ES2318905T3 - Conjunto de reactivos liquido, para la determinacion del l-lactato. - Google Patents
Conjunto de reactivos liquido, para la determinacion del l-lactato. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2318905T3 ES2318905T3 ES99953363T ES99953363T ES2318905T3 ES 2318905 T3 ES2318905 T3 ES 2318905T3 ES 99953363 T ES99953363 T ES 99953363T ES 99953363 T ES99953363 T ES 99953363T ES 2318905 T3 ES2318905 T3 ES 2318905T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hydrogen
- reagents
- agent
- lactate
- liquid reagents
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
- G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
- G06F2207/00—Indexing scheme relating to methods or arrangements for processing data by operating upon the order or content of the data handled
- G06F2207/72—Indexing scheme relating to groups G06F7/72 - G06F7/729
- G06F2207/7219—Countermeasures against side channel or fault attacks
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un conjunto de reactivos líquido para un ensayo espectrofotométrico del L-lactato, el cual conjunto de reactivos comprende: a) una lactato oxidasa; b) una peroxidasa, c) un dador de hidrógeno de estructura 1 ** ver fórmula** en donde R1 es hidrógeno o alquilo, R2 y R3 son, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo, o arilo; R4 es SO3M ó CO 2M, en donde M es hidrógeno o un catión; y R 5 es hidrógeno o alquilo; d) un agente que oxida por lo menos un 90% del ascorbato de una muestra e) un agente que oxida por lo menos un 90% de la bilirrubina de una muestra f) un compuesto que copula con un dador de hidrógeno oxidado, dando por resultado la formación de un agente cromógeno; y g) un tampón, en donde el conjunto de reactivos presenta un factor de calibración que varía en menos de un 10% durante un período de 20 días, cuando el conjunto de reactivos se almacena a aproximadamente 4ºC.
Description
Conjunto de reactivos líquidos, para la
determinación del L-lactato.
La presente invención se refiere a conjuntos de
reactivos líquidos que proporcionan estabilidad de calibración en
un ensayo espectrofotométrico basado en enzimas, para la medición
del lactato en muestras de un paciente. La presente invención se
refiere también a un método para el empleo de los reactivos
líquidos.
Para diagnosticar una enfermedad, un médico
busca a menudo la aparición de un marcador químico en un paciente.
El marcador químico es un compuesto específico que se expresa, o
bien en cantidades anormalmente altas o bien en cantidades bajas
durante el curso de una enfermedad. Un clínico examina el plasma de
un paciente y/o el fluido cefalorraquídeo, empleando un ensayo
específicamente diseñado para determinar cuantitativamente la
concentración del marcador. Cuando un médico observa las anormales
concentraciones del marcador, comprende que el paciente puede estar
padeciendo una enfermedad asociada.
El L-lactato es un marcador
químico que está asociado con un buen número de estados patológicos
que resultan de una reducida oxigenación de los fluidos biológicos.
Un shock, una neumonía y un fallo cardíaco congestivo producen
niveles aumentados de L-lactato en plasma. Se
observan niveles de L-lactato en el fluido
cefalorraquídeo anormalmente altos, como resultado de la meningitis
bacteriana, la hipocapnia y la isquemia cerebral.
Los científicos han desarrollado un cierto
número de ensayos enzimáticos para la determinación cuantitativa
del L-lactato en soluciones biológicas. El ensayo
empleado más corrientemente, se basa en la conversión enzimática
del lactato en piruvato (esquema 1). Ver la patente U.S. nº
4.166.763. El L-lactato se oxida a piruvato mediante
la lactato oxidasa (LOD). El peróxido de hidrógeno resultante es
utilizado por la peroxidasa (POD), la cual induce la copulación de
un dador de hidrógeno y un agente de copulación; se forma un
compuesto coloreado (cromógeno). La concentración del cromógeno se
mide espectrofotométricamente. Debido a que la concentración del
cromógeno, es directamente proporcional a la concentración de
lactato en la solución inicial, se puede calcular la concentración
del lactato observado.
Los ensayos clínicos de
L-lactato se efectúan principalmente por técnicos en
los laboratorios del hospital. Estos ensayos no se efectúan
normalmente como parte de un panel de ensayos de rutina. Cuando un
paciente padece una reducida oxigenación de los fluidos biológicos,
existe una necesidad crítica de un diagnóstico inmediato. En
consecuencia, un técnico debe ser capaz de determinar las
concentraciones de L-lactato tan rápidamente y
eficientemente como sea posible.
Existen varios pasos que un técnico debe
realizar para efectuar un ensayo espectrofotométrico basado en
enzimas, para el L-lactato. En primer lugar se
escoge la longitud de onda adecuada para la medición
espectrofotométrica del cromógeno. En segundo lugar se establece un
"factor de calibración", que permite la conversión matemática
de la medición espectrofotométrica del cromógeno en la concentración
observada del L-lactato. Se recoge la muestra de
plasma o fluido cefalorraquídeo de un paciente, y se prepara para el
ensayo. Finalmente la muestra preparada se mezcla con los reactivos
enzimáticos adecuados y se procede a la medición espectrofotométrica
de la absorbancia de la radiación por el cromógeno.
El técnico establece el factor de calibración
para la concentración de L-lactato, mediante la
correlación de la concentración original de
L-lactato en una muestra con la cantidad de
radiación absorbida por el cromógeno resultante. Para establecer
esta correlación hay que ser capaz de separar la absorbancia del
cromógeno de la absorbancia de otros componentes en el sistema de
ensayo. Este procedimiento está representado por el esquema 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El técnico combina concentraciones conocidas de
los reactivos del ensayo: lactato oxidasa, peroxidasa, un dador de
hidrógeno, un agente copulante, y cualquier otro elemento químico
necesario para efectuar la determinación espectrofotométrica. Se
retira un alícuota de la combinación del reactivo y se lee la
absorbancia en un espectrofotómetro. A la solución de reactivo en
stock, el técnico añade una cantidad predeterminada de
L-lactato y deja que la reacción enzimática que
proporciona el cromógeno, tenga lugar hasta que ha terminado
esencialmente. A continuación se retira un alícuota de la solución
que contiene el cromógeno, y se efectúa una segunda lectura de la
absorbancia sobre el espectrofotómetro. La diferencia entre las
lecturas espectrofotométricas final e inicial, del técnico, es el
"factor de calibración".
Un técnico puede emplear un único conjunto de
reactivos durante un largo período de tiempo; 90 días no es inusual
cuando el técnico refrigera los recipientes abiertos. Debido a que
los reactivos no son estables, el factor de calibración debe
determinarse frecuentemente durante este período de tiempo. Si se
pudiera calcular el factor de calibración para un conjunto de
reactivos una vez, y a continuación emplear dicho número durante
cada ensayo espectrofotométrico con el conjunto de reactivos, se
ahorraría una sustancial cantidad de tiempo en realizar un ensayo
de L-lactato. Este ahorro de tiempo permitiría al
médico una mayor rapidez y eficiencia en la interpretación de los
resultados del ensayo y en emitir un diagnóstico.
La patente
EP-A-0 371 513 describe una
composición de un reactivo líquido de lactato en la cual, el color
formado por el dador de hidrógeno es el
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina
(TOOS). Esta sustancia tiene un grupo hidroxilo en el radical
sulfopropilo y conduce a una variación muy alta de la absorbancia
durante un período de almacenamiento de 21 días. De esta forma, el
reactivo de la patente EP-A-0 371
513 no conduce a un reactivo que proporciona una alta calibración y
una estabilidad al almacenamiento.
Tamaoku et al., (Analytica Chimica Acta
vol. 136, 1982, páginas 121-127) describe el
compuesto TOPS
(N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina),
como un dador de hidrógeno perfeccionado para la determinación
espectrofotométrica del peróxido de hidrógeno, aunque solamente por
razones espectrales, lo cual es igualmente válido también para el
compuesto TOOS^{3} (ver Tamaoku et al., Chem. Pharm. Bull.
vol. 30(7), 1982, páginas 2492-2497). Ninguna
de las referencias de Tamaoku da una insinuación para emplear el
compuesto TOPS en lugar del compuesto TOOS en un reactivo líquido
previsto para un ensayo espectrofotométrico del
L-lactato, debido a su mayor estabilidad de
calibración.
\vskip1.000000\baselineskip
El empleo de un factor de calibración durante un
extenso período de tiempo, requiere que el factor de calibración
permanezca relativamente constante. En consecuencia, los componentes
del conjunto de reactivos no deben reaccionar químicamente entre sí
en el marco de tiempo dado para obtener productos que absorben la
radiación en la misma longitud de onda que el cromógeno.
Un conjunto de reactivos de ensayo puede estar,
o bien en forma de un cartucho de fase sólida, o bien en forma
líquida. Los cartuchos de fase sólida están limitados a ser
empleados en instrumentos especializados diseñados para recibir los
cartuchos. Los reactivos líquidos, por otra parte, pueden emplearse
en una gran variedad de instrumentos generalizados. Esta
versatilidad permite a los laboratorios de los hospitales, que
tengan menos instrumentos y por lo tanto reduce los costes
asociados a los ensayos de laboratorio. Además, cuando un reactivo
está en forma líquida, el usuario no necesita reconstituirlo antes
de efectuar el ensayo. Un técnico puede determinar más rápidamente
la concentración del L-lactato en un fluido
biológico y también eliminar los errores de mezclado asociados con
la reconstitución del reactivo.
El desarrollo de un conjunto de reactivos
líquido para un ensayo de L-lactato, que presenta un
factor de calibración relativamente constante, satisface una
importante necesidad. Proporciona un diagnóstico más eficiente de un
conjunto de condiciones médicas críticas. La presente inversión
proporciona un conjunto de reactivos líquido para un ensayo
espectrofotométrico del L-lactato.
En una versión, el conjunto de reactivos líquido
incluye una lactato oxidasa, una peroxidasa, un dador de hidrógeno
de estructura 1, un agente que oxida por lo menos el 90% del
ascorbato de la muestra,
\global\parskip0.970000\baselineskip
un agente que oxida por lo menos el
90% de la bilirrubina de una muestra, un compuesto que copula con un
dador de hidrógeno oxidado, dando por resultado la formación de un
agente cromógeno en un
tampón.
Los substituyentes del dador de hidrógeno 1 se
definen como sigue: R_{1} es hidrógeno o alquilo; R_{2} y
R_{3} son, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo o
arilo, R_{4} es SO_{3}M ó CO_{2}M, en donde M es hidrógeno o
un catión; y R_{5} es hidrógeno o alquilo. En esta versión el
conjunto de reactivos tiene un factor de calibración que varía en
menos de aproximadamente el 10% durante un período de
aproximadamente 20 días, cuando el conjunto de reactivos se
almacena a 4ºC.
En otra versión, la lactato oxidasa se aísla a
partir de un microorganismo.
En otra versión, la peroxidasa se aísla a partir
del rábano silvestre.
En otra versión, los substituyentes del dador de
hidrógeno, se definen como sigue: R_{1} es alquilo; R_{2} y
R_{3} son hidrógeno, R_{4} es SO_{3}M, en donde M es un
catión; y R_{5} es alquilo.
En otra versión, el agente que previene
substancialmente la interferencia del ácido ascórbico, es un agente
biológico oxidante.
En otra versión, el agente que previene
substancialmente la interferencia de la bilirrubina, es un agente
oxidante químico.
En otra versión, el agente de copulación es la
4-aminoantipirina, o un análogo de la
4-aminoantipirina.
En otra versión, el tampón es un tampón de
fosfato.
En otra versión, el conjunto de reactivos tiene
un factor de calibración que varía en menos de aproximadamente el
7% durante un período de aproximadamente 40 días.
En otra versión, el conjunto de reactivos
comprende además un conservante.
En otra versión, el conjunto de reactivos tiene
un factor de calibración que varía en menos de aproximadamente el
7% durante un período de aproximadamente 40 días, y los
substituyentes del dador de hidrógeno se definen como sigue:
R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno, R_{4} es
SO_{3}M, en donde M es sodio; y R_{5} es metilo.
En otra versión, el conjunto de reactivos
comprende además un conservante, y dicho conservante es la azida de
sodio.
En otra versión, el conjunto de reactivos
comprende además un conservante, y el conservante es la azida de
sodio. En esta versión, los substituyentes del dador de hidrógeno se
definen como sigue: R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son
hidrógeno, R_{4} es SO_{3}M, en donde M es sodio; y R_{5} es
metilo.
En otra versión, el conjunto de reactivos
comprende un conservante, y el conservante es la azida de sodio. En
esta versión, el tampón es un tampón de fosfato, y los
substituyentes del dador de hidrógeno se definen como sigue:
R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno, R_{4} es
SO_{3}M, en donde M es sodio; y R_{5} es metilo.
En otra versión, el conjunto de reactivos
comprende además un conservante, y el conservante es la azida de
sodio. En esta versión el tampón es un tampón de fosfato, y los
substituyentes del dador de hidrógeno se definen como sigue:
R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno, R_{4} es
SO_{3}M, en donde M es sodio; y R_{5} es metilo. Este conjunto
de reactivos tiene un factor de calibración que varía en menos de
aproximadamente el 7% durante un período de aproximadamente 40
días.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En otra versión, el conjunto de reactivos
comprende un conservante, y el conservante es la azida de sodio. En
esta versión, el tampón es un tampón de fosfato, y los
substituyentes del dador de hidrógeno se definen como sigue:
R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno, R_{4} es
SO_{3}M, en donde M es sodio; y R_{5} es metilo. Este conjunto
de reactivos tiene un factor de calibración que varía en menos de
aproximadamente el 5% durante un período de aproximadamente 60
días.
La presente inversión proporciona también un
método para la determinación de la concentración del
L-lactato en un fluido biológico.
En una versión, el método incluye los siguientes
pasos: recogida de un fluido biológico a partir de un individuo; y,
realización de un ensayo espectrofotométrico sobre un fluido
biológico recogido de un individuo empleando un conjunto de
reactivos líquido. El conjunto de reactivos líquido en esta versión
incluye una lactato oxidasa, una peroxidasa, un dador de hidrógeno
de estructura 1, un agente que oxida por lo menos el 90% del
ascorbato de una muestra, un agente que
oxida por lo menos el 90% de la
bilirrubina de una muestra, un compuesto que copula con un dador de
hidrógeno oxidado, dando por resultado la formación de un agente
cromógeno, y un tampón. Los substituyentes del dador de hidrógeno 1
se definen como sigue: R_{1} es hidrógeno o alquilo; R_{2} y
R_{3} son, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo o
arilo; R_{4} es SO_{3}M ó CO_{2}M, en donde M es hidrógeno o
un catión; y R_{5} es hidrógeno o alquilo. El conjunto de
reactivos tiene un factor de calibración que varía en menos de
aproximadamente el 10% durante un período de aproximadamente 20
días, cuando el conjunto de reactivos se almacena a
4ºC.
En otra versión, los substituyentes del dador de
hidrógeno del conjunto de reactivos líquido empleados en el método
de la determinación del L-lactato, se definen como
sigue: R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno; R_{4}
es SO_{3}M, en donde M es el ión sodio; y R_{5} es metilo.
La presente invención proporciona también un
método para la determinación de la concentración del
L-lactato en un fluido biológico, en el cual el
conjunto de reactivos empleado en la determinación, incluye un
conservante.
En una versión, el método incluye los siguientes
pasos: recogida de un fluido biológico de un individuo; y
realización de un ensayo espectrofotométrico sobre el fluido
biológico empleando un conjunto de reactivos líquido. El conjunto
de reactivos líquido en esta versión incluye una lactato oxidasa,
una peroxidasa, un dador de hidrógeno de estructura 1, un agente
que evita sustancialmente la interferencia del ácido ascórbico,
un
agente que evita substancialmente
la interferencia de la bilirrubina, un agente de copulación, un
tampón, y un conservante. Los substituyentes sobre el dador de
hidrógeno 1 se definen como sigue: R_{1} es hidrógeno o alquilo;
R_{2} y R_{3} son, independientemente entre sí, hidrógeno,
alquilo o arilo; R_{4} es SO_{3}M ó CO_{2}M, en donde M es
hidrógeno o un catión; y R_{5} es hidrógeno o alquilo. El conjunto
de reactivos tiene un factor de calibración que varía en menos del
10% durante un período de aproximadamente 20 días, cuando el
conjunto de reactivos se almacena a
4ºC.
En otra versión, los substituyentes del dador de
hidrógeno del conjunto de reactivos líquido empleado en el método
de determinación del L-lactato, se definen como
sigue: R_{1} es metilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno; R_{4}
es SO_{3}M, en donde M es el ión sodio; y R_{5} es metilo.
La figura 1 muestra una estructura general para
un dador de hidrógeno de la presente invención.
"Fluido biológico" se refiere a cualquier
sustancia líquida extraída de un organismo vivo. De preferencia, el
fluido biológico será o bien un plasma o bien un fluido
cefalorraquídeo. Con más preferencia, el fluido biológico será, o
bien un plasma o bien un fluido cefalorraquídeo de un humano.
"Factor de calibración" es un número que
permite que matemáticamente se convierta la medición
espectrofotométrica de un cromógeno en la concentración observada
de L-lactato. Se obtiene este número correlacionando
una concentración conocida de L-lactato en una
muestra, con la cantidad de radiación UV absorbida por el cromógeno
producido por la reacción del L-lactato. Este
proceso se ilustra en el esquema 2.
"Dador de hidrógeno" se refiere a un
compuesto que es oxidado en una reacción química, dando por
resultado la formación de un cromógeno en un ensayo
espectrofotométrico. Los dadores de hidrógeno son ya conocidos en
la técnica, y ejemplos de dadores de hidrógeno incluyen, aunque no
están limitados a, el siguiente compuesto: sal sódica de la
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina.
"Agente copulante" se refiere a un
compuesto que copula con un dador de hidrógeno oxidado, dando por
resultado la formación de un cromógeno en un ensayo
espectrofotométrico. Agentes copulantes son ya conocidos en la
técnica, y ejemplos de agentes copulantes incluyen, aunque no están
limitados a, los siguientes compuestos;
4-aminoantipirina;
4-amino-3-pirazolina-5-onas
trisubstituidas, como por ejemplo la
1-(2,4,6-tricloro-fenil)-2,3-dimetil-4-amino-pirazolin-5-ona,
y la
1-(3,5-di-clorofenil)-2,3-dimetil-4-amino-3-pirazolin-5-ona;
y análogos de la 4-aminoantipirina, como por
ejemplo la
1-fenil-2,3-dimetil-4-dimetilamino-3-pirazolin-5-ona.
De preferencia, el agente copulante es la
4-aminoantipirina.
"Factor de calibración substancialmente
estable", se refiere a un factor de calibración que no varía en
más de aproximadamente un 10% durante un período de aproximadamente
20 días. De preferencia, el factor de calibración no varía en más
de aproximadamente el 7% durante un período de aproximadamente 20
días. Con más preferencia, el factor de calibración no varía en más
de aproximadamente el 7% durante un período de aproximadamente 40
días. Todavía con mayor preferencia, el factor de calibración no
varía en más del 5% durante un período de aproximadamente 40 días.
Con la máxima preferencia, el factor de calibración no varía en más
de aproximadamente el 5% durante un período de 60 días.
"Agente que previene substancialmente la
interferencia del ácido ascórbico", se refiere a un compuesto
oxidante químico o biológico. La interferencia del ácido ascórbico
resulta de la conversión del ácido ascórbico en ascorbato, el cual
actúa para reducir un cromógeno en un ensayo espectrofotométrico. El
agente químico o biológico oxida por lo menos el 90% del ascorbato
a ácido ascórbico en una muestra, con lo cual previene
substancialmente la interferencia. De preferencia, el agente oxida
por lo menos el 95% del ascorbato a ácido ascórbico. Con más
preferencia, el agente oxida por lo menos el 99% del ascorbato a
ácido ascórbico.
"Agente que previene substancialmente la
interferencia de la bilirrubina", se refiere a un compuesto
oxidante químico o biológico. La interferencia de la bilirrubina
resulta debido a que la bilirrubina absorbe luz a las longitudes de
onda corrientemente empleadas en los ensayos espectrofotométricos.
El agente químico o biológico oxida por lo menos el 90% de la
bilirrubina en una muestra, por lo que previene substancialmente la
interferencia. De preferencia, el agente oxida por lo menos el 95%
de la bilirrubina. Con mayor preferencia, el agente oxida por lo
menos el 99% de la bilirrubina.
La presente invención se refiere a conjuntos de
reactivos líquidos que proporcionan estabilidad de calibración en
un ensayo espectrofotométrico basado en enzimas, para la medición
del lactato en muestras de pacientes. Los conjuntos de reactivos
para el ensayo espectrofotométrico incluyen una lactato oxidasa, una
peroxidasa, un dador de hidrógeno, un agente que previene
substancialmente la interferencia del ácido ascórbico, un agente
que previene substancialmente la interferencia de la bilirrubina, un
agente copulante, un tampón y, opcionalmente, un conservante.
Un experto normalmente experimentado en la
especialidad, comprenderá que puede emplearse cualquier lactato
oxidasa que sea adecuada para el ensayo espectrofotométrico. La
lactato oxidasa debe ser específica para el
L-lactato, soluble, libre de catalasa y altamente
estable. Un ejemplo no limitante de una lactato oxidasa que
satisface estos criterios es la producida por el Streptococcus
faecalis. Ver la patente U.S. nº 4.166.763. De preferencia, la
lactato oxidasa empleada en la presente invención se aísla a partir
de un microorganismo.
La lactato oxidasa está presente en el conjunto
de reactivos a una concentración que oscila desde aproximadamente
2,6 U/ml a aproximadamente 17,5 U/ml. Con más preferencia la lactato
oxidasa está presente en una concentración que oscila desde
aproximadamente 10,0 U/ml hasta aproximadamente 17,5. Con mayor
preferencia, la lactato oxidasa está presente en una concentración
que oscila desde aproximadamente 12,5 U/ml hasta aproximadamente
17,5 U/ml. Con la máxima preferencia, la lactato oxidasa está
presente en una concentración de aproximadamente 15,0 U/ml.
La peroxidasa empleada en la presente invención
puede aislarse a partir de una variedad de fuentes. Una lista no
limitante de fuentes de peroxidasa incluye el rábano silvestre, las
patatas, la savia de higuera, los nabos (peroxidasa vegetal), la
leche (peroxidasa láctea), corpúsculos blancos de la sangre (verdo
peroxidasa) y microorganismos. Ver la patente U.S. nº 4.166.763.
Ciertas peroxidasas sintéticas son también adecuadas para emplear
en la presente invención. Ver Theorell et al., (1950) Act
Chem. Scand. 4:422-433. De preferencia, la
peroxidasa se aísla a partir del rábano silvestre.
La peroxidasa está presente en el conjunto de
reactivos a una concentración que oscila desde aproximadamente 2,0
U/ml hasta aproximadamente 30,0 U/ml. De preferencia, la peroxidasa
está presente en una concentración que oscila desde aproximadamente
10 U/ml hasta aproximadamente 30,0 U/ml. Con más preferencia, la
peroxidasa está presente a una concentración que oscila desde
aproximadamente 20 U/ml hasta aproximadamente 30,0 U/ml. Con la
máxima preferencia, la peroxidasa está presente en una concentración
de aproximadamente 24 U/ml.
El dador de hidrógeno empleado en la presente
invención es una anilina derivada de la siguiente estructura:
En donde R_{1} es hidrógeno o alquilo; R_{2}
y R_{3} son, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo o
arilo; R_{4} es SO_{3}M ó CO_{2}M, en donde M es hidrógeno o
un catión; y R_{5} es hidrógeno o alquilo. De preferencia R_{1}
es alquilo, R_{2} y R_{3} son hidrógeno; R_{4} es SO_{3}M; y
R_{5} es alquilo. Con más preferencia R_{1} es metilo, etilo o
propilo; R_{2} y R_{3} son hidrógeno, R_{4} es SO_{3}Na; y
R_{5} es metilo, etilo o propilo. Con la máxima preferencia
R_{1} es metilo, R_{2} y R_{3} son hidrógeno; R_{4} es
SO_{3}Na; y R_{5} es metilo (sal de sodio de la
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina).
(Para la síntesis de estos compuestos, ver Tamaoku et al.,
(1982). Anal. Chim. Acta 136: 121-127 y Tamaoku
et al., (1982) Chem. Pharm. Bull. 30:
2492-2497).
Un dador de hidrógeno empleado en la presente
invención no reaccionará químicamente consigo mismo u otros
componentes del conjunto de reactivos para proporcionar una cantidad
sustancial de un producto cromogénico a aproximadamente 4ºC. Se
puede seleccionar un dador de hidrógeno para emplear en la presente
invención, por ejemplo, midiendo la absorbancia de un conjunto
particular de reactivos, el cual se almacena a aproximadamente 4ºC
durante un extenso período de tiempo. Por ejemplo, el día 0 se
mezclan alícuotas de los reactivos A y B. Después de un tiempo de
143-190 segundos, se mide la absorbancia de la
muestra a 660 nm.
En los días 7, 14 y 21, se repite el
procedimiento. Cuando el valor de la absorbancia en el día 21 es más
de aproximadamente el 10% diferente del valor de la absorbancia en
el día 0, el conjunto de reactivos no proporciona un factor de
calibración relativamente estable; el dador de hidrógeno incluido en
el conjunto de reactivos no debe seleccionarse.
Este procedimiento puede ilustrarse además a
través del empleo de un cálculo de muestra. El dador de hidrógeno X
está incluido en un conjunto de reactivos. En el día 0, el conjunto
de reactivos proporciona una lectura de la absorbancia de 100. Las
lecturas de la absorbancia para el conjunto de reactivos en los días
7, 14 y 21 son respectivamente, 104, 109 y 114. Entre el día 21 y
el día 0 ha habido una variación del 14% en la lectura de la
absorbancia: (114 -100)/
100 = 14%. El dador de hidrógeno X no debe ser seleccionado para emplear en la presente invención.
100 = 14%. El dador de hidrógeno X no debe ser seleccionado para emplear en la presente invención.
El dador de hidrógeno está presente en el
conjunto de reactivos en una concentración que oscila desde
aproximadamente 0,48 g/l (1,75 mM) a aproximadamente 1,92 g/l (7
mM). De preferencia, el dador de hidrógeno está presente en una
concentración que oscila desde aproximadamente 0,75 g/l hasta
aproximadamente 1,5 g/l. Con más preferencia, el dador de hidrógeno
está presente en una concentración que oscila desde aproximadamente
0,85 g/l hasta aproximadamente 1,25 g/l. Con más preferencia, el
dador de hidrógeno está presente en una concentración de
aproximadamente 0,98 g/l.
El agente que previene substancialmente la
interferencia del ácido ascórbico es un agente oxidante, o bien
químico o bien biológico. Los agentes oxidantes químicos que
previenen la interferencia del ácido ascórbico incluyen, sin
limitación, el Fe(III)-HEDTA y yodato. La
ascorbato oxidasa es un ejemplo de agente oxidante biológico que se
emplea en la presente invención. De preferencia el agente es un
agente oxidante biológico. Con más preferencia, es la ascorbato
oxidasa.
El agente que previene substancialmente la
interferencia del ácido ascórbico está presente en el conjunto de
reactivos en una concentración que oscila desde aproximadamente 26,0
U/ml hasta aproximadamente 34,0 U/ml. De preferencia, el agente
está presente en una concentración que oscila desde aproximadamente
28,0 U/ml hasta aproximadamente 32 U/ml. Con mayor preferencia, el
agente está presente en una concentración que oscila desde
aproximadamente 29,0 U/ml hasta aproximadamente 31,0 U/ml. Con la
mayor preferencia, el agente está presente en una concentración de
aproximadamente 30,0 U/ml.
El agente que previene substancialmente la
interferencia de la bilirrubina es un agente oxidante o bien químico
o bien biológico. La bilirrubina oxidasa es un ejemplo de un agente
oxidante biológico que se emplea en la presente invención. Los
agentes químicos de oxidación que previenen la interferencia de la
bilirrubina, incluyen, sin ser limitante, el ferrocianuro de
potasio, el ferrocianuro de sodio, el ferrocianuro de calcio, el
ferrocianuro de amonio, y los compuestos que son capaces de generar
ferrocianuro. De preferencia, el agente es un agente de oxidación
químico. Con más preferencia es el ferrocianuro de potasio
(K_{4}[Fe(CN)_{6}]).
El agente que previene substancialmente la
interferencia de la bilirrubina está presente en el conjunto de
reactivos en una concentración que oscila desde aproximadamente 0,08
g/l a aproximadamente 0,2 g/l. De preferencia, el agente está
presente en una concentración que oscila desde aproximadamente 0,09
g/l a aproximadamente 0,15 g/l. Con más preferencia, el agente está
presente en una concentración que oscila desde aproximadamente 0,1
g/l hasta aproximadamente 0,14 g/l. Con la mayor preferencia, el
agente está presente en una concentración de aproximadamente
0,13 g/l.
0,13 g/l.
El agente copulante es un compuesto que copula
con un dador de hidrógeno oxidado para proporcionar un cromógeno.
Ejemplos de agentes copulantes incluyen, pero no están limitados
por, los siguientes compuestos: 4-aminoantipirina;
4-amino-3-pirazolin-5-onas
trisubstituidas, tales como la
1-(2,4,6-triclorofenil)-2,3-dimetil-4-amino-pirazolin-5-ona
y la
1-(3,5-diclorofenil)-2,3-dimetil-4-amino-3-pirazolin-5-ona;
y análogos de la 4-aminoantipirina tales como la
1-fenil-2,3-dimetil-4-dimetilamino-3-pirazolin-5-ona.
De preferencia, el agente copulante es la
4-aminoantipirina o un análogo de la
4-aminoantipirina. Con más preferencia, el agente
copulante es la 4-aminoantipirina.
El agente copulante está presente en el conjunto
de reactivos a una concentración que oscila desde aproximadamente
1,0 mM hasta aproximadamente 7,0 mM. De preferencia el agente
copulante está presente en una concentración que oscila desde
aproximadamente 2,0 mM hasta aproximadamente 6,0 mM. Con más
preferencia, el agente copulante está presente en una concentración
que oscila desde aproximadamente 2,5 mM hasta aproximadamente 5,5
mM. Con la mayor preferencia, el agente copulante está presente en
una concentración de aproximadamente 2,9 mM.
El tampón es de una capacidad tamponante
adecuada para mantener un margen de pH desde aproximadamente 6,0
hasta aproximadamente 7,9 en el conjunto de reactivos. De
preferencia, el sistema tampón conserva un margen de pH de
aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,9. Con más preferencia,
el sistema tampón conserva un margen de pH de aproximadamente 7,5
hasta aproximadamente 7,9. Con la mayor preferencia, el sistema
tampón conserva un margen de pH de aproximadamente 7,7 hasta
7,9.
Ejemplos no limitantes de un tampón, incluyen el
fosfato, HEPES, ácido 4-morfolin propanosulfónico
(MOPS), ácido
2-[tris(hidroximetil)metilamino]-1-etano-sulfónico
(TES), y TRIS. De preferencia, el tampón es un tampón de
fosfato.
Los conjuntos de reactivos de la presente
invención contienen opcionalmente un conservante. Ejemplos no
limitantes de conservantes incluyen, la azida de sodio, el ácido
hidroxibenzoico, la gentamicina, el timol y conservantes exentos de
mercurio. De preferencia, el conservante es la azida de sodio.
El conservante cuando está en el conjunto de
reactivos, está presente en una concentración que oscila desde
aproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 0,4%. De
preferencia, el conservante está presente en un margen de
concentración desde aproximadamente el 0,075% hasta aproximadamente
el 0,3%. Con más preferencia, el conservante está presente en un
margen de concentración desde aproximadamente el 0,085% hasta
aproximadamente el 0,25%. Con la máxima preferencia el conservante
está presente en una concentración que oscila desde aproximadamente
el 0,09% hasta aproximadamente el 0,2%.
Un conjunto de reactivos de la presente
invención que no contiene un conservante en presencia de un dador
de hidrógeno, cuando se almacena a una temperatura de
aproximadamente 35ºC, proporcionará un factor de calibración que
varía en menos de aproximadamente un 10% durante un período de
aproximadamente 20 días. De preferencia, el conjunto de reactivos
proporcionará un factor de calibración que varía en menos de
aproximadamente un 10% durante un período de aproximadamente 40
días. Con más preferencia, el conjunto de reactivos proporcionará
un factor de calibración que varía en menos de aproximadamente un 7%
durante un período de aproximadamente 40 días.
Un conjunto de reactivos de la presente
invención que contenga un conservante en presencia de un dador de
hidrógeno, cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente
4ºC, proporcionará un factor de calibración que varía en menos de
aproximadamente un 10% durante un período de aproximadamente 20
días. De preferencia, el conjunto de reactivos proporcionará un
factor de calibración que varía en menos de aproximadamente un 7%
durante un período de aproximadamente 20 días. Con más preferencia,
el conjunto de reactivos proporcionará un factor de calibración que
varía en menos de aproximadamente un 7% durante un período de
aproximadamente 40 días. Todavía con mayor preferencia, el conjunto
de reactivos proporcionará un factor de calibración que varía en
menos de aproximadamente un 5% durante un período de aproximadamente
40 días. Con la máxima preferencia el conjunto de reactivos
proporcionará un factor de calibración que varía en menos de un 5%
durante un período de aproximadamente 60 días.
El conjunto de reactivos que consiste
esencialmente en composiciones R1 y R2 es una versión preferida de
la presente invención. El reactivo R1 contiene NaH_{2}PO_{4} x
H_{2}O, Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O, azida de sodio, ascorbato
oxidasa y
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina,
sal de sodio, como el dador de hidrógeno. El reactivo R2 contiene
CaCl_{2} x 2H_{2}O, NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O, NaHPO_{4} x
2H_{2}O, azida de sodio,
K_{4}[Fe(CN)_{6} x 3H_{2}O,
4-AAP, lactato oxidasa y peroxidasa.
El conjunto de reactivos R1 y R2 proporciona una
estabilidad de calibración en un ensayo espectrofotométrico basado
en enzimas, para la medición del lactato. La absorbancia del
conjunto de reactivos a 660 nm se midió en los días 0, 7, 14 y 21.
En el día 0, la absorbancia fue de 86. En los días 7, 14 y 21, la
absorbancia fue respectivamente de 83, 83 y 83. Entre los días 21 y
0, por lo tanto, hubo una variación en la absorbancia de
aproximadamente solamente el 3,5%: (86 -83)/86.
Este resultado debe ser contrastado con un
conjunto de reactivos similar, en donde el dador de hidrógeno, la
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina,
sal de sodio, fue sustituida por la
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina,
sal de sodio. Al igual que con el conjunto de reactivos anteriores,
la absorbancia se midió en los días 0, 7, 14 y 21. La absorbancia
en aquellos días fue respectivamente de 59, 105, 131 y 155. Hubo una
variación en la absorbancia de aproximadamente el 163% entre los
días 21 y 0: (155 -59)/59.
En otra versión preferida, el conjunto de
reactivos consiste esencialmente en los reactivos R3 y R4. El
reactivo R3 contiene NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O,
Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O, ascorbato oxidasa y
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina,
sal de sodio, como dador de hidrógeno. El reactivo R4 contiene
CaCl_{2} x 2H_{2}O, NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O,
Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O, azida de sodio,
K_{4}[Fe(CN)_{6}]x 3H_{2}O,
4-AAP, lactato oxidasa y peroxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de reactivos R3 y R4 proporcionan
también una estabilidad de calibración en un ensayo
espectrofotométrico basado en enzimas, para la medición del
lactato. Se midió la absorbancia del conjunto de reactivos R3 y R4
a 660 nm durante un período de 48 días a 35ºC y se comparó con la
absorbancia del conjunto de reactivos R1 y R2 en las mismas
condiciones. El conjunto de reactivos R1 y R2 tuvo una variación de
aproximadamente un 23% durante un período de 48 días; el conjunto
de reactivos R3 y R4 tuvo una variación de aproximadamente un 7%
durante un período de 48 días.
\vskip1.000000\baselineskip
LOD, lactato oxidasa; POD, peroxidasa;
4-AAP, 4-aminoantipirina;
H_{2}O_{2}, peróxido de hidrógeno; TOPS,
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina;
TOOS,
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina;
NaN_{3}, azida de sodio.
Las mediciones de lactato se efectuaron
empleando un analizador Boehringer Mannheim/Hitachi 717. La
longitud de onda primaria empleada para el análisis
espectrofotométrico fue 660 nm. La longitud de onda secundaria
empleada para el análisis espectrofotométrico fue 700 nm. Los
siguientes reactivos se obtuvieron en Boehringer Mannheim GmbH:
lactato oxidasa (número ID 1 798 197); peroxidasa (número de
catálogo 012 1606 102);
K_{4}[Fe(CN)_{6}]x 3H_{2}O (número
ID 0 034 592 001); ascorbato oxidasa (número de catálogo 0 199 605
102); y tampón de fosfato (número de ID 0 004 537). La azida de
sodio se compró en Fairmont Chemical Company (número de catálogo
4565). La
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina,
sal de sodio, fue adquirida en Research Organics (número de
catálogo 3026 E). Otros dadores de hidrógeno fueron sintetizados de
acuerdo con los métodos descritos en Tamaoku et al., (1982)
Anal. Chim. Acta 136:121-127 y Tamaoku et
al., (1982) Chem. Pharm. Bull.
30:2492-2497.
Una muestra de fluido biológico (3 \mul), se
introdujo en una cubeta a 37ºC (baño María controlado), en un
analizador Boehringer Mannheim/Hitachi 717. Se añadió el reactivo
R1 (tabla 1, 250 \mul) y se mezcló con la muestra biológica.
Después de 5 minutos de incubación, se añadió el reactivo R2 (tabla
1, 50 \mul) y se mezcló. La cubeta se dejó en reposo durante
140-193 segundos. Se midió la absorbancia de la
muestra a 660 nm.
Se introdujeron aproximadamente 800 ml de agua
desionizada, de alta pureza, en un recipiente de polipropileno. Se
disolvieron NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O (1,06 g) y
Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O (16,82 g), en el agua desionizada. A
continuación se añadieron NaN_{3} (0,95 g), TOPS (0,98 g), y
30.000 unidades de ascorbato oxidasa, a la solución y se
disolvieron. La solución se agitó y el volumen se ajustó a 1,0
litros con agua desionizada, de alta pureza. El reactivo R1 se
almacenó a 2-8ºC.
Se introdujeron aproximadamente 800 ml de agua
desionizada, de alta pureza, en un recipiente de polipropileno. Se
disolvieron CaCl_{2} x 2 H_{2}O (1,17 mg), NaH_{2}PO_{4} x
H_{2}O (1,06 g) y Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O (16,82 g), en el
agua desionizada. A continuación se añadieron NaN_{3} (0,95 g),
K_{4}[Fe(CN)_{6}] x 3 H_{2}O (0,127 g) y
4-AAP (1,016 g), a la solución y se disolvieron. Se
añadió LOD (15.000 unidades) cuidadosamente, y se disolvió. Se
añadió POD (24.000 unidades) cuidadosamente y se disolvió. El
volumen de la solución se ajustó a 1,0 litro con agua desionizada,
de alta pureza. El reactivo R2 se almacenó a
2-8ºC.
Una muestra de fluido biológico (3 \mul), se
introdujo en una cubeta a 37ºC (baño María controlado), en un
analizador Boehringer Mannheim/ Hitachi 717. El reactivo R3 (tabla
1, 250 \mul) se añadió y se mezclo con la muestra biológica.
Después de 5 minutos de incubación, se añadió el reactivo R4 (tabla
1, 50 \mul) y se mezcló. La cubeta se dejó en reposo durante
140-193 segundos. Se midió la absorbancia de la
muestra a 660 nm.
Se introdujeron aproximadamente 800 ml de agua
desionizada, de alta pureza, en un recipiente de polipropileno. Se
disolvieron NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O (1,06 g) y
Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O (16,82 g), en el agua desionizada. A
continuación se añadieron TOPS (0,98 g), y 30.000 unidades de
ascorbato oxidasa, a la solución y se disolvieron. La solución se
agitó y el volumen se ajustó a 1,0 litros con agua desionizada, de
alta pureza. El reactivo R3 se almacenó a 2-8ºC.
\newpage
Se introdujeron aproximadamente 800 ml de agua
desionizada, de alta pureza, en un recipiente de polipropileno. Se
disolvieron CaCl_{2} x 2 H_{2}O (1,17 mg), NaH_{2}PO_{4} x
H_{2}O (1,06 g) y Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O (16,82 g), en el
agua desionizada. A continuación se añadieron NaN_{3} (0,95 g),
K_{4}[Fe(CN)_{6}] x 3 H_{2}O (0,127 g) y
4-AAP (1,016 g), a la solución y se disolvieron. Se
añadió LOD (15.000 unidades) cuidadosamente, y se disolvió. Se
añadió POD (24.000 unidades) cuidadosamente y se disolvió. El
volumen de la solución se ajustó a 1,0 litros con agua desionizada,
de alta pureza. El reactivo R4 se almacenó a
2-8ºC.
Claims (14)
1. Un conjunto de reactivos líquido para un
ensayo espectrofotométrico del L-lactato, el cual
conjunto de reactivos comprende:
a) una lactato oxidasa;
b) una peroxidasa,
c) un dador de hidrógeno de estructura 1
en donde R_{1} es hidrógeno o
alquilo, R_{2} y R_{3} son, independientemente entre sí,
hidrógeno, alquilo, o arilo; R_{4} es SO_{3}M ó CO_{2}M, en
donde M es hidrógeno o un catión; y R_{5} es hidrógeno o
alquilo;
d) un agente que oxida por lo menos un 90% del
ascorbato de una muestra
e) un agente que oxida por lo menos un 90% de la
bilirrubina de una muestra
f) un compuesto que copula con un dador de
hidrógeno oxidado, dando por resultado la formación de un agente
cromógeno; y
g) un tampón,
en donde el conjunto de reactivos presenta un
factor de calibración que varía en menos de un 10% durante un
período de 20 días, cuando el conjunto de reactivos se almacena a
aproximadamente 4ºC.
2. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con la reivindicación 1, en donde la lactato oxidasa se aísla a
partir de un microorganismo.
3. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2, en donde la peroxidasa se aísla a
partir de rábanos silvestres.
4. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con la reivindicación 1, en donde los substituyentes del dador de
hidrógeno son como sigue: R_{1} es alquilo; R_{2} y R_{3} son
hidrógeno; R_{4} es SO_{3}M, en donde M es un catión; y R_{5}
es alquilo.
5. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el
agente que oxida por lo menos un 90% del ascorbato en una muestra,
es un agente oxidante biológico.
6. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el
agente que oxida por lo menos un 90% de la bilirrubina en una
muestra, es un agente oxidante químico.
7. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el
agente copulante es la 4-aminoantipirina.
8. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el
tampón es un tampón de fosfato.
9. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el
conjunto de reactivos presenta un factor de calibración que varía en
menos del 7% durante un periodo de 40 días.
10. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con la reivindicación 1, en donde los substituyentes del dador de
hidrógeno se definen como sigue: R_{1} es metilo, R_{2} y
R_{3} son hidrógeno; R_{4} es SO_{3}M, en donde M es Na; y
R_{5} es metilo, y en donde el tampón es un tampón de fosfato y en
donde el conjunto de reactivos comprende además azida de sodio como
conservante, y en donde el conjunto de reactivos presenta un factor
de calibración que varía en menos del 5% durante un período de 60
días.
11. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el
conjunto de reactivos comprende además un conservante.
12. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con la reivindicación 11, en donde el conservante es la azida de
sodio.
13. Un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo
con la reivindicación 1, en donde los substituyentes del dador de
hidrógeno se definen como sigue: R_{1} es metilo, R_{2} y
R_{3} son hidrógeno; R_{4} es SO_{3}M, en donde M es Na; y
R_{5} es metilo, y en donde el tampón es un tampón de fosfato.
14. Un método para la determinación de la
concentración de L-lactato en un fluido biológico,
que comprende la realización sobre un fluido biológico el cual ha
sido extraído de un individuo, un ensayo espectrofotométrico
empleando un conjunto de reactivos líquido, de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8723098P | 1998-05-29 | 1998-05-29 | |
| US87230 | 1998-05-29 | ||
| US94235 | 1998-06-09 | ||
| US09/094,235 US6030802A (en) | 1998-05-29 | 1998-06-09 | Liquid reagent set for L-lactate determination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2318905T3 true ES2318905T3 (es) | 2009-05-01 |
Family
ID=26776752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99953363T Expired - Lifetime ES2318905T3 (es) | 1998-05-29 | 1999-05-28 | Conjunto de reactivos liquido, para la determinacion del l-lactato. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6030802A (es) |
| EP (1) | EP1082453B1 (es) |
| CA (1) | CA2334276C (es) |
| DE (1) | DE69940155D1 (es) |
| ES (1) | ES2318905T3 (es) |
| WO (1) | WO1999061657A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110734953B (zh) * | 2019-09-20 | 2022-07-05 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种l-乳酸盐检测试剂盒 |
| CN112904011A (zh) * | 2019-12-04 | 2021-06-04 | 苏州普瑞斯生物科技有限公司 | 一种血清C1q补体的检测试剂盒及制备方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US32016A (en) * | 1861-04-09 | Improvement in compositions for blasting-powder | ||
| USRE32016E (en) | 1976-12-10 | 1985-10-29 | Eastman Kodak Company | Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase |
| US4166763A (en) * | 1976-12-10 | 1979-09-04 | Eastman Kodak Company | Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase |
| JPS55138398A (en) * | 1979-04-16 | 1980-10-29 | Eiken Kagaku Kk | Method of measurement of lactic dehydrogenase |
| JPS59230161A (ja) * | 1983-06-13 | 1984-12-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元性物質の分解方法及び分解用試薬 |
| US4600689A (en) * | 1983-11-21 | 1986-07-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Novel bilirubin oxidase, its production and use |
| US5250420A (en) * | 1987-04-02 | 1993-10-05 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Method and reagent for determination of dehydrogenase or its substrate |
| JP2739473B2 (ja) * | 1987-12-26 | 1998-04-15 | 天野製薬株式会社 | Ｄ−乳酸の高感度測定量法 |
| JP2647684B2 (ja) * | 1988-04-15 | 1997-08-27 | 旭化成工業株式会社 | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 |
| DE3826922A1 (de) * | 1988-08-09 | 1990-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung eines analyten mittels enzymatischer oxidation |
| JPH0721455B2 (ja) | 1988-12-01 | 1995-03-08 | 株式会社京都第一科学 | 液体試料中の特定成分を分析するための用具および方法 |
| EP0411604B1 (en) * | 1989-08-04 | 1995-02-15 | Kyowa Medex Co.Ltd. | Method and kit for determination of components |
| IT1231737B (it) * | 1989-08-31 | 1991-12-21 | Instrumentation Lab Spa | Metodo per la inibizione di colorazione aspecifica e spontanea nei reattivi basati sulla reazione di trinder mediante l'uso di chelanti. |
| JP2512578B2 (ja) * | 1990-02-13 | 1996-07-03 | イチビキ株式会社 | 新規アスコルビン酸オキシダ―ゼ及びその製造方法 |
| CA2081870A1 (en) * | 1991-11-15 | 1993-05-16 | Robert Bauer | Detection of analytes in saliva using peroxide-peroxidase test systems |
| JPH05168495A (ja) * | 1991-12-25 | 1993-07-02 | Kainosu:Kk | 酵素的測定方法 |
| JP3159273B2 (ja) * | 1993-01-14 | 2001-04-23 | 東洋紡績株式会社 | ソルビトール測定方法およびその組成物 |
| DE4343082A1 (de) * | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Mittel und Verfahren zur Bilirubin-Entstörung enzymatischer H¶2¶O¶2¶-Farbtests |
| JP3598438B2 (ja) * | 1994-03-31 | 2004-12-08 | 株式会社三菱化学ヤトロン | エタノールアミン類緩衝液の安定化方法 |
| EP0885970A4 (en) * | 1996-02-09 | 2003-05-07 | Asahi Chemical Ind | METHOD FOR DETERMINING AMMONIA AND RELATED CONNECTIONS |
-
1998
- 1998-06-09 US US09/094,235 patent/US6030802A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-28 CA CA002334276A patent/CA2334276C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-28 WO PCT/US1999/012174 patent/WO1999061657A1/en not_active Ceased
- 1999-05-28 DE DE69940155T patent/DE69940155D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 EP EP99953363A patent/EP1082453B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 ES ES99953363T patent/ES2318905T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1082453A1 (en) | 2001-03-14 |
| DE69940155D1 (de) | 2009-02-05 |
| US6030802A (en) | 2000-02-29 |
| CA2334276A1 (en) | 1999-12-02 |
| WO1999061657A1 (en) | 1999-12-02 |
| CA2334276C (en) | 2009-12-22 |
| EP1082453B1 (en) | 2008-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4543326A (en) | Stabilization of oxidase | |
| Bernt et al. | Glutathione | |
| ES2235977T3 (es) | Analogos de 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato y su uso en ensayos de deteccion de analitos. | |
| Matsubara et al. | Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide with titanium 2-((5-bromopyridyl) azo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol reagent and its application to the determination of serum glucose using glucose oxidase | |
| EP0114381B1 (en) | Reagent for measuring direct bilirubin by enzymatic method and method for measurement thereof | |
| CS244665B2 (en) | Method of enzymatic determination of enzyme substrates | |
| Bergmeyer et al. | Colorimetric assay of Reitman and Frankel | |
| Gutmann et al. | Pyruvate kinase assay in serum and erythrocytes | |
| Bergmeyer et al. | Colorimetric assay with l-lactate, NAD phenazine methosulphate and INT | |
| CN101498662A (zh) | 单胺氧化酶mao单试剂测定试剂盒 | |
| AU655594B2 (en) | Very rapid detection of fungal infections | |
| ES2318905T3 (es) | Conjunto de reactivos liquido, para la determinacion del l-lactato. | |
| US5278044A (en) | Stable aqueous NADH reagent and kit | |
| Winartasaputra et al. | Fluorometric and colorimetric enzymic determination of triglycerides (triacylglycerols) in serum. | |
| JP2005278626A (ja) | 酵素的測定試薬の安定化方法 | |
| US4560650A (en) | Method and compositions for determination of gamma glutamyl transpeptidase | |
| JP2003116539A (ja) | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化法 | |
| EP0721986A2 (en) | Creatine kinase reagent | |
| Pinto et al. | Aldolase: II. Spectrophotometric Determination Using an Ultraviolet Procedure | |
| JPS6349081A (ja) | アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 | |
| EP1484414A1 (en) | Reagent for measuring alanine aminotransferase activity | |
| Goldbarg et al. | A method for the colorimetric determination of α-d-glucosidase with a chromogenic substrate | |
| JP3159273B2 (ja) | ソルビトール測定方法およびその組成物 | |
| US5783407A (en) | Method of measuring bilirubin | |
| JP2805805B2 (ja) | スーパーオキサイドジスムターゼの測定法及び測定用試薬 |