ES2319982T3 - Proteinas que se unen a amiloide que contiene la estructura beta-cruzada y procedimientos de modulacion de la estructura beta-cruzada, de su formacion y de la toxicidad asociada a la misma. - Google Patents

Proteinas que se unen a amiloide que contiene la estructura beta-cruzada y procedimientos de modulacion de la estructura beta-cruzada, de su formacion y de la toxicidad asociada a la misma. Download PDF

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Abstract

Utilización de un compuesto capaz de unión a una estructura beta-cruzada para la preparación de un medicamento para disminuir las proteínas desplegadas que han adoptado una conformación parcialmente estructurada, involucradas en una enfermedad conformacional, en la que dicho compuesto es un anticuerpo o comprende un dominio "finger", en el que dicho dominio "finger" es derivado de Fibronectina, FXII o HGFa, y en la que dicha enfermedad es una enfermedad caracterizada por amiloide, ateroesclerosis, diabetes, hemorragia, trombosis, cáncer, sepsis, Esclerosis Múltiple, enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, enfermedad asociada con pérdida de memoria o enfermedad de Parkinson y/o epilepsia.

Description

Proteínas que se unen a amiloide que contiene la estructura beta-cruzada y procedimientos de modulación de la estructura beta-cruzada, de su formación y de la toxicidad asociada a la misma.
La presente invención se refiere al sector de la bioquímica, biología molecular, biología estructural y medicina. Más en particular, la invención se refiere a una estructura cross-\beta (beta-cruzada) a sus proteínas de unión y a sus funciones biológicas.
Introducción
Un volumen de pruebas creciente sugiere que el desplegado de proteínas globulares puede conducir a la toxicidad^{1}. Las proteínas desplegadas pueden iniciar la agregación de proteínas y la fibrilización al adoptar una conformación parcialmente estructurada. Estos agregados fibrilares pueden acumularse (lentamente) en diferentes tipos de tejidos y están asociados con una serie de enfermedades degenerativas. El término "amiloide" se utiliza para describir estos depósitos fibrilares (o placas). Las enfermedades caracterizadas por amiloides reciben la designación de amiloidosis e incluyen la enfermedad de Alzheimer (AD), amiloidosis de cadena ligera, diabetes de tipo II y encefalopatías esponjiformes. Se ha descubierto recientemente que la toxicidad es una característica inherente de las proteínas mal plegadas. De acuerdo con la presente invención este es un mecanismo común de estas enfermedades de
conformación^{1}.
Una estructura cross-\beta (beta-cruzada) es un elemento estructural secundario en los péptidos o proteínas. Una estructura beta-cruzada puede ser formada después de desnaturalización, proteolisis o desplegado de proteínas^{2}. Estos elementos de estructura secundaria se encuentran típicamente ausentes en zonas globulares de las proteínas. La estructura beta-cruzada se encuentra en fíbrilas amiloides. Los péptidos o proteínas amiloides son citotóxicos con respecto a las células. Una estructura beta-cruzada está compuesta por láminas \beta apiladas. En una estructura beta-cruzada las hebras \beta individuales discurren perpendicularmente con respecto al eje largo de una fibrila, o las hebras \beta discurren paralelamente al eje largo de una fibra. La dirección de apilamiento de las láminas \beta en estructuras beta-cruzadas es perpendicular al eje largo de la fibra.
Los inventores dan a conocer por el presente documento que la glicación de proteínas induce también la formación de la estructura beta-cruzada. Nuestros resultados, combinados con información de literatura ya existente, indican que se induce una estructura común en el desplegado de proteínas globulares. Por lo tanto, la presente invención da a conocer una nueva ruta que involucra la estructura beta-cruzada, cuya ruta puede ser llamada "ruta de la estructura beta-cruzada". Esta ruta consiste en varias proteínas de estructura beta-cruzada incluyendo los llamados receptores multiligando y está involucrada en la degradación de proteínas y/o eliminación de proteínas. Los inventores también dan a conocer la identificación de nuevas proteínas de unión beta-cruzada que contienen un módulo de unión de la estructura beta-cruzada. Estos descubrimientos apoyan la identificación de una ruta de la estructura beta-cruzada. Múltiples aspectos de esta nueva ruta quedan indicados a continuación.
Por ejemplo, la presente invención da a conocer que las proteínas proteolizadas, desnaturalizadas, desplegadas, glicadas, oxidadas, acetiladas o alteradas estructuralmente de otro modo adoptan estructuras beta-cruzada. Ejemplos de proteínas conocidas que forman estructura beta-cruzada son todas las proteínas que provocan amiloidosis o proteínas que se encuentran en depósitos amiloides relacionados con enfermedades, por ejemplo, sin que ello sirva de limitación, el \beta amiloide (A\beta) de Alzheimer y el Polipéptido Amiloide de Isletas (IAPP). La presente invención da a conocer que la fibrina, proteínas glicadas (por ejemplo, albúmina glicada y hemoglobina glicada) y endostatina son también capaces de adaptar una estructura beta-cruzada.
La invención da a conocer también la identificación de la formación de una estructura beta-cruzada como señal de degradación de la proteína y/o desaparición de la proteína.
El activador de serina proteasa de plasminógeno de tejidos (tPA) induce la formación de plasmina a través del fraccionamiento del plasminógeno. La plasmina divide la fibrina y esto tiene lugar durante la lisis de un coágulo sanguíneo. Si bien no es esencial para la fibrinólisis en ratones^{8;4}, el tPA ha sido reconocido por su intervención en la fibrinólisis durante largo tiempo^{5;6}. La activación de plasminógeno por el tPA es estimulada por la fibrina o fragmentos de fibrina pero no por su precursor, el fibrinógeno^{7-10}. Esto se puede explicar en parte por la unión fuerte de tPA a fibrinas y la unión débil al fibrinógeno. Los lugares de unión en la fibrina y en el tPA responsables de la unión y la activación de tPA han sido localizados y estudiados en detalle^{8-21}. No obstante, la base estructural exacta para la interacción de tPA con fibrina era desconocida. Además de la fibrina y fragmentos de fibrina, se han descrito muchas otras proteínas que son igualmente capaces de unión con tPA y de estimular la formación de plasmina mediada por tPA^{22-36}. Al igual que con la fibrina y fragmentos de fibrina, la naturaleza exacta de las interacciones entre estos ligandos para tPA y tPA no era conocida. Además, era desconocido el porqué y como todas estas proteínas, que carecen de homología de secuencia primaria, se unen a tPA. Se da a conocer un activador de plasminógeno de tipo tejidos (tPA) como proteína capaz de unión a estructuras beta-cruzadas. Además la invención da a conocer el dominio apéndice ("finger") (también designado dominio de fibronectina tipo I) y otros dominios "finger" comparables como módulo de unión a estructura beta-cruzada. La presente invención da a conocer además que las proteínas que se unen a estos "fingers" serán típicamente capaces de formar estructuras beta-cruzadas.
Dado que la fibrina contiene la estructura beta-cruzada, la presente invención da a conocer también que la generación de estructuras beta-cruzadas desempeña un papel en los procesos fisiológicos. La invención da a conocer que la generación de estructuras beta-cruzadas es parte de una ruta de señalización, la "ruta de la estructura beta-cruzada", que regula la degradación de proteínas y/o la desaparición de las mismas. Una función no adecuada de esta ruta puede tener como resultado el desarrollo de enfermedades tales como enfermedades de conformación^{87} y/o amiloidosis.
La presente invención da a conocer además que la estructura beta-cruzada es un denominador común en ligandos para preceptores multiligando^{88}. La invención da a conocer por lo tanto que los receptores multiligando pertenecen a la "ruta de la estructura beta-cruzada".
El ejemplo mejor estudiado de receptor para la estructura beta-cruzada es RAGE^{89-44}. Son ejemplos de ligandos para RAGE A\beta, productos finales del glicado avanzado de proteínas (AGE) aductos (incluyendo BSA glicado) amfoterina y S100. El RAGE es un miembro de una familia más amplia de receptores multiligando^{98}, que incluyen otros varios receptores algunos de los cuales, incluyendo CD36 se sabe que se unen a proteínas que contienen estructura beta-cruzada (ver también figura 1). En la actualidad no está clara la naturaleza exacta de la estructura o estructuras en los ligandos de estos receptores que median la unión a estos receptores. Los inventores dan a conocer que el glicado de proteínas induce también la formación de estructura beta-cruzada. Por lo tanto, damos a conocer que todos estos receptores forman parte de un mecanismo que tiene que ver con la destrucción y eliminación de proteínas o agentes no deseados o incluso perjudiciales. Estos receptores juegan un papel en el reconocimiento de agentes o células infecciosas, reconocimiento de células apoptóticas y en la internalización de complejos de proteínas y/o patógenos. Además se da a conocer que todos estos receptores reconocen la misma estructura o estructura similar, la estructura beta-cruzada, para responder a moléculas no deseadas. Los inventores muestran que el tPA se une a estructuras beta-cruzadas proporcionando la evidencia de que el tPA pertenece a la familia de receptores multiligando. Tal como se da a conocer en el presente documento, el tPA y otros receptores multiligandos se unen a la estructura beta-cruzada y participan en la destrucción de biomoléculas no deseadas. Un papel prominente de la proteasa tPA en la ruta, consiste en su habilidad en iniciar una cascada proteolítica que incluye la formación de plasmina. La proteolisis es probablemente esencial para la degradación y su siguiente eliminación de componentes de matriz extracelular. El efecto del tPA en la matriz extracelular afectará la adherencia de las células, emigración de las células, supervivencia de las células y muerte de las células, a través, por ejemplo, de procesos mediados por integrina. Basándose en los estudios de los inventores, estos proporcionan sólidas pruebas de que como mínimo otras tres proteínas FXII a.k.a. FXII (factor XII), activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFa) y fibronectina que contiene uno o varios dominios "finger" son también una parte de la "ruta de la estructura beta-cruzada".
En especial el papel de FXII es importante puesto que activa la ruta de coagulación intrínseca. La activación de la ruta intrínseca y la formación resultante de péptidos vasoactivos y la activación de otras importantes proteínas contribuyen al proceso de protección y/o eliminación de proteínas o agentes no deseados. La "ruta de la estructura beta-cruzada" es modulada de muchas maneras. Los factores que regulan la ruta comprenden moduladores de síntesis y de secreción así como moduladores de actividad. La ruta está involucrada en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Por lo tanto, un método para modular la degradación de proteínas extracelulares y/o eliminación de proteínas comprendiendo la modulación de la actividad de un receptor para proteínas que forman estructura beta-cruzada se da a conocer de forma adicional. Se incluyen entre los ejemplos de receptores para proteínas formadoras de estructura beta-cruzada RAGE, CD36, proteína relacionada con la lipoproteína de baja densidad (LRP), receptor de barrido B-1 (SR-BI), SR-A. La invención da a conocer que FXII, HGFa y la fibronectina son también receptores para la estructura beta-cruzada. Se da a conocer que el activador de plasminógeno tipo tejido (tPA) es una proteína de unión de estructura beta-cruzada, un receptor multiligando y un miembro de la "ruta de la estructura beta-cruzada". Se da a conocer que el tPA media la disfunción celular inducida por estructura beta-cruzada y/o la toxicidad celular. Se da a conocer que el tPA media como mínimo en parte en la disfunción celular y/o toxicidad celular a través de la activación de plasminógeno. Los efectos dependientes de plasminógeno son inhibidos por carboxipeptidasa de tipo B actividad B y por lo tanto se da a conocer un papel de los residuos de lisina carboxiterminales en la ruta de la estructura beta-cruzada.
La presente invención se refiere, entre otras cuestiones, a la estructura o estructuras de la fibrina y otras proteínas que se unen a tPA, al dominio de unión en tPA y a la ruta o rutas reguladas por esta estructura. Se da a conocer la presencia de estructuras beta-cruzadas en proteínas y polipéptidos que son capaces de unión con tPA. Los resultados que se indican en el presente documento indican una fuerte correlación entre la presencia de una estructura beta-cruzada y la capacidad de una molécula de unión con tPA. Además, los resultados indican la presencia de una estructura amiloide en la fibrina. Esto indica que en condiciones fisiológicas se puede formar una estructura beta-cruzada, fenómeno que no se ha observado anteriormente. La formación de estructuras beta-cruzadas ha sido asociada hasta el momento principalmente con fuertes desórdenes patológicos. El tPA se une a proteínas desnaturalizadas, lo que indica que un gran número de proteínas, posiblemente todas las proteínas, pueden adaptar una conformación que contiene estructura beta-cruzada o una estructura o estructuras similares a beta-cruzada. Todo ello en conjunto, la formación de estructuras beta-cruzadas es probable que inicie y/o participe en una cascada de eventos fisiológicos necesaria para tratar adecuadamente con la eliminación de moléculas no deseadas, es decir proteínas mal plegadas, células apoptóticas o incluso patógenos. La figura 1 muestra una representación esquemática de la "ruta de la estructura beta-cruzada". Esta ruta regula la eliminación de biomoléculas no deseadas durantes varios procesos incluyendo fibrinólisis, formación de redes sinápticas neuronales, eliminación de proteínas agotadas, no deseadas y/o destruidas (desnaturalizadas), inducción de apoptosis y eliminación de células apoptóticas y patógenos. Si esta ruta es regulada de manera insuficiente o incorrecta o desequilibrada, la ruta puede conducir a varias enfermedades.
Se da a conocer una forma de modular la degradación de proteínas extracelulares y/o eliminación de proteínas, comprendiendo la modulación de la formación de la estructura beta-cruzada (y/o la actividad mediada por la estructura beta-cruzada) de dicha proteína presente en la circulación.
Hay dos modelos principales de plegado de proteínas regulares que son conocidos como lámina \beta (\beta-sheet)y hélice-a (a-helix). Se forma una lámina \beta antiparalela cuando una cadena de polipéptido extendida se pliega hacia atrás y hacia delante sobre si misma, de manera que cada sección de las cadenas discurre en una dirección opuesta a la de sus vecinas inmediatas. Esto proporciona una estructura consolidada por enlaces de hidrógeno que conectan las uniones de los péptidos con cadenas adyacentes. Las zonas de una cadena de polipéptido que discurren en la misma dirección forman una lámina \beta paralela. Una estructura beta-cruzada está formada por láminas \beta apiladas. En una estructura beta-cruzada las hebras \beta individuales discurren perpendicularmente al eje largo de una fibrina o bien las hebras \beta discurren en paralelo con el eje largo de una fibra. La dirección del apilamiento de las láminas \beta en estructuras beta-cruzadas es perpendicular al eje largo de la fibra. Tal como se da a conocer en el presente documento dentro de la parte experimental, una amplia gama de proteínas es capaz de adoptar una estructura beta-cruzada y además estas estructuras beta-cruzadas que comprenden proteínas son todas ellas capaces de unión y estimulación de tPA y por lo tanto de promover la destrucción de proteínas o agentes no deseados o perjudiciales.
Una proteína extracelular es definida de forma típica como proteína que se encuentra presente en el exterior de una célula o células.
La degradación de una proteína y/o eliminación de una proteína incluye la destrucción y eliminación de proteínas no deseadas, por ejemplo, una proteína no deseada y/o destruida (por ejemplo, desnaturalizada). También se incluye la eliminación de biomoléculas no deseadas durante varios procesos, incluyendo fibrinólisis, formación de redes sinápticas neuronales, eliminación de proteínas agotadas, no deseadas y/o destruidas (desnaturalizadas), inducción de apoptosis y eliminación de células apoptóticas y patógenos.
El término "en la circulación" se define en este documento como circulación por fuera de una célula o células, por ejemplo, sin que ello sirva de restricción, el movimiento continuo de la sangre.
Se da a conocer una forma de disminuir la degradación de proteínas extracelulares y/o eliminación de proteínas que comprende disponer un compuesto capaz de disminuir la formación de estructura beta-cruzada de dicha proteína presente en la circulación. La disminución de la formación de estructura beta-cruzada se consigue, por ejemplo, por la protección o bloqueo de los grupos involucrados en la formación de una estructura beta-cruzada. Son ejemplos de compuestos capaces de disminuir la formación de estructura beta-cruzada los anticuerpos.
Se da a conocer además una forma de modular la degradación de proteínas extracelulares y/o eliminación de proteínas extracelulares comprendiendo la modulación de tPA, o de actividad similar a tPA. El tPA induce la formación de plasmina a través del fraccionamiento del plasminógeno. La plasmina divide la fibrina y ésta tiene lugar durante la lisis de un coágulo sanguíneo. La activación de plasminógeno por tPA es estimulada por fibrina o fragmentos de fibrina, pero no por su precursor fibrinógeno. El término "actividad similar a tPA" se define en la presente descripción como un compuesto capaz de inducir la formación de plasmina, posiblemente en cantidades distintas y/o otras actividades mediadas por tPA. Preferentemente, la actividad similar a tPA es modificada de manera tal que tiene una mayor actividad o afinidad hacia el sustrato y/o un cofactor. Esto se consigue, por ejemplo, al proporcionar dicha actividad similar a tPA con múltiples dominios de unión para estructura beta-cruzada comprendiendo proteínas. Preferentemente, dicha actividad similar a tPA es proporcionada por múltiples dominios "finger". Se da a conocer que las estructuras tridimensionales de un dominio tPA "finger" y los dominios "finger" de fibronectina 4-5 muestran una sorprendente homología estructural con respecto a la distribución local por densidad de carga. Ambas estructuras contienen un tramo similar expuesto a disolventes de cinco residuos de aminoácidos con carga alternada para tPA Arg7, Glu9, Arg23, Glu32, Arg30, y para fibronectina Arg83, Glu85, Lys87, Glu89, Arg90, situados en el quinto dominio "finger", respectivamente. Las alineaciones de residuos cargados están localizadas en el mismo lado del módulo "finger". A causa de ello, preferentemente, la actividad similar a tPA es proporcionada con uno o varios dominios "finger" adicionales que comprenden ArgXGlu(X)13Arg(X)8GluXArg o ArgXGluXLysXGluArg.
Un fragmento funcional y/o un equivalente funcional es definido de manera típica como fragmento y/o equivalente capaz de llevar a cabo la misma función, posible en diferentes cantidades. Por ejemplo, un fragmento funcional de un anticuerpo capaz de unión a una estructura beta-cruzada sería el fragmento Fab' de dicho anticuerpo.
Se observará que al incrementar la interacción entre un compuesto que comprende una estructura beta-cruzada y un compuesto que comprende actividad similar a tPA se consigue también por mutaciones en el compuesto que comprende la estructura beta-cruzada o en el compuesto que comprende la actividad similar a tPA, tal como intercambio de dominios (por ejemplo, proporcionando dicho compuesto que comprende actividad similar a tPA con otro u otros dominios "finger" (que se pueden obtener a partir de fibronectina, FXII o HGFa).
La presente invención da a conocer además la utilización de una nueva estrategia para prevenir la formación o para disminuir/reducir placas (amiloides) involucrada en una enfermedad conformacional, diabetes tipo II y/o envejecimiento (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Las placas son definidas de manera típica como depósitos de proteínas fibrilares extracelulares (agregados fibrilares) y son característicos de enfermedades degenerativas. Las características "nativas" de las proteínas amiloides constituyentes pueden variar: algunas son oligómeros solubles in vivo (por ejemplo, transtiretina en polineuropatía amiloide familiar), mientras que otros son péptidos flexibles (por ejemplo, amiloide-b en la enfermedad de Alzheimer (AD)). La patogénesis básica de las enfermedades conformacionales como, por ejemplo, desórdenes neurodegenerativos (AD, desórdenes de priones), se cree que está relacionada a la conformación anormal de proteínas patológicas, es decir, la conversión de una proteína celular normal y/o circulante en una forma rica en estructura \beta, aglutinada, insoluble, que es depositada en el cerebro. Estos depósitos son tóxicos y producen disfunción neuronal y muerte. La formación de estructuras beta-cruzadas ha sido asociada hasta el momento solamente con desórdenes patológicos severos. Los resultados alcanzados por los inventores muestran que el tPA y otros receptores para estructura beta-cruzada que forman proteínas se pueden unir a proteínas desnaturalizadas, indicando que un gran número de proteínas es capaz de adoptar una conformación que contiene estructuras beta-cruzadas o similares a beta-cruzadas. Considerado todo ello, la formación de una estructura beta-cruzada inicia o participa en una cascada de eventos fisiológicos necesaria para tratar de manera adecuada con la eliminación de las moléculas no deseadas, es decir, proteínas mal plegadas, células apoptóticas o incluso patógenos. Al incrementar la formación de estructura beta-cruzada en una proteína involucrada en una enfermedad conformacional, la ruta para la degradación de la proteína y/o eliminación de la proteína es activada y dicha proteína es degradada, teniendo como resultado una disminución de placa o más preferentemente la eliminación completa de la placa. Por lo tanto, los efectos de la enfermedad conformacional disminuyen o más preferentemente quedan suprimidos por completo.
En una realización de la invención se prevé la utilización de un compuesto capaz de unión a una estructura beta-cruzada para la preparación de un medicamento para disminuir proteínas desplegadas que han adoptado parcialmente una conformación estructurada, involucrada en una enfermedad conformacional, de manera que dicho compuesto es un anticuerpo o comprende un dominio "finger", en el que dicho dominio "finger" es derivado de fibronectina, FXII o HGF\alpha, y en el que dicha enfermedad es una enfermedad caracterizada por amiloide, aterosclerosis, diabetes, hemorragia, trombosis, cáncer, sepsis, esclerosis múltiple, enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, enfermedad asociada con pérdida de memoria o enfermedad de Parkinson y/o epilepsia.
Son ejemplos de dichos anticuerpos 4B5 ó 3H7.
Preferentemente, dicho dominio "finger" comprende un tramo de un mínimo de 5 residuos de aminoácidos con carga alternante, por ejemplo, ArgXGlu(X)_{13}Arg(X)_{8}GluXArg o ArgXGluXLysXGluArg. Incluso de forma más preferente, dicho domino "finger" es derivado de la fibronectina, FXII o HGFa.
En otra realización preferente, dicha proteína es un anticuerpo.
También se dan a conocer la utilización de un compuesto capaz de incrementar o estabilizar la interacción de un compuesto que comprende una estructura beta-cruzada y un compuesto que comprende una actividad similar a tPA para disminuir placas involucradas en una enfermedad conformacional. Son ejemplos de compuestos capaces de incrementar o estabilizar la interacción de un compuesto que comprende una estructura beta-cruzada y un compuesto que comprende una actividad similar a tPA los que se indican en este documento. Preferentemente se prevé una utilización de acuerdo con la invención en la que dicha enfermedad conformacional es Alzheimer o diabetes. Es evidente que la invención no proporciona solamente una utilización para reducir/disminuir placas involucradas en una enfermedad conformacional sino que el inicio de dicha enfermedad puede ser también inhibido o más preferentemente impedido por completo. Son ejemplos de enfermedades que pueden ser prevenidas y/o tratadas de acuerdo con la invención la enfermedad conformacional, enfermedades tipo amiloidosis, aterosclerosis, diabetes, hemorragia, trombosis, cáncer, sepsis y otras enfermedades inflamatorias, esclerosis múltiple, enfermedades auto-inmunes, enfermedades asociadas con pérdida de memoria o Parkinson y otras enfermedades neuronales (epilepsia).
Dado que esta invención ha puesto en evidencia que la estructura beta-cruzada es dañina cuando existe en ciertas partes del cuerpo tales como, por ejemplo, el cerebro, y los daños son llevados a cabo por la combinación de las estructuras beta-cruzadas con tPA, se facilita una ruta para inhibir los efectos mediados por estructuras beta-cruzadas que comprende el proporcionar una cantidad efectiva de una proteína que comprende un dominio "finger" para bloquear los lugares de unión de la estructura beta-cruzada para tPA.
En otra realización, el efecto mediado por la estructura beta-cruzada local puede ser utilizado contra tumores.
Descripción detallada
Se da a conocer: (i) la identificación de una "ruta de la estructura beta-cruzada", (ii) la identificación de receptores multiligando como receptores de estructura beta-cruzada, (iii) la identificación del dominio "finger" como módulo de unión beta-cruzada y (iv) la identificación de proteínas que contienen "finger", incluyendo tPA, FXII, HGFa y fibronectina como parte de la "ruta de la estructura beta-cruzada".
Se dan a conocer además compuestos no previamente conocidos para unión con la estructura beta-cruzada.
Tal como se ha dado a conocer en este documento, se facilitan compuestos y tratamientos de enfermedades asociadas con la formación excesiva de estructura beta-cruzada. Estas enfermedades incluyen enfermedades conformacionales conocidas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y otros tipos de amiloidosis. No obstante, la presente invención da a conocer asimismo que otras enfermedades, que no han sido todavía asociadas con la excesiva formación de estructura beta-cruzada son también provocadas por la excesiva formación de estructura beta-cruzada. Estas enfermedades comprenden aterosclerosis, sepsis, coagulación intravascular difusa, síndrome urémico hemolítico, preeclampsia, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunes, trombosis y cáncer.
El compuesto es una molécula de unión a estructura beta-cruzada, preferentemente un dominio "finger" o una molécula que contiene uno o varios dominios "finger", o es un análogo péptido mimético de uno o varios dominios "finger". El compuesto puede ser también un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo dirigido a la estructura beta-cruzada.
Los dominios "finger", apéndices que contienen moléculas o anticuerpos pueden ser humanos, de ratón, rata o de cualquier otra especie.
De acuerdo con la invención se pueden sustituir los aminoácidos de las proteínas correspondientes por otros aminoácidos que pueden incrementar/disminuir la afinidad, potencia, biodisponibilidad y/o vida media del péptido. Las alteraciones incluyen sustituciones convencionales (ácido-ácido, masa-masa y similares), introduciendo aminoácidos D, haciendo cíclicos los péptidos, etc.
Además, se dan a conocer compuestos y rutas para:
1)
inhibir la formación de fibrilas amiloides.
2)
modular la toxicidad inducida por estructura beta-cruzada.
3)
eliminación de la circulación de moléculas que contienen estructura beta-cruzada.
Se dan a conocer compuestos y rutas para la preparación de un compuesto para la inhibición de la formación de fibrilas de estructura beta-cruzada.
Se dan a conocer compuestos y rutas para la preparación de un compuesto para modular la toxicidad inducida por una estructura beta-cruzada.
Abreviaturas: A\beta, péptido \beta amiloide; AD, enfermedad de Alzheimer; AGE, productos finales de glicado avanzado; CpB, carboxipeptidasa B; COI (inhibidor de carboxipeptidasa); ELISA, ensayo inmunoenzimático (ELISA); FN, fibronectina; FXII, factor XII (factor de Hageman); HGFa, activador del factor de crecimiento de hepatocitos; LAPP, polipéptido amiloide de isletas; PCR, reacciones de la cadena de polimerasa (PCR); RAGE, receptor para AGE; tPA, activador de plasminógeno de tipo tejido.
La invención da a conocer la utilización de compuestos tal como se ha definido en la reivindicación 1 para el tratamiento de enfermedades asociadas con la excesiva formación de estructura beta-cruzada, tal como se ha definido en la reivindicación 1.
La estructura beta-cruzada puede ser parte de una fibrila A\beta o puede ser parte de otra fibrila amiloide. La estructura beta-cruzada puede encontrarse presente también en proteínas desnaturalizadas.
Se da a conocer una forma de inhibir la formación de fibrilas de amiloides o para modular la toxicidad inducida por la estructura beta-cruzada. El compuesto es un módulo de unión beta-cruzada, preferentemente un dominio "finger", un dominio "finger" que contiene una molécula, un análogo péptido mimético y/o un anticuerpo anti-estructura beta-cruzada, o un fragmento del mismo.
La inhibición de formación de fibrilas tiene preferentemente la consecuencia de disminuir la carga de fibrilas.
La inhibición de la formación de fibrilas o la modulación de la toxicidad de la estructura beta-cruzada puede tener también la consecuencia de modulación de la muerte celular. La célula puede ser cualquier célula pero preferentemente es una célula neuronal, una célula endotelial o una célula tumoral. La célula puede ser una célula humana o una célula de otra especie.
La célula puede encontrarse presente de manera típica en un sujeto. El sujeto al que se administra el compuesto puede ser un mamífero, preferentemente un humano.
El sujeto puede sufrir de amiloidosis, de otra enfermedad conformacional, de enfermedad de priones, de fallo crónico renal y/o amiloidosis relacionada con diálisis, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad autoinmune o el sujeto puede ser obeso. El sujeto puede sufrir también de inflamación, artritis reumatoide, diabetes, retinopatía, sepsis, coagulación intravascular difusa o el síndrome urémico hemolítico y/o preeclampsia. Las enfermedades que pueden ser tratadas o prevenidas incluyen diabetes, enfermedad de Alzheimer, senilidad, fallo renal, ateroesclerosis hiperlipidémica, citotoxidad neuronal, síndrome de Down, demencia asociada con trauma de la cabeza, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, amiloidosis y enfermedades autoinmunes, inflamación, tumor, cáncer, impotencia masculina, curación de heridas, enfermedad periodontal, neuropatía, retinopatía, nefropatía o degeneración
neuronal.
La administración de compuestos de acuerdo con la invención puede ser constante o para un cierto periodo de tiempo. El compuesto puede ser administrado por horas, diariamente, semanalmente, mensualmente (por ejemplo, en una forma de liberación a lo largo del tiempo) o con una sola administración. La administración puede ser también continua, por ejemplo, administración intravenosa.
Se puede utilizar un portador. El portador puede ser un diluyente, un aerosol, una solución acuosa, una solución no acuosa o un portador sólido. También se dan a conocer compuestos farmacéuticos incluyendo cantidades terapéuticamente efectivas de compuestos y composiciones de polipéptidos junto con diluyentes adecuados, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, coadyuvantes y/o portadores. Estos compuestos pueden ser líquidos o liofilizados o formulaciones secadas de otro modo y pueden incluir diluyentes o diferentes contenidos tampón (por ejemplo, Tris-HCl., acetato, fosfato) pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para impedir la absorción en superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos bílicos), agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietileno glicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (por ejemplo, Timerosal, alcohol benzílico, parabenes), sustancias de volúmen o modificadores de tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol), fijación covalente de polímeros tales como polietilenglicol al compuesto, formación de complejo con iones metálicos o incorporación del compuesto en preparados de partículas de compuestos polímeros tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc, o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multi lamelares, eritrocitos incompletos ("ghost") o esferoplas-
tos.
La administración de compuestos según la invención puede comprender inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; infusión; suministro mediado por liposomas; tópica, intratecal, por la bolsa gingival, por el recto, intrabronquial, nasal, oral, ocular o por el oído. En otra realización la administración comprende administración intrabronquial, anal, intratecal o transdérmica.
De acuerdo con la invención los compuestos pueden ser administrados según horario, diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. En otra realización la cantidad efectiva del compuesto comprende 0.000001 mg/Kg de peso corporal hasta 100 mg/Kg de peso corporal.
Los compuestos según la invención pueden ser administrados localmente con intermedio de una cápsula que permite la liberación mantenida del agente a lo largo de un periodo de tiempo. Los compuestos de liberación controlada o mantenida incluyen formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites). También se incluyen en la invención compuestos en partículas recubiertos con polímeros (por ejemplo, polaxámeros o poloxaminas) y el agente acoplado a anticuerpos dirigido contra receptores específicos de tejidos, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos de tejidos. Otras realizaciones de las composiciones de la invención incorporan formas en partículas, recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o amplificadores de permeación para varias rutas de administración incluyendo rutas parenteral, pulmonar, nasal y oral.
La cantidad efectiva de los compuestos de acuerdo con la invención comprende preferentemente 1 ng/Kg de peso corporal hasta 1 gr/Kg de peso corporal. La cantidad efectiva real se basará en el tamaño del compuesto y sus características.
Dado que la presente invención ha demostrado que las estructuras beta-cruzadas son dañinas cuando se encuentran presentes en ciertas partes del cuerpo, tales como, por ejemplo, el cerebro y el daño es efectuado por la combinación de estructuras beta-cruzadas con tPA, se da a conocer una forma de inhibir los efectos mediados por la estructura beta-cruzada comprendiendo el proporcionar una cantidad efectiva de una proteína que comprende un dominio "finger" para bloquear los lugares de unión de la estructura beta-cruzada para tPA.
La invención da a conocer la utilización de un compuesto capaz de unión a una estructura beta-cruzada para la eliminación de estructuras beta-cruzadas. Dicho compuesto consiste en moléculas que se unen a estructuras beta-cruzadas preferentemente una proteína tal como se define en la reivindicación 1.
Preferentemente dicho compuesto comprende un dominio "finger" o un dominio "finger" que contiene moléculas. De modo más preferente, dicho dominio "finger" se deriva de la fibronectina, FXII o HGFa. Es evidente que la invención comprende también anticuerpos que se unen a estructuras beta-cruzadas. En otra realización preferente dicha proteína es un anticuerpo.
Tal como se utiliza en esta descripción "apéndice" o "finger" comprende una secuencia que cumple los criterios representados en la figura 14. La secuencia comprende aproximadamente 50 aminoácidos que contienen 4 residuos de cisteína con diferentes separaciones. Se utilizan los dominios "finger" de FXII, HGFa o fibronectina.
El alcance de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
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Parte experimental Reactivos
Albúmina de suero bovino (BSA) fracción V pH 7.0 y D-glucosa-6-fosfato di-sódico (g6p), D, L-gliceraldehido, y lisocima de yema de huevo de pollo procedentes de ICN (Aurora, Ohio, USA). Activador de plasminogeno de tipo tejido antirrecombinante de conejo (tPA) 385R y tPA 374B antirrecombinante de ratón fueron adquiridos de American Diagnostica (Veenendaal, Holanda). La anti-laminina (L9393) procedía de Sigma. Las inmunoglobinas anticonejo de cerdo/HRP (SWARPO) y las inmunoglobinas antiratón de conejo/HRP (RAMPO) eran de la firma DAKO Diagnostics B.V. (Holanda). Alteplase (activador de plasminógeno de tipo de tejido recombinante, tPA) fue conseguido de la firma Boehringer-Ingelheim (Alemania). Reteplase (Rapilysin) es un tPA mutante recombinante que contiene solamente kringle2 y el dominio catalítico (K2P-tPA) fue obtenido de Roche, Hertfordshire, UK, y la carboxipeptidasa de páncreas porcino B(CpB) era de Roche, Mannheim, Alemania. El inhibidor de carboxipeptidasa (CPI) era de Calbiochem (La Jolla, CA, USA). El tween 20 fue adquirido a Merck-Schuchardt (Hohenbrunn, Alemania). El rojo Congo fue obtenido de Aldrich (Milwaukee, WI, USA). La Tioflavina T y hemoglobina humana liofilizada (Hb) eran de Sigma (St. Louis, MO, USA). El fibrinógeno humano liofilizado era de Kordia (Leiden, Holanda). El sustrato de plasmina cromogénico fue adquirido a Chromogenix (Milan, Italia). Los oligonucleótidos fueron adquiridos a Sigma-Genosys (U.K.). Los capilares de vidrio al boro (0.5 mm \diameter) eran de Mueller (Berlín, Alemania).
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Péptidos sintéticos
El péptido A\beta (1-40), conteniendo aminoácidos tal como se encuentra presente en el péptido de Alzheimer humano (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV), péptidos de fibrina 85 (o FP13) (KRLEVDIDI
KIRS), 86 (o FP12) (KRLEVDIDIKIR) y 87 (o FP10) (KRLEVDIDIK), derivados de la secuencia de fibrinógeno humano y el polipéptido amiloide de isletas (LAPP), péptido o derivados (fl-hIAPP:KCNTATCATQRLANFLVHSSNN
FGAILSSTNVGSNTY, \DeltahIAPP (SNNFGAILSS), \DeltamIAPP (SNNLGPVLPP) fueron obtenidos de Pepscan, Inc. (Holanda) o de la instalación de síntesis de péptidos del Instituto del Cáncer de Holanda (NCI, Ámsterdam, Holanda). Los péptidos fueron disueltos en solución salina con tampón fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1 mg ml^{-1} y se almacenaron durante tres semanas a temperatura ambiente (RT) para permitir la formación de fibrilas. Durante este periodo la suspensión fue sometida a torbellino dos veces semanalmente. Después de tres semanas la suspensión fue almacenada a 4ºC. A\beta (1-40) liofilizada de NCI permitió formar beta-cruzada en la misma en la misma forma. La formación de estructura beta-cruzada fue seguida a lo largo del tiempo por el examen de unión de rojo Congo y birrefringencia verde bajo luz polarizada.
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Unión de rojo Congo y fluorescencia de Tioflavina T de un coágulo de sangre
Para las mediciones de fluorescencia de Tioflavina T se incubó 1 mg ml^{-1} de fibrinógeno a 37ºC con 2 U ml^{-1} de factor IIa en 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM CaCl_{2}, 50 \muM Tioflavina T. La fluorescencia de fondo de un coágulo fue registrada en ausencia de Tioflavina T y la fluorescencia de la Tioflavina T de fondo fue medida en ausencia de factor IIa. La fluorescencia fue medida en un espectrómetro de fluorescencia Hitachi F-4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japón), utilizando cubetas Sarstedt REF67.754. Ajustes del aparato: excitación a 435 nm (ranura 10 nm), emisión a 485 nm (ranura 10 nm), voltaje PMT 950 V, tiempo de medición 10'', retardo 0''. Para la detección de la unión de rojo Congo se formó un coágulo de fibrina a temperatura ambiente tal como se ha descrito en lo anterior (se omitió Tioflavina T en el tampón). El coágulo fue incubado con solución de rojo Congo y lavado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma Diagnostics, MO, USA). El coágulo fue analizado bajo luz polarizada.
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Preparación inicial de albúmina glicada, hemoglobina (Hb)y lisozima
Para la preparación de producto final de glicado avanzado se incubó albúmina de suero bovino modificada (albúmina-g6p), se incubaron 100 mg ml^{-1} de albúmina con PBS conteniendo 1 M de g6p y 0.05% m/v NaN_{3}, a 37ºC a oscuras. Una solución de albúmina fue glicada durante dos semanas, se efectuó el glicado de un lote distinto de albúmina durante cuatro semanas. El glicado fue prolongado hasta 23 semanas con parte del último lote. Se incubó Hb humano a 5 mg ml^{-1} durante 10 semanas a 37ºC con PBS conteniendo 1 M de g6p y 0.5% m/v de NaN_{3}. Además una solución de Hb de 50 mg ml^{-1} fue incubada durante ocho semanas con el mismo tampón. Para la preparación de albúmina modificada por gliceraldeido (albúmina-gliceraldeido) y lisozima de yema de huevo de pollo (lisozima-gliceraldeido), se incubaron soluciones de proteína esterilizadas por filtrado de 15 mg ml^{-1} durante dos semanas con PBS conteniendo 10 mM de gliceraldeido. En los controles se omitió en las soluciones g6p o gliceraldeido. Después de las incubaciones se dializaron a fondo soluciones de albúmina y de lisozima contra agua destilada y a continuación se almacenaron a -20ºC. Se determinaron las concentraciones de proteína con reactivo de ensayo de proteína avanzado ADV01 (Cytoskeleton, Denver, CO, USA). El glicado fue confirmado por medición de señales fluorescentes intrínsecas de productos finales de glicado avanzado; longitud de onda de excitación 380 nm, longitud de onda de emisión 435 nm.
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Otros experimentos que involucran glicado
Para la preparación de albúmina-AGE, se incubaron a 37ºC en la oscuridad 100 mg ml^{-1} de albúmina de suero bovino (fracción V, catálogo #A-7906, fraccionamiento inicial por choque de calor, pureza \geq98% (electroforesis), resto mayoría de globulinas, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, cloruro sódico 140 mM, cloruro potásico 2,7 mM, fosfato ácido disódico 10 mM, fosfato de ácido de potasio 1,8 mM, pH 7,3), sal disódica de 1 M D-glucosa-6-fosfato hidrato (anhidro) (ICN, Aurora, Ohio, USA) y 0,05% (m/v) NaN_{3}. La albúmina bovina tiene 83 lugares de glicado potenciales (59 residuos de lisina y 23 residuos de arginina, extremo N). La albúmina fue glicada durante dos semanas (albúmina-AGE:2), cuatro semanas (albúmina-AGE:4) o 23 semanas (albúmina-AGE:23). En los controles se omitió g6p. Después de incubación, las soluciones fueron dializadas a fondo contra agua destilada y a continuación fueron almacenadas a 4ºC. Se determinaron las concentraciones de proteínas con reactivo de ensayo de proteínas avanzado ADV01 (Cytoskeleton, CO, USA). De manera alternativa, se incubó albúmina durante 86 semanas con 1 M g6p, 250 mM DL-gliceraldehido (ICN, Aurora, Ohio, USA)/100 mM NaCNBH_{3}, 1M \beta-D-(-)-fructosa (ICN, Aurora, Ohio, USA), 1 M D(+)-glucosa (BDH, Poole, Inglaterra), 500 mM de ácido glioxílico monohidratado (ICN, Aurora, Ohio, USA)/100 mM NaCNBH_{3}, y correspondientes controles tampón PBS y PBS/NaCNBH_{3}. El glicado fue confirmado (i.) por observación de tinción de color marrón intenso, (ii.) por la presencia de multímeros de geles de SDS-poliacrilamida, (iii) por ensayo de unión de anticuerpos específicos de AGE moab anti-albúmina-g6p 4B5^{46} y poab anti-fibronectina-g6p (Ph. De Groot/I. Bobbink, UMC Utrecht; datos no publicados), y (iv.) midiendo señales fluorescentes intrínsecas de AGE (longitud de onda de excitación 380 nm, longitud de onda de emisión 445 nm). Las señales autofluorescentes de controles de albúmina fueron menos de 4% de las señales medidas para albúmina AGE y se utilizaron para correcciones del fondo.
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Aislamiento de Hb de eritrocitos humanos
Se aisló Hb humana de eritrocitos en sangre anticoagulada con EDTA de 3 individuos sanos y de 16 pacientes diabéticos. 100 \mul de sangre completa fueron diluidos en 5 ml de sal fisiológica (154 mM NaCl), las células fueron precipitadas por centrifugación suave y resuspendidas en 5 ml de sal fisiológica. Después de 16 horas de incubación a temperatura ambiente, las células fueron precipitadas nuevamente por centrifugación. Las células en pastillas fueron sometidas a lisis añadiendo 2 ml de ácido bórico 0,1 M, pH 6,5 y a continuación los residuos celulares fueron precipitados por centrifugación. El sobrenadante fue recogido y almacenado a -20ºC.
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Determinación de concentraciones de glicoHb
Se determinaron concentraciones de Hb glicado, designadas también glicohemoglobina o Hb_{A1c}, en sangre tratada con EDTA de donantes humanos sanos o pacientes diabéticos, utilizando un inmunoensayo de inhibición turbidimétrica con sangre completa hemolizada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se midieron desviaciones estándar de 2,3% de las concentraciones medidas de Hb_{Alc}.
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Unión de rojo Congo a albúmina glicada
La unión de rojo Congo a albúmina AGE glicada durante 86 semanas con carbohidratos de glucosa, fructosa y glucosa-6-fosfato o con derivados de carbohidratos gliceraldehido y ácido glioxílico, fue comprobada utilizando muestras secadas al aire. Con este objetivo, se aplicaron 5 \mug de albúmina a un portaobjetos de vidrio y se secó al aire. Las muestras fueron incubadas con rojo Congo y a continuación fueron lavadas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA). Se tomaron fotografías con un microscopio de fluorescencia Leica DMIRBE (Rijswijk, Holanda) utilizando longitudes de onda de excitación y emisión respectivamente de 596 nm y 620 nm.
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Preparaciones de endostatina
Se purificó endostatina a partir de Escherichia coli esencialmente tal como se ha descrito^{47}. En resumen, bacterias BI21.DE3 expresando endostatina fueron sometidas a lisis en un tampón que contenía 8 M urea, 10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM imidazol y 10 mM \beta-mercapto-etanol. Después de purificación sobre Ni^{2+}-agarosa, la muestra de proteína fue dializada a fondo contra H_{2}O. Durante la diálisis, la endostatina precipita en forma de sólido blanco fino. Partes alicuotas de este material se almacenaron a -80ºC para uso posterior, o se liofilizaron antes del almacenamiento. La endostatina soluble producida en la cepa de levadura Pichia pastoris fue facilitada amablemente por el Dr. Kim Lee Sim (EntreMEd, Inc., Rockville, MA). La endostatina agregada fue preparada a partir de endostatina soluble del modo que se indica a continuación. Se dializó durante una noche endostatina soluble de levadura en urea 8 M y, a continuación, tres veces contra H_{2}O. Igual que la endostatina bacteriana, la endostatina de levadura precipita en forma de sólido fino de color blanco.
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Teñido con rojo Congo
Se resuspendió endostatina bacteriana liofilizada en 0,1% de ácido fórmico (FA), o en dimetil-sulfoxido y se introdujo en un capilar de vidrio. El disolvente se dejó evaporar y el material de endostatina resultante fue teñido con rojo Congo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA).
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Medición del dicroismo circular
Se midieron espectros de dicroismo circular UV (CD) de soluciones de péptido y de proteína (100 \mug ml^{-1} en H_{2}O) en un espectropolarímetro JASCO J-810 CD (Tokyo, Japón). Se registran espectros de absorción promedio de 5 ó 10 mediciones individuales a partir de 190-240 nm o de 190-250 nm, para los péptidos de fibrina 85, 86, 87 o para albúmina, albúmina glicada y A\beta humana (16-22), respectivamente. El espectro CD de A\beta(16-22) fue medido como control positivo. El A\beta(16-22) adopta fácilmente conformación de fibrila amiloide con estructura beta-cruzada cuando se incuba en H_{2}O^{45}. Para la albúmina y A\beta(16-22) se estimó el porcentaje relativo de los elementos de la estructura secundaria presentes utilizando software k2d^{48}.
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Difracción de fibras por rayos X
La endostatina agregada fue solubilizada en 0,1% FA, los péptidos de fibrina liofilizados fueron disueltos en H_{2}O y se dializó a fondo albúmina glicada contra agua. Las muestras fueron introducidas en un capilar de vidrio. El disolvente se dejó evaporar durante un periodo de varios días. Los capilares conteniendo las muestras secas fueron colocados en un difractómetro Nonius kappaCCD (Bruker-Nonius, Delft, Holanda). La dispersión fue medida utilizando radiación con tubo estanco MoK\alpha con un monocromador de grafito sobre el detector de áreas CCD durante 16 horas. La dispersión del aire y del capilar de cristal fueron restados utilizando software propio (VIEW/EVAL, Dept. of Crystal and Structural Chemistry, Utrecht University, Holanda).
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Microscopía electrónica de transmisión
Se aplicaron muestras de endostatina, hemoglobina y albúmina a rejillas de muestra de malla 400 cubiertas con películas de colodión con recubrimiento de carbón. Después de 5 minutos las gotas fueron retiradas con papel de filtro y los preparados fueron teñidos con 1% de metilcelulosa y 1% de uranil acetato. Después de lavado en H_{2}O, las muestras fueron deshidratadas en una serie graduada de EtOH y hexanoetildisilazano. Se registraron imágenes del microscopio electrónico de transmisión (TEM) a 60 kV en un microscopio electrónico JEM-1200EX (JEOL, Japón).
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Ensayo inmunoencimático: unión de tPA a albúmina glicada, Hb y A\beta (1-40)
La unión de tPa a albúmina-g6p (incubaciones de cuatro semanas y 23 semanas), albúmina-gliceraldehido, albúmina de control, Hb-g6p humano (incubación, diez semanas), control Hb, o a A\beta (1-40) fue comprobado utilizando un ensayo inmunoenzimático ELISA. La albúmina-g6p y albúmina de control (2,5 \mug ml^{-1} en tampón de recubrimiento, 50 mM Na_{2}CO_{3}/NaHCO_{3} pH 9,6, 0,02% m/v NaN_{3}, 50 \mul/pocillo) se inmovilizaron durante 1 hora a temperatura ambiente en placas de inmovilizador de proteínas de 96 pocillos (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). A\beta (1-40) (10 \mug ml^{-1} en tampón de recubrimiento) se inmovilizó durante 75 minutos a temperatura ambiente en una placa de inmovilizador de péptidos de 96 pocillos (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Algunos pocillos de control fueron incubados con tampón de recubrimiento solamente. Después de una etapa de lavado con 200 \mul de PBS/0,1% v/v Tween20, las placas fueron bloqueadas con 300 \mul de PBS/1% v/v Tween20, durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Todas las incubaciones subsiguientes fueron llevadas a cabo en PBS/0,1%v/v Tween20 durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación, con volúmenes de 50 \mul por pocillo. Después de cada incubación los pocillos fueron lavados cinco veces con 200 \mul de PBS/0,1% v/v Tween20. Se añadieron cantidades crecientes de f.l. tPA o K2-P tPA en triplicado a los pocillos con recubrimiento y a los pocillos de control. Se añadieron anticuerpo 385R y, a continuación, SWARPO o anticuerpo 374B y, a continuación, RAMPO a los pocillos con una concentración de 1 \mugml^{-1}. El anticuerpo unido marcado con peroxidasa fue visualizado utilizando 100 \mul de una solución conteniendo 8 mg de orto-fenilen-diamina y 0,0175% v/v de H_{2}O_{2} en 20 ml de ácido cítrico 50 mM/100 mM Na_{2}HPO_{4} pH 5,0. Se interrumpió la tinción después de añadir una solución de 50 \mul de 2-M H_{2}SO_{4}. La absorbancia fue leída a 490 nm sobre un lector cinético de microplacas V_{max} (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Se llevaron a cabo experimentos de competición con 20 o 40 nM de tPA, respectivamente con albúmina-g6p o A\beta (1-40) y con cantidades crecientes de rojo Congo en PBS/0,08% v/v Tween20/2% v/v EtOH.
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ELISA: unión de tPA a albúmina -AGE
La unión del marcador tPA con estructura beta-cruzada a la albúmina-AGE fue comprobada utilizando un dispositivo ELISA. Los inventores han demostrado que el tPA se une a péptidos prototipo amiloide humano A\beta (1-40) y IAPP^{49} humano (esta solicitud). Por lo tanto, los inventores utilizaron unión de tPA a estos dos péptidos como control positivo. Las muestras y los controles glicados 86 semanas fueron aplicados como recubrimiento a placas microlon Greiner (catálogo # 655092, Greiner, Frickenhausen, Alemania). Los pocillos fueron bloqueados con Superblock (Pierce, Rockford, IL, USA). Todas las incubaciones subsiguientes fueron llevadas a cabo en PBS/0.1% (v/v) Tween20 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación con volúmenes de 50 \mul por pocillo. Después de incubación los pocillos fueron lavados cinco veces con 300 \mul PBS/0.1% (v/v) Tween20. Se añadieron concentraciones crecientes de tPA en triplicado a pocillos con recubrimiento así como para controlar los pocillos. Durante las incubaciones de tPA de muestras incubadas de 86 semanas se añadió, como mínimo, un exceso molar de 123.000 veces de ácido \varepsilon-amino caproico (\varepsilonACA, 10 mM) a las soluciones. El \varepsilonACA es un análogo de lisina y es utilizado para evitar la unión potencial de tPA a la albúmina a través de su dominio kringle2^{50}. El anticuerpo monoclonal 374b (American Diagnostica, Instrumentation laboratory, Breda, Holanda) y a continuación RAMPO (Dako diagnostics, Glostrup, Dinamarca) fueron añadidos a los pocillos a una concentración de 0.3 \mug ml^{-1}. El anticuerpo unido marcado con peroxidasa fue visualizado utilizando 100 \mul de una solución que contenía 8 mg de ortofenilendiamina en 20 ml de ácido cítrico 50 mM/Na_{2}HPO_{4} 100 mM pH 5.0 con 0.0175% (v/v) H_{2}O_{2}. El teñido fue interrumpido después de añadir 50 \mul de una solución 2 M de H_{2}SO_{4}. Se leyó la absorbancia a 490 nm sobre un lector de microplaca cinética V_{max} (Molecular Devices, CA, USA). Las señales de fondo de los pocillos de control sin recubrimiento fueron restadas de los pocillos correspondientes con recubrimiento.
Inicialmente, fluorescencia de Tioflavina T de albúmina glicada y lisocima y tPA. Para mediciones de fluorescencia se incubaron 500 nM de albúmina-g6p, albúmina-gliceraldeido, albúmina de control, lisocima-gliceraldeido o lisocima de control con cantidades crecientes de Tioflavina T en 50 nM de glicina NaOH, pH 9. Para lecturas en blanco se preparó una dilución idéntica de Tioflavina T sin proteína o se omitió la Tioflavina T en las soluciones de proteína. Las soluciones fueron preparadas por triplicado.
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Fluorescencia de Tioflavina T
En otros experimentos se llevaron a cabo mediciones de fluorescencia, albúmina-g6p:2, albúmina-g6p:4, albúmina-g6p:23 y controles en 50 mM glicina-NaOH, pH9 fueron incubados con cantidades crecientes de ThT (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Alemania), un marcador para estructura beta-cruzada amiloide^{51}. La concentración de albúmina-AGE:4 fue de 175 nM, otras concentraciones de proteína fueron 500 nM. Para mediciones de fluorescencia con muestras glicadas de 86 semanas se incubaron 140 nM de proteína con una concentración fija de 20 \muM ThT. Se midió la fluorescencia en triplicado en un espectrofotómetro Hitachi F-4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japón), después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 435 nm (ranura 10 nm) y 485 nm (ranura 10 nm) respectivamente. Las señales de fondo del tampón y la solución de proteína sin ThT fueron restadas de las mediciones correspondientes con solución de proteína incubada con ThT.
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Fluorescencia: Unión competitiva de Tioflavina T y tPA a albúmina-g6p
Una solución de 430 nM albúmina-g6p y 19 \muM de Tioflavina T fue incubada con cantidades crecientes de tPA durante 1 hora a temperatura ambiente. Para lecturas en blanco se omitió albúmina-g6p. Se prepararon muestras cuatro veces en 50 nM glicina-NaOH pH 9. Se llevaron a cabo mediciones de emisión tal como se ha descrito anteriormente.
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Absorbancia: Unión competitiva de Tioflavina T y tPA a albúmina-g6p
Se incubaron Albúmina-g6p (500 nM) y Tioflavina T (10 \muM) con cantidades crecientes de tPA en 50 mM glicina-NaOH pH 9 durante una hora a temperatura ambiente. Se llevaron a cabo mediciones de absorbancia al máximo de absorbancia albúmina-g6p Tioflavina T a 420 nm. Las muestras fueron preparadas por cuadruplicado. Para lecturas en blanco se omitió albúmina-g6p en las soluciones. La absorbancia fue leída en una cubeta de cuarzo en un espectrofotómetro Pharmacia Biotech Ultrospec 3000 UV/visible (Cambridge, Inglaterra).
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Ensayo de activación de plasminógeno
Se incubó plasminógeno (200 \mug ml^{-1}) con tPA (200 pM) en presencia o ausencia de un cofactor (5 \muM de endostatina, A\beta (1-40) o uno de los péptidos derivados de fibrina 85, 86 y 87). A los intervalos de tiempo indicados se tomaron muestras y la reacción fue interrumpida en un tampón que contenía 5 mM EDTA y 150 mM \varepsilonACA. Después de recoger las muestras se añadió un sustrato de plasmina cromogénica S-2251 y se determinó la actividad de la plasmina cinéticamente en un espectrofotómetro a 37ºC.
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Cultivo celular N1E-115 y diferenciación
Se cultivaron de forma rutinaria células de neuroblastoma de ratón N1E-115 en DMEM que contenía 5% FCS suplementado con antibióticos. Las células fueron diferenciadas en neuronas post mitóticas^{52}. Las células fueron expuestas a A\beta (50 \mug ml^{-1}) durante 24 horas en presencia o ausencia de 20 \mug ml^{-1} de plasminógeno en presencia o ausencia de 50 \mug ml^{-1} CpB. Las células fueron fotografiadas, contadas y sometidas a lisis por la añadidura de 4x de tampón muestra (250 mM Tris pH 6.8,8% SDS, 10% glicerol, 100 mM DTT, 0.01% w/v azul de bromofenol) al medio. El lisado que tiene tanto adherente como flotante (presumiblemente células en proceso de muerte y/o muertas) así como el medio de cultivo fueron analizados en cuanto a presencia de plasminógeno y plasmina así como de laminina mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos específicos contra plasminógeno (MoAb 3642, American Diagnostics), laminina (PoAb L9393, Sigma).
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Unión de factor XII humano a péptidos, amiloides y proteínas que contienen el pliegue de estructura beta-cruzada
Los inventores probaron la unión de FXII humano (Calbiochem, La Jolla, CA, USA, catálogo #233490) a (poli)péptidos amiloides. Péptidos amiloide prototipo, amiloide humano-beta(1-40) (hA\beta(1-40)) y fragmento \alpha_{147-159} FP 13, de fibrina humana y albúmina bovina glicada con glucosa-6-fosfato (producto final de glicado avanzado-albúmina (AGE)) y hemoglobina humana glicada con glucosa-6-fosfato (Hb-AGE), todos los cuales contienen estructura beta-cruzada así como controles negativos de polipéptido amiloide de isleta \Delta de ratón (\DeltamlAPP), albúmina de control y Hb de control, careciendo los tres de estructura amiloide específica, fueron aplicados como recubrimiento a placas ELISA y superpuestos con una serie de concentración de factor humano XII. Se detectó la unión de FXII utilizando un anticuerpo anti-FXII policlonal de conejo (Calbiochem, La Jolla, CA, USA, catálogo #233504) y IgG anti-conejo de cerdo marcado con peroxidasa. Los pocillos se recubrieron por triplicado. El tampón de unión de FXII consistía en 10 mM HEPES pH 7.3, 137 mM NaCl, 11 mM D-glucosa, 4 mM KCl, 1 mg ml^{-1} albúmina, 50 \muM ZnCl_{2}, 0.02% (m/v) NaN_{3} y 10 mM de ácido \varepsilon-amino caproico (\varepsilonACA). Se añadió \varepsilonACA análogo de lisina para evitar la unión putativa de FXII a la estructura beta-cruzada con intermedio del dominio kringle de FXII. Además se comprobó la unión de FXII a hA\beta (1-40) y al fragmento h\DeltaIAPP de amilina humana amiloide prototipo, utilizando análisis de transferencia de zonas ("dot blot"). Se aplicaron 10 \mug de los péptidos que contienen estructura beta-cruzada así como el péptido de control negativo m\DeltaIAPP y solución salina con tampón fosfato (PBS) por duplicado sobre nitrocelulosa activada por metanol. Se procedió a continuación a incubación de zonas con tampón 2 nM FXII en FXII o con tampón de FXII solo, anticuerpo anti-FXII y SWARPO. La unión de FXII fue visualizada por quimioluminiscencia en la incubación con un reactivo de luminol amplificado (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA). Para probar si FXII y tPA que son conocidas por su capacidad en unirse a polipéptidos que contienen el plegado de estructura beta-cruzada^{49}, se unen a lugares solapados de unión sobre amiloides (poli)péptidos, los inventores llevaron a cabo un ensayo competitivo ELISA. Se incubaron hA\beta (1-40)o amiloide albúmina-AGE con 2.5 nM o 15 nM FXII en tampón de unión en presencia de una serie de concentración de activador de plasminógeno de tipo tejido recombinante humano (Actilyse®, tPA de longitud completa) o Reteplase® (K2P-Tpa). El Reteplase es una forma truncada de tPA que consiste en el segundo dominio kringle y el dominio proteasa. La concentración de f.I. tPA-y K2P-tPA era como máximo 135 veces el k_{D} para tPA de unión hA\beta (1-40) (50 nM) o 150 veces el k_{D} para tPA de unión a albúmina-AGE (1 nM).
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Procedimiento de clonado
El clonado del dominio "finger" aminoterminal (F) de tPA humano, residuos Ser1 - Ser50, precedido del propéptido (residuos Met-35 - Arg-1) y un lugar de restricción BgIII fue llevado a cabo utilizando PCR y técnicas de ADN recombinante estándar. En resumen, la zona propéptido-"finger" fue amplificada por PCR utilizando 1 ng de plasmina Zp17^{53}, conteniendo el cADN que codifica tPA como molde. Los oligonucleótidos utilizados fueron 5'AAAAGTC
GACAGCCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGA (1) y 3'AAAAGCGGCCGCCCACTTTTGACAGGCACTGAG (2) comprendiendo un lugar de restricción Sa/l -o Notl restrictivamente (subrayado). El producto PCR fue clonado en un vector de expresión tratado con Sa/l -o Notl, pMT 2-GST^{54}. Como resultados se genera un constructo que contiene un lugar de restricción SaII, la secuencia de codificación para el dominio "finger" de tPA, un lugar de restricción Notl y Kpnl, un lugar de fraccionamiento de trombina (TCS), un marcador de glutation-S-transferasa (GST) y un lugar de restricción EcoRI. La secuencia apropiada del constructo fue confirmada por análisis de secuencias. De manera similar se preparó un constructo consistente en los dominios tPAF-EGF. A continuación los constructos fueron ligados SaII-EcoRI en pGEM3Zf (-) (Promega, Madison, WI, USA). El propéptido HindIII - SaII - tPA BgIII - F- NotI-KpnI - TCS - GST- EcoRI constructo fue utilizado como casete de clonado para la preparación de constructos que contenían tPA K1, F-EGF-K1, EGF, así como activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos F y F-EGF, factor humano XII F y F-EGF y fibronectina humana F4, F5, F4-5 y F10-12. A continuación, los constructos fueron ligados en el vector de expresión pcDNA3 HindIII-EcoRI (Invitrogen, Breda, Holanda). Además, el marcador GST solo fue clonado en pcDNA3 precedido por el propéptido tPA. Los cebadores utilizados para los constructos fueron:
100
101
Expresión transitoria de tPA-F-GST en células 293T
Inicialmente se cultivaron células 293T en medio RPMI1640 (Invitrogen, Escocia, U.K.) suplementado con 5% v/v de suero fetal bovino, penicilina, estreptomicina y guanidina hasta 15% de confluencia. Las células fueron transfectadas transitoriamente utilizando Fugene-6 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Roche, IN, USA). pMT2-tPA-F-GST conteniendo el fragmento de tPA o un plásmido de control, pMT2-RPTP\mu-GST conteniendo el dominio extracelular de la tirosina fosfatasa similar a receptor \mu(RPTP\mu)^{54} y se recogió el medio después de 48 horas de la transfección. La expresión de tPA-F-GST y RPTP\mu-GST en medio 293T se verificó por inmunoteñido. Las muestras recogidas fueron pasadas sobre geles de SDS-PAA después de la adición del tampón muestra 2x. Los geles fueron aplicados sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas en 1% de leche (Nutricia) e incubadas con anticuerpo 2F3^{54} monoclonal primario anti-GST y IgG (RAMPO) de conejo anti-ratón conjugado HRP secundario. Las zonas fueron desarrolladas utilizando reactivo de quimioluminiscencia Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, MA, USA).
Expresión estable de constructos de "Finger" en células BHK
Se sembraron células de riñón de hamster "baby" en medio DMEM/NUT mix F-12(HAM) (Invitrogen, U.K.) suplementado con 5% v/v de suero fetal de vaca (FSC), penicilina, estreptomicina y guanidina hasta 1% de confluencia. Las células fueron transfectadas de forma estable utilizando el método de precipitación Ca_{3}(PO_{4})_{2}-DNA. Después de 24 horas el medio fue suplementado con 1 mg ml^{-1} de geneticina G-418 sulfato (Gibco, U.K.). Se renovó el medio con G-418 varias veces durante 10 días para eliminar las células muertas. Después de este periodo de tiempo se transfirieron colonias individuales estables a nuevos frascos de cultivo y las células fueron cultivadas hasta confluencia. La expresión de constructos fue verificada a continuación por inmunoteñido. Las muestras recogidas fueron pasadas a geles SDS-PAA después de la adición de un tampón muestra 2x. Se aplicaron geles sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas en leche al 5% (Nutricia) con 1,5% m/v BSA y se incubaron con anticuerpo primario monoclonal anti-GST (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Ca, U.S.A., catálogo # Z-5), e IgG de conejo secundaria conjugada HRP (RAMPO). Las zonas fueron desarrolladas utilizando Reactivo de Quimioluminiscencia Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, MA, U.S.A.). Los clones estables fueron cultivados a continuación en presencia de 250 \mug ml^{-1} G-418. Para experimentos descendentes ("pull-down"), se utilizó medio acondicionado con 5% de FCS de clones estables que producen constructos de interés. Para efectos de purificación, se transfirieron células de un clon estable de tPA F-EGF-GST a frascos de cultivo de capa triple y se cultivaron en medio con 0,5% v/v Ultroser G (ITK Diagnostics, Uithoorn, Holanda). El medio fue renovado cada tres o cuatro días. Se aisló tPA F-EGF-GST del medio sobre una columna de Glutatión Sefarosa 4B (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) y se eluyó con 100 mM glutatión reducido (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La pureza del constructo fue comprobada con SDS-PAGE seguido de teñido con azul Coomassie o transferencia Western. De estos análisis es evidente que una parte de GST se encuentra presente en la preparación. Se dializó tPA F-EGF-GST purificado contra PBS y se almacenó a -20ºC.
Purificación de tPA-F-GST y RPTP\mu-GST marcados con GST
El medio fue concentrado veinte veces utilizando dispositivos centrífugadores Nanosep 10K Q (Pall Gelman Laboratory, MI, U.S.A.) y se incubó con glutatión acoplado a Sefarosa 4B, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Los constructos unidos fueron lavados con PBS y eluidos con 10 mM de glutatión en 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Los constructos fueron almacenados a -20ºC antes de su utilización.
Ensayo descendente ("pull-down") de amiloide
Medio acondicionado de células BHK expresando tPA F, F-EGF, EGF, K1, F-EGF-K1, FXII F, HGFa F, Fn F4, Fn F5, Fn F4-5 y GST con marcado GST fueron utilizadas para ensayos de unión de amiloide. En primer lugar, los constructos fueron ajustados aproximadamente a concentración igual utilizando transferencia Western. Se evalúa la unión cualitativa de los fragmentos recombinantes utilizando un ensayo "descendente" ("pull-down"). Con este objetivo, los fragmentos realizados de forma recombinante son incubados con A\beta o fibrilas IAPP. Dado que estos péptidos forman fibras insolubles, las proteínas no unidas pueden ser retiradas fácilmente de las fibras después de centrifugación. Las pastillas que contienen los fragmentos unidos son lavadas a continuación varias veces. Los fragmentos unidos son solubilizados en tampón muestra SDS y analizados por PAGE, así como proteínas no unidas en la fracción sobrenadante y material inicial. Los geles son analizados utilizando análisis de inmunoteñido con el anticuerpo Z-5 anti-GST.
ELISA de amiloide con tPA F-EGF-GST
A efectos de definir la afinidad de la proteína recombinante tPA F-EGF-GST los inventores llevaron a cabo ensayos ELISA con (poli)péptidos amiloides inmovilizados y control \DeltamlAPP no amiloide. Veinticinco \mug ml^{-1} de AB, FP 13, IAPP o \DeltamlAPP fueron inmovilizados sobre placas inmovilizadoras de péptido Exiqon. Una serie de concentración de tPA F-EGF-GST en presencia de \varepsilonACA en exceso, fue añadida a los pocillos y se ensayó la unión utilizando anticuerpo Z-5 anti-GST. Como control se utilizó GST (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A., catálogo # G-5663) a las mismas concentraciones.
Inmunohistoquímica: unión de tPA F-EGF a cerebro AD
Secciones de cerebro en parafina de un humano afectado de AD fueron un amable regalo del Prof. Slootweg (Departamento de Patología, UMC, Utrecht). Las secciones fueron desparafinizadas en una serie de xileno-etanol. Se bloquearon las peroxidasas endógenas con metanol/1,5% H_{2}O_{2} durante 15 minutos. Después de aclarar en H_{2}O, las secciones fueron incubadas con ácido fórmico no diluido durante 10 minutos, seguido de incubación en PBS durante 5 minutos. Las secciones fueron bloqueadas en 10% HPS en PBS durante 15 minutos. Las secciones fueron sometidas durante 2 horas a 7 nM de tPA F-EGF-GST o GST en PBS/0,3% BSA. Después de tres etapas de lavado con PBS, las secciones recibieron la superposición de 200 ng ml^{-1} de anticuerpo Z-5 anti-GST, durante 1 hora. Después de lavado, se aplicó Powervision (Immunologic, Duiven, Holanda, catálogo # DPVR-55AP)listo para utilizar de cabra anti-conejo y se incubó durante 1 hora. Después de lavado, las secciones fueron teñidas durante 10 minutos con 3,3'-diamino benzidina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, U.S.A., catálogo # D-5905), seguido de teñido con hematoxilina durante 10 segundos. Después de lavado con H2O, las secciones fueron incubadas con rojo Congo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma Diagnostics, St Louis, MO, U.S.A.). Las secciones fueron aclaradas en xileno y montadas sobre medio de montaje D.P.X. (Nustain, Nottingham, Reino Unido). Se llevó a cabo el análisis de las secciones en un microscopio de fluorescencia Leica DMIRBE (Rijswijk, Holanda). La fluorescencia de rojo Congo fue analizada utilizando una longitud de onda de excitación de 596 nm y una longitud de onda de emisión de
620 nm.
ELISA: unión de tPA-F-GST y RPTP\mu-GST a Ab(1-40) humano y albúmina glicada
La unión de tPA-F-GST y RPTP\mu-GST a amiloides fibrosos de A\beta (1-40) humana y albúmina-g6p con un ensayo ELISA. En resumen, se aplicaron como recubrimiento A\beta (1-40) humana, albúmina-g6p, o tampón solamente sobre un inmovilizador de péptido 1, o un inmovilizador de proteína 1, respectivamente. Los pocillos fueron incubados con los constructos marcados GST purificados o medio de control, y la unión fue detectada utilizando anticuerpo monoclonal primario anti-GST 2F3 y RAMPO. Los pocillos fueron también incubados con 500 nM de tPA en presencia de 10 mM de eACA. La unión de tPA es entonces independiente del lugar de unión de lisilo situado en el dominio kringle2. La unión de tPA fue medida utilizando anticuerpo primario 374B y RAMPO. Los experimentos fueron llevados a cabo en triplicado y se restaron las lecturas ciegas de los pocillos sin recubrimiento.
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Anticuerpos anti-AGE
Anticuerpos contra albúmina de suero bovino glicada con glucosa-6-fosfato fueron elicitados en conejos utilizando esquemas de inmunización estándar. Anti-AGE 1 fue obtenido después de inmunización con albúmina-AGE glicada dos semanas (Prof. Dr. Ph. G. de Groot/Dr. I. Bobbink, datos no publicados). El anticuerpo fue purificado a partir de suero utilizando una columna de proteína G. Se desarrollo anti-AGE 2 por Davids Biotechnologie (Regensburg, Alemania). Después de inmunización con albúmina-AGE:23, los anticuerpos fueron purificados por afinidad sobre A\beta(1-40) humana conjugada a perlas activadas EMD-Epoxi (Merck, Darmstadt, Alemania). Anticuerpo policlonal anti-AGE de ratón fue obtenido después de inmunización con albúmina-AGE:23 y A\beta (1-40) humana, en una proporción molar 9:1. El suero policlonal fue obtenido utilizando procesos de inmunización estándar, que fueron llevados a cabo por Academic Biomedical Cluster Hybridoma Facility (Universidad de Utrecht, Holanda). A continuación se generaron anticuerpos monoclonales utilizando procesos estándar.
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Ensayo ELISA: Unión de anticuerpos contra péptidos amiloide o proteína glicada a proteína-AGE y fibrilas amiloides
Para el ensayo ELISA, se inmovilizaron compuestos amiloides sobre péptido Exiqon o inmovilizadores de proteínas (Vedbaek, Dinamarca), tal como se ha descrito anteriormente. Anticuerpos anti-AGE y anti-A\beta(1-42) H-43 disponibles comercialmente (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.) fueron diluidos en PBS con 0,1% v/v Tween20. Vitronectina de conejo anti-humana K9234 fue un amable regalo del Dr. H. de Boer (UMC Utrecht), y fue utilizada como control negativo. Para análisis ELISA con anti-albúmina-AGE/A\beta policlonal de ratón se utilizó suero de control con anticuerpo elicitado contra una proteína no relacionada. La unión de anti-albúmina-AGE/A\beta policlonal de ratón fue llevada a cabo utilizando una serie de dilución de suero en PBS/0,1% Tween20. Para ensayos de unión competitiva con IAPP, se preincubó anti-AGE 1 con concentraciones variables de IAPP. Las fibrilas de IAPP fueron precipitadas por centrifugación y el sobrenadante fue aplicado por triplicado a pocillos de una placa ELISA con recubrimiento de A\beta. Se llevaron a cabo ensayos competitivos de unión con serina proteasa tPA ligando estructura beta-cruzada multiligando de forma ligeramente distinta. Se aplicaron como superposición A\beta e IAPP con una concentración de anti-AGE 1 o anti-A\beta(1-42) H-43 relacionada con el kD, junto con una serie de concentración de tPA. Un exceso molar de 10^{7}-10^{4} veces de análogo de lisina \varepsilonACA (10 mM) se encontraba presente en el tampón de unión a efectos de evitar la unión de tPA a los residuos de lisina de A\beta e IAPP, que sería independiente de la presencia de estructuras amiloides.
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Ensayo descendente ("pull-down") con péptidos amiloides y anticuerpo de conejo anti-AGE 1
Se incubó anti-AGE 1 con agregados amiloides de A\beta(16-22), A\beta(1-40) e IAPP. Después de centrifugación, las pastillas fueron lavadas tres veces con PBS/0,1% Tween20, disueltas en tampón de muestra no reductor (1,5% (m/v) de dodecil sulfato sódico, 5% (v/v) de glicerol, 0,01% (m/v) de azul de bromofenol, 30 mM Tris-HCl pH 6,8). El sobrenadante después de formación de pastillas de las fibrilas de amiloide fue diluido 1:1 con tampón muestra 2x. Las muestras fueron aplicadas a un gel de poliacrilamida y después de transferencia Western, se detectó anti-AGE 1 con SWARPO.
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Análisis inmunohistoquímico de la unión de anti-AGE2 a una placa amiloide en una sección de cerebro humano infectado por AD
Anti-AGE2 de conejo, purificado por afinidad sobre columna A\beta, fue utilizado para ensayar características de unión hacia placas amiloides en secciones de cerebro de un humano afectado de AD. El proceso fue llevado a cabo esencialmente tal como se ha descrito en lo anterior. Para evitar la eventual unión de 11 \mug ml^{-1} anti-AGE2 a aductos de proteína-AGE o a albúmina humana en la sección del cerebro, se añadieron al tampón de unión 300 nM de Gly-Lys dipéptido glicado con g6p, junto con 0,3% m/v de BSA. Después del teñido inmunohistoquímico, la sección fue teñida con rojo Congo.
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ELISA Sándwich para detección de albúmina-AGE amiloide
Para la detección de una estructura beta-cruzada amiloide en soluciones los inventores utilizaron el enfoque ELISA sándwich. Se inmovilizó Actilyse tPA a una concentración de 10 \mug ml^{-1} a los pocillos de una placa inmovilizadora de proteínas de 96 pocillos (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). La serie de concentración de albúmina-AGE:23 y albúmina-control:23 fueron añadidas a pocillos con recubrimiento de tPA, y también a pocillos de control sin recubrimiento. La unión de estructuras amiloides fue detectada después de la incubación con 1 \mug ml^{-1} anti-A\beta (1-42) H-43 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.) y a continuación 0,3 \mug ml^{-1} SWARPO, seguido de teñido con ortofenilén-diamina/H_{2}O_{2}/H_{2}SO_{4}.
Resultados 1. La estructura beta-cruzada se encuentra presente en fibrina y en péptidos sintéticos derivados de fibrina
Hemos demostrado que un coágulo de fibrina tiñe con rojo Congo (no mostrado) y muestra fluorescencia de Tioflavina T (Figura 2A), indicativa de la presencia de estructura amiloide en un coágulo de fibrina. Utilizando tinción con rojo Congo (no mostrado), mediciones de dicroísmo circular y análisis de difracción por rayos X demostramos que los péptidos sintéticos derivados de la secuencia de fibrina adoptan estructura beta-cruzada (Figura 2B,C). Se ha encontrado previamente que estos péptidos poseen propiedades de unión tPA y de activación tPA^{18}. La presencia de estructura beta-cruzada en estos péptidos se observó que se correlacionaba con la capacidad de estimular activación de plasminógeno mediado por tPA (Figura 2D).
En conclusión, estos datos proporcionan pruebas de la ocurrencia/relevancia fisiológica para la formación de estructura beta-cruzada y el papel de este elemento estructural en la unión de tPA a fibrina.
2. A\beta contiene estructura beta-cruzada, se une a plasminógeno y tPA, estimula la activación de plasminógeno, induce degradación de matriz e induce desacoplamiento celular que es agravado por el plasminógeno e inhibido por CpB
Para probar si tPA, plasminógeno y plasmina se unen a A\beta los inventores llevaran a cabo ensayos de unión en fase sólida. A\beta se aplicó como recubrimiento sobre placas de plástico de 96 pocillos y se evaluó la unión del péptido al plasmin(ógeno) o a tPA superponiendo el péptido recubierto con concentraciones crecientes de tPA, plasminógeno o plasmina. La unión fue evaluada utilizando anticuerpos específicos con respecto a plasmin(ógeno) o a tPA llevando a cabo ensayo ELISA. La figura 3A muestra que el tPA se une a A\beta con un Kd de aproximadamente 7 nM, similar al Kd de tPA que se une a fibrina^{55}. Como contraste, los inventores no encuentran unión detectable de plasminógeno a A\beta (Figura 3B). No obstante, el plasminógeno activado (plasmina) se une a A\beta y lo hace con un Kd de 47 nM. El hecho de que la plasmina (activa) pero no el plasminógeno (inactivo) se une a A\beta sugiere que la actividad de plasmina y por lo tanto la generación de lisinas libres es importante para la unión de plasmina a A\beta. La pruebas que han realizado los inventores utilizan el análogo de lisina ácido \varepsilon-aminocaproico (\varepsilonACA) y comprobaron la unión de plasmina y tPA a A\beta en su presencia. Los inventores demuestran que la unión de plasmina a A\beta queda completamente suprimida en presencia de \varepsilonACA (Figura 3D). Como contraste, el \varepsilonACA no tiene efecto en la interacción tPA-A\beta (Figura 3C). Por lo tanto, llegan a la conclusión de que la plasmina se une a lisinas libres que fueron generadas durante el periodo de incubación, preferiblemente con intermedio de sus dominio o dominios Kringle de unión a lisina. De manera correspondiente el Kd del dominio Kringle del plasminógeno que se une a las lisinas libres en la fibrina es similar al Kd para la plasmina que se une a A\beta.
Los inventores investigaron la cinética de la activación de plasminógeno en ausencia y en presencia de A\beta. Tal como se ha publicado anteriormente por Kingston y otros^{24} los inventores han observado que la A\beta estimula de manera potente la activación de plasminógeno por tPA (Figura 4A). No obstante, los inventores observan que la reacción procede con una cinética de segundo orden en vez de primer orden. Los inventores han considerado la posibilidad de que la generación de lisinas libres durante la reacción provocaba este fenómeno (ver más adelante). La generación de plasmina mediada por tPa ha sido implicada en la muerte celular neuronal provocada por isquemia o por aminoácidos excitotóxicos. Datos recientes sugieren que la plasmina puede degradar a A\beta y por lo tanto impide la toxicidad de A\beta ^{56;57}. Los inventores han descubierto que 48 horas después de la adición A\beta a un cultivo de células N1E-115 diferenciadas, la mayor parte de las células han muerto y se han desacoplado de la matriz (no mostrado). Cuando se reúne con A\beta, la plasmina (hasta 100 nM) fue incapaz de mejorar desacoplamiento de células inducido por A\beta. Incluso pre-incubaciones prolongadas de A\beta con 100 nM de plasmina no afectaron el desacoplamiento de células inducido por A\beta (Figura 4B). Como consecuencia, los inventores consideraron la posibilidad de que la generación de plasmina pueda potenciar en vez de inhibir el desacoplamiento de células inducidas por A\beta y sobrevivir. Para la comprobación de ello, los inventores sometieron células N1E-115 a concentraciones sub-óptimas de A\beta y bajas concentraciones de plasminógeno durante 24 horas. En ausencia de A\beta el plasminógeno no tiene efecto sobre la adherencia celular (Figura 4C). No obstante, el plasminógeno tiene un gran efecto potenciador en el desacoplamiento celular inducido por A\beta. Los niveles mínimos de plasminógeno que son necesarios para potenciar el desacoplamiento celular inducido por A\beta (10-20 \mug/ml) se encuentran muy por debajo de los que se encuentran en el plasma humano (250 \mug/ml). La degradación mediada por plasmina de la laminina de la molécula de la matriz extracelular precede el desacoplamiento neuronal y muerte celular en cerebro isquémico. Los inventores comprobaron si la generación de plasmina estimulada por A\beta conduce a la degradación de laminina. El desacoplamiento celular fue acompañado por la degradación de la laminina de la proteína de la matriz extracelular (Figura 4D).
Los inventores consideraron la posibilidad de que la generación de lisinas libres durante la formación de plasmina estimulada por A\beta era responsable de la cinética de segundo orden observada. Para su comprobación los inventores utilizaron carboxipeptidasa B(CpB), una enzima que fracciona la lisina del terminal C y residuos de arginina y el inhibidor CPI de CpB. La figura 5A muestra que en presencia de CpB la generación de plasmina disminuye notablemente. Además este efecto depende de la actividad de CpB puesto que queda suprimido por co-incubación con CPI. La figura 5A muestra también que CpB no suprime por completo la generación de plasmina estimulada por A\beta sino que la reacción procede con cinética lenta de primer orden. Estos datos sugieren que la generación (mediada por plasmina) de lisinas libres durante la reacción es esencial para una generación eficaz de plasmina estimulada por A\beta, presumiblemente soportando unión de plasminógeno y tPA por interacción con sus respectivos dominios Kringle. Una dependencia similar sobre la generación de lisinas del terminal C ha sido demostrada para generación eficaz de plasmina mediada por fibrina^{58}. Estos resultados demuestran que la formación de plasmina estimulada por A\beta es regulada por carboxipeptidasa B in vitro. Por lo tanto, si el desacoplamiento celular es el resultado de la generación de plasmina, CpB puede afectar el desacoplamiento celular inducido por A\beta y/o su viabilidad. Los inventores demuestran que el desacoplamiento celular inducido por plasminógeno y A\beta queda evitado por completo por co-incubación con CpB (Figura 5B,C). Ello se ve acompañado por una inhibición completo de la formación de plasmina estimulada por A\beta tanto en el medio como en las células (Figura 5D).
3. La endostatina puede formar fibrilas amiloides que comprenden estructura beta-cruzada
Utilizando teñido de rojo Congo (no mostrado), análisis por difracción de rayos X y TEM los inventores han demostrado la presencia de estructura beta-cruzada en endostatina agregada procedente de Escherichia coli, así como Pichia pastoris y la capacidad de la endostatina para formar fibrilas amiloides (Figuras 6A-B). Los inventores han descubierto que la endostatina bacteriana producía líneas de reflexión en 4,7 \ring{A} (distancia del enlace de hidrógeno) así como en 10-11 \ring{A} (distancia entre láminas). Las líneas de reflexión muestran intensidades máximas en ángulos de difracción opuestos. El eje de la fibra con su distancia de repetición de enlace de hidrógeno de 4,7 \ring{A} está orientado a lo largo del eje capilar vertical. Esto implica que la distancia entre láminas de 10-11 \ring{A} es perpendicular a estos enlaces de hidrógeno. Esto es coherente con el hecho de que la proteína es una conformación de láminas beta-cruzadas con una estructura beta-cruzada. Las láminas intramoleculares \beta en una proteína globular no pueden provocar un modelo de difracción ordenado de esta manera. De la magnitud de dispersión de fondo resulta que solamente una parte de la proteína contribuye a la formación de la estructura beta-cruzada. Los inventores han descubierto que la presencia de estructuras beta-cruzadas en la endostatina se correlaciona con su capacidad de estimular la activación de plasminógeno mediada por tPA (Figura 6C) y se correlaciona con la muerte celular neuronal (Figura 6D).
En este documento, los inventores han demostrado que la endostatina es un ejemplo de una proteína desnaturalizada que es capaz de estimular la ruta beta-cruzada sugerida.
4. IAPP se une a tPA y estimula la activación de plasminógeno mediada por tPA
Se forman depósitos amiloides de IAPP en el páncreas de pacientes diabéticos tipo II^{59}. El IAPP puede provocar muerte celular in vitro y por lo tanto se cree que contribuye a la destrucción de células \beta que se aprecia in vivo, lo que conduce a insuficiente producción de insulina. La IAPP forma fibrila comprendiendo estructura beta-cruzada^{60}.
Los inventores han comprobado si IAPP podía estimular la activación de plasminógeno mediada por tPA (Figura 7). Ciertamente, de forma similar a A\beta, IAPP puede fomentar la formación de plasmina por tPA.
5. La albúmina glicada se une a Tioflavina T y tPA, y se agrega como fibrilas amiloides comprendiendo estructura beta-cruzada
Se ha demostrado que el glicado de varias proteínas puede inducir o incrementar la capacidad de estas proteínas en unirse a tPa y estimular la formación de plasmina mediada por tPA^{22;61}. Los inventores demuestran en este documento que el glicado de albúmina con g6p no solamente confiere unión de alta afinidad de tPA a albúmina (Figura 8A) sino que lleva asimismo a su capacidad de unir Tioflavina T (Figura 8C). La unión de tPA puede recibir competencia de rojo Congo (Figura 8B). Además, la unión de Tioflavina T a albúmina glicada puede también recibir competencia de tPA (figura 8 D,E). El hecho de que el rojo Congo y/o Tioflavina T y tPa compiten muestran que tienen los mismo lugares de unión o lugares de unión solapados.
El análisis con TEM de los preparados de albúmina modificados con g6p mostraron que después de cuatro semanas de incubación se forman agregados amorfos de albúmina (Figura 8G) que muestra un espectro CD indicativo de la presencia de 7% de los residuos de aminoácidos de albúmina en láminas \beta (Tabla 1). La incubación prolongada hasta 23 semanas resultó en un cambio a estructuras fibrosas laminares altamente ordenadas, con una longitud de aproximadamente 500 nm y un diámetro comprendido entre 50 a 100 nm aproximadamente (Figura 8H). Estas fibras mostraron un incremento de 19% de láminas \beta una vez analizadas por espectropolarimetría CD (Tabla 1). La albúmina de un lote distinto que fue glicada de la misma manera mostró haces de agregados fibrosos después de un periodo de dos semanas de incubación (Figura 8I), mientras que no se detecta incremento de contenido de láminas \beta con espectropolarimetría CD (Tabla 1). En cada haz se pueden identificar aproximadamente diez fibras lineales separadas con una anchura de 3-5 nm con una longitud de 200-300 nm. En el extremo de cada haz se observan zonas regularmente distribuidas con un diámetro de 5 nm aproximadamente. Estas zonas pueden ser determinadas por moléculas de albúmina globular unidas a las fibras o alternativamente se encuentran parcialmente incorporadas en las fibras. No existían agregados en la albúmina de control (no mostrado) y no se midieron láminas \beta utilizando espectropolarometría CD (Tabla 1). Las estructuras fibrosas obtenidas después de dos semanas y 23 semanas de glicado aumentan la fluorescencia de Tioflavina T (ThT) de manera similar, mientras que las precipitados amorfos obtenidos después de cuatro semanas difícilmente incrementaron la señal fluorescente.
Los análisis de difracción de fibras por rayos X revelaron que la albúmina-g6p (23 semanas) comprende una cantidad significativa de fibras cristalinas (Figuras 8J,L) mientras que los modelos de difracción de albúmina-g6p (2 semanas) y albúmina-g6p (4 semanas) muestran características que se originan de proteína globular precipitada amorfa muy similares a los modelos obtenidos para controles de albúmina (Figura 8K). Para albúmina-g6p (23 semanas) la repetición de 4,7 \ring{A} corresponde a la distancia característica del enlace de hidrógeno entre hebras \beta en láminas \beta. Las repeticiones 2,3 y 3,3 \ring{A} tienen una orientación preferente perpendicular a la repetición 4,7 \ring{A} (Figura 8M). Combinando las repeticiones 2,3 y 3,3 \ring{A} sugiere que el eje de la fibra está orientado perpendicularmente en la dirección de los enlaces de hidrógeno con una repetición de 6,8 \ring{A}. Esta dimensión corresponde a la longitud de dos enlaces péptidos e indica que las hebras \beta discurren paralelas al eje de la fibra. Esto implica que la estructura albúmina-g6p (23 semanas) está compuesta por una estructura beta-cruzada que consiste en células \beta apiladas de cadenas de enlace de hidrógeno (Figura 8N). Se encuentra una orientación similar en fibrilas amiloides de la primera región hélice \alpha de predición de PrP^{c62}. Cuando el eje a es de 9,4 \ring{A}, o alternativamente 4,7 \ring{A}, y el eje c es de 6,8 \ring{A}, las repeticiones de 2,5 y 6,0 \ring{A} pueden ser solamente indexadas como (h k 1). Esto implica una repetición altamente ordenada en el eje b, correspondiendo a la distancia entre láminas \beta. Con un eje a y eje c de 4,7, o 9,4 \ring{A} y 6,8 \ring{A}, respectivamente, la fuerte repetición 3,8 \ring{A} debe ser indexada como (2 0 1) o (1 0 1). Considerando todas las observaciones es evidente que las fibras de albúmina-g6p (23 semanas) están constituidas por estructuras beta-cruzadas, peculiaridad característica de las fibrilas amiloides.
Estos resultados muestran que debido a la incubación y/o modificación con fracciones de azúcar se forman estructuras beta-cruzadas en albúmina que son capaces de soportar la unión de tPA.
6. El glicado de hemoglobina induce unión de tPA y formación de fibrilas.
La incubación de hemoglobina humana con g6p resultó en unión de tPA de alta afinidad (figura 9A). Se observaron aductos de Hb-g6p agregados amorfos incluyendo fibrilas con TEM (figura 9B), mientras que el Hb de control no se agregó (no mostrado). La Hb humana de pacientes de diabetes mellitus tiene la tendencia a formar agregados fibrilares, una vez que se ha glicado 12,4% de Hb (Tabla II).
7. La albúmina amiloide se forma independientemente del carbohidrato original (derivado)
De las observaciones indicadas anteriormente es evidente que la modificación de grupos -NH_{2} de albúmina con g6p induce a la formación de una estructura beta-cruzada amiloide. La siguiente cuestión que enfocaron los inventores fue si el inicio de replegado de albúmina globular en un pliegue amiloide era una característica restringida de g6p, o si la formación de amiloide tiene lugar por independencia del carbohidrato original o derivado de carbohidrato utilizado para la formación de AGE. Se incubaron soluciones de albúmina durante 86 semanas a 37ºC con 1 M g6p, 250 mM DL-gliceraldehido/100 mM NaCNBH_{3}, 1 M \beta-D-(-)-fructosa, 1 M D(+)-glucosa, 500 mM ácidoglioxílico/100 mM NaCNBH_{3}, y correspondientes controles tampón de PBS y PBS/NaCNBH_{3}. El gliceraldehído y el ácido glicólico son derivados de carbohidratos que son precursores de AGE en las reacctiones de Maillard^{63; 64}. Después de 86 semanas la albúmina-gliceraldehído y albúmina-fructosa adoptaron forma de suspensiones amarillentas/marrón. Los controles eran soluciones incoloras y transparentes. La albúmina-glucosa y albúmina-ácido glioxílico eran soluciones transparentes amarillentas a marrón claro. La albúmina-g6p:86 era una solución transparente y marrón oscuro. La formación de AGE fue confirmada por mediciones de autofluorescencia utilizando longitudes de onda de excitación/emisión específicas de AGE (no mostrado), unión de moab anti-AGE 4B5 (no mostrado) y unión de poab anti-AGE (no mostrado). Tal como se había esperado, la albúmina-ácido glioxílico no mostró señal autofluorescente debido al hecho de que se formaron^{63} principalmente aductos no fluorescentes de carboximetil-lisina (CML).
Los datos de autofluorescencia y la unión de anticuerpos específicos de AGE que se ha mostrado en lo anterior demuestra que diferentes carbohidratos y derivados de carbohidratos pueden conducir a similares estructuras AGE. Utilizando g6p como punto inicial para la formación de AGE, los inventores demostraron que la albúmina adoptaba características amiloides, similares a las observadas en fibrilas bien estudiadas de A\beta e IAPP. Por lo tanto, los inventores comprobaron la presencia de estructuras amiloides en los aductos albúmina-AGE obtenidos con carbohidratos y derivados alternativos. Los inventores midieron la fluorescencia de soluciones albúmina-AGE - ThT (figura 10J) y de preparados de albúmina secada al aire-AGE que fueron incubados con rojo Congo (figura 10A-I). La incubación de albúmina con gliceraldehído, glucosa o fructosa resultó en una señal fluorescente incrementada de ThT (figura 10J). Después de restar las señales de fondo de ThT y tampón, no se midió fluorescencia específica amiloide - ThT para albúmina-ácido glioxílico y controles tampón. La albúmina-g6p, albúmina-gliceraldehído y albúmina-fructosa proporcionaron una señal fluorescente rojo Congo similar a señales de A\beta e IAPP (figura 10C-E, G-H). Con albúmina glucosa se observa un dibujo uniformemente distribuido de precipitados fluorescentes (figura 10F). Con albúmina-ácido glioxílico y controles tampón difícilmente se observa tinción alguna (figura 10A-B,I). Estos datos de fluorescencia de ThT y de rojo Congo muestran que, además de albúmina-g6p, albúmina-gliceraldehído, albúmina-glucosa y albúmina-fructosa tienen características similares a amiloides. Para sustanciar adicionalmente estos descubrimientos, los inventores comprobaron la unión de serina proteasa tPA específica de amiloide en un ensayo ELISA. La enzima se unió específicamente a albúmina-g6p, albúmina-gliceraldehído, y albúmina-glucosa y albúmina-fructosa (figura 10K-L) y a controles positivos A\beta e IAPP, tal como se había demostrado antes^{49}. No se observó unión de tPA para albúmina-ácido glioxílico y controles tampón.
A partir de los datos de ThT, rojo Congo y tPA, es evidente que la inducción de características amiloides en la albúmina no es una propiedad exclusiva de g6p. Aparentemente, un espectro de carbohidratos y derivados de carbohidratos comprendiendo g6p, glucosa, fructosa, gliceraldehído, y probablemente más, tiene la capacidad de iniciar el paso de pliegue nativo globular a pliegue de estructura beta-cruzada amiloide, después de su unión covalente con albúmina.
8. Análisis de unión de rojo Congo y unión de tPA a A\beta
Se ha demostrado que A\beta puede unirse con tPA y rojo Congo. Los inventores demuestran que la unión de tPA a A\beta puede ser competida por el rojo Congo (figura 11). Estos resultados soportan el descubrimiento de los inventores de que las estructuras de A\beta, fibrina y albúmina glicada son similares y capaces de mediar la unión a tPA.
9. Unión de FXII humano a péptidos y proteínas amiloides, que contienen el pliegue de la estructura beta-cruzada
Los gráficos de la figura 12 muestran que el FXII se une específicamente a todos los compuestos amiloides comprobados. Los k_{D} para hA\beta(1-40), FP13, albúmina-AGE y Hb-AGE son aproximadamente 2, 11, 8 y 0,5 nM, respectivamente. Los datos obtenidos con el FXII - tPA ELISA competitivo muestran que tPA inhibe de manera eficaz la unión de FXII a (poli)péptidos amiloides (figura 12). De estos datos se llega a la conclusión de que FXII y f.1. tPA compiten por los lugares de unión solapados en hA\beta(1-40). K2P-tPA no inhibe la unión de FXII. La unión de FXII a albúmina-AGE queda suprimida también de manera efectiva por tPA pero no por K2P-tPA, de manera similar al observado para hA\beta(1-40). Esto indica que FXII se puede unir de manera similar a hA\beta(1-40) y a albúmina-AGE. Además, estos datos muestran que los tres primeros dominios de tPA "finger", similar-EGF, kringle 1) parecen estar involucrados en el efecto inhibidor de f.I. tPA en las interaciones entre FXII y hA\beta(1-40) amiloide o albúmina-AGE. Utilizando un ensayo de transferencia de zonas ("dot-blot") los inventores comprobaron la unión de FXII a h\DeltaIAPP y hA\beta(1-40) amiloide. No se observó unión de FXII para los controles negativos PBS y m\DeltaIAPP (figura 12). No obstante, el FXII se unió específicamente a hA\beta(1-40), de acuerdo con un informe anterior^{65}, así como a h\DeltaIAPP (figura 12). Estos datos, junto con los datos de ELISA mostrados en las figuras 12A-F, sugieren que FXII puede unirse a polipéptidos que no comparten homología de secuencia de aminoácido, sino los que comparten el pliegue de la estructura beta-cruzada. Esto está de acuerdo con los datos recientes de los inventores sobre interacciones entre tPA y polipéptidos, que contienen el pliegue específico de amiloide.
10. Unión de tPA a moléculas que contienen estructura beta-cruzada, A\beta y albúmina glicada requieren la presencia de una región terminal N en tPA, que contiene el dominio "finger"
Se ha demostrado que varios dominios en tPA median la unión a la fibrina o fragmentos de fibrina ^{12; 53; 66; 67}. No obstante no se conoce qué dominio de tPA es necesario para unir a A\beta u otras moléculas que contienen estructura beta-cruzada. Los inventores demuestran que un tPA mutado, reteplasa con terminales, que carece del apéndice ("finger") del terminal N, EGF y dominio kringle 1 (K2-tPA) es incapaz de unirse a moléculas que comprenden estructura beta-cruzada. Estos resultados sugieren que la zona N-terminal es necesaria para unión de tPA a fibrilas que comprenden estructura beta-cruzada.
Expresión y purificación de tPA-F-GST Y RPTP-GST
La purificación de constructos tPA-F-GST y RPTP\mu-GST(control) marcados con GST a partir de medio 293T utilizando glutatión acoplado a perlas de Sefarosa 4B resultó en bandas únicas de aproximadamente 35 kDa y 150 kDa, respectivamente (no mostrado). También se encontraban presentes trazas de BSA, con origen en el FCS utilizado en el medio.
Ensayo ELISA: unión de tPA-F-GST y RPTP-GST a A\beta(1-40) humano y albúmina glicada
En el ensayo ELISA, tPA de control se unió tanto a A\beta(1-40) humana como a albúmina-g6p en presencia de un exceso de \varepsilonACA (figura 13C). Esto demuestra que en el ensayo el tPA utilizado es capaz de unirse a amiloides fibrosos en una forma independiente de kringle2. El dominio tPA-F se unió a A\beta(1-40) humana y a albúmina-g6p, mientras que no se observó unión con RPTP\mu-GST. Por lo tanto, la unión observada con tPA-F-GST es específica y no se origina del marcado GST. Este resultado apunta al dominio tPA "finger" como dominio específico diseñado por naturaleza para unión a fibrilas amiloides con estructura beta-cruzada.
Los inventores prepararon constructos cDNA en pcDNA3 de los fragmentos F, F-EGF, EGF, F-EGF-K1 y K1 de tPA humano. Se expresaron proteínas recombinantes con un terminal C marcado GST en células BHK y se segregaron al medio. Medio de células BHK expresando el marcado GST solo se utilizó como control. Se utilizó medio condicionado para ensayos descendentes ("pull-down") utilizando A\beta y fibrilas de IAPP, seguido de análisis de transferencia Western. La unión eficaz a A\beta es evidente para los tres mutantes tPA que contienen el dominio "finger", es decir, F-GST, F-EGF-GST y F-EGF-K1-GST (figura 13D). Los constructos K1-GST y EGF-GST, así como el marcador GST solo permanecen en el sobrenadante después de incubación de A\beta. Un modelo similar fue obtenido después de ensayos descendentes IAPP (no mostrado).
Los inventores compararon la unión de tPA F-EGF-GST, purificado, control f.1. Actilyse tPA y un GST recombinante a amiloide A\beta inmovilizado, fragmento \alpha_{148-160} FP13 de fibrina amiloide, IAPP amiloide y control m\DeltaIAPP no amiloide (figura 13E-G). tPA y tPA F-EGF-GST de longitud completa se unen a los tres péptidos amiloides; para A\beta k_{D} para tPA y F-EGF son 2 y 2 nM, respectivamente, para FP13 5 y 2 nM, para IAPP 2 y 13 nM. No se observó unión a m\DeltaIAPP no amiloide (figura 13E). El GST no se une a FP13 y I)PP, mientras que se detecta un cierto grado de unión a A\beta. Esto puede reflejar la pequeña fracción de GST que se une a A\beta en el ensayo descendente (figura
13D).
Mediante análisis inmunoistoquímico los inventores controlaron la unión del constructo tPA F-EGF-GST recombinante purificado a secciones de parafina de cerebro humano afectado por AD. La presencia de depósitos amiloides fue confirmada por el Departamento de Patología (UMC Utrecht) utilizando técnicas estándar. En los experimentos de los inventores, estos depósitos amiloides fueron localizados utilizando fluorescencia de rojo Congo (figura 13I, K, M). En la figura 13H e I, y en la figura 13J y K se aprecia claramente que áreas que son positivas para unión de rojo Congo coinciden con las áreas que son positivas para la unión de tPA F-EGF-GST. El teñido de control con GST no muestra unión específica del marcador solo (Figura 13L-M). En la actualidad, en base a homología secuencial y estructural se conocen además de tPA tres proteínas que contienen uno o varios dominios "finger" es decir, HGFa (un dominio F), FXII (un dominio F), Fn (un tramo de seis dominios F, dos tramos de tres dominios F). De los resultados indicados anteriormente los inventores llegaron a la conclusión de que el dominio F de tPA juega un papel crucial en la unión de tPA a polipéptidos amiloides. Los inventores sustentaron la hipótesis de que el dominio "finger" puede ser un módulo general de unión a la estructura beta-cruzada. En la actualidad se conocen 4 proteínas tPA, FXII, HGFa y fibronectina, que contienen un motivo "finger". La figura 14A muestra esquemáticamente la localización del módulo "finger" en las respectivas proteínas. La figura 14B muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos humanos de los dominios "finger" en estas cuatro proteínas. La figura 14C muestra una representación esquemática de la estructura tridimensional del dominio "finger" de tPA y del cuarto y quinto dominio "finger" de fibronectina. Para comprobar su hipótesis de que los dominios "finger" en general se unen a amiloide, los inventores clonaron los dominios F de HGF y FXII, así como el cuarto y quinto dominio F de Fn, que se conocen por su capacidad de unión a fibrina^{68}. Utilizando un ensayo descendente, los inventores han demostrado que Fn F4-GST y Fn F4-5-GST, así como FXII F-GST y HGFa F-GST se unen específicamente A\beta (Figura 13 M-N)y IAPP (no mostrado). Fn F5-GST se une a A\beta en cierta medida, no obstante se extrae de manera menos eficaz del medio y parece ser liberado parcialmente durante el proceso de lavado de la pastilla amiloide (Figura 13M). No se dejó constructo en el medio después de extracción del control positivo tPA F-EGF-GST, mientras que no se detectó control negativo GST en la fracción de pastilla (no mostrado). Estos datos muestran que la unión a polipéptidos amiloides no es una capacidad única del dominio tPA F sino una propiedad más general de los dominios F sometidos a prueba. Además, estos datos indican que la unión observada de FXII a polipéptidos amiloides tal como se ha mostrado en la figura 13A, H y por Shibayama y otros^{65}, está regulada por intermedio del dominio F.
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11. Dominio de unión amiloide de tPA
Se ha mostrado que el dominio "finger" de tPA es importante para la unión de alta afinidad a la fibrina^{12;66}. Los presentes resultados de los inventores utilizando reteplasa (K2-P tPA) y F-tPA, F-EGF-tPA y F-EGF-K1-tPA indican un importante papel para el dominio "finger" del terminal N de tPA en la unión de factores estimuladores distintos de la fibrina. Hasta el momento todos estos factores se unen a rojo Congo y contienen estructura beta-cruzada. Además, el lugar de unión de la fibronectina para la fibrina ha sido localizado en el dominio "finger" tandem F4-F5^{68}. Se ha demostrado que la activación de plasminógeno por tPA de longitud completa en presencia del fragmento de fibrina FCB2 puede ser inhibida por fibronectina^{69}. Consideradas en su conjunto, estas observaciones sugieren que tPA y fibronectina compiten a través de su dominio "finger" para los mismos lugares de unión o lugares de unión solapados sobre la fibrina. Los datos de los inventores muestran actualmente que los dominios F4-5 de Fn se unen a amiloide A\beta.
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12. Unión de anticuerpos anti-AGE a polipéptidos amiloides y unión de anti-A\beta a aductos de la proteína-AGE
Recientemente, O'Nuallain y Wetzel^{70} han demostrado que anticuerpos elicitados contra un péptido con características amiloide se pueden unir a cualquier otro péptido con similares características amiloides, independientemente de la secuencia de aminoácido. Basándose en estos datos y en las observaciones de los inventores de que el activador de plasminógeno de tipo tejido y el factor XII se pueden unir a una familia de polipéptidos no relacionados por secuencia, que comparten el pliegue de estructura beta-cruzada específico, los inventores hicieron la hipótesis de que una clase más amplia de proteínas puede mostrar afinidad hacia esta unidad estructural en vez de hacerlo hacia un epítopo lineal o conformacional, constituido por residuos de aminoácido específicos. Esta hipótesis planteó la cuestión de si anticuerpos elicitados contra albúmina-AGE que contiene el pliegue de estructura beta-cruzada amiloide, muestran también la especificidad de amplia gama hacia cualquier polipéptido que contiene este pliegue de estructura
beta-cruzada.
En una disposición ELISA \alpha-AGE1, que fue elicitado contra albúmina-AGE glicada con g6p, se une a albúmina-AGE: 23 amiloide (K_{d }= 66 nM) y Hb-AGE:32 (K_{d} = 20 nM), así como a A\beta(1-40) (K_{d} = 481 nM) y IAPP (K_{d} = 18 nM)(Figura 15A-C). Los controles negativos fueron albúmina no glicada y Hb, \DeltaIAPP de ratón péptido no amiloide para IAPP y anticuerpo vitronectina antihumano policlonado \alpha-hVn K9234 para A\beta. Para probar si la misma fracción de \alpha-AGE1 se une a IAPP y A\beta, el anticuerpo fue preincubado con fibrilas de IAPP, seguido de peletizado de las fibrilas, junto con la posible fracción amiloide de \alpha-AGE1. La unión de \alpha-AGE1, en el sobrenadante, a A\beta(1-40) fue reducida (Figura 15D). Esto indica que la misma fracción de \alpha-AGE1 se une a IAPP y A\beta(1-40). Con un ensayo descendente los inventores evaluaron la unión de anti-AGE1 a péptidos amiloides en una forma alternativa. Después de la incubación de soluciones anti-AGE con fibrilas amiloides A\beta(16-22)(Figura 15E; vías 1-2), A\beta(1-40)(Figura 15E; vías 4-5) y IAPP (Figura 15E; vías 6-7), y peletizando a continuación las fibrilas de amiloide, el sobrenadante quedó completamente agotado de \alpha-AGE por A\beta(16-22). Con IAPP aproximadamente el 50% del anticuerpo se encuentra en la fracción amiloide mientras que se peletiza una cantidad menor de anticuerpo con A\beta(1-40). Estos datos obtenidos de forma complementaria muestran nuevamente que anti-AGE1 se puede unir a péptidos amiloides que no comparten homología de secuencia de aminoácido con albúmina-AGE:23, si bien comparten el pliegue de estructura beta-cruzada. Además, la observación de que la unión de tPA a péptidos amiloides inhibe la unión de anti-AGE1 indica también que anti-AGE1, igual que tPA, se une al pliegue de estructura beta-cruzada (Figura 15F-G). La observación de que tPA reduce la unión de anti-AGE1 a A\beta en menor medida que la reducción experimental con IAPP, está relacionada putativamente con el número más elevado de lugares de unión anti-AGE1 sobre A\beta con recubrimiento cuando se compara con IAPP (ver Figura 15B-C), y a la afinidad más elevada de tPA para IAPP (k_{D}=6 nM)que para A\beta (k_{D}=46 nM) cuando se utiliza placas Exiqon ELISA (no mostrado). Los datos de unión conjuntamente sugieren que anti-AGE1 se une a este pliegue amiloide con independencia del polipéptido que lleva el pliegue de estructura beta-cruzada que identifica anti-AGE1 como miembro de la clase de proteínas de unión de estructura beta-cruzada
multiligando.
En base a los resultados anteriormente indicados obtenidos con anti-AGE1, los inventores comprobaron si A\beta(1-42)H-43 anti humano de conejo disponible comercialmente muestra también una amplia gama de especificidad hacia cualquier polipéptido con secuencia de aminoácidos no relacionada, si bien con características amiloides. Ciertamente, con un ensayo ELISA los inventores pudieron demostrar que H-43 no solamente se une a A\beta(1-40), sino también a IAPP y a albúmina-AGE(Figura 15H). Además, la unión de H-43 a IAPP inmovilizado fue efectivamente disminuida por tPA (Figura 15I). Estas observaciones muestran conjuntamente que anti- A\beta(1-42)H-43 puede unirse a otros polipéptidos amiloides de manera similar a la proteína tPA de unión a la estructura beta-cruzada multili-
gando.
El ensayo ELISA con anti-albúmina-AGE/A\beta policlonal de ratón muestra que el anticuerpo no solamente se une a estos antígenos sino que específicamente se une a otros péptidos amiloides distintos a los utilizados para inmunización (Figuras 15J-L). De manera similar al anticuerpo de conejo anti-AGE1 y anti- A\beta(1-42)H-43, la anti-albúmina AGE/A\beta muestra afinidad para los péptidos amiloides comprobados con independencia de la secuencia de aminoácido. Esto sugiere que también la anti-albúmina AGE/A\beta de ratón es un anticuerpo de unión a amiloide multili-
gando.
Basado en las características de unión de amiloide de anti-AGE1, anti-A\beta(1-42)H-43 y anti-albúmina-AGE/A\beta, los inventores purificaron la fracción de unión a amiloide de anti-AGE2, que es elicitada contra la albúmina-AGE:23 con fibrilas A\beta irreversiblemente acopladas a una columna. Esta fracción fue utilizada para análisis inmunohistoquímicos de una sección de cerebro humano afectado por la enfermedad de Alzheimer. En la figura 15M se observa claramente que el anticuerpo se une específicamente al depósito amiloide esférico indicado por la fluorescencia de rojo Congo mostrada en la figura 15N.
El descubrimiento de los inventores de que los anticuerpos anti-amiloide y anti-AGE muestran afinidad para un amplio campo de polipéptidos no relacionados secuencialmente, siempre que se encuentre presente a lo largo del pliegue de estructura beta-cruzada, está de acuerdo con los datos recientemente publicados por O'Nuallain y Wetzel^{70} y Kayed y otros ^{71}. A partir de otros varios informes anteriores de la literatura se puede deducir que se pueden obtener anticuerpos anti-beta-cruzada. Por ejemplo, se describen ^{72;73} anticuerpos con reacción cruzada contra fibrina y A\beta y contra A\beta y hemoglobina. Los inventores han indicado que el fibrinógeno y hemoglobina-AGE adoptan el pliegue de estructura beta-cruzada lo que sugiere que la reactividad cruzada observada para anticuerpos anti-A\beta era en realidad la unión de anticuerpos de estructura anti-A\beta a epítopos estructurales similares en A\beta, fibrinógeno y
hemoglobina.
Basándose en los resultados de los inventores con el anti-AGE policlonal y anticuerpos amiloides los inventores formaron la hipótesis de que los anticuerpos de estructura anti-beta-cruzada podían ser obtenidos. Por lo tanto, los inventores fusionaron el bazo de ratones inmunizados con BSA glicado y A\beta con células de mieloma. Los inventores seleccionaron a continuación anticuerpos de estructura anti-beta-cruzada potenciales examinando la unión de anticuerpos producidos de hibridoma a hemoglobina glicada y IAPP. Utilizando este procedimiento los inventores aislaron un anticuerpo monoclonal 3H7, que reconoce hemoglobina glicada así como varios péptidos que contienen la estructura beta-cruzada (Figura 16). No se observó unión a la hemoglobina no glicada o un péptido sintético que no forma fibrilas amiloides (m\DeltaIAPP).
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13. ELISA Sandwich: recuperación de estructuras amiloides de la solución
Utilizando el enfoque ELISA Sandwich los inventores aplicaron recubrimiento de tPA al que se superpuso albúmina amiloide-AGE:23 en solución seguido por la detección con anti- A\beta(1-42)H-43 (Figura 17), de amplia gama con lo que fueron capaces de detectar proteínas en solución que contenían estructura beta-cruzada.
Se explica en el presente documento que las estructuras tridimensionales del dominio "finger" tPA^{74;75} y los dominios "finger" de fibronectina 4-5^{75;76} revelan una sorprendente homología estructural con respecto a distribución de densidad de carga local. Ambas estructuras contienen un segmento de cinco residuos de aminoácidos con carga alternativa expuesto a los disolventes de manera similar; para tPA Arg7, Glu9, Arg23, Glu32, Arg30, y para fibronectina Arg83, Glu85, Lys87, Glu89, Arg90, situados en el quinto dominio "finger" respectivamente. Las alineaciones de residuos cargados están localizadas en el mismo lado del módulo "finger". Estas alineaciones pueden ser esenciales para la unión de fibrina.
Basándose en las observaciones de los inventores, en los resultados y en las similitudes que se han dado a conocer, los inventores demuestran que los mismos lugares de unión para tPA se encuentran presentes en todas las proteínas que se unen y activan con tPA y que este lugar de unión comprende estructura beta-cruzada.
Tomados en conjunto, los datos de los inventores demuestran que la estructura beta-cruzada es un elemento de estructura cuaternaria fisiológicamente relevante cuyo aspecto está regulado íntimamente y cuya aparición induce una respuesta fisiológica normal, es decir, la eliminación de las biomoléculas no deseadas. De acuerdo con lo que conocen los inventores la existencia de un sistema general que designan como "ruta de la estructura beta-cruzada" para la eliminación de biomoléculas no deseadas se a dado a conocer por primera vez en el presente documento. Los resultados de los inventores demuestran que este mecanismo es fundamental en la naturaleza y controla muchos procesos fisiológicos que protegen organismos contra daños inducidos o contra acumulación de biomoléculas inútiles o desnaturalizadas. Si por cualesquiera medios se desregula, este sistema puede provocar graves problemas. Por otra parte, si se utiliza de manera apropiada este sistema puede ser aplicable para inducir muerte celular en células diana específicas tales como por ejemplo, células tumorales.
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Descripción de las figuras
Figura 1
Representación esquemática de la "ruta de la estructura beta-cruzada"
La estructura beta-cruzada se encuentra en una serie de proteínas (1). La formación de una estructura beta-cruzada puede ser iniciada por varios estados fisiológicos o patológicos y a continuación inicia una cascada de eventos, la "ruta de la estructura beta-cruzada". Entre los factores que inician o regulan la formación de una estructura beta-cruzada dentro de una proteína determinada se encuentran: 1) propiedades fisicoquímicas de la proteína, 2) proteólisis, 3) modificación postranslacional regulada incluyendo reticulación, oxidación, fosforilación, glicosilación y glicado, 4) glucosa, y 5)zinc. Ciertas mutaciones dentro de la secuencia de una proteína se sabe que incrementan la capacidad de la misma en adoptar estructura beta-cruzada y formar fibrilas de amiloide. Estas mutaciones se encuentran frecuentemente en formas hereditarias de amiloidosis, por ejemplo en AD. La presente invención da a conocer múltiples ejemplos nuevos de proteínas capaces de adoptar una estructura beta-cruzada.
Se conocen varias proteínas que se unen a proteínas (2) que contienen estructura beta-cruzada. Estas proteínas son parte de la cascada de señales que se da a conocer en este documento ("ruta de la estructura beta-cruzada") que se inicia después de la formación de una estructura beta-cruzada. La "ruta de la estructura beta-cruzada" es modulada de muchas maneras (3,4,5). Los factores que regulan la ruta incluyen moduladores de síntesis y de secreción incluyendo reguladores de NO así como moduladores de actividad, incluyendo inhibidores de proteasa. La ruta está involucrada en muchos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo, sin que ello sea limitativo, aterosclerosis, diabetes, amiloidosis, hemorragia, inflamación, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, sepsis, síndrome urémico hemolítico (7). Dado el papel demostrado de tPA en potenciación a largo plazo la "ruta de la estructura beta-cruzada" puede estar también involucrada en aprendizaje.
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Figura 2
Estructura beta-cruzada en fibrina
(A) Fluorescencia de Tioflavina T de un coágulo de fibrina. Se formó un coágulo de fibrina en presencia de Tioflavina T y se registró fluorescencia en los momentos de tiempo indicados. La fluorescencia de fondo del tampón, Tioflavina T y un coágulo formado en ausencia de Tioflavina T fueron restados. (B) Análisis de dicroísmo circular de péptido derivado de fibrina 85, 86 y 87. La elipticidad (Dg.cm^{2}/dmol) es registrada contra longitud de onda (nm). Los espectros CD demuestran que los péptidos 85 y 86 pero no el péptido 87 contienen láminas \beta. (C) El análisis de fibras por difracción de rayos X del péptido 85 muestra que el péptido forma láminas beta-cruzadas. (D) Ensayo de activación de plasminógeno con péptidos de fibrina 85, 86 y 87. Se observa que los péptidos 85 y 86, conteniendo ambos una estructura beta-cruzada, estimulan la formación de plasmina por tPA mientras que el péptido 87 que carece de estructura beta-cruzada no lo hace.
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Figura 3
Unión de tPA, plasminógeno y plasmina a A\beta
Se aplicó como recubrimiento A\beta sobre placas de plástico de 96 pocillos. Se permitió la unión de concentraciones crecientes de (A) tPA o (B) plasminógeno al péptido inmovilizado. Después de lavado a fondo se evaluó la unión de tPA y plasminógeno por ensayos inmunoenzimáticos utilizando anticuerpos, anti-tPA y anti-plasminógeno. La unión de (C) tPA y (D) plasmina a A\beta en presencia de 50 mM de ácido \varepsilon-aminocaproico (\varepsilon-ACA) fue evaluada igual que en A y B.
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Figura 4
Estimulación de la formación de plasmina mediada por tPA por A\beta y estimulación sinérgica del desacoplamiento celular por plasminógeno y A\beta
Se incubaron (A) plasminógeno (200 \mug/ml) y tPA (200 pM) con A\beta (5 \muM) o tampón de control. Se tomaron muestras de la mezcla de reacción en los periodos indicados de tiempo y se midió la actividad de plasmina por conversión del sustrato cromogénico de plasmina S-2251 a 405 nm. (B) Células N1E-115 fueron diferenciadas y recibieron las concentraciones indicadas de plasmina en presencia o ausencia de 25 \muM A\beta. Después de 48 horas las células muertas fueron retiradas por lavado y las células adherentes restantes fueron teñidas con azul de metileno. La plasmina no puede impedir el desacoplamiento de las células inducidas por A\beta. (C) Células N1E-115 fueron diferenciadas y recibieron las concentraciones indicadas de plasminógeno en presencia o ausencia de 10 \muM A\beta. Después de 24 horas el desacoplamiento celular fue evaluado. A\beta o plasminógeno solos no afectan la adherencia celular, pero provocan desacoplamiento celular masivo cuando se añaden conjuntamente. (D) El análisis de inmunotransferencia de formación de plasmina y degradación de laminina. Las células diferenciadas N1E-115 fueron tratadas con o sin A\beta (10 \muM) en ausencia o presencia de plasminógeno añadido. La adición de A\beta resulta una formación de plasmina (panel inferior) y en la degradación de laminina (panel superior).
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Figura 5
La carboxipeptidasa B inhibe la formación de plasmina mediada por tPA estimulada por A\beta y el desacoplamiento celular
(A) Plasminógeno (200 \mug/ml) y tPA (200 pM) fueron incubados con A\beta (5 \muM) o tampón de control. Se tomaron muestras de la mezcla de reacción en los periodos indicados de tiempo y se midió la actividad de la plasmina por conversión del sustrato cromogénico de plasmina S-2251 a 405 nm. La reacción fue llevada a cabo en ausencia o presencia de 50 \mug ml^{-1} de carboxipeptidasa B (CpB) y en la ausencia o presencia de 3,5 \muM de inhibidor de carboxipeptidasa (CPI). La CpB atenúa notablemente la formación de plasmina estimulada por A\beta. (B) Células N1E-115 fueron diferenciadas y tratadas con A\beta (10 \muM), plasminógeno (Plg, 20 \mug ml^{-1}) y/o CpB (1 \muM) tal como se ha indicado. Después de 24 horas las células fueron fotografiadas. (C) A continuación las células fueron lavadas una vez con PBS y las células restantes fueron cuantificadas como porcentaje de células adheridas mediante teñido con azul de metileno. (D) Las células fueron tratadas igual que en (B) y (C) y se recogieron el medio y fracciones de células y se analizaron por transferencia western utilizando un anticuerpo anti-plasminógeno. A\beta estimula la formación de plasmina que es inhibida por CpB.
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Figura 6
La endostatina puede formar fibrilas que comprenden estructura beta-cruzada y estimula la activación de plasminógeno
(A) El microscopio TEM muestra la formación de fibrilas de endostatina. (B) El análisis por rayos X revela la presencia de estructura beta-cruzada en endostatina precipitada (prec.). (C) Ensayo de activación de plasminógeno que demuestra la actividad estimulante de endostatina que contiene estructura beta-cruzada sobre la formación de plasmina mediada por tPA. Se ha mostrado A\beta a efectos comparativos. (D) Análisis de muerte celular inducida por endostatina por tinción con azul de metileno. Se observa que sólamente la forma precipitada es capaz de inducir eficazmente la muerte celular. La muerte celular directa, pero no el desacoplamiento celular, es protegida en presencia de suficiente glucosa. Tampón prec. indica tampón de control.
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Figura 7
IAPP estimula la activación de plasminógeno mediada por tPA
Tanto el núcleo de longitud completa (fl-hIAPP) como el núcleo amiloide truncado (\Delta-hIAPP) pero no el de ratón IAPP (\Delta-mIAPP) estimulan la activación de plasminógeno mediada por tPA.
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Figura 8
Albúmina glicada: unión de Tioflavina T y tPA, imágenes TEM, difracción de fibras por rayos X
(A) ELISA que muestra unión de tPA a albúmina-g6p. (B) Competición de tPA que se une a albúmina-g6p por rojo Congo determinado con utilización de ensayo ELISA. (C) Mediciones de fluorescencia de unión de Tioflavina T a albúmina-g6p, incubada 2, 4 ó 23 semanas. (D) Inhibición de la señal de fluorescencia obtenida después de la incubación de 430 nM de albúmina-g6p con 19 \muM de Tioflavina T por tPA. (E) El análisis espectrofotométrico a 420 nm muestra que cantidades crecientes de tPA resultan en una disminución de la absorbancia específica obtenida por incubación de 500 nM de albúmina-g6p con 10 \muM de Tioflavina T. (G) Micrografías electrónicas que muestran precipitados amorfos de albúmina glicada-g6p de cuatro semanas. (H) Haces de agregados fibrilares de albúmina-g6p incubada 23 semanas. (I) Albúmina-g6p glicada de 2 semanas. (J) Distorsión por rayos X de albúmina-g6p (23 semanas). Las intensidades de distorsión son codificadas por color sobre una escala lineal y disminuyen en el orden blanco-gris-negro. La distorsión de la albúmina de control amorfa es restada así como la distorsión de la pared de vidrio capilar y del aire. Se indican las separaciones d y la dirección del eje de la fibra y las orientaciones preferentes y se indican las orientaciones preferentes mediante flechas. (K) Escaneado radial de albúmina de control y albúmina-g6p (23 semanas). (L) Escaneado radial de albúmina-g6p (23 semanas) mostrando repeticiones que se originan de estructura fibrosa como después de restar dispersión de fondo de albúmina precipitada amorfa. Se muestran separaciones d (en \ring{A}) por encima de los picos. (M) Escaneados tangenciales a lo largo de los ángulos de dispersión 2\theta correspondientes a las separaciones d indicadas. Los escaneados muestran que la repetición 4,7 \ring{A} que corresponde a la distancia del enlace de hidrógeno dentro de las láminas individuales \beta y la repetición 6 \ring{A} están orientadas perpendicularmente a la repetición 2,3 \ring{A} que discurre paralelamente al eje de la fibra. (N) Dibujo esquemático de la orientación de las estructuras beta-cruzada en fibrilas amiloides de albúmina-g6p (23 semanas).
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Figura 9
Formación de fibrilas de hemoglobina humana
(A) Unión de tPA a Hb-g6p glicada in vitro. (B) Micrografías electrónicas que muestran Hb glicada in vitro, que se agrega de forma amorfa y fibrosa.
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Figura 10
Se introducen propiedades amiloides de albúmina-AGE con independencia del carbohidrato o derivado de carbohidrato utilizado para glicado
(A-I) Fluorescencia de rojo Congo de preparados de albúmina secados al aire. La fluorescencia fue medida con albúmina incubada con tampón (A) o con tampón y NaCNBH_{3} (B), con péptido de núcleo amiloide de IAPP humano (C), A\beta (D), con albúmina incubada con g6p (E), glucosa (F), fructosa (G), gliceraldehído (H), y ácido glioxílico (I). (J). Se midió la fluorescencia de tioflavina T-amiloide en solución con los preparados de albúmina indicados. (K-L) Se ensayó la unión de serina proteasa tPA que se une a amiloide a preparados de albúmina utilizando una disposición ELISA. En (K) se ha mostrado la unión de tPA a albúmina-glucosa, -fructosa, -gliceraldehído, ácido glioxílico, y controles albúmina-tampón. En (L) se ha mostrado la unión de tPA a controles positivos albúmina-g6p, A\beta e IAPP, así como a albúmina incubada con tampón de control.
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Figura 11
Análisis de unión de rojo Congo y tPA a A\beta
(A) Unión de tPA a A\beta inmovilizada, medida utilizando un ensayo ELISA. (B) influencia de concentraciones crecientes de rojo Congo en la unión de tPA a A\beta. En el ensayo ELISA se aplicaron como recubrimiento 10 \mug ml^{-1} de A\beta(1-40) y se incubó con 40 nM de tPA y 0-100 \mum de rojo Congo.
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Figura 12
Unión de FXII humano a péptidos y proteínas amiloides, que contienen el pliegue de estructura beta-cruzada
(A-B) Unión de FXII a péptidos amiloide prototipo hA\beta(1-40) y fragmento de fibrina humana \alpha_{147-159}FP13, y albúmina-AGE y Hb-AGE, todos los cuales contienen estructura beta-cruzada, según comprobación en ensayo ELISA. El FXII no se une a polipéptido amiloide de isletas \Delta de ratón de control negativo (\DeltamIAPP), control de albúmina y control Hb, careciendo los tres de estructura amiloide específica. Los k_{D} para hA\beta(1-40), FP13, albúmina-AGE y Hb-AGE son aproximadamente 2, 11, 8 y 0,5 nM, respectivamente. (C-D) Se incubó hA\beta(1-40) como recubrimiento con 2,5 nM FXII en tampón de unión, en presencia de una serie de concentración de activador plasminógeno de tipo tejido recombinante humano (Actilyse®, tPA de longitud completa), o Reteplase® (K2P-tPA). La concentración f.1. tPA- y K2P-tPA se encontró en un máximo de 135 veces el k_{D} para unión de tPA a hA\beta(1-40)(50 nM). (E-F) se incubó albúmina-AGE amiloide como recubrimiento con 15 nM FXII en tampón de unión, en presencia de una serie de concentración de f.l. tPA o K2P-tPA. La concentración de tPA era como máximo 150 veces el k_{D} para unión de tPA a albúmina-AGE (1 nM). (G) Unión de FXII a hA\beta(1-40) y el fragmento de amilina humana amiloide prototipo h\DeltaIAPP fue comprobado utilizando análisis de transferencia de zonas. 10 \mug de péptidos, que contienen estructura beta-cruzada, así como el péptido de control negativo m\DeltaIAPP y solución salina con tampón fosfato (PBS) fueron examinados por duplicado. FXII específicamente unido a hA\beta(1-40), y también a h\DeltaIAPP.
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Figura 13
Los dominios "finger" se unen a polipéptidos amiloides
(A) Unión de tPA y K2-P tPA a albúmina-g6p. (B) Unión de tPA y K2-P tPA a A\beta(1-40). El anticuerpo tPA utilizado para detección reconoce ambos tPA y K2-P-tPA con igual afinidad (no mostrado). (C) Unión de tPA-F-GST y tPA a A\beta(1-40) inmovilizado y albúmina-g6p. El control RPTP\mu-GST no se une a A\beta o albúmina-g6p. (D) Ensayo descendente con fibrilas insolubles de A\beta y dominios tPA. Medio BHK acondicionado procedente de líneas celulares transfectadas de forma estable expresando tPA F, F-EGF, EGF, F-EGF-K1 y K1 con un marcador GST en el terminal C, así como en el marcador solo, fueron utilizados para el ensayo. Medio de "Control" antes del ensayo descendente, "A\beta", pastilla de A\beta amiloide lavada, después del ensayo descendente, "Sup", medios después de extracción con A\beta. Las muestras fueron analizadas con transferencia Western utilizando anticuerpo Z-5 anti-GST de conejo. (E-G) ELISA que muestra unión de tPA F-EGF-GST y tPA recombinante f.1. a amiloide A\beta (E), FP 13 (F) e IAPP (G). Se aplicó como recubrimiento m\DeltaIAPP como control negativo no amiloide (E). Los péptidos fueron inmovilizados en placas ELISA y se colocó un recubrimiento con la serie de concentración de tPA y F-EGF-GST. Se utilizó GST como control negativo. La unión fue detectada utilizando anticuerpo Z-5 anti-GST de conejo. (H-M) Análisis inmunohistoquímico de la unión de tPA F-EGF-GST a depósitos de amiloide en el cerebro humano afectado de AD. Las secciones del cerebro fueron recubiertas con tPA F-EGF-GST (H,J) o GST (L) de control negativo. Las mismas secciones fueron incubadas con rojo Congo (I, K, M) para localizar depósitos de amiloide. (N-O) Ensayo descendente con fibrilas insolubles de A\beta y dominios "finger". Los dominios recombinantes F con marcador GST en el terminal C fueron expresados por células BHK transfectadas de manera estable. Medio de 'Control' antes del ensayo descendente, "A\beta", pastilla de A\beta amiloide lavada, después del ensayo descendente, 'Sup', medio después de extracción con A\beta. Las muestras fueron analizadas mediante transferencia Western utilizando anticuerpo Z-5 anti-GST de conejo.
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Figura 14
Módulo "finger"
(A) Representación esquemática de la localización del dominio "finger" en tPA, factor XII, HGFa y fibronectina. (B) Alineación de la secuencia de aminoácido del dominio "finger" de las respectivas proteínas. (C) Representación de armazón de péptido del domino "finger" tPA, y cuarto y quinto dominios "finger" de FN. Los enlaces de disulfuro conservados se han mostrado en forma de bola y palo.
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Figura 15
Anticuerpos elicitados contra péptidos amiloides reaccionan de forma cruzada con proteínas glicadas, y viceversa
(A-C) ELISA con albúmina-AGE:23 y Hb-AGE glicadas inmovilizadas g6p, sus controles no glicados (A), A\beta(1-40)(B), e IAPP y m\DeltaIAPP (C). Para el ELISA A\beta se utilizó anticuerpo \alpha-hVn K9234 de vitronectina antihumano policlonal como control negativo. (D) Unión de \alpha-AGE1 a A\beta(1-40) inmovilizado sobre una placa ELISA, después de preincubación de \alpha-AGE1 con fibrilas IAPP. (E) Ensayo descendente con anticuerpo anti-AGE1 y fibrilas amiloides de A\beta(16-22) (vías 1-2), A\beta(1-40) (vías 4-5) e IAPP (vías 6-7). Después de peletizar y lavar las fibrilas, se hirvieron muestras en tampón muestra no reductor y se analizó mediante SDS-PAGE. s = sobrenadante después de extracción de amiloide, p = pastilla de amiloide después de extracción, m = marcador molecular. (F-G) En una disposición ELISA, A\beta(1-40) inmovilizada (F) e IAPP (G) son coincubadas con tPA y 250 ó 18 nM \alpha-AGE1, respectivamente. (H) En una disposición ELISA se comprueba la unión de \alpha-A\beta(1-42)H-43 a control positivo inmovilizado A\beta(1-40), y a IAPP y albúmina-AGE:23. Se utilizan albúmina-control:23 y m\DeltaIAPP como controles negativos. (I) Unión de 100 nM \alpha-A\beta(1-42) H-43 a IAPP, inmovilizado en una placa ELISA, en presencia de una serie de concentración de tPA. (J-K) ELISA que muestra la unión de un anticuerpo policlonal en suero de ratón elicitado contra albúmina-AGE:23 y A\beta(1-40)(proporción 9:1) ("poab anti-amiloide") y de un anticuerpo policlonal elicitado contra una proteína de control ("suero de control") a IAPP inmovilizado (J) y albúmina-AGE:23 (K). El suero fue diluido en PBS con 0,1% v/v Tween20. (L) ELISA que muestra la unión de ratón poab anti-amiloide a miloide A\beta(1-40), h\DeltaIAPP y fragmento de fibrina \alpha_{148-160} FP13. Suero de control con anticuerpos contra una proteína no relacionada, tampón y m\DeltaIAPP no amiloide inmovilizada y fragmento de fribrina \alpha_{148-157} FP10 se utilizaron como controles negativos. (M) Análisis inmunohistoquímico de la unión de anti-AGE2 de conejo a una placa amiloide esférica (flecha) en una sección de un cerebro humano afectado por AD. Aumento 400x. (N) Fluorescencia de rojo Congo en la misma sección. Aumento 630x.
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Figura 16
Anticuerpo 3H7 con estructura anti-beta-cruzada monoclonal detecta hemoglobina glicada, A\beta, IAPP y FP13
ELISA que muestra la unión de anticuerpo 3H7 de estructura anti-beta-cruzada monoclonal de ratón a (A) hemoglobina glicada con respecto a hemoglobina no glicada de control o (B) A\beta, hIAPP, \DeltamIAPP y fragmento de fibrina \alpha_{148-160} FP13.
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Figura 17
ELISA sándwich para detección de albúmina-AGE amiloide o hemoglobina amiloide en solución
Se superpuso tPA recombinante inmovilizado sobre inmovilizadores de proteína Exiqon con solución de albúmina-AGE:23 o solución de albúmina-control:23 a las concentraciones indicadas. A continuación, se detectaron las estructuras amiloides unidas con (1-42) H-43 (A) anti-A\beta.
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Tablas TABLA I
1
TABLA II
2
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Claims (1)

1. Utilización de un compuesto capaz de unión a una estructura beta-cruzada para la preparación de un medicamento para disminuir las proteínas desplegadas que han adoptado una conformación parcialmente estructurada, involucradas en una enfermedad conformacional, en la que dicho compuesto es un anticuerpo o comprende un dominio "finger", en el que dicho dominio "finger" es derivado de Fibronectina, FXII o HGFa, y en la que dicha enfermedad es una enfermedad caracterizada por amiloide, ateroesclerosis, diabetes, hemorragia, trombosis, cáncer, sepsis, Esclerosis Múltiple, enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, enfermedad asociada con pérdida de memoria o enfermedad de Parkinson y/o epilepsia.
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