ES2318906T3 - Vectores de transposicion derivados de helice 3 de homeodominio de antennapedia. - Google Patents
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Abstract
Fracción portadora de péptido de transposición de membrana de fórmula: ** ver fórmula** en la que de 6 a 9 aminoácidos se eliminan de la terminación amino, o una variante de dicha fracción portadora de péptido de transposición de membrana en la que (a) uno o dos restos de aminoácido se sustituyen homólogamente, (b) el orden de dos restos de aminoácido está invertido, o (c) tanto (a) como (b) están presentes conjuntamente.
Description
Vectores de transposición derivados de hélice 3
de homeodominio de Antennapedia.
La presente invención se refiere a nuevas
fracciones portadoras de péptido de transposición de membrana y a
vectores de transposición de membrana que comprenden una nueva
fracción portadora de péptidos junto con una fracción de carga, de
utilización en la administración mejorada de agentes terapéuticos
en células diana.
La industria farmacéutica se ha preocupado
durante muchos años de la administración eficaz de agentes
terapéuticos. Este problema puede atribuirse al breve periodo de
eliminación del agente en el cuerpo (vida media corta), a la
posición del punto de acción o posiblemente a la naturaleza del
propio agente terapéutico, por ejemplo, a su solubilidad,
hidrofobia, etc.. De este modo, muchos desarrollos y estrategias se
han adoptado, incluyendo la formulación del agente terapéutico con
el fin de protegerlo de un medio hostil en el camino de su punto de
acción, mediante por ejemplo, comprimidos entéricamente
recubiertos, dispositivos de liberación controlada y similares.
El desarrollo de agentes terapéuticos derivados
de péptidos ha planteado un problema adicional debido a su
sensibilidad a la degradación enzimática no solamente en el aparato
digestivo sino también en el torrente sanguíneo. Un ejemplo de cómo
este problema se ha estudiado se refiere a la incorporación de
péptido en los liposomas o de microesferas poliméricas que dirigen
los péptidos al sistema linfático.
Un problema relacionado adicional, especialmente
para los agentes terapéuticos que funcionan en el interior de la
célula es la barrera colocada por la membrana celular. De este
modo, puede ser posible aumentar la vida media del agente o asegurar
que pase a través del cuerpo sin degradarse, aunque muchos agentes
deben realmente entrar en las células para ejercer su efecto
terapéutico.
Las homeoproteínas son factores de
transactivación implicados en múltiples procesos morfológicos. Se
unen al ADN mediante una secuencia de 60 restos de aminoácidos, el
denominado homeodominio. La estructura de este dominio está
constituida por tres hélices \alpha, interrumpidas por una espira
\beta entre las hélices 2 y 3 (Gehring, W.J. et al.,
(1990) Trends Genet 6, 323-9). La relación
filogenética entre numerosas homeoproteínas es sorprendente a nivel
del homeodominio y particularmente en la tercera hélice \alpha.
Esta hélice es responsable tanto de la interacción con el ADN, como
de la capacidad de las homeoproteínas para trasladarse a través de
las membranas celulares a los núcleos celulares de manera
inespecífica.
La patente europea 485578 da a conocer que el
homeodominio y específicamente, la hélice 3 de un péptido con
homeosecuencia, específicamente la derivada de la Drosophila
Antennapedia, es de utilización como vector de transporte
intracelular. La patente da a conocer que una secuencia de 57
aminoácidos de un homeopéptido de Drosophila Antennapedia
(denominado péptido pAntp) era capaz de penetrar en fibroblastos y
células embrionarias (in vivo). Se hizo incapié en los 27
últimos aminoácidos de la secuencia que corresponden con la hélice
3 y 4. No existe ninguna descripción del péptido pAntp que esté
unido a ningún otro péptido o agente terapéutico.
Las descripciones ulteriores (Derossi D. et
al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 10444-10450,
Derossi D. et al., J. Biol. Chem. (1996) 271,
18188-18193, Joliot AH et al., (1991) The
New Biol. 3, 1121-1134 y PNAS (1991) 88,
1864-1868, Pérez F. et al., J. Cell Sci.
(1992) 102, 712-722), se han enfocado en un péptido
sintético de 16 aminoácidos procedente de la tercera hélice del
homeodominio de Antennapedia que puede utilizarse para la
administración intracelular de productos bioactivos y
oligonucleótidos complementarios. La secuencia de aminoácidos de
este péptido es
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID. nº: 1) conocido también como penetratina. En el transcurso de sus investigaciones los autores anteriores sintetizaron varias variantes de esta secuencia, correspondiendo ésta a los restos 41-60, 41-55 y 46-60 del péptido pAntp y demostraron que en todos los casos, los únicos péptidos para interiorizarse en las células eran los que incluían los restos 43-58 (Derossi D. et al., supra).
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID. nº: 1) conocido también como penetratina. En el transcurso de sus investigaciones los autores anteriores sintetizaron varias variantes de esta secuencia, correspondiendo ésta a los restos 41-60, 41-55 y 46-60 del péptido pAntp y demostraron que en todos los casos, los únicos péptidos para interiorizarse en las células eran los que incluían los restos 43-58 (Derossi D. et al., supra).
En un esfuerzo para evitar la escisión
enzimática de este péptido Brugidou J. et al., (Biochem.
Biophys. Res. Comm. (1995) 214(2),
685-693) preparó una forma
retro-inverso (aminoácidos D en orden
inverso) de la SEC. ID. nº: 1, sustituyendo los dos restos de
isoleucina en las posiciones 3 y 5 de la penetratina por valina y
añadiendo un resto de glicina en el terminal C para facilitar la
unión a una resina. Una forma retro-inverso
adicional se preparó sustituyendo la glicina adicional con un resto
de colesterol unido mediante un grupo enlazador sulfhidrilo. La
adición del resto de colesterol mejoró la penetración debido al
aumento de hidrofobia de la molécula.
El desarrollo de la forma
retro-inverso de penetratina ha dado lugar al
documento WO 97/12912 que da a conocer péptidos de 16 aminoácidos
que comprenden entre 6 y 10 aminoácidos hidrófobos en los que el
sexto aminoácido de uno de los dos extremos debe ser triptófano.
Esta descripción intenta definir las características mínimas de las
secuencias capaces de actuar como vectores de interiorización ya que
siendo la retención de un resto de triptófano en la sexta posición
del terminal amino y que el péptido contiene de 6 a 10 restos de
aminoácidos hidrófobos (la clasificación de los restos amino
hidrófobos en el documento WO 97/12912 no se cree que esté de
acuerdo con la clasificación generalmente aceptada).
De las descripciones expuestas anteriormente,
tal como se resume en el documento WO 97/12912, se ha sacado la
conclusión de que es esencial para las propiedades de transposición
de la membrana de los péptidos del homeodominio, la presencia de un
resto de triptófano en el sexto resto del terminal amino. De acuerdo
con estos requisitos ha sido una variante de penetratina de fórmula
(KWKK)_{4} que se ha descrito que posee capacidad de
transposición (Maruta H. et al. Cytoskeletal tumour
suppresors that block oncogenic RAS signalling. Presentado en
Anti-Cancer Proteins and Drugs: Structure, Function
and Design: 6-9 de noviembre 1998, New York Academy
of Sciences. Poster/resumen nº 11) y Plank C. et al. (Human Gene
Therapy, (1998) 10, 319-332) que da a conocer
un número de péptidos ramificados de transposición de la membrana
tales como (KWKK)_{2}KGGC, en la que cada KWKK está unido
al resto de lisina siguiente.
La presente invención busca proporcionar una
gama más amplia de péptidos de transposición de la membrana basados
en la penetratina, incluyendo los péptidos que no contienen un
resto de triptófano como el sexto resto del terminal amino y los
péptidos que son de tamaño más pequeño que la penetratina. Dichas
formas más pequeñas o truncadas de penetratina presentan ventajas
porque son más aceptables a la industria farmacéutica como
fracciones portadoras del péptido para administración, en virtud del
conjugado transportador-carga con una
inmunogenicidad ventajosa, solubilidad y eliminación y en algunos
casos eficacia ventajosa en comparación con utilizar un conjugado
compuesto por penetratina "completa" (SEC. ID. nº: 1). Por lo
tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a
derivados truncados de penetratina, mientras que un segundo aspecto
se refiere a formas modificadas de penetratina. Estos primer y
segundo aspectos se describen a continuación con mayor detalle y se
hace referencia a ambos a continuación como "fracción portadora
de péptido" de un sistema de administración de carga.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere por lo tanto a una fracción portadora de péptidos de
transposición de la membrana de fórmula:
en la que de 6 a 9 aminoácidos se
eliminan del terminal amino, o las variantes de dicha fracción
portadora de péptido de transposición de la membrana. Por lo tanto,
se ha observado de manera sorprendente que al contrario que lo dado
a conocer en la técnica anterior, la capacidad para transponer una
membrana celular se conserva con las secuencias que no contienen el
conjunto de los restos 43 a 58 del péptido
pAntp.
Más preferentemente, se eliminan 9
aminoácidos.
En una forma de realización preferida, las
fracciones portadoras de péptidos de la presente invención incluyen
los compuestos 16, 17, 18 y 19 mostrados en la Tabla 1 a
continuación donde se presentan junto con una asa de
biotinil-\betaAla utilizada con la finalidad de
análisis bioquímico.
Por lo tanto, en una forma de realización
preferida, la fracción portadora de péptidos incluye la secuencia
peptídica RRMKWKK o una variante de la misma y puede estar definida
preferentemente como una fracción portadora de péptido de
transposición de la membrana que comprende hasta 15 restos de
aminoácidos y por lo menos el péptido de fórmula:
o variantes de la misma. Las formas
de realización preferidas expuestas con relación con el primer
aspecto aplican en su totalidad al péptido de fórmula (I). En una
forma de realización, los restos de aminoácidos añadidos al péptido
de fórmula (I) son los restos correspondientes en la penetratina o
a variantes de los
mismos.
Se ha observado que esta secuencia (de fórmula
(I)) y sus variantes son la secuencia mínima de la molécula de
penetratina necesaria para facilitar la transposición de la
membrana. De este modo, las formas de realización anteriores apoyan
la idea de que la presencia del triptófano en la sexta posición de
uno de los dos extremos del péptido no es esencial para en traslado
en la membrana.
Dentro de las definiciones anteriores de las
fracciones portadoras de péptidos de la presente invención, los
restos de aminoácidos específicos del péptido pueden modificarse de
tal manera que conserven su capacidad para trasladar, dichos
péptidos modificados denominados "variantes".
Una variante de la fracción portadora de
péptidos definida anteriormente incluye cualquier variación en la
que:
- (a)
- uno o dos restos de aminoácidos están sustituidos de manera homóloga
- (b)
- el orden de dos restos de aminoácidos está invertido, (c) ambos (a) y (b) están presentes conjuntamente.
Por lo tanto, la sustitución homóloga
(sustitución y reemplazamiento se utilizan ambos en la presente
memoria para significar el intercambio de un resto de aminoácido
existente, por un resto alternativo) puede producirse p. ej. la
sustitución semejante por semejante tal como básico por básico,
ácido por ácido, polar por polar, etc.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Dentro de cada fracción portadora de péptidos
puede modificarse de una vez un resto de aminoácidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
aminoácidos se clasifican en las clases siguientes:
básicos: H, K, R
ácidos: D, E
apolares: A, F, G, I, L, M, P, V, W
polares: C, N, Q, S, T, Y,
(utilizando la anotación de aminoácidos de una
sola letra aceptada internacionalmente) y la sustitución homóloga
se define utilizando estas clases. Por lo tanto, la sustitución
homóloga se utiliza para referirse a la sustitución dentro de la
misma clase.
Dentro de la definición de la fórmula (I) se ha
demostrado que es preferible para la variación del aminoácido,
preferentemente de tipo (a) o (b), que se produzca
independientemente en cualquiera de las posiciones 1, 2, 3, 5 ó 6.
Más preferentemente, la variación del aminoácido se produce en las
posiciones 3 ó 7, especialmente 3. Se ha descubierto que la
sustitución homóloga es preferible en las posiciones 1 y 2.
Como se mencionó anteriormente puede producirse
simultáneamente más de una sustitución homóloga, por ejemplo en las
posiciones 2 y 3, 4 y 5 ó 5 y 6. Una variación adicional puede
producirse en virtud de la inversión de la secuencia de un número de
restos de aminoácidos dentro de una secuencia. Por ejemplo, en la
secuencia peptídica RRMKWKK, los restos de lisina y triptófano
pueden invertirse para dar un péptido RRMWKKK. Esta modificación
puede producirse además en combinación con una sustitución homóloga.
la fracción portadora de péptido puede incluir además restos de
aminoácidos con el extremo del terminal amino, más preferentemente
mediante la adición de 1 a 3 restos de aminoácidos. De este modo,
una forma de realización más de este aspecto de la presente
invención se refiere a un péptido seleccionado de entre RRMKWKK,
NRRMKWKK, QNRRMKWKK y FQNRRMKWKK.
En la forma de realización más preferida del
primer aspecto de la invención, la forma truncada de penetratina es
la de la fórmula (I) descrita anteriormente o más preferentemente a
un péptido de 7 aminoácidos seleccionados de entre KRMKWKK,
RKMKWKK, RRMWKKK y RRMKKWK, aún más preferentemente la fracción
portadora de péptido es RRMKWKK.
Las fracciones portadoras de péptidos de la
presente invención pueden comprender aminoácidos en forma L o D, es
decir, uno o más restos, preferentemente todos los restos pueden
estar en forma L o D. En esta forma de realización, el péptido
puede estar en forma retro.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el sexto resto de aminoácido del terminal amino
del péptido no es triptófano.
Los péptidos de transposición de la membrana de
la presente invención son capaces de trasladarse por la membrana
celular y en una forma de realización preferida, también la
membrana nuclear. Es irrelevante si el péptido se traslada desde el
exterior de la célula/núcleo o desde el interior, es decir, los
péptidos pueden originarse dentro del citoplasma o el núcleo (por
ejemplo, en virtud de haber sido sintetizados allí o insertados en
este compartimento) y trasladarse a una posición exterior al
compartimento celular (citoplasma o núcleo) donde se origina. En
general, los péptidos se preparan fuera de la célula y se trasladan
desde una posición exterior al citoplasma y a continuación
opcionalmente, al interior del núcleo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "transposición de la membrana celular" se refiere a
la capacidad del péptido para atravesar la membrana celular e
introducirse en el citosol/citoplasma de una célula o a través del
citosol/citoplasma de una célula al exterior, al espacio exterior,
extracelular o intersticial.
La expresión "transposición de la membrana
nuclear" se refiere a la capacidad del péptido para atravesar la
estructura de la membrana que rodea el núcleo de la célula, o para
atravesar el citosol/citoplasma en una célula hasta el núcleo.
La Figura 1 presenta el análisis
RP-HPLC de algunas fracciones portadoras de
péptidos preparadas según el primer aspecto de la presente
invención.
La Figura 2 presenta los resultados del ensayo
de interiorización celular realizados utilizando fracciones
portadoras de péptidos preparadas según el primer aspecto de la
invención.
La Figura 3 presenta los resultados del ensayo
de interiorización celular realizado utilizando el compuesto 39
(penetratina marcada con fluoresceína).
La Figura 4 (A, B y C) muestra la observación en
tiempo real del ensayo de interiorización celular realizado
utilizando el compuesto 39.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Figura 5 presenta los resultados del ensayo
de interiorización celular realizado utilizando las fracciones
portadoras de péptidos preparadas según el segundo aspecto de la
presente invención.
En un aspecto adicional de la invención, una
fracción portadora de péptidos (la forma truncada de penetratina
según el primer aspecto) se une a una fracción de carga para formar
un vector de transposición de la célula). la fracción de carga puede
comprender oligonucleótidos, nucleótidos, proteínas, péptidos,
compuestos biológicamente activos, agentes para diagnóstico o
combinaciones de los mismos.
En una forma de realización preferida la
fracción de carga es una proteína o péptido y en una forma de
realización más preferida la fracción de carga es un agente
biológicamente activo tal como un fármaco.
La fracción de carga puede estar unida directa o
indirectamente a la fracción portadora de péptidos. En la forma de
realización en la que la fracción de carga está unida
indirectamente al transportador de péptidos, el enlace puede ser
mediante un grupo intermediario de enlace tal como un grupo
sulfhidrilo o carboxilo o cualquier grupo mayor, todos estos grupos
de unión se denominan en la presente memoria grupos enlazadores
como se expone a continuación. Preferentemente las fracciones
portadoras de péptidos y de carga se unen directamente.
Los ejemplos de restos de oligonucleótidos o
nucleótidos adecuados incluyen los genes, fragmentos de gen,
secuencias de ADN, ADNc, ARN, nucleótidos, nucleósidos, bases
heterocíclicas, oligonucleótidos sintéticos y no sintéticos o
complementarios incluyendo aquellos con ejes centrales resistentes
a la nucleasa, etc. o cualquiera de los anteriores que incorporan
un marcador radioactivo, que se desea que sean administrados dentro
de una célula o alternativamente sean administrados desde una célula
a su exterior. Preferentemente, el grupo de carga de
oligonucleótidos es un gen o un fragmento de gen.
Los ejemplos de proteína o de grupos de carga de
péptidos adecuados incluyen: proteínas, péptidos y sus derivados
tales como: anticuerpos y fragmentos de los mismos; citocinas y
derivados o fragmentos de las mismas, por ejemplo, las interleucinas
(IL) y especialmente los subtipos IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11 e IL-12 de las mismas;
factores estimuladores de colonias, por ejemplo el factor
estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, el factor
estimulador de colonias de granulocitos (formas alfa y beta), el
factor estimulador de colonias de macrófagos (conocido también como
CSF-1); hemopoyetinas, por ejemplo eritropoyetina,
hemopoyetina-alfa y ligando de kit (conocido también
como factor de células madre o factor Steel); interferones (IFNS),
por ejemplo IFN-\alpha,
IFN-\beta e IFN-\gamma; factores
de crecimiento y moduladores de crecimiento bifuncionales, por
ejemplo el factor de crecimiento epidérmico, el factor de
crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento
transformante (formas alfa y beta), anfirregulina,
somatomedina-C, el factor de crecimiento de huesos,
el factor de crecimiento de fibroblastos, los factores de
crecimiento similares a la insulina, los factores de crecimiento
que se fijan a la heparina y los factores del crecimiento del
tumor; factores de diferenciación y similares, por ejemplo el factor
de diferenciación de macrófagos, el factor que produce
diferenciación (DIF) y el factor inhibidor de la leucemia, factores
de activación, por ejemplo el factor activador de plaquetas y el
factor de activación de macrófagos, factores de coagulación tal como
los agentes fibrinolíticos/anticoagulantes incluyendo la heparina y
las proteasas y sus profactores, por ejemplo los factores de
coagulación VII, VIII, IX, X, XI y XII, la antitrombina III, la
proteína C, la proteína S, estreptocinasa, urocinasa, prourocinasa,
el activador tisular de plasminógeno, fibrinógeno e hirudina;
hormonas peptídicas, por ejemplo insulina, hormona de crecimiento,
gonadotrofinas, la hormona estimulante del folículo, la hormona
leutenizante, la hormona de liberación de la hormona de crecimiento
y la calcitonina; enzimas tales como la superóxido dismutasa,
glucocerebrosidasa, asparaginasa y adenosina desaminasa; vacunas o
antígenos de vacunas tales como, por ejemplo, la vacuna contra la
hepatitis B, la vacuna contra el paludismo, la vacuna contra el
melanoma y la vacuna contra el VIH-1, factores de
transcripción y moduladores de transcripción. Más preferentemente,
la carga puede ser una proteína o un péptido seleccionado de entre
proteínas o péptidos que interfieren con el ciclo celular, tales
como los péptidos p53 o fragmentos de los mismos, los péptidos
p21^{WAF} o fragmentos de los mismos tales como los descritos en
los documentos WO 96/14334 y WO 97/42222, los péptidos FenI o
fragmentos de los mismos tales como los descritos en el documento WO
96/35715 o los péptidos p16 o fragmentos de los mismos tales como
los descritos en el documento WO 97/11174 o fragmentos y derivados
de los mismos.
Los ejemplos de fracciones de carga no
nucleotídicas/proteínicas biológicamente activas son las fracciones
de fármacos seleccionadas de entre los agentes citotóxicos, agentes
antineoplásticos, antihipertensores, agentes cardioprotectores,
antiarrítmicos, inhibidores de ACE, antiinflamatorios, diuréticos,
relajantes musculares, anestésicos locales, hormonas, fármacos
reductores del colesterol, anticoagulantes, antidepresores,
tranquilizantes, neurolépticos, analgésicos tales como los
analgésicos narcóticos o antipiréticos, antivíricos,
antibacterianos, antimicóticos, bacterioestáticos, agentes activos
en el SNC, anticonvulsionantes, anxiolíticos, antiácidos,
narcóticos, antibióticos, agentes respiratorios, antihistamínicos,
inmunosupresores, agentes inmunoactivadores, aditivos de la
nutrición, antitusígenos, agentes de diagnóstico, eméticos y
antieméticos, carbohidratos, glucosoaminoglucanos, glucoproteínas y
polisacáridos, lípidos, por ejemplo
fosfatidil-etanolamina, fosfatidilserina y derivados
de los mismos; esfingosina; esteroides; vitaminas; antibióticos
incluyendo los agentes antibióticos bacterioestáticos y
bactericidas; antimicóticos; antihelmínticos y otros agentes
eficaces contra los agentes infecciosos incluyendo los patógenos
unicelulares; pequeñas moléculas efectoras tales como la
noradrenalina, los ligandos del receptor alfa adrenérgico, los
ligandos del receptor de dopamina, ligandos del receptor del
histamina, ligandos del receptor GABA/benzodiazepina, ligandos del
receptor de serotonina, leucotrienos y triyodotironina; agentes
citotóxicos tales como doxorrubicina, metotrexato y derivados de los
mismos.
Preferentemente el grupo del fármaco es un
agente citotóxico o antineoplásico, particularmente los que se
utilizan para la terapia contra el cáncer. Dichos fármacos
incluyen, en general, agentes destructores del ADN, antimetabolitos,
antibióticos antitumorales, productos naturales y sus análogos,
inhibidores de la dihidrofolato reductasa, análogos de pirimidina,
análogos de purina, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina,
inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN,
segmentadores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas,
fármacos de los vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleósidos
citotóxicos, fármacos de pteridina, diynenos, podofilotoxinas,
fármacos que contienen platino, provocadores de diferenciación y
taxanos. Los miembros particularmente útiles de estas clases
incluyen, por ejemplo, metotrexato, metopterina,
diclorometotrexato, 5-fluorouracilo,
6-mercaptopurina, purinas trisustituidas tales como
olomoucina, roscovitina y bohemina, flavopiridol, estaurosporina,
arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, actinomicina,
daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina D, mitomicina A,
carninomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina,
etopósido, cisplatino, carboplatino, vinblastina, vincristina,
vindesina, paclitaxel, docetaxel, taxotere, ácido retinoico, ácido
butírico, acetil espermidina, tamoxifeno, irinotecán y camptotecina.
Más preferentemente el fármaco se selecciona de entre olomoucina,
roscovitina y bohemina, flavopiridol, estaurosporina y
podofilotoxina, etopósido, derivados de purvalanol, taxol,
paclitaxel y camptotecina.
Como se expuso anteriormente el fármaco y las
fracciones portadoras del péptido pueden unirse directa o
indirectamente mediante una fracción enlazadora. El enlace directo
puede producirse mediante cualquier grupo funcional conveniente en
la fracción de fármaco tal como un grupo hidroxi, carboxi o amino.
El enlace indirecto que es preferible, se producirá mediante un
grupo enlazador. Los grupos enlazadores adecuados incluyen los
grupos alquilo bi y multifuncional, arilo, aralquilo o los
peptídicos, los ésteres de alquilo, arilo o aldehídos ácidos de
aralquilo y los grupos anhidrido, sulfhidrilo o carboxilo, tales
como los derivados del ácido maleimidobenzoico, los derivados del
ácido maleimido propiónico y los derivados de succinimido o pueden
proceder de bromuro o cloruro cianúrico, carbonil diimidazol,
ésteres de succinimidilo o haluros sulfónicos y similares. Los
grupos funcionales o el grupo enlazador utilizado para formar los
enlaces covalentes entre el enlazador y los fármacos por una parte,
así como el grupo enlazador y el transportador de péptidos por la
otra, pueden ser de dos o más de entre, p. ej., los grupos amino,
hidrazino, hidroxilo, tiol, maleimido, carbonilo y carboxilo, etc.
La fracción enlazadora puede incluir una secuencia corta de 1 a 4
restos de aminoácidos que opcionalmente incluye un resto de
cisteína mediante el cual la fracción enlazadora se une a la
fracción portadora de péptidos.
Según la presente invención cada fracción
portadora de péptidos puede unirse a por lo menos una fracción de
fármaco. En una forma de realización adicional, la fracción
portadora de péptidos se prepara de tal manera que facilite enlace a
más de una fracción de carga, siendo la fracción de carga igual o
diferente, por ejemplo, la fracción portadora de péptidos puede
comprender componentes que faciliten el acoplamiento de más de una
fracción de carga tales como los derivados de los aminoácidos
naturales o la inserción de un aminoácido sintético multivalente o
pueden adaptarse específicamente a hacer esto por ejemplo mediante
una red de restos de lisina ramificados que pueden estar unidos a la
fracción portadora de péptidos como un grupo enlazador y cada resto
de lisina puede acoplarse a continuación a una fracción de carga.
De esta manera una sola fracción portadora de péptidos puede
transportar hasta 32 fracciones de carga, preferentemente de 2 a 10
o más, preferentemente de 4 a 5 fracciones de carga. En esta forma
de realización adicional cada fracción de carga puede unirse
directa o indirectamente a la fracción portadora de péptidos.
Cuando se une más de un tipo diferente de fracción de carga, es
posible coordinar las relaciones y dosis de los fármacos
individuales para facilitar la administración de combinaciones de
carga específica.
En un ejemplo preferido de la presente forma de
realización, la fracción portadora de péptidos es una fracción
portadora de péptidos como se definió anteriormente, con una red de
restos de lisina unida a por lo menos el extremo que facilita el
acoplamiento de hasta 32 fracciones de carga.
En una forma de realización adicional, el vector
de transposición puede comprender además una fracción de
direccionamento. La fracción de direccionamiento es capaz de
dirigir la fracción portadora de péptidos al tipo de célula
específica al cual es preferible para que funcione la fracción de
carga. De este modo, una fracción de direccionamiento actúa como un
sistema de dirección que tiene predisposición a la distribución
natural de los cuerpos de los fármacos o el sistema de distribución
a un tipo de célula específico. Una fracción de direccionamiento
puede estar unida a una fracción de carga o más preferentemente a
la fracción portadora de péptidos y dirigirá el sistema de
administración al punto deseado, en el momento de la llegada al cual
la fracción portadora de péptidos facilitará la interiorización
celular de la carga. Las fracciones de direccionamiento adecuadas
incluyen las secuencias peptídicas identificadas por E. Ruoslahti
et al. en la patente U.S. nº 5.622.699; Pasqualini, R.,
Ruoslahti, E. Nature (London) (1996), 380,
364-366, Ruoslahti, E. Ann. Rev. Cell Dev.
Biol. (1996), 12, 697-715; Arap, W.,
Pasqualini, R., Ruoslahti, E., Science (1998), 279,
377-380. Estas exposiciones describen determinados
péptidos que se ha descubierto que actúan como marcadores de
dirección para determinados tipos de células.
Según cualquiera de las anteriores formas de
realización definidas de la presente invención, los aminoácidos
(cualquier número de ellos, preferentemente todos ellos) que
comprende la fracción portadora de péptidos puede estar en forma L o
D (inverso). Más preferentemente están en forma L.
En una forma de realización la fracción
portadora de péptidos como se describió anteriormente puede estar
en forma retro. En esta forma de realización adicional, los
aminoácidos (cualquier número de ellos, pero preferentemente todos
ellos) que comprende la fracción portadora de péptidos puede estar
en forma L o D.
\newpage
Cuando la propia fracción de carga es una
proteína o péptido, el transportador de péptidos y las fracciones
de carga pueden estar ambos en forma L o D o alternativamente el
transportador de péptidos puede estar en forma L y la carga en forma
D o el transportador de péptidos en forma D y la carga en forma
L.
En una forma de realización, el vector de
transposición de la membrana se desplaza por la membrana celular y
permanece en el citosol.
En otra forma de realización, el vector de
transposición de la membrana desplaza la membrana celular y la
membrana nuclear.
En las fracciones portadoras de péptidos
definidas como penetratina o derivados de la misma, una
modificación adicional que es de utilidad en el contexto de la
presente invención es la conversión del grupo carboxilo libre del
resto de aminoácido del terminal carboxi, a un grupo carboxamida. A
título de ejemplo, cuando la fracción portadora de péptidos tiene
la fórmula I (RRMKWKK) el resto de lisina en el terminal carboxi
puede tener su grupo carboxilo convertido en un grupo carboxamida.
Esta modificación se cree que aumenta la estabilidad de la fracción
portadora de péptidos y por consiguiente el sistema de
administración en conjunto. Por lo tanto, el resto de aminoácido del
terminal C puede estar en forma -C(O)-NRR',
en la que R y R' se seleccionan cada una independiente de entre
hidrógeno, alquilo C1-6, alquileno
C1-6 o alquinilo C1-6 (denominado
vulgarmente "alk"), arito tal como bencilo o alcarilo,
sustituido opcionalmente cada uno por heteroátomos tales como O, S
o N. Preferentemente, por lo menos uno de entre R o R' es
hidrógeno, más preferentemente ambos son hidrógeno.
Preferentemente la fracción portadora de
péptidos es RRMKWKK-NH_{2}.
Por lo tanto, su forma de realización más
preferida, la presente invención se refiere a una fracción
portadora de péptidos RRMKWKK con un resto de lisina con terminal
opcionalmente amidado, directamente unido a una fracción de carga
seleccionada de entre los péptidos derivados de p21^{WAF},
péptidos derivados de p16 o los fármacos, roscovitina, taxol o
podofilotoxina.
Los sistemas de administración descritos en la
presente memoria son nuevas entidades químicas. Las entidades
químicas específicas dadas a conocer en la presente memoria
incluyen:
\newpage
El efecto terapéutico procedente de la
administración del sistema de administración puede presentarse en
el sistema de administración intacto o en cualquiera de sus
componentes disociados que incluyen la fracción de carga, es decir,
la fracción de carga sola o unida al enlazador, parte del enlazador
o el enlazador y una parte del portador de péptidos. De este modo
la expresión "sistema de administración" se ha utilizado en la
presente memoria en su sentido ordinario, es decir, el de
administrar algo tal como la fracción de carga y además incluir el
sistema o cualquier parte del mismo que es activa en su estado
intacto. Por lo tanto, la utilidad proporcionada por el sistema
expuesto anteriormente es aplicable a la carga y al sistema de
administración.
Los vectores de administración pueden prepararse
por algunos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la
fracción portadora de péptidos puede ensamblarse utilizando los
procedimientos convencionales de síntesis de péptidos en solución o
en fase sólida, que proporcionan un precursor completamente
protegido únicamente con el grupo amino terminal en forma reactiva
desprotegida. Esta función puede hacerse reaccionar a continuación
directamente con una fracción de carga o un derivado reactivo
adecuado de una fracción de carga. Alternativamente, este grupo
amino puede convertirse en un grupo funcional diferente adecuado
para la reacción con una fracción de carga o un enlazador. Por lo
tanto, p. ej. la reacción del grupo amino con el anhídrido
succínico proporcionará un grupo carboxilo selectivamente dirigible,
mientras que la extensión de la cadena del péptido adicional con un
derivado de cisteína producirá un grupo tiol selectivamente
dirigible. Una vez se ha obtenido un grupo funcional adecuado
selectivamente dirigible en el precursor del vector de
administración, una fracción de carga o un derivado del mismo puede
acoplarse mediante p. ej. la formación de un enlace amida, éster o
disulfuro. Alternativamente, un grupo enlazador, p. ej.,
m-maleimidobenzoílo, se introduce mediante la reacción de un
precursor del grupo enlazador con la función selectivamente
dirigible del precursor del vector de administración, seguido de la
formación de un enlace covalente entre el grupo enlazador y un grupo
de carga. Los montajes multivalentes del vector de administración
de la carga pueden obtenerse, entre otros, mediante la extensión
sucesiva del precursor del vector de administración selectivamente
dirigible con grupos químicos trivalentes. De este modo la extensión
de la cadena peptídica con derivados p. ej. de Lys protegidos con
N^{\alpha,\sigma}-Fmoc proporcionarán precursores
de montajes di-, tetra- y octa-valentes después de
uno, dos o tres ciclos de acoplamiento/desprotección con Fmoc.
Utilizando estos procedimientos, un experto será
capaz de preparar una amplia variedad de conjugados
carga-transportador utilizando una variedad de
fracciones enlazadoras. De manera ejemplificativa a continuación,
un grupo apropiado en la fracción de carga puede seleccionarse para
el acoplamiento a la fracción portadora de péptido y si se desea un
enlazador unido a la carga o a la fracción portadora de péptido o a
ambos antes de su acopla-
miento.
miento.
Los compuestos de la presente invención pueden
formularse con un diluyente o transportador fisiológicamente
aceptable para su utilización como productos farmacéuticos tanto
para utilización veterinaria, por ejemplo en mamíferos, como
particularmente humana mediante una variedad de procedimientos. Por
ejemplo, pueden aplicarse como composición incorporando un
diluyente o transportador líquido, por ejemplo una solución,
suspensión o emulsión acuosa o aceitosa, que puede emplearse con
frecuencia en forma inyectable para la administración parenteral y
por consiguiente puede ser convenientemente estéril y exenta de
pirógenos. Puede utilizarse también la administración oral y aunque
las composiciones con este objetivo puedan incorporar un diluyente
o transportador líquido, es más habitual utilizar un sólido, por
ejemplo un material transportador sólido convencional tal como
almidón, lactosa, dextrina o estearato de magnesio. Dichas
composiciones sólidas pueden tomar la forma de polvos pero son más
convenientemente de un tipo formado, por ejemplo en forma de
comprimidos, sellos o cápsulas (incluyendo spansules). Como
alternativa, los tipos más especializados de formulación incluyen
liposomas y nano-
partículas.
partículas.
Otros tipos de administración que por inyección
o por vía oral que son de utilización tanto en los contextos humano
como veterinario incluyen la utilización de supositorios u óvulos
vaginales. Otra forma de composición farmacéutica es aquella para la
administración bucal o nasal o la administración a las vías
respiratorias tales como el tejido alveolar. Otras formulaciones de
administración tópica incluyen lociones, pomadas, cremas, geles y
atomizadores.
Las composiciones pueden formularse en forma
farmacéutica urinaria, es decir en forma de porciones discretas que
contienen una dosis unitaria, una múltiple o una subunidad de una
dosis unitaria.
Los vectores de transposición de la presente
invención proporcionan varias ventajas sobre los sistemas de
administración conocidos. Estas ventajas incluyen mejor eficacia en
comparación con los tratamientos convencionales, mejor absorción
celular del agente terapéutico, mejor solubilidad en agua,
reducción de los efectos secundarios y biodisponibilidad celular y
disminución de la aparición de la resistencia a los fármacos.
\vskip1.000000\baselineskip
La nomenclatura de aminoácidos y péptidos está
de acuerdo con las reglas IUPAC-IUB (Eur. J.
Biochem. 1984, 138, 9-37). Otras
abreviaturas: Ahx, 6-aminohexanoil; APasa,
fosfatasa alcalina. DE MALDI-TOF MS, espectrometría
de masas de tiempo de vuelo de ionización con desorción por láser
asistido en la matriz con extracción retardada. DIEA,
N,N-diisopropiletilamina. PBS, solución salina tamponada con
fosfato (fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4); PyBOP,
hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio;
RP-HPLC, cromatografía líquida de alta resolución en
fase inversa; TFA, ácido trifluoroacético.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de desprotección/escisión del péptido
utilizada en todo los experimentos fue la siguiente: 0,75 : 0,5
:
0,5 : 0,25 : 10 (w/v/v/v/v) PhOH, H_{2}O, PhSMe, 1,2-etanoditiol, TFA (Beavis, R.C. et al., (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156-158). Se realizó la RP-HPLC analítica y de preparación utilizando las columnas Vydac 218TP54 (4,6 \times 250 mm) y 218TP1022 (22 \times 250 mm), respectivamente. Se utilizaron caudales de 1 ml/min para las series analíticas y de 9 ml/min para el trabajo de preparación (a 25ºC). Se realizó elución con gradiente con aumentos crecientes de MeCN en H_{2}O (que contiene 0,1% de TFA) durante 20 min. (anal.) y 40 min. (prep.). Se controlaron los eluyentes a \lambda = 200-300 nm. Se analizaron también muestras de péptido por espectrometría de masas DE MALDI-TOF (instrumento ThermoBioAnalysis Dynamo). Se utilizó una matriz del ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinnámico (Beavis, R.C. et al., (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156-158) y se calibró el intervalo m/z apropiado utilizando patrones de péptido auténticos en el intervalo m/z 1.000-2.600.
0,5 : 0,25 : 10 (w/v/v/v/v) PhOH, H_{2}O, PhSMe, 1,2-etanoditiol, TFA (Beavis, R.C. et al., (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156-158). Se realizó la RP-HPLC analítica y de preparación utilizando las columnas Vydac 218TP54 (4,6 \times 250 mm) y 218TP1022 (22 \times 250 mm), respectivamente. Se utilizaron caudales de 1 ml/min para las series analíticas y de 9 ml/min para el trabajo de preparación (a 25ºC). Se realizó elución con gradiente con aumentos crecientes de MeCN en H_{2}O (que contiene 0,1% de TFA) durante 20 min. (anal.) y 40 min. (prep.). Se controlaron los eluyentes a \lambda = 200-300 nm. Se analizaron también muestras de péptido por espectrometría de masas DE MALDI-TOF (instrumento ThermoBioAnalysis Dynamo). Se utilizó una matriz del ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinnámico (Beavis, R.C. et al., (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156-158) y se calibró el intervalo m/z apropiado utilizando patrones de péptido auténticos en el intervalo m/z 1.000-2.600.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron péptidos utilizando un kit para
síntesis de péptidos Multipin (Chiron Technologies Pty. Ltd.,
Clayton, VIC, Australia). Las cadenas peptídicas se reunieron en
"Macro Crowns" (SynPhase HM Series I, Rink Amide Linker; 5.3
\mumol/crown) utilizando Fmoc-aminoácidos (100 mM
en DMF) y la química de acoplamiento PyBOP/HOBt)/DIEA (1 : 1 : 1,5).
Los grupos protectores de la cadena lateral de aminoácidos fueron
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(Arg), tritilo (Asn y Gln) y t-butiloxicarbonilo (Lys y Trp).
Las soluciones de aminoácidos activados se repartieron utilizando
un dispositivo PinAID (Chiron Technologies). Se dejaron proceder
las reacciones de acoplamiento durante un mínimo de 4 h. Todas las
demás manipulaciones del montaje de la cadena, incluyendo las
reacciones de desprotección repetitivas (20% de piperidina en DMF) y
los ciclos de lavado (DMF y MeOH) se realizaron según los
procedimientos indicados en el manual del kit. Tras el acoplamiento
y la desprotección de los restos \betaAla del terminal N,
se acopló (+)-biotina (300 mM en DMF) (la química
fue como anteriormente para los aminoácidos) durante 4 h. Tras el
lavado y secado, se retiraron las "Macro Crowns" del
dispositivo de síntesis y se colocaron en tubos de 10 ml tapados
con polipropileno. A cada tubo se añadieron 1,5 ml de mezcla de
escisión/desprotección. Después de 2 h, se retiraron las "Macro
Crowns" y se lavaron con 0,5 ml cada una de TFA puro. Se añadió a
cada tubo que contenía las mezclas de escisión combinadas y lavados
con Et_{2}O (8 ml). Después del enfriamiento a 4ºC, se recogieron
los péptidos precipitados por centrifugación (4 min a 5.000 r.p.m.)
y decantación. Se volvieron a poner en suspensión los sedimentos en
Et_{2}O (5 ml/tubo). Se enfriaron de nuevo las suspensiones y se
aislaron los péptidos como anteriormente. Se repitió el
procedimiento de lavado una vez más antes de que se secaran los
péptidos en bruto al vacío.
Se redisolvieron los péptidos en bruto en TFA
ac. al 0,1% utilizando tratamiento con ultrasonidos (2 ml/muestra)
y se aplicaron a cartuchos de extracción en fase sólida cebados
(MeOH y a continuación TFA ac. al 0,1%) (Merck LiChrolut
RP-18, 500 mg). Éstos se lavaron sucesivamente (2
\times 2 ml de TFA ac. al 0,1% cada uno) y se eluyeron (2 ml de
TFA al 0,1% en MeCN/H_{2}O 6 : 4). Se evaporaron los eluidos a
sequedad por centrifugación al vacío. Los rendimientos y los datos
analíticos para los compuestos del título se resumen en la Tabla
2.
La secuencia peptídica se montó en
Fmoc-Cys(Trt)-resina (asa del
ácido p-hidroxi-metilfenoxiacético, 0,50
mmoles/g de grupo funcional, 0,50 g, 0,25 mmoles; ABI 401418)
utilizando un sintetizador de péptidos ABI 433A
(Perkin-Elmer Applied Biosystems) y la química
convencional "0,25 mmoles FastMoc MonPrevPk". Tras la
desprotección final con Fmoc y lavado (Et_{2}O), la resina
peptidílica se secó al vacío (1,43 g, 91%). Se volvió a poner en
suspensión una alícuota (285 mg, aprox. 0,05 mmoles) de este
material en DMF, se purgó y se hizo reaccionar con éster del
biotinamidocaproato con N-hidroxisuccinimida (137 mg, 0,3
mmoles), HOBt (50 mg, 0,3 mmoles) y DIEA (0,14 ml, 0,8 mmoles) en
DMF (3 ml) durante 18 h bajo N_{2}. La resina se lavó a
continuación sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O,
secándose antes al vacío.
La resina peptidílica biotinilada anterior (290
mg, aprox. 0,05 mmoles) se trató con la mezcla de
escisión/despro-
tección (5 ml) durante 2,5 h. El residuo de la resina se filtró a continuación. Se trató el filtrado con Et_{2}O (45 ml), se enfrió la mezcla y el péptido precipitado se recogió por centrifugación (2 min. a 4.000 r.p.m.). El péptido biotinilado en bruto (141 mg, aprox. cuantitativo) se lavó dos veces más con Et_{2}O de manera similar secándose antes al vacío. Se disolvió una muestra (20 mg) de este material en TFA ac. al 0,1% (2 ml), se filtró la solución y se fraccionó por RP-HPLC de prep. Las fracciones que contenían el material puro (por RP-HPLC anal.) se agruparon y se liofilizaron para proporcionar el péptido 37 puro (12,1 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,8 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en MeCN de 20-30%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.776, [2 M + H]^{2+} = 1.389 (C_{127}G_{205}N_{39}O_{25}S_{3} = 2.774,43).
tección (5 ml) durante 2,5 h. El residuo de la resina se filtró a continuación. Se trató el filtrado con Et_{2}O (45 ml), se enfrió la mezcla y el péptido precipitado se recogió por centrifugación (2 min. a 4.000 r.p.m.). El péptido biotinilado en bruto (141 mg, aprox. cuantitativo) se lavó dos veces más con Et_{2}O de manera similar secándose antes al vacío. Se disolvió una muestra (20 mg) de este material en TFA ac. al 0,1% (2 ml), se filtró la solución y se fraccionó por RP-HPLC de prep. Las fracciones que contenían el material puro (por RP-HPLC anal.) se agruparon y se liofilizaron para proporcionar el péptido 37 puro (12,1 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,8 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en MeCN de 20-30%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.776, [2 M + H]^{2+} = 1.389 (C_{127}G_{205}N_{39}O_{25}S_{3} = 2.774,43).
\newpage
El péptido 37 en bruto (antes de la
RP-HPLC de prep., 35 mg) se disolvió en solución
ac. de NH_{4}HCO_{3} (0,1 M, 70 ml). La mezcla destapada se
agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La solución resultante
se acidificó a continuación a pH 4 con AcOH (aprox. 2 ml) para
proporcionar una solución transparente que se evaporó a sequedad por
centrifugación al vacío durante 18 h. El residuo se volvió a
disolver en TFA ac. al 0,1% (2 ml) y se purificó por
RP-HPLC de prep. de manera similar al precursor 37
reducido anteriormente excepto que el gradiente se desarrolló en
MeCN del 20 al 30%. Tras la liofilización, se obtuvo el péptido 38
puro (4,5 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,7
min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en
20-30%). DE MALDI-TOF MS: [M +
H]^{+} = 2.774, [2 M + H]^{2+} = 1.388
(C_{127}H_{203}N_{39}O_{25}S_{3} = 2.772,42).
\vskip1.000000\baselineskip
Se montó la secuencia de manera similar a la
descrita para el péptido 37, excepto que se utilizó la resina con
Fmoc-Lys(Boc) (carga de 0,5 mmoles/g; ABI
401425). Se hizo reaccionar la resina
H-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)
(300 mg, aprox.
0,055 mmoles) con 5-carboxifluoresceína (103 mg, 0,27 mmoles; Sigma C 0537), PyBOP (142 mg, 0,27 mmoles)), HOBt (37 mg, 0,27 mmoles) y DIEA (71 ml, 0,41 \mumoles) en DMF (5 ml) bajo N2 yen la oscuridad durante 18 h. Se lavó a continuación (DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O) y se secó al vacío. Tras el tratamiento durante 2 horas con mezcla de escisión/desprotección (12 ml) a la oscuridad y preparación como anteriormente, se obtuvo el péptido en bruto (183 mg). Se purificó una alícuota (90 mg) por RP-HPLC de preparación para dar el péptido puro tras la liofilización (38 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,7 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en 22,5-32,5%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.677, [2 M + H]^{2+} = 5.359 (C_{128}H_{183}N_{35}O_{27}S_{3} = 2.676,11).
0,055 mmoles) con 5-carboxifluoresceína (103 mg, 0,27 mmoles; Sigma C 0537), PyBOP (142 mg, 0,27 mmoles)), HOBt (37 mg, 0,27 mmoles) y DIEA (71 ml, 0,41 \mumoles) en DMF (5 ml) bajo N2 yen la oscuridad durante 18 h. Se lavó a continuación (DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O) y se secó al vacío. Tras el tratamiento durante 2 horas con mezcla de escisión/desprotección (12 ml) a la oscuridad y preparación como anteriormente, se obtuvo el péptido en bruto (183 mg). Se purificó una alícuota (90 mg) por RP-HPLC de preparación para dar el péptido puro tras la liofilización (38 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,7 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en 22,5-32,5%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.677, [2 M + H]^{2+} = 5.359 (C_{128}H_{183}N_{35}O_{27}S_{3} = 2.676,11).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células HaCaT (estirpe celular de
fibroblasto humano "normal" inmortalizada) en placas de 96
pocillos a razón de 50.000 células por pocillo en medio (DMEM) con
suero de ternero fetal al 10% y antibióticos. Tras una incubación
toda la noche, se prepararon los péptidos como series de dilución
en medio de células y se añadieron a las células. Al final del
periodo de incubación (normalmente 10 y 60 min.), se enjuagaron las
células tres veces con PBS y se fijaron durante 20 min. a -20ºC en
EtOH/AcOH (95 : 5). Tras la fijación, las células se hicieron
permeables por tratamiento durante 10 min. con PBS que contenía
Tween-20 al 3%. Se neutralizó la actividad de la
fosfatasa alcalina endógena por incubación a 65ºC durante 60 min. Se
incubaron las células durante 30 min. a temperatura ambiente con
fosfatasa alcalina-estreptavidina (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL, UEA) en BSA al 0,1% en PBS y se lavó extensamente
con PBS. Se añadió a cada pocillo la solución del sustrato recién
preparada (1 mg/ml de fosfato disódico de p-nitrofenilo
(Pierce Chemical Co.) en dietanolamina 10 mM (pH 9,5) que contenía
MgCl_{2} 0,5 mM y se incubó hasta que se hubo desarrollado color
suficiente (aprox. 30 min.). La reacción enzimática se interrumpió
añadiendo NaOH ac. 2 M a cada pocillo. Se midió la actividad de
fosfatasa alcalina por espectrometría a 405 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los péptidos 1-20
simultáneamente utilizando el procedimiento denominado
Multipin^{TM} (Valerio, R.M. et al., (1993)
International Journal of Peptide and Protein Research 42,
1-9). Se realizaron un promedio de 2 ciclos de
acoplamiento/desprotección al día y la síntesis completa (incluyendo
la biotinilación, escisión/desprotección, purificación por
extracción en fase sólida y análisis, se completó durante una
quincena. Los rendimientos aislados y purificados de los péptidos
oscilaron entre 40 y 81% y las purezas fueron del 75 al 96% (Tabla
2). La excelente calidad de los péptidos se demuestra en la Figura
1. Las principales impurezas observadas (MS, datos no mostrados)
eran trazas de péptidos que contenían Met(O) (picos
principales en las trazas en la Fig. 1). La formación de sulfóxido
de metionina parece ser un problema general asociado al
procedimiento Multipin, supuestamente debido a la oxidación durante
los ciclos de secado con aire extendido tras las etapas de acilación
y desprotección. En principio es posible volver a reducir el
Met(O) en los péptidos; p. ej., a escala analítica pudieron
convertir la impureza que contiene
Met(O) en 1 limpiamente utilizando NH_{4}I/Me_{2}S en TFA (Nicolás, E. et al., (1995) Tetrahedron 51, 57013) (resultados no mostrados).
Met(O) en 1 limpiamente utilizando NH_{4}I/Me_{2}S en TFA (Nicolás, E. et al., (1995) Tetrahedron 51, 57013) (resultados no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se expuso anteriormente, el péptido de 16
elementos que abarca los restos 43 al 58 del homeodominio de
Antennapedia se identificó originalmente como la secuencia
mínima que conserva propiedades de transposición eficaces utilizando
los péptidos correspondientes a los restos 41-60,
43-58, 41-55 y
46-60. Los resultados (Figura 2) demuestran que el
truncamiento del terminal C del péptido 1 produce una reducción en
el grado de interiorización pero no obstante, los péptidos
truncados eran todavía capaces de desplazarse en la membrana
celular. El truncamiento sucesivo del terminal N del péptido
1, sin embargo demuestra que se conservan niveles significativos de
transposición en los péptidos truncados en muchos casos
aproximándose al nivel alcanzado por el propio péptido 1. Se perdió
poca actividad en las tres primeros truncamientos
(11-13) pero sólo aproximadamente la mitad de la
señal original se dejó con los derivados 14 y 15. Sin embargo, en
la etapa del polímero de 10 a 7 elementos (16-19)
casi la eficacia de transposición de la membrana completa en
comparación con el péptido de referencia 1 se volvió a obtener
antes de que se observara una caída severa con el péptido 20 de 6
elementos con terminal C. Este efecto fue reproducible en
varios experimentos independientes. Aunque los valores para
solamente una concentración de péptido se presentan en la Figura 2,
las curvas de respuesta a la dosis para cada péptido individual han
demostrado que se observa el mismo modelo, independientemente de la
concentración del péptido. Se ha descubierto que la unión no
específica en ausencia de células es uniforme e insignificante
(resultados no mostrados).
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Este ensayo permitió el estudio y la medición de
la interiorización celular sin la posibilidad de observar
artefactos que provienen de las manipulaciones celulares necesarias
con los péptidos biotinilados. La Figura 4 presenta la medición
directa de la interiorización del péptido en células vivas.
(cuadrados cuando t = 10 min., rombos cuando
t = 60 min.). Como puede apreciarse en la Figura 4, la Penetratina biotinilada 1 se sitúa principalmente en el núcleo celular y se acumula en los nucleolos, con concentración menor en el citosol. Evidentemente la distribución es muy similar cuando se utiliza la sonda fluorescente 39 directa, validando de este modo el método de visualización indirecto de biotina-avidina. El hecho de que aparezca la Penetratina para localizar principalmente el núcleo demuestra que este péptido puede trasladarse de hecho a través tanto de las membranas plasmática como nuclear. La acumulación nucleolar puede ser debida a la fijación no específica del péptido con carga positiva al ADN.
t = 60 min.). Como puede apreciarse en la Figura 4, la Penetratina biotinilada 1 se sitúa principalmente en el núcleo celular y se acumula en los nucleolos, con concentración menor en el citosol. Evidentemente la distribución es muy similar cuando se utiliza la sonda fluorescente 39 directa, validando de este modo el método de visualización indirecto de biotina-avidina. El hecho de que aparezca la Penetratina para localizar principalmente el núcleo demuestra que este péptido puede trasladarse de hecho a través tanto de las membranas plasmática como nuclear. La acumulación nucleolar puede ser debida a la fijación no específica del péptido con carga positiva al ADN.
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2.1 Según los procedimientos descritos en los
apartados 1.1 y 1.2 anteriormente, se prepararon los péptidos
siguientes:
RRMKWKK,
NRRMKWKK,
QNRRMKWKK,
KRMKWKK,
RKMKWKK,
RRMWKKK,
RRMKKWK,
Cada uno de estos péptidos se utilizaron en el
ensayo de interiorización del péptido descrito en el apartado 1.3
anterior y se observó que se interiorizaban en las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
5-17
Utilizando los procedimientos descritos
anteriormente los vectores de transposición que comprenden la
fracción portadora unida a una carga se prepararon tal como se
describe.
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Ejemplo
5
Partiendo de la resina Rink Amida AM (0,69
mmoles/g, Novabiochem), se montó
H-Cys(Trt)-\betaAla-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-resina.
Tras la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por
precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se
purificaron las alícuotas (246 mg totales) por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN
6,5-16,5%) para proporcionar el compuesto del
título puro (106,4 mg). RP-HPLC anal.:
t_{R} = 15,8 min (gradiente en MeCN del 6,5 al 16,5%,
pureza >95%, \lambda = 214 nm). DE MALDI-TOF
MS: [M + H]^{+} = 1.205,4,
(C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{2} = 1.205,55).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (17 \mumoles, 17,4 mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(15 \mumoles, 18,1 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,0
\mul). Se agitó la mezcla durante 1 h, se filtró y se purificó por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN
10-70%). El compuesto del título puro (9,4 mg) se
obtuvo como un sólido incoloro. RP-HPLC anal.:
t_{R} = 17,2 min, (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza
>97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} =
2.211,7 = 1.388 (C_{106}H_{148}N_{22}O_{26}S_{2} =
2.210,57).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó durante 1 h una solución de
podofilotoxina (60 \mumoles, 25,6 mg), ácido
3-maleimidopropiónico (0,31 mmoles, 52,4 mg), DIC
(0,17 mmoles, 21,5 mg) y DMAP (80 \mumoles, 10 mg) en
CH_{2}Cl_{2} (2 ml). Se evaporó el disolvente al vacío y el
residuo se volvió a disolver en DMF/MeOH (1 ml) y se purificó por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 20 al
70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro
(7,3 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,1
(gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza >95%).
RMN-H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta:
2,66-2,71 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH_{2}),
2,82-2,84 (m, 2H, H2 y H3), 3,69 (s, 6H,
OCH_{3}\times2), 3,75 (s, 3H, OCH_{3}), 3,83 (t, J =
6,3 Hz, 2H, CH_{2}), 4,12 (t, J = 9,92 Hz, 1H, H11), 4,31
(m, 1H, H11), 4,53 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H1), 5,80 (d,
J = 8,7 Hz, 1H, H4), 5,92 (dd, J = 5,49, 1,17 Hz, 2H,
OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'), 6,47 (s, 1H, H8), 6,66 (s, 2H,
CH=CH), 6,74 (s, 1 H, H5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (17,7 \mumoles, 10
mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(25 \mumoles, 30,4 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (3,5
\mul). Se agitó la mezcla durante 40 min., se filtró y se purificó
por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0
al 60%). Se obtuvo el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (17,8 mg, 57%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
14,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1772,3
(C_{81}H_{119}N_{21}O_{20}S_{2} = 1.771,07).
\newpage
Ejemplo
7
Partiendo de la resina Rink Amide AM (0,69
mmoles/g, Novabiochem), se montó la resina
H-Cys(Trt)-\betaAla-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Met-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc).
Tras la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por
precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se
purificaron las alícuotas (237 mg en total) por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 8 al
18%) para dar el compuesto del título puro (66 mg).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 12,9 min. (gradiente en
MeCN del 9 al 19%, pureza > 99%, \lambda = 214 nm). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.207,2
(C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{2} = 1.205,55).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (18,9 \mumoles, 10,7
mg) y
H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys
(28 \mumoles, 33,8 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,5
\mul). Se agitó la mezcla durante 40 min., se filtró y se purificó
por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0
al 60%). Se obtuvo el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (6,9 mg, 21%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
14,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.771,5
(C_{81}H_{119}N_{21}O_{20}S_{2} = 1.771,07).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de
4'-desmetilepipodofilotoxina (12 mmoles, 5 mg),
ácido 3-maleimido-propiónico (50
\mumoles, 12,2 mg) y DIC (28 \mumoles, 3,47 mg) en piridina (1
ml) se agitó durante 30 min. Se añadió MeOH (0,5 ml) y la mezcla se
purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en
MeCN del 0 al 60%) para dar el compuesto del título puro como un
sólido incoloro (4,2 mg, 62%). RP-HPLC anal.:
t_{R} = 17,6 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza >
95%). RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta:
2,84 (m, 1H, H3), 2,99 (t, J = 7,44 Hz, 2H,
CH_{2}-Mim), 3,32 (dd, J = 14,04, 5,07 Hz,
1H, H2), 3,69 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,95 (t, J = 7,44
Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 4,39 (dd, J = 8,13,
4,28 Hz, 2H, H11), 4,66 (d, J = 5,00 Hz, 1H, H1), 4,89 (d,
J = 3,32 Hz, 1H, H4), 6,01 (d, J = 6,42 Hz, 2H,
OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'), 6,57 (s, 1H, H8), 6,74 (s, 2H,
CH=CH), 6,90 (s, 1H, H5). ^{13.}C-RMN (75 MHz,
CDCl_{3}) \delta: 28,64, 31,02, 32,55, 37,33, 39,53, 42,99,
55,15, 65,78, 66,56, 100,65, 106,54, 107,97, 109,65, 130,68,
130,92, 133,21, 136,96, 146,62, 147,61, 150,39, 167,36, 169,30,
173,89.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución
4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (14 \mumoles, 7,9
mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(26 \mumoles, 31,5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,9
\mul). Después de la agitación durante 40 min., la mezcla se
purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente del 0
al 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (15,8 mg, 63%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
13,3 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.757,2
(C_{80}H_{117}N_{21}O_{20}S_{2} = 1.757,05).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de podofilotoxina (0,49 mmoles, 204
mg), ácido yodoacético (1,03 mmoles, 192 mg), DIC (0,552 mmoles,
69,7 mg) y DMPA (0,164 mmoles, 20 mg) en CH_{2}Cl_{2} anhidro
(5 ml) se enfrió a 0ºC. Se añadió piridina (0,2 ml) y la mezcla de
reacción se dejó agitar durante 1 h a 0ºC. Se evaporó la mezcla a
sequedad. El residuo amarillo claro resultante se volvió a disolver
en MeCN y se purificó por RP-HPLC de preparación
(gradiente en MeCN del 20 al 70%) para proporcionar el compuesto del
título puro como un sólido incoloro (89,5 mg).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 22,3 min. (gradiente en
MeCN del 0 al 60%, pureza > 95%). RMN-^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,85 (m, 2H, H2,3), 3,70 (s, 6H,
OCH_{3}\times2), 3,72 (s, 2H, CH_{2}l), 3,74 (s, 3H,
OCH_{3}), 4,13 (m, 1H, H11), 4,34 (m, 1H, H11), 4,53 (d, 1H,
J = 3,60 Hz, H1), 5,83 (d, 1H, J = 8,43 Hz, H4), 5,93
(dd, 2H, J = 4,35, 1,17 Hz, OCH_{2}O)), 6,31 (s, 2H,
H2'6'), 6,48 (s, 1H, H8), 6,77 (s, 1H, H5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de
4-(yodoacetil)podofilotoxina (17 \mumoles, 10 mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(23 \mumoles, 28,6 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,4
\mul, 17 \mumoles). Después de agitación durante 1 h se añadió
MeCN (0,5 ml) y la mezcla se purificó por RP-HPLC
de preparación (gradiente en MeCN del 0 a 60%) para proporcionar el
compuesto del título puro como un sólido incoloro (29,4 mg, 100%).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,1 min. (gradiente en
MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF
MS: [M + H]^{+} = 1.661,0
(C_{76}H_{114}N_{20}O_{18}S_{2} = 1.659,97).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
A una solución de
4'-desmetilepipodofilotoxina (0,26 mmoles, 104 mg),
ácido yodoacético (0,53 mmoles, 98,8 mg) y DIC (0,32 mmoles, 40,1
mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a 0ºC se añadió piridina (50 \mul)
y DMAP (0,1 mmoles, 12,8 mg). Tras 1 h en agitación se evaporaron
los disolventes. Se redisolvió el residuo en DMF (1 ml) y se
purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en
MeCN del 20 al 60%) para dar el compuesto del título puro como un
sólido incoloro (35,7 mg, 24%). RP-HPLC anal.:
t_{R} = 20,3 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza >
96%). RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta:
3,02 (m, 1H, H3), 3,20 (m, 1H, H2), 3,71 (s, 6H,
OCH_{3}\times2), 3,63 (s, 2H, CH_{2}I), 3,74 (s, 3H,
OCH_{3}), 4,05 (m, 1H, H11), 4,27 (m, 1H, H11), 4,60 (d, 1H,
J = 4,94 Hz, H1), 6,06 (d, 1 H, J = 3,41 Hz, H4), 5,92
(m, 2H, OCH_{2}O), 6,21 (s, 2H, H2'6'), 6,49 (s, 1H, H8), 6,80
(s, 1H, H5).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4'-desmetil-4-(yodoacetil)epipodofilotoxina
(17,6 \mumoles, 10 mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(14,9 \mumoles, 18 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,1
\mul, 15 \mumoles). Tras la agitación durante 1 h se purificó la
mezcla de reacción por RP-HPLC de preparación
(gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del
título puro como un sólido incoloro (11,2 mg, 46%).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 12,8 min. (gradiente en
MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF
MS: [M + H]^{+} = 1.647,2
(C_{75}H_{112}N_{20}O_{18}S_{2} = 1.645,95).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
\newpage
Se agitó durante 1 h una mezcla de
podofilotoxina (400 mg, 0,97 mmoles),
Boc-Gly-OH (510 mg, 2,91 mmoles),
DIC (1,73 mmoles, 273 \mul), DMAP (0,41 mmoles, 50 mg) y piridina
(173 \mul) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml). Se evaporaron los
disolventes. Se redisolvlió el residuo en DMF (1,5 ml) y se
purificó por RP-HPLC (gradiente en MeCN del 20 al
70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (502,6 mg, 91%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
22,1 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-(Boc-Gly)podofilotoxina (0,24 mmoles, 137
mg) en CH_{2}Cl_{2} (8 ml) se añadió TFA (0,5 ml). Después de
agitar durante 1 h se evaporaron los disolventes. El residuo sólido
amarillo claro resultante se purificó presión
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al
70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (41,7 mg, 37%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
15,2 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido
3-maleimidopropiónico (70 \mumoles, 11,8 mg) y DIC
(38 \mumoles, 4,83 mg) en DMF (1 ml) se añadió
4-(H-Gly)podofiilotoxina (17 \mumoles, 8
mg), DMAP (10 \mumoles, 1,2 mg) y piridina (20 \mul). Después de
agitar durante 1 h la mezcla se purificó por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al
60%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (1,1 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 18,2
min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-(maleimidopropionoil-Gly)podofilotoxina
(1,8 \mumoles, 1,1 mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(4 \mumoles, 5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,5 \mul,
4 \mumoles). Se agitó la mezcla durante 1 h. Se diluyó con MeCN
(0,5 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación
(gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del
título como un sólido incoloro (1,1 mg, 33%).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,7 min. (gradiente en
MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%). DE MALDI-TOF
MS: [M + H]^{+} = 1.829,8
(C_{83}H_{122}N_{22}O_{21}S_{2} = 1.828,12).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Partiendo de la resina Rink Amide AM (0,69
mmoles/g, Novabiochem), se montó
H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-resina.
Tras la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por
precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se
purificaron las alícuotas (258 mg en total) por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 9 al
19%) para proporcionar el compuesto del título puro 8132,4 mg).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,3 min. (gradiente en
MeCN del 8 al 18%, pureza > 99%). DE MALDI-TOF
MS: [M + H]^{+} = 1.238,6
(C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{3} = 1.237,63).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (19 \mumoles, 11 mg)
y
H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-CysNH_{2}
(12 \mumoles, 15 mg), en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,8
\mul). Tras agitación durante 1 h la mezcla se purificó por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al
70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro
(9,0 mg, 32%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 17,4 min.
(gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.369,7
(C_{110}H_{146}N_{22}O_{31}S_{3} = 2.368,66).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
A una solución de
10-O-(maleimidopropionoil)camptotecina (0,005 mmoles,
2,6 mg), 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (5,6
\mumoles, 3,1 mg) y
H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2}
(11 \mumoles, 13 mg), en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,5
\mul). Tras agitación durante 1,5 h se purificó la mezcla por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al
70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (1,9 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,8
min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 96%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.304,6
(C_{107}H_{138}N_{24}O_{28}S_{3} = 2.304,58).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
A una solución
4'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})]epipodofilotoxina
(2 \mumoles, 3,5 mg), 2'-(maleimidopropionil)paclitaxel (2
\mumoles, 2 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,3 \mul).
Tras agitación durante 1,5 h se purificó la mezcla de reacción por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al
70%) para proporcionar el compuesto del título como un sólido
incoloro (1,5 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 17,8
min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.794,5
(C_{134}H_{173}N_{23}O_{37}S_{3} = 2.794,14).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
A una solución de
4'-metoxi-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina
(7 \mumoles, 4,6 mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(14 \mumoles, 16,3 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1
\mul). Tras agitación durante 1 h, la mezcla se purificó por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al
60%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido
incoloro (6,4 mg, 49%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
15,2 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.861,6
(C_{87}H_{125}N_{23}O_{19}S_{2} = 1.861,20).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
A una solución de
4'-desmetil-4-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina
(24 \mumoles, 12 mg), ácido 3-maleimidopropiónico
(49 \mumoles, 8,3 mg) y DIC (27 \mumoles, 3,4 mg) en
DMF/CH_{2}Cl_{2} (2 ml) se añadió piridina (10 \mul). Después
de agitar durante 1 h, se evaporó la mezcla de reacción. El sólido
amarillo claro resultante se purificó por RP-HPLC de
preparación (gradiente en MeCN del 10 al 70%) para proporcionar el
compuesto del título puro como un sólido incoloro (5,3 mg, 34%).
RP-HPLC anal.: t_{R} = 19,5 min. (gradiente en
MeCN del 0 al 60%, pureza > 96%). RMN-^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,65 (t, 2H, J = 7,3 Hz,
CH_{2}), 2,98 (m, 1H, H3), 3,17 (m, 1H, H2), 3,79 (s, 6H,
OCH_{3}), 3,93 (t, 2H, J = 7,0 Hz, CH_{2}), 3,99 (m, 1H,
H5, H11), 4,38 (m, 1H, H11), 4,58 (d, 1 H, J = 4,95 Hz, H1),
4,64 (d, 1 H, J = 3,95 Hz, H4), 5,96 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,33 (s,
2H, H2'6'), 6,49-6,53 (m, 3H, H8, Ar), 6,74 (s, 2H,
CH=CH), 6,75 (s, 1 H, H5), 7,33 (m, 2H, Ar).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4'-desmetil-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina
(8,3 \mumoles, 5,3 mg) y
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
(13 \mumoles, 15,6 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (2
\mul). Después de agitar durante 1 h, se purificó la mezcla por
RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al
60%) para proporcionar el compuesto del título como un sólido
incoloro (14,9 mg, 97%). RP-HPLC anal.: t_{R} =
13,7 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE
MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.847,1
(C_{86}H_{123}N_{23}O_{19}S_{2} = 1.847,17).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Ensayo con topoisomerasa II - Se incubó
ADN plásmido (0,3 \mug) a 37ºC con 4 unidades de topoisomerasa II
humana recombinante purificada en tampón de escisión (Tris\cdotHCl
30 mM, pH 7,6, NaCl 60 mM, ATP 3 mM, mercaptoetanol 15 mM,
MgCl_{2} 8 mM) con o sin adición del compuesto de ensayo (a una
concentración final de 1 mM, 100 \muM o 10 \muM). Se
interrumpieron las reacciones mediante la adición inmediata de SDS
(p/v final al 1%). Se trataron las muestras con proteinasa K (30
min. a 37ºC) y se extrajo dos veces con un volumen igual de
CHCl_{3}/alcohol i-amílico 42:1. Después de añadir
colorante de carga, se cargaron las muestras hasta una 4 \times
TAE, gel de agarosa al 1% que contiene 0,5 mg/ml de bromuro de
etidio y se realizó la electroforesis durante 16 a 24 h. La
inhibición de topoisomerasa II fue interpretada por la producción
del ADN plásmido lineal, que representa el producto intermedio de
escisión atrapado y mediante la relación del sustrato (ADN
superenrollado) para el producto (ADN distendido). Se realizó un
ensayo de distensión de manera idéntica, excepto que el tampón de la
reacción fue optimizado para la detección de catálisis en lugar de
escisión, es decir, solamente 2 unidades de enzima se utilizaron
por muestra. El tampón de reacción fue Tris\cdotHCl 50 mM, pH 8,
KCl 120 mM, ATP 0,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, MgCl_{2} 10 mM. La
inhibición con topoisomerasa II fue interpretada por la relación
del sustrato (ADN superenrollado) a producto (ADN distendido).
- a)
- I indica inhibición de la relajación del plásmido superenrollado por topoisomerasa II. C indica la acumulación del compuesto intermedio de la reacción de la topoisomerasa II.
\vskip1.000000\baselineskip
Con objeto de comparar el efecto biológico
citotóxico en células de cáncer (estirpes celulares en la Tabla 9)
de las fracciones de fármaco aplicadas utilizando la longitud
completa y las fracciones portadoras de penetratina truncadas, se
expusieron los conjugados apropiados de podofilotoxina
(podofilotoxin-(vector de 16 elementos),
4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina;
vector de 7 elementos de podofilotoxina,
4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]-podofilotoxina,
se expusieron a las células a concentraciones apropiadas.
Se aplicaron diluciones en serie de los
compuestos de ensayo a las estirpes celulares. Tras la incubación
durante 96 h, se evaluó la citotoxicidad utilizando un ensayo de
proliferación celular con sulforrodamina B patrón (SRB). En la Tabla
9 se resumen los valores de IC_{50}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede apreciarse en la Tabla, el conjugado
de penetratina-podofilotoxina truncado es más
eficaz desde el punto de vista de la actividad antiproliferante en
células tumorales en cuanto que presenta toxicidad generalizada
menor.
Claims (39)
1. Fracción portadora de péptido de
transposición de membrana de fórmula:
en la que de 6 a 9 aminoácidos se
eliminan de la terminación amino, o una variante de dicha fracción
portadora de péptido de transposición de membrana en la que (a) uno
o dos restos de aminoácido se sustituyen homólogamente, (b) el
orden de dos restos de aminoácido está invertido, o (c) tanto (a)
como (b) están presentes
conjuntamente.
2. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 1, que comprende por lo menos el péptido de
fórmula:
3. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 1, en la que se eliminan 9 aminoácidos.
4. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 1, seleccionada de entre RRMKWKK, NRRMKWKK,
QNRRMKWKK y FQNRRMKWKK.
5. Fracción portadora de péptido según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionada de
entre
KRMKWKK, RKMKWKK, RRMWKKK y RRMKKWK.
KRMKWKK, RKMKWKK, RRMWKKK y RRMKKWK.
6. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 1, representada por cualquiera de los compuestos 16
a 19 a continuación.
7. Fracción portadora de péptido según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el grupo
carboxilo libre del resto de aminoácido del terminal carboxi esta
en la forma -C(O)-NRR', en la que R y R' se
seleccionan cada uno independiente de entre hidrógeno, alquilo
C1-6, alquileno C1-6 o alquinilo
C1-6, arilo, opcionalmente sustituido cada uno por
heteroátomos tales como O, S o N.
8. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 7, en la que el grupo carboxilo del resto del
aminoácido del terminal carboxi es un grupo carboxamida.
9. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 8, de fórmula RRMKWKK-NH_{2}.
10. Fracción portadora de péptido según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el péptido
está compuesto de restos de aminoácidos en su forma L.
11. Fracción portadora de péptido según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el péptido
está compuesto de restos de aminoácidos en su forma D.
12. Fracción portadora de péptido según la
reivindicación 10 u 11, en la que el péptido está en forma
retro.
13. Vector de transposición de membrana que
comprende una fracción portadora de péptido de transposición de
membrana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, unido a
una fracción de carga.
14. Vector de transposición según la
reivindicación 13, en el que la fracción de carga es un
oligonucleótido, nucleótido, proteína, péptido, compuesto
biológicamente activo o agente de diagnóstico.
15. Vector de transposición según la
reivindicación 14, en el que la fracción de carga es un
oligonucleótido o nucleótido seleccionado de entre genes, fragmentos
de gen, secuencias de ADN, ADNc, ARN, nucleótidos, nucleósidos,
bases heterocíclicas, oligonucleótidos complementarios o mensajeros
sintéticos y no sintéticos.
16. Vector de transposición según la
reivindicación 14, en el que la fracción de carga es una proteína o
péptido que interfiere en el ciclo celular.
17. Vector de transposición según la
reivindicación 16, en el que la fracción de carga se selecciona de
entre fragmentos del péptido p53, fragmentos del péptido
p21^{WAF}, fragmentos del péptido Fen1 o fragmentos del péptido
p16.
18. Vector de transposición según la
reivindicación 13, en el que la fracción de carga es un
fármaco.
19. Vector de transposición según la
reivindicación 18, en el que la fracción de carga procede de un
fármaco citotóxico.
20. Vector de transposición según la
reivindicación 19, en el que la fracción de carga se selecciona de
entre agentes destructores del ADN, antimetabolitos, antibióticos
antitumorales, productos naturales y sus análogos, inhibidores de la
dihidrofolato reductasa, análogos de pirimidina, análogos de
purina, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores
de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, segmentadores de ADN,
inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas, fármacos de vinca,
mitomicinas, bleomicinas, nucleósidos citotóxicos, fármacos de
pteridina, diynenos, podofilotoxinas, fármacos que contienen
platino, inductores de diferenciación y taxanos.
21. Vector de transposición según la
reivindicación 20, en el que la fracción de carga se selecciona de
entre metotrexato, metopterina, diclorometotrexato,
5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina,
purinas trisustituidas tales como olomoucina, roscovitina y
bohemina, flavopiridol, estaurosporina, arabinósido de citosina,
melfalán, leurosina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina,
mitomicina D, mitomicina A, carninomicina, aminopterina,
talisomicina, podofilotoxina, etopósido, cisplatino, carboplatino,
vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel,
taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, acetil espermidina,
tamoxifeno, irinotecán y camptotecina.
22. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 21, en el que la fracción de carga está
unida directamente a la fracción portadora de péptidos.
23. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 21, en el que la fracción de carga está
unida indirectamente a la fracción portadora de péptidos mediante
una fracción enlazadora.
24. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 23, que comprende además una fracción de
direccionamiento.
25. Vector de transposición según la
reivindicación 24, en el que la fracción de direccionamiento está
unida a la fracción portadora de péptidos.
26. Vector de transposición según la
reivindicación 24, en el que la fracción de direccionamiento está
unida a la fracción de carga.
27. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 26, en el que cada fracción portadora de
péptidos presenta más de una fracción de carga.
28. Vector de transposición según la
reivindicación 27, en el que las fracciones de carga son
diferentes.
29. Vector de transposición según la
reivindicación 27 ó 28, en el que las fracciones de carga están
unidas a a fracción portadora de péptidos por una red de restos de
lisina.
30. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 19, en el que la fracción portadora de
péptidos está compuesta por restos de aminoácidos en su forma
L.
31. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 30, en el que la fracción portadora de
péptidos está compuesta por restos de aminoácidos en su forma
D.
32. Vector de transposición según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 31, en el que la fracción portadora de
péptidos está en la forma retro.
33. Vector de transposición según la
reivindicación 17 ó 18, en el que tanto la fracción portadora de
péptidos como la fracción de carga están en la forma L.
\newpage
34. Vector de transposición según la
reivindicación 17 o 18, en el que tanto la fracción portadora de
péptidos como la fracción de carga están en la forma D.
35. Vector de transposición según la
reivindicación 17 ó 18, en el que la fracción portadora de péptidos
está en la forma D y la fracción de carga en la forma L.
36. Vector de transposición según la
reivindicación 17 ó 18, en el que la fracción portadora de péptidos
está en la forma L y la fracción de carga en la forma D.
37. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 36, que transpone la membrana celular y
permanece en el citosol.
38. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 36, que transpone la membrana celular y la
membrana nuclear.
39. Sistema de administración que comprende una
fracción de fármaco unida a una fracción portadora mediante una
fracción enlazadora, en el que dichas fracción de fármaco, fracción
portadora y fracción enlazadora se seleccionan de entre las
combinaciones presentadas en la tabla siguiente:
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