathon RACE usando como molde ADNc listo Marathon de placenta humana (Clonetech). Un cebador oligonucleotídico 3'-antisentido específico del extremo 5' del clon 1863920 se emparejó con el cebador 5'-sentido específico del adaptador sintético de ADNc listo de Marathon en la PCR. Los productos específicos de la PCR se secuenciaron directamente mediante secuenciación en ciclos y la secuencia resultante se ensambló con la secuencia del clon 1863920 para dar la secuencia codificadora completa de Hu-Asp1
(SEC ID Nº 1).

En la secuencia de aminoácidos primaria de Hu-Asp1 están presentes varias características interesantes (Figura 1, SEC ID Nº 2). La secuencia contiene un péptido señal (residuos 1-20 en la SEC ID Nº 2), un pro-segmento y un dominio catalítico que contiene dos copias del motivo de sitio activo de aspartil proteasa (DTG/DSG). El espacio entre el primero y el segundo motivo de sitio activo es de aproximadamente 200 residuos, que deberían corresponder al tamaño esperado de un único dominio eucariótico de aspartil proteasa. Más interesante es el hecho de que la secuencia contiene un dominio transmembrana predicho (residuos 469-492 en la SEC ID Nº 2) cerca de su extremo C, lo que sugiere que la proteasa está anclada en la membrana. Esta característica no se encuentra en ninguna otra aspartil proteasa.

Clonación de un ADNc de Hu-Asp de longitud completa

Como se ha descrito en lo que antecede en el Ejemplo 1, una amplia exploración del genoma de Caenorhabditis elegans en la base de datos WormPep12 en busca de posibles aspartil proteasas y la posterior extracción en bases de datos de EST humanos reveló un ortólogo humano del gen de C. elegans T18H9.2 denominado Hu-Asp1 El cóntigo ensamblado para Hu-Asp1 se usó para buscar parálogos humanos usando la herramienta de búsqueda BLAST en bases de datos de EST humanos y se encontró una única coincidencia significativa (2696295CE1) con una identidad compartida de aproximadamente un 60% en la base de datos LifeSeq FL. Búsquedas similares de gb105PubEST o de la familia de bases de datos humanas disponibles de TIGR no identificaron clones similares de EST. El clon de ADNc 2696295, identificado mediante análisis de secuencia de un solo pase de una biblioteca de ADNc de útero humano, se obtuvo de Incyte y se secuenció completamente en ambas hebras. Este clon contenía un marco de lectura abierto incompleto de 1266 pb que codificaba un polipéptido de 422 aminoácidos pero carecía de un ATG iniciador en el extremo 5'. La inspección de la secuencia predicha reveló la presencia del motivo de sitio activo duplicado de aspartil proteasa DTG/DSG, separada por 194 residuos de aminoácidos. Posteriores búsquedas de posteriores RELEASES de la base de datos de EST LifeSeq identificaron EST adicionales, secuenciados de una biblioteca de ADNc de astrocitos humanos (4386993), que parecían contener una secuencia adicional en 5' con respecto al clon 2696295. El análisis comparativo del clon 4386993 y del clon 2696295 confirmó que el clon 4386993 tenía el marco de lectura abierto ampliado en 31 residuos de aminoácidos, incluidos dos codones de iniciación de la traducción dentro del marco. A pesar de la presencia de los dos ATG dentro del marco, no se observó ningún codón de terminación dentro del marco en dirección 5' del ATG, lo que indica que el 4386993 puede no tener la longitud completa. Además, la alineación de las secuencia de los clones 2696295 y 4386993 reveló una inserción de 75 pares de bases en el clon 2696295 respecto al clon 4386993 que tiene como resultado la inserción de 25 residuos de aminoácidos adicionales en 2696295. El resto de la secuencia codificadora de Hu-Asp2 se determinó mediante análisis 5' Marathon RACE usando como molde ADNc listo Marathon de hipocampo humano. Un cebador oligonucleotídico 3'-antisentido específico de la región 5' compartida de los clones clones 2696295 y 4386993 se emparejó con el cebador 5'-sentido específico del adaptador sintético de ADNc listo de Marathon en la PCR. Los productos específicos de la PCR se secuenciaron directamente mediante secuenciación en ciclos y la secuencia resultante se ensambló con la secuencia de los clones 2696295 y 4386993 para dar la secuencia codificadora completa de Hu-Asp2(a) (SEC ID Nº 3) y Hu-Asp2(b) (SEC ID Nº 5), respectivamente.

En la secuencia primaria de aminoácidos de Hu-Asp2(a) (Figura 3 y SEC ID Nº 4) y de Hu-Asp2(b) (figura 2, SEC ID Nº 6) están presentes varias características interesantes. Ambas secuencias contienen un péptido señal (residuos 1-21 en la SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6), un pro-segmento y un dominio catalítico que contiene dos copias del motivo de sitio activo de aspartil proteasa (DTG/DSG). El espacio entre el primero y el segundo motivo de sitio activo es variable debido a la deleción de 25 residuos de aminoácidos en Hu-Asp2(b) y consiste en 168 frente a 194 residuos de aminoácidos, para Hu-Asp2(b) y Hu-Asp2(a), respectivamente. Más interesante es el hecho de que ambas secuencias contienen un dominio transmembrana predicho (residuos 455-477 en la SEC ID Nº 4 y 430-452 en la SEC ID Nº 6)) cerca de su extremo C, lo que indica que la proteasa está anclada en la membrana. Esta característica no se encuentra en ninguna otra aspartil proteasa, a excepción de Hu-Asp 1.

Ejemplo 3 Clonación molecular de ADNc y ADN genómico de Asp2 de ratón. Clonación y caracterización del ADNc de Asp2 murino

El ortólogo murino de Hu-Asp2 se clonó usando una combinación de detección selectiva en biblioteca de ADNc, PCR y clonación genómica. Aproximadamente 500.000 clones independientes de una biblioteca de ADNc de cerebro de ratón se sometieron a detección selectiva usando una sonda de la secuencia codificadora marcada con ^{32}P preparada a partir de Hu-Asp2. Los positivos duplicados se sometieron a análisis de secuencia del ADN y el ADNc más largo contenía toda la región 3' no traducida y 47 aminoácidos en la región codificadora. La amplificación por PCR de la misma biblioteca de ADNc de cerebro de ratón con un cebador oligonucleotídico antisentido específico de la secuencia de ADNc más en 5' determinada antes y un cebador sentido específico de la región 5' de la secuencia de Asp2 humana, seguida por análisis de la secuencia de ADN dio 980 pb adicionales de la secuencia codificadora. El resto de la secuencia 5' de Asp-2 murino derivó de la secuencia genómica (véase más adelante).

Aislamiento y análisis de secuencia del gen de Asp2 murino. En la base de datos de EST GenBank se identificó una secuencia de EST murino que codifica una porción del ADNc de Asp2 murino usando la herramienta de búsqueda BLAST y la secuencia codificadora de Hu-Asp2 como petición. El clon g3160898 mostró un identidad compartida del 88% con la secuencia humana de aproximadamente 352 pb. Los pares de cebadores oligonucleotídicos específicos de esta región de Asp2 murino se sintetizaron y usaron para amplificar las regiones del gen murino. El ADN genómico murino, derivado de la cepa 129/SvJ, se amplificó en la PCR (25 ciclos) usando varios conjuntos de dejadores específicos del Asp2 murino y los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El conjunto de cebadores Zoo-1 y Zoo4 amplificó un fragmento de 750 pb que contenía aproximadamente 600 pb de secuencia intrónica basada en la comparación con la secuencia de ADNc conocida. Este conjunto de cebadores se usó a continuación para la detección selectiva de una biblioteca BAC murina mediante PCR, se aisló un único clon genómico y este clon se confirmó que contenía el gen de Asp2 murino mediante análisis de secuencia de ADN. La secuenciación aleatoria (en disparo) del ADN de este clon genómico de Asp2 y la comparación con las secuencias de ADNc de Hu-Asp2 y las secuencias de aDNc murino parciales definieron la secuencia de longitud completa de ASp2 murino (SEC ID Nº 7). La secuencia de aminoácidos predicha de Asp2 murino (SEC ID Nº 8) mostró una identidad compartida del 96,4% (algoritmo GCG BestFit) con 18/501 sustituciones de residuos de aminoácidos en comparación con la secuencia humana (Figura 4).

Ejemplo 4 Distribución tisular de la expresión de transcritos de Hu-Asp2 Materiales y procedimientos

La distribución tisular de la expresión de Hu-Asp2 se determinó usando múltiples transferencias titulares de tipo Northern obtenidos de Clonetech (Palo Alto, CA). El clon 2696295 de Incyte en el vector pINCY se digirió hasta el final con EcoRI/NotI y el inserto de ADNc de 1,8 kb se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento se marcó radiactivamente para una actividad específica > 1 X 10^{9} dpm/\mug mediante cebado aleatorio en presencia de [\alpha-^{32}P-Datp] (> 3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) y el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Filtros de nylon que contenían ARN poliA desnaturalizados fraccionados por tamaño aislados de diferentes tejidos humanos se hibridaron con 2 x 10^{6} dpm/ml de sonda en tampón ExpressHyb (Clonetech, Palo Alto, CA) durante 1 hora a 68ºC y se lavaron tal y como recomienda el fabricante. Las señales de hibridación se visualizaron mediante autoradiografía usando película BioMax XR (Kodak, Rochester, NY) con pantallas de intensificación a -80ºC.

Resultados y discusión

Del análisis de la base de datos se obtuvo información limitada sobre la distribución tisular de la expresión de los transcritos de Hu-Asp2 debido al número relativamente pequeño de EST detectados usando los procedimientos descritos en lo que antecede (< 5). En un esfuerzo de obtener más información sobre la expresión del gen de Hu-Asp2 se empleó un análisis de tipo nortean para determinar tanto el tamaño(s) como la abundancia de los transcritos de Hu-Asp2. Los ARN poliA aislados de una serie de tejidos periféricos y regiones cerebrales se mostraron en un soporte sólido después de la separación en condiciones desnaturalizantes y los transcritos de Hu-Asp2 se visualizaron mediante hibridación de alta astringencia con el inserto radiomarcado del clon 2696295. La sonda de ADNc de 2696295 visualizó una constelación de transcritos que migraron con tamaños aparentes de 3,0 kb, 4,4 kb y 8,0 kb, siendo los dos últimos transcritos los más abundantes.

En los tejidos analizados, los transcritos de Hu-Asp2 fueron los más abundantes en el páncreas y el cerebro, con niveles menores pero detectables observados en los demás tejidos examinados, a excepción del timo y los PBL. Dada la relativa abundancia de los transcritos de Hu-Asp2 en el cerebro, también se estableció la expresión regional en regiones cerebrales. Se detectó una constelación similar de tamaños de transcritos en todas las regiones cerebrales examinadas [cerebelo, corteza cerebral, polo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal y putamen], con la abundancia mayor en la médula y la columna vertebral.

Ejemplo 5 Detección de transferencia de tipo northern de transcritos de Hu-Asp1 y Hu-Asp2 en líneas celulares humanas

Se analizó la capacidad de diversas líneas celulares humanas para producir ARNm de Hu-Asp1 y Asp2. De la ATCC se obtuvieron células renales embrionarias humanas (HEK-293), células de mono verde africano (Cos-7), células de ovario de hámster chino (CHO), células HELA y la línea celular de neuroblastoma IMR-32. Las células se cultivaron en DME que contenía 10% de FCS, a excepción de las células CHO que se mantuvieron en \alpha-MEM/10% de FCS a 37ºC en 5% de CO_{2} hasta que estaban cerca de confluencia. Las monocapas lavadas de células (3 x 107) se lisaron sobre las placas y se extrajo el ARN poliA+ usando el kit de Qiagen Oligotex Direct mRNA. Las muestras que contenían 2 \mug de ARN poliA+ de cada línea celular se fraccionaron en condiciones de desnaturalización (se trataron con glioxal), se transfirieron a un soporte sólido de membrana de nylon mediante acción capilar y los transcritos se visualizaron mediante hibridación con sondas de secuencias codificadoras marcadas (^{32}P) de cebado aleatorio derivadas de Hu-Asp1 o Hu-Asp2. Las señales radiactivas se detectaron mediante exposición a una película de rayos X y a través de análisis de imagen con PhosphorImager.

Con la sonda de ADNc de Hu-Asp1 se visualizó una constelación similar de transcritos (2,6 kb y 3,5 kb) que anteriormente se habían detectado en tejidos humanos. La abundancia relativa determinada mediante cuantificación de la señal radiactiva fue Cos-7 > HEK 292 = HELA > IMR32.

Con la sonda de ADNc de Hu-Asp2 también se visualizó una constelación similar de transcritos en comparación con el tejido (3,0 kb, 4,4 kb y 8,0 kb) con la siguiente abundancia relativa; HEK 293 > Cos 7 > IMR32 > HELA.

Ejemplo 6 Modificación de la PPA para incrementar el procesamiento del \betaA para la detección selectiva in vitro

Las líneas celulares humanas que procesan el péptido \betaA de la PPA proporcionan un medio para la detección selectiva en ensayos celulares para inhibidores de la \beta y la \gamma-secretasa. La producción y liberación del péptido \betaA en el sobrenadante del cultivo se monitoriza mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (EIA). Aunque la expresión de PPA es amplia y tanto líneas de células neurales como no neurales procesan y liberan péptido \betaA, los niveles de procesamiento de PPA endógeno son bajos y difíciles de detectar mediante EIA. El procesamiento del péptido \betaA se puede incrementar a través de la expresión en mutaciones de la PPA en líneas celulares transformadas que potencian el procesamiento del péptido \betaA. Los inventores realizaron la fortuita observación de que la adición de dos residuos de lisina al extremo carboxilo de PPA695 incrementa el procesamiento de \betaA todavía más. Esto permitió a los inventores crear una línea celular transformada que libera péptido \betaA al medio de cultivo al notable nivel de 20.000 pg/ml.

Materiales y procedimientos Materiales

La línea de células embrionarias humana 293 (células HEK293) se obtuvo internamente. El vector pIRES-EGFP se adquirió de Clontech, Los oligonucleótidos para mutación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se adquirieron en Genosys. Un plásmido que contiene PAA695 humano (SEC ID Nº 9 [de nucleótidos] y la SEC ID Nº 10 [de aminoácidos]) se obtuvo en Northwestern University Medical School. Este se subclonó en pSK (Stratagene) en el sitio Not1 y se creó el plásmido pAPP695.

Protocolo de mutagénesis

La mutación Swedish (K670N, M671L) se introdujo en pAPP695 usando el kit Stratagene Quick Change mutagénesis para crear el plásmido pAPP695NL SEC ID Nº 11 [de nucleótidos] y la SEC ID Nº 12 [de aminoácidos]). Para introducir el motivo de di-lisina en el extremo C de PPA695, se usó el cebador directo nº 276 5' GACTGAC
CACTCGACCAGGTTC (SEC ID Nº 47) con el cebador "parche" nº 274 5' CGAATTAAATTCCAGCACACTGGC
TACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAAC (SEC ID Nº 48) y el cebador flanqueante nº 275 CGAATTAAATTCCAG
CACACTGGCTA (SEC ID Nº 49) para modificar el extremo 3' del ADNc de PAA695 (SEC ID Nº 15 [de nucleótidos] y la SEC ID Nº 16 [de aminoácidos]), Esto también añadió un sitio de restricción BstX1 que será compatible con el sitio BstX1 en el sitio de clonación múltiple de pIRES-EGFP. La amplificación por PCR se realizó un kit de PCR Clontech HF Advantage cDNA usando la mezcla de polimerasa y los tampones suministrados por el fabricante. Para la PCR de "parche", el cebador parche se usó a la 1/20 de la concentración molar de los cebadores flanqueantes. Los productos de la amplificación con PCR se purificaron usando un kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen). Tras la digestión con enzimas de restricción, los productos se separaron en geles de agarosa al 0,8% y después los fragmentos de ADN escindidos se purificaron usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).

Para reensamblar un ADNc de APP695-Sw modificado, el fragmento de 5' Not1-Bgl2 del ANDc de APP695-Sw y el fragmento 3' Bgl2-BstX1 del ADNc de APP695 obtenidos mediante PCR se ligaron en el ADN del plásmido pIRES-EGFP abierto en los sitios Not1 y BstX1. Las uniones se realizaron durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un kit de unión Rapid DNA (Boehringer Mannheim) y se transformaron en Library Efficiency DH5\alpha Competent Cells (GibcoBRL-Life Technologies). Mediante amplificación por PRC usando cebadores nº 276 y 275 se realizó una detección selectiva de insertos en las colonias bacterianas. El ADN del plásmido se purificó mediante transfección en células de mamíferos usando un kit QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen). El constructo obtenido se designó pMG125.3 (APPSW-KK, SEC ID Nº 17 [de nucleótidos] y SEC ID Nº 18 [de aminoácidos]).

Transfección en células de mamífero

Las células HEK293 para transfección se cultivaron hasta una confluencia del 80% en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal. Las co-transfecciones se realizaron usando LipofectAmine (Gibco-BRL) con 3 \mug de pMG 125.3 ADN y 9 \mug de ADN de pcDNA3.1 por 10 x 10^{6} células. A los tres días de la transfección, las células se pasaron a medio que contenía G418 a una concentración de 400 \mug/ml. Tras tres días de crecimiento en medio selectivo, las células se clasificaron según su fluorescencia.

Selección clonal de células 125.3 mediante FACS: Las muestras celulares se analizaron en un citómetro de flujo EPICS Elite ESP (Coulter, Hialeah, FL) equipado con una línea de excitación de 488 nm mediante un láser de argón enfriado con aire. La emisión de EGFP se midió a través de un filtro de paso de banda de 525 nm y la intensidad de la fluorescencia se mostró en una escala log de 4 décadas tras localizar las células viables determinadas mediante dispersión de la luz en ángulo directo y derecho. Las células aisladas de color verde se separaron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenía medio de cultivo sin G418. Después de un periodo de recuperación de 4 días se añadió G418 al medio hasta una concentración final de 400 \mug/ml. Tras la selección, el 32% de los pocillos contenían clones en expansión. Los pocillos con los clones se expandieron de la placa de 96 pocillos a una placa de 24 pocillos y después a una placa de 6 pocillos en las que se escogieron las colonias de crecimiento más rápido para su expansión en cada pase. La línea celular final seleccionada fue la de crecimiento más rápido de las últimas seis pasadas. Este clon, designado 125.3, se ha mantenido en G418 a 400 \mug/ml con pases cada cuatro días en medio fresco. En 23 pases no se ha observado pérdida de producción de \betaA de fluorescencia EGFP.

Análisis EIA de \betaA (ELISA de tipo Sándwich con doble anticuerpo para h\betaA -1-40/42)

Los sobrenadantes de los cultivos celulares recogidos 48 horas después de la transfección se analizaron en un EIA de \betaA estándar del siguiente modo. El péptido \betaA humano 1-40 o 1-42 se midió usando el anticuerpo monoclonal (AcMo) 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) y anticuerpo de conejo biotinilado 162 o 164 (New York State Institute for Basic Research, Staten Island, NY) en un ELISA de tipo sándwich con doble anticuerpo. El anticuerpo de captura 6E10 es específico de un epítopo presente en los residuos de aminoácidos del extremo N 1-16 del \betaAh. Los anticuerpos conjugados de detección 162 y 164 son específicos de \betaAh 1-40 y 1-42, respectivamente. Brevemente, una inmunoplaca de 96 pocillos Nunc Maxisorp se revistió con 100 \mul/pocillo del AcMo 6E10 (5 \mug/ml) diluido en tampón carbonato-bicarbonato 0,1M, a pH 9,6, y se incubó a 4ºC durante la noche. Después de lavar la placa 3 veces con DPBS 0,01M (solución salina tamponada con fosfato modificada con Dulbecco (fosfato sódico 0,008M, fosfato potásico 0,002M, cloruro sódico 0,14M, cloruro potásico 0,01M, pH 7,4) de Pierce, Rockford, II) que contenía 0,05% de Tween-20 (DPBST), la placa se bloqueó durante 60 minutos con 200 \mul de 10% de suero de oveja normal (Sigma) en DPBS para evitar la unión inespecífica. Después de lavar la placa se añadieron patrones de \betaA humano 1-40 o 1-42 a 100 \mul/pocillo (Bachem, Torrance, CA) diluidos de una solución madre de 1 mg/ml en DMSO, en medio de cultivo, así como 100 \mul/pocillo de la muestra, por ejemplo medio acondicionado de células transfectadas. La placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y 4ºC durante la noche. Al día siguiente, después de lavar la placa se añadieron 100 \mul/pocillo de antisuero de conejo biotinilado 162 a 1:400 o 164 a 1:50 diluido en DPBST + 0,5% de BSA y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora 15 minutos. Después de los lavados, se aplicaron 100 \mul/pocillo de neutravidina-peroxidasa de rábano (Pierce, Rockford, II) diluida 1:10.000 en DPBST y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los últimos lavados se añadieron como sustrato 100 \mul/pocillo de clorhidrato de o-fenilendiamina (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en tampón de ácido cítrico 50 mM/fosfato sódico 100 mM (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) a pH 5,0 y se controló el desarrollo de color a 450 nm en un lector de cinética de microplacas durante 20 minutos usando software Soft max Pro. Todos los patrones y las muestras se realizaron por triplicado. Las muestras con valores de absorbancia dentro de la curva estándar se extrapolaron de las curvas estándar usando software Soft max Pro y se expresaron en pg/ml de medio de
cultivo.

Resultados

La adición de dos residuos de lisina en los extremos carboxilo de APP695 incrementa en gran medida el procesamiento del \betaA en las células HEK293 como muestra la expresión transitoria (Tabla 1). La adición a APP695 del motivo di-lisina incrementa el procesamiento de \betaA al observado con la APP695 que contenía la mutación Swedish. La combinación del motivo de di-lisina con la mutación Swedish multiplica más el procesamiento por 2,8.

La co-transformación de las células HEK293 con pMG125.3 y pcDNA3.1 permitió la selección doble de células transformadas con resistencia a G418 y un nivel elevado de expresión de EGFP. Tras la selección clonal mediante FACS, la línea celular obtenida produce n notable péptido \betaA de 20.000 pg por ml de medio de cultivo tras su crecimiento durante 36 horas en placas de 24 pocillos. La producción del péptido \betaA en varias condiciones de crecimiento se resume en la Tabla 2.

TABLA 1 Liberación del péptido \betaA al medio de cultivo 48 horas después de la transfección transitoria de las células HEK293 con los vectores indicados que contienen la PPA natural o modificada. Los valores tabulados son la media + SD y el valor P para la comparación pareada usando la t de Student suponiendo varianzas desiguales

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TABLA 2 Liberación de péptido \betaA de las células HEK125.3 en varias condiciones de crecimiento

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Ejemplo 7 Inhibición con el oligómero antisentido del procesamiento del péptido Abeta en células HEK125.3

Las secuencias de Hu-Asp1 y Hu-Asp2 se proporcionaron a Sequitur, Inc (Natick, MA) para la selección de secuencias objetivo y el diseño de oligómeros antisentido quiméricos de 2ª generación usando tecnología patentada (Sequitur Ver. D patente pendiente nº 3002). Los lotes nº S644, S645, S646 and S647 de los oligómeros antisentido se dirigieron contra Asp1. Los lotes nº S648, S649, S650 y S651 de los oligómeros antisentido se dirigieron contra Asp2. Los lotes nº S652, S653, S655 y S674 de los oligómeros antisentido control se dirigieron contra un gen irrelevante y los lotes nº S656, S657, S658 y S659 se dirigieron contra un segundo gen irrelevante.

Para la transfección con los oligómeros antisentido, se cultivaron las células HEK125.3 hasta una confluencia de aproximadamente el 50% en placas de 6 pocillos en medio mínimo esencial (MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal. Una solución madre de oligofectina G (Sequitur Inc., Natick, MA) a 2 mg/ml se diluyó hasta 50 \mug/ml en MEM sin suero. Por separado, la solución madre del oligómero antisentido a 100 \muM se diluyó hasta 800 nM en Opti-MEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY). Las soluciones madre diluidas de oligofectina G y el oligómero antisentido se mezclaron a una proporción de 1:1 y se incubaron a temperatura ambiente. Tras una incubación de 15 minutos el reactivo se diluyó 10 veces en MEM que contenía 10% de suero bovino fetal y se añadieron 2 ml a cada pocillo de la placa de 6 pocillos después de eliminar primero el medio viejo. Después de la transfección, las células se cultivaron en presencia continua del oligómero antisentido/oligofectina G. Para controlar la liberación del péptido Ab, periódicamente se eliminaron 400 \mul de medio acondicionado del pocillo del cultivo y se sustituyeron con medio fresco comenzando 24 horas después de la transfección. Los datos indicados son de los sobrenadantes del cultivo recogidos 48 horas después de la transfección.

Resultados

Los 16 oligómeros antisentido diferentes obtenidos de Sequitur Inc se transfeccionaron por separado en células HEK 125.3 para determinar su efecto sobre el procesamiento del péptido \betaA. Sólo los oligómeros antisentido dirigidos contra Asp1 & Asp2 redujeron el procesamiento Abeta por las células HEK125.3, mientras que los dirigidos contra Asp2 tenían un efecto inhibidor mayor. Tanto \betaA (1-40) como \betaA (1-42) sufrieron un mismo grado de inhibición. En la tabla 3 se calcula el porcentaje de inhibición con respecto a las células no transfectadas. Los reactivos de oligómeros antisentido que proporcionan una inhibición superior al 50% se han marcado con un asterisco. De los reactivos analizados, 3 de 4 oligómeros antisentido dirigidos contra ASP1 dieron una inhibición media del 52% del procesamiento de \betaA 1-40 y una inhibición del 47% del procesamiento de \betaA 1-42. Para ASP2, 4 de 4 oligómeros antisentido dieron una inhibición superior al 50% con una inhibición media del 62% para el procesamiento de \betaA 1-40 y del 60% para el procesamiento de \betaA 1-42.

TABLA 3 Inhibición de la liberación de péptido \betaA de células HEK125.3 tratadas con oligómeros antisentido

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Ejemplo 8 Demostración de la actividad \beta-secretasa de Hu-Asp2 en células cultivadas

Se ha demostrado que varias mutaciones en la PPA asociadas con la enfermedad de Alzheimer de inicio precoz alteran el procesamiento del péptido \betaA. Estos flanquean los sitios de escisión en los extremos N y C que liberan el péptido \betaA de la PPA. Estos sitios de escisión se denominan sitios de escisión de la \beta-secretasa y la \gamma-secretasa, respectivamente. La escisión de la PPA en el sitio de la \beta-secretasa crea un fragmento en el extremo C de la PPA que contiene 99 aminoácidos de 11.145 daltons de peso molecular. La mutación Swedish KM\rightarrowNL justo en dirección 5' del sitio de escisión de la \beta-secretasa produce un incremento general en la producción de ambas formas de 1-40 y 1-42
aminoácidos del péptido \betaA. La mutación London VF (V717\rightarrowF en la isoforma APP770) tiene poco efecto sobre la producción total del péptido \betaA, pero parece que preferentemente incrementa el porcentaje de la forma más larga de 1-42 aminoácidos del péptido \betaA afectando a la elección del sitio de escisión de la \gamma-secretasa usado durante el procesamiento de la PPA. Por tanto, los inventores buscan determinar si estas mutaciones alteraban la cantidad y el tipo de péptido \betaA producido por las células cultivadas co-transfectadas con un constructo que dirige la expresión de Hu-Asp2.

Se realizaron dos experimentos que demuestran la actividad de \beta-secretasa de Hu-Asp2 en las células cultivadas. En el primer experimento se descubrió que el tratamiento de las células HEK125.3 con oligómeros antisentido dirigidos contra los transcritos de Hu-Asp2 como se describe en el Ejemplo 7 disminuía la cantidad del fragmento del extremo C de la PPA creado mediante la escisión de la \beta-secretasa (CTF99) (Figura 9). Esto muestra que Hu-Asp2 actúa directamente o indirectamente facilitando la escisión por la \beta-secretasa. En el segundo experimento, se muestra que la mayor expresión de Hu-Asp2 en células Neuro2A de ratón transfectadas aumenta la acumulación del fragmento de escisión por la \beta-secretasa CTF99 (Figura 10). Este incremento se observa con mayor facilidad cuando para la transfección se usa un clon mutante APP-KK que contiene un motivo de di-lisina en el extremo C. Se observa otro incremento cuando Hi-Asp2 se co-transfecciona con APP-Sw-KK que contiene la mutación Swedish KM\rightarrowNL. Se sabe que la mutación Swedish incrementa la escisión de la PPA por la \beta-secretasa.

Un segundo grupo de experimentos demuestra que Hu-Asp2 facilita la actividad de la \gamma-secretasa en experimentos de co-transfección con células renales embrionarias humanas HEK293. La co-transfección de Hu-Asp2 con un clon de APP-KK incrementa enormemente la producción y liberación de los péptidos \betaA 1-40 y \betaA 1-42 solubles de las células HEK293. Existe un incremento proporcionadamente mayor de la liberación de \betaA 1-42. Otro incremento en la producción de \betaA 1-42 se observa cuando Hu-Asp2 se co-transfecciona con APP-VF (SEC ID Nº 13 [de nucleótidos] y SEC ID Nº 14 [de aminoácidos]) o con los clones APP-VF-KK SEC ID Nº 19 [de nucleótidos] y SEC ID Nº 20 [de aminoácidos]) que contienen la mutación London V717\rightarrowF. Se sabe que la mutación V717\rightarrowF altera la especificidad de escisión de la PPA por la \gamma-secretasa de modo que se incrementa la preferencia por la escisión en el sitio \betaA42. Por tanto, la Asp2 actúa directa o indirectamente facilitando el procesamiento por la \gamma-secretasa de la PPA en el sitio de escisión \beta42.

Materiales

Los anticuerpos 6E10 y 4G8 se adquirieron en Senetek (St. Louis, MO). El anticuerpo 369 se obtuvo del laboratorio de Paul Greengard en la Rockefeller University. El anticuerpo C8 se obtuvo del laboratorio de Dennos Selkoe en la Harvard Medical School y el Brigham and Women's Hospital.

Constructos de la PPA usados

Los constructos de la PPA usados para los experimentos de transfección comprendían los siguientes

APP APP695 natural (SEC ID Nº 9 y Nº 10)

APP-Sw APP695 que contiene la mutación Swedish KM\rightarrowNL (SEC ID Nº 11 y Nº 12),

APP-VF APP695 que contiene la mutación London V\rightarrowF (SEC ID Nº 13 y Nº 14)

APP-KK APP695 que contiene un motivo KK en el extremo C (SEC ID Nº 15 y Nº 16),

APP-Sw-KK APP695-Sw que contiene un motivo KK en el extremo C (SEC ID Nº 17 y Nº 18),

APP-VF-KK APP695-VF que contiene un motivo KK en el extremo C (SEC ID Nº 19 y Nº 20).

Estos se insertaron en el vector pIRES-EGFP (Clontech, Palo Alto CA) entre los sitios Not1 y BstX1 usando las secuencias de unión adecuadas introducidas por PCR.

Transfección de oligómeros antisentido o constructos de ADN plasmídico en células HEK293, células HEK125.3 y células Neuro2A

Células renales embrionarias humanas HEK293 y células Neuro-2a de ratón se transfeccionaron con constructos de expresión usando el reactivo Lipofectamina Plus de Gibco/BRL. Las células se sembraron en placas de cultivo tisular de 24 pocillos hasta obtener una densidad de 70-80% de confluencia. Cuatro pocillos por placa se transfeccionaron con 2 \mug de ADN (3:1, APP:co-transfectante), 8 \mul de reactivo Plus y 4 \mul de lipofectamina en OptiMEM. Se añadió OptiMEM hasta un volumen total de 1ml, se distribuyeron 200 \mul por pocillo y se incubaron 3 horas. Se tomaron precauciones para mantener constantes las proporciones de los dos plásmidos usados para la co-transfección, así como la cantidad total de ADN usada en la transfección. El medio de transfección se sustituyó con DMEM, 10% de FBS, piruvato Na con antibiótico/antimicótico y las células se incubaron en condiciones normales (37º, 5% de CO_{2}) durante 48 horas. Los medios acondicionados se pasaron a tubos de polipropileno y se almacenaron a -80ºC hasta el análisis del contenido de \betaA1-40 y \betaA1-42 mediante EIA tal y como se ha descrito en los ejemplos precedentes. La transfección de los oligómeros antisentido en células HEK125.3 se realizó como se ha descrito en el ejemplo 7.

Preparación de extractos celulares, protocolo de transferencia de tipo Western

Las células se recogieron después de transfeccionarse con el ADN plasmídico durante aproximadamente 60 horas. Primero, las células se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml desde la placa y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos para eliminar el medio. Los sedimentos celulares se lavaron con PBS una vez. A continuación, los inventores lisaron las células con tampón de lisis (HEPES 10 mM, pH 7,9, NaCl 150 mM, 10% de glicerol, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, vanadato sódico 0,1 mM y 1% de NP-40). Las mezclas de células lisadas se centrifugaron a 5000 rpm y el sobrenadante se almacenó a -20ºC como los extractos celulares. Cantidades iguales de extractos de células HEK125.3 transfectadas con los oligómeros antisentido de Asp2 y controles se precipitaron con el anticuerpo 369 que reconoce el extremo C de la PPA y, después, se detectó CTF99 en el inmunoprecipitado con el anticuerpo 6E10. El experimento se repitió usando C8, un segundo anticuerpo de precipitación que también reconoce el extremo C de la PPA. Para la transferencia de tipo Western de los extractos de células Neuro-2a de ratón con Hu-Asp2 y APP-KK, APP-Sw-KK, APP-VF-KK o APP-VF, cantidades iguales de los extractos celulares se sometieron a electroforesis a través de geles de gradiente Tricina 4-10% o 10-20% (NOVEX, San Diego, CA). La PPA de longitud completa y el producto CTF99 de la \beta-secretasa se detectaron con el anticuerpo 6E10.

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Resultados

La transfección de células HEK125.3 con oligómeros antisentido de Asp2 o Asp2-2 reduce la producción del producto CTF de la \beta-secretasa en comparación con células transfectadas de forma similar con los oligómeros control que tienen la secuencia inversa (Asp2-1 inversa y Asp2-2 inversa). En experimentos de co-transfección, la con-transfección de Hu-Asp2 en células Neuro-2a de ratón con el constructo APP-KK incrementó la formación de CTF99. Esto se incrementó más si la Hu-Asp2 se co-expresó con APP-Sw-KK, una forma mutante de la PPA que contiene la mutación Swedish KM\rightarrowNL que incrementa el procesamiento de la \beta-secretasa.

La co-transfección de Hu-Asp2 con PAA tiene poco efecto sobre la producción del \betaA40, pero aumenta la producción de \betaA42 por encima del nivel basal (Tabla 4). La adición del motivo de di-lisina al extremo C de la PPA multiplica el procesamiento del péptido \betaA aproximadamente por dos, aunque la producción de \betaA40 y de \betaA42 sigue siendo bastante baja (352 pg/ml y 21 pg7ml, respectivamente). La co-transfección de Asp2 con APP-KK incrementa más la producción tanto de \betaA40 como de \betaA42. La estimulación de la producción de \betaA40 por Hu-Asp2 es superior a 3 veces mayor, mientras que la producción de \betaA42 se multiplica por más de 10. Por tanto, la co-transfección de Hu-Asp2 y los constructos de APP-KK aumentan preferentemente la producción de \betaA42.

Se ha demostrado que la mutación de APP V717\rightarrowF incrementa el procesamiento de la \gamma-secretasa en el sitio de escisión de \betaA42. La co-transfección de Hu-Asp2 con los constructos APP-VF o APP-VF-KK aumentó la producción de \betaA42 (una multiplicación por dos con APP-VF y una multiplicación por cuatro con AP-VF-KK, Tabla 4), pero tuvo efectos mixtos sobre la producción de \betaA49 (una ligera disminución con APP-VF y una multiplicación por dos con APP-VF-KK en comparación con el control de co-transfección pcDNA. Por tanto, el efecto de Asp2 sobre la producción de \betaA42 fue proporcionadamente mayor, lo que conduce a un incremento en la proporción de \betaA42/\betaA total. De hecho, la proporción de \betaA42/\betaA total alcanza un valor muy elevado de 42% en células HEK293 co-transfectadas con Hu-Asp2 y APP-VF-KK.

La transferencia tipo Western muestra la reducción de la producción de CTF99 por las células HEK125.3 transfectadas con los oligómeros antisentido dirigidos al ARNm DE Hu-Asp2. (derecha) La transferencia tipo Western muestra el incremento de la producción de CTF99 por las células Neuro-2a de ratón co-transfectadas con Hu-Asp2 y APP-KK. Otro incremento en la producción de CTF99 se observa en células co-transfectadas con Hu-Asp2 y APP-Sw-KK.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Resultados de la co-transfección de Hu-ASP2 o ADN del plásmido pcDNA con varios constructos de PPA que contienen la mutación V717\rightarrowF que modifica el procesamiento de la \gamma-secretasa. La co-transfección con Asp2 incrementa de forma constante la proporción de \betaA42/\betaA total. Los valores tabulados son péptido \betaA en pg/ml

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Ejemplo 9 Expresión bacteriana de Asp2L humano Expresión de Hu-Asp2L recombinante en E. coli

Hu-Asp2L se puede expresar en E. coli tras la adición de secuencias en el extremo N tales como un marcador T7 (SEC ID Nº 21 y Nº 22) o un marcador T7 seguido por una secuencia líder de la caspasa 8 (SEC ID Nº 23 y Nº 24). Como alternativa, se puede usar la reducción del contenido en GC de la secuencia 5' mediante mutagénesis dirigida a sitio para incrementar el rendimiento de Hu-Asp2 (SEC ID Nº 27 y Nº 28). Además, la Asp2 se puede someter a ingeniería en un sitio de escisión proteolítica (SEC ID Nº 27 Y Nº 28). Para producir una proteína soluble tras la expresión y después de volver a plegarse se prefiere la deleción del dominio transmembrana y de la cola citoplasmática o la deleción de la región proximal a la membrana, del domino transmembrana y de la cola citoplasmática.

Procedimientos

Para ensamblar las fusiones de la secuencia codificadora de Asp2 con las modificaciones de la secuencia en el extremo N, incluido un marcador T7 (SEC ID Nº 21 y Nº 22) o T7-una secuencia líder de caspasa 8 (SEC ID Nº 23 y 24) se usó PCR con cebadores que contienen las secuencias de unión adecuadas. Estos constructos se clonaron en el vector de expresión pet23a(+) [Novagen], en el que un promotor T7 dirige la expresión de un marcador T7 que precede a una secuencia de múltiples sitios de clonación. Para clonar las secuencias de Hu-Asp2 detrás de la secuencie líder de T7 de pet23a+, se usaron los oligonucleótidos siguientes para la amplificación de la secuencia de Hu-Asp2 seleccionada:

nº553=GTGGATCCACCCAGCACGGCATCCGGCTG (SEC ID Nº 35), nº554=GAAAGCTTTCATGACTCATC
TGTCTGTGGAATGTTG (SEC ID Nº 36) que introdujo los sitios BamHI y HindIII flanqueando los extremos 5' y 3' del inserto, respectivamente. La secuencia de Asp2 se amplificó a partir del ADNc de Asp2(b) de longitud completa clonado en pcDNA3.1 usando la Advantage-GC cDNA PCR [Clontech] siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante usando hibridación y extensión a 68ºC en un ciclo de PCR de dos etapas durante 25 ciclos. El inserto y el vector se cortaron con BamHI and HindIII, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se ligaron usando el kit Rapid DNA Ligation [Boerhinger Mannheim]. La reacción de unión se usó para transformar la cepa de E. coli JM109 (Promega) y se escogieron las colonias para la purificación del plásmido (Qiagen, Qiaprep minispin) y el análisis de la secuencia del ADN. Para la expresión inducible usando inducción con isopropil b-D-tiogalactopiranósido (IPTG), el vector de expresión se transfirió a la cepa de E. coli BL21 (Stratagene). Los cultivos bacterianos se cultivaron en caldo LB en presencia de ampicilina a 100 \mug/ml y se indujo el crecimiento en fase log a una DO600 de 0,6-1,0 con IPTG 1 mM durante 4 horas a 37ºC. El sedimento celular se recogió mediante centrifugación.

Para clonar las secuencias de Hu-Asp2 detrás del marcador T7 y la secuencia líder de caspasa (SEC ID Nº 23 Y 24), el constructo creado anteriormente que contenía la secuencia de T7-Hu-Asp2 (SEC ID Nº 21 y 22) se abrió en el sitio BamH1 y, a continuación, los oligonucleótidos de la secuencia líder de caspasa 8 fosforilada, nº 559=GATCGATGAC
TATCTCTGACTCTCCGCGTGAACAGGACG (SEC ID Nº 37), nº 560=GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGT
CAGAGATAGTCATC (SEC ID Nº 38) se hibridaron y unieron en el ADN del vector. La parte sobresaliente en 5' para cada grupo de oligonucleótidos se diseñó de un modo tal que permitió la unión en el sitio BamHI, pero no la posterior digestión con BamHI. La reacción de unión se transformó en JM109 como antes para el análisis de la expresión proteica tras la transferencia a la cepa de E. coli BL21.

Con el fin de reducir el contenido en GC del extremo 5' de Asp2 se diseñó un par de oligos antiparalelos para cambiar las bases de los codones degenerados en 15 posiciones de aminoácidos de G/C a A/T (SEC ID Nº 25 y 26). La nueva secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de asp2 no cambió el aminoácido codificado y se escogió para optimizar la expresión de E. coli. La secuencia del engarce sentido es 5' CGGCATCCGGCTGCCCCTGCG
TAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCG TCTGCCCCGGGAGACCGACGAA G 3' (SEC ID Nº 39) La secuencia del engarce antisentido es: 5' CTTCGTCGGTCTCCCGGGGCAGACGCAGACCCAGTGGAGCAC
CACCCAGACCG CTACGCAGGGGCAGCCGGATGCCG 3' (SEC ID Nº 40). Tras la hibridación de los engarcees fosforilados juntos en NaCl 0,1M-Tris 10 mM, pH 7,4, se ligaron en sitios únicos Cla I y Sma I en Hu-Asp2 en el vector pTAC. Para la expresión inducible usando inducción con isopropil b-D-tiogalactopiranósido (IPTG), Los cultivos bacterianos se cultivaron en caldo LB en presencia de ampicilina a 100 \mug/ml y se indujo el crecimiento en fase log a una DO600 de 0,6-1,0 con IPTG 1 mM durante 4 horas a 37ºC. El sedimento celular se recogió mediante centrifugación.

Para crear un vector en el que las secuencias líder se puedan eliminar mediante proteolisis limitada con caspasa 8 de modo que éste libere un polipéptido de Hu-Asp2 que comience con la secuencia del extremo N GSFV (SEC ID Nº 27 Y 28), se siguió el siguiente procedimiento. Dos oligonucleótidos fosforilados que contienen el sitio de escisión de la caspasa 8 IETD, nº 571=5' GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATC
GAAACCGACG (SEC ID Nº 41) y nº 572= GATCCGTCGGTTTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGA
GATAGTCATC (SEC ID Nº 42) se hibridaron y ligaron en pET23a+ que se había abierto con BamHI. Tras la transformación en JM109, se recuperó el ADN del vector purificado y se confirmó la orientación del inserto mediante análisis de la secuencia de ADN. +, los siguientes oligonucleótidos se usaron para la amplificación de la secuencia de Hu-Asp2 seleccionada: nº553=5'AAGGATCCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTG (SEC ID Nº 43), nº554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (SEC ID Nº 44) que introdujo los sitios BamHI y HindIII flanqueando los extremos 5' y 3' del inserto, respectivamente. La secuencia de Asp2 se amplificó a partir del ADNc de Asp2 de longitud completa clonado en pcDNA3.1 usando la Advantage-GC cDNA PCR [Clontech] siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante usando hibridación y extensión a 68ºC en un ciclo de PCR de dos etapas durante 25 ciclos. El inserto y el vector se cortaron con BamHI and HindIII, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se ligaron usando el kit Rapid DNA Ligation [Boerhinger Mannheim]. La reacción de unión se usó para transformar la cepa de E. coli JM109 [Promega] y se escogieron las colonias para la purificación del plásmido (Qiagen, Qiaprep minispin) y el análisis de la secuencia del ADN. Para la expresión inducible usando inducción con isopropil b-D-tiogalactopiranósido (IPTG), el vector de expresión se transfirió a la cepa de E. coli BL21 (Stratagene). Los cultivos bacterianos se cultivaron en caldo LB en presencia de ampicilina a 100 \mug/ml y se indujo el crecimiento en fase log a una DO600 de 0,6-1,0 con IPTG 1 mM durante 4 horas a 37ºC. El sedimento celular se recogió mediante centrifugación.

Para ayudar a la purificación, se puede introducir un marcador 6-His en cualquiera de los constructos anteriores, siguiendo la líder T7 abriendo el constructo en el sitio BahHI y, después, logando en los oligonucleótidos hibridados, fosforilados que contienen la secuencia de seis histidinas nº 565=GATCGCATCATCACCATCACCATG (SEC ID Nº 45), nº 566=GATCCATGGTGATGGTGATGATGC (SEC ID Nº 46 ). La parte sobresaliente en 5' para cada grupo de oligonucleótidos se diseñó de un modo tal que permitió la unión en el sitio BamHI, pero no la posterior digestión con BamHI.

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Preparación del sedimento bacteriano

Del sedimento bacteriano, 36,34 g que representan 10,8 l de crecimiento se dispersó en un volumen total de 200 ml usando una sonda de homogeneizador tisular de 20 mm a 3000 a 5000 rpm en Kcl 2M, Tris 0,1M, EDTA 0,05M, DTT 1 mM. La conductividad se ajustó hasta aproximadamente 192 mMhos con agua.

Una vez dispersado el sedimento se añadió una cantidad adicional de la solución de KCl, y se llevó hasta el volumen total de 500 ml. Esta suspensión se homogeneizó más durante aproximadamente 3 minutos a 5000 rpm usando la misma sonda. La mezcla se pasó después a través de un homogeneizador de presión elevada de Rannie a 68947 kPa.

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En todos los casos, el material precipitado se siguió usando, mientras que se desechó la fracción soluble. La solución resultante se centrifugó en un rotor GSA durante 1 hora a 12.500 rpm. El sedimento se resuspendió en la misma solución (sin el DTT) usando la misma sonda homogeneizadora de tejido a 2.000 rpm. Después de homogeneizar durante 5 minutos a 3000 rpm, el volumen se ajustó hasta 500 ml con la misma solución y se agitó durante 1 hora a 12.500 rpm. A continuación, el sedimento se resuspendió como antes, pero esta vez el volumen final se ajustó hasta 1,5 ml con la misma solución, antes de homogeneizar durante 5 minutos. Después de centrifugar a la misma velocidad durante 30 minutos, se repitió este procedimiento. Después, el sedimento se resuspendió en aproximadamente 150 ml de agua fría y se combinaron los sedimentos obtenidos de los seis tubos de centrífuga usadnos en el rotor GSA. El sedimento se ha homogeneizado durante 5 minutos a 3.000 rpm, el volumen se ha ajustado hasta 250 ml con agua fría, después se ha agitado durante 30 minutos. El peso del sedimento resultante fue de 17,75 g.

Resumen: Para preparar inicialmente el sedimento se usó lisis del sedimento bacteriano en solución de KCl, seguida por centrifugación en rotor GSA. A continuación se usó la misma solución tres veces más para resuspensión/homogeneización. Después se realizó un lavado con agua/homogeneización final para eliminar el exceso de KCl y EDTA.

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Solubilización de rHuAsp2L

Para solubilizar la ruHuAsp2L del sedimento previamente descrito se utilizó una proporción de 9-10 ml/gramo de sedimento. Se descongelaron 17,75 g y se añadieron 150 ml de guanidina HCl 8M, \betaME 5 Mm, 0,1% de DEA. Para titular el pH hasta 8,6 se usó Tris 3M. El sedimento se resuspendió inicialmente en la solución de guanidina usando una sonda homogeneizadora de tejido de 20 mm a 1000 rpm. A continuación, la mezcla se agitó a 4ºC durante 1 hora antes de la centrifugación a 12.5000 rpm durante 1 hora en rotor GSA. El sobrenadante resultante se centrifugó después durante 30 minutos a 40.000 x g en un rotor SS-34. Después, el sobrenadante final se almacenó a -20ºC, a excepción de 50 ml.

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Cromatografía de afinidad por níquel inmovilizado de rHuAsp2L

Se utilizaron las soluciones siguientes:

A): Guanidina HCl 6M, NaP 0,1M, pH 8,00, Tris 0,01M, \betaME 5 mM, imidazol 0,5 mM

A'): Urea 6M, NaP 20 mM, pH 6,80, NaCl 50 mM

B'): Urea 6M, NaP 20 mM, pH 6,20, NaCl 50 mM, imidazol 12 mM

C'): Urea 6M, NaP 20 mM, pH 6,80, NaCl 50 mM, imidazol 300 mM

Nota: Los tampones A' y C' se mezclaron a las proporciones adecuadas para dar las concentraciones intermedias de imidazol.

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Los 50 ml de material solubilizado se combinaron con 50 ml de tampón A antes de añadirlos a 100-125 ml de Qiagen Ni-NTA SuperFlow (pre-equilibrado con tampón A) en una columna Bio-Rad econo column de 5 x 10 cm. Esto se agitó suavemente durante la noche a 4ºC en el cuarto frío.

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Etapas de cromatografía

1): Drenaje del flujo continuo resultante.

2): Lavado con 50 ml de tampón A (con recogida en la fracción de flujo continuo)

3): Lavado con 250 ml de tampón A (lavado 1)

4): Lavado con 250 ml de tampón A (lavado 2)

5): Lavado con 250 ml de tampón A'

6): Lavado con 250 ml de tampón B'

7): Lavado con 250 ml de tampón A'

8): Elución con 250 ml de imidazol 75 mM

9): Elución con 250 ml de imidazol 150 mM (150-1)

10): Elución con 250 ml de imidazol 150 mM (150-2)

11): Elución con 250 ml de imidazol 300 mM (300-1)

12): Elución con 250 ml de imidazol 300 mM (300-2)

13): Elución con 250 ml de imidazol 300 mM (300-3)

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Resultados de la cromatografía

La rHuAsp eluyó a imidazol 75 mM hasta imidazol 300 mM. La fracción de 75 mM, así como la primera fracción de imidazol 150 mM (150-1) contenía proteínas contaminantes que se visualizan en geles teñidos con azul coomassie. Por tanto, dado que contienen la mayor cantidad de proteína (véase el gel teñido con azul de coomassie), para los experimentos de replegamiento se usarán las fracciones 150-2 y 300-1.

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Experimentos de replegamiento de rHuAsp2

Experimento 1

Se añadió a cuarenta ml de la fracción 150-2 DTT 1M, Tris 3M, pH 7,4 y DEA hasta una concentración final de 6 mM, 50 mM y 0,1% respectivamente. Esto se diluyó bruscamente (mientras se estaba agitando) con 200 ml de NaP 20 mM frío (4ºC), a pH 6,8, NaCl 150 mM. Esta dilución dio una concentración final de urea de 1M. Esta solución permaneció transparente, aun cuando se dejó reposar abierta a temperatura ambiente o a 4ºC.

Después de dejarla abierta al aire durante 4-5 horas a 4ºC, esta solución se dializó después durante la noche contra NaP 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 20% de glicerol. Este procedimiento elimina con eficacia la urea en la solución sin precipitación de la proteína.

Experimento 2

Parte del eluido 150-2 se concentró 2 veces en Amicon Centriprep, COPM 10.000, después se trató como en el Experimento 1. Este material también permaneció en solución sin precipitación visible.

Experimento 3

Se añadió a 89 ml del eluido 150-2 DTT 1M, Tris 3M, pH 7,4 y DEA hasta una concentración final de 6 mM, 50 mM y 0,1% respectivamente. Esto se diluyó bruscamente (mientras se estaba agitando) con 445 ml de NaP 20 mM frío (4ºC), a pH 6,8, NaCl 150 mM. Esta solución parecía transparente, sin aparente precipitación. La solución se pasó a temperatura ambiente y se agitó durante 10 minutos antes de añadir MEA hasta una concentración final de 0,1 mM. Esto se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Después se añadieron cistamina y CuSO_{4} hasta unas concentraciones finales de 1 mM y 10 \muM, respectivamente. La solución se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de pasarla al cuarto frío a 4ºC y de agitar lentamente durante la noche, expuesta al aire.

Al día siguiente, la solución (todavía transparente, sin precipitación aparente) se centrifugó a 100.000 g durante 1 hora. Se combinaron los sobrenadantes de múltiples ciclos y la mayor parte de la proteína estabilizada se dializó contra NaP 200 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 20% de glicerol. Después de la diálisis, el material se almacenó a -20ºC.

Parte (aproximadamente 10 ml) de la solución proteica (todavía en urea 1M) se reservó para análisis bioquímicos y se congeló a -20ºC para almacenamiento.

Ejemplo 10 Expresión de Hu-Asp2 y derivados en células de insecto

Expresión por infección por baculovirus. La secuencia codificadora de Hu-Asp2 y varios derivados se sometieron a ingeniería para su expresión en células de insecto usando la PCR. Para la secuencia de longitud completa, un cebador oligonucleotídico 5' sentido que modificaba el sitio de iniciación de la traducción para encajar con la secuencia consenso Kozak se emparejó con un cebador 3'-antisentido que contenía el codón natural de terminación de la traducción en la secuencia de Hu-Asp2. Amplificación por PCR del molde pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2 (véase el Ejemplo 12). Usando PCR también se sometió a ingeniería dos derivados de Hu-Asp2 en los que se eliminó el dominio transmembrana del extremo C (SEC ID Nº 29 y Nº 30) o el dominio transmembrana y se introdujo un marcador hexa-histidina en el extremo C (SEC ID Nº 31 y Nº 32). El mismo cebador oligonucleotídico 5'-sentido descrito en lo que antecede se emparejó con un cebador 3'-antisentido que (1) introdujo un codón de terminación de la traducción tras el codón 453 (SEC ID Nº 3) o (2) incorporó un marcador hexa-histidina seguido por un codón de terminación de la traducción en la PCR usando pcDNA3.1 (hygro)/Hu-Asp-2L como molde. En todos los casos, las reacciones de PCR se realizaron amplificadas durante 15 ciclos usando ADN polimerasa Pwol (Boehringer-Mannheim) de acuerdo con el suministrador. Los productos de la reacción se digirieron hasta completarla con BamHI y NotI y se ligaron en el vector de transferencia de baculovirus digerido con BamHI y NotI pVL1393 (Invitrogen). Una porción de las uniones se usó para transformar las células de E. coli DH5\alpha competentes, seguido por selección con antibiótico en LB-Amp. El ADN plasmídico se preparó mediante lisis alcalina estándar y formación de bandas en CsCl para dar los vectores de transferencia de baculovirus pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2DTM y pVL1393/Asp2DTM(His)_{6}. La creación de baculovirus recombinantes y la infección de células de insecto sf9 se realizó usando procedimientos estándar.

Expresión mediante transfección- La expresión transitoria y estable de Hu-Asp2\DeltaTM y Hu-Asp2\DeltaTM(His)_{6} en células de insecto High 5 se realizó usando el vector de expresión en insectos pIZ/V5-His. Los insertos de ADN de los vectores plasmídicos de expresión pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2DTM y pVL1393/Asp2DTM(His)_{6} se escindieron mediante digestión doble con BamHI y NotI y se subclonaron en pIZ/V5-His digerido con BamHI y NotI usando procedimientos convencionales. Los plásmidos de expresión resultantes, denominados pIZ/Hu-Asp2DM and pIZ/Hu-Asp2DTM(His)_{6}, se prepararon tal y como se ha descrito en lo que antecede.

Para la transfección, las células de insecto High 5 se cultivaron en medio sin suero High Five suplementado con 10 \mug/ml de gentamicina a 27ºC en matraces sellados. Las transfecciones se realizaron usando células High five, medio sin suero High Five suplementado con 10 \mug/ml de gentamicina y liposomas InsectinPlus (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando procedimientos convencionales.

Para las transfecciones transitorias a gran escala se sembraron 1,2 x 107 células high five en una placa de tejido tisular de 150 mm se dejaron pegarse a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Durante el tiempo de adherencia se preparó la mezcla de ADN/liposoma mediante la mezcla de 6 ml de medio sin suero, 60 \mug de Asp2DTM/pIZ (+/- His) ADN y 120 \mul de InsectinPlus e incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se retiró el medio de siembra de la placa de células y se sustituyó con la mezcla ADN/liposoma durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación constante a 2 rpm. Antes de la incubación durante 4 días a 27ºC en un incubador húmedo se añadieron a la placa 6 ml adicionales de medio. A los cuatro días de la transfección se recogió el medio, se aclaró mediante centrifugación a 500 g, se analizó la expresión de Asp2 mediante transferencia de tipo Western. Para la expresión estable se trató las células con 50 \mug/ml de ceocina y el conjunto superviviente se usó para preparar células clonales mediante dilución límite, seguido por análisis del nivel de expresión como se ha indicado en lo que antecede.

Purificación de Hu-Asp2\DeltaTM y Hu-Asp2\DeltaTM(His)_{6}- La eliminación del segmento transmembrana de Hu-Asp2 tuvo como resultado la secreción del polipéptido al medio de cultivo. Tras la producción de proteína mediante infección o transfección de baculovirus se recogió el medio acondicionado, se aclaró mediante centrifugación y se dializó contra Tris-HCl (pH 8,0). A continuación, este material se purificó mediante sucesivas cromatografías de intercambio aniónico (Tris-HCl pH 8,0), seguida por cromatografía de intercambio catiónico (tampón de acetato a pH 4,5) usando gradientes de NaCl. El perfil de elución se monitorizó mediante (1) análisis de transferencia de tipo Western y (2= mediante ensayo de actividad usando el sustrato peptídico descrito en el Ejemplo 12. Para la Hu-Asp2DM_(His)6, el medio acondicionado se dializó contra tampón Tris (pH 8,0) y se purificó mediante cromatografía secuencial en resina IMAC, seguida por cromatografía de intercambio aniónico.

El análisis de la secuencia de la proteína Hu-Asp2\DeltaTM(His)6 reveló que se había escindido el péptido señal [TQHGIRLPLR].

Ejemplo 11 Expresión de Hu-Asp2 en células CHO

Expresión heteróloga de Hu-Asp-2L en células CHO-K1- La totalidad de la secuencia codificadora de Hu-Asp2 se clonó en el vector de expresión en mamíferos pcDNA3.1(+)Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contiene el promotor inmediato precoz de CMV y la señal de poliadenilación bGH para producir sobreexpresión. El plásmido de expresión, pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2, se preparó mediante lisis alcalina y formación de bandas en CsCl y se secuenció completamente en ambas hebras para verificar la integridad de la secuencia codificadora.

Las células de ovario de hámster chino de tipo natural (CHO-K1) se obtuvieron de la ATCC. Las células se mantuvieron en cultivos de monocapa en \alpha-MEM que contenía 10% de FCS a 37ºC en 5% de CO_{2}. Dos placas de 100 mm de células CHO-K1 (confluencia del 60%) se transfeccionaron con pcDNA3.1(+)/Hygro solo (simulación) o pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 usando el liposoma catiónico DOTAP según lo recomendado por el suministrador. Las células se trataron con mezclas de ADN del plásmido/liposoma durante 15 horas y después se sustituyó el medio por medio de crecimiento que contenía 500 unidades/ml de higromicina B. En el caso de las células CHO-KI transfectadas con pcDNA3.1 (+)Hygro/Hu-Asp2, células individuales resistentes a higromicina B se clonaron mediante dilución límite. Tras la expansión clonal de líneas celulares individuales, se accedió a la expresión de la proteína Hu-Asp2 mediante análisis de transferencia tipo Western usando un anticuerpo policlonal de conejo producido contra Hu-Asp2 recombinante preparado mediante expresión en E. coli. Las placas casi confluentes de cada línea celular se recogieron mediante rascado en PBS y las células se recuperaron mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis frío (Tris-HCl 25 mM (8,0)/EDTA 5 mM) que contenía inhibidores de la proteasa, y las células se lisaron mediante sonicación. Las fracciones soluble y de membrana se separaron mediante centrifugación (105.000 g, 60 minutos) y, después, cantidades normalizadas de proteína de cada fracción se separaron mediante SDS-PAGE. Después de la electrotransferencia de los polipéptidos separados a membranas de PVDF, la proteína Hu-Asp2L usando antisuero anti-Hu-Asp2 de conejo (dilución 1/1000) y los complejos anticuerpo-antígeno se visualizaron usando anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con fosfatasa alcalina. Se detectó una proteína inmunorreactiva específica con un valor Mr aparente de 65 kDa en células transfectadas con pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 y no en células transfectadas con la simulación. Asimismo, el polipéptido Hu-Asp2 sólo se detectó en la fracción de membrana, algo consistente con la presencia de un péptido señal y un único dominio transmembrana en la secuencia predicha. Según este análisis, el clon nº 5 tenía el nivel de expresión más elevado de la proteína Hu-Asp2 y estas líneas celulares de producción se aumentaron para proporcionar material para purificar.

Purificación de Hu-Asp2L recombinante del clon nº 5 CHO-K1/Hu-Asp2. En una purificación típica, los sedimentos celulares del clon nº 5 derivados de 20 placas de 150 mm de células confluentes se usaron como material de partida. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 ml de tampón de lisis frío como se ha descrito en lo que antecede. Las células se lisaron mediante homogeneización en Polytron (2 x 20 segundos) y el lisado se centrifugó a 338.000 g durante 20 minutos. El sedimento de membrana se resuspendió después en 20 ml de tampón de lisis frío que contenía \beta-octilglucósido 50 mM, seguido por agitación a 4ºC durante 1 hora. El extracto de detergente se aclaró mediante centrifugación a 338.000 g durante 20 minutos y se recogió el sobrenadante para su posterior análisis.

El extracto de \beta-octilglucósido se aplicó a una columna de intercambio aniónico Mono Q que previamente se había equilibrado con Tris-Hcl 25 mM (pH 8,0)/\beta-octilglucósido 50 mM. Tras la aplicación de la muestra, la columna se eluyó con un gradiente lineal de concentración de NaCl creciente (0,10m en 30 minutos (y las fracciones individuales se analizaron mediante análisis de transferencia de tipo Western y para determinar la actividad de \beta-secretasa (véase más adelante). Las fracciones que contenían inmunorreactividad a Hu-Asp2L y actividad de \beta-secretasa se combinaron y dializaron contra NaOAc 25 mM (pH 4.5)/\beta-octilglucósido 50 mM. Tras la diálisis, el material que ha precipitado se eliminó mediante centrifugación y el material soluble se sometió a cromatografía en una columna de intercambio catiónico MonoS previamente equilibrada en NaOAc 25 mM (pH 4,5)/)/\beta-octilglucósido 50 mM. La columna se eluyó usando un gradiente lineal de concentración de NaCl creciente (0,10m en 30 minutos (y las fracciones individuales se analizaron mediante análisis de transferencia de tipo Western y para determinar la actividad de \beta-secretasa. Las fracciones que contenían inmunorreactividad de Hu-Asp2 y actividad de \beta-secretasa y, mediante SDS-PAGE/tinción con azul de Coomassie se determinó una pureza de > 90%.

Ejemplo 12 Análisis de la actividad \beta-secretasa de Hu-Asp2 usando sustratos peptídicos

Ensayo de \beta-secretasa. La actividad \beta-secretasa se midió cuantificando la hidrólisis de un péptido sintético que contiene la mutación Swedish de PPA mediante RP-HPLC con detección de UV. Cada reacción contenía Na-MES 50 mM (pH 5,5), 1% de \beta-octilglucósido, sustrato peptídico ((SEVNLDAEFR, 70 \muM) y enzima (1-5 \mug de proteína). Las reacciones se incubaron a 37ºC varias veces y los productos de la reacción se resolvieron mediante RP-HPLC usando un gradiente lineal de 0-70 B en 30 minutos (A= 0,1% TFA en agua, B= 1% de TFA/10% de agua/90% de AcCN). El perfil de elución se monitorizó mediante absorbancia a 214 nm. En experimentos preliminares, se confirmó que los dos picos del producto que eluyeron antes que el sustrato peptídico intacto tenían la secuencia DAEFR y SEVNL usando la secuenciación de Edman y espectrometría de masas MADLI-TOF. El porcentaje de hidrólisis del sustrato peptídico se calculó mediante comparación de las áreas integradas de los picos para los dos productos peptídicos y el material de partida derivado de la absorbancia a 214 nm. La especificidad de la reacción de escisión con proteasa se determinó mediante la realización del ensayo de \beta-secretasa en presencia de un cóctel de inhibidores de la proteasa (pepestatina A 8 \muM, leupeptina 10 \muM, E64 10 \muM y EDTA 5 mM).

Un ensayo alternativo de \beta-secretasa utiliza sustratos fluorescentes inactivados internamente para monitorizar la actividad enzimática usando espectroscopia de fluorescencia en una muestra sencilla o formato en multipocillos. Cara reacción contenía Na-MES 50 mM (ph 5,5), sustrato peptídico MCA-EVKMDAEF[K-DNP] (BioSource International) (50 \muM) y enzima Hu-Asp2 purificada. Estos componentes se equilibraron a 37ºC varias veces y la reacción se inició mediante la adición de sustrato. La excitación se realizó a 33 nm y la cinética de la reacción se monitorizó midiendo la emisión de fluorescencia a 390 nm. Para detectar los compuestos que modulan la actividad Hu-Asp2, los compuestos problema se añadieron durante la fase de preincubación de la reacción y la cinética de la reacción se monitorizó como se ha descrito antes. Los activadores se puntúan como compuestos que incrementan la velocidad de aparición de la fluorescencia, mientras que los inhibidores disminuyen la velocidad de aparición de la fluorescencia.

Quedará claro que la invención se puede practicar de un modo distinto al que particularmente se describe en la descripción y ejemplos anteriores.

<110> Gurney, Mark E.

\hskip1cm Bienkowski. Michael J.

\hskip1cm Heinrikson. Robert L.

\hskip1cm Parodi. Luis A.

\hskip1cm Yan, Riqiang

\hskip1cm Pharmacia & Upjohn Company

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<120> Secretasa en la enfermedad de Alzheimer

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<130> 6177.P CP

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<140>

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<141>

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<150> 60/101,594

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<151> 1998-09-24

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<160> 49

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1804

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm5

6

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<210> 2

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<211> 518

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

7

8

9

\hskip1cm10

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<210> 3

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<211> 2070

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip1cm11

12

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<210> 4

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<211> 501

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

13

14

15

16

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<210> 5

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<211> 1977

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

17

18

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<210> 6

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<211> 476

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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19

20

21

22

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<210> 7

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<211> 2043

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 7

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23

24

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<210> 8

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<211> 501

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

\newpage

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<400> 8

25

26

27

\newpage

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<210> 9

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<211> 2088

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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29

30

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<210> 10

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<211> 695

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400>10

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31

32

33

34

35

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<210> 11

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<211> 2088

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

36

37

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<210> 12

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<211> 695

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400>12

38

39

40

41

42

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<210> 13

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<211> 2088

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 13

43

44

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<210> 14

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<211> 695

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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45

46

47

48

51

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<210> 15

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<211> 2094

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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52

53

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<210> 16

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<211> 697

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

54

55

56

57

58

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<210> 17

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<211> 2094

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400>17

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59

60

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<210> 18

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<211> 697

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 18

61

62

63

64

65

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<2T0> 19

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<211> 2094

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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66

67

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<210> 20

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<211> 697

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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68

69

70

71

72

\hskip1cm73

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<210> 21

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<211> 1341

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

74

75

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<210> 22

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<211> 446

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

76

77

78

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<210> 23

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<211> 1380

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

79

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<210> 24

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<211> 459

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 24

80

81

82

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<210> 25

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<211> 1302

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

83

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<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

84

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

88

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

97

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 459

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

99

100

101

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm103

\hskip1,2cm104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggatccac ccagcacggc atccggctg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgatgac tatctctgac tctccgcgtg aacaggacg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccgtcct gttcacgcgg agagtcagag atagtcatc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Hu-Asp2

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Hu-Asp2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Sitio de escisión de la caspasa 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgatgac tatctctgac tctccgctgg actctggtat cgaaaccgac g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccgtcgg tttcgatacc agagtccagc ggagagtcag agatagtcat c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctt tgtggagatg gtggacaacc tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: 6-His tag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgcatca tcaccatcac catg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: 6-His tag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccatggt gatggtgatg atgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Introducir motivo KK

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Introducir motivo KK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Introducir motivo KK

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

110

Claims

1. Un procedimiento para identificar un agente que modula la actividad de una proteasa implicada en el procesamiento de la proteína precursora del amiloide (PPA) en beta amiloide, que comprende las etapas de

(a) poner en contacto la proteasa purificada y un sustrato de la PPA de la misma que comprende un sitio de procesamiento del beta amiloide en presencia y ausencia de un agente de ensayo, en el que la proteasa

(i): comprende un fragmento de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 6, que incluye DTG y DSG; o

(ii): está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complementario de SEC ID Nº 5 en las siguientes condiciones estrictas de hibridación:

(1): hibridar a 42ºC durante aproximadamente 2,5 horas 6xSCC y 0,1% SDS, y

(2): lavar a 65ºC en 1xSCC y 0,1% SDS, y

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato de la PPA comprende un sitio de escisión de la \beta-secretasa.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el sitio de escisión comprende la secuencia P2-P1-D-A, en la que P2 es K o N, y P1 es M o L.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el sitio de escisión comprende KMDA.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sitio de escisión comprende EVKMDAEF.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el sitio de escisión comprende NLDA.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el sitio de escisión comprende SEVNLDAEFR.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato de la PPA comprende una di-lisina en el extremo carboxi (KK).

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato de la PAA incluye un péptido que tiene un fluoróforo y un inactivador emparejados.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la PAA es una isoforma humana de la PPA.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (a) se lleva a cabo en una célula que expresa la PPA.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la determinación comprende medir la producción del péptido beta amiloide por la célula en presencia y ausencia del agente de ensayo.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se aísla la proteasa.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteasa comprende el fragmento definido en la reivindicación 1 o una variante del mismo que es idéntica al mismo excepto por una sustitución conservadora.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 90% con la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 6.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la identidad es de al menos un 95%.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la proteasa comprende un fragmento de la SEC ID Nº 4 que incluye tripéptidos DTG y DSG.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la proteasa comprende la SEC ID Nº 4.

19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la proteasa comprende un fragmento de la SEC ID Nº 6 que incluye tripéptidos DTG y DSG.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la proteasa comprende la SEC ID Nº 6.

21. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteasa carece de un dominio transmembrana.