CZ2001966A3 - Sekretasa spojená s Alzheimerovou chorobou - Google Patents

Description

(57)Anotace:

Řešení popisuje enzymy a enzymové způsoby pro štěpení βamyloidního prekursorového proteinu v β sekretasovém štěpném místě a související nukleové kyseliny, peptidy, vektory, buňky a buněčné isoláty a stanovení modulátorů βsekretasové aktivity.

CO <

co co σ>

CM

N O

Sekretasa spojená s Alzheimerovou chorobou

Oblast techniky • ·

• · ·

Vynález se týká Alzheimerovy choroby, amyloidního beta peptidu (APP) a lidských aspartylproteas stejně jako způsobů identifikace látek modulujících aktivitu těchto polypeptidů.

Dosavadní stav techniky

Alzheimerova choroba (AD) způsobuje progresivní demenci spojenou s tvorbou amyloidních plaků, neurofibrilámích smotků, glióz a ztrátu neuronů. Nemoc se vyskytuje jak v geneticky podmíněné tak sporadické formě, jejichž klinický průběh a patologické znaky jsou dosti podobné. V současnosti jsou známy tři geny jejich mutace způsobuje autosomálně dominantní formu Alzheimerovy choroby. Tyto geny kódují prekursor amyloidního proteinu (APP) a dva související proteiny, presenilin-1 (PS 1) a presenilin-2 (PS 2), které, jak naznačují jejich jména, jsou si strukturně i funkčně blízké. Mutace kteréhokoli z těchto tří proteinů zvyšuje proteolytickou úpravu APP skrze intracelulární dráhu, která produkuje beta amyloidní peptid nebo Αβ peptid (zde někdy uvedený jako Abeta), 40-42 aminokyselin dlouhý peptid, který je primární komponentou amyloidních plaků při AD. Porucha regulace intracelulámích drah pro proteolytickou úpravu může být podstatou patofyziologie AD. V případě tvorby plaků mutace APP, PSI nebo PS2 ovlivňují proteolytickou úpravu APP, takže se zvyšuje tvorba Αβ 1-42, formy Αβ peptidu, který se zdá být zvláště amyloidogenní a tedy velmi důležitá pro AD. Různé formy APP se liší velikostí v rozmezí 695-770 aminokyselin, jsou lokalizovány na povrchu buněk a mají jednu C-koncovou transmembránovou doménu. A beta peptid je odvozen od regionu APP přilehlému a obsahuje část transmembránové domény. Při úpravě obvykle dochází APP ke štěpení v α-sekretasovém štěpícím místě v oblasti Αβ sekvence přilehlé k membráně t.j. rozpustné extracelulámí domény APP, která je tak uvolněna z povrchu buňky. Tato α-sekretas ová APP úprava vede k rozpustnému APP-α a je považována za normální a domníváme se, že nezpůsobuje AD.

Patologická úprava APP na β- a γ-sekretasových místech vede k velmi rozdílným produktům ve srovnání s úpravou v α-místě. Postupná úprava na β- a γ-sekretasovém místě uvolňuje Αβ peptid, peptid patrně velmi důležitý v patogenezi AD. Úprava na β- a γsekretasových místech se může uskutečňovat na endoplazmatickém retikulu (v neuronech) a v rámci endozomálně/lysozomální dráhy po reintemalizaci buněčného povrchu obsahujícího APP (ve všech typech buněk). Přes intenzivní snahu, v průběhu více než deseti let, identifikovat ··· ···· · · · · • ···· · · ·· · ·· • ·· · · · · · ··· ·· • · · · · ♦ ♦ · · ·· ·· · · · · · · · · ··· enzymy odpovědné za úpravu APP na β a γ místech a produkujících Αβ peptid, zůstaly tyto proteasy až dosud neznámé. Zde je poprvé předložena identifikace a charakterizace β-sekretasového enzymu. Jsou zde uvedeny některé známé a některé nové lidské aspartylproteasy, které mohou fungovat jako β-sekretasové proteasy a poprvé je také vysvětlena role těchto proteas při AD. Dále jsou popsány oblasti v proteasách kritické pro jejich unikátní funkci a poprvé je charakterizován jejich substrát. Jedná se o první popis exprimovaného izolovaného purifikovaného aktivního proteinu tohoto typu, stanovení, která využívají tento protein, to vše navíc k identifikaci a vytvoření vhodných buněčných linií a inhibitorů.

Podstata vynálezu

Je popsáno mnoho variant asp2 genu a peptidu.

Jakákoli izolovaná nebo purifikovaná nukleová kyselina, která kóduje proteasu schopnou štěpit beta (β) sekretázové štěpné místo APP, která obsahuje dvě nebo více sad speciálních nukleových kyselin, kde tyto speciální nukleové kyseliny jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi od 100 do 300 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde se první sada těchto speciálních nukleových kyselin skládá z nukleových kyselin, které kódují peptid DSG nebo DTG, kde poslední nukleová kyselina druhé sady nukleových kyselin je poslední touto speciální nukleovou kyselinou, s výjimkou, že nejsou zahrnuty nukleové kyseliny uvedené jako SEQ č.l a SEQ č.5. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi od 125-222 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné. Nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují asi od 150-172 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné. Nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují asi od 125-222 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné. Nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují asi 172 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde jejich nukleotidy jsou popsány v SEQ č. 3. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi od 150-196 aminokyselinových pozic. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi 196 aminokyselinových pozic. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které mají stejné sekvence, které vymezují stejnou sadu speciálních nukleových kyselin podle SEQ č. 5. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi od 150-190 aminokyselinových pozic. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi 190 aminokyselinových pozic. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tyto dvě sady nukleových kyselin jsou odděleny nukleovými kyselinami, které mají stejné sekvence, které vymezují stejnou sadu speciálních nukleových kyselin podle SEQ č. 1. Polynukleotid podle vynálezu, kde první nukleová kyselina první speciální sady aminokyselin, která je první touto speciální nukleovou kyselinou, je funkčně připojena k jakémukoli kodonu, kde nukleová kyselina tohoto kodonu kóduje jakýkoli peptid obsahující od 1 do 10 000 aminokyselin (pozic). Polynukleotid podle vynálezu, kde první nukleová kyselina první speciální sady aminokyselin, která je první touto speciální nukleovou kyselinou, je funkčně připojen k jakémukoli kodonu, kde nukleová kyselina tohoto kodonu kóduje jakýkoli peptid vybraný ze skupiny obsahující: jakékoli reportérové proteiny, nebo proteiny, které usnadňují purifikaci. Polynukleotid podle vynálezu, kde první nukleová kyselina první speciální sady aminokyselin, která je první touto speciální nukleovou kyselinou, je funkčně připojen k jakémukoli kodonu, kde nukleová kyselina od tohoto kodonu kóduje jakýkoli peptid vybraný ze skupiny obsahující: těžký řetězec imunoglobulinu, maltózu vážící protein, glutathion S transferasu, zelený fluorescentní protein a ubichitin. Polynukleotid podle vynálezu, kde poslední nukleová kyselina druhé speciální sady aminokyselin, která je první touto speciální nukleovou kyselinou, je funkčně připojen k polynukleotidu, který kóduje jakýkoli peptid obsahující od 1 do 10 000 aminokyselin (pozic). Polynukleotid podle vynálezu, kde poslední speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k jakémukoli kodonu připojenému k polynukleotidu, který kóduje jakýkoli peptid vybraný ze skupiny obsahující: jakékoli reportérové proteiny, nebo proteiny, které usnadňují purifikaci. Polynukleotid podle vynálezu, kde první nukleová kyselina je funkčně připojena k polynukleotidu, který kóduje jakýkoli peptid vybraný ze skupiny obsahující těžký řetězec imunoglobulinu, maltózu vážící protein, glutathion S transferasu, zelený fluorescentní protein a ubichitin.

Jakákoli izolovaná nebo purifikovaná nukleová kyselina, která kóduje proteasu schopnou Štěpit beta (β) sekretasové štěpné místo APP, která obsahuje dvě nebo více sad speciální nukleových kyselin, kde tyto speciální nukleové kyseliny jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi od 100 do 300 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde se první sada těchto speciálních nukleových kyselin skládá z nukleových kyselin, které kódují peptid DTG, kde první nukleová kyselina první speciální sady nukleových kyselin je první touto speciální nukleovou kyselinou, a kde druhá sada nukleových kyselin kóduje • · · · · · · «··· • · · ·· · · ·· · ·· • · · ··· ·· ··· ·· • · · · · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·

DSG nebo DTG, kde poslední nukleová kyselina druhé sady speciálních nukleových kyselin je poslední speciální nukleovou kyselinou, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleovým kyselinám, které kódují jakýkoli počet aminokyselin od nuly do 81 aminokyselin, a kde každý z těchto kodonů může kódovat jakoukoli aminokyselinu. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje od 64 do 77 aminokyselin, kde každý kodon může kódovat jakoukoli aminokyselinu. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje 71 aminokyselin. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje 71 aminokyselin, kde první z těchto 71 aminokyselin je aminokyselina T. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 11). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 11). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje od 40 do 54 aminokyselin, kde každý kodon může kódovat jakoukoli aminokyselinu. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje 47 aminokyselin. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje 47 aminokyselin, kde první z těchto 47 aminokyselin je aminokyselina E. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 10). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 10).

Jakákoli izolovaná nebo purifikovaná nukleová kyselina, která kóduje proteasu schopnou štěpit beta (β) sekretasové štěpné místo APP, která obsahuje dvě nebo více sad speciální nukleových kyselin, kde tyto speciální nukleové kyseliny jsou odděleny nukleovými kyselinami, které kódují asi od 100 do asi 300 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde se první sada těchto speciálních nukleových kyselin skládá z nukleových kyselin, které kódují peptid DTG, kde první nukleová kyselina první speciální sady nukleových kyselin je první touto speciální nukleovou kyselinou, a kde druhá sada nukleových kyselin kóduje DSG nebo DTG, kde poslední nukleová kyselina druhé sady speciálních nukleových kyselin je poslední speciální nukleovou kyselinou a je funkčně připojena k nukleovým kyselinám, které kódují od 50 do 170 kodonů. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde poslední speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje od 100 do 170 kodonů. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde poslední speciální nukleová kyselina je funkčně • 99 9 · 9 9 9 99 9 • · · · · · 9 9 9 9 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9· • 9 9 9 9999 999 ·· ·· 99 99 99999 připojena k nukleové kyselině, která kóduje od 142 do 163 kodonů. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde poslední speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje 142 kodonů. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde poslední speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleovým kyselinám, které kódují asi 163 kodonů. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Nukleová kyselina podle vynálezu, kde poslední speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleové kyselině, která kóduje asi 170 kodonů. Druhá sada speciálních nukleových kyselin podle vynálezu kóduje polypeptid DSG a případně první sada nukleových kyselin je funkčně připojena k peptidovému purifikačnímu přívěšku. Nukleová kyselina podle vynálezu je funkčně připojena k peptidovému purifikačnímu přívěšku, kterým je 6 histidinů. První sada speciálních nukleových kyselin podle vynálezu tvoří jeden polynukleotid a druhá sada speciálních nukleových kyselin tvoří druhý polynukleotid, kde první i druhý polynukleotid má alespoň 50 kodonů. První sada speciálních nukleových kyselin podle vynálezu tvoří jeden polynukleotid a druhá sada speciálních nukleových kyselin tvoří druhý polynukleotid, kde první i druhý polynukleotid má alespoň 50 kodonů, kde uvedené polynukleotidy jsou ve stejném roztoku. Vektor obsahující polynukleotid podle vynálezu. Buňka nebo buněčná linie, která obsahuje polynukleotid podle vynálezu.

Jakýkoli izolovaný nebo purifikovaný peptid nebo protein obsahující proteasu schopnou štěpit beta (β) sekretasové štěpné místo APP, který obsahuje dvě nebo více sad speciální aminokyselin, kde tyto aminokyseliny jsou odděleny asi od 100 do 300 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde se první sada těchto speciálních aminokyselin tvoří peptid DTG, aminokyselina první speciální sady aminokyselin je touto první aminokyselinou, a kde druhá sada aminokyselin tvoří DSG nebo DTG, kde poslední aminokyselina druhé sady speciálních aminokyselin je poslední speciální aminokyselinou, s výhradou proteas uvedených jako SEQ č. 2 a SEQ č. 6. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi od 125 do 222 aminokyselinových pozic, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné aminokyseliny. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi od 150 do 172 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi 172 aminokyselinami. Polypeptid podle ·· ♦· ·· ···· · • · · ···· · ··· • ···· · · · · · ·· • · · · · · · · ··· ·· • · · · · · · · ··· ·· ·♦ ·· ·· ····· vynálezu, kde tato proteasa je popsána v SEQ č. 4. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi od 150 do 196 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi 196 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny stejnými aminokyselinovými sekvencemi, které oddělují stejnou sadu speciálních aminokyselin v SEQ č. 6. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi od 150 do 190 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny asi 190 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tyto dvě sady aminokyseliny jsou odděleny stejnými aminokyselinovými sekvencemi, které oddělují stejnou sadu speciálních aminokyselin v SEQ č. 2. První aminokyselina první speciální sady aminokyselin podle vynálezu, která je první speciální aminokyselinou, je funkčně připojena k jakémukoli polypeptidu obsahujícímu od 1 do 10000 aminokyselin. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k jakémukoli polypeptidu vybranému ze skupiny obsahující: jakékoli reportérové proteiny usnadňující purifikaci. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k jakémukoli polypeptidu vybranému ze skupiny obsahující: těžký imunoglobulinový řetězec, protein vážící maltózu, glutathion S transferasa, zelený fluorescenční protein a ubichitin. Poslední aminokyselina druhé speciální sady aminokyselin podle vynálezu, která je poslední speciální aminokyselinou, je funkčně připojena k jakémukoli polypeptidu obsahujícímu od 1 do 10000 aminokyselin. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k jakémukoli polypeptidu vybranému ze skupiny obsahující: jakékoli reportérové proteiny usnadňující purifikaci. Polypeptid podle vynálezu, kde poslední speciální aminokyselina je funkčně připojena k jakémukoli polypeptidu vybranému ze skupiny obsahující: těžký imunoglobulinový řetězec, protein vážící maltózu, glutathion S transferasa, zelený fluorescenční protein a ubichitin.

Jakýkoli izolovaný nebo purifikovaný polypeptid, který tvoří proteasu schopnou štěpit beta (β) sekretasové štěpné místo APP, která obsahuje dvě nebo více sad speciálních aminokyselin, kde tyto speciální aminokyseliny jsou odděleny asi od 100 do 300 aminokyselin, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde se první sada těchto speciálních aminokyselin skládá z aminokyselin DTG, kde první aminokyselina první speciální sady aminokyselin je první touto speciální aminokyselinou a je to D, a kde druhá sada aminokyselin je DSG nebo DTG, kde poslední speciální aminokyselina druhé sady speciálních aminokyselin je poslední speciální aminokyselinou aje to G, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k aminokyselinám, které kódují jakýkoli počet aminokyselin od nuly do 81 aminokyselin, a kde každá může být jakoukoli aminokyselinou. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu od 64 do 77 aminokyseliny, kde každá aminokyselina může být jakákoli aminokyselina. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu o 71 aminokyselině. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k 71 aminokyselinám, kde první z těchto 71 aminokyselin je aminokyselina T. Polypeptid podle vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 11). Polypeptid podle vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 11). Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k jakémukoli počtu od 40 do 54 aminokyselin, kde každá aminokyselina může být jakoukoli aminokyselinou. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k 47 aminokyselinám. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k 47 aminokyselinovému peptidu, kde první z těchto 47 aminokyselin je aminokyselina E. Polypeptid podle vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 10). Polypeptid, kde celý polypeptid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 10).

Jakýkoli izolovaný nebo purifikovaný polypeptid, který tvoří proteasu schopnou štěpit beta (β) sekretasové štěpné místo APP, který obsahuje dvě nebo více sad speciální aminokyselin, kde tyto speciální aminokyseliny jsou odděleny asi od 100 do 300 aminokyselinami, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde první sada těchto speciálních aminokyselin tvoří peptid DTG, kde první aminokyselina první speciální sady aminokyselin je první touto speciální aminokyselinou, a kde druhá sada aminokyselin tvoří DSG nebo DTG, kde poslední aminokyselina druhé sady speciálních aminokyselin je poslední speciální aminokyselinou a je funkčně připojena k od 50 do 170 aminokyselin, které mohou být jakýmikoli aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde poslední speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu tvořenému od 100 do 170 aminokyselin. Polypeptid podle vynálezu, kde poslední speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu tvořenému od 142 do 163 aminokyselin. Polypeptid podle vynálezu, kde poslední speciální aminokyselina je funkčně připojena peptidu tvořenému 142 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Polypeptid podle vynálezu, kde poslední speciální aminokyselina je funkčně připojena peptidu tvořenému asi 163 aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Polypeptid podle vynálezu, kde celý polypeptid obsahuje sekvenci SEQ č. (příklad 9 nebo 10). Polypeptid podle vynálezu, kde poslední speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu tvořenému asi 170 • · aminokyselinami. Polypeptidy podle vynálezu tvoří sekvence DSG. Polypeptid podle vynálezu, který je funkčně připojen k peptidovému purifikačnímu přívěšku. Polypeptid podle vynálezu je funkčně připojen k peptidovému purifikačnímu přívěšku, kterým je 6 histidinů. První sada speciálních aminokyselin podle vynálezu tvoří jeden polypeptid a druhá sada speciálních aminokyselin tvoří druhý polypeptid, kde první i druhý polypeptid má alespoň 50 aminokyselin, kde uvedené polypeptidy jsou ve stejné nádobce. Vektor obsahující polypeptid podle vynálezu. Buňka nebo buněčná linie, která obsahuje polynukleotid podle vynálezu. Způsob přípravy kteréhokoli z polynukleotidů, vektorů, nebo buněk podle vynálezu. Jakékoli polynukleotidy, polypeptidy, vektory, buňky, nebo buněčné linie podle vynálezu připravené způsoby podle vynálezu.

Jakýkoli isolovaný, nebo purifikovaný polypeptid, který tvoří proteasu schopnou štěpit beta (β) sekretasové štěpné místo APP, který obsahuje dvě nebo více sad speciální aminokyselin, kde tyto speciální aminokyseliny jsou odděleny asi od 100 do 300 aminokyselinami, kde aminokyseliny na těchto pozicích mohou být libovolné, kde se první sada těchto speciálních aminokyselin tvoří peptid DTG, kde první aminokyselina první speciální sady aminokyselin je první touto speciální aminokyselinou a to je D, a kde druhá sada aminokyselin tvoří DSG nebo DTG, kde poslední aminokyselina druhé sady speciálních aminokyselin je poslední speciální aminokyselinou a to je G, kde první speciální aminokyselina k libovolnému počtu od nuly do aminokyselin, které mohou být jakýmikoli aminokyselinami.

Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu tvořenému od 30 do 77 aminokyselin, které mohou být jakýmikoli aminokyselinami. Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena k peptidu tvořenému 35, 47, 71, nebo 77 aminokyselinami.

Polypeptid podle vynálezu, kde první speciální aminokyselina je funkčně připojena ke stejnému odpovídajícímu polypeptidu SEQ č. 3, který dlouhý 35, 47, 71, nebo 77 aminokyselin, počínaje s počítáním od první aminokyseliny první speciální sekvence, DTG, směrem k N-konci SEQ č. 3.

Polypeptid podle vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s SEQ č. 4, která je identická s částí sekvence SEQ č. 4, včetně všech sekvencí z první a/nebo druhé speciální sady nukleových kyselin, směrem k N-konci, včetně 71, 47, 35 aminokyselin před první speciální aminokyselinou (příklady 10 a 11).

Polypeptid podle vynálezu, kde celý polypeptid obsahuje 71 aminokyselin, kde první aminokyselina je T a druhá je Q. Nukleová kyselina podle vynálezu, kde tato nukleová kyselina ·· ·· ♦ · ♦ * *· • 9 · • ··

• 9 9 9

99 obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická s odpovídající aminokyselinovou sekvencí SEQ č. 3, včetně sekvencí z první a/nebo druhé speciální sady nukleových kyselin, směrem k N-konci, včetně 71 aminokyselin, viz příklad 10, počínaje DTG místem a včetně nukleotidů, které kódují 71 aminokyselin.

Nukleová kyselina podle vynálezu, kde tato nukleová kyselina obsahuje sekvenci, která je identická s odpovídající aminokyselinovou sekvencí SEQ č. 3, která je identická se sekvencí v SEQ č. 3, včetně sekvencí z první a/nebo druhé speciální sady nukleových kyselin, směrem k Nkonci, včetně 71, viz příklad 10, počínaje DTG místem a včetně nukleotidů, které kódují 71 aminokyselin.

Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k nukleovým kyselinám, které kódují jakýkoli počet od asi 30 do 54 aminokyselin, kde každý kodon může kódovat jakoukoli aminokyselinu.

Nukleová kyselina podle vynálezu, kde první speciální nukleová kyselina je funkčně připojena k 47 kodonům, kde první aminokyselinou z těchto 35 nebo 47 aminokyselin je aminokyselina E nebo G.

Polynukleotid podle vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95% identická co do odpovídajících aminokyselin ze sekvencí SEQ č. 3, která je identická s Částí sekvence SEQ č. 3 zahrnující sekvence prvních a/nebo druhých speciálních nukleových kyselin, směrem kN-konci, včetně 35 nebo 47 aminokyselin, v případě 47 viz příklad 11, počínaje od DGT místa a včetně nukleotidů, které kódují 35 nebo 47 aminokyselin před DTG místem. Nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tento polynukleotid je identický co do odpovídajících aminokyselin ze sekvencí SEQ č. 3, která je identická se sekvencí v SEQ č. 3 zahrnující sekvence prvních a/nebo druhých speciálních nukleových kyselin, směrem k N-konci, včetně 35 nebo 47 aminokyselin, v případě 47 viz příklad 11, počínaje od DGT místa a včetně nukleotidů, které kódují 35 nebo 47 aminokyselin před DTG místem.

Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující polynukleotid, kde tento polynukleotid kóduje Hu-Asp polypeptid a má nukleotidovou sekvenci alespoň z 95% identickou se sekvencí zvolenou ze skupiny obsahující:

a) nukleotidovou sekvenci kódující Hu-Asp polypeptid zvolený ze skupiny obsahující Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b), kde uvedené Hu-Asp 1, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) polypeptidy mají kompletní aminokyselinovou sekvenci SEQ č. 2, SEQ č. 4 respektive SEQ č. 6; a

b) nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidové sekvenci v bodu (a).

·· ·· Μ 44 4** • · · ···*»444 • J ^t>#· · · ·· · ·· • · · · 4 4 4 4 · ·· ♦· ·· ·· 44 ··»«»

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tento Hu-Asp polypeptid je Hu-Aspl a uvedená polynukleotidová molekula podle l(a) obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ č. 1. Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tento Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(a) a uvedená polynukleotidová molekula podle l(a) obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ č. 4. Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, kde tento Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(b) a uvedená polynukleotidová molekula podle l(a) obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ č. 5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující polynuldeotid, který hybridizuje za přísných podmínek s polynukleotidem majícím polynukleotidovou sekvenci podle bodu (a) nebo (b). Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu. Vektor podle vynálezu, kde tato molekula nukleové kyseliny je funkčně připojena k promotoru pro expresi Hu-Asp polypeptidu. Vektor podle vynálezu, kde uvedený Hu-Asp polypeptid je Hu-Aspl. Vektor podle vynálezu, kde uvedený Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(a). Vektor podle vynálezu, kde uvedený Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(b). Hostitelská buňka obsahující vektor podle vynálezu. Způsob získání Hu-Asp polypeptidu zahrnující kultivaci hostitelských buněk podle vynálezu a izolaci uvedeného Hu-Asp polypeptidu. Izolovaný Hu-Aspl polypeptid obsahující aminokyselinou sekvenci alespoň z 95% identickou se sekvencí obsahující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ č. 2. Izolovaný Hu-Asp2(a) polypeptid obsahující aminokyselinou sekvenci alespoň z 95% identickou se sekvencí obsahující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ č. 4. Izolovaný Hu-Asp2(b) polypeptid obsahující aminokyselinou sekvenci alespoň z 95% identickou se sekvencí obsahující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ č. 8. Izolovaná protilátka, která se váže specificky k HuAsp polypeptidu podle vynálezu.

Uvádíme větší počet metod stanovení enzymu.

Způsob pro identifikaci buněk, které mohou být použity ke screeningu inhibitorů β sekretasové aktivity zahrnuje:

identifikování buněk, které exprimují proteasu schopnou štěpit APP v β sekretasovém místě, což zahrnuje:

i) odebrání buněk nebo supematantu z buněk, které mají být identifikovány ii) měření produkce kritického peptidu, kde kritický peptid je zvolen ze skupiny obsahující buď APP C-koncový peptid, nebo rozpustný APP, iii) selekce buněk, které produkují kritický peptid.

Způsob podle vynálezu, kde jsou odebrány buňky a kritickým peptidem je APP C-koncový peptid vzniklý jako důsledek β sekretasového štěpení. Způsob podle vynálezu, kde je odebrán supematant a kritickým peptidem je rozpustný APP, kde rozpustný APP má C-konec vzniklý jako tf · 44 · ♦«

4 4 » 4 4 · 4 ·4 ·

4 4 44 4 4 4» · ·· • · 4 · 4 4 44 4 · · ·4

4 4 4 4 »4 4 4 44 • 4 44 ·♦ 44 «4»44 důsledek β sekretasového štěpení. Způsob podle vynálezu, kde buňky obsahují některou z nukleových kyselin nebo polypeptidů podle vynálezu a kde je ukázáno, že buňky štěpí β sekretasové místo některého zpeptidů majících následující peptidovou strukturu, P2, Pl, Pl', P2', kde P2 je K nebo N, kde Pl je M nebo L, kde ΡΓ je D, kde P2' je A. Způsob podle nároku 111, kde P2 je K a Pl je M. Způsob podle nároku 112, kde P2 je N a Pl je L.

Jakákoli bakteriální buňka obsahující jakékoli nukleové kyseliny nebo peptidy podle vynálezu. Bakteriální buňka podle vynálezu, kde tato bakterie je E coli. Jakákoli eukariotická buňka obsahující kterékoli nukleové kyseliny nebo polypeptidy podle vynálezu. Jakákoli hmyzí buňka obsahující jakékoli nukleové kyseliny nebo polypeptidy podle vynálezu. Hmyzí buňka podle vynálezu, kde tímto hmyzem je sf9, nebo High5. Hmyzí buňka podle vynálezu, kde tímto hmyzem je High5. Jakákoli savčí buňka obsahující jakékoli nukleové kyseliny nebo polypeptidy vynálezu. Savčí buňka podle vynálezu, kde savčí buňka je vybrána ze skupiny obsahující buňky lidské, hlodavců, zajícovitých a primátů. Savčí buňka vynálezu, kde savčí buňka je vybrána ze skupiny obsahující buňky lidské. Savčí buňka podle vynálezu, kde lidská buňka je vybrána ze skupiny obsahující HEK293 a IMR-32. Savčí buňka podle vynálezu, kde tato buňka je buňka primáta. Buňka primáta podle vynálezu, kde buňka primáta je COS-7 buňka. Savčí buňka podle vynálezu, kde savčí buňka je vybrána ze skupiny obsahující buňky hlodavců. Hlodavčí buňka podle vynálezu vybraná ze skupiny obsahující CH0-K1, Neuro-2A, 3T3 buňky. Buňky kvasinek podle vynálezu. Ptačí buňky podle vynálezu.

Jakákoli izoforma APP, kde poslední dvě karboxy terminální aminokyseliny této izoformy jsou obě lysinové zbytky. V popisu je izoforma APP definována jako jakýkoli APP polypeptid, včetně variant APP (včetně mutantních) a fragmenty APP, které existují u lidí jako jsou ty popsané v US 5,766,846, oddíl 7, řádek 45 až 67, na nějž je zde odkazováno. Izoforma APP podle nároku 114 obsahující izoformu známou jako APP695 modifikovanou tak, že posledními dvěma karboxy terminálními kyselinami jsou dva lysinové zbytky. Izoforma podle vynálezu obsahující SEQ č. 16. Izoformní varianta podle vynálezu obsahující SEQ č. 18 a 20. Jakákoli eukariotická buněčná linie, obsahující nukleové kyseliny nebo polypeptidy podle vynálezu. Jakákoli buněčná linie podle vynálezu, která je savčí buněčnou linií (HEK293, Neuro2a, jsou výhodné - plus jiné). Způsob pro identifikaci inhibitorů enzymu, který štěpí beta sekretasové štěpné místo APP, kteiý zahrnuje:

a) kultivace buněk v kultivačním médiu za podmínek, kdy enzym způsobuje zpracování (processing) APP a uvolňuje amyloidní beta-peptid do média a způsobuje akumulaci CTF99 fragmentů APP v buněčném lyzátu,

• 9	··			* -9
•	•	•	9	•	•	9	• ·	• 9
• ·		•	•	··	>	•
•	•	• ·	•	•	•	•	•	9
··	··	··			4·

b) vystavení kultivovaných buněk působení testované sloučeniny; a zvláště stanovení zda testovaná sloučenina inhibuje funkci enzymu měřením množství uvolněného amyloidního betapeptidu v médiu a/nebo množství CTF99 fragmentů APP v buněčných lyzátech;

c) identifikace testovaných sloučeniny snižujících množství rozpustného amyloidního beta-peptidu přítomného v kultivačním médiu a úbytek CTF99 fragmentů APP v buněčných lyzátech jako Asp2 inhibitorů.

Způsob podle vynálezu, kde kultivovanými buňkami jsou buňky hlodavců, lidské nebo hmyzí. Způsob podle vynálezu, kde lidské nebo hlodavčí buněčné linie vykazují β sekretasovou aktivitu způsobující APP zpracování s uvolňováním amyloidního beta-peptidu do kultivačního média a akumulací CTF99 v buněčném lyzátu. Způsob podle vynálezu, kde je na lidské nebo hlodavční buňky působeno pozitivními oligomery proti enzymu, který vykazuje β sekretasovou aktivitu, čímž se sníží množství rozpustného amyloidního beta-peptidu přítomného v kultivačním médiu a úbytek CTF99 fragmentů APP v buněčných lyzátech. Způsob pro identifikaci látek, které snižují aktivitu Hu-Asp polypeptidu vybraného ze skupiny obsahující Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a HuAsp2(b), způsob zahrnuje:

a) stanovení aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidy v přítomnosti testované látky a v nepřítomnosti testované látky; a

b) srovnání aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanoveného v přítomnosti uvedené testované látky s aktivitou uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanoveného v nepřítomnosti uvedené testované látky;

kde nižší hladina aktivity v přítomnosti uvedené testované látky než v její nepřítomnosti indikuje, že tato látka snižuje aktivitu Hu-Asp polypeptidu. Nukleové kyseliny, peptidy, proteiny, vektory, buňky a buněčné linie a stanovení zde popsaná.

Vynález přináší izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy, které kódují polypeptid vybraný ze skupiny obsahující lidské aspartylproteasy. Zvláště lidská aspartylproteasa 1 (Hu-Aspl) a dvě alternativní zestřihové varianty lidské aspartylproteasy 2 (Hu-Asp2) označované zde jako Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Označením „Hu-Asp“ se zde myslí Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) i Hu-Asp2(b). Označením „Hu-Asp2“ se zde myslí Hu-Asp2(a) i Hu-Asp2(b). HuAspl je exprimován nejvíce v pankreatu a prostatické tkáni, zatímco Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) jsou exprimovány nejvíce v pankreatu a mozkové tkáni. Vynález také přináší izolované polypeptidy Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b), stejně jako jejich fragmenty, které vykazují aspartylproteasovou aktivitu.

··· · · · · ··· • ···· · · ·· · * • ·· · · · ·· ··· · • · · · ···· ·· • · ·· ·« · · ·· ·

Ve výhodném provedení obsahuje molekula nukleové kyseliny polynukleotid o sekvenci zvolené ze skupiny obsahující zbytky 1-1554 ze SEQ č. 1; kódující Hu-Aspl, zbytky 1-1503 ze SEQ č. 3 kódující Hu-Asp(a), a zbytky 1-1428 ze SEQ č. 5 kódující Hu-Asp(b). V dalším aspektu vynález přináší izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotid, který hybridizuje za přísných podmínek s polynukleotidem kódujícím Hu-Aspl, Hu-Asp2(a), Hu-Asp2(b), nebo jejich fragmenty. Evropská patentová přihláška EP 0 848 062 uvádí polypeptid označovaný jako Aspl, který se vyznačuje značnou homologií s Hu-Aspl, zatímco mezinárodní přihláška WO 98/22597 uvádí polypeptid označený jako „Asp2“, který se vyznačuje významnou homologií s Hu-Asp2(a).

Vynález také přináší vektory obsahující izolované nukleové kyseliny podle vynálezu, hostitelské buňky, do kterých jsou takové vektory byly vloženy a rekombinantní metody získávání Hu-Aspl, Hu-Asp2(a), nebo Hu-Asp2(b) polypeptidů kultivováním výše popsaných hostitelských buněk a izolace relevantních polypeptidů.

Dalším aspektem vynálezu jsou izolované Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b) polypeptidy, stejně jako jejich fragmenty. Ve výhodném provedení mají Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b) polypeptidy aminokyselinovou sekvenci podle SEQ č. 2, SEQ č. 4, nebo respektive SEQ č. 6. Vynález také popisuje aktivní formy Hu-Asp2, způsoby pro přípravu těchto aktivních forem, způsoby pro přípravu rozpustných forem, způsoby pro měření Hu-Asp2 aktivity a substráty pro Hu-Asp2 štěpení. Vynález rovněž popisuje pozitivní oligomery proti Aspl, Hu-Asp2(a), a HuAsp2(b) mRNA transkryptům a jejich použití jako antisens reagent pro vyřazení takové mRNA a následné produkci odpovídajícího polypeptidů. Izolované protilátky, polyklonální i monoklonální, které se vážou specificky k Aspl, Hu-Asp2(a), nebo Hu-Asp2(b) polypeptidům jsou rovněž zahrnuty.

Vynález rovněž přináší způsoby pro identifikaci látek, které modulují aktivitu kteréhokoli z Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b). Vynález popisuje způsoby pro testování takových látek v bezbuněčných stanoveních, kde je přidán Hu-Asp2, stejně jako způsoby pro testování těchto látek na lidských nebo jiných savčích buňkách, ve kterých je Hu-Asp2 přítomen.

Stručný popis seznamu sekvencí

Sekvence č. 1-Lidská Aspl, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 2-Lidská Aspl, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 3-Lidská Asp2(a), nukleotidová sekvence

Sekvence č. 4-Lidská Asp2(a), předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 5-Lidská Asp2(b), nukleotidová sekvence • · • · · · · · · · ····· ···· · · • · · ··· · ♦ ··· · ···· ···· ♦ · ·· ·· ·· ·· · · Sekvence Č. 6-Lidská Asp2(b), předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 7-Myší Asp2(a), nukleotidová sekvence

Sekvence Č. 8-Myší Asp2(a), předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 9-Lidská APP695, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 10-Lidská APP695, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 11-Lidská APP695-Sw, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 12-Lidská APP695-Sw, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 13-Lidská APP695-VF, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 14-Lidská APP695-VF, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 15-Lidská APP695-KK, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 16-Lidská APP695-KK, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 17-Lidská APP695-Sw-KK, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 18-Lidská APP695-Sw-KK, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 19-Lidská APP695-VF-KK, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 20-Lidská APP695-VF-KK, předpovězená aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 21-T7-Human-pro-Asp-2(a)ATM, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 22-T7-Human-pro-Asp-2(a)ATM, aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 23-T7-Caspase-Human-pro-Asp-2(a)ATM, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 24-T7-Caspase-Human-pro-Asp-2(a)ATM, aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 25-Human-pro-Asp-2(a)ATM (nízké GC), nukleotidová sekvence

Sekvence č. 26-Human-pro-Asp-2(a)ATM (nízké GC), aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 27-T7-Caspase- Caspase 8 štěpení Human-pro-Asp-2(a)ATM, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 28-T7-Caspase- Caspase 8 štěpení Human-pro-Asp-2(a)ATM, aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 29-Human-pro-Asp-2(a)ATM, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 30-Human-pro-Asp-2(a)ATM, aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 31-Human-pro-Asp-2(a)ATM(His)₆, nukleotidová sekvence

Sekvence č. 32-Human-pro-Asp-2(a)ATM(His)₆, aminokyselinová sekvence

Sekvence č. 33-46 jsou popsány dále v detailním popisu vynálezu.

Následuje několik definic používaných v tomto vynálezu, většina používaných definic jsou běžně užívány odborníky v oboru.

• · • · * ·· · · • · · · · · · · · ·· • * · ··· ·· ···· • · · · ···· · · • · ·· 9 9 · 99 9 β amyloidní peptid znamená jakákoliv peptid vznikající beta sekretasovým štěpením APP. Zahrnuje to peptidy o délce 39, 40, 41, 42, a 43 aminokyselin, počínaje od β sekretasového štěpícího místa až po 39, 40, 41, 42, a 43 aminokyselinu od tohoto místa, β amyloidní peptid také znamená sekvence 1-6, SEQ č. 1-6 podle US 5,750,349, vydaný 12. května 1998 (zahrnuté do tohoto dokumentu odkazem), β sekretasový štěpný fragment uvedený zde je nazýván CTF-99, a zaujímá místo od β sekretasového štěpného místa až po karboxy konec APP.

Izoformy APP znamená jakýkoli APP polypeptid, včetně APP variant (včetně mutací) a APP fragmenty, které existují u lidí tak jak jsou popsány v US 5,766,846, oddíl 6, řádky 45-67, zahrnuté do tohoto dokumentu odkazem a viz níže.

Termín „β-amyloidní prekursorový protein“ (APP) tak, jak je používán zde, je definován jako polypeptid, který je kódován genem stejného jména nacházejícím se u člověka na dlouhém rameni chromozomu 21 , a který obsahuje ,,βΑΡ“ zde „β-amyloidní protein“ viz výše, ve své karboxy třetině. APP je glykosylovaný, jeden transmembránový segment obsahující protein exprimovaný v širokém spektru buněk v mnoha savčích tkáních. Příklady specifických isotypů APP, které jsou v současnosti známy u lidí jsou 695-aminokyselinový polypeptid popsaný v Kang et al. (1987) Nátuře 325:733-736, který je označován jako „normální“ APP; 751-aminokyselinový polypeptid popsaný v Ponte et al. (1988) Nátuře 331:525-527 (1988) a Tanzi et al. (1988) Nátuře 331:528-530; a 770-aminokyselinový polypeptid popsaný v Kitaguchi et al. (1988) Nátuře 331:530-532. Příklady specifických variant APP zahrnují bodové mutace, které se mohou lišit pozicí i fenotypem (pro přezkoumání známých mutantních variant viz Hardy (1992) Nátuře Genet. 1:233-234). Všechny citované odkazy jsou zde zahrnuty svým odkazem. Termín „APP fragment“, jak je zde používán, znamená fragment APP jiný než ty, které obsahují výlučně βΑΡ, nebo βΑΡ fragmenty. Takže APP fragmenty zahrnují aminokyselinové sekvence APP navíc k těm, které tvoří intaktní 3 AP, nebo βΑΡ fragment.

Termín Jakákoli aminokyselina“, jak je zde používán, znamená aminokyselinu zvolenou z následující skupiny, tří písmennou a jednopísmennou zkratku, které mohou být také použity: Alanin, Ala, A; Arginin, Arg, R; Asparagin, Asn, N; Asparagová kyselina, Asp, D; Cystein, Cys, C; Glutamin, Gin, Q; Glutamová kyselina, Glu, E; Glycin, Gly, G; Histidin, His, H; Isoleucin, Ile, I; Leucin, Leu, L; Lysin, Lys, K; Methionin, Met, M; Fenylalanin, Phe, F; Prolin, Pro, P; Serin, Ser, S; Threonin, Thr, T; Tiyptofan, Trp, W; Tyrosin, Tyr, Y; Valin, Val, V; Asparagová kyselina, nebo Asparagin, Asx, B; Glutamová kyselina nebo Glutamin, Glx, Z; jakákoli aminokyselina, Xaa, X.

• ·

Vynález přináší způsoby pro vyhledávání v genových databází jednoduchého motivu aktivního místa charakteristického pro aspartylproteasy. Eukaryotické aspartylproteasy, jako je pepsin, nebo renin jsou tvořeny dvěma charakteristickými doménami, které přivádí do blízkosti v aktivním místu dva aspartylové zbytky. Ty zabudované v krátkém tripeptidovém motivu DTG, nebo zřídka DSG. Většina aspartylproteas vzniká jako proenzymy jejichž N-konec musí být pro aktivaci odštěpen. DTG, nebo DSG motivy aktivního místa se vyskytují asi na pozicích 65-70 proenzymu (prorenin, pepsinogen), ale asi na pozicích 25-30 v aktivním enzymu po odštěpení Nkoncové prodomény. Omezená délka motivu aktivního místa ztěžuje nalézt soubor krátkých expresních sekvenčních značek (tags) (EST) nových aspartylproteas. EST sekvence mají obvykle asi 250 nukleotidů, nebo méně a tedy kódují 80-90 aminokyselinových zbytků, nebo méně. Měla by to být to tak krátká sekvence, že nemůže obsahovat dva motivy aktivního místa. Výhodnou metodou je zkoumat databáze na hypotetickou, nebo sestavenou protein kódující sekvenci. Vynález popisuje počítačovou metodu pro identifikaci kandidátů aspartylproteas v databázi proteinových sekvencí. Způsob byl použit pro identifikaci sedmi kandidátů aspartylproteasových sekvencí v genomu Caenorhabditis elegans. Tyto sekvence byly poté použity pro identifikaci HuAspl a dvou alternativních sestřihových variant Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) pomocí hledání homologie.

Hlavním aspektem vynálezu je poskytnutí nových informací o zpracování (processingu) zpracování APP. Patogenní zpracování amyloidního prekursorového proteinu (APP) přes Αβ dráhu vyžaduje sekvenční působení dvou proteas označovaných jako β-sekretasa a γ-sekretasa. Štěpení APP β-sekretasou a γ-sekretasou uvolňuje N-konec respektive C-konec Αβ peptidu. Díky nadprodukci Αβ peptidu, je zvláště Αβ_Μ2 považován za příčinu iniciace Alzheimerovy choroby, inhibitory buď β-sekretasy, a/nebo γ-sekretasy jsou potencionálními léky na Alzheimerovu chorobu. Přes význam β-sekretasy a γ-sekretasy v patogenním zpracování APP nebyly tyto enzymy až dodnes molekulárně identifikovány. Nebylo tedy známo, které enzymy jsou odpovědné za štěpení v β—sekretasovém nebo γ-sekretasovém štěpném místě. Tato místa samotná byla známa, protože byl znám APP a rovněž byl znám Αβι.₄₂ viz US 5766846 a US 5837672 (uvedené zde jako odkaz, s výjimkou odkazu na „rozpustné“ peptidy). Nebylo ovšem známo, které enzymy se podílejí na produkci Αβι.42 peptidu.

Vynález obsahuje molekulární definice několika nových lidských aspartylproteas a jedna z nich označovaná jako Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) byla charakterizovaná detailně. Předchozí formy aspl a asp2 byly již uveřejněny, viz EP 0848062A2 a EP 085444A2 autorů David Powel a kol. Smith Kline Beecham Corp. (zahrnuty odkazem). Zde jsou uvedeny dříve známé a nové formy • · • · • · ·· • · · · · · · · · · • · ·· ·· · · · · ·

Hu-Asp2. Poprvé se podařilo je exprimovat v aktivní formě, jsou uvedeny jejich substráty a jejich specificita. Předtím bylo ke štěpení β-sekretasového místa zapotřebí buněk nebo buněčného extraktu, nyní může být pro stanovení použit purifikovaný protein, což je zde také uvedeno. Na základě výsledků (1) antisens knock out experimentů, (2) experimentů s přechodným vyřazením pomocí transfekce, a (3) biochemických experimentů s využitím purifikovaného rekombinantního Hu-Asp2 bylo ukázáno, že Hu-Asp2 je β-sekretasa hrající roli ve zpracování APP. Ačkoliv již byla známa nukleotidová a předpovězená aminokyselinová sekvence Hu-Asp2(a), viz výše, viz EP 0848062A2 a EP 0855444A2, nebyla dosud zveřejněna žádná charakterizace tohoto enzymu. Nyní je zde charakterizován Hu-Asp2 enzym a je vysvětleno, proč se jedná o zásadní a nezbytný enzym nutný pro vznik Αβι.42 peptidu možná také rozhodující krok při vývoji AD.

V jiném provedením podle vynález je popsána nová sestřihová varianta Hu-Asp2 označená jako Hu-Asp2(b), který nebyl dosud znám.

V dalším provedení podle vynález jsou poskytnuty izolované molekuly nukleových kyselin obsahující nukleotidové sekvence kódující polypeptid vybraný ze skupiny obsahující lidskou aspartyl proteasu 1 (Hu-Aspl) a dvě altremativní sestřihové varianty lidské aspartylproteasy 2 (Hu-Asp2), zde označené jako Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Pokud je zde uveden nějaký odkaz na Hu-Asp2 jsou tím myšleny obě varianty Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Hu-Aspl je exprimován nejvíce v pankreatu a pro statické tkáni, zatímco Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) jsou exprimovány nejvíce v pankreatu a mozkové tkáni. Vynález také přináší izolované Hu-Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b) polypeptidy, stejně jako jejich fragmenty, které vykazují aspartylproteasovou aktivitu.

Předpovězené aminokyselinové sekvence Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) sdílejí významnou homologii s dříve identifikovanými savčími aspartylproteasami, jako je pepsinogen A, pepsinogen B, katepsin D, katepsin E a renin. P.B. Szecs, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 52:(210 522 (1992)). Tyto enzymy jsou charakterizované přítomností duplikovaného DTG/DSG sekvenčního motivu. Hu-Aspl a Hu-Asp2 polypeptidy zde zveřejněné také vykazují extrémně vysokou homologii s ProSite konsensuálním motivem aspartylproteas získané z SwissProt databáze.

Nukleotidová sekvence určená jako zbytky 1-1554 SEQ č. 1 odpovídá nukleotidové sekvenci kódující Hu-Aspl, nukleotidová sekvence určená jako zbytky 1-1503 SEQ č. 3 odpovídá nukleotidové sekvenci kódující Hu-Asp2(a) a nukleotidová sekvence určená jako zbytky 1-1428 SEQ č. 5 odpovídá nukleotidové sekvenci kódující Hu-Asp2(b). Isolace a sekvencování DNA kódující Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) je popsáno dále v příkladech 1 a 2.

··· ···· ·♦ · • ···· · ··· ·· • ♦ · · · · ·· ♦ · ·· ···· ······ «· · · · · · · ♦· ·

Jak je popsáno v příkladech 1 a 2 byly pro sekvencování použity automatizované sekvenační metody za získání sekvencí Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Hu-Asp nukleotidová sekvence podle vynálezu byla získána pro oba řetězce DNA a věříme, že je 100% přesná. Jak je však známo z literatury, může nukleotidová sekvence získaná takovýmito automatizovanými metodami obsahovat nějaké chyby. Nukleotidová sekvence získaná automatickým sekvencováním je obvykle alespoň z 90 %, obvykleji alespoň z 95 % až 99,9 % identická se skutečnou nukleotidovou sekvencí dané molekuly nukleové kyseliny. Sekvence může být přesněji zjištěna pomocí manuálních sekvenačních metod, které jsou z literatury dobře známy. Chyba v sekvenci, která vede k inzerci nebo deleci jednoho nebo více nukleotidů může vést k posunu čtecího rámce při translaci takže předpovězená aminokyselinová sekvence se bude lišit od té, která by byla stanovena pomocí skutečné nukleotidové sekvence, počínaje bodem mutace. HuAsp DNA podle vynálezu zahrnuje cDNA, chemicky syntetizovanou DNA, DNA izolovanou pomocí PCR, genomovou DNA a jejich kombinace. Genomová Hu-Asp DNA může být získána prohledáváním genetické knihovny pomocí Hu-Asp2 cDNA zde popsané, pomocí metod dobře známých z literatury nebo pomocí oligonukleotidů zvolených z Hu-Asp2 sekvence, které mohou být použity jako primery pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR). RNA přepsaná z Hu-Asp DNA je také zahrnuta v rozsahu vynálezu.

Kvůli degeneraci genetického kódu mohou dvě odlišné DNA kódovat stejnou aminokyselinovou sekvenci. Vynález proto přináší izolované molekuly nukleových kyselin mající polynukleotidovou sekvenci kódující jakýkoli Hu-Asp polypeptid podle vynálezu, kde tato polynukleotidová sekvence kóduje Hu-Asp polypeptid mající kompletní aminokyselinovou sekvenci SEQ č. 2, SEQ č. 4, SEQ č. 6, nebo jejich fragmenty.

Vynález zahrnuje také purifikované Hu-Asp polypeptidy, jak rekombinantní, tak nerekombinantní. Především jsou zde uvedeny způsoby pro produkci Hu-Asp2 polypeptidů v aktivní formě. To zahrnuje produkci Hu-Asp2 polypeptidů a jejich variant v bakteriálních buňkách, hmyzích buňkách a savčích buňkách, také ve formách, které umožňují sekreci Hu-Asp2 polypeptidů z bakteriální buňky, hmyzí buňky, nebo lidské buňky do kultivačního média, dále způsoby pro produkci variant Hu-Asp2 polypeptidů obsahujícího aminokyselinové přívěšky, které usnadňují purifikaci. Ve výhodném provedení podle vynálezu je Hu-Asp2 polypeptid převeden do proteolyticky aktivní formy buď v transformovaných buňkách, nebo po purifikaci a štěpení další proteasou v „cell-free“ systému, tedy systému prostého buněk, takové aktivní formy Hu-Asp2 polypeptidů začínají N-koncovou sekvencí TQHGIR nebo ETDEEP. Varianty a deriváty, včetně fragmentů Hu-Asp proteinů majících nativní aminokyselinové sekvence dané v SEQ č. 2, 4, a 6,

9 • 99 9 9 9 ·· • 9 9 9 9 9 9 9 99 • 9 9 · · · 9 9 · 99

999 99999 • 9 99 99 *9 99·♦· které si uchovávají nějakou biologickou aktivitu Hu-Asp jsou také v rozsahu vynálezu. Odborník v oboru je samozřejmě schopen odlišit, zda varianta, derivát, nebo fragment Hu-Asp proteinu vykazuje Hu-Asp aktivitu stanovením aspartylproteasové aktivity této varianty, derivátu, nebo fragmentu. Fragmenty Hu-Asp patřící do rozsahu vynálezu zahrnují ty, které obsahují doménu aktivního místa obsahující DTG aminokyselinovou sekvenci, fragmenty, které obsahují doménu aktivního místa obsahující DSG aminokyselinovou sekvenci, fragmenty obsahující DTG aminokyselinovou sekvenci i DSG aminokyselinovou sekvenci, fragmenty, ve kterých bylo prodlouženo oddělení DTG a DSG aktivních míst, fragmenty, ve kterých toto oddělení bylo zkráceno. V rozsahu vynálezu jsou také fragmenty Hu-Asp, ve kterých byla odstraněna transmembránová doména a tak umožněna produkce Hu-Asp2 v rozpustné formě. V dalším provedení podle vynálezu mohou být dvě poloviny Hu-Asp2, každá obsahující jedno aktivní místo DTG nebo DSG sekvence produkovány odděleně jako rekombinantní polypeptidy a poté spojeny v roztoku, kde dojde k rekonstituci aktivní proteasy.

Hu-Asp varianty mohou být například získány mutací nativní Hu-Asp kódující nukleotidové sekvence. Hu-Asp varianta, tak jak je zde tento pojem používán, je polypeptid významně homologický s nativním Hu-Asp polypeptidem, který má ale aminokyselinovou sekvenci odlišnou od nativního Hu--Asp polypeptidu díky jedné nebo více delecím, insercím nebo substitucím v aminokyselinové sekvenci. Variantní aminokyselinová nebo nukleotidová sekvence je s výhodou alespoň asi z 80 % identická, výhodněji z 90 % identická a nejlépe alespoň asi z 95% identická s nativní Hu-Asp sekvencí. Tak tedy varianta nukleotidové sekvence, která obsahuje, například 5 bodových mutací na každých sto nukleotidů, v porovnání s nativním Hu-Asp genem, bude z 95% identická s nativním proteinem. Procentuální identita sekvencí, také nazývaná homologií, mezi nativní a variantní Hu-Asp sekvencí může být také stanovena , například porovnáním obou sekvencí pomocí některého z počítačových programů obvykle pro tento účel používaných, jako je program Gap (Viskonsin Sequence Analysis Package, verze 8 pro Unix, Genetic Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), který využívá algoritmus Smith a Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)).

Změny nativní aminokyselinové sekvence mohou být provedeny mnoha známými technikami. Například mohou být na určených pozicích vloženy mutace postupy dobře z literatury známými, jako je oligonukleotidem řízená mutagenese, popsaná Walderem a kol. (Gene 42: 133 (1986)); Bauer a kol. (Gene 37: 73 (1985)); Craik (BioTechniques, Leden 1985, str. 12-19); Smith a kol. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenům Press (1981)); a U.S. patent č. 4518584 a 4737462.

«

Hu-Asp varianty patřící do rozsahu vynálezu mohou obsahovat konzervativně substituované sekvence, což znamená, že je jeden nebo více aminokyselinových zbytků nahrazen jiným zbytkem, přičemž není změněna sekundární a/nebo terciální struktura Hu-Asp polypeptidu. Takové substituce mohou zahrnovat nahrazení aminokyselinového zbytku zbytkem jiným majícím podobné fyzikálně-chemické vlastnosti, jako je nahrazení jednoho alifatického zbytku (Ile, Val, Leu,, nebo Ala) jiným, nebo substituce mezi basickými zbytky Lys a Arg, kyselými zbytky Glu a Asp, amidickými zbytky Gin a Asn, hydroxylovými zbytky Ser a Tyr, nebo aromatickými zbytky Phe a Tyr. Další informace týkající se přípravy fenotypicky neutrálních aminokyselinových záměn mohou být nalezeny v Bowie a kol. Science 247: 1306-1310 (1990). Další Hu-Asp, které si uchovávají významně vysokou biologickou aktivitu Hu-Asp jsou ty, kde jsou aminokyselinové substituce provedeny v oblastech mimo funkční regiony proteinu.

Dalším aspektem vynálezu je poskytnutí isolovaných molekul nukleových kyselin obsahujících polynukleotidy, které hybridizují za přísných podmínek s částí molekul nukleových kyselin popsaných výše, například alespoň sasi 15 nukleotidy, výhodněji alespoň s asi 20 nukleotidy a nejlépe alespoň s asi 30 nukleotidy a zcela nejlépe alespoň s asi 30 až alespoň s asi 100 nukleotidy výše popsaných molekul nukleových kyselin. Takové části nukleových kyselin mají popsanou délku odpovídající například alespoň 15 nukleotidům referenční molekuly nukleové kyseliny.

Přísnými hybridizačními podmínkami je myšlena inkubace přes noc při asi 42 °C po asi 2,5 hodiny v 6 x SSC/0,1% SDS, následovaná promytím filtrů v 1,0 x SSC při 65 °C, 0,1% SDS.

Fragmenty Hu-Asp kódujících molekul nukleových kyselin zde popsaných, stejně jako polynukleotidy schopné hybridizace s těmito molekulami nukleových kyselin mohou být použity jako sondy nebo primery v polymerasové řetězové reakci (PCR). Takové sondy mohou být použity například k detekci přítomnosti Hu-Asp nukleových kyselin v in vitro stanoveních, stejně jako při Southem a Nothem blottingu. Typy buněk exprimujících Hu-Asp mohou být také identifikovány pomocí těchto sond. Tyto postupy jsou odborníkovi v oboru dobře známy a je schopen zvolit sondu vhodné délky pro konkrétní aplikaci. V PCR jsou využity 5'a 3' primery odpovídající koncům žádané Hu-Asp molekuly nukleové kyseliny k izolaci a amplifikaci této sekvence konvenčními technikami.

Dalšími výhodnými fragmenty Hu-Asp molekul nukleových kyselin jsou pozitivní nebo negativní oligonukleotidy obsahující jednořetězcovou nukleovou kyselinu sekvence schopné se vázat k cílové Hu-Asp mRNA (pomocí negativního řetězce), nebo Hu-Asp DNA (pomocí • · 44 • 4 • · · · • · • 4 ·· ·

• ··

4

pozitivního řetězce) sekvenci. Ve výhodném provedení podle vynálezu tyto Hu-Asp pozitivní oligonukleotidy redukují množství Hu-Asp mRNA a následně produkci Hu-Asp polynukleotidů.

V dalším aspektu vynález zahrnuje Hu-Asp polypeptidy s nebo bez nativně se vyskytující glykosylace. Jak Hu-Asp 1, tak Hu-Asp2 mají kanonická akceptorová místa pro Asn připojené cukry, kde Hu-Asp 1 má dvě taková místa a Hu-Asp2 má čtyři. Hu-Asp exprimované v kvasinkách nebo savčích (diskutovaných dále) mohou být podobné nebo významně rozdílné od nativního Hu-Asp polypeptidu v molekulární hmotnosti a způsobu glykosilace. Exprese Hu-Asp v bakteriálních expresních systémech poskytuje neglykosylované Hu-Asp.

Polypeptidy podle vynálezu jsou s výhodou v isolované formě, s výhodou jsou do značné míry purifikovány. Hu-Asp polypeptidy mohou být získány a purifikovány z tkání, buněčných kultur nebo rekombinantních buněčných kultur známými metodami, včetně precipitace síranem amonným nebo ethanolem, chromatografie na katexech nebo anexech, chromatografie na fosfocelulose, hydrofobní chromatografie, afinitní chromatografie, chromatografie na hydroxyapatitu, lektinové chromatografie, vysokoůčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Ve výhodném provedení vynálezu je k Hu-Asp polypeptidu, technikami genového inženýrství, přidán aminokyselinový přívěšek, který je velmi dobře znám, a který obsahuje šest histidinových aminokyselinových zbytků, a který umožňuje purifikaci vazbou na imobilizovaní nikl na vhodném nosiči, epitopy pro polyklonální nebo monoklonální protilátky včetně, ale nejen T7 epitopu, myc epitopu a V5a epitopu a fúzí Hu-Asp2 k vhodným proteinovým partnerům včetně, ale nejen glutathion-S-transferase nebo proteinu vážícího maltosu. Ve výhodném provedení podle vynálezu jsou tyto přídatné aminokyseliny umístěny na C-konec Hu-Asp, ale mohou být přidány na Nkonec nebo přímo do sekvence Hu-Asp2 polypeptidu.

Vynález se také týká vektorů obsahujících polynukleotidové molekuly podle vynálezu, stejně jako hostitelských buněk transformovaných těmito vektory. Kterákoli polynukleotidová molekula podle vynálezu může být vnesena do vektoru, který obvykle obsahuje selekční markér a počátek replikace, pro pomnožení v hostiteli. Protože vynález rovněž zahrnuje Hu-Asp polypeptidy exprimované z polynukleotidových molekul popsaných výše, existují vektory výhodné pro expresi Hu-Asp. Tyto vektory zahrnují DNA kódující některý z Hu-Asp polypeptidů popsaných výše nebo níže, funkčně připojených k vhodným transkripčním nebo translačním regulačním sekvencím, kde tyto sekvence jsou odvozeny od savčích, mikrobiálních, virových nebo hmyzích genů. Příklady takových regulačních sekvencí zahrnují transkripční promotory, operátory nebo zesilovače transkripce, mRNA ribosomální vazná místa a vhodné sekvence, které řídí transkripci a translaci. Nukleotidové sekvence jsou funkčně spojeny tehdy, když funkční sekvence • ♦ · ♦ · ·· • · ··· ·· ·♦ • · · *·· · ·· · • · * · · ·♦♦ ·· ·· ·· ·· má funkční vztah k DNA kódující. Promotorová nukleotidová sekvence je tedy funkčně připojená kHu-Asp DNA sekvenci řídí-li promotorová nukleotidová sekvence transkripci Hu-Asp sekvence.

Výběr vhodných vektorů použitelných pro klonování polynukleotidových molekul kódujících Hu-Asp nebo pro expresi Hu-Asp polypeptidů samozřejmě závisí na hostitelské buňce, do které bude vektor transformován a případně, která bude Hu-Asp polypeptid exprimovat. Vhodné hostitelské buňky pro expresi Hu-Asp polypeptidů zahrnují prokaryota, kvasinky a vyšší eukaryotické buňky, což je diskutováno dále.

Hu-Asp polypeptidy, které mají být exprimovány v takových hostitelských buňkách mohou být také fuzní proteiny, které obsahují oblasti z heterologních proteinů. Takové oblasti mohou být zahrnuty, aby umožňovaly například sekreci, zvyšovaly stabilitu nebo usnadňovaly purifikaci polypeptidu. Například může být do expresního vektoru vložena sekvence kódující vhodný signální peptid. DNA sekvence signálního peptidu (sekreční signál) může být připojena za zachování čtecího rámce kHu-Asp sekvenci, takže Hu-Asp je překládán jako fuzní protein obsahující signální peptid. Signální peptid, který je funkční v dané hostitelské buňce iniciuje extracelulámí sekreci Hu-Asp polypeptidu. S výhodou je signální sekvence po sekreci Hu-Asp z buňky od Hu-Asp polypeptidu odštěpena. Nelimitující příklady signálních sekvencí, které mohou být použity podle vynálezu zahrnují kvasničný I-faktor a včelí melatin vedoucí sekvence v sf9 hmyzích buňkách.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je Hu-Asp polypeptid fuzním proteinem, který obsahuje heterologní oblast, která usnadňuje purifikaci polypeptidu. Mnoho dostupných peptidů používaných pro tento účel umožňuje selektivní vazbu fuzního proteinu na vazného partnera. Například Hu-Asp protein může být například modifikován, za vzniku fuzního proteinu, tak, že obsahuje peptid, který se specificky váže k vaznému partnerovi nebo peptidový přívěšek. Neomezující příklady takových peptidových přívěšků zahrnují 6-His přívěšek, thioredoxinový přívěšek, hemaglutininový přívěšek, GST přívěšek a OmpA signální sekvenci. Jak je jistě odborníkem v oboru rozeznáno, vazný partner, který rozezná a váže peptid, může být některá z molekul nebo sloučenin zahrnující ionty kovů (například afinitní kolona s imobilizovanými ionty kovu), protilátky nebo jejich fragmenty a jakýkoli protein nebo peptid, který váže daný peptid jako je FLAG přívěšek.

Vhodné hostitelské buňky pro expresi Hu-Asp polypeptidů zahrnují prokaryota, kvasinky a vyšší eukaryotické buňky. Vhodné prokaryotické hostitelské buňky použitelné pro expresi HuAsp zahrnují bakterie rodů Escherichia, Bacillus a Salmonella, stejně jako zástupce rodů • 4 44 ·· 44 ·♦·

4 4 4 4 · 4 4 ♦4 4 • 4 444 4 4 44 · ♦4 • 4 4 4 4 · 4 · ·4 • 444 4444 tt 4

4 4 44 44 4 4444

Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus. Pro expresi například v E.coli může Hu-Asp polypeptid obsahovat N-terminální methioninový zbytek pro usnadnění exprese rekombinantního polypeptidu v prokaryotickém hostiteli. N-terminální Met může být případně poté z exprimovaného Hu-Asp polypeptidu odštěpen. Pro usnadnění exprese v Escherichia coli mohou být nakonec přidány další aminokyseliny včetně, ale nejen, T7 vedoucí sekvence, T7-caspasa 8 vedoucí sekvence stejně jako jiné vedoucí sekvence včetně přívěšků pro purifikaci takových, jako je 6-His přívěšek (příklad 9). Hu-Asp polypeptidy exprimované v E.coli mohou být získány buď v rozpustné formě, nebo v nerozpustné formě, kdy může nebo nemusí být přítomen ve formě inkluzních tělísek. Nerozpustné polypeptidy mohou být převedeny na rozpustné pomocí guanidin hydrochloridu, močoviny nebo dalších látek, znovu sbaleny do rozpustné formy před nebo po purifikaci dialýzou proti vhodnému vodnému roztoku pufru. Pokud je rekombinantními metodami získána inaktivní Hu-Asp protoforma může být na aktivní převedena odštěpením prosegmentu vhodnou další proteasou, například proteasa viru lidské imunodeficience.

Expresní vektory použitelné v prokaryotických hostitelích obvykle obsahují jeden nebo více genů fenotypových selekčních markérů. Takové geny obvykle kódují například proteiny, které zajišťují resistenci k antibiotikům, nebo které zajišťují požadavky auxotroffi. S komerčních zdrojů je pohotově k dispozici široká škála takových vektorů. Příklady zahrnují pSPORT vektory, pGEM vektory (Promega), pPROEX vektory (LTI, Bethesda, MD), Bluescript vektory (Stratagene), pET vektory (Novagen) a pQE vektory (Qiagen).

Hu-Asp mohou být také exprimovány v kvasinkových hostitelských buňkách rodů Saccharomyces, Pichia, a Kluveromyces. Výhodné kvasinkové buňky jsou S. cerevisiae a P. pastoris. Kvasinkové vektory často obsahují počátek replikace z2T kvasinkového plasmidu, autonomně replikující se sekvenci (ARS), oblast promotoru, sekvenci pro polyadenylaci, sekvenci pro ukončení transkripce a gen selekčního markéru. Vektory replikující se v kvasinkách i v E.coli (označované jako „shuttle“ - člunky) mohou být rovněž použity. Navíc k výše zmíněným znakům kvasinkových vektorů obsahují člunkové vektory sekvence pro replikaci a selekci v E.coli. Přímá sekrece Hu-Asp polypeptidů exprimovaných v kvasinkových hostitelých může být zajištěna vložením nukleotidové sekvence kódující kvasničný I-faktor vedoucí sekvenci na 5'-konci HuAsp kódující nukleotidovou sekvenci.

Pro expresi Hu-Asp polypeptidů mohou být rovněž použity systémy založené na kulturách hmyzích buněk. Ve výhodném provedení podle vynálezu jsou Hu-Asp polypeptidy podle vynálezu exprimovány pomocí expresních systémů založených na hmyzích buňkách (viz. příklad 10). Dále

• · ·9

9 99

9999 ·· ·· • · · *

9 99 «

9 9 mohou být pro expresi v hmyzích buňkách použity expresní systémy založené na baciloviru popsané v Luckow a Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

V dalším výhodném provedení podle vynálezu je Hu-Asp polypeptid exprimován v savčích buňkách. Neomezující příklady vhodných savčích buněk zahrnují COS-7 linii opičích ledvinových buněk (Gluzman a kol., Cell 23:175 (1981)), linii lidských embryonálních ledvinových buněk 293 a ovariální buňky čínského křečka. S výhodou jsou pro expresi Hu-Asp proteinů použity ovariální buňky čínského křečka (příklad 11).

Volba vhodného expresního vektoru pro expresi Hu-Asp polypeptidů podle vynálezu bude samozřejmě záviset na konkrétních použitých savčích buňkách v rámci známé technologie. Příklady vhodných expresních vektorů zahrnují pcDNA3 (Invitrogen) a pSVL(Pharmacia Biotech). Výhodný vektor pro expresi Hu-Asp polypeptidů je pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Expresní vektory použitelné v savčích buňkách mohou obsahovat transkripční a translační řídící sekvence odvozené od genomů virů. Obvykle užívané promotorové sekvence a sekvence zesilovačů transkripce, které mohou být použity ve vynálezu zahrnují, bez omezení jmenované, ty, které jsou odvozeny od lidského cytomegaloviru (CMV), Adenoviru 2, Polyoma viru a Simian viru 40 (SV40). Metody pro konstrukci savčího expresního vektoru jsou uvedeny například v Okayama a Berg (Mol. Cell. Biol 3:280 (1983)); Cosman a kol. (Mol. Immunol. 23:935 (1986)); Cosman a kol. (Nátuře 312:768 (1984)); EP-A-0367566; a WO 91/18982.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být také použity k přípravě polyklonálních a monoklonálních protilátek, které jsou vhodné k diagnostickým stanovením pro detekci exprese Hu-Asp polypeptidů. Tyto protilátky mohou být připraveny konvenčními technikami. Viz například. Antibodies: A laboratoratory manual, Harlow a Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Monoklonal antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenům Press, New York (1980). Syntetické peptidy obsahující části Hu-Asp zahrnující 5 až 20 aminokyselin mohou být také použity pro produkci polyklonálních nebo monoklonálních protilátek a to po připojení k vhodnému proteinovému nosiči například mimo jiné k hemacyaninu přílepky (KLH), kuřecímu ovalbuminu, nebo hovězímu sérovému albuminu pomocí různých síťovacích činidel včetně karbodiimidů, glutaraldehydu nebo jestliže peptid obsahuje cystein, N--methylmaleinimid. Výhodným peptidem pro imunizaci je KLH konjugovaný s C-koncem Hu-Asp 1, nebo Hu-Asp2 t.j. QRRPRDPEWNDESSLVRHRWK, respektive LRQQHDDFADDISLLK.

Hu-Asp molekuly nukleových kyselin podle vynálezu jsou vhodné rovněž pro identifikaci chromosomů, protože se mohou hybridizovat se specifickými místy na lidských chromozomech.

Hu--Aspl byl lokalizován na chromozomu «4·· • ♦· • 9 999

9 99

9 99

9999

9· ♦·

21, zatímco Hu-Asp2 byl lokalizován na chromozomu llq23.3-24.1. V současnosti je třeba identifikovat konkrétní místa na chromozomech vzhledem k tomu, že jsou k dispozici sondy založené na aktuálních sekvenčních datech (repetiční polymorfismus). Jakmile budou sekvence přesně lokalizovány na chromozomech, může být fyzická pozice na chromozomu porovnána s genetickou mapou. Může poté být stanoven vztah mezi nemocemi a geny, které na mapě přísluší ke stejnému místu. Zda daný gen má vztah ke konkrétní nemoci je tedy její příčinou může být stanoveno porovnáním sekvencí nukleových kyselin mezi zasaženými a nezasaženými osobami.

V dalším provedení se vynález týká způsobů stanovení funkce Hu-Asp, zvláště funkce HuAsp2, který zahrnuje inkubaci roztoku Hu-Asp polypeptidu s vhodným substrátem, který může být mimo jiné syntetický peptid obsahující β-sekretasové štěpné místo APP, s výhodou obsahující mutaci nalezenou u Švédů zasažených AD, kde je KM zaměněno za NL, takový peptid obsahující sekvenci SEVNLDAEFR v kyselém tlumivém roztoku, s výhodou v kyselém tlumivém roztoku s pH 5,5 (viz příklad 12), využívající štěpení tohoto peptidu sledovaného pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie jako mhy Hu-Asp proteolytické aktivity. Výhodné stanovení proteolytické aktivity využívá substráty umožňující stanovení pomocí vnitřního zhášení. Takové vhodné substráty zahrnují peptidy, které mají připojeny pár fluoroforu a zhášedla například mimo jiné kumarinu a dinitrofenolu, takže rozštěpení peptidu účinkem Hu-Asp vede ke zvýšení fluorescence díky fyzikální separaci fluoroforu a zhášedla. Výhodné kolorimetrické stanovení HuAsp proteolytické aktivity využívá jiné substráty, které obsahují PÍ a P2 aminokyseliny zahrnující místo štěpení připojené amidickou vazbou k o-nitrofenolu, takovéto štěpení Hu-Asp vede ke zvýšení absorbance po změně pH pufřu na alkalické.

V dalším provedení se vynález týká způsobů pro identifikaci látek, které zvyšují aktivitu Hu-Asp polypeptidů ze skupiny obsahující Hu-Asp 1, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b), způsob zhmuje:

a) stanovení aktivity daného Hu-Asp polypeptidu v přítomnosti testované látky a v nepřítomnosti testované látky; a

b) porovnání aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanovené v přítomnosti testované látky s aktivitou daného Hu-Asp polypeptidu stanovené v nepřítomnosti testované látky;

vyšší aktivita v přítomnosti testované látky v porovnání s aktivitou v nepřítomnosti testované látky indikuje, že testovaná látka zvyšuje aktivitu uvedeného Hu-Asp polypeptidu. Takové testy mohou být prováděny s Hu-Asp polypeptidy v bezbuněčném systému a s kultivovanými buňkami, které exprimují Hu-Asp, nebo jejich varianty a isoformy.

V dalším provedení se vynález týká způsobů pro identifikaci látek, které snižují aktivitu Hu-Asp polypeptidu zvoleného ze skupiny obsahující Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b), způsob zahrnuje:

a) stanovení aktivity daného Hu-Asp polypeptidu v přítomnosti testované látky a v nepřítomnosti testované látky; a

b) porovnání aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanovené v přítomnosti testované látky s aktivitou daného Hu-Asp polypeptidu stanovené v nepřítomnosti testované látky;

nižší aktivita v přítomnosti testované látky v porovnání s aktivitou v nepřítomnosti testované látky indikuje, že testovaná látka snižuje aktivitu uvedeného Hu-Asp polypeptidu. Takové testy mohou být prováděny s Hu-Asp polypeptidy v bezbuněčném systému a s kultivovanými buňkami, které exprimují Hu-Asp, nebo jejich varianty a isoformy.

V dalším provedení se vynález týká nových buněčných linií (HEK 125.3 buněk) pro stanovení zpracování amyloidního β-peptidu (Αβ) zamyloidního proteinového prekursoru (APP). Tyto buňky jsou stabilními transformanty lidských embryonálních ledvinových buněk 293 (HEK293) s bicistronickým vektorem odvozeným od pIRES-EGFP (Clontech) obsahujícího modifikovanou lidskou APP cDNA, vazné místo pro ribosom a cDNA zesíleného zeleného fluorescenčního proteinu ve druhém cistronu. APP cDNA byla modifikována přidáním dvou kodonů pro lysin na karboxy konec sekvence kódující APP. Tato úprava zvýší zpracování (processing) na Αβ peptid asi 2 až 4 krát. Tato hladina zpracování Αβ peptidu je 60 krát vyšší než můžeme pozorovat pro netransformované HEK293 buňky. HEK125.3 buňky budou vhodné pro posouzení sloučenin, které inhibují zpracování Αβ peptidu. Tento vynález rovněž zahrnuje přidání dvou lysinových zbytků na C-konec dalších izoforem APP včetně 751 a 770 aminokyselinových izoforem, k izoformám APP majícím mutace nalezené u lidské AD včetně Švédské KM-»NL a V717-»F mutace, na C konec APP obsahující β-sekretasové štěpné místo, které je funkčně připojeno k N-terminálnímu signálnímu peptidu pro inserci do membrány a sekreci a reportérové sekvenci obsahující například mimojiné zelený fluorescenční protein nebo alkalickou fosfatasu, takže štěpení v β-sekretasovém štěpném místě uvolňuje reporterový protein z povrchu buňky exprimující polypeptid.

Tímto jsme obecně popsali vynález. Pro lepší srozumitelnost uvádíme následující příklady provedení vynálezu, jejich účelem je vynález ilustrovat a nikoliv vymezovat jeho rozsah.

·♦ ·♦ • · · · • · ·« ♦ · · · · • * t * ·♦ ·«

• ·

Stručný popis obrázků

Obr. l:Obr. 1 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 1) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 2) lidského Aspl.

Obr. 2: Obr. 2 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 3) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 4) lidského Asp2(a).

Obr. 3: Obr. 3 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 5) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 6) lidského Asp2(b). Předpovězená transmembránová doména Hu-Asp2(b) je uzavřena v závorkách.

Obr. 4: Obr. 4 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 7) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 8) myšího Asp2(a).

Obr. 5: Obr. 5 ukazuje nejlepší přiložení a porovnání předpovězené aminokyselinové sekvence Hu-Asp2(a) a myšího Asp2(a).

Obr. 6: Obr. 6 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 21) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 22) T7-Human-pro-Asp-2(a)ATM.

Obr. 7: Obr. 7 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 23) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 24) T7-caspase-Human-pro-Asp-2(a)ATM.

Obr. 8: Obr. 8 ukazuje nukleotidovou (SEQ č. 25) a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 26) Human-pro-Asp-2(a)ATM (nízké GC).

Obr. 9: Western blot ukazující snížení CTF99 produkce HEK125.3 buňkami transfekovanými pozitivní oligomery proti Hu-Asp2 mRNA.

Obr. 10: Western blot ukazující zvýšení CTF99 produkce v myších Neuro-2a buněk kotransfekovaných s APP-KK a s a bez Hu-Asp2 pouze v těch buňkách kotransfekovaných s HuAsp2. Další zvýšení produkce CTF99 je patrné v buňkách kotransfekovaných s APP-Sw-KK s a bez Hu-Asp2 jen v těch buňkách kotransfekovaných Hu-Asp2.

Obr. 11: Obr. 11 ukazuje předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 30) HumanAsp-2(a)ATM.

Obr. 12: Obr. 12 ukazuje předpovězenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ č. 30) HumanAsp-2(a)ATM(His)6.

Příklady provedení vynálezu • 4 44 44 44 444 • 44 4 4 4 4 4 444 • φ 444 4 · 44 · ♦· • 4 4 4·· 44 444 44

4444 4444 444 • 4 44 44 44 ·«444

Příklad 1

Vývoj prohledávacího algoritmu vhodného pro identifikaci aspartylproteasy a identifikaci C. elegans aspartylproteasových genů v Wormpep 12:

Materiál a metody:

Klasické aspartylproteasy, například pepsin a renin mají dvojdoménovou strukturu, která je sbalena tak, že se dva aspartylové zbytky dostávají do blízkosti v aktivním centru. Jsou vloženy v krátkém tripeptidovém motivu DTG, nebo méně často DSG. DTG nebo DSG motivy aktivního místa se nalézají na zbytcích 25-30 tohoto enzymu, a asi 65-70 proenzymu (prorenin, pepsinogen). Znovu se tento motiv objevuje dále mezi zbytky 150-200. Proenzym je aktivován odštěpením N-terminální prodomény. Toto uspořádání ve dvojdoménové struktuře svědčí o tom, že dnešní aspartylproteasy vznikly genovou duplikací a divergencí. Tedy: NH₂---------X----------D²⁵TG----------Y---------D^y+25TG-------------C, kde X znamená začátek enzymu, následující po N-koncové prodoméně a Y znamená centrum molekuly, kde začíná repetice genu.

V případě retrovirových enzymů jako je HTV proteasa, se jedná pouze o polovinu dvojdoménové struktury dobře známých enzymů, jako je pepsin, katepsin D, renin, atd. Nemají žádný prosegment, jsou vyštěpeny z polypeptidového prekursoru obsahujícího gag a pol proteiny viru. Mohou být znázorněny:

NH₂---------D²⁵TG----------Cioo

Tento „monomer“ má jen asi 100 aminokyselin, je tedy extrémně úsporný v porovnání s jinými „dimerními“ aspartylproteasami, které mají tak asi 330 aminokyselin, nepočítaje N-terminální prodoménu.

Limitovaná délka aktivního místa eukaryotických aspartylproteas ztěžuje vyhledávání těchto sekvencí. EST sekvence typicky zahrnují 250 nukleotidů, v tomto případě je nepravděpodobné překlenout obě aspartylproteasová aktivní místa. Proto jsem se zaměřili na genom C.elegans. Genom C.elegans obsahuje asi 13000 genů. Asi 12000 z nich bylo sekvencováno a byly v nich vyznačeny hypotetické otevřené čtecí rámce (ORF) a uloženy v databázi Wormpepl2. Tato databáze byla použita jako základ pro vyhledávání nových eukaryotických aspartylproteas, pomocí algoritmu, který byl vyvinut specielně pro tento účel. Pro vyhledávání proteinů obsahujících dva DTG nebo DSG motivy byl použit následující AWK skript, ·«

·· • ·* •«4 • ·· • ♦· který byl čtyři krát opakován, aby byly odhaleny všechny párové kombinace aspartylového motivu.

BEGIN {RS=,,>“} /*definuje „>„ jako separátor záznamů pro FASTA formát*/ {

pos = index($0, „DTG“) /*najde ,J)TG“ v záznamu */ if(pos>0) { rest - substr($0,pos+3) /*načte zbytek záznamu za prvním DTG*/ pos2 = index(rest, „DTG“) /*najde druhý DTG záznam*/ if (pos2>0) printf(„%s%s\n“,“>„,$0)} /* zaznamená zásah*/ * · ec ·

Výše uvedený AWK skript byl použit pro prohledání Wormpepl2, který byl stáhnut z ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/wormpep, a nalezení sekvencí obsahujících alespoň dva DTG nebo DSG motivy. Použití AWK omezilo každý záznam na 3000 znaků nebo méně. Z tohoto důvodu bylo 35 větších záznamů eliminováno ručně ačkoli bylo nepravděpodobné, že by kódovaly aspartylproteasy.

Výsledky a diskuse:

Databáze Wormpepl2 obsahuje 12178 vstupů, ačkoliv některé z nich (<10%) představuje alternativní sestřihy transkriptů stejného genu. Bere-li se do úvahy počet genů kódovaných genomem C.elegans, který je v asi 13000, pokrývá Wormpepl2 více než 90% genomu C.elegans.

Eukaryotické aspartylproteasy mají dvojdoménovou strukturu, pravděpodobně vzniklou duplikací původního genu. Každá z domén obsahuje motiv aktivního místa D(S/T)G umístěný mezi zbytky 20-25 každé z domén. Retrovirové (například HIV proteasa) nebo retrotranspozomové proteasy jsou homodimery podjednotek, které jsou homologní s jednou eukaryotickou doménou aspartylproteasy. Pro prohledání databáze Wormpepl2 byl použit AWK skript pro nalezení proteinů, které obsahují alespoň dva D(S/T)G motivy. Takto bylo identifikováno více než 60 proteinů s dvěma DTG nebo DSG motivy. Tyto proteiny byly vizuálně posouzeny a bylo určeno zda nenaznačují, že by mohly mít dvojdoménovou strukturu popsanou výše.

Dále byl pro prohledání Wormpepl2 použit profil eukaryotického a virového aktivního místa aspartylproteasy PS00141 z databáze PROSÍTE. (Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., The *30 »· ♦ · ·♦ ·· ·♦· •JV φ · φ Φ · Φ * < ··· > · · Φ· · ♦ ♦♦♦ ♦ ·

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ· · · ·« φφ 4« ΦΦ « · Φ<Φ

PROSÍTE, stav v roce 1997, Nucleic Acid Res. 24:217-221(1997)). Takto jsou získány překrývající se sady sekvencí z Wormpepl2. Z těchto sekvencí 7 obsahovalo dva DTG, nebo DSG motivy a PROSÍTE profil aktivního místa aspartylproteasy. Z těchto sedmi tři byly nalezeny na stejném cosmidovém klonu (F21F8.3, F21F8.4, a F21F8.7) což naznačuje, že se jedná o rodinu proteinů, které vznikly duplikací původního genu. Další dva ORF s vysokou homologií k F21F8.3, F21F8.4 a F21F8.7 byly přítomny ve stejném genovém klastru F21F8.2 a F21F8.6), ale obsahovaly pouze jeden DTG motiv. Důkladné hledání těchto sekvencí programem BLAST v databázi Wormpepl2 nenalezlo žádného dalšího kandidáta aspartylproteasy v genomu C.elegans obsahujícího dvě opakování DTG nebo DSG motivů.

Porovnávání každé s C.elegans sekvencí BLASTX se sekvencemi v SWISS-PROT, GenPeP a TREMBL databázemi ukázalo, že nejbližší červí homolog se známou savčí aspartylproteasou je R12H7.2 a že poněkud vzdáleněji příbuzný je T18H9.2 zatímco CEAZP1, F21F8.3, F21F8.4 a F21F8.7 tvoří subklastr s nejmenší homologií se savčími sekvencemi. Diskuse:

APP, presenilin, a p35, aktivátor cdk5, procházejí oba intracelulámím proteolytickým zpracováním v místech, která odpovídají substrátové specificitě HIV proteázy. Deregulace buněčné aspartylproteasy se stejnou substrátovou specificitou může tedy poskytnout sjednocující mechanismus příčiny vzniku plakových a smotkových patologií u AD. Proto se snažíme identifikovat nové lidské aspartylproteasy. Snímání celého genomu C.elegans poskytlo identifikaci sedmi otevřených čtecích rámců, které vyhovují profilu aspartylproteasy, jak byl identifikován. Těchto sedm aspartylproteas pravděpodobně zahrnuje kompletní sadu těchto proteas v jednoduchém mnohobuněčném eukaryontním organismu. Tato sada zahrnuje čtyři blízce příbuzné aspartylproteasy specifické pro C.elegans, které pravděpodobně vznikly duplikací původního genu. Další tři kandidáti aspartylproteas (T18H9.2, R12H7.2 a C11D2.2) vykazují homologií se savčími genovými sekvencemi.

Příklad 2

Identifikace nových lidských aspartylproteas pomocí prohledávání databáze propojením genomu

Materiál a metody:

Počítačová analýza EST databází, cDNA a předpovězené polypeptidové sekvence:

Pátrám v EST databázi po homologií s CESZP1, F21F8.3, F21F8.4 a F21F8.7 sekvencemi nepřineslo výsledek v nalezení nějakého nového savčího homologu. TBLASTN prohledávání »*

44

4·

4·

4·

4«4

4 4 4 « ♦ « 4 44 • ♦4

4·

4«44

44«4

4 4·

444 • 4 4 44

4··

444 4 pomocí sekvence R12H7.2 nalezlo homologii s katepsinem D, katepsinem E, pepsinogenem A, pepsinogenem C a reninem, zvláště v okolí DTG motivu uvnitř aktivního místa, ale rovněž selhala v identifikaci nějaké nové savčí aspartylproteasy. To naznačuje, že genom C.elegans pravděpodobně obsahuje pouze jednu lysozomální aspartylproteasu, která je u savců reprezentována genovou rodinou, která vznikla duplikací a následnou modifikací původního genu.

TBLASTN prohledávání pomocí další C.elelgans sekvence T18H9.2 identifikovalo několik EST, které ukázaly na úsek kódující novou lidskou aspartylproteasu (Hu-Aspl). Jak již bylo uvedeno výše v příkladu 1, BLASTX prohledávání pomocí Hu-Aspl úseku v SWISS-PROT prokázalo, že motiv aktivního místa v této sekvenci je homologický s aktivními místy dalších aspartylproteas. Opakované BLASTN prohledávání LifeSeq, LifeSeqFL a veřejných EST kolekcí identifikovalo 102 sekvencí z cDNA knihoven, které byly sestaveny do jednoho souboru. 51

Sekvencí v tomto souboru nalezených ve veřejných EST kolekcí bylo rovněž sestaveno do jednoho souboru (THC213329) Institutem pro výzkum genomu (TIGR). TIGR anotace indikuje, že v databázi nebyla nalezena žádná dostatečná shoda s tímto souborem. Poznamenáváme, že TIGR soubor je reversním komplementem LifeSeq kontigu, který byl sestaven. BLASTN hledání HuASPl v krysích a myších EST sekvencích in ZooSeq nalezlo jeden homologický EST v každé databázi (Incyte klon 700311523 a IMAGE klon 313341, GenBank č. W1O53O respektive).

TBLASTN hledání sestavené DNA sekvence pro Hu-Aspl v LifeSeqFL a veřejných EST databázích identifikovalo další příbuznou lidskou sekvenci (Hu-Asp2) representovanou jedním EST (2696295). Translace této cDNA sekvence ukázalo jeden DTG motiv, který byl homologický s motivem aktivního místa hovězí aspartylproteasy, NM1.

BLAST prohledávání, sestavení souborů a mnohočetné porovnávání sekvencí bylo provedeno pomocí bioinformatických nástrojů poskytovaných LifeSeq, LifeSeqFL a LifeSeq Sestavené databáze od Incyte. Předpovězené motivy proteinů byly identifikovány buď pomocí ProSite (motivy v GCG 9), nebo databázi Pfam.

Klonování celé délky Hu-Aspl do cDNA.

Otevřený čtecí rámec C.elegans genu T18H9.2CE byl použit pro prohledání LifeSeq a LifeSeq-FL databází a tak byl detekován úsek označený jako 1863920CE1. cDNA na samém 5'konci tohoto kontigu, 1863920, byl získán od Incyte a kompletně sekvencován na obou řetězcích. Translace otevřeného čtecího rámce obsaženého uvnitř klonu 1863920 ukázala přítomnost duplikované aspartylproteasy s motivem aktivního místa (DTG/DSG), ale 5' konec byl neúplný. Zbytek Hu-Aspl sekvence byl stanoven 5'Marathon Race analysou pomocí lidského ·· · · • · ♦·· • » « ·· *· • · ♦» • ·

·♦ ♦ placentámího Marathon předpřipraveného cDNA templátu (Clonetech). 3 '-pozitivní oligonukleotidový příměr specifický pro 5'konec klonu 1863920 byl použit spolu s 5' negativní primerem specifickým pro Marathon předpřipravený cDNA syntetický adaptor při PCR. Specifické PCR produkty byly přímo sekvencovány cyklickým sekvencováním a výsledná sekvence byla sestavena ze sekvence klonu 1863920 za získání kompletní sekvence kódující HuAspl (SEQIDč.l).

Primární aminokyselinová sekvence Hu-Aspl obsahuje několik zajímavých rysů (obr. 1, SEQ č. 2). Sekvence obsahuje signální peptid (zbytky 1-20 v SEQ ID č.2), a pro-segment a katalytickou doménu obsahující dvě kopie motivu aktivního místa aspartylproteasy (DTG/DSG). Prostor mezi prvním a druhým motivem aktivního místa je asi 200 zbytků, což by mělo odpovídat očekávané velikosti jedné domény eukaryotické aspartylproteasy. Zajímavější je, že sekvence obsahuje předpovězenou transmembránovou doménu (zbytky 469-492 v SEQ č. 2) blízko svého C-konce, což naznačuje, že proteasa je zakotvena v membráně. Tento znak nebyl nalezen v žádné jiné aspartylprotease.

Klonování plné délky Hu-Asp-2 cDNA:

Jak je popsáno výše v příkladu 1, poskytlo široké prozkoumávání genomu Caenorhabditis elegans v databázi Wormpepl2 a hledání případné aspartylproteasy a následné prohledávání lidské EST databáze lidský protějšek C.elegans genu T18H9.2, kteiý byl označen jako Hu-Aspl. Sestavený úsek Hu-Aspl byl použit pro hledání příbuzných sekvencí pomocí nástroje BLAST v lidských EST databázích a byla nalezena jedna sekvence (269625CE1) s přibližně 60% identitou v LifeFL databázi. Podobné klíče v gbl05PubEST nebo lidských databází dostupných od TIGR neidentifikovalo podobný EST klon. cDNA klon 2696295 identifikovaný jednoduchou sekvenční analysou z lidské děložní cDNA knihovny, byl získán od Incyte oba jeho řetězce byly kompletně sekvencovány. Tento klon obsahoval neúplný 1266bp otevřený čtecí rámec, který kóduje 422 aminokyselinový polypeptid, ale postrádá iniciační ATG na 5'konci. Zkoumám předpovězené sekvence ukázalo přítomnost duplikovaných míst aspartylproteasy DTG/DSG oddělených 194 aminokyselinami. Následné vyhledávání zmíněné sekvence poskytlo v LifeSeq EST databázi další EST sekvence z cDNA knihovny lidských astrocytů (4386993), kde byly nalezeny další 5 sekvence příbuzné klonu 2696295. Klon 4386993 byl získán od Incyte a oba jeho řetězce byly kompletně sekvencovány. Srovnání klonu 4386993 a klonu 2696295 potvrdilo, že klon 4386993 přesahuje otevřený čtecí rámec 31 aminokyselinami včetně dvou in-frame translačních iniciačních kodonů. Přes přítomnost dvou in-frame ATG nebyl nalezen žádný in-frame stop kodon upstream

9 · 9 »·»····· • · ··· · · ·* · ·· > · · » · · ♦ · · · ♦ ·· « « · · <♦·· ··· • Q ·* ·♦ *♦ ···· od ATG, což by indikovalo, že 4386993 nemá plnou délku. Dále srovnání sekvencí klonů 2696295 a 4386993 ukázalo inserci 25 aminokyselinových zbytků v 2696295. Zbývající Hu-Asp2 kódující sekvence byla určena 5' Marathon RACE analysou pomocí lidského hypokampového Marathon předpřipraveného cDNA templátu (Clontech). 3'Pozitivní oligonukleotidový primer specifický pro společný 5'úsek klonů 2696295 a 4386993 byl použit spolu s 5'negativním primerem specifickým pro Marathon předpřipravený cDNA syntetický adaptor pro PCR. Specifické PCR produkty byly přímo sekvencovány cyklickým sekvencováním a výsledná sekvence byla sestavena se sekvencemi klonů 2696295 a 4386993 ze získání kompletní kódující sekvence Hu-Asp2(a) (obr. 2 a SEQ č.3) a Hu-Asp2(b) (obr. 3, SEQ č. 6). Obě sekvence obsahují signální peptid (zbytky 1-21 v SEQ č. 4 a SEQ a SEQ č. 6), pro-segment a katalytickou doménu obsahující dvě kopie motivu aktivního místa katalytické domény aspartylproteasy (DTGZDSG). První a druhý motiv aktivního místa je odděleno úsekem různě dlouhým pro 25 aminokyselinovou deleci v Hu-Asp2(b), který obsahuje 168, nebo 194 aminokyselinových zbytků pro Hu-Asp2(b) respektive Hu-Asp2(a). Zajímavější je, že obě sekvence obsahují předpovězenou transmembránovou doménu (zbytky 455-477 v SEQ č. 4 a 430-452 v SEQ č. 6) blízko svého Ckonce, což naznačuje, že proteasa je zakotvena v membráně. Tento znak nebyl nalezen v žádné jiné aspartylprotease kromě Hu-Aspl.

Příklad 3

Molekulární klonování myší ASP2 cDNA a genomové DNA.

Klonování a charakterizace myší ASP2 cDNA.

Myší ortolog Hu-Asp2 byl klonován pomocí kombinace snímání (screeningu) cDNA knihovny, PCR a genomového klonování. Bylo prohledáno přibližně 500 000 nezávislých klonů z cDNA knihovny myšího mozku pomocí ³²P značené sekvenční sondy připravené z Hu-Asp2. Pozitivní klony byly podrobeny sekvenční analyse a nejdelší cDNA obsahoval kompletní 3 nepřekládaný region a 47 aminokyselin z kódující oblasti. PCR amplifikace stejné myší mozkové cDNA knihovny s pozitivním oligonukleotidovým primerem specifickým pro 5 nejzažší oblast cDNA sekvence stanovenou výše a negativní primer specifický pro 5' region lidské Asp2 sekvence následovaná DNA sekvenční analýzou poskytla dalších 980 pb kódující sekvence. Zbývající 5'sekvence myší Asp2 byla odvozena z genomické sekvence (viz níže).

··· ········ • · ··· · · ·· · ·· « · · · · · · · ··· ·· • · · · ···· · ·· ·· ·« -»♦ ·· ·· ··· Isolace a sekvenční analysa myšího Asp2 genu.

Myší EST sekvence kódující část myší Asp2 cDNA byla identifikována v GenBank EST databáze pomocí prohledávacího nástroje BLAST s Hu-Asp2 kódující sekvencí jako klíčem. Klon g3160898 vykazoval 88% homologii s lidskou sekvencí v rozsahu 352 pb.

Poté byl syntetizován pár oligonukleotidových primerů specifických pro tento region myší Asp2 a použit pro amplifikaci regionů myšího genu. Myší genomová DNA odvozená od kmene 129/SvJ byla amplifikována v PCR (25 cyklů) pomocí různých sad primerů specifických pro myší Asp2 a produkty byly analyzovány elektroforesou na agarosovém gelu. Set primerů Zoo-1 a Zoo-4 amplifikoval 750 bp fragment obsahující přibližně 600 bp sekvence intronu zjištěného na základě porovnání se známou cDNA sekvencí. Tato sada primerů byla poté použita pro prohledání myší BAC knihovny pomocí PCR, byl izolován jediný genomický klon a bylo zjištěno, pomocí DNA sekvenční analysy, že obsahuje myší Asp2 gen. DNA sekvencování tohoto Asp2 genomického klonu a srovnání s cDNA sekvencemi obou Hu-Asp2 a částí myší cDNA sekvencí poskytlo plnou délku sekvence myší Asp2 (SEQ č. 7). Předpovězená aminokyselinová sekvence myší Asp2 (SEQ č. 8) vykazuje 96,4% identitu (GCG BestFit algoritmus) s 15/501 aminokyselinovými substitucemi v porovnání s lidskou sekvencí (obr. 4).

Přiklad 4

Distribuce exprese Hu-Asp2 transkriptů ve tkáních.

Materiál a metody:

Distribuce exprese Hu-Asp2 transkriptů ve tkáních byla stanovena pomocí mnohonásobných Nothem blotů získaných od Clonetech (Palo Alto, CA). Klon Incyte 2696295 ve vektoru pINCY byl štěpen EcoRI/Notl a 1.8 kb cDNA insert byl purifikován pomocí preparativní elektroforesy v agarosovém gelu. Tento fragment byl radioaktivně označen na specifickou aktivitu > 1 x 10⁹ dpm/pg náhodným prodloužením v přítomnosti [a³²P-dATP] (>3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) a Klenowova fragmentu DNA polymerasy I. Nylonové filtry obsahující denaturovanou, podle velikosti rozdělené póly A⁺RNA izolované z různých lidských tkání byly hybridizovány s 2 x 10⁶ dpm/ml sondou v ExpressHyb pufřu (ClonTech, Palo Alto, CA) po 1 hodinu při 68 °C a promyty podle doporučení výrobce. Hybridizační signály byly vizualizovány autoradiografií pomocí BioMax XR filmu (Kodak, Rochester, NY) při -80 °C.

• · · · · · ···· · • · · ··· ·· · ·· · • · · · · · · ··· • · · · ·· · ·· ·

Výsledky a diskuse:

Byly získány pouze omezené informace o distribuci exprese Hu-Asp2 transkriptů ve tkáních z důvodů relativně malého počtu EST detekovaných pomocí metod popsaných výše (<5). Ve snaze získat další informace o expresi Hu-Asp2 genu byla použita Nothem analysa pro stanovení velikostí a zastoupení Hu-Asp2 transkriptů. PolyAŮRNA byly izolovány ze série periferních tkání a oblastí mozku a poté byly po separaci za denaturačních podmínek na pevném nosiči vizualizovány Hu-Asp2 transkripty pomocí hybridizace z radioaktivně značeným insertem klonu 2696259 za přísných podmínek. 2696295 cDNA sonda ukázala trankripty pohybující se zdánlivými velikostmi 3,0 kb, 4,4 kb a 8,0 kb, kde poslední dva transkripty byly nejvýraznější.

Ve zkoumaných tkáních byly Hu-Asp transkripty nejhojnější v pankreatu a mozku s nižšími, ale detekovatelnými hladinami ve všech dalších tkáních kromě thymu a PBL tkání. Po zjištění relativní hojnosti Hu-Asp2 transkriptů v mozku byla stanovena také exprese v jednotlivých oblastech mozku. Podobná konstalace velikostí transkriptů byla detekována ve všech zkoumaných oblastech mozku (cerebellum, mozková kůra, okcipitální pole, čelní lalok, spánkový lalok a putamen) s nejvyšší přítomností v medulla a prodloužené míše.

Příklad 5

Detekce Hu-Asp 1 a Hu-Asp2 transkriptů pomocí Nothem blotu u lidí

Buněčné linie:

Různé lidské buněčné linie byly testovány na schopnost produkce Hu-Asp 1 a Hu-Asp2 mRNA. Z ATCC byly získány lidské embryonální ledvinové buňky (HEK-293), buňky africké zelené opice (Cos-7), ovariální buňky čínského křečka (CHO), Hela buňky a linie neuroblastomových buněk IMR-32. Buňky byly kultivovány v DME obsahujícím 10% FCS, kromě CHO buněk, které byly udržovány v a-MEM/10% FCS při 37 °C v 5% CO₂ dokud téměř nesrostly. Promyté monovrstvy buněk (3 x 10⁷) byly zlyzovány na miskách a polyA RNA byla extrahována pomocí Qiagen Oligotes Direct mRNA kitu. Vzorky obsahující 2 pg póly A RNA z každé buněčné linie byly frakcionovány za denaturačních podmínek (glyoxal), přeneseny na pevný podklad z nylonové membrány pomocí kapilárních sil a transkripty byly vizualizovány hybridizací se značenou (³²P) kódující sekvenční sondou odvozenou buď z Hu-Asp 1, nebo Hu-Asp2. Radioaktivní signály byly detekovány pomocí rentgenového filmu a analýzy obrazu ve Phosphorlmageru.

Hu-Asp 1 cDNA sonda vizualizovala podobnou sestavu transkriptů (2,6 kb a 3,5 kb), které byly dříve detekovány v lidských tkáních. Relativní zastoupení stanovené kvantifikací radioaktivního signálu bylo Cos-7>HEK 292 = HELA > IMR32.

Hu-Asp2 cDNA sonda také zobrazila podobnou sestavu transkriptů ve srovnání z tkáněmi (3,0 kb, 4,4 kb a 8,0 kb) s následujícím relativním zastoupením HEK 293 > Cos 7 > IMR 32 > HELA.

Příklad 6

Modifikace APP pro vedoucí ke zvýšení Αβ zpracování pro in vitro screening

Lidské buněčné linie, které vyštěpují Αβ peptid z APP poskytují nástroj pro stanovení a vyhledávání inhibitorů β- a γ- sekretas. Produkce a uvolnění Αβ peptidu do supematantu kultury je monitorováno enzymovým imuno stanovením (EIA). Ačkoliv se exprese APP objevuje v širokém spektru buněk a zpracování a uvolňování Αβ peptidu je uskutečňováno jak v neurálních tak v buněčných liniích, které neuronálními nejsou, jsou endogenní hladiny APP zpracování nízké a je obtížné je detekovat pomocí EIA. Αβ zpracování může být zvýšen exprimováním APP v mutantních buněčných liniích, což zvyšuje Αβ zpracování. Zjistili jsme, že přidání dvou lysinových zbytků na karboxykonec APP695 zvýší Αβ zpracování. Umožnilo nám to vytvořit transformovanou buněčnou linii, která uvolňuje Αβ peptid do kultivačního média v pozoruhodném množství 20 000 pg/ml.

Materiál a metody

Materiál:

Lidské embryonální ledvinové buňky linie 293 (HEK293 buňky) byly získány z interních zdrojů. Vektor pIRES-EGFP byl zajištěn od ClonTech. Oligonukleotidy pro mutace pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) byly zajištěny od Genosys. Plasmid obsahující lidský APP695 (SEQ č. 9 [nukleotidy] a SEQ č. 10 [aminokyseliny]) byl získán od Northwestem University Medical School. Byl klonován do pSK (Stratagene) do Notl místa za vzniku plasmidu pAPP695.

Postup mutagenese:

Švédská mutace (K670N, M671L) byla vložena do pAPP695 pomocí Stratagene Quick Change Mutagenesis Kit za vzniku plasmidu pAPP695NL (SEQ č. 11 [nukleotidy] a SEQ č. 12 [aminokyseliny]). Pro vložení di-lysinového motivu na C-konec APP695 byl použit původní primer č.276 5' GACTGACCACTCGACCAGGTTC (SEQ č. 47) spolu s „opravovacím“ primerem č.274 5' CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTACTTCTTGTTCTGCATCTCA37 ·♦ ·· ·» ·· ·· * ··· ······· • ···· · ··· * · • · · · · · · · · · · · ···· ···· · · ·· · · · · · · · · ·

AAGAAC (SEQ č. 48) a hraničním primerem č. 275 CGAATTAAATTCCAGCACTGGCTA (SEQ č. 49), čímž došlo k modifikaci 3' konce APP695 cDNA (SEQ č. 15 [nukleotidy] a SEQ č.

[aminokyseliny]). Tak bylo zároveň přidáno BstXl restrikční místo, které bude kompaktibilní s BstXl místem v mnohonásobném klonovacím místě pIRES-EGFP. PCR amplifikace byla provedena pomocí ClonTech HF Advantage cDNA PCR křtu pomocí polymerásového mixu a pufrů dodaných výrobcem. Pro „opravovací“ PCR byl opravovací primer použit v koncentraci 1/20 molámí koncentrace ohraničujících primerů. PCR amplifikační produkty byly purifikovány pomocí QIAquick PCR purifikačního kitu (Qiagen). Po štěpení restrikčními enzymy byly produkty separovány v 0,8% agarosovém gelu a poté byly vyštěpené DNA fragmenty purifikovány pomocí QIAquick gel extrakčního kitu (Qiagen).

Pro znovu sestavení modifikované APP695-SW cDNA byl získán Notl-Bgl2 fragment APP695-Sw cDNA a pomocí PCR 3 'Bgl2-BstXl APP695 cDNA fragment a tyto byly ligovány do pIRES-EGFP plasmidové DNA otevřené v Notl a BsXl místech. Ligace byly prováděny 5 minut při pokojové teplotě pomocí sady Rapid DNA Ligation (Boehringer Mannheim) a transformovány do Library Efficiency DH5a kompetentních buněk (GibcoBRL-Life Technologies). Bakteriální kolonie byly testovány na přítomnost insertu pomocí PCR amplifikace s primery č.276 a č.275. Plasmidová DNA byla purifikována pro trasfekci savčích buněk pomocí sady QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Získaný konstrukt byl označen pMG125.3 (APPSW-KK, SEQ č. 17 [nukleotidová] a SEQ č. 18 [aminokyselinová]).

Transfekce savčích buněk:

HEK293 buňky pro transfekci byly napěstovány do 80 % srůstu v Dulbecco modifikovaném Eagle médiu (DMEM) s 10% fetálním hovězím sérem. Kotransfekce byly provedeny pomocí LipofectAmine (Gibco-BRL) s 3 pg pMG125.3 DNA a 9 pg pcDNA3.1 DNA na 10 x 10⁶ buněk. Tři dny po transfekci byly buňky přeneseny do média obsahujícího G418 v koncentraci 400 pg/ml. Po třech dnech růstu v selektivním médiu byly buňky rozděleny podle jejich fluorescence.

Klonální selekce 125.3 buněk pomocí FACS:

Vzorky buněk byly analyzovány na EPICS Elitě ESP průtokovém cytometru (Coulter, Hialeah, FL) vybaveným vzduchem chlazeným argonovým laserem s 488 nm excitační linií. EGFP emise byla měřena za 525 nm filtrem a intensita fluorescence byla zobrazována na přes 4 řády jdoucí logaritmické stupnice po oddělení živých buněk stanovených přímým a pravoúhlým • · · ···· ·· · • · · · · · · · · ·· • · · · · · « · · · ·· ···· ·«···· • · ·· · · «· ·· · rozptylem. Jednotlivé zelené buňky byly rozděleny do každé s 96 jamek destičky obsahující růstové médium s G418. Po čtyřech dnech bylo G418 přidáno do média na konečnou koncentraci 400 pg/ml. Po selekci obsahovalo 32 % jamek expandující klony. Jamky s klony byly z 96 jamkové destičky přeneseny na 24 jamkovou destičku a poté nejrychleji rostoucí kolonie na 6 jamkovou destičku. Konečná vybraná buněčná linie byla ta nejrychleji rostoucí z 6 klonů. Tento klon označený 125.3 byl udržován v G418 o koncentraci 400 pg/ml a každé 4 dny přenášen do čerstvého média. Nebyla pozorována žádní ztráta Αβ produkce podle EGFP fluorescence během 23 přepasážování.

Αβ EIA analysa (sendvičová ELISA s dvojí protilátkou pro ΙιΑβ 1-40/42):

Supematanty sklizené 48 hodin po transfekci byly analyzovány v standardní Αβ EIA, jak je popsáno dále. Lidský Αβ 1-40, nebo 1-42 byl stanoven pomocí monoklonální protilátky (mAb) 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) a biotinované králičím antisérem 162, nebo 164 (New York Statě institute for Basic Research, Staten Island, NY) v ELISA s dvojí protilátkou. Vazná protilátka 6E10 je specifická k epitopu přítomném na N-koncových aminokyselinách 1-16 ΙιΑβ. Konjugované detekční protilátky 162 a 164 jsou specifické pro ΙιΑβ 1-40 respektive 1-42. Ve stručnosti, Nunc Maxisorp 96 jamková imunodestička byla pokryta ΙΟΟμΙ/jamku mAb 6E10 (5 pg/ml) zředěnou v 0,1 M uhličitanový pufr, pH 9,6 a inkubována při 4 °C přes noc. Po promytí destičky 3 podíly 0,01 M DPBS (Modifikovaný Dubelcco PBS (0,008 M fosforečnan sodný, 0,002 M fosforečnan draselný, 0,14 M chlorid sodný, 0,01 M chlorid draselný, pH 7,4) od Pierce, Rockford, II) obsahujícího 0,05% Tween-20 (DPBST), byla miska blokována 60 min 200 μΐ 10% normálního ovčího séra (Sigma) v 0,01 DPBS, aby byla vyloučena nespecifická vazba. Lidský Αβ 1-40, nebo 1-42 jako standardy ΙΟΟμΙ/jamka (Bachem, Torrance, CA) zředěné ze zásobního roztoku v DMSO v kultivačním médiu byly přidány po promytí destičky, stejně jako 100 pFjamku vzorku, například upravené médium transfekovaných buněk. Destička byla inkubována 2 hodiny za pokojové teploty a při 4 °C přes noc. Další den, po promytí destičky, bylo přidáno 100 μΐ/jamku biotinylovaného králičího antiséra zředěného 162 1:400, nebo 164 1:50 v DPBST + 0,5% BSA a inkubováno při pokojové teplotě 1 hodinu 15 minut. Následovalo promytí 100 μΐ/jamku neutravidin-křenová peroxidasa (Pierce, Rockford, II) zředěný 1:10000 v DPBST s inkubací 1 hodinu při pokojové teplotě. Po posledním promytí byl přidán jako substrát 100 μΐ/jamku o-fenylendiaminu dihydrochloridu (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), v 50 mM kyselině citrónové a 100 mM sodném fosfátovém pufru (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), pH

5,0 mM vytvořené zbarvení bylo monitorováno při 450 nm na kinetické čtečce mikrodestiček 20 minut pomocí Soft max Pro software. Všechny standardy a vzorky byly provedeny třikrát vedle sebe. Vzorky jejichž absorbance spadala do rozsahu kalibrační křivky byly vyhodnoceny pomocí Soft max Pro software a vyjádřena pg/ml v kultivačním médiu.

Výsledky:

Přidání dvou lysinů na karboxy-konec APP695 velmi zvýšilo Αβ zpracování v HEK293 buňkách (tabulka 1). Přidání di-lysinového motivu do APP695 zvyšuje Αβ zpracování na hladinu pozorovanou u APP695 obsahujícím švédskou mutaci. Kombinace di-lysinového motivu se švédskou mutací dále zvyšuje zpracování asi 2,8 krát.

Kotransformace HEK293 buněk pomocí pMG125.3 a pcDNA3.1 umožnila dvojí selekci transformovaných buněk na resistenci ke G418 a vysokou hladinu exprese EGFP. Po selekci klonů pomocí FACS produkovala získaná buněčná linie pozoruhodných 20 000 pg Αβ peptidu na ml kultivačního média po 36 hodinovém růstu na 24 jamkových destičkách. Produkce Αβ peptidu za různých podmínek je shrnuta v tabulce 2.

Tabulka 1. Uvolnění Αβ peptidu do kultivačního média 48 hodin po přechodné transfekci HEK293 buněk pomocí uvedeného vektoru obsahujícího divoký, nebo modifikovaný APP. Hodnoty jsou průměry + SD a P-hodnoty pro párové srovnání pomocí Studentova t-testu, kde je brána do úvahy neshodná variabilita.

APP konstrukt	Αβ 1-40 peptid (pg/ml)	Násobek zvýšení	P-hodnota
pIRES-EGFP vektor	147+28	1,0
wt APP695 (142.3)	194+15	1,3	0,051
wt APP695-KK (124.1)	424+34	2,8	3 x 10-5
APP695-Sw (143.3)	457+65	3,1	2 x 10-3
APP695-SwKK (125.3)	1308+98	8,9	3 x 10-4

• · · · ·· ·· 9 9 • 99 9 9 9 9 · 9 9 • · · ·· ···· · *

Tabulka 2. Uvolnění Αβ peptidu z HEK125.3 buněk za různých růstových podmínek.

Typ kultivační destičky	Objem média	Trvání kultivace	Ab 1-40 (pg/ml)	Ab 1-42 (pg/ml)
24 jamková	400 μΐ	36 hodin	28,036	1,439

Příklad 7

Pozitivní oligomer inhibice Abeta zpracování v HEK125.3 buňkách

Sekvence Hu-Asp 1 a Hu-Asp2 byly poskytnuty Sequitur, lne (Natick, MA) pro selekci cílených sekvencí a design druhé generace chimérických pozitvních oligomerů pomocí chráněné technologie (Sequitur Ver.D Pat pending č.3002). Pozitivní oligomeiy Lotě. S644, S645, S646 a S647 byly cíleny proti Aspl. Pozitivní oligomery Lotě. S648, S649, S650 a S651 byly cíleny proti Asp2. Kontrolní pozitivní oligomery Lotě. S652, S653, S654 a S655 byly cíleny proti irelevantnímu genu a pozitivní oligomery Lotě. S648, S649, S650 a S651 byly cíleny proti druhému irelevantnímu genu.

Pro transfekci s pozitivními oligomery byly HEK125.3 buňky napěstovány asi do 50 % srůstu na 6 jamkových destičkách v minimálním esenciálním médiu (MEM) obohaceném 10% fetálním telecím sérem. Zásobní roztok oligofektinu G (Sequitur lne., Natick, MA) o koncentraci 2 mg/ml bylo zředěno na 50 pg/ml v MEM bez séra. Odděleně byl naředěn 100 μΜ zásobní roztok pozitivních oligomerů a to na 800 nM v Opti-MEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY). Zředěné zásobní roztoky oligofektinu G a pozitivního oligomerů byly poté smíchány v poměru 1:1 a inkubovány za pokojové teploty. Po 15 minutách inkubace byly činidla zředěny lOkrát v MEM obsahujícího 10% fetálního telecího séra a 2 ml tohoto roztoku bylo přidáno do každé jamky 6 jamkové destičky odkud bylo před tím odstraněno staré médium. Po transfekci byly buňky kultivovány za stálé přítomnosti oligofektinu G/pozitivního oligomerů. Pro sledování uvolňování Ab peptidu byly z upraveného média periodicky odebírány podíly 400 μΐ a nahrazovány čerstvým médiem, to vše počínaje 24 hodinami po transfekci. Uváděná data pocházejí ze supematantů kultur sklizených 48 hodin po transfekci.

Výsledky:

Šestnáct různých oligomerů získaných z Sequirur lne bylo transfekováno odděleně do HEK125.3, aby bylo možno stanovit jejich účinek na Αβ zpracování peptidů. Pouze pozitivní oligomery cílené proti Aspl a Asp2 snižovaly Abeta zpracování v HEK125.3 buňkách, přičemž ty, které jsou zaměřeny proti Asp2 mají větší inhibiční účinek. Jak Αβ (1-40) a Αβ (1-42) byly inhibovány se stejnou intenzitou. V tabulce 3 jsou vypočítána procenta inhibice v porovnání s

• 4 • 4 4 ·	* ♦ · * 4 4 44	♦ «44 4 4 4
4 4	44 ·♦	4 · 4 4

• 4 netransfekovanými buňkami. Pozitivní oligomemí reagenty vykazující větší než 50% inhibici jsou označeny hvězdičkou. Z testovaných reagentů, 3 ze 4 pozitivních oligomerů cílených proti ASP1 vykazovalo průměrně 52% inhibici Αβ 1-40 zpracování a 47% inhibici Αβ 1-42 zpracování. Pro ASP2, 4 ze 4 pozitivních oligomerů cílených proti ASP1 vykazovalo větší než 50% inhibici s průměrnou inhibici 62% pro Αβ 1-40 zpracování a 60% inhibici pro Αβ 1-42 zpracování.

Tabulka 3

Inhibice uvolňování Αβ peptidu z HEK125.3 buněk, na které je působeno pozitivními oligomery.

Cílový gen	pozitivní oligomer	Abeta (1-40)	Abeta (1-42)
Aspl-1	S644	62%*	56%
Aspl-2	S645	41%*	38%
Aspl-3	S646	52%*	46%
Aspl-4	S647	6%	25%
Asp2-1	S648	71%*	67%
Asp2-2	S649	83%*	76%
Asp2-3	S650	46%*	50%
Asp2-4	S651	47%*	46%
Conl-1	S652	13%	18%
Conl-2	S653	35%	30%
Conl-3	S655	9%	18%
Conl-4	S674	29%	18%
Con2-1	S656	12%	18%
Con2-2	S657	16%	19%
Con2-3	S658	8%	35%
Con2-4	S659	3%	18%

Příklad 8

Demonstrace Hu-Asp2 β-sekretasové aktivity v kultivovaných buňkách

Bylo ukázáno, že několik mutací APP asociovaných s časným nástupem Alzheimerovy choroby ovlivňuje Αβ zpracování. Ten se týká N- a C- terminálních štěpných míst, která uvolňují v

Αβ APP. Tato štěpná místa jsou označovaná jako β sekretasová respektive γ sekretasová. Štěpení APP v β sekretasovém štěpném místě vede k vytvoření C-terminálního fragmentu APP

4 · ·	• · · ·	• 9 99
• · · · ·	• · ··	• 99
·· · ·	• · ··	• » · · ·

obsahujícího 99 aminokyselin s molekulovou hmotností 11 145 daltonů. Tzv. Švédská KM—>NL mutace ihned upstream β sekretázového štěpného místa způsobuje významné zvýšení tvorby jak 1-40 tak 1-42 aminokyselinové formy Αβ peptidu. Tzv. Londýnská VF mutace (V717->F v izoformě APP770) má malý vliv na celkovou tvorbu Αβ peptidu, ale zvyšuje procentuální zastoupení delšího 1-42 aminokyselinové formy Αβ peptidu ovlivněním výběru γ-sekretasového štěpného místa použitého během APP zpracování. Bylo stanoveno, zda tyto mutace ovlivňují množství a typ produkovaného Αβ peptidu produkovaného kultivovanými buňkami kotransfekovanými konstruktem řídícím expresi Hu-Asp2.

Byly provedeny experimenty, které demonstrovaly Hu-Asp2 β-sekretasovou aktivitu kultivovaných buněk. V prvním experimentu bylo ukázáno, že působením pozitivních oligomerů proti Hu-Asp2 transkriptům na HEK125.3 buňky, jak je to popsáno v příkladu 7 dochází k poklesu množství C-terminálního fragmentu APP tvořeného β-sekretasovým štěpením (CTF99) (Obr. 9). To ukazuje, že Hu-Asp2 působí přímo nebo nepřímo na uskutečnění β sekretázového štěpení. Ve druhém experimentu bylo ukázáno, že zvýšená exprese Hu-Asp2 v transfekovaných myších Neuro2A buňkách zvyšuje akumulaci CTF99 β-sektretasového štěpného fragmentu (Obr. 10). Toto zvýšení je nejlépe patrné, je-li pro transfekci použit mutantní APP-KK klon obsahující C-terminální di-lysinový motiv. Další zvýšení je pozorováno, je-li Hu-Asp2 kotransfekován s APP-Sw-KK obsahujícím Švédskou mutaci KM-NL. Švédská mutace zvyšuje štěpení APP β-sekretasou.

Druhá sada experimentů ukázala, že Hu-Asp2 zprostředkuje γ sekretasovou aktivitu v experimentech s kotransfekovanými embryonálními ledvinovými HEK293 buňkami. Kotransfekce Hu-Asp2 s APP-KK klonem výrazně zvyšuje produkci a uvolňování rozpustných Αβ1-40 a Αβί-42 peptidů z HEK293 buněk. Je zde patrné proporcionálně větší zvýšení uvolňování Αβ1-42. Další zvýšení produkce Αβ1-42 je pozorováno, je-li Hu-Asp 1 kostransfekován s APP-VF (SEQ ID č. 13 [nukleotidová] a SEQ ID č. 14 [aminokyselinová]) nebo s APP-VF-KK (SEQ ID č. 19 [nukleotidová] a SEQ ID č. 20 [aminokyselinová]) klonem nesoucím Londýnskou mutaci V717—>F. Je známo, že V717—>F mutace ovlivňuje specifické γ sekretasové štěpení APP, takže je zvýšeno štěpení na Αβ42 štěpném místě. Asp2 tedy působí přímo nebo nepřímo na usnadnění γ-sekretasového zpracování APP na β42 štěpném místě.

Materiál

Protilátky 6E10 a 4G8 byly získány od Senetek (St. Louis, MO). Protilátka 369 byla získána z laboratoře Paula Greengarda na Rockefellerově Universitě. Protilátka 08 bylo získáno z laboratoře Dennise Selkoe na Harvard Medical School a Brigham a Ženské nemocnici.

Použité APP konstrukty

APP konstrukty použité pro transfekční experimenty zahrnovaly:

APP	divoký typ APP695 (SEQ ID č. 9 a č. 10)
APP-Sw	APP695 obsahující Švédskou KM-^NL mutaci (SEQ ID č. 11 a č. 12),
APP-VF	APP695 obsahující Londýnskou V-»F mutaci (SEQ ID č. 13 a č. 14),
APP-KK	APP695 obsahující C-terminální KK motiv (SEQ ID č. 15 a č. 16),

APP-Sw-KK APP695-Sw obsahující C-terminální KK motiv (SEQ ID č. 17 a č. 18),

APP-VF-KK APP695-VF obsahující C-terminální KK motiv (SEQ ID č. 19 a ě. 20),

Tyto kostrukty byly vloženy do vektoru pIRES-EGFP (Clontech, Palo Alto CA) mezi

Notl a BstXl místa pomocí vhodné sekvence spojovníku vložené pomocí PCR

Transfekce pozitivních oligomerových nebo plasmidových DNA konstruktů v HEK293 buňkách, HEK125.3 buňkách a Neuro-2A buňkách.

Lidské embryonální ledvinové HEK293 buňky a myší Neuro-2a buňky byly transfekovány expresními konstrukty pomocí Lipofectamine Plus reagentu od Gibco/BRL. Buňky byly vysety na 24 jamkovou destičku pro tkáňové kultury na hustotu 70 až 80 % srůstu. Čtyři jamky na destičku byly transfekovány 2 pg DNA (3:1, APP:kotransfektant), 8 μΐ Plus reagentu a 4 μΐ Lipofectaminu v OptiMEM. OptiMEM bylo přidáno na konečný objem 1 ml, rozděleno do jamek, 200 μΐ na jamku, a inkubováno 3 hodiny. Byl kladen důraz na dodržení konstantního poměru dvou plasmidů použitých pro kotransfekci a celkového množství DNA použité pro kotransfekci. Transfekční médium bylo nahrazeno DMEM, 10% FBS, Na-pyruvátem s antibiotiky/antimykotiky a buňky byly inkubovány za normálních podmínek (37 °C, 5% CO₂) po 48 hodin. Upravené médium bylo přeneseno do polypropylenových zkumavek a uchováváno při -80 °C až do stanovení obsahu Αβ1-40 a Αβ1-42 pomocí EIA, jak je popsáno v předchozích příkladech. Transfekce pozitivních oligomerů do HEK125.3 buněk byla provedena, jak je popsáno v příkladu 7.

·· ·· *· «« ·· • ♦ · ···· ♦ « · • · · · · · ··· ·· ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

99 99 999*9

Příprava buněčných extraktů, Western blot protokol

Buňky byly sklizeny asi 60 hodin po transfekci plasmidovou DNA. Nejprve byly buňky přeneseny z destiček do 15-ml kónických zkumavek a centrifugovány při 1 500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut, aby bylo odstraněno médium. Pelety buněk byly jednou promyty PBS. Poté jsme lyžovaly buňky lyžujícím pufrem (10 mM HEPES, pH 7,9, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,1 mM vanadičnan sodný a 1% NP-40). Směsi lyžovaných buněk byly centrifugovány při 5000 otáčkách za minutu a supematant byl skladován při -20 °C jako buněčné extrakty. Stejná množství extraktů HEK125.3 buněk transfekovaných s Asp2 pozitivními oligomery a kontrolami byla precipitována protilátkou 369, která rozeznává C-konec APP a poté byl CTF99 detekován v imunoprecipitátu pomocí protilátky 6E10. Experiment byl opakován pomocí C8, druhé precipitační protilátky, která také rozeznává C-konec APP. Pro získání Western blotu extraktů z myších Neuro-2a buněk kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APP-KK, APP-Sw-KK, APP-VF-KK, nebo APP-VF byla stejná množství buněčných extraktů elektroforesována v 4-10%, nebo 10-20% Tricine gradientovém gelu (NOVEX, San Diego, CA). Plná délka APP a CTF99 β-sekretasových produktů byla detekována pomocí protilátky 6E10.

Výsledky

Transfekce HEK125.3 buněk s Asp2-1 nebo Asp2-2 pozitivními oligomery redukovalo produkci CTF β-sekretasového produktu ve srovnání s buňkami podobně transfekovanými kontrolními oligomery majícími reversní sekvenci (Asp2-1 reverzní a Asp2-2 reverzní). V experimentu s kotransfekcí Hu-Asp2 do myších Neuro-2a buněk APP-KK konstruktem zvyšoval tvorbu CTF99. Ta byla dále zvýšena byl-li Hu-Asp2 koexprimován s APP-Sw-KK mutantní formou APP nesoucí Švédskou mutaci KM->NL, která zvyšuje β-sekretasové zpracování.

Kotransfekce Hu-Asp2 s APP měla menší účinek na produkci Αβ40, ale zvýšila produkci Αβ42 nad úroveň pozadí (tabulka 4). Přídavek di-lysinového motivu na C-konec APP zvyšuje Αβ peptidové zpracování asi dvakrát, ačkoliv produkce Αβ40 a Αβ42 zůstává poměrně nízká (352 pg/ml respektive 21 pg/ml). Kotransfekce Asp2 s APP-KK dále zvyšuje produkci Αβ40 i Αβ42. Stimulace Αβ40 produkce přítomností HuAsp2 je více než trojnásobné, zatímco produkce Αβ42 je zvýšeno více než desetkrát. Kotransfekce Hu-Asp2 a APP-KK konstruktů tedy přednostně zvyšuje produkci Αβ42.

APP V717->F mutace způsobuje zvýšení γ sekretasového zpracování v Αβ42 štěpném místě. Kotransfekce Hu-Asp2 s APP-VF, nebo APP-VF-KK kostrukty zvyšuje Αβ42 produkci (dvojnásobné zvýšení s APP-VF a čtyřnásobné zvýšení s APP-VF-KK, tabulka 4), ale mělo ·· ·♦ ·· 99 999 • 9 9 9 9 9 9 9 999 • · ··· · · ·· 9 ·· • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ···· 9 9 9 9 9 99 ·· 99 99 99999 směsný účinek na produkci Αβ40 (mírné snížení s APP-VF a dvojnásobné zvýšení s APP-VF-KK ve srovnání s pcDNA kotransfekční kontrolou). Účinek Asp2 na Αβ42 produkci byl tedy prqporcionálně větší a vedl ke zvýšení poměru Αβ42 ku celkovému Αβ. Poměr Αβ42 ku celkovému Αβ tak dosáhl velmi vysoké hodnoty 42 % v HEK293 buňkách kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APP-VF-KK.

Western blot ukazující snížení produkce CTF99 HEK125.3 buňkami transfekovanými pozitivními oligomery cílenými proti Hu-Asp2 mRNA. (vpravo) Western blot ukazující zvýšení produkce CTF99 v myších Neuro-2a buňkách kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APP-KK. Další zvýšení produkce CTF99 je pozorováno u buněk kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APP-Sw-KK.

Tabulka 4

Výsledky kotransfekce Hu-Asp2, nebo pcDNA plasmidových DNA s různými APP konstrukty obsahujícími V717->F mutaci, která modifikuje γ-sekretasové zpracování. Kotransfekce Asp2 zvyšuje poměr Αβ42 ku celkovému Αβ. Tabelované hodnoty jsou množství Αβ peptidu pg/ml.

		pcDNA kotransfekce		Asp2 kotransfekce
	Αβ40	Αβ42	Αβ42/οβΠ«^	Αβ40	Αβ42	Αβ42/οε^ονγ
APP	192+18	<4	<2%	188±40	8±10	3,9%
APP-VF	118±15	15±19	11,5%	85±7	24±12	22,4%
APP-KK	352±24	5,5±216	5,5%	1062±101	226±49	17,5%
APP-VF-KK	230±31	88+24	27,7%	491±35	355+36	42%

Příklad 9

Bakteriální exprese lidské Asp2L

Exprese rekombinantního Hu-Asp2L v E.coli.

Hu-Asp2L může být exprimováno v E.coli po přídavku N-terminální sekvence jako je T7 tag (SEQ LD č. 21 ač. 22) nebo T7 tágu následovaného vedoucí sekvencí kaspasy 8 (SEQ ID č. 23 a č. 24). Alternativně může být pro zvýšení výtěžku Hu-Asp2 použita cílená mutagenese 5'konce pro snížení obsahu GC (SEQ ID č. 27 a č. 26). Navíc může být upraveno proteolytické štěpné místo Asp2 (SEQ ID č. 27 a č. 28). Pro získání rozpustného proteinu po expresi a

4*4 • 444 •t ·

4·

44444 refoldingu je výhodná delece transmembránové domény a cytoplasmatického úseku, nebo delece úseku za membránou, transmembránové domény a cytoplasmatického úseku.

Metody

Byly použity PCR primery obsahující vhodné sekvence spojovníků, aby bylo možno sestavit fúze Asp2 kódujících sekvencí s N-koncovými modifikacemi včetně T7 tágu (SEQ ID č. 21 a 22), nebo T7-kaspase vedoucí sekvence (SEQ ID č. 23 a 24), Tyto konstrukty byly klonovány do expresního vektoru pet23a(+)[Novagen], kde T7 promotor řídí expresi T7 tágu předcházející sekvenci mnohonásobného klonovacího místa. Pro klonování Hu-Asp za T7 vedoucí sekvenci pet23a byly pro amplifikaci zvolené Hu-Asp2 sekvence použity následující oligonukleotidy: č.553=GTGGATCCACCCAGCACGGCAATCCGGCTG(SEQ ID č. 35), č.554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG(SEQ ID č. 36), které vytváří v 5' respektive 3' volných koncích BamHI respektive HindlU přesahy. Asp2 sekvence byla amplifikována z plné délky Asp2(b) cDNA klonované do pcDNA3.1 pomocí Advanced-GC cDNA PCR (Clontech) podle instrukcí výrobce s anelací a prodlužováním při 68 °C v dvou krokovém PCR cyklu v 25 cyklech. Insert a vektor byly štěpeny BamHI a HindlII, purifikovány elektroforesou v agarosovém gelu a poté ligovány pomocí sady Rapid DNA Ligation (Boerhinger Mannheim). Ligační reakční směs byla použita pro transformaci kmene E.coli JMI09 (Promega) a byly sklizeny kolonie pro purifikaci plasmidu (Qiagen, Qiaprep minispin) a DNA sekvenční analýzu. Pro inducibilní expresi pomocí indukce s isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidem (EPTG), byl expresní vektor transfekován do kmene E.coli BL21 (Statagene). Bakteriální kultury byly pěstovány v LB médiu v přítomnosti ampicilinu (100 μg/ml) a indukovány v log fázi růstu při OD600 0,6-1,0 pomocí 1 mM IPTG 4 hodiny při 37 °C. Pelet buněk byl získán centrifúgací.

Pro klonování Hu-Asp2 sekvencí za T7 tag a kaspasová vedoucí sekvence (SEQ ID č. 23 a 24) byl výše uvedený konstrukt obsahující T7-Hu-Asp2 sekvence (SEQ ID č. 21 a 22) byl otevřen v BamHI místě, poté byly podrobeny teplotní hybridizaci a ligovány do vektorové DNA kaspase 8 vedoucí sekvence oligonukleotidy

č.559=GATCGATGACTATATCTGACTCTCCGCGTGAACAG-GACG (SEQ ID č. 37), č.560=GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (SEQ ID č. 38). 5' přesah každé sady oligonukleotidů byl navržen tak, aby umožňoval ligaci do BamHI místa, ale ne následné štěpení BamHI. Reakční směs po ligaci byla použita pro transformaci do JMI09 stejně jak je uvedeno výše pro analysu exprese proteinu po transferu do E.coli BL21.

·· ·· ·· ···♦ • 4 · 4 4 4 4 4 44

44444 444444

44 444 44 4444

4444 444444 *4 44 44 44 444

Pro snížení obsahu GC v 5 konci asp2 byly páry antiparalelních oligonukletidů navrženy tak, aby byly změněny báse degenerovaných kodonů na 15 aminokyselinových pozicích z G/C na A/T (SEQ ID č. 25 a 26). Nové nukleotidové sekvence na 5'konci asp2 nezměnily kódované nukleotidy a byly změněny pro optimalizaci exprese v E.coli.

Sekvence negativního spojovníku je: 5'CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCGTC TGCCCCGGGAGACCGACGAA3' (SEQ ID č. 39).

Sekvence pozitivního spojovníku je: 5'CTTCGTCGGTCTCCCGGGGCAGACGCAGACCCAGTGGAGCACCACCCAGACCGCTA CGCAGGGGCAGCCGGATGCCG3' (SEQ ID č. 40).

Po vzájemné teplotní hybridizaci fosforylovaných spojovníků v 0,1 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4 byly tyto ligovány do unikátního Cla I a Sma I míst Hu-Asp2 ve vektoru pTAC. Pro inducibilní exprese pomocí indukce s isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG), byly bakteriální kultury pěstovány v LB médiu v přítomnosti ampicilinu (100 pg/ml) a indukovány v log fázi růstu při OD600 0,6-1,0 pomocí 1 mM IPTG 4 hodiny při 37 °C. Pelet buněk byl získán centrifugací.

Pro vytvoření vektoru, kde vedoucí sekvence může být odstraněna omezenou proteolýzou pomocí kaspasy 8, takže je uvolněn Hu-Asp2 polypeptid začínající N-terminální sekvencí GSFV (SEQ ID č. 27 a 28), byl sledován následující postup. Dva fosforylované oligonukleotidy obsahující kaspasa 8 štěpné místo IETD, č.571 =5 GATCGATGACTATGTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATCGAAACCGACG (SEQ ID č. 41) a č.572=GATCCGTCGGTTTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (SEQ ID č. 42) byly podrobeny teplotní hybridizaci a ligovány do pET23a+, který byl otevřen BamHL Po transformaci do JMI09 byla získána purifikovaná vektorová DNA byla orientace insertu potvrzena DNA sekvenční analysou a pro amplifikaci zvolené Hu-Asp2 sekvence byly použity následující oligonukleotidy:

č.573-5 AAGGATCCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTG (SEQ ID č. 43) Č.554-GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (SEQ ID č. 44), které umístily BamHI respektive HindlII místa na volné 5' respektive 3' konce insertu. Asp2 sekvence byla amplifikována z plné délky Asp2 cDNA klonované do pcDNA3.1 pomocí Advanced-GC cDNA PCR (Clontech) podle instrukcí výrobce s anelací a prodlužováním při 68 °C v dvou krokovém PCR cyklu v 25 cyklech. Insert a vektor byly štěpeny BamHI a HindlII, purifikovány ·· ·· ·♦ ** φφ φφ • · * φ ♦ φ · «» • · Φ·· φ φ φφ φ φ • ·· ·φφ φφ φ · φ φ ···· φφφφ φφ ·♦ ·· Φ· φφ ·4 elektroforesou v agarosovém gelu a poté ligovány pomocí sady Rapid DNA Ligation (Boerhinger φφ

Mannheim). Ligační reakční směs byla použita pro transformaci kmene E.coli JM109 (Promega) a byly sklizeny kolonie pro purifikaci plasmidu (Qiagen, Qiaprep minispin) a DNA sekvenční analýzu. Pro inducibilní expresi pomocí indukce s isopropyl-3-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG), byl expresní vektor transfekován do kmene E.coli BL21 (Statagene). Bakteriální kultury byly pěstovány v LB médiu v přítomnosti ampicilinu (100 pg/ml) a indukovány v log fázi růstu při

OD600 0,6-1,0 pomocí 1 mM IPTG 4 hodiny při 37 °C. Pelet buněk byl získán centrifugací.

Pro usnadnění purifikace byl vložen do všech výše zmíněných konstruktů vložen 6-His tag a to za T7 vedoucí sekvenci otevřením konstruktu v BamHI místě a ligací fosforylovaných oligonukleotidů podrobených teplotní hybridizaci, obsahujících 6 histidinovou sekvenci

Č 565-GATCGCATCATCACCATCATTACG (SEQ ID č. 45),

č.566=GATCCATGGTGATGGTGATGATGATGC (SEQ ID č. 46). 5' Přesah každé sady oligonukleotidů byl navržen tak, aby umožňoval ligaci do BamHI místa, ale ne následné štěpeni s

BamHI.

Příprava peletu buněk:

Pelety bakteriálních buněk (36,34 g) reprezentující 10,8 litrů kultury bylo suspendováno do objemu 200 ml pomocí 20 mm tkáňového homogenizátoru při 3000 až 5000 otáček za minutu v 2 M KC1, 0,1 M Trisu, 0,05 M EDTA, 1 mM DTT. Vodivost byla nastavena na asi 193 mMhos pomocí vody.

Po dispergaci peletu bylo přidáno další množství roztoku KC1 a to na celkový objem 500 ml. Tato suspense byla dále homogenizována asi 3 minuty při 5000 otáčkách za minutu pomocí stejného zařízení. Směs byla poté protlačena přes Rannie vysokotlaký homogenizátor při tlaku 69 MPa.

Ve všech případech byl dále použit pelet zatímco supematant byl vylit. Vzniklý roztok byl centrifugován v GSA rotoru 1 hodinu při 12 500 otáčkách za minutu. Pelet byl resuspendován ve stejném roztoku (bez DTT) pomocí stejné tkáňového homogenizátoru při 2000 otáčkách za minutu. Po homogenizaci 5 minut při 3000 otáčkách za minutu byl objem upraven na 5000 ml stejným roztokem a ten byl stočen 1 hodinu při 12 500 otáčkách za minutu. Pelet byl poté resuspendován jako prve, ale tentokrát byl celkový objem upraven na 1,5 1 stejným roztokem před 5 minutovou homogenizací. Po centrifugací stejnou rychlostí po 30 minut byla tato procedura zopakována. Pelet byl poté resuspendován v asi 150 ml studené vody byly spojeny pelety ze šesti centrifugačních zkumavek pro GSA rotor. Pelet byl homogenizován 5 minut při 3000 otáčkách za ♦· ♦· t· ♦ ♦* • · · · ♦ · · · »·· • · 9 ·« · · ·· t ♦· • · · ♦ « · f · · · · ♦9 • · 9 · 9 9 9 9 9 99

99 99 99 99 999 minutu, objem byl upraven na 250 ml studenou vodou a stočen v průběhu 30 minut. Hmotnost výsledného peletu byla 17,75 g.

Souhrn: Lyže peletu bakterií v roztoku KC1 následovaná centrifugací v GSA rotoru byla nejprve použita k přípravě peletu. Stejný roztok byl poté třikrát použit pro resuspendaci a homogenizaci. Konečné promytí vodou/homogenizace bylo provedeno pro odstranění nadbytku

KClaEDTA.

Solubilizace rHuAsp2L:

Pro solubilizaci rHuAsp2L z peletu byla použit poměr 9-10ml/g peletu. Bylo roztaveno

17,75 g peletu a přidáno 150 ml 8 M guanidinu HC1, 5 mM βΜΕ, 0,1% DEA. Pro úpravu pH na

8,6 byl použit 3 M Tris. Pelet byl nejprve resuspendován v roztoku guanidinu pomocí 20 mm tkáňového homogenizátoru při 1000 otáčkách za minutu. Směs byla poté míchána při 4 °C hodinu a zcentrifugována 1 hodinu při 12 500 otáčkách za minutu v GSA rotoru. Výsledný supematant byl poté centrifiigován 30 min při 40 000 g v SS-34 rotoru. Výsledný supematant byl poté skladován při -20 °C, kromě 50 ml podílu.

Afinitní chromatografie s mobilizovaným niklem solubilizovaného rHuAsp2L:

Byly použity následující roztoky:

A) 6 M guanidin HC1, 0,1 M NaP, pH 8,0, 0,01 M Tris, 5 mM βΜΕ, 0,5 mM imidazol

A ) 6 M močovina, 20 mM NaP, pH 6,80, 50 mM NaCl

B') 6 M močovina, 20 mM NaP, pH 6,20, 50 mM NaCl, 12 mM imidazol

C') 6 M močovina, 20 mMNaP, pH 6,80, 50 mM NaCl, 300 mM imidazol

Poznámka: Pufiy A' a C' byly míchány ve vhodném poměru pro dosažení příslušné koncentrace imidazolu.

ml Solubilizovaného materiálu bylo spojeno s 50 ml pufru A a naneseno na 100 až

125 ml Qiagen Ni-NTA SuperFlow (preekvilibrovanou pufrem A) v 5x10 cm Biorad econo koloně. Takto byla kolona jemně třepána přes noc při 4 °C.

Kroky při chromatografii:

1) Odtečení zbytku z kolony.

2) Promytí 50 ml pufru A (spojeno s proteklou frakcí)

3) Promytí 250 ml pufru A (promytí 1)

4) Promytí 250 ml pufru A (promytí 2)

5) Promytí 250 ml pufru A'

6) Promytí 250 ml pufru B' ·· 99 99 »99 · 9 · « <* · 9 9·· • 9*99 9 « · 9 * φ·

99 999 99 *99 99

9999 9999 ♦ 99 · «9 99 99 99999

7) Promytí 250 ml pufru A'

8) Eluce 250ml 75mM imidazolu

9) Eluce 250ml 150mM imidazolu (150-1)

10) Eluce 250ml 150mM imidazolu (150-2)

11) Eluce 250ml 300mM imidazolu (300-1)

12) Eluce 250ml 300mM imidazolu (300-2)

13) Eluce 250ml 300mM imidazolu (300-3)

Výsledky chromatografie:

rHuAsp bylo eluováno při 75 mM imidazolu až 300mM imidazolu. Frakce (75 mM) stejně jako první 150mM imidazolová (150-1) frakce obsahovala kontaminující proteiny, jak je vidět na gelech barvených Coomassie Blue. Proto byly pro refolding experiment použity frakce 150-2 a

300-1, protože obsahovaly největší množství (viz Coomassie Blue barvené gely).

Refolding experimenty s rHuAsp2L:

Experiment 1:

Do 40 ml 150-2 byl přidán 1M DTT, 3M Tris, pH 7,4 a DEA na konečné koncentrace mM, 50 mM, respektive 0,1%. Roztok byl náhle (za míchání) zředěn 200ml 4 °C studeného mM NaP, pH 6,8, 150 mM NaCl. Toto zředění ustavilo konečnou koncentraci močoviny na

M. Roztok zůstal čirý, dokonce i když byl ponechán, aby v otevřené nádobce na RT, nebo při °C.

Po stání na vzduchu po 4-5 hodin při 4 °C byl roztok dializován přes noc proti 20 mM

NaP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20% glycerol. Tato metoda účinně odstraní močovinu bez precipitace proteinu.

Experiment 2:

Některé z 150-2 eluátů byly 2x koncentrovány na Amicon Centriprep, 10 000 MWCO, a poté s nimi bylo nakládáno stejně jako v experimentu 1. Tento materiál také zůstal v roztoku bez viditelné precipitace.

Experiment 3:

Do 89 ml 150-2 byl přidán 1M DTT, 3M Tris, pH 7,4 a DEA na konečné koncentrace

6mM, 50mM, respektive 0,1%. Roztok byl náhle (za míchání) zředěn 445ml 4 °C studeného *♦ ♦♦ »t »·· *·· · · · · * » * ·« *··· · ·· • · · · ♦ ♦ · · * · · 99 • · · · « · « « · *« ” *· ♦· »· ·· ··* mM NaP, pH 6,8, 150 mM NaCl. Roztok zůstal čistý bez zjevné precipitace. Roztok byl oddělen do RT míchán 10 minut a poté přidán MEA na konečnou koncentraci 0,1 mM. Roztok byl pomalu míchán 1 hodinu. Poté byl přidán cystamin a CuSO₄ na konečné koncentrace lmM respektive 10 μΜ. Roztok byl pomalu míchán na RT 10 minut a poté umístěn do chlazené místnosti (4 °C) a mírně třepán přes noc za přístupu vzduchu.

Následující den byl roztok (stále čirý a bez precipitace) centrifugován při 100 000 x g 1 hodinu. Supematanty z více podílů byly spojeny a dialyzovány proti 20 mM NaP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20% glycerol. Po dialýze byl materiál skladován při -20 °C.

Malý podíl (asi 10 ml) roztoku proteinu (stále v 1 M močovině) oddělen pro biochemické analysy a zmražen při -20 °C.

Příklad 10

Exprese Hu-Asp2 a jeho derivátů ve hmyzích buňkách.

Exprese pomocí baculovirové infekce.

Kódující sekvence Hu-Asp2 a několik derivátů bylo upraveno pro expresi ve hmyzích buňkách pomocí PCR. 5' Negativní oligonukleotidový primer, který modifikuje místo iniciace translace tak, aby souhlasilo s Kozák konsensuální sekvencí byl párován s 3 pozitivním primerem, který obsahuje přirozený translační terminační kodon v Hu-Asp2 sekvenci. PCR amplifikace pcDNA3.1 (hygro)/Hu-Asp2 templátu viz příklad 12. Pomocí PCR byl rovněž upraveny dva deriváty Hu-Asp2 s deletovanou C terminální transmembránovou doménou (SEQ ID č. 29 a č. 30), nebo deletovanou C terminální transmembránovou doménou a vloženým hexa-histidinovým zakončením na C-konci. (SEQ ID č. 31 a 32). Byl párován stejný 5 negativní oligonukleotidový primer jako popsaný výše s buď 3 pozitivním primerem, který (1) vkládá translační terminační kodon po kodonu 453 (SEQ ID č. 3), nebo (2) vkládá hexahistidinový tag za dá translační terminační kodon pomocí PCR. s pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2L jako templátu. Ve všech případech byla PCR prováděna v 15 cyklech pomocí Pwol DNA polymerasy (BoehringerMannheim) podle instrukcí výrobce. Reakční produkty byly štěpeny BamHI a Notl a ligovány do BamHI a Notl štěpeného baculovirového transferového vektoru pVL1393 (Invitrogen). Část reakční směsi po ligaci byla použita pro transformaci kompetentních buněk E.coli a poté byla provedena antibiotická selekce transformantů na LB-Amp. Plasmidová DNA byla získána standardní alkalickou lyží a zaostřením v CsCl za získání baculovirového transferového vektoru pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ATM, pVL1393/Asp2ATM(His)6. Vytvoření rekombinantních baculovirů a infekce sf6 hmyzích buněk byla provedena pomocí standardních metod.

• 4

	• 444 · · · · 4* ·« »4 «4 «4
Exprese transfekci	- Přechodná a stabilní exprese pVL1393/Asp2ÁTM a

pVL1393/Asp2ATM(His)6 ve High 5 hmyzích buňkách byla uskutečněna pomocí hmyzího expresního vektoru pIZ/V5-His. DNA inserty z expresního plasmidového vektoru pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ÁTM, pVL1393/Asp2ATM(His)6 byly vyštěpeny pomocí BamHI a Notl a subklonovány do BamHI a Notl štěpeného pIZ/V5-Hís pomocí standardních metod.

Výsledné expresní plasmidy označené pIZ/VL1393/Asp2, pIZ/VL1393/Asp2ÁTM, pIZ/VL1393/Asp2ÁTM(His)6, byly připraveny jak je popsáno výše.

Pro transfekci byly High 5 hmyzí buňky kultivovány v High Five free médiu doplněném o 10 pg/ml gentamycin při 27 °C v utěsněných láhvích. Transfekce byly provedeny za použití High five buněk, High five média bez séra doplněném o 10 pg/ml gentamycin a InsectinPlus liposomy (Invitrogen, Carlsbad, CA) pomocí standardních metod.

Pro přechodnou transfekci ve velkém měřítku bylo 1,2 x 10⁷ High five buněk vysety na 150 mm misky pro tkáňové kultury a ponechány 15-30 min za pokojové teploty, aby se připojily. Během času připojování byla připravena DNA/liposomová směs smícháním 6 ml média bez séra, pg AspATM/pIZ(+/-His) DNA a 120 μΐ Insectin Plus a inkubována za pokojové teploty 15 minut. Vysévací médium bylo z misek z buňkami odstraněno a nahrazeno DNA/liposomovou směsí a to na 4 hodiny při pokojové teplotě při konstantním kývám 2 otáčky za minutu. Dále bylo na misky přidáno 6 ml média a byly inkubovány 4 dny při 27 °C ve vlhkém inkubátoru. Čtyři dny po transfekci bylo médium sklizeno přečištěno centrifugací 500 x g, byla stanovena exprese Asp2 Western blotingem. Pro stabilní expresi bylo na buňky působeno 50 pg/ml Zeocinem a buňky, které přežily byly spojeny a použity jako klonální buňky omezeným zředěním a následně analýzou hladiny exprese, jak je uvedeno výše.

Purifikace Asp2ÁTM a Asp2ATM(His)e

Odstranění transmembránového segmentu Hu-Asp2 vede k sekreci polypeptidu do kultivačního média. Po produkci proteinu buď baculovirovou infekcí, nebo transfekci je kondiciované médium sklizeno, přečištěno centrifugací a dialyzováno proti Tris-HCl (pH 8,0). Tento materiál byl poté purifikován chromatografií na anexu (Tris-HCl, pH 8,0) a poté katexu (acetátový pufr, pH 4,5) s použitím gradientů NaCl. Eluční profil byl monitorován (1) Western blotem (2) stanovením aktivity pomocí peptidového substrátu popsaného v příkladu 12. V případě Asp2ÁTM(His)₆ bylo upravené médium dialyzováno proti Tris pufru (pH 8,0) a purifikována chromatografií na náplni IMAC a následně na anexu.

		•r *·	·*	•
• ·	•	• · · ·	♦	•	··
« ·		• · ··	•	♦	•
«·	*<·			···

Sekvenční analysa purifikovaného Hu-Asp2AIM(His)₆ ukázala, že byl odštěpen signální peptid [TQHGIRLPLR].

Příklad 11

Exprese Hu-Asp2 v CHO buňkách

Heterologní exprese Hu-Asp2 v CH0-K1 buňkách

Kódující sekvence Hu-Asp2 byla klonována do savčího expresního vektoru pcDNA3.1(+)Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA), který obsahuje CMV okamžitý časný promotor a bGH polyadenilační signál, aby byla zajištěna exprese. Expresní plasmid pcDNA3.1(+)Hygro/ Hu-Asp2 byl připraven alkalickou lyží a izolací v CsCl a kompletní sekvence obou řetězců potvrdila integritu kódující sekvence.

Ovariální buňky čínského křečka divokého typu (CH0-K1) byly získány z ATCC. Buňky byl udržovány v monovrstevných kulturách v α-MEM obsahujícím 10% FCS při 37 °C v 5% CO2. Dvě lOOmm misky CHO-K1 buněk (60% srůst) byly transfekovány pcDNA3.1(+)Hygro samotném (kontrola), nebo pcDNA3.1(+)Hygro/ Hu-Asp2 pomocí kationických liposomů DOTAP podle doporučení výrobce. K buňkám byly přidány směsi DNA/liposomy, byly inkubovány 15 hodin a poté bylo médium nahrazeno růstovým médiem obsahujícím 500 jednotek/ml hygromycinu Β. V případě pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 transfekovaných buněk byly individuální hygromycin rezistentní buňky klonovány omezeným zředěním. Po expanzi klonů individuálních buněčných linií byla exprese Hu-Asp2 proteinu potvrzena Western blotem za použití polyklonálního králičího antiséra proti rekombinantnímu Hu-Asp2 připravenému expresí v E.coli. Misky s buňkami každé linie blízko srůstu byly sklizeny seškrábnutím do PBS a buňky byly získány centrifugací. Pelety buněk byly resuspendovány v chladném lyžujícím pufru (25 mM Tris-HC1 (8,0)/5 mM EDTA) obsahující inhibitory proteáz a buňky byly lyžovány sonifikací. Rozpustná a membránová frakce byly odděleny centrifugací (105 000 x g, 60 min) a normalizovaná množství proteinů z každé frakce byla separována na SDS-PAGE. Po elektrotransferu separovaných polypeptidů na PVDF membrány byl Hu-Asp2L protein detekován pomocí králičího anti-Hu-Asp2 antiséra (1/1000 zředění) komplexy protilátka/antigen byly vizualizovány pomocí s alkalickou fosfatasou konjugované ovčí protilátky proti králičí protilátce (1/2500). Specifický imunoreaktivní protein se zdánlivou Mr 65 kDa byl detekován v pcDNA3.1(+)Hygro/ Hu-Asp2 transfekovaných buněk a ne u kontroly. Hu-Asp2 polypeptid byl detekován jen v membránové frakci, což je v souladu s přítomností signální sekvence jedné

*·		··	··		··		··
•	•	•	•	•	• ·	•	•	··
•	•	···	•	•	··	•	•
•
•	•	• ·	•	•	• ·	•	•
··		9 9			··		»·	··

transmembránové domény v předpovězené sekvenci. Na základě této analýzy měl největší hladinu exprese Hu-Asp2 klon č.5 a tato buněčná linie byla namnožena jako materiál pro purifikaci.

Purifikace rekombinantního Hu-Asp2L z CH0-Kl/Hu-Asp2 klonu č.5

Při typické purifikaci byly jako materiál použity pelety buněk klonu č.5 ze 20 150 mm misek se srostlými buňkami. Pelety buněk byly resuspendovány v 50 ml studeného lyžujícího pufru jak je popsán výše. Buňky byly lyžovány polytron homogenizací (2 x 20 sec) a lyzát byl centrifugo ván při 338 000 x g 20 minut. Pelet membrán byl poté resuspendován v 20 ml studeného lyžujícího pufru obsahujícího 50 mM β-oktylglukosid a jemně míchán při 4 °C 1 hodinu. Detergentový extrakt byl přečištěn centrifugací při 338 000 x g po 20 minut a supematant byl uschován pro další analýzu.

β-Oktylglukosidový extrakt byl aplikován na kolonu s MonoQ anexem, která byla dříve ekvilibrována 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)/50 mM β-oktylglukosid. Po aplikaci vzorku byla kolona eluována lineárním gradientem zvyšující se koncentrace NaCl (0-1,0 M v průběhu 30 minut) a jednotlivé frakce byly analyzovány pomocí Western blotu a byla v nich stanovována β-sekretasová aktivita (viz. níže). Frakce obsahující jak Hu-Asp2L imunoreaktivitu a β-sekretasovou aktivitu byly spojeny a dialyzovány proti 25 mM NaOAc (pH 4,5)/50 mM β-oktylglukosid. Po dialýze byl precipitovaný materiál odstraněn centrifugací a rozpustný materiál na koloně s MonoS katexem, která byla dříve ekvilibrována roztokem obsahujícím 25 mM NaOAc (pH 4,5)/50 mM β-oktylglukosid. Kolona byla ekvilibrována lineárním gradientem zvyšující se koncentrace NaCl (0-1,0 M v průběhu 30 minut) blotu a byla v nich stanovována β-sekretasová aktivita. Frakce obsahující jak Hu-Asp2L imunoreaktivitu a β-sekretasovou aktivitu byly spojeny a bylo zjištěno, že jsou z více než 90 % čisté pomocí SDS-PAGE s barvením pomocí Coomassie Blue.

Příklad 12

Stanovení Hu-Asp2 β-sekretasové aktivity pomocí peptidových substrátů.

Stanovení β-sekretasy β-Sekretasová aktivita byla měřena stanovením hydrolýzy syntetického peptidu obsahujícího APP Švédskou mutaci pomocí RP-HPLC s UV detekcí. Každá reakční směs obsahovala 50 mM NaMES (pH 5,5), 1% β-oktylglukosid, peptidový substrát (SEVNLDAEFR, 70 μΜ) a enzym (1-5 pg proteinu). Směsi byly inkubovány při 37 °C různou dobu a reakční produkty byly stanoveny na RP-HPLC pomocí lineárního gradientu 0-70 B v průběhu 30 minut • · · · ♦ · · ··· • ···· · · ·· · · ·· ·· · · ·· ·· · (A = 0,1% TFA ve vodě, B = 1% TFA/10% voda/90 AcCN). Eluční profil byl monitorován pomocí absorbance při 214 nm. V předběžných experimentech byly dva píky produktů eluovány před intaktním peptidovým substrátem, potvrdili jsme, že mají sekvence DAEFR a SEVNL a to pomocí Edmanova odbourávání a MALDI-TOF hmotnostního spektrometru. Procento hydrolýzy peptidového substrátu bylo spočítáno porovnáním integrovaných ploch píků pro dva produktové peptidy a počáteční materiál získaných měřením při 214 nm. Specificita proteázové štěpné reakce byla stanovena provedením β-sekretasového stanovení v přítomnosti směsi proteázových inhibitorů (8 μΜ pepstatin A, 10 μΜ leupeptin, 10 μΜ E64 a 5 mM EDTA).

Alternativní stanovení β-sekretasové aktivity využívá substráty s vnitřně zhášenou fluorescencí pro monitorování enzymové aktivity pomocí fluorescenční spektroskopie v jednom vzorku, nebo na mikrodestičce. Každá reakční směs obsahovala 50 mM Na-MES (pH 5,5), peptidový substrát MCA-EVKMDAEF[K-DNP] (bioSource Intemational) (50 μΜ) a purifikovaný Hu-Asp2 enzym. Tyto komponenty byly ekvilibrovány na 37 °C a reakce byla zahájena přídavkem substrátu. Excitace byla prováděna při 330 nm a reakční kinetika byla monitorována měřením fluorescence při 390 nm. Pro detekci sloučenin, které ovlivňují Hu-Asp2 aktivitu byly testované sloučeniny přidány během preinkubační fáze reakce a poté byla reakce monitorována stejně jak bylo popsáno výše. Jako aktivátory jsou označeny sloučeniny, které zvyšují rychlost nástupu fluorescence, zatímco inhibitory snižují rychlost nástupu fluorescence.

Je zřejmé, že vynález může být prováděn i jinak než je právě popsáno ve výše uvedených příkladech.

Je mnoho možných modifikací a variací vynálezu a tyto jsou rovněž zahrnuty v rozsahu vynálezu.

Všechny publikace výše citované jsou zde zahrnuty svými odkazy.

Claims (130)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifíkovaný polypeptid obsahující savčí Asp2 polypeptid, který štěpí savčí β-amyloidní prekursorový protein, nebo fragment, analog nebo derivát savčího Asp2 polypeptidu, který si zachovává aktivitu štěpení β-amyloidního prekursorového proteinu.
2. 2. Purifíkovaný polypeptid podle nároku 1, vybraný ze skupiny sestávající z:

   a) polypeptidu obsahujícího purifikovanou, lidskou Asp2(a) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 4 nebo jeho fragment, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein;

   b) polypeptidu obsahujícího purifikovanou, lidskou Asp2(b) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 6 nebo jeho fragment, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein;

   c) polypeptidu obsahujícího myší Asp2(b) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 8 nebo jeho fragment, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein;

   d) polypeptidu obsahujícího purifíkovaný polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 95 % identická s a), b) nebo c).
3. 3. Purifíkovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující purifikovanou lidskou Asp2(a) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 4 nebo jeho fragment, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein.
4. 4. Purifíkovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující část lidské Asp2(a) aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 4, přičemž tato část obsahuje aminokyseliny 22 až 501 v SEQ ID NO: 4 a postrádá aminokyseliny 1 až 21.
5. 5. Purifíkovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující část lidské Asp2(a) aminokyselinové sekvence ukázanou v SEQ ID NO: 4 schopné Štěpit β-amyloidní prekursorový protein, přičemž polypeptid postrádá aminokyselinové zbytky 455 až 477 transmembránové domény z SEQ ID NO: 4.
6. 6. Polypeptid podle nároku 5, kde polypeptid postrádá aminokyselinové zbytky 454 až 501 z SEQ ID NO: 4.

   • « · · ·· ·· ·· · • · · ···· · · · · • ···· · · · · · ·· • ·· · · · ·· ··· ·· • · · · · · · · · ·· ·· · · · · ♦ · ·· ···
7. 7. Purifikovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující purifikovanou lidskou Asp2(b) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 6 nebo jeho fragment, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein.
8. 8. Purifikovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující část lidské Asp2(b) aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 6, přičemž tato část obsahuje aminokyseliny 22 až 476 v SEQ ID NO: 6 a postrádá aminokyseliny 1 až 21.
9. 9. Purifikovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující část lidské Asp2(b) aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 6, schopné štěpit β-amyloidní prekursorový protein, přičemž tato část postrádá aminokyselinové zbytky 430 až 452 transmembránové domény z SEQ ID NO:

   6.
10. 10. Purifikovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující myší Asp2 aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 8 nebo jeho fragment, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein.
11. 11. Purifikovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující fragment savčího Asp2 polypeptidu, kde purifikovaný polypeptid postrádá transmembránovou doménu savčího Asp2 polypeptidu.
12. 12. Fúzní protein obsahující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a který obsahuje heterologní cílovou aminokyselinovou sekvenci.
13. 13. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid štěpí lidský β-amyloidní prekursorový protein nebo lidský β-amyloidní prekursorový protein-Sw v β-sekretasovém

    Štěpném místě.
14. 14. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, 5 až 7 nebo 9 až 13, kde polypeptid postrádá kteroukoliv ze savčí Asp2 pro-peptidové sekvence.
15. 15. Polypeptid podle nároku 14, jehož počáteční N-koncová sekvence je ETDEEP.

    ··· ···· ··· • · · ·· · ··· · ·
16. 16. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, 5 až 7 nebo 9 nebo 11 až 15, vybraný ze skupiny sestávající z:

    a) polypeptidů obsahujícího část aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 4 schopné štěpit β-amyloidní prekursorový protein, kde polypeptid postrádá aminokyseliny 1 až 45 z SEQ ID NO: 4; a

    b) polypeptidů obsahujícího část aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 6 schopné štěpit β-amyloidní prekursorový protein, kde polypeptid postrádá aminokyseliny 1 až 45 z SEQ ID NO: 6.
17. 17. Purifikovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.
18. 18. Polynukleotid podle nároku 17, vybraný ze skupiny sestávající z:

    a) polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 3;

    b) polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 5;

    c) polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 7;

    d) polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z 95 % identická se sekvencí z bodu a), b) nebo c) a která kóduje polypeptid, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein; a

    e) fragmentu odvozeného ze sekvence z bodu a), b), c) nebo d), která kóduje polypeptid, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein.
19. 19. Polynukleotid podle nároku 17, obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 29 a 31.
20. 20. Purifikovaný polynukleotid podle nároku 17, vybraný ze skupiny sestávající z:

    a) purifikovaného polynukleotidu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyseliny 22 až 501 ze SEQ ID NO: 4 a postrádá přilehlou nukleotidovou sekvenci kódující aminokyseliny 1 až 21 ze SEQ ID NO: 4;

    b) purifikovaného polynukleotidu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyseliny 22 až 476 ze SEQ ID NO: 6 a postrádá přilehlou nukleotidovou sekvenci kódující aminokyseliny 1 až 21 ze SEQ ID NO: 6.

    • · • ·· • · ·· • ·· ··· ·· ··· • · ·· ·· ··
21. 21. Purifíkovaný polynukleotid podle nároku 17, vybraný ze skupiny sestávající z:

    a) purifikovaného polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci kódující část lidské Asp2(a) aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 4, která štěpí β-amyloidní prekursorový protein a kde polynukleotid postrádá přilehlou nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinové zbytky 455 až 477 transmembránové domény ze SEQ ID NO:4; a

    b) purifikovaného polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci kódující Část lidské Asp2(a) aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 6, která štěpí β-amyloidní prekursorový protein a kde polynukleotid postrádá přilehlou nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinové zbytky 430 až 452 transmembránové domény ze SEQ ID NO: 6.
22. 22. Purifíkovaný polynukleotid podle nároku 21, přičemž polynukleotid postrádá nukleotidovou sekvenci kódující aminokyseliny 454 až 501 ze SEQ ID NO:4.
23. 23. Purifíkovaný polynukleotid podle nároku 17, obsahující fragment savčího Asp2 polynukleotidu, kde fragment postrádá nukleotidovou sekvenci kódující transmembránovou doménu savčího Asp2 polynukleotidu.
24. 24. Purifíkovaný polynukleotid podle nároku 17, kde polynukleotid postrádá nukleotidovou sekvenci kódující savčí Asp2 pro-peptidovou sekvenci.
25. 25. Vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 17 až 24.
26. 26. Vektor podle nároku 25, který je expresním vektorem, kde je polynukleotid funkčně připojen k sekvenci kontroly exprese.
27. 27. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 17 až 24.
28. 28. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná vektoren podle nároků 25 až 26.
29. 29. Hostitelská buňka podle nároku 28, kterou je savčí buňka.

    ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · ·· «·· ····· ···· · · • · · · · · · ···· · • · ♦ · · · ·· · · ·· *· ·· · · 999
30. 30. Hostitelská buňka podle nároku 28 nebo 29, kde exprese polypeptidu probíhá na jejím povrchu.
31. 31. Hostitelská buňka podle nároku 28 nebo 29, která vylučuje polypeptid kódovaný polynukleotidem, přičemž vyloučený polypeptid postrádá transmembránovou doménu.
32. 32. Hostitelská buňka podle jakéhokoliv z nároků 27 až 31, kde je hostitelská buňka transfektována nukleovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje β-amyloidní prekursorový protein nebo jeho fragment, jenž obsahuje místo rozpoznání proteasy, rozpoznané polynukleotidem.
33. 33. Hostitelská buňka podle nároku 32, kde je hostitelská buňka transfektována nukleovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje β-amyloidní prekursorový protein.
34. 34. Hostitelská buňka podle nároku 33, kde je hostitelská buňka transfektována nukleotidovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje β-amyloidní prekursorový protein, který obsahuje dva zbytky karboxy-terminálního lysinu.
35. 35. Hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 32 až 34, kde β-amyloidní prekursorový protein nebo jeho fragment obsahuje Švédskou mutaci KM->NL amyloidního prekurzorového proteinu ihned upstream β-sekretasového štěpného místa.
36. 36. Hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 32 až 35, kde exprese polypeptidu a β-

    -amyloidního prekursorového proteinu nebo fragmentu β-amyloidního prekursorového proteinu probíhá na jejím povrchu.
37. 37. Způsob přípravy polypeptidu, který štěpí β-amyloidní prekursorový protein, vyznačující se tím, že se hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 27 až 36 kultivují v kultivačním médiu za podmínek, při kterých buňky produkují polypeptid, který je kódovaný polynukleotidem.
38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že se dále polypeptid z buněk nebo kultivačního média purifikuje.

    ** ** ·* ·· ·· · • · · ···· · ··· • · · ·· · · ·· · ·· • ♦ · · · · ·· ··· ·· ···· ···· · · · ·· ·· ·· ·· ·♦ · · ·
39. 39. Způsob pro identifikaci látek, které inhibují aktivitu lidské Asp2 aspartylproteasy, vyznačující se tím, že se obsahuje následující kroky:

    a) kontaktování β-amyloidního prekursorového proteinu s polypeptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky;

    b) stanovení aktivity zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky; a

    c) srovnání aktivity zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu v přítomnosti testované látky s aktivitou v nepřítomnosti testované látky, aby se stanovila látka, která inhibuje aktivitu zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu, přičemž snížená aktivita v přítomnosti testované látky určuje látku, která inhibuje Hu-Asp2 aktivitu.
40. 40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že se polypeptid, který je rekombinantním polypetidem, purifikuje a isoluje z buněk transformovaných nebo transfektováných polynukleotidem obsahujícím nukleotidovou sekvenci, která polypeptid kóduje.
41. 41. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že se polypeptid exprimuje v buňkách transformovaných nebo transfektovaných polynukleotidem obsahujícím nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, přičemž kontaktování obsahuje kultivaci buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky a krok stanovení obsahuje měření aktivity zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu buněk.
42. 42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že krok stanovení obsahuje měření produkce beta amyloidního peptidu buňkami v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky.
43. 43. Způsob podle nároku 41 nebo 42, vyznačující se tím, že buňka je buňka lidské embryonální buněčné linie 293 ledvin.
44. 44. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 40 až 43, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence je vybraná ze skupiny sestávající z:

    a) nukleotidové sekvence kódující Hu-Asp2(a) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID

    NO: 4;

    b) nukleotidové sekvence kódující Hu-Asp2(b) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID

    NO: 6;

    * · • ♦ ·· • · • ··

    c) nukleotidové sekvence kódující fragment Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) nebo Hu-Asp2(b) (SEQ ID NO: 6), kde fragment vykazuje charakteristiky aspartylaproteasové aktivity Hu-Asp2(a) nebo Hu-Asp2(b); a

    d) nukleotidová sekvence polynukleotidu, která se hybridizuje v přísných hybridizačních podmínkách k Hu-Asp2-kódujícímu polynukleotidu vybraného ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5.
45. 45. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 40 až 43, vyznačující se tím, že Hu-Asp2 obsahuje Hu-Asp2(a) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 4.
46. 46. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 40 až 43, vyznačující se tím, že Hu-Asp2 obsahuje Hu-Asp2(b) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 6.
47. 47. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 40 až 43, vyznačující se tím, že Hu-Asp2 obsahuje fragment Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) nebo Hu-Asp2(b) (SEQ ID NO: 6), kde fragment vykazuje charakteristiky aspartylproteasové aktivity Hu-Asp2(a) nebo Hu-Asp2(b).
48. 48. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 40 až 47, vyznačující se tím, že buňka obsahuje vektor, který obsahuje polynukleotid.
49. 49. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 39 až 48, vyznačující se tím, že β-amyloidní prekursorový protein obsahuje Švédskou mutaci K-»N, M-->L přiléhající k místu β-sekretasového zpracování.
50. 50. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 39 až 49, vyznačující se tím, že β-amyloidní prekursorový protein dále obsahuje karboxy-terminální di-lysin.
51. 51. Způsob pro identifikaci látek, které modulují aktivitu lidské Asp2 aspartylproteasy, vyznačující se tím, že se obsahuje následující kroky:

    a) kontaktování purifikovaného nebo isolovaného polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a β-amyloidního prekursorového proteinu v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky; kde Asp2 aspartylproteasa je kódována molekulou nukleové kyseliny, která se hybridizuje za

    99 ·9 99 99·· • 9 9 9 9 9 9999 • 99·· · 999 99 přísných hybridizačních podmínek k Hu-Asp2-kódujícímu polynukleotidu vybranému ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6;

    b) stanovení aktivity polypeptidu pro zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky; a

    c) srovnání aktivity polypeptidu pro zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu v přítomnosti testované látky s aktivitou v nepřítomnosti testované látky, aby se stanovily látky, které modulují aktivitu zpracování amyloidního prekurzorového proteinu, přičemž modulátorem je Asp2 inhibitor, který zpomaluje zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu a modulátor, kterým je Asp2 agonista, který zvyšuje toto zpracování.
52. 52. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 39 až 51, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok léčby Alzheimerovy nemoci látkou stanovenou jako inhibitor Hu-Asp2 podle kroků a) až c).
53. 53. Použití látky stanovené jako inhibitor Hu-Asp2 podle kteréhokoliv z nároků 39 až 41 pro výrobu léku pro léčbu Alzheimerovy nemoci.
54. 54. Způsob pro stanovení modulátorů β-sekíeiasové aktivity, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

    a) kontaktování první kompozice s druhou kompozicí, obě v přítomnosti a nepřítomnosti sloučeniny předpokládaného modulátoru, kde první kompozice obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a kde druhá kompozice obsahuje polypeptid, jako substrát, mající aminokyselinovou sekvenci obsahující místo β-sekretasového štěpení;

    b) měření štěpení polypeptidu, jako substrátu, v přítomnosti a v nepřítomnosti sloučeniny předpokládaného modulátoru; a

    c) stanovení modulátorů β-sekretasové aktivity z rozdílu ve štěpení v přítomnosti proti štěpení v nepřítomnosti sloučeniny předpokládaného modulátoru, kde modulátor, kterým je antagonista β-sekretasy zpomaluje toto štěpení a modulátor, kteiým je agonista β-sekretasy zvyšuje toto štěpení.
55. 55. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že polypeptid první kompozice obsahuje polypeptid purifikovaný nebo isolovaný z buněk transformovaných nebo transfektovaných polynukleotidem obsahujícím nukleotidovou sekvenci, která kóduje tento polypetid.

    • ·

    99 9
56. 56. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že se polypeptid první kompozice exprimuje v buňce transformované nebo transfektované polynukleotidem obsahujícím nukleotidovou sekvenci, která kóduje tento polypetid a kde krok měření obsahuje měření aktivity zpracování β-amyloidního prekursorového proteinu buňky.
57. 57. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že první kompozice obsahuje purifikovaný lidský Asp2 polypeptid.
58. 58. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že první kompozice obsahuje rozpustný fragment lidského Asp2 polypeptidů, který zachovává aktivitu Asp2 β-sekretasy.
59. 59. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že rozpustný fragment je fragment postrádající Asp2 transmembránovou doménu.
60. 60. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že polypeptid, jako substrát, ze druhé kompozice obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEVNLDAEFR.
61. 61. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že polypeptid, jako substrát, ze druhé kompozice obsahuje aminokyselinovou sekvenci EVKMDAEF.
62. 62. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že druhá kompozice obsahuje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci lidského β-amyloidního prekursorového proteinu.
63. 63. Způsob podle nároku 62, vyznačující se tím, že lidský β-amyloidní prekursorový protein je vybraný ze skupiny sestávající z APP695, APP751 a APP770.
64. 64. Způsob podle nároku 63, vyznačující se tím, že lidský β-amyloidní prekurzorový protein obsahuje alespoň jednu mutaci vybranou z KM-^NL Švédské mutace a V-»F Londýnské mutace.
65. 65. Způsob podle nároku 62, vyznačující se tím, že polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci lidského β-amyloidního prekursorového proteinu dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci ♦· ·» »· ·· ·*« »»· ···♦«««· ♦ ! · · ·« · 9· • ·· ♦ *··*»« * ·♦ ·» ♦· ♦· ·»··· obsahující markér sekvence připojený amino koncem k aminokyselinové sekvenci lidského β-amyloidního prekursorového proteinu.
66. 66. Způsob podle nároku 62, vyznačující se tím, že polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci lidského β-amyloidního prekursorového proteinu dále obsahuje dva zbytky lysinu připojené ke karboxylovému konci aminokyselinové sekvence lidského β-amyloidního prekursorového proteinu.
67. 67. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že druhá kompozice obsahuje eukaryotickou buňku, která exprimuje β-amyloidní prekursorový protein nebo jeho fragment obsahující místo štěpení β-sekretasy.
68. 68. Způsob podle nároku 67, vyznačující se tím, že β-amyloidní prekursorový protein exprimovaný hostitelskou buňkou je variantou β-amyloidního prekursorového proteinu, která obsahuje dva karboxyl-terminální zbytky lysinu.
69. 69. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 54 až 68, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok léčby

    Alzheimerovy nemoci látkou stanovenou jako inhibitor Hu-Asp2 podle kroků a) až c).
70. 70. Použití látky stanovené jako inhibitor Hu-Asp2 podle kteréhokoliv z nároků 54 až 68 pro výrobu léku pro léčbu Alzheimerovy nemoci.
71. 71. Způsob stanovení látky, která inhibuje aktivitu lidské Asp2 aspartylproteasy, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

    a) pěstování buňky v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky, kde buňka exprimuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a exprimuje β-amyloidní prekursorový polypeptid, který obsahuje karboxy-terminální di-lysin;

    b) určení aktivity zpracování β-amyloidního prekursorového polypeptidu buňky v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky; a

    c) srovnání aktivity zpracování β-amyloidního prekursorového polypeptidu v přítomnosti testované látky s aktivitou v nepřítomnosti testované látky, aby se stanovila látka, která inhibuje aktivitu Hu-Asp2, kde redukovaná aktivita v přítomnosti testované látky svědčí o látce, která inhibuje Hu-Asp2.

    9 9 ·« 99 • · 99 9 9 9 9 9 • • 9 9 • 99 9 9 • 999 9 • 99 • • 9 9 • 9 9 • • 9 9 « • • 99 99 ♦ · 99 99 9
72. 72. Způsob podle nároku 71, vyznačující se tím, že β-amyloidní prekursorový polypeptid dále obsahuje Švédskou mutaci K—>N, M—>L přilehlou k místu zpracování β-sekretasy.
73. 73. Způsob podle z nároků 71 nebo 72, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka transformuje nebo transfektuje polynukleotidem obsahujícím nukleotidovou sekvenci, která kóduje Hu-Asp2, kde nuldeotidová sekvence je vybraná ze skupiny sestávající z:

    a) nukleotidové sekvence kódující Hu-Asp2(a) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 4;

    b) nukleotidové sekvence kódující Hu-Asp2(b) aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 6;

    c) nukleotidové sekvence kódující fragment Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) nebo Hu-Asp2(b) (SEQ ID NO: 6), kde fragment vykazuje charakteristiky aspartylproteasové aktivity Hu-Asp2(a) nebo Hu-Asp2(b); a

    d) nukleotidové sekvence polynukleotidu, která se hybridizuje v přísných hybridizačních podmínkách k Hu-Asp2-kódujícímu polynukleotidu vybraného ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5.
74. 74. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 71 až 73, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok léčby Alzheimerovy nemoci látkou stanovenou jako inhibitor Hu-Asp2 podle kroků a) až c).
75. 75. Použití látky stanovené jako inhibitor Hu-Asp2 podle kteréhokoliv z nároků 71 až 73 pro výrobu léku pro léčbu Alzheimerovy nemoci.
76. 76. Způsob snížení buněčné produkce β-amyloidu z β amyloidního prekursorového proteinu, obsahujícího krok transformace neb transfekce buněk pozitivním reagentem schopným snížit produkci Asp2 polypeptidu snížením transkripce nebo translace Asp2 v buňkách, kde snížená produkce Asp2 polypeptidu v buňkách koreluje se snížením zpracování β-amyloidního prekursorového polypeptidu na β-amyloid.
77. 77. Způsob snížení buněčné produkce β-amyloidu z β-amyloidního prekursorového proteinu, vyzačujícího se tím, že obsahuje následující kroky:

    a) stanovení savčích buněk, které produkují β-amyloid; a « ·

    b) transformace nebo transfekce buněk pozitivním reagentem schopným snížit produkci Asp2 polypeptidu snížením transkripce nebo translace Asp2 v buňkách, kde snížená produkce Asp2 polypeptidu v buňkách koreluje se snížením zpracování β-amyloidního prekursorového polypeptidu na β-amyloid.
78. 78. Způsob podle nároku 77, vyznačující se tím, že krok stanovení obsahuje diagnostikování Alzheimerovy nemoci, Alzheimerova nemoc koreluje s přítomností buněk, které produkují β-amyloid, který tvoří amyloidní plaky v mozku.
79. 79. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 76 až 78, vyznačující se tím, že buňka je nervovou buňkou.
80. 80. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 76 až 79, vyznačující se tím, že pozitivní reagent obsahuje oligonukleotid obsahující jednořetězovou sekvenci nukleové kyseliny schopné vázat Hu-Asp mRNA.
81. 81. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 76 až 80, vyznačující se tím, že pozitivní reagent oligonukleotid obsahující jednořetězovou sekvenci nukleové kyseliny schopné vázat Hu-Asp DNA.
82. 82. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci savčího β-amyloidního prekursorového proteinu nebo jeho fragmentu obsahující místo štěpení β-amyloidního prekursorového proteinu rozpoznatelné savčí β-sekretasou a dále obsahující dva lysinové zbytky na karboxylovém konci aminokyselinové sekvence savčího β-amyloidního prekursorového proteinu nebo fragmentu β-amyloidního prekursorového proteinu.
83. 83. Polypeptid podle nároku 82 obsahující aminokyselinovou sekvenci savčího β-amyloidního prekursorového proteinu a dále obsahuje dva lysinové zbytky na karboxylovém konci aminokyselinové sekvence savčího β-amyloidního prekursorového proteinu.
84. 84. Polypeptid podle nároku 82 nebo 83, kde savčí β-amyloidní prekursorový protein je lidský β-amyloidní prekurzorový protein.

    • Μ· ·· ·· »4·

    4 4 4 4 4 ·44

    4 4 44 4 44 • ·4 4#4 4 4 444 44 •444 4444 444 ♦· ·♦ 44 44 44444
85. 85. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 82 až 84, kde je lidský β-amyloidní prekursorový protein obsahuje alespoň jednu variantu vybranou ze skupiny sestávající ze Švédské mutace

    KM—>NL a Londýnské mutace V717->F.
86. 86. Popynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 82 až 85.
87. 87. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 86.
88. 88. Vektor podle nároku 87, kde polynukleotid je funkčně spojen s promotorem k podpoře exprese polypeptidu kódujícího polynukleotid v hostitelské buňce.
89. 89. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná polynukleotidem podle nároku 86 nebo vektorem podle nároku 87 nebo 88.
90. 90. Hostitelská buňka podle nároku 89, která je savčí buňkou.
91. 91. Isolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci alespoň z 95 % identickou se sekvencí vybrané ze skupiny sestávající z:

    a) nukleotidové sekvence kódující Hu-Asp polypeptid vybraný ze skupiny sestávající se z Hu-

    -Aspl, Hu-Asp(a) a Hu-Asp(b), kde Hu-Asp 1, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp(b) polypeptidy mají úplnou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ Π) NO:4 a SEQ ID NO:6; a

    b) nukleotidové sekvence komplementární k nukleotidové sekvenci a).
92. 92. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 91, kde Hu-Asp polypeptid je Hu-Aspl.
93. 93. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 91, kde Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(a).
94. 94. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 91, kde Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(b).
95. 95. Isolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující polynukleotid, který hybridizuje za přísných podmínek hybridizace k polynukleotidu obsahujícímu nukleotidovou sekvenci vybranou z:

    a) nukleotídové sekvence kódující Hu-Asp polypeptid vybraný ze skupiny sestávající se z Hu-Aspl, Hu-Asp(a) a Hu-Asp(b), kde Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp(b) polypeptidů, které mají úplnou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6; a

    b) nukleotídové sekvence komplementární k nukleotídové sekvenci a).
96. 96. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 91 až 95.
97. 97. Vektor podle nároku 96, kde molekula nukleové kyseliny je funkčně spojena s promotorem pro expresi Hu-Asp peptidu.
98. 98. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 96 nebo 97.
99. 99. Způsob získání Hu-Asp polypeptidu, vyznačující se tím, že se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 98 a isoluje se Hu-Asp polypeptid.
100. 100. Isolovaný Hu-Aspl polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci alespoň z 95 % identickou se sekvencí obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.2.
101. 101. Isolovaný Hu-Asp2(a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci alespoň z 95 % identickou se sekvencí obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:4.
102. 102. Isolovaný Hu-Asp2(a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci alespoň z 95 % identickou se sekvencí obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.
103. 103. Isolovaná protilátka, která se specificky váže k Hu-Asp polypeptidu podle kteréhokoliv nároku 100 až 102.
104. 104. Buňka podle nároku 98, jenž je bakteriální buňkou.
105. 105. Bakteriální buňka podle nároku 104, kde bakterie je E. coli.
106. 106. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 27 až 36 nebo 98, kde buňka je eukaryotická.

     • * * · ·· • 9 ·· *· • · · · 9 · * • · ·· · · • * · ♦ ···· · « ·♦ ·· 99 99 99 9
107. 107. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 27 až 36 nebo 98, kde buňka je hmyzí buňkou.
108. 108. Hmyzí buňka podle nároku 107, kde hmyzí je sf9 nebo High 5.
109. 109. Hmyzí buňka podle nároku 107, kde hmyzí buňkou je High 5.
110. 110. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 27 až 36 nebo 98, kde buňka je buňkou savčí.
111. 111. Savčí buňka podle nároku 110, vybraná ze skupiny sestávající z lidských buněk, buněk hlodavců, zajícovitých a primátů.
112. 112. Savčí buňka podle nároku 111, kde savčí buňka je buňkou lidskou.
113. 113. Savčí buňka podle nároku 112, vybraná ze skupiny sestávající z HEK293 a IMR-32 buněk.
114. 114. Savčí buňka podle nároku 111, kde buňka je buňka primáta.
115. 115. Buňka primáta podle nároku 114, buňka primáta je COS-7 buňka.
116. 116. Savčí buňka podle nároku 111, kde savčí buňka je hlodavčí buňka.
117. 117. Hlodavčí buňka podle nároku 116 vybraná ze skupiny obsahující CHO-K1, Neuro-2A, 3T3 buňky.
118. 118. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 27 až 36 nebo 98, kde buňkou je buňka kvasinek.
119. 119. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 27 až 36 nebo 98, kde buňkou je ptačí buňka.
120. 120. Isoforma β-amyloidního prekursorového proteinu modifikovaná tak, že alespoň dvě karboxy terminální aminokyseliny isoformy jsou lysiny.

     ·· ·· ♦· ♦ · * · · · · · ♦ ♦ ····« *··· · · ♦ ♦ · « · * · · »· ·· ·· ♦· ♦· ·« ·
121. 121. Isoforma β-amyloidního prekursorového proteinu podle nároku 120 obsahující isoformu známou jako APP695 modifikovanou tak, že posledními dvěma karboxy terminálními aminokyselinami jsou dva lysinové zbytky.
122. 122. Isoforma podle nároku 111 obsahující SEQ ID NO: 16.
123. 123. Isoformní varianta podle nároku 121 obsahující SEQ ID NO: 18 nebo 20.
124. 124. Nukleová kyselina kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 120 až 123.
125. 125. Eukaryotická buňka obsahující nukleové kyseliny podle nároku 124.
126. 126. Eukaryotická buňka obsahující polypeptid podle nároků 120 až 123.
127. 127. Eukaryotická buňka podle nároku 125 nebo 126, kde buňkou je savčí buňka.
128. 128. Savčí buňka podle nároku 127, vybraná ze skupiny sestávající z HEK293 a Neuro2a.
129. 129. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 39, 41 až 50, 54, 56 a 71 až 73, vyznačující se tím, že krok stanovení a měření obsahuje měření množství amyloidního β-peptidu uvolněného do buněčného růstového média a/nebo množství CTF99 fragmentů β-amyloidního prekursorového proteinu v buněčných lysatech.
130. 130. Způsob podle nároku 129, vyznačující se tím, že buňka je z lidské, hlodavčí nebo hmyzí buněčné linie.