ES2319941T3 - Luciferasa mutante que tiene termoestabilidad aumentada. - Google Patents

Luciferasa mutante que tiene termoestabilidad aumentada. Download PDF

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Melenie Jane Murphy
Rachel Louise Leslie
Christopher R. Lowe
Peter John White
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Abstract

Una luciferasa recombinante que tiene actividad luciferasa y una secuencia aminoacidica que difiere de la luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata, Luciola laterales, Hotaria paroula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia nayako o Photinus pennsylanvanica en que, en la secuencia de la luciferasa recombinante, el residuo aminoacídico correspondiente a la treonina 214 en luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis o a la glicina 216 de luciferasa de tipo silvestre de Luciola mingrelica, o a la asparagina 216 en luciferasas de tipo silvestre de Luciola cruciata o Luciola lateralis está mutado en comparación con el correspondiente aminoácido que aparece en la correspondiente secuencia de luciferasa de tipo silvestre, de tal modo que la luciferasa recombinante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la correspondiente luciferasa de tipo silvestre.

Description

Luciferasa mutante que tiene termoestabilidad aumentada.
La presente invención se refiere a proteínas novedosas, en particular a enzimas luciferasa mutantes que tienen una termoestabilidad aumentada en comparación con la correspondiente enzima de tipo silvestre, al uso de estas enzimas en ensayos y a kits de ensayo que las contienen.
La luciferasa de luciérnaga cataliza la oxidación de luciferina en presencia de ATP, Mg^{2+} y oxígeno molecular, con la producción resultante de luz. Esta reacción tiene un rendimiento cuántico de aproximadamente 0,88. La propiedad de emisión de luz ha conducido a su uso en una amplia variedad de ensayos luminométricos en los que se están midiendo los niveles de ATP. Los ejemplos de dichos ensayos incluyen aquellos que están basados en lo descrito en los documentos EP-B-680515 y WO 96/02665.
La luciferasa es obtenible directamente a partir de los cuerpos de insectos, en particular escarabajos tales como luciérnagas o gusanos de luz. Las especies particulares de las que se han obtenido luciferasas incluyen las luciérnagas japonesas GENJI o KEIKE, Luciola cruciata y Luciola lateralis, la luciérnaga de Europa Oriental Luciola mingrelica, la luciérnaga de América del Norte Photinus pyralis y el gusano de luz Lampyris noctiluca. Se enumeran otras especies de las que puede obtenerse luciferasa en Ye et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1339 (1997) 39-52. Es una especie adicional más Phrixothrix (gusanos ferrocarril), como se describe por Viviani et al., Biochemistry, 38, (1999) 8271-8279.
Sin embargo, puesto que muchos de los genes que codifican estas enzimas se han clonado y secuenciado, pueden producirse también usando tecnología de ADN recombinante. Se usan secuencias de ADN recombinante que codifican las enzimas para transformar microorganismos tales como E. coli, que expresa entonces el producto enzimático deseado.
La estabilidad térmica de luciferasas de tipo silvestre y recombinante es tal que pierden actividad bastante rápidamente cuando se exponen a temperaturas superiores a aproximadamente 30ºC, particularmente superiores a 35ºC. Esta inestabilidad causa problemas cuando la enzima se usa o almacena a alta temperatura ambiental, o si el ensayo se efectúa en condiciones de reacción de alta temperatura, por ejemplo, para aumentar la velocidad de reacción.
Son conocidas luciferasas mutantes que tienen termoestabilidad aumentada por los documentos EP-A-524448 y WO95/25798. El primero de estos describe una luciferasa mutante que tiene una mutación en la posición 217 de la luciferasa de luciérnaga japonesa, en particular reemplazando un residuo de treonina por un residuo de isoleucina. El segundo describe luciferasas mutantes que tienen más de un 60% de similitud con la luciferasa de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis pero en que el residuo aminoacídico correspondiente al residuo 354 de Photinus pyralis o 356 de la especie Luciola está mutado de tal modo que es distinto de glutamato.
Los solicitantes han encontrado aún más mutantes que pueden causar una termoestabilidad aumentada y que pueden complementar las mutaciones ya conocidas en la técnica.
La presente invención proporciona una luciferasa recombinante que tiene actividad luciferasa y una secuencia aminoacídica que difiere de la luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata, Luciola lateralis, Hotaria paroula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia nayako o Photinus pennsylanvanica en que, en la secuencia de la luciferasa recombinante, el residuo aminoacídico correspondiente a la treonina 214 en luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis o a la glicina 216 de luciferasa de tipo silvestre de Luciola mingrelica, o a la asparagina 216 en luciferasas de tipo silvestre de Luciola cruciata o Luciola lateralis está mutado en comparación con el correspondiente aminoácido que aparece en la correspondiente secuencia de luciferasa de tipo silvestre, de tal modo que la luciferasa recombinante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la correspondiente luciferasa de tipo silvestre.
En particular, la luciferasa recombinante puede ser una proteína recombinante que tiene actividad luciferasa y sustancialmente la secuencia de una luciferasa de tipo silvestre, por ejemplo de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis, Hotaria paroula, Pyrophorus plagiophthalamus (Luc-verde GR), Pyrophorus plagiophthalamus (Luc amarilla-verdosa YG), Pyrophorus plagiophthalamus (Luc amarilla YE), Pyrophorus plagiophthalamus (Luc naranja OR), Lampyris noctiluca, Pyrocelia nayako Photinus pennsylanvanica LY, Photinus pennsylanvanica KW, Photinus pennsylanvanica J19, o Phrixothrix verde (Pv_{GR}) o roja (Ph_{RE}).
En particular, las enzimas bioluminiscentes de especies que pueden usar el sustrato D-luciferina (ácido 4,5-dihidro-2-[6-hidroxi-2-benzotiazolil]-4-tiazolcarboxílico) para producir emisión de luz pueden formar la base de las enzimas mutantes de la invención.
A modo de ejemplo, cuando la luciferasa recombinante tiene sustancialmente la secuencia de luciferasa de Photinus pyralis, según la invención, el residuo aminoacídico correspondiente al residuo 214 en luciferasa de Photinus pyralis puede cambiarse para ser distinto de treonina.
\newpage
Cuando la luciferasa recombinante tiene sustancialmente la secuencia de la enzima de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis, según la invención, el residuo aminoacídico correspondiente al residuo 216 de luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis puede ser distinto de glicina (para secuencias basadas en Luciola mingrelica) o asparagina (para secuencias basadas en Luciola cruciata o Luciola lateralis).
Los aminoácidos sustituidos particulares que dan lugar a una termoestabilidad potenciada pueden determinarse en cualquier caso mediante métodos rutinarios como se ilustran en adelante en la presente memoria. En cada caso, diferentes sustituciones pueden dar lugar a una termoestabilidad potenciada. La sustitución puede efectuarse mediante mutagénesis dirigida a sitio de ADN que codifica proteínas nativas o mutantes adecuadas como entendería un experto. La invención está asociada en este caso a la identificación de las posiciones que están asociadas a la termoestabilidad.
Sin embargo, en general puede ser deseable considerar sustituir por un aminoácido de diferentes propiedades al aminoácido de tipo silvestre. Por tanto, los residuos aminoacídicos hidrófilos pueden sustituirse preferiblemente, en algunos casos, por residuos aminoacídicos hidrófobos, y viceversa. De forma similar, los residuos aminoacídicos ácidos pueden sustituirse por residuos básicos.
Por ejemplo, la luciferasa recombinante que tiene actividad luciferasa puede diferir de la luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis en que, en la secuencia de la luciferasa recombinante, el residuo aminoacídico correspondiente al residuo 214 en luciferasa de Photinus pyralis y al residuo 216 de luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis está mutado y es distinto de treonina en el caso de luciferasa de Photinus pyralis, y la enzima luciferasa recombinante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con luciferasa de tipo silvestre.
Las secuencias de todas las diversas luciferasas muestran que están altamente conservadas y tienen un alto grado de similitud entre ellas. Esto significa que las correspondientes regiones entre las secuencias enzimáticas son fácilmente determinables mediante examen de las secuencias para detectar las regiones más similares, aunque si es necesario puede usarse software comercialmente disponible (por ejemplo, "Bestfit" del University of Wisconsin Genetics Computer Group; véase Devereux et al (1984) Nucleic Acid Research 12: 387-395) para determinar las correspondientes regiones o aminoácidos particulares entre las diversas secuencias. Como alternativa o adicionalmente, pueden determinarse los correspondientes aminoácidos por referencia a L. Ye et al., Biochim. Biophys Acta 1339 (1997) 39-52. El sistema de numeración usado en esta referencia forma la base del sistema de numeración usado en la presente
solicitud.
Con respecto al cambio del residuo aminoacídico correspondiente al residuo 214 en luciferasa de Photinus pyralis, el aminoácido polar treonina se reemplaza adecuadamente por un aminoácido no polar tal como alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano o cisteína. Una sustitución particularmente preferida para el residuo de treonina correspondiente al residuo 214 en Photinus pyralis es la alanina. Es una sustitución más preferida la cisteína. Sin embargo, diferentes residuos polares tales como asparagina pueden potenciar también en esta posición la termoestabilidad de la correspondiente enzima que tiene treonina en esta posición.
Otros aminoácidos que aparecen en esta posición en enzimas luciferasa de tipo silvestre incluyen glicina (Luciola mingrelica, Hotaria paroula), asparagina (Pyrophorus plagiophthalamus, GR, YC, YE y OR, Luciola cruciata, Luciola lateralis, Lampyris noctiluca, Pyrocelia nayako, Photinus pennsylanvanica LY, KW, J19) y serina (posición 211 en luciferasa de Phrixothrix). Estos pueden sustituirse ventajosamente por cadenas laterales no polares o no polares diferentes tales como alanina y cisteína. Pueden estar presentes también otras mutaciones en la enzima. Por ejemplo, en una realización, la luciferasa recombinante tiene también el aminoácido en la posición correspondiente al aminoácido 354 de luciferasa de Photinus pyralis (356 en luciferasa de Luciola y 351 en Phrixothrix) cambiado de glutamato, en particular a un aminoácido distinto de glicina, prolina o ácido aspártico. Adecuadamente, el aminoácido en esta posición es triptófano, valina, leucina, isoleucina o asparagina, pero lo más preferiblemente es lisina o arginina. Esta mutación se describe en el documento WO 95/25798.
En una realización alternativa, la luciferasa recombinante tiene también el aminoácido en la posición correspondiente al aminoácido 217 en luciferasa de Luciola (215 en Photinus pyralis) cambiado a un aminoácido hidrófobo, en particular a isoleucina, leucina o valina como se describe en el documento EP-A-052448.
La luciferasa recombinante puede contener mutaciones adicionales en la secuencia a condición de que la actividad luciferasa de la proteína no esté indebidamente comprometida. Las mutaciones potencian adecuadamente las propiedades de la enzima o la adaptan mejor para el fin pretendido de algún modo. Esto puede significar que dan como resultado una termoestabilidad potenciada y/o propiedades de desplazamiento de color, y/o de la K_{m} por ATP de las enzimas. Se describen ejemplos de mutaciones que dan lugar a desplazamientos de color en el documento WO95/18853. Las mutaciones que afectan a los valores de K_{m} se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/22376 y la solicitud de patente internacional nº PCT/GB98/01026.
Las proteínas como se describen en la presente memoria tienen adecuadamente más de una de dichas mutaciones, tal como las tres mutaciones descritas anteriormente.
La invención proporciona adicionalmente ácidos nucleicos que codifican las luciferasas recombinantes reivindicadas. Adecuadamente, los ácidos nucleicos están basados en secuencias de tipo silvestre que son bien conocidas en la técnica. La mutación adecuada para efectuar la mutación deseada en la secuencia aminoacídica sería fácilmente evidente basándose en el conocimiento del código genético.
Los ácidos nucleicos de la invención se incorporan adecuadamente a un vector de expresión tal como un plásmido bajo el control de elementos de control tales como promotores, potenciadores, terminadores, etc. Estos vectores pueden usarse entonces para transformar una célula hospedadora, por ejemplo una célula procariótica o eucariótica tal como una célula de planta o animal, pero en particular una célula procariótica tal como E. coli, de modo que la célula exprese la enzima luciferasa deseada. El cultivo de las células así transformadas usando condiciones que son bien conocidas en la técnica dará como resultado la producción de la enzima luciferasa, que puede separarse entonces del medio de cultivo. Cuando las células son células de planta o animal, pueden propagarse plantas o animales no humanos a partir de dichas células. La proteína puede extraerse entonces de las plantas o, en el caso de animales no humanos transgénicos, las proteínas pueden recuperarse de la leche. Los vectores, células transformadas, plantas y animales transgénicos y los métodos de producción de enzima cultivando estas células forman todos aspectos adicionales de la invención.
La luciferasa mutante de Photinus pyralis T214A se creó mediante mutagénesis aleatoria como se describe en adelante en la presente memoria. Se encontró que la mutación puntual individual T214A tiene mayor termoestabilidad que la luciferasa de tipo silvestre.
Se prepararon también dos nuevas luciferasas mutantes triples: E354K/T214A/A215L y E354K/T214A/I232A, y éstas han exhibido también mayor termoestabilidad.
Los ejemplos particulares de enzimas mutantes de Photinus pyralis que entran dentro del alcance de la invención incluyen los siguientes:
T214A/I232A/E354K
T214A/I232A/E354K/A215L
1232A/E354K/T214A/F295L
1232A/E354K/T214A F295UF14A/L35A
1232A/E354K/T214A/F295L/F14A/L35A/A215L
T214A
T214C
T214N
o equivalentes de cualquiera de estos cuando derivan de luciferasas de otras especies.
Las mutaciones para la creación del mutante triple se introdujeron en el gen de luciferasa en el plásmido pET23 mediante mutagénesis dirigida a sitio (PCR). Los oligonucleótidos añadidos a la reacción PCR para efectuar las mutaciones relevantes se dan en los ejemplos siguientes.
Se ha reseñado anteriormente que el efecto de mutaciones puntuales en las posiciones 354 y 215 es aditivo. Esta invención proporciona la posibilidad de combinar tres o más de dichas mutaciones para proporcionar una termoestabilidad aún mayor.
La luciferasa termoestable de la invención se empleará ventajosamente en cualquier ensayo de bioluminiscencia que utilice la reacción de luciferasa/luciferina como medio de señalización. Existen muchos de dichos ensayos conocidos en la bibliografía. Las proteínas pueden incluirse por lo tanto en kits preparados con vistas a realizar dichos ensayos, opcionalmente con luciferina y cualquier otro reactivo necesario para realizar el ensayo particular.
Se describirán ahora particularmente diversos mutantes a modo de ejemplo con referencia a los dibujos esquemáticos acompañantes, en los que:
la Figura 1 ilustra los plásmidos usados en la producción de mutantes;
la Figura 2 muestra los resultados de estudios de inactivación térmica de luciferasas;
la Figura 3 muestra los resultados de experimentos de termoestabilidad en diversas luciferasas mutantes;
la Figura 4 muestra los resultados de experimentos de termoestabilidad en otras luciferasas mutantes; y
la Figura 5 muestra oligonucleótidos que pueden usarse en la preparación de enzimas mutantes.
Ejemplo 1 Identificación de la luciferasa mutante termoestable
La PCR con tendencia al error se basaba en el protocolo desarrollado por Fromant et al., Analytical Biochemistry, 224, 347-353 (1995).
La mezcla de dNTP en esta reacción era:
dTTP 35 mM
dGTP 12,5 mM
dCTP 22,5 mM
dATP 14 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de PCR fueron:
0,5 \mul (50 ng) de plásmido pPW601a J54*
5,0 \mul de 10 x tampón de reacción de KCl
1 \mul de cada uno de W56 y W57^{+} (60 pmoles de cada cebador)
1 \mul de polimerasa Biotag^{TM} (5U)
2 \mul de dNTP (véase anteriormente)
1,76 \mul de MgCl_{2} (disolución madre 50 mM)
1 \mul de mNCl_{2} (disolución madre 25 mM) [concentración final en la reacción = 3,26 mM] 36,7 \mul de H_{2}Od
*El plásmido pPW601 aJ54 es una versión mutada de pPW601 a (documento WO 95/25798) en la que se ha creado un sitio NdeI en las 3 bases anteriores al codón de inicio ATG. Esto permite una fácil clonación a partir de pPW601 a en el vector pET23.
+Secuencias cebadoras:
\quad
W56:
\quad
5'- AAACAGGGACCCATATGGAAGACGC - 3'
\quad
W57:
\quad
5'- AATTAACTCGAGGAATTTCGTCATCGCTGAATACAG - 3')
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros de ciclación fueron:
94ºC-5 min
Entonces 12 x ciclos de: 94ºC-30 s
55ºC-30 s
72ºC-5 min
72ºC-10 min
Se purificaron los productos de PCR de la mezcla de reacción usando un kit PCR-pure Clontech Advantage^{TM}. Se digirió entonces una alícuota de los productos purificados con las enzimas de restricción NdeI y XhoI. Se "limpiaron" entonces los productos de PCR digeridos con el kit Advantage y se ligaron al vector pET23a que se había digerido con las mismas enzimas.
\newpage
Condiciones de ligamiento:
4 \mul de pET23a (56 ng)
5 \mul de productos de PCR (200 ng)
3 \mul de 5 x tampón de reacción de ligasa Gibco BRL
1 \mul de ligasa Gibco BRL (10 U)
2 \mul de H_{2}Od
Se llevó a cabo el ligamiento durante una noche a 16ºC.
Se purificaron entonces los ADN ligados usando el kit Advantage^{TM} y se electroporaron entonces en células HB101 de E. coli electrocompetentes (cubetas de 1 mm, 1,8 kV).
Se realizaron 11 electroporaciones y se añadieron entonces las células a 40 ml de caldo TY que contenía ampicilina 50 \mug/ml. Se cultivaron entonces las células durante una noche a 37ºC. Se usaron todos los 50 ml de cultivo crecido durante una noche para purificar el ADN de plásmido. Esta es la colección.
\vskip1.000000\baselineskip
Cribado de la colección
Se usó una alícuota de la colección de plásmido para electroporar células BL21 DE3 de E. coli. Se sembraron entonces estas células en agar LB que contenía ampicilina 50 \mug/ml y se cultivaron durante una noche a 37ºC.
Al día siguiente, se recogieron las colonias, se formaron parches sobre filtros de nailon en placas de agar LB + amp y se continuó el crecimiento durante una noche a 37ºC. Al día siguiente, se cubrieron los filtros con una disolución de luciferina 500 \muM en citrato de sodio 100 mM a pH 5,0. Se observaron entonces los parches en una cámara oscura. Se recogió una colonia/parche de 200 para análisis adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización del mutante termoestable
Se aisló el clon de E. coli que alberga el plásmido mutante. Se preparó ADN de plásmido para secuenciación ABI. Se secuenció todo el marco abierto de lectura que codifica luciferasa usando 4 cebadores oligonucleotídicos diferentes. La secuenciación reveló una mutación puntual individual en el nt 640 (A \rightarrow G) que da un cambio de codón de ACT (T) a GCT (A) en la posición aminoacídica 214.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Preparación de la enzima mutante triple
Se usó entonces un oligonucleótido mutagénico para crear esta misma mutación en pMOD1 (A215L/E354K), creando un mutante triple pMOD2 (A215L/E354K/T214A). Esta mutación crea también un sitio SacI/SstI único en pMOD1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Preparación de enzima mutante triple adicional
Se usaron los siguientes cebadores para crear el mutante triple T214A/I232A/E354K usando una reacción de PCR estándar y con el plásmido pET23 con la mutación T214A como molde:
CTGATTACACCCAAGGGGGATG E354K-con sentido
CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG E354K-antisentido
GCAATCAAATCGCTCCGGATACTGC I232A-con sentido
GCAGTATCCGGAGCGATTTGATTGC I232A-antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Identificación del mutante 295 termoestable
Se creó el mutante F295 usando el método de PCR con tendencia al error descrito por Fromant et al., Analytical Biochemistry, vol 224, 347-353 (1995). Las condiciones de PCR usadas fueron las siguientes:
0,5 \mul (50 ng) de plásmido pET23
5,0 \mul de 10 x tampón de reacción de KCl
1 \mul de cebador, 1-60 pmoles de cada cebador
1 \mul de cebador 2
1 \mul de polimerasa Biotag^{TM} (5U)
2 \mul de dNTP en mezcla de dTTP 35 mM, dGTP 12,5 mM, dCTP 22,5 mM, dATP 14 mM
1,76 \mul de MgCl_{2} (disolución madre 50 mM)
1 \mul de MnCl_{2} (disolución madre 25 mM) [concentración final en la reacción = 3,26 mM]
36,7 \mul de H_{2}Od
Cebador 1 = 5' - AAACAGGGACCCATATGGAAGACGC - 3'
Cebador 2 = 5' - AATTAACTCGAGGAATTTCGTCATCGCTGAATACAG - 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros de ciclación fueron:
94ºC durante 5 min
15 ciclos de: 30 s a 94ºC
30 s a 55ºC
5 min a 72ºC
entonces 10 min a 72ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron los productos de PCR de la mezcla de reacción usando un kit PCR-pure Clontech Advantage^{TM}. Se digirió entonces una alícuota de los productos purificados con las enzimas de restricción NdeI y XhoI. Se "limpiaron" entonces los productos de PCR digeridos con el kit Advantage^{TM} y se ligaron al vector pET23a que se había digerido con las mismas enzimas.
Las condiciones de ligamiento fueron las siguientes:
56 ng de pET23a
200 ng de productos de PCR
3 \mul de 5 x tampón de reacción de ligasa Gibco BRL
1 \mul de ligasa Gibco BRL (10 U)
volumen completado hasta 10 \mul con H_{2}Od
Se llevó a cabo el ligamiento durante una noche a 16ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron entonces los ADN ligados usando el kit Advantage^{TM} y se electroporaron entonces en células DH5\alpha de Escherichia coli electrocompetentes (cubetas de 1 mm, 1,8 kV). Se añadió 1 ml de caldo SOC a cada electroporación y se dejaron recuperar las células y expresar genes de resistencia a antibiótico codificados por el plásmido. Se inocularon alícuotas de la colección en agar LB que contenía ampicilina 50 \mug/ml y se cultivaron las bacterias durante una noche a 37ºC. Se recubrieron entonces discos de filtro de nailon sobre las placas de agar y se transfirieron las colonias a placas recientes. Se dejaron las placas originales a temperatura ambiente para que las colonias volvieran a crecer. Se incubaron las placas con los filtros de nailon a 42ºC durante 2 h antes de pulverizar las placas con luciferina 500 \muM en tampón citrato 100 mM a pH 5,0, y se observaron en una cámara oscura.
Se seleccionaron tres colonias termoestables basándose en que todavía lucían después de 2 h a 42ºC. Se aisló ADN de plásmido de estos clones y se secuenció, y esto reveló la mutación F295L en cada caso.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Se produjeron otros mutantes mediante PCR usando combinaciones apropiadas de los oligonucleótidos enumerados anteriormente, así como los siguientes:
GAAAGGCCCGGCACCAGCCTATCCTCTAGAGG F14A-con sentido
CCTCTAGCGGATAGGCTGGTGCCGGGCCTTTC F14A-antisentido
GAGATACGCCGCGGTTCCTGG L35A-con sentido
CCAGGAACCGCGGCGTATCTC L35A-antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Purificación de luciferasa y estudios de inactivación térmica
Se cultivaron células que expresaban luciferasas mutantes recombinantes, se desestabilizaron y se extrajeron como se describe en el documento WO 95/25798, proporcionando extractos exentos de célula de luciferasa.
Se incubaron tubos Eppendorf que contenían los extractos exentos de célula generalmente a 40ºC a menos que se indique otra cosa. Se incubaron preparaciones purificadas de luciferasas de tipo silvestre con fines comparativos en tampón de termoestabilidad que comprendía fosfato de potasio 50 mM a pH 7,8 que contenía 10% de sulfato de amonio saturado, ditiotreitol 1 mM y 0,2% de seroalbúmina bovina (BSA). Se retiró un tubo a tiempos fijados y se enfrió en un baño de hielo/acetona antes de ensayar, calculándose la actividad ensayada restante como el porcentaje de la actividad inicial o bioluminiscencia relativa.
Se ilustran los resultados en las Figuras 2 y 3 en adelante en la presente memoria. Puede observarse en la Figura 2 que diversos mutantes de luciferasa descritos en la presente memoria tienen una termoestabilidad mejorada en comparación con los mutantes conocidos anteriormente.
El aumento drástico de estabilidad frente a la luciferasa de tipo silvestre (RWT) es claro en la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Investigaciones de la actividad de 214 mutantes
Se preparó una colección de 214 mutantes usando mutagénesis dirigida a sitio usando oligonucleótidos de módulo (Figura 5) y mutantes termoestables seleccionados y ensayados como se describe en el Ejemplo 1. Se caracterizaron tres mutantes particularmente termoestables mediante secuenciación como se describe en el ejemplo 1 como T214A, T214C y T214N.
Se lisaron cultivos O/N de XL1-Blue de E. coli que albergaban plásmidos que codificaban T214, T214A, T214C y T214N usando el tampón de Tisis Promega. Se inactivaron entonces térmicamente 50 \mul de extractos líquidos a 37ºC y 40ºC en diversos momentos. Se ensayaron entonces alícuotas de 10 \mul de extracto calentado en el tampón de ensayo Promega live (100 \mul).
Se muestran los resultados en las siguientes tablas
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
3
Se repitió el experimento a 40ºC con los 3 mutantes
4 
\vskip1.000000\baselineskip
5
Estos resultados indican que T214C es significativamente más termoestable que cualquiera de r-wt o T214A o N. Este cambio en las propiedades es inesperado, ya que habitualmente se espera que cuantos más residuos de cisteína están presentes, peor es la termoestabilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Investigación de otras mutaciones puntuales
Se preparó una serie de otros mutantes de Photinus pyralis con mutaciones puntuales usando PCR con tendencia al error aleatorio (Figura 5). Después de cribar y secuencias los mutantes generados, se comprobó la secuenciación usando mutagénesis dirigida a sitio seguida de secuenciación adicional. Estos eran D234G, A105V y F295L. Se ensayó la termoestabilidad de estos mutantes así como de la luciferasa recombinante de tipo silvestre de Photinus pyralis. Se incubaron muestras de proteína en tampón de tisis Promega a 37ºC durante 10 minutos y se ensayó su actividad después de 2, 5 y 10 minutos. Los resultados, que muestran que cada mutación producía una termoestabilidad potenciada frente al tipo silvestre, se muestran en la Figura 4.

Claims (14)

1. Una luciferasa recombinante que tiene actividad luciferasa y una secuencia aminoacidica que difiere de la luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata, Luciola laterales, Hotaria paroula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia nayako o Photinus pennsylanvanica en que, en la secuencia de la luciferasa recombinante, el residuo aminoacídico correspondiente a la treonina 214 en luciferasa de tipo silvestre de Photinus pyralis o a la glicina 216 de luciferasa de tipo silvestre de Luciola mingrelica, o a la asparagina 216 en luciferasas de tipo silvestre de Luciola cruciata o Luciola lateralis está mutado en comparación con el correspondiente aminoácido que aparece en la correspondiente secuencia de luciferasa de tipo silvestre, de tal modo que la luciferasa recombinante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con la correspondiente luciferasa de tipo silvestre.
2 La luciferasa recombinante según la reivindicación 1, en la que la luciferasa recombinante es una forma mutada de luciferasa de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis.
3. La luciferasa recombinante según la reivindicación 2, en la que la luciferasa recombinante es una forma mutada de luciferasa de Photinus pyralis.
4. La luciferasa recombinante según la reivindicación 3, en la que el residuo aminoacídico correspondiente a la treonina 214 en luciferasa de Photinus pyralis se ha mutado a alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteina o asparagina.
5. La luciferasa recombinante según la reivindicación 4, en la que el residuo aminoacídico correspondiente a la treonina 214 en luciferasa de Photinus pyralis se ha mutado a alanina, cisteína o asparagina.
6. Un ácido nucleico que codifica una luciferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
7. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 6.
8. Una célula transformada con un vector según la reivindicación 7.
9. La célula según la reivindicación 8 que es una célula procariótica.
10. La célula según la reivindicación 8 que es una célula de planta.
11. Una planta que comprende células según la reivindicación 10.
12. Un método de producción de una luciferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula según la reivindicación 8 o el crecimiento de una planta según la reivindicación 11.
13. El uso de una luciferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 6 en un ensayo de bioluminiscencia.
14. Un kit que comprende una luciferasa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. El kit según la reivindicación 14, que comprende adicionalmente luciferina.
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