PT1536778E - Proteínas que se ligam a amilóide compreendendo estrutura cruzada beta e métodos para modulação da estrutura cruzada beta, sua formação e sua toxicidade associada - Google Patents

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ΡΕ1536778 1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS QUE SE LIGAM A AMILÓIDE COMPREENDENDO ESTRUTURA CRUZADA BETA E MÉTODOS PARA MODULAÇÃO DA ESTRUTURA CRUZADA BETA, SUA FORMAÇÃO E SUA TOXICIDADE ASSOCIADA" A invenção refere-se ao campo da bioquímica, biologia molecular, biologia estrutural e medicina. Mais em particular, a invenção refere-se uma estrutura β cruzada, suas proteínas de ligação e seus papéis biológicos.

Introdução

Um conjunto crescente de evidências sugere que a desdobragem das proteínas globulares pode conduzir a toxicidade1. As proteínas não dobradas podem iniciar a agregação e fibrilhação de proteínas adoptando uma conformação parcialmente estruturada. Esses agregados fibrilhares podem (lentamente) acumular-se em vários tipos de tecido e estão associados com uma variedade de doenças degenerativas. 0 termo "amilóide" é utilizado para descrever estes depósitos fibrilhares (ou placas). As doenças caracterizadas por amilóide são referidas como amiloidoses e incluem doença de Alzheimer (AD), amiloidose de cadeia leve, diabete de tipo II e encefalite espongiforme. 2 ΡΕ1536778

Observou-se recentemente que a toxicidade é uma propriedade inerente de proteínas dobradas deficientemente. De acordo com a presente invenção este é um mecanismo comum para estas doenças conformacionais1.

Uma estrutura β cruzada é um elemento de estrutura secundária em péptidos ou proteínas. Pode ser formada uma estrutura β cruzada após desnaturação, proteólise ou desdobragem de proteínas2. Estes elementos de estrutura secundária estão tipicamente ausentes nas regiões globulares das proteínas. A estrutura β cruzada encontra-se em fibrilhas amilóides. Os péptidos ou proteínas amilóides são citotóxicos para as células. Uma estrutura β cruzada é composta por folhas β empilhadas. Numa estrutura β cruzada as cadeias β individuais, correm ou perpendicular ao eixo longo de uma fibrilha, ou as cadeias β correm em paralelo com o eixo longo de uma fibra. A direcção do empilhamento das folhas β nas estruturas β cruzadas é perpendicular ao eixo longo da fibra.

Relata-se aqui que a glicação das proteínas também induz a formação da estrutura β cruzada. Os nossos resultados, combinados com a informação existente na literatura indicam que uma estrutura comum é induzida após a desdobragem das proteínas globulares. Por isso, a presente invenção revela uma nova via envolvendo estrutura β cruzada, cuja via será denominada "via da estrutura β cruzada". Esta via consiste em várias proteínas de ligação de estrutura β cruzada, incluindo os denominados receptores 3 ΡΕ1536778 multi-ligando e está envolvida na degradação de proteína e/ou eliminação de proteína. Também relatámos a identificação de novas proteínas de ligação cruzada β que contêm um módulo de ligação de estrutura β cruzada. Estas descobertas suportam a identificação de uma via de estrutura β cruzada. Aspectos múltiplos desta nova via são delineados abaixo.

Por exemplo, a presente invenção revela que as proteínas proteolisadas, desnaturadas, desdobradas, glicadas, oxidadas, acetiladas ou de outra forma estruturalmente alteradas adoptam estruturas β cruzadas. Exemplos de proteínas conhecidas que formam estrutura β cruzada são todas as proteínas que provocam amiloidose ou proteínas que se encontram em depósitos amilóides relacionados com a doença, por exemplo, mas não restritos a, β-amilóide de Alzheimer (Αβ) e polipéptido de Ilha Amilóide (IAPP). A presente invenção revela que a fibrina, proteínas glicadas (por exemplo albumina glicada e hemoglobina glicada) e a endostatina são também capazes de adoptar uma estrutura β cruzada. A invenção revela ainda a identificação da formação de uma estrutura β cruzada como um sinal para degradação de proteína e/ou eliminação de proteína.

Um activador de plasminogénio de tecido de protease serínica (tPA) induz a formação de plasmina através da clivagem de plasminogénio. A plasmina cliva a 4 ΡΕ1536778 fibrina e isto ocorre durante a lise de um coágulo de sangue. Embora não essencial para a fibrinólise em ratinhos8’4, tPA foi reconhecido pelo seu papel na fibrinólise durante um tempo longo5’’6. A activação de plasminogénio por tPA é estimulada por fibrina ou fragmentos de fibrina, mas não pelo seu precursor, o f ibrinogénio7”10. Isto pode ser explicado em parte pela forte ligação de tPA à fibrilha e fraca ligação ao

fibrinogénio. Os sitios de ligação na fibrina e em tPA responsáveis pela ligação e activação de tPA foram mapeados e estudados em detalhe8”21. Todavia, a base estrutural exacta para a interacção de tPA com fibrina era desconhecida. Adicionalmente à fibrina e fragmentos de fibrina, foram descritas muitas outras proteínas que são de um modo semelhante capazes de ligação a tPA e estimular a formação de plasmina mediada por tPA22"36. Tal como com fibrina e fragmentos de fibrina, a natureza exacta da(s) interacção(ões) entre estes ligandos para tPA e tPA não era conhecida. Para além disso, era desconhecido porquê e como todas estas proteínas, que não possuem homologia de sequência primária, se ligam a tPA. É revelado activador de plasminogénio de tipo de tecido (tPA) como uma proteína capaz de se ligar a estruturas β cruzadas. Para além disso, a invenção revela o domínio de dedo (também denominado domínio de fibronectina tipo I) e outros domínios de dedo comparáveis como um módulo de ligação a estrutura β cruzada. A presente invenção revela ainda que as proteínas que se ligam a estes dedos serão tipicamente capazes de formar estruturas β cruzadas. 5 ΡΕ1536778

Uma vez que a fibrina contém a estrutura β cruzada, a presente invenção também revela que a criação de estruturas β cruzadas desempenha um papel em processos fisiológicos. A invenção revela que a criação de estruturas β cruzadas é parte de uma via de sinalização, a "via de estrutura cruzada", que regula a degradação da proteína e/ou a eliminação da proteína. A função inadequada desta via pode resultar no desenvolvimento de doenças, tais como doenças conformacionais87 e/ou amiloidose. A presente invenção, para além disso, revela que a estrutura β cruzada é um denominador comum em ligandos para preceptores multi-ligando88. A invenção revela por isso que os receptores multi-ligando pertencem à "via da estrutura β cruzada". 0 exemplo melhor estudado de um receptor para uma estrutura β cruzada é RAGE89" 44. Exemplos de ligandos para RAGE são Αβ, adutos de produtos finais de glicação avançada de proteína (AGE) (incluindo BSA glicada), anfoterina e S100. RAGE é um membro de uma família maior de receptores de multi-ligando98, que inclui vários outros receptores, alguns dos quais, incluindo CD36, são conhecidos por ligarem proteínas contendo estrutura β cruzada (ver também figura 1) . Presentemente não é claro qual é a natureza exacta da estrutura ou estruturas que está nos ligandos destes receptores que medeiam a ligação a estes receptores. Relatamos aqui que a glicação de proteínas também induz a 6 ΡΕ1536778 formação de uma estrutura β cruzada. Por isso, revelámos que todos estes receptores fazem parte de um mecanismo para lidar com a destruição e remoção de proteínas ou agentes indesejados ou mesmo lesivos. Estes receptores desempenham um papel no reconhecimento de agentes infecciosos ou células, reconhecimento de células apoptóticas e na internalização de complexos de proteína e/ou patogénios. É, para além disso, revelado que todos esses receptores reconhecem a mesma estrutura ou semelhante, a estrutura β cruzada, para responder a moléculas indesejadas. Foi demonstrado que tPA se liga a estruturas β cruzadas, fornecendo evidência de que tPA pertence à família do receptor multi-ligando. Como aqui revelado, tPA e os outros receptores multi-ligandos ligam-se à estrutura β cruzada e participam na destruição de biomoléculas indesejadas. Um papel proeminente da protease tPA na via reside na sua capacidade para iniciar uma cascata proteolítica que inclui a formação de plasmina. É provável que a proteólise seja essencial para a degradação e subsequente remoção de componentes da matriz extracelular. 0 efeito de tPA na matriz extracelular irá afectar a adesão celular, a migração celular, a sobrevivência celular e a morte celular, através de, por exemplo, processos mediados pela integrina. Com base nos nossos estudos, proporcionámos forte evidência de que pelo menos três outras proteínas, FXII a.k.a. FXII (factor XII), activador do factor de crescimento do hepatócito (HGFa) e fibronectina, que contém um ou mais domínio(s) de dedo, são também parte da "via da estrutura β cruzada". 7 ΡΕ1536778

Especialmente o papel de FXII é importante, uma vez que activa a via da coagulação intrínseca. A activação da via intrínseca, e a formação resultante de péptidos vasoactivos e a activação de outras proteínas importantes contribuem para o processe de protecção e/ou eliminação de proteínas ou agentes indesejados. A "via da estrutura β cruzada" é modulada de muitas maneiras. Factores que regulam a via incluem moduladores de síntese e secreção, assim como moduladores de actividade. A via está envolvida em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por isso, um método para modular a degradação de proteína extracelular e/ou a eliminação de proteína compreendendo modular a actividade de um receptor para proteínas que formam estrutura β cruzada é, para além disso, revelada. Exemplos de receptores para proteínas que formam estrutura β cruzada incluem RAGE, CD36, Proteína Relacionada com lipoproteína de baixa densidade (LRP), Receptor de Eliminador B-l (SR-BI), SR-A. A invenção revela que FXII, HGFa e fibronectina são também receptores para estrutura β cruzada. É revelado que o activador de plasminogénio do tipo de tecido (tPA) é uma proteína de ligação de estrutura β cruzada, um receptor multi-ligando e um membro da "via da estrutura β cruzada". É revelado que o tPA medeia disfunção celular induzida por estrutura β cruzada e/ou toxicidade celular. É revelado que o tPA medeia, pelo menos em parte, a disfunção e/ou toxicidade celular através da activação de plasminogénio. Os efeitos dependentes de plasminogénio são inibidos pela actividade B de carboxipeptidase de tipo B e ΡΕ1536778 desse modo é revelado um papel para os resíduos de lisina carboxiterminais na via da estrutura β cruzada. A presente revelação refere-se, entre outros, à(s) estrutura (s) na fibrina e outras proteínas que se ligam o tPA, ao domínio de ligação no tPA e à(s) via(s) reguladas por esta estrutura. A presença das estruturas β cruzadas nas proteínas e péptidos que são capazes de se ligar a tPA é revelada. Os resultados aqui revelados indicam uma forte correlação entre a presença de uma estrutura β cruzada e a capacidade de uma molécula para se ligar a tPA. Para além disso, os resultados indicam a presença de uma estrutura amilóide em fibrina. Isto indica que a estrutura β cruzada se pode formar em condições fisiológicas, um fenómeno que não era previamente reconhecido. A formação de estruturas β cruzadas foi até agora apenas associada a distúrbios patológicos graves. 0 tPA liga-se a proteinas desnaturadas, o que indica que um grande número das proteínas, se não todas as proteínas, podem adoptar uma conformação contendo estrutura β cruzada ou estrutura(s) de tipo β cruzada(s). Tomados em conjunto, a formação das estruturas β cruzadas é provável que inicie e/ou participe numa cascata de eventos fisiológicos, necessários para lidar adequadamente com a remoção de moléculas indesejadas, i.e. f proteinas mal dobradas, células apoptóticas ou mesmo patogénios. A Figura 1 apresenta uma representação esquemática da "via da estrutura β cruzada". Esta via regula a remoção de biomoléculas indesejadas durante vários processos incluindo 9 ΡΕ1536778 fibrinólise, formação de redes sinápticas neuronais, eliminação de proteínas utilizadas, indesej adas e/ou destruídas (desnaturadas) , indução de apoptose e a eliminação de células apoptóticas e patogénios. Se insuficientemente ou incorrectamente regulada ou desequilibrada, a via pode conduzir a doença grave. É revelado um modo de modulação de degradação de proteina extracelular e/ou eliminação de proteína compreendendo modular a formação da estrutura β cruzada (e/ou actividade mediada pela estrutura β cruzada) da referida proteína presente na circulação.

Existem dois padrões principais de dobragem de proteína regular, que são conhecidos como as folhas β e a hélice a. Uma folha β antiparalela é formada quando uma cadeia de polipéptidos estendida se dobra para a frente e para trás sobre si própria, com cada secção das cadeias a correr na direcção oposta à dos seus vizinhos imediatos. Isto produz uma estrutura mantida unida por pontes de hidrogénio que ligam as ligações peptídicas nas cadeias vizinhas. As regiões de uma cadeia polipeptídica que correm na mesma direcção formam uma folha β paralela. A estrutura β cruzada é composta de folhas β empilhadas. Numa estrutura β cruzada as cadeias β individuais, correm perpendicularmente ao eixo longo de uma fibrilha ou as cadeias β correm em paralelo ao eixo longo de uma fibra. A direcção do empilhamento das folhas β nas estruturas β cruzadas é perpendicular ao eixo longo da fibra. Como aqui revelado na 10 ΡΕ1536778 parte experimental, uma gama larga de proteínas é capaz de adoptar a estrutura β cruzada e para além disso, esta estrutura β cruzada compreendendo proteínas são bem capazes de ligar e estimular tPA e desse modo promover a destruição de proteínas ou agentes indesejados ou lesivos.

Uma proteína extracelular é tipicamente definida como uma proteína presente fora de uma célula ou células. A degradação da proteína e/ou a eliminação de proteína inclui a quebra e remoção de proteínas indese-jadas, por exemplo proteína indesejada e/ou destruída (por exemplo desnaturada). É também incluída a remoção de biomo-léculas indesejadas durante vários processos, incluindo fibrinólise, formação de redes sinápticas neuronais, eliminação de proteínas utilizadas, indesejadas e/ou destruídas (desnaturadas), indução de apoptose e eliminação de células apoptóticas e patogénios. O termo "na circulação" é aqui definido como uma circulação fora de uma célula ou células, por exemplo, mas não restrito ao movimento contínuo de sangue. É aqui revelado um modo de diminuição da degradação da proteína extracelular e/ou a eliminação de proteína compreendendo proporcionar um composto capaz de diminuir a formação da estrutura β cruzada da referida proteína presente na circulação. A diminuição da formação da estrutura β cruzada é, por exemplo, realizada através da 11 ΡΕ1536778 protecção ou bloqueamento dos grupos envolvidos na formação da estrutura β cruzada. Exemplos de compostos capazes de diminuir a formação de estrutura β cruzada são os anticorpos. É ainda revelado um modo para modular a degradação da proteína extracelular e/ou a eliminação de proteína compreendendo modular tPA, ou actividade de tipo tPA. 0 tPA induz a formação de plasmina através da clivagem do plasminogénio. A plasmina cliva a fibrina e isto ocorre durante a lise de um coágulo sanguíneo. A activação do plasminogénio por tPA é estimulada pela fibrina ou fragmentos de fibrina, mas não pelo seu precursor f ibrinogénio. 0 termo "actividade de tipo tPA" é aqui definido como um composto capaz de induzir a formação de plasmina, possivelmente em quantidades diferentes, e/ou outras actividades mediadas por tPA. Preferencialmente, a actividade de tipo tPA é modificada de modo a que possua uma actividade superior ou afinidade para o seu substrato e/ou um cofactor. Isto é realizado, por exemplo, proporcionando a referida actividade de tipo tPA com múltiplos domínios de ligação para proteínas compreendendo estrutura β cruzada. Preferencialmente, a referida actividade de tipo tPA é proporcionada com múltiplos domínios de dedo. É aqui revelado que as estruturas tridimensionais do domínio de dedo de tPA e os domínios de dedo de fibronectina 4-5 revelam uma homologia estrutural impressionante em relação à carga local-distribuição de densidade. Ambas as estruturas contêm uma porção semelhante exposta ao solvente 12 ΡΕ1536778 de cinco resíduos de aminoácidos com carga alternada; para tPA Arg7, Glu9, Arg23, Glu32, Arg30, e para fibronectina Arg83, Glu85, Lys87, Glu89, Arg90, localizados no quinto domínio de dedo, respectivamente. Os alinhamentos de resíduos carregados estão localizados no mesmo lado do módulo de dedo. Assim, preferencialmente, a actividade de tipo tPA é proporcionada com um ou mais domínio(s) de dedo extra que compreende(m) ArgXGlu(X)13Arg(X)8GluXArg ou ArgXGluXLysXGluArg.

Um fragmento funcional e/ou um equivalente funcional é tipicamente definido como um fragmento e/ou um equivalente capaz de realizar a mesma função, possível em quantidades diferentes. Por exemplo, um fragmento funcional de um anticorpo capaz de se ligar a uma estrutura β cruzada seria o fragmento Fab' do referido anticorpo. É entendido que o aumento de interacção entre um composto compreendendo uma estrutura β cruzada e um composto compreendendo actividade de tipo tPA é também realizado através de mutações quer no composto compreendendo uma estrutura β cruzada ou no composto compreendendo actividade de tipo tPA, como troca de domínios (por exemplo proporcionando o referido composto compreendendo actividade de tipo tPA com outros ou mais domínios de dedo (que se podem obter a partir de fibronectina, FXII ou HGFa). A presente invenção revela ainda a utilização de uma nova estratégia para prevenir a formação ou para 13 ΡΕ1536778 decrescer/diminuir as placas (amilóides) envolvidas numa doença conformacional, diabetes de tipo II e/ou envelhecimento (e.g., doença de Alzheimer) . As placas são tipicamente definidas como depósitos de proteína fibrilhar extracelular (agregados fibrilhares) e são características de doenças degenerativas. As propriedades "nativas" das proteínas amilóides constituintes podem variar: algumas são oligómeros solúveis in vivo (e.g. transtiretina em polineuropatia amilóide familiar), enquanto que outros são péptidos flexíveis (e.g., amilóide-b na doença de Alzheimer (AD) ) . A patogénese básica de doenças conformacionais, por exemplo pensa-se que os distúrbios neurodegenerativos (AD, distúrbios de priões) estejam relacionados com a conformação de proteína patológica anormal, í. e, a conversão de uma proteína de circulação celular normal e/ou em circulação numa forma insolúvel, agregada, rica em estrutura β que está depositada no cérebro. Estes depósitos são tóxicos e produzem disfunção neuronal e morte. A formação de estruturas β cruzadas tem estado até agora apenas associada a distúrbios patológicos graves. Os nossos resultados, demonstram que o tPA e outros receptores para proteínas que formam estrutura β cruzada se podem ligar a proteínas desnaturadas, indicando que um grande número de proteínas são capazes de adoptar uma conformação contendo estruturas β cruzadas ou de tipo β cruzadas. Tomados em conjunto, a formação de uma estrutura β cruzada inicia ou participa numa cascata fisiológica de eventos, necessários para lidar adequadamente com a remoção de moléculas indesejadas, i.e., proteínas mal dobradas, células apoptóticas ou mesmo 14 ΡΕ1536778 patogénios. Aumentando a formação de estrutura β cruzada numa proteína envolvida numa doença conformacional, a via para a degradação da proteína e/ou a eliminação de proteína é activada e a referida proteína é degradada, resultando numa placa decrescente ou mais preferencialmente a referida placa é completamente removida. Assim, os efeitos da doença conformacional são diminuídos ou, mais preferencialmente, completamente abolidos.

Numa forma de realização a invenção proporciona uma utilização de um composto capaz de se ligar a uma estrutura β cruzada para a preparação de um medicamento para diminuir as proteínas não dobradas que tenham adoptado uma conformação parcialmente estruturada, envolvida numa doença conformacional, em que o referido composto é um anticorpo ou compreende um domínio de dedo, em que o referido domínio de dedo é derivado de fibronectina, FXII ou HGFa, e em que a referida doença é uma doença caracte-rizada por amilóide, aterosclerose, diabetes, hemorragia, trombose, cancro, sepsia, Esclerose Múltipla, doenças auto-imunes, artrite reumatóide, doença associada a perda de memória ou doença de Parkinson e/ou epilepsia.

Exemplos desses anticorpos são 4B5 ou 3H7.

Preferencialmente, o referido domínio de dedo compreende uma porção de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos com carga alternada, por exemplo ArgXGlu (X) 13Arg (X) 8GluXArg ou ArgXGluXLysXGluArg. Ainda mais preferencialmente, o referi- 15 ΡΕ1536778 do domínio de dedo é derivado de fibronectina, FXII, ou HGFa.

Noutra forma de realização preferida a referida proteína é um anticorpo. É também revelada a utilização de um composto capaz de aumentar ou estabilizar uma interacção de um composto compreendendo uma estrutura β cruzada e um composto compreendendo actividade de tipo tPA para diminuir placas envolvidas numa doença conformacional. São aqui apresentados exemplos de um composto capaz de aumentar ou estabilizar uma interacção de um composto compreendendo uma estrutura β cruzada e um composto compreendendo actividade de tipo tPA. É apresentada a utilização preferencial de acordo com a invenção, em que a referida doença conformacional é Alzheimer ou diabetes. É claro que uma invenção não apenas proporciona uma utilização para decrescer/dimi-nuir placas envolvidas numa doença conformacional mas que o início da referida doença possa também ser inibida ou mais preferencialmente completamente prevenida. Exemplos de doenças que podem ser prevenidas e/ou tratadas de acordo com a invenção são doença conformacional, doenças tipo amiloidose, aterosclerose, diabetes, hemorragia, trombose, cancro, sepsia e outras doenças inflamatórias, Esclerose Múltipla, doenças auto-imunes, doença associada com perda de memória ou Parkinson e outras doenças neuronais (epilepsia) . 16 ΡΕ1536778

Dado que a invenção tornou claro que a estrutura β cruzada é lesiva quando presente em certas partes do corpo, como por exemplo o cérebro, e a lesão é efectuada pela combinação de estruturas β cruzadas com tPA, é proporcionado um modo para inibir os efeitos mediados pela estrutura β cruzada compreendendo proporcionar uma quantidade eficaz de uma proteína compreendendo um domínio de dedo para bloquear os sítios de ligação da estrutura β cruzada para tPA.

Noutra forma de realização, o efeito mediado pela estrutura β cruzada local pode ser utilizado contra tumores.

Descrição Detalhada São revelados (i) a identificação de uma "via da estrutura β cruzada", (ii) a identificação de receptores multi-ligando como sendo receptores de estrutura β cruzada, (iii) a identificação do domínio de dedo como um módulo de ligação β cruzada e (iv) a identificação de proteínas contendo dedo, incluindo tPA, FXII, HGFa e fibronectina como parte da "via da estrutura β cruzada. São ainda proporcionados compostos não previa-mente conhecidos por se ligarem a estrutura β cruzada.

Como aqui revelado, são proporcionados compostos e tratamentos de doenças associadas com a formação 17 ΡΕ1536778 excessiva de estrutura β cruzada. Essas doenças incluem doenças conformacionais conhecidas, incluindo doença de Alzheimer e outros tipos de amiloidose. Todavia, a nossa invenção revela também que outras doenças, ainda não conhecidas como estando associadas com a formação excessiva de estrutura β cruzada são também provocadas pela formação excessiva de estrutura β cruzada. Essas doenças incluem aterosclerose, sepsia, coagulação intravascular difusa, sindrome urémica hemolitica, pré-eclampsia, artrite reumatóide, doenças auto-imunes, trombose e cancro. 0 composto é uma molécula de ligação a estrutura β cruzada, preferencialmente um domínio de dedo ou uma molécula contendo um ou mais domínios de dedo, ou é um análogo peptidomimético de um ou mais domínios de dedo. 0 composto pode também ser um anticorpo ou um seu fragmento funcional dirigido para a estrutura β cruzada.

Os domínios de dedo, moléculas contendo dedo ou anticorpos podem ser humanos, de ratinho, rato ou de qualquer outra espécie.

De acordo com a invenção, os aminoácidos das respectivas proteínas podem ser substituídos por outros aminoácidos que podem aumentar/diminuir a afinidade, a potência, biodisponibilidade e/ou semi-vida do péptido. Alterações incluem substituições convencionais (ácido-ácido, volumoso-volumoso e semelhantes) , introduzindo D-aminoácidos, formando péptidos cíclicos, etc. 18 ΡΕ1536778

Para além disso são proporcionados compostos e modos: 1) para inibir a formação de fibrilhas amilóides. 2) para modular toxicidade induzida por estrutura β cruzada. 3) para a remoção de moléculas contendo estrutura β cruzada da circulação. São proporcionados compostos e modos de preparação de uma composição para inibir a formação de fibrilhas de estrutura β cruzada. São proporcionados compostos e modos de preparação de uma composição para modular a toxicidade induzida pela estrutura β cruzada.

Abreviaturas: Αβ, péptido beta-amilóide; AD, doença de Alzheimer; AGE, produtos finais de glicação avançada; CpB, carboxipeptidase B; COI (inibidor de carboxipeptidase); ELISA, ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA); FN, fibronectina; FXII, factor XII (factor Hageman); HGFa, activador do factor de crescimento do hepatócito; LAPP, polipéptido de ilha amilóide; PCR, reacções da polimerase em cadeia (PCR); RAGE, receptor para AGE; tPA, activador de plasminogénio do tipo de tecido. A invenção proporciona a utilização de compostos como definido na reivindicação 1 para o tratamento de 19 ΡΕ1536778 doenças associadas com a formação excessiva de estrutura β cruzada, como definido na reivindicação 1. A estrutura β cruzada pode ser parte de uma fibrilha Αβ ou parte de outra fibrilha amilóide. A estrutura β cruzada pode também estar presente em desnaturadas. É aqui proporcionado um modo de inibir a formação de fibrilhas amilóides ou de modular a toxicidade induzida pela estrutura β cruzada. Os compostos são uma molécula de ligação β cruzada, preferencialmente um domínio de dedo, uma molécula contendo domínio de dedo, um análogo peptidomimético, e/ou um anticorpo anti-estrutura β cruzada, ou um fragmento deste. A inibição da formação de fibrilha possui preferencialmente a consequência de diminuir a carga de fibrilhas. A inibição da formação de fibrilhas ou a modulação da toxicidade da estrutura β cruzada pode também possuir a consequência de modular a morte celular. A célula pode ser qualquer célula, mas preferencialmente é uma célula neuronal, uma célula endotelial, ou uma célula tumoral. A célula pode ser uma célula humana ou uma célula de qualquer outra espécie. A célula pode estar tipicamente presente num 20 ΡΕ1536778 indivíduo. O indivíduo ao qual o composto é administrado pode ser um mamífero ou preferencialmente um humano. O indivíduo pode sofrer de amiloidoses, de outra doença conformacional, de doença de prião, de falência renal crónica e/ou amiloidose relacionada com diálise, de ateroscleroses, de doença cardiovascular, de doença autoimune, ou o indivíduo pode ser obeso. O indivíduo pode também sofrer de inflamação, artrite reumatóide, diabetes, retinopatia, sepsia, coagulação intravascular difusa, síndrome urémica hemolítica, e/ou pré-eclampsia. As doenças que podem ser tratadas ou prevenidas incluem diabetes, doença de Alzheimer, senilidade, falência renal, ateros-clerose hiperlipidémica, citotoxicidade neuronal, síndrome de Down, demência associada a traumatismo craniano, escle-rose lateral amiotrópica, esclerose múltipla, amiloidose, uma doença autoimune, inflamação, um tumor, cancro, impotência masculina, cicatrização de feridas, doença periodontal, neuropatia, retinopatia, nefropatia ou degeneração neuronal. A administração de compostos de acordo com a invenção pode ser constante ou durante um certo período de tempo. O composto pode ser distribuído a intervalos de horas, diariamente, semanalmente, mensalmente (e.g., numa forma de libertação temporal) ou como uma única distribuição no tempo. A distribuição pode também ser contínua, e.g., distribuição intravenosa. 21 ΡΕ1536778

Pode ser utilizado um veiculo. 0 veiculo pode ser um diluente, um aerossol, uma solução aquosa, uma solução não aquosa ou um veiculo sólido. São também reveladas composições farmacêuticas incluindo quantidades terapeuti-camente eficazes de composições de polipéptidos e compostos, juntamente com diluentes, conservantes, solubilizado-res, emulsificadores, adjuvantes e/ou veículos adequados. Essas composições podem ser líquidas ou liofilizadas ou formulações secas por qualquer outro modo e incluem diluentes de vários teores de tampão (e.g., Tris-HCl., acetato, fosfato), pH e força iónica, aditivos tais como albumina ou gelatina para prevenir a absorção a superfícies, detergentes (e.g., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácido biliar), agentes solubilizantes (e.g., glicerol, polietilenoglicerol), antioxidantes (e.g., ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (e.g., Timerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias de aumento de volume ou modificadores de tonicidade (e.g., lactose, manitol), ligação covalente de polímeros tais como poli-etilenoglicol ao composto, complexação com iões metálicos, ou incorporação do composto para ou em preparações parti-culadas de compostos poliméricos, tais como ácido poli-láctico, ácido polglicólico, hidrogéis, etc, ou em lipos-somas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócitos, ou esferoplastos. A administração de compostos de acordo com a invenção pode compreender injecção intralesional, intrape-ritoneal, intramuscular ou intravenosa; infusão; distribui- 22 ΡΕ1536778 ção mediada por lipossomas; tópica, intratecal, bolsa gengival, pelo recto, intrabronquial, nasal oral, ocular ou ótica. Noutra forma de realização, a administração inclui administração intrabronquial, administração anal, intratecal ou distribuição transdérmica.

De acordo com a invenção os compostos podem ser administrados de hora a hora, diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente. Noutra forma de realização, a quantidade eficaz do composto compreende desde 0,000001 mg/kg de peso corporal até 100 mg/kg de peso corporal.

Os compostos de acordo com a invenção podem ser distribuídos localmente através de uma cápsula que permite a libertação sustentada do agente ao longo de um período de tempo. Composições de libertação controlada ou sustentada incluem formulação em depósitos lipofílicos (e.g., ácidos gordos, ceras, óleos). São também incluídas na invenção composições particuladas revestidas com polímeros (e.g., poloxâmeros ou poloxaminas) e o agente acoplado aos anticorpos dirigidos contra receptores específicos para o tecido, ligandos ou antigénios ou acoplados a ligandos de receptores específicos para o tecido. Outras formas de realização das composições da invenção incorporam revestimentos protectores de formas particuladas, inibidores de protease ou intensificadores de permeação para várias vias de administração, incluindo parentérica, pulmonar, nasal e oral. 23 ΡΕ1536778 A quantidade eficaz dos compostos de acordo com a invenção compreende preferencialmente 1 ng/kg de peso corporal até 1 gr/kg de peso corporal. A quantidade eficaz actual será baseada no tamanho do composto e nas suas propriedades.

Dado que esta invenção tornou claro que as estruturas β cruzadas são lesivas quando presentes em certas partes do corpo, como por exemplo o cérebro, e a lesão é efectuada pela combinação de estruturas β cruzadas com tPA, é proporcionado um modo para inibir os efeitos mediados pela estrutura β cruzada compreendendo proporcionar uma quantidade eficaz de uma proteína compreendendo um domínio de dedo para bloquear os sítios de ligação da estrutura β cruzada para tPA. A invenção proporciona a utilização de um composto capaz de se ligar a uma estrutura β cruzada para a remoção de estruturas β cruzadas. 0 referido composto é uma molécula de ligação β cruzada, preferencialmente uma proteína como definido na reivindicação 1.

Preferencialmente, o referido composto compreende um domínio de dedo ou uma molécula contendo domínio de dedo. Ainda mais preferencialmente, o referido domínio de dedo é derivado de fibronectina, FXII, ou HGFa. É claro que a invenção também compreende anticorpos que se ligam a estruturas β cruzadas. Noutra forma de realização preferida a referida proteína é um anticorpo. 24 ΡΕ1536778

Como aqui utilizado "dedo" compreende uma sequência que cumpre os critérios delineados na Figura 14. A sequência compreende aproximadamente 50 aminoácidos, contendo 4 resíduos de cisteína a espaçamentos distintos. Os domínios de dedo de FXII, HGFa ou fibronectina são utilizados. O âmbito da invenção é definido nas reivindicações anexas.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes

Albumina de soro bovino (BSA) fracção V pH 7,0 e D-glucose-6-fosfato di-sódio (g6p) , D, L-gliceraldeído, e lisozima da clara de ovo de galinha foram adquiridos a ICN (Aurora, Ohio, EUA). Activador de plasminogénio do tipo de tecido anti-recombinante de coelho (tPA) 385R e anti-recombinante de ratinho tPA 374B foram adquiridos a American Diagnostica (Veenendaal, Holanda). Anti-laminina (L9393) foi de Sigma. Imunoglobulinas anti-coelho de suíno/HRP (SWARPO) e imunoglobulinas anti-ratinho de coelho/HRP (RAMPO) foram de DAKO Diagnostics B.V. (Holanda) . Alteplase (activador de plasminogénio do tipo de tecido recombinante, tPA) foi obtido de Boehringer-Ingelheim (Alemanha). Reteplase (Rapilisina), um tPA mutan-te recombinante contendo apenas kringle2 e o domínio 25 ΡΕ1536778 catalítico (K2P-tPA) foi obtido de Roche, Hertfordshire, Reino Unido, e a carboxipeptidase B de pâncreas porcino (CpB) foi de Roche, Mannheim, Alemanha. 0 inibidor da carboxipeptidase (CPI) foi de Calbiochem ( LcL Jolla, CA, USA) . 0 Tween20 foi adquirido de Merck-Schuchardt (Hohenbrunn, Alemanha). 0 vermelho de Congo foi obtido de

Aldrich (Milwaukee, WI, EUA). Tioflavina T e hemoglobina humana liofilizada (Hb) foram de Sigma (St. Louis, MO, EUA). 0 fibrinogénio humano liofilizado foi de Kordia (Leiden, Holanda). 0 substrato de plasmina cromogénico S- 2251 foi adquirido a Chromogenix (Milão, Itália). Os oligonucleótidos foram adquiridos de Sigma-Genosys (Reino Unido) . Os capilares de Boro vidro (0,5 mm 0) foram de Mueller (Berlim, Alemanha). Péptidos sintéticos O péptido Αβ (1-40), contendo aminoácidos como presente no péptido descrito para Alzheimer humano (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV), péptidos de fibrina 85 (ou FP13) (KRLEVDIDIKIRS) , 86 (ou FP12) (KRLEVDIDIKIR) e 87 (ou FP10) (KRLEVDIDIK), derivados da sequência de fibrina(ogénio) humano e o péptido ou derivados do polipéptido da ilha amilóide (LAPP) (fl-hIAPP: KCNTATCATQRLANFLVHS SNNFGAILS S TNVGSNTY, DhIAPP (SNNFGAILSS) , DmIAPP (SNNLGPVLPP) foram obtidos de Pepscan, Inc. (Holanda) ou da instituição de síntese de péptidos no Instituto do Cancro da Holanda (NCI, Amsterdão, Holanda). Os péptidos foram dissolvidos em soro fisiológico tamponado 26 ΡΕ1536778 com fosfato (PBS) para uma concentração final de 1 mg mL"1 e armazenados durante três semanas à temperatura ambiente (RT) para permitir a formação de fibrilhas. Durante este período, a suspensão foi vortexadas duas vezes semanalmente. Após três semanas, a suspensão foi armazenada a 4 °C. Αβ liofilizado (1-40) a partir da NCI permitiu formar estrutura β cruzada do mesmo modo. A formação de estruturas β cruzadas foi seguida no tempo pelo exame de ligação a vermelho do Congo e birefringência verde sob luz polarizada .

Ligação de vermelho do Congo e fluorescência de tioflavina T de um coágulo de fibrina

Para as medições de fluorescência com tioflavina T de 1 mg mL”1 de fibrinogénio foi incubado a 37 °C com 2 U mL-1 de factor lia em NaCl a 150 mM, Tris-HCl a 20 mM pH 7,5, CaCl2 a 10 mM, Tioflavina T a 50 μΜ. A fluorescência de fundo de um coágulo foi registada na ausência de Tioflavina T e a fluorescência de Tioflavina T de fundo foi medida na ausência de factor lia. A fluorescência foi medida num espectrofotómetro de fluorescência Hitachi F-4500 (Ltd., Tóquio, Japão), utilizando cuvetes Sarstedt REF67.754. Condições do aparelho: excitação a 435 nm (entrada 10 nm), emissão a 485 nm (entrada 10 nm), voltagem PMT 950 V, tempo de medição 10", atraso 0". Para a detecção da ligação ao vermelho do Congo um coágulo de fibrina foi formado à temperatura ambiente como descrito acima (foi omitido tioflavina T no tampão). O coágulo foi incubado com 27 ΡΕ1536778 solução de vermelho do Congo e lavado de acordo com as recomendações do fabricante (Sigma Diagnostics, MO, EUA). 0 coágulo foi analisado sob luz polarizada.

Preparação inicial de albumina glicada, hemoglobina (Hb) e lisozima

Para a preparação de albumina de soro bovino modificada por glicação avançada do produto final (albumina-g6p) , foi incubado 100 mg mL'1 de albumina com PBS contendo 1 M de g6p e 0,05% m/v NaN3, a 37 °C na escuridão. Uma solução de albumina foi glicada durante duas semanas, um lote diferente de albumina foi glicado durante quatro semanas. A glicação foi prolongada até 23 semanas com parte do último lote. Foi incubado Hb Humano a 5 mg mL"1 durante 10 semanas a 37 °C com PBS contendo 1 M de g6p e 0,05% m/v de NaN3. Adicionalmente, uma solução de Hb de 50 mg mL'1 foi incubada durante oito semanas com o mesmo tampão. Para a preparação de albumina modificada com gliceraldeido (albumina-gliceraldeido) e lisozima de clara de ovo de galinha (lisozima-gliceraldeído), foram incubadas soluções de proteína esterilizadas por filtro de 15 mg mL'1 durante duas semanas com PBS contendo 10 mM de glice-raldeído. Nos controlos, g6p ou gliceraldeido foi omitido nas soluções. Após as incubações, as soluções de albumina e lisozima foram dialisadas extensivamente contra água destilada e, subsequentemente, armazenadas a -20 °C. As concentrações de proteína foram determinadas com Advanced protein-assay reagent ADV01 (Cytoskeleton, Denver, CO, 28 ΡΕ1536778 EUA). A glicação foi confirmada medindo sinais de fluorescência intrínseca a partir de produtos finais de glicação avançada; comprimento de onda de excitação de 380 nm, comprimento de onda da emissão de 435 nm.

Outra experiência envolvendo glicação

Para preparação de albumina-AGE, foram incubados 100 mg mL"1 de albumina de soro bovino (fracção V, N° catálogo # A-7906, fraccionamento inicial através de choque térmico, pureza ^98% (por electroforese), sendo o restante principalmente globulinas, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 37 °C na escuridão, com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, cloreto de sódio a 140 mM, cloreto de potássio a 2,7 mM, fosfato de hidrogénio di-sódico a 10 mM, di-hidrogenofosfato de potássio a 1,8 mM, pH 7,3), 1 M de D-glucose-6-fosfato di-sódico sal de hidrato (anidro) (ICN, Aurora, Ohio, EUA) e 0,05% (m/v) NaN3. A albumina bovina possui 83 sítios de glicação potenciais (59 resíduos de lisina e 23 resíduos de arginina, terminal N) . A albumina foi glicada durante duas semanas (albumina-AGE:2) , quatro semanas (albumina-AGE:4) ou 23 semanas (albumina-AGE:23). Nos controlos, foi omitida g6p. Após incubação, as soluções foram extensivamente dialisadas contra água destilada e, subsequentemente, armazenadas a 4 °C. As concentrações de proteína foram determinadas com advanced protein-assay reagent ADV01 (Cytoskeleton, CO, USA). Alternativamente, a albumina foi incubada durante 8 6 semanas com 1 M g6p, 250 mM de DL-gliceraldeído (ICN, Aurora, Ohio, EUA)/100 mM 29 ΡΕ1536778

NaCNBH3, 1 M de β-D-(-)-frutose (ICN, Aurora, Ohio, EUA), 1 M D(+)-glucose (BDH, Poole, Inglaterra), 500 mM de ácido glioxílico mono-hidratado (ICN, Aurora, Ohio, EUA)/100 mM NaCNBH3, e aos correspondentes controlos de tampão PBS e PBS/NaCNBH3. A glicação foi confirmada (i.) através da observação de coloração castanha intensa, (ii.) através da presença de multimeros em géis de SDS-poliacrilamida, (iii) através do ensaio da ligação de anticorpos específicos para AGE moab anti-albumina-g6p 4B546 e poab anti-fibronectina-g6p (Ph. De Groot/I. Bobbink, UMC Utrecht; resultados não publicados), e (iv.) através da medição de sinais fluorescentes intrínsecos de AGE (comprimento de onda de excitação 38 0 nm, comprimento de onda de emissão 445 nm) . Os sinais autofluorescentes de controlos de albumina foram menos de 4% dos sinais medidos para albumina-AGE e foram utilizados para correcções do fundo.

Isolamento de Hb de eritrócitos humanos O Hb humano foi isolado a partir de eritrócitos em sangue anticoagulado com EDTA de 3 indivíduos saudáveis e de 16 doentes diabéticos. Foi diluído 100 pL de sangue total em 5 mL de sal fisiológico (154 mM de NaCl) , as células foram sedimentadas por centrifugação cuidadosamente, e ressuspensas em 5 mL de sal fisiológico. Após uma incubação de 16 h à temperatura ambiente, as células foram novamente sedimentadas por centrifugação. As células sedimentadas foram lisadas adicionando 2 mL de ácido bórico a 0,1 M, pH 6,5 e subsequentemente, os 30 ΡΕ1536778 resíduos celulares foram sedimentados por centrifugação. O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -20 °C.

Determinação de concentrações de glicoHb

Foram determinadas as concentrações de Hb gli-cado, também denominado glico-hemoglobina, ou denominado HbAic, em EDTA-sangue de dadores humanos saudáveis ou doentes diabéticos, utilizando um imunoensaio de inibição turbidimétrico com sangue total hemolisado, de acordo com as recomendações do fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Os desvios padrão são 2,3% das concentrações medidas de HbAic·

Ligação de vermelho do Congo com albumina glicada A ligação de vermelho do Congo a albumina-AGE glicada durante 86 semanas com os carbo-hidratos glucose, frutose e glucose-6-fosfato, ou com os derivados de carbo-hidrato gliceraldeído e ácido glioxílico, foi testada utilizando amostras secas ao ar. Para este objectivo foi aplicado 5 pg de albumina a uma lâmina de vidro e seca ao ar. As amostras foram incubadas com vermelho de Congo e subsequentemente lavadas de acordo com as recomendações do fabricante (Sigma Diagnostics, St Louis, MO, EUA). As fotografias foram tiradas num microscópio de fluorescência Leica DMIRBE (Rijswijk, Holanda) utilizando comprimento de onda de 596 nm e 620 nm de excitação e de emissão, respectivamente. 31 ΡΕ1536778

Preparações de endostatina A endostatina foi purificada a partir de

Escherichia coli, essencialmente como descrito47. Em resumo, bactérias B121.DE3 expressando endostatina foram lisadas num tampão contendo ureia a 8 M, Tris a 10 mM (pH 8,0), imidazole a 10 mM e β-mercaptoetanol a 10 mM. Após purificação sobre Ni2+-agarose, a amostra de proteína foi extensivamente dialisada contra H20. Durante a diálise a endostatina precipita como um sólido fino branco. Fracções deste material foram armazenadas a -80 °C para utilização mais tarde, ou foram liofilizados antes do armazenamento. A endostatina solúvel produzida na estirpe de levedura Pichía pastoris foi gentilmente cedida pelo Dr. Kim Lee Sim (EntreMed, Inc., Rockville, MA). A endostatina agregada foi preparada a partir da endostatina solúvel como se segue. A endostatina de levedura solúvel foi dialisada durante a noite em ureia a 8 M e subsequentemente três vezes contra Η20. Tal como a endostatina bacteriana, a endostatina de levedura precipita como um sólido fino branco.

Coloração com vermelho de Congo A endostatina bacteriana liofilizada foi ressus-pensa em ácido fórmico a 0,1% (FA), ou em dimetilsulfóxido e recuperada num capilar de vidro. O solvente foi deixado evaporar e o material de endostatina resultante foi corado com vermelho do Congo de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, EUA). 32 ΡΕ1536778

Medições de Dicroismo Circular

Os espectros de dicroismo circular com UV (CD) de soluções de péptidos e proteínas (100 pg mlT1 em H20) foram medidos num espectropolarímetro JASCO J-810 CD (Tóquio, Japão). Os espectros de absorção ponderados de 5 ou 10 medições únicas de 190-240 nm ou de 190-250 nm, para os péptidos de fibrina 85, 86, 87 ou para albumina, albumina glicada e humanos Αβ(16-22), respectivamente, são registadas. O espectro de CD de Αβ(16-22) foi medido como um controlo positivo. Αβ(16-22) adopta rapidamente a conformação de fibrilha amilóide com estrutura β cruzada, quando incubado em H2045. Para albumina e Αβ(16-22) a percentagem relativa dos elementos de estrutura secundária presentes foi estimada utilizando o software k2d 48.

Difracção de fibra por raios X A endostatina agregada foi solubilizada em 0,1% de FA, os péptidos de fibrina liofilizados foram dissolvidos em H20 e a albumina glicada foi extensivamente dialisada contra água. As amostras foram recuperadas num capilar de vidro. O solvente foi então deixado evaporar durante um período de vários dias. Capilares contendo as amostras secas foram colocados num difractómetro Nonius kappaCCD (Bruker-Nonius, Delft, Holanda). A disseminação foi medida utilizando radiação em tubo MoKa selado com um monocromator de grafite no detector de área CCD durante 16 33 ΡΕ1536778 horas. A disseminação a partir do ar e da parede de vidro do capilar foram subtraídas utilizando software interno (VIEW/EVAL, Dept. de Química de Cristalografia e Estrutural, Universidade de Utrecht, Holanda).

Microscopia electrónica de transmissão

As amostras de endostatina, hemoglobina e albumina foram aplicadas a grelhas de espécimen de malha 400 cobertas com películas de colóides revestido com carbono. Após 5 min. as gotas foram removidas com papel de filtro e as preparações foram coradas com 1% de metilcelulose e 1% de acetato de uranilo. Após lavagem em H20, as amostras foram desidratadas numa série graduada de EtOH e hexanotildisilazano. As imagens de microscopia electrónica de transmissão (TEM) foram registadas a 60 kV num microscópio electrónico JEM-1200 EX (JEOL, Japão).

Ensaio de imunoabsorção ligado a enzima: ligação de tPA a albumina glicada, Hb e Αβ(1-40) A ligação de tPA a albumina-g6p (incubações de quatro semanas e 23 semanas), albumina-gliceraldeído, albumina de controlo, Hb-g6p humano (incubação de dez semanas), Hb controlo, ou a Αβ(1-40) foi testada utilizando um sistema de ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). Foram imobilizados albumina-g6p e albumina controlo (2,5 pg mL"1 em tampão de revestimento, 50 mM de Na2C03/NaHCC>3 pH 9,6, 0,02% m/v NaN3, 50 pL/poço) durante 34 ΡΕ1536778 1 h à temperatura ambiente, em placas de 96 poços de Imobilizador de proteína (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Αβ(1-40) (10 pg mL"1 em tampão de revestimento) foi imobilizada durante 75 min. à temperatura ambiente numa placa de 96 poços de Imobilizador de péptidos (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Os poços de controlo foram incubados apenas com tampão de revestimento. Após um passo de lavagem com 200 pL de PBS/0,1% v/v Tween20, as placas foram bloqueadas com 300 pL de PBS/1% v/v Tween20, durante 2 h à temperatura ambiente, enquanto a agitação decorria. Todas as incubações subsequentes foram realizadas em PBS/0,1% v/v Tween20 durante 1 h à temperatura ambiente durante a agitação, com volumes de 50 pL por poço. Após cada incubação os poços foram lavados cinco vezes com 200 pL de PBS/0,1% v/v Tween20. Foram adicionadas quantidades crescentes de f.l. tPA ou K2-P tPA em triplicado a poços revestidos e a poços de controlo. 0 anticorpo 385R e, subsequentemente, SWARPO, ou anticorpo 374B e, subsequentemente, RAMPO foram adicionados aos poços a uma concentração de 1 pg mL-1. O anticorpo marcado com peroxidase ligado foi visualizado utilizando 100 pL de uma solução contendo 8 mg de orto-fenileno-diamina e 0,0175% v/v de H2O2 em 20 mL de 50 mM de ácido cítrico/100 mM de Na2HP04 pH 5,0. A coloração foi parada após a adição de 50 pL de uma solução de H2S04 a 2 Μ. A absorvência foi lida a 490 nm num leitor de microplacas Vmax kinetic (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Foram realizadas experiências de competição com 20 ou 40 nM de tPA, com respectivamente albumina-g6p ou Αβ (1-40) e com quantidades crescentes de vermelho do Congo em PBS/0,08%v/v Tween20/2% v/v EtOH. 35 ΡΕ1536778

ELISA: ligação de tPA a albumina-AGE A ligação de marcador de tPA de estrutura β cruzada a albumina-AGE foi testada utilizando um sistema de ELISA. Nós demonstrámos que o tPA se liga a péptidos de protótipo amilóide humano Αβ(1-40) e IAPP49 humano (este pedido). Por isso, utilizámos a ligação de tPA a estes dois péptidos como controlo positivo. As amostras de 86 semanas glicadas e os controlos foram utilizados para revestir placas Greiner microlon (catálogo # 655092, Greiner,

Frickenhausen, Alemanha). Os poços foram bloqueados com Superblock (Pierce, Rockford, IL, EUA). Todas as incubações subsequentes foram realizadas em PBS/0,1% (v/v) Tween20 durante 1 h à temperatura ambiente durante a agitação, com volumes de 50 pL por poço. Após incubação, os poços foram lavados cinco vezes com 300 pL de PBS/0,1% (v/v) Tween20.

Concentrações crescentes de tPA foram adicionadas em triplicado a poços revestidos assim como a poços de controlo. Durante as incubações com tPA de amostras incubadas durante 86 semanas, foi adicionado às soluções um excesso molar de pelo menos 123 000 vezes de ácido ε- aminocapróico (sACA, 10 mM). sACA é um análogo da lisina e é utilizado para evitar a ligação potencial de tPA a albumina através do seu domínio kringle250. O anticorpo monoclonal 374b (American Diagnostica, Instrumentation laboratory, Breda, Holanda) e, subsequentemente, foi adicionado RAMPO (Dako diagnostics, Glostrup, Dinamarca) aos poços a uma concentração de 0,3 pg mL'1. O anticorpo 36 ΡΕ1536778 ligado marcado com peroxidase foi visualizado utilizando 100 pL de uma solução contendo 8 mg de orto-f enileno-diamina em 20 mL de ácido cítrico a 50 mM/Na2HP04 a 100 mM pH 5,0 com 0,0175% (v/v) de H2O2. A coloração foi parada com a adição de 50 pL de uma solução de H2SO4 a 2 Μ. A absorvência foi lida a 490 nm num leitor de microplacas Vmax kinetic (Molecular Devices, CA, EUA). Os sinais de fundo de poços de controlo não revestidos foram subtraídos dos poços revestidos correspondentes.

Inicialmente, a fluorescência de Tioflavina T de albumina glicada e lisozima, e tPA para medições de fluorescência, foram incubados 500 nM de albumina-g6p, albumina-gliceraldeído, albumina de controlo, lisozima-gliceraldeído, ou lisozima de controlo com quantidades crescentes de Tioflavina T, em 50 mM de glicina-NaOH, pH 9. Para as leituras do branco, foi preparada uma gama de diluição idêntica de Tioflavina T sem proteína, ou a Tioflavina T foi omitida nas soluções de proteína. As amostras foram preparadas em triplicado.

Fluorescência de Tioflavina T

Noutras experiências as medições de fluorescência, albumina-g6p:2, albumina-g6p:4, albumina-g6p:23 e controlsina a 50 mM glicina-NaOH, pH 9 foram incubadas com quantidades crescentes de ThT (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Alemanha), um marcador para amilóide estrutura β cruzada51. A concentração de Albumina-AGE: 4 foi de 175 nM, 37 ΡΕ1536778 as concentrações de outras proteínas foram de 500 nM. Para medições de fluorescência com amostras glicadas de 86 semanas, 140 nM de proteína foi incubado com uma concentração fixa de 20 μΜ de ThT. A fluorescência foi medida em triplicado num espectrofotómetro de fluorescência Hitachi F-4500 (Ltd., Tóquio, Japão), após 1 h de incubação à temperatura ambiente. O comprimento de onda de excitação e de emissão foram de 435 nm (entrada 10 nm) e 485 nm (entrada 10 nm), respectivamente. Os sinais de fundo do tampão e da solução de proteína sem ThT foram subtraídos das medições correspondentes com solução de proteína incubada com ThT.

Fluorescência: Ligação competitiva de Tioflavina T e tPA a albumina-g6p A solução de 430 nM de albumina-g6p e 19 μΜ de Tioflavina T foi incubada com quantidades crescentes de tPA, durante 1 h à temperatura ambiente. Para as leituras do branco, a albumina-g6p foi omitida. As amostras foram preparadas em quadriplicados em glicina-NaOH a 50 mM pH 9. As medições de emissão foram realizadas como descrito acima.

Absorvência: Ligação competitiva de Tioflavina T e tPA a albumina-g6p

Foram incubadas albumina-g6p (500 nM) e Tioflavina T (10 μΜ) com quantidades crescentes de tPA, em 38 ΡΕ1536778 glicina-NaOH a 50 mM pH 9, durante 1 h à temperatura ambiente. As medições de absorvência foram realizadas à absorvência máxima de albumina-g6p Tioflavina T a 420 nm. As amostras foram preparadas em quadriplicado. Para as leituras do branco, a albumina-g6p foi omitida nas soluções. A absorvência foi lida numa cuvete de quartzo num espectrofotómetro Pharmacia Biotech Ultrospec 3000 UV/visivel (Cambridge, Inglaterra).

Ensaio de activação de plasminogénio.

Foi incubado plasminogénio (200 pg mL-1) com tPA (200 pM) na presença ou na ausência de um cofactor (5 μΜ de endostatina, Αβ(1-40) ou de um dos péptidos derivados de fibrina 85, 86 e 87). Aos intervalos de tempo indicados as amostras foram retiradas e a reacção foi parada num tampão contendo EDTA a 5 mM e sACA a 150 mM. Após a recolha das amostras foi adicionado um substrato de plasmina cromogénico S-2251 e a actividade da plasmina foi determinada cineticamente num espectrofotómetro a 37 °C.

Cultura e diferenciação de células N1E-115 Células de neuroblastoma de ratinho N1E-115 foram cultivadas de rotina em DMEM contendo FCS a 5%, suplementadas com antibióticos. As células foram diferenciadas em neurónios pós-mitóticos52. As células foram expostas a Αβ (50 pg mL"1) durante 24 horas na presença ou ausência de 20 pg mL’1 de plasminogénio na presença ou 39 ΡΕ1536778 ausência de 50 pg mL”1 de CpB. As células foram fotografadas, contadas e lisadas pela adição de 4x tampão de amostra (250 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 10% glicerol, 100 mM DTT, 0,01% p/v de azul bromofenol) ao meio. O lisado, contendo ambas células aderentes e flutuantes (presumivel- mente moribundas e/ou mortas) assim como o meio de cultura foram analisadas para a presença de plasminogénio e plasmina assim como para laminina por transferência de

Western utilizando anticorpos específicos contra plasmino-génio (MoAb 3642, American Diagnostics) , laminina (PoAb L9393, Sigma).

Ligação do factor XII humano a péptidos e proteínas amilóides, que contêm a dobra da estrutura β cruzada Nós testámos a ligação de FXII humano (Calbio-chem, La Jolla, CA, EUA, catálogo #233490) a (poli)péptidos amilóides. Os péptidos amilóides protótipos humanos amilóide-β (1-40) (1ιΑβ(1-40)) e fragmento de fibrina humana «147-159 FP13, e glucose-6-fosfato de albumina bovina glicada (produto final de glicação de albumina avançado (AGE)) e hemoglobina humana glicada com glucose-6-fosfato (Hb-AGE), que todos contêm a estrutura β cruzada, assim como os controlos negativos polipéptido de ilha amilóide de ratinho Δ (AmIAPP), albumina-control e Hb-control, em que todos três que têm falta da estrutura específica de amilóide, foram utilizados para revestir placas de ELISA e sobrepostos com uma série de concentração de factor XII humano. A ligação de FXII foi detectada utilizando 40 ΡΕ1536778 anticorpo anti-FXII policlonal de coelho (Calbiochem, La Jolla, CA, EUA, catálogo #233504) e IgG anti-coelho de porco marcado com peroxidase. Os poços foram revestidos em triplicado. O tampão de ligação de FXII consistiu em HEPES a 10 mM pH 7,3, NaCl a 137 mM, D-glucose a 11 mM, KC1 a 4 mM, albumina a 1 mg mL"1, ZnCl2 a 50 μΜ, NaN3 0,02% (m/v) e ácido ε-aminocapróico a 10 mM (sACA). O análogo de lisina sACA foi adicionado para evitar a ligação putativa de FXII à estrutura β cruzada através do dominio kringle de FXII. Adicionalmente, a ligação de FXII a 1ιΑβ(1-40) e o fragmento hAIAPP de amilina humana do protótipo amilóide foi testado utilizando análise de transferência em gota. Foram aplicados 10 pg dos péptidos, que contêm estrutura β cruzada, assim como poços como o controlo negativo péptido mAIAPP e soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) em duplicado em nitrocelulose activado com metanol. As aplicações foram subsequentemente incubadas com 2 nM de FXII em tampão FXII ou com tampão FXII isoladamente, anticorpo anti-FXII, e SWARPO. A ligação de FXII foi visualizada por quimioluminescência após incubação com reagente de luminol intensificado (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA) . Para testar se FXII e tPA, que é conhecido pela sua capacidade par se ligar a polipéptidos que contêm a dobra da estrutura β cruzada49, ligam-se a sitios de ligação sobreponiveis em (poli)péptidos de amilóide, realizámos ELISA competitiva. Foram incubados 1ιΑβ(1-40) ou amilóide albumina-AGE revestidos com 2,5 nM ou 15 nM FXII em tampão de ligação, na presença de uma série de concentração de activador de plasminogénio do tipo de tecido recombinante humano (Actilyse®, tPA de comprimento 41 ΡΕ1536778 total), ou Reteplase® (K2P-tPA). Reteplase é uma forma truncada de tPA, que consiste no segundo domínio kringle e no domínio de protease. A concentração de f.l. tPA- e K2P-tPA foi no máximo 135 vezes a kD para a ligação de tPA a 1ιΑβ(1-40) (50 nM) ou 150 vezes a kD para a ligação de tPA a albumina-AGE (1 nM).

Processo de clonagem A clonagem do domínio de dedo amino-terminal (F) de tPA humano, resíduos Serl - Ser50, precedidos pelo pró-péptido (resíduos Met-35 - Arg-1) e um sítio de restrição BglII, foi realizado utilizando PCR e técnicas de DNA recombinante convencionais. Em resumo, a região pró-péptido-dedo foi amplificada por PCR utilizando 1 ng de plasmina Zpl753, contendo o cDNA que codifica tPA como um molde. Os oligonucleótidos utilizados foram 5'AAAAGTCGACAG-CCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGA(1) e 3'AAAAGCGGCCGCCCACTTTTGA-CAGGCACTGAG (2) compreendendo um sítio de restrição Sall ou NotI, respectivamente (sublinhado) . O produto de PCR foi clonado num vector de expressão dirigido com Sall/Notl, pMT2-GST54. Como resultado é criada uma construção que contém um sítio de restrição SalI, a sequência codificante para o domínio de dedo de tPA, um sítio de restrição NotI e um Kpnl, um sítio de clivagem de trombina (TCS), uma marca de glutationa-S-transferase (GST) e um sítio de restrição EcoRI. A sequência apropriada da construção foi confirmada por análise de sequência. De um modo semelhante foi preparada a construção consistindo nos domínios F-EGF de tPA. De seguida, as construções foram ligadas SalI-EcoRI em 42 ΡΕ1536778 pGEM3Zf(-) (Promega, Madison, WI, USA). A construção iJindIII - Sall - pró-péptido tPA - BglII - F - NotI-Kpnl -TCS - GST - FcoRI foi utilizado como uma cassete de clo-nagem para a preparação de construções contendo tPA Kl, F-EGF-K1, EGF, bem como poços como activador do factor de crescimento humano do hepatócito F e F-EGF, factor XII F e F-EGF humano, e fibronectina humana F4, F5, F4-5 e F10-12. Subsequentemente, as construções foram ligadas HindIII -EcoRI no vector de expressão pcDNA3 (Invitrogen, Breda, Holanda). Adicionalmente, a marca GST isolada foi clonada em pcDNA3, precedida pelo pró-péptido tPA. Os iniciadores utilizados para as construções foram:

tPA F-EGF

3' AAAAGCGGCCGCGTGGCCCTGGTATCTATTTC (3) e (1) tPA EGF 5'AAAAGAGATCTGTGCCTGTCAAAAGTTGC (4) e (2) tPA Kl 5'AAAAGAGATCTGATACCAGGGCCACGTGCTAC (5) 3'AAAAGCGGCCGCCCGTCACTGTTTCCCTCAGAGCA (6) tPA F-EGF-K1 (D e (6)

Etiqueta GST (1) e AAAAGCGGCCGCCTGGCTCCTCTTCTGAATC (7) ΡΕ1536778 43

Fibronectina F4 5'TGCAAGATCTATAGCTGAGAAGTGTTTTGAT (8) 3'GATGCGGCCGCCCTGTATTCCTAGAAGTGCAAGTG (9)

Fibronectina F5 5'TGCAAGATCTACTTCTAGAAATAGATGCAAC (10) 3'TGATGCGGCCGCCCCACAGAGGTGTGCCTCTC (11)

Fibronectina F4-5 (8) e (11)

Fibronectina F10-12 5'AAAAAAGAT C TAAC CAAC C TAC GGAT GAC T C (12) 3'A,AAAAAGGTACCGACTGGGTTCACCCCCAGGT (13)

factor XII F 5'GAAACAAGATCTCAGAAAGAGAAGTGCTTTGA (14)

3'ACGGGCGGCCGCCCGGCCTGGCTGGCCAGCCGCT (15) factor XII F-EGF 5'AAAAAAGAT C T CAGAAAGAGAAGT GC T T T GA (16) 3'AAAAAGGTACCGGCTTGCCTTGGTGTCCACG (17)

HGFa F 5'GCAAGAAGATCTGGCACAGAGAAATGCTTTGA (18) 3'AAGGGCGGCCGCCCAGCTGTATGTCGGGTGCCTT (19) 44 ΡΕ1536778

HGFa F-EGF 5'AAAAAAGAT C T GGCACAGAGAAT GCT TT GA (20) 3'AAAAAGGTACCGCTCATCAGGCTCGATGTTG (21)

Expressão transiente de tPA-F-GST em células 293T

Inicialmente, as células 293T foram cultivadas em meio RPMI1640 (Invitrogen, Escócia, Reino Unido) suplementadas com 5% v/v de soro de vitela fetal, penicilina, estreptomicina e guanidina, até 15% de confluência. As células foram transfectadas transientemente utilizando Fugene-6, de acordo com as recomendações do fabricante (Roche, IN, EUA). Foram transfectados pMT2-tPA-F-GST contendo o fragmento tPA, ou um plasmideo de controlo, pMT2-RPTPP-GST, contendo o dominio extracelular da proteína tipo receptor tirosinaf osf atase p(RPTPp)54, e o meio foi recolhido após 48 h de transfecção. A expressão de tPA-FGST e RPTPP-GST em meio 293T foi verificada por imunotrans-ferência. As amostras recolhidas foram corridas em géis de SDS-PAA após a adição de 2x tampão de amostra. Os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em leite a 1% (Nutricia) e incubadas com anticorpo 2F354 anti-GST monoclonal primário, e IgG anti-ratinho de coelho conjugado com HRP secundário (RAMPO). As transferências foram reveladas utilizando Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, MA, EUA). 45 ΡΕ1536778

Expressão estável de construções de Dedo em células BHK

Foram semeadas células de rim de hamster bebé em meio de mistura DMEM/NUT F-12(HAM) (Invitrogen, Reino Unido) suplementadas com 5% v/v de soro de vitela fetal (FCS), penicilina, estreptomicina e guanidina, até 1% de confluência. As células foram transfectadas de forma estável utilizando o método de precipitação de DNA com Ca3(P04)2. Após 24 h o meio foi suplementado com 1 mg mL"1 de sulfato de geneticina G-418 (Gibco, Reino Unido). 0 meio com G-418 foi refrescado várias vezes durante 10 dias, para remover células mortas. Após este período de tempo, as colónias únicas estáveis foram transferidas para novos frascos de cultura e as células foram cultivadas até à confluência. A expressão das construções foi então verificada por imunotransferência. As amostras recolhidas foram corridas em géis de SDS-PAA após a adição de 2x tampão de amostra. Os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em 5% de leite (Nutricia) com 1,5% m/v de BSA e incubadas com anticorpo monoclonal primário anti-GST (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA, catálogo # Z-5), e IgG anti-ratinho de coelho conjugado com HRP secundário (RAMPO). As transferências foram reveladas utilizando Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, MA, USA) . Os clones estáveis foram daqui em diante cultivados na presença de 250 pg mL"1 G-418. Para experiências de precipitação, foi utilizado meio condicionado com 5% de FCS de clones estáveis que 46 ΡΕ1536778 produzem construções de interesse. Para efeitos de purificação, as células de um clone estável de tPA F-EGF-GST foram transferidas para frascos de cultura com tripla camada e cultivados em meio com 0,5% v/v Ultroser G (ITK Diagnostics, Uithoorn, Holanda). O meio foi refrescado a cada três a quatro dias. O TPA F-EGFGST foi isolado do meio numa coluna de Glutationa Sepharose 4B (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) e eluido com 100 mM de glutationa reduzida (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) . A pureza da construção foi verificada com SDS-PAGE seguido de coloração com Coomassie ou de transferência de Western. A partir destas análises é claro que algum GST está presente na preparação. O tPA F-EGF-GST purificado foi dialisado contra PBS e armazenado a -20 °C.

Purificação de tPA-F-GST e RPTPp-GST marcados com

GST O meio foi concentrado vinte vezes utilizando dispositivos de centrifugação Nanosep 10K Q (Pall Gelman Laboratory, MI, EUA) e incubado com glutationa acoplada a Sepharose 4B, de acordo com as recomendações do fabricante (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). As construções ligadas foram lavadas com PBS e eluidas com 10 mM de glutationa em Tris-HCl a 50 mM pH 8,0. As construções foram armazenadas a -20 °C, antes da utilização.

Precipitação de Amilóide O meio condicionado de células BHK que expressam tPA F marcado com GST, F-EGF, EGF, Kl, F-EGF-K1, FXII F, 47 ΡΕ1536778 HGFaF, Fn F4, Fn F5, Fn F4-5 e GST foi utilizado para ensaios de ligação amilóide. A principio, as construções foram ajustadas até uma concentração aproximadamente igual utilizando transferências de Western. As ligações qualitativas dos fragmentos recombinantes são avaliadas utilizando um ensaio de "precipitação". Com esta finalidade, os fragmentos produzidos de forma recombinante, são incubados com fibrilhas de Αβ ou IAPP. Dado que estes péptidos formam fibras insolúveis, as proteínas não ligadas podem ser facilmente removida das fibras após centrifugação. Os sedimentos, contendo os fragmentos ligados são subsequentemente lavados várias vezes. Os fragmentos ligados são solubilizados em tampão de amostra de SDS e analisados por PAGE, assim como as proteínas não ligadas na fracção do sobrenadante e material de partida. Os géis são analisados utilizando análise de imunotransferência com o anticorpo anti-GST Z-5.

Amilóide ELISA com tPA F-EGF-GST

De modo a definir a afinidade da proteína recombinante tPA F-EGF-GST purificada realizou-se ELISAs com (poli)péptidos de amilóide imobilizados e não amilóide de controlo AmIAPP. Foram imobilizados vinte e cinco pg mL“ 1 de AB, FP13, IAPP ou AmIAPP em placas de imobilização de péptidos Exiqon. Foi adicionada uma série de concentrações de tPA F-EGF-GST na presença de sACA em excesso aos poços e a ligação foi ensaiada utilizando anticorpo anti-GST Z-5. Como um controlo foi utilizado GST (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA, catálogo # G-5663) às mesmas concentrações. 48 ΡΕ1536778

Imuno-histoquimica: ligação de tPA F-EGF a cérebro AD humano

Secções de cérebro em parafina de um humano infligido com AD foram gentilmente cedidos pelo Prof. Slootweg (Dept. de Patologia, UMC Utrecht) . As secções foram desparafinizadas numa série de xileno-etanol. As peroxidases endógenas foram bloqueadas com metanol/1,5% H2O2 durante 15 minutos. Após lavagem em H20, as secções foram incubadas com ácido fórmico não diluído durante 10 minutos, seguido por incubação em PBS durante 5 minutos. As secções foram bloqueadas em HPS a 10% em PBS durante 15 minutos. As secções foram expostas durante 2 h com 7 nM de tPA F-EGF-GST ou GST em PBS/0,3% BSA. Após três passos de lavagem com PBS, as secções foram cobertas com 200 ng mL"1 de anticorpo anti-GST Z-5, durante 1 h. Após lavagem, foi aplicado Powervision anti-coelho de cabra pronto a utilizar (Immunologic, Duiven, Holanda, catálogo # DPVR-55AP) e incubado durante 1 h. Após lavagem, as secções foram coradas durante 10 minutos com 3,3'-diamino benzidina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA, catálogo # D-5905), seguido por coloração com hematoxilina durante 10 segundos.

Após lavagem com H20, as secções foram incubadas com vermelho do Congo de acordo com as recomendações do fabricante (Sigma Diagnostics, St Louis, MO, EUA). As secções foram clarificadas em xileno e montadas com D.P.X. Mounting Médium (Nustain, Nottingham, Reino Unido). A análise das secções foi realizada num microscópio de 49 ΡΕ1536778 fluorescência Leica DMIRBE (Rijswijk, Holanda). A fluorescência do vermelho do Congo foi analisada utilizando um comprimento de onda de excitação de 596 nm e um comprimento de onda de emissão de 620 nm. ELISA: ligação de tPA-F-GST e RPTPp-GST a Αβ(1-40) humano e albumina glicada A ligação de tPA-F-GST e RPTPP-GST a Αβ(1-40) de amilóides fibrosos humanos e albumina-g6p foi ensaiada com ELISA. Em resumo, Αβ(1-40) humano, albumina-g6p, ou apenas tampão, foram utilizados para revestimento num Imobilizador de péptidos I, ou um Imobilizador de proteína I, respecti-vamente. Os poços foram incubados com as construções purificadas marcadas com GST ou meio de controlo, e a ligação foi detectada utilizando monoclonal anticorpo anti-GST primário 2F3 e RAMPO. Os poços foram também incubados com 500 nM de tPA na presença de 10 mM de sACA. A ligação de tPA é então independente do sitio de ligação a lisilo localizado no domínio kringle2. a ligação de tPA foi medida utilizando anticorpo 374B primário e RAMPO. As experiências foram realizadas em triplicado e as leituras do branco dos poços não revestidos foram subtraídas.

Anticorpos anti-AGE

Anticorpos contra albumina de soro bovino glicada com glucose-6-fosfato foram induzidos em coelhos utilizando esquemas de imunização convencionais. Foi obtido anti-AGEl 50 ΡΕ1536778 após imunização com albumina-AGE glicada durante duas semanas (Prof. Dr. Ph. G. de Groot/Dr. I. Bobbink; resultados não publicados). O anticorpo foi purificado a partir do soro utilizando uma coluna de Proteína G. Foi desenvolvido anti-AGE2 por Davids Biotechnologie (Regensburg, Alemanha). Após imunização com albumina-AGE:23, os anticorpos foram purificados por afinidade em Αβ(1-40) humano conjugado com esferas activadas de EMD-Epoxi (Merck, Darmstadt, Alemanha) . Foi obtido o anticorpo anti-AGE policlonal de ratinho após imunização com albumina-AGE:23 e Αβ(1-40) humano numa proporção molar de 9:1. Foi obtido soro policlonal utilizando processos de imunização convencionais, que foram realizados pelas Instalações de do Grupo de Hibridomas Biomédico Académico (Universidade de Utrecht, Holanda). Subsequentemente foram criados anticorpos mono-clonais utilizando processos convencionais. ELISA: Ligação de anticorpos contra péptidos amilóide ou proteína glicada a proteína-AGE e fibrilhas amilóide

Para ELISA, os compostos amilóides foram imobilizados em péptido Exiqon ou Imobilizadores de proteína (Vedbaek, Dinamarca), como descrito antes. Os anticorpos anti-AGE e anti-Αβ(1-42) H-43 comercialmente disponíveis (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) foram diluídos em PBS com 0,1% v/v Tween20. K9234 anti-vitronectina humana de coelho foi gentilmente cedido pelo Dr. H. de Boer (UMC Utrecht) , e foi utilizado como um 51 ΡΕ1536778 controlo negativo. Para ELISA com anti-albumina-AGE/Αβ policlonal de ratinho, foi utilizado soro de controlo com anticorpo induzido contra uma proteína não relacionada. A ligação de anti-albumina-AGE/Αβ policlonal de ratinho foi realizada utilizando uma série de diluição de soro em PBS/0,1% Tween20. Para ensaios de ligação competitiva com IAPP, anti-AGEl foi pré-incubado com concentrações variáveis de IAPP. As fibrilhas IAPP foram concentradas por centrifugação e o sobrenadante foi aplicado em triplicado a poços de uma placa de ELISA revestida com Αβ. Os ensaios de ligação competitiva com ligação de multi-ligando de estrutura β cruzada a tPA de protease serínica foram realizados de um modo ligeiramente diferente. Αβ e IAPP revestidos foram cobertos com uma concentração de anti-AGEl ou anti-Αβ (1-42) H-43 relacionada com a kD, juntamente com uma série de concentrações de tPA. Estava presente um excesso molar de 107-104 vezes do análogo de lisina sACA (10 mM) no tampão de ligação de modo a evitar a ligação de tPA a resíduos de lisina de Αβ e IAPP, o que seria independente da presença de estruturas amilóides.

Ensaio de precipitação com péptidos amilóides e anticorpo anti-AGEl de coelho

Foi incubado anti-AGEl com agregados amilóides de Αβ (16-22), Αβ(1-40) e IAPP. Após centrifugação, os sedimentos foram lavados três vezes com PBS/0,1% Tween20, dissolvido em tampão de amostra de não redução (1,5% (m/v) dodecil sulfato de sódio, 5% (v/v) de glicerol, 0,01%(m/v) 52 ΡΕ1536778 de azul de bromofenol, Tris-HCl a 30 mM pH 6,8) . O sobrenadante após sedimentação das fibrilhas amilóides foi diluído 1:1 com 2x tampão de amostra. As amostras foram aplicadas a um gel de poliacrilamida e após transferência de Western, foi detectado anti-AGEl com SWARPO.

Análise imuno-histoquímica da ligação de anti-AGE2 a uma placa amilóide numa secção de um cérebro humano inflingido por AD.

Foi utilizado anti-AGE2 de coelho, purificado por afinidade numa coluna Αβ, para o ensaio de propriedades de ligação para placas amilóides em secções de cérebro de um humano com AD. O processo foi realizado essencialmente como descrito acima. Para evitar eventual ligação de 11 pg mL"1 anti-AGE2 aos adutos de proteina-AGE ou a albumina humana na secção de cérebro, foi adicionado 300 nM de dipéptido Gly-Lys glicado com g6p ao tampão de ligação, juntamente com 0,3% m/v de BSA. Após a coloração imuno-histoquímica, a secção foi corada com vermelho do Congo. ELISA de sanduíche para detecção de albumina-AGE amilóide em solução

Para a detecção de estrutura β cruzada amilóide em soluções utilizámos a abordagem de ELISA de sanduíche. Foi imobilizado Actilise tPA a uma concentração de 10 pg mL”1 aos poços de uma placa Imobilizadora de proteína de 96 poços (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Foram adicionadas 53 ΡΕ1536778 séries de concentração de albumina-AGE:23 e albumina-control:23 aos poços revestidos com tPA, bem como a poços de controlo não revestidos. A ligação de estruturas amilóides foi detectada após incubação com 1 pg mL-1 anti-Αβ (1-42)H-43 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e subsequentemente 0,3 pg mL”1 SWARPO, seguido por coloração com ortofenileno-diamina/H202/H2S04.

RESULTADOS 1. A estrutura β cruzada está presente na fibrina e em péptidos sintéticos derivados de fibrina.

Demonstrámos que um coágulo de fibrina cora com vermelho do Congo (não apresentado) e apresenta fluorescência de Tioflavina T (Figura 2A) , indicativa da presença de estrutura amilóide num coágulo de fibrina. Utilizando coloração de vermelho do Congo (não apresentado), medições de dicroismo circular e análise por difracção de raios X demonstrámos que os péptidos sintéticos derivados da sequência de fibrina adoptam estrutura β cruzada (Figura 2B, C). Verificou-se previamente que estes péptidos possuem

propriedades de ligação a tPA e de activação de tPA18. Verificou- se que a presença da estrutura β cruzada nestes péptidos está correlacionada com a capacidade para estimular a activação de plasminogénio mediada por tPA (Figura 2D) .

Em conclusão, estes resultados fornecem evidência 54 ΡΕ1536778 para a ocorrência fisiológica/relevância para a formação de estrutura β cruzada e o papel deste elemento estrutural na ligação de tPA a fibrina.

2. Αβ contém estrutura β cruzada, liga-se a plasmina(ogénio) e tPA, estimula a activação de plasmino-génio, induz a degradação da matriz e induz a separação das células que é agravada pelo plasminogénio e inibida por CpB

Para testar se tPA, plasminogénio e plasmina se ligam a Αβ realizámos ensaios de ligação em fase sólida. Αβ foi utilizado para revestir placas de plástico de 96 poços e a ligação do péptido a plasmina (ogénio) ou a tPA foi avaliada cobrindo o péptido revestido com concentrações crescentes de tPA, plasminogénio ou plasmina. A ligação foi avaliada utilizando anticorpos específicos para plasmina (ogénio) ou para tPA realizando ELISA. A Figura 3A demonstra que a tPA se liga a Αβ com uma Kd e cerca de 7 nM, semelhante à Kd de tPA ligando-se a fibrina55. Em contraste, não observámos ligação detectável de plasminogénio a Αβ (Figura 3B). Todavia, o plasminogénio (plasmina) activado liga-se a Αβ, e fá-lo com uma Kd de 47 nM. 0 facto de a plasmina (activa) , mas não o plasminogénio (inactivo) se ligar a Αβ sugere que a actividade da plasmina, e desse modo a criação de lisinas livres é importante para a ligação de plasmina a Αβ. Para testar isto utilizámos o análogo da lisina ácido ε-aminocapróico (eACA) e testámos a ligação de plasmina e tPA a Αβ na sua presença. Demonstrámos que a ligação de plasmina a Αβ é completamente 55 ΡΕ1536778 abolida na presença de sACA (Figura 3D). Em contraste, sACA não tem efeito na interacção tPA-Αβ (Figura 3C) . Assim, concluímos que a plasmina se liga às lisinas livres que foram criadas durante o período de incubação, presumivelmente através do(s) seu(s) domínio(s) Kringle de ligação a lisina. Na linha com isto, a Kd da ligação do domínio Kringle do plasminogénio às lisinas livres em fibrina é semelhante à Kd para a ligação de plasmina a Αβ.

Investigámos a cinética da activação de plasminogénio na ausência e na presença de Αβ. Como foi publicado antes por Kingston et al.24 verificámos que Αβ estimula potencialmente a activação do plasminogénio por tPA (Figura 4A) . Todavia, verificámos que a reacção prossegue com uma cinética de segunda ordem, em vez de com cinética de primeira ordem. Considerámos a possibilidade de a criação de lisinas livres durante a reacção ter provocado este fenómeno (ver abaixo). A criação de plasmina mediada por tPA está implicada na morte celular neuronal provocada por isquemia ou por aminoácidos excitotóxicos. Dados recentes sugerem que a plasmina pode degradar Αβ e desse modo prevenir a toxicidade de Αβ56'"57. Verificámos que 48 horas após a adição de Αβ a uma cultura de células N1E-115 diferenciadas, a maioria das células morreram e destacaram-se da matriz (não apresentado). Quando adicionados em conjunto com Αβ, a plasmina (até 100 nM) foi incapaz de melhorar o destaque de células induzida por Αβ. Mesmo pré-incubações de Αβ prolongadas com plasmina a 100 nM não afectam o destaque de células induzidas por Αβ (Figura 4B). 56 ΡΕ1536778

Subsequentemente, considerámos a possibilidade de a criação de plasmina pode potenciar em vez de inibir o destaque e a sobrevivência de células induzida por Αβ. Para testar isto expusemos células N1E-115 a concentrações subóptimas de Αβ e concentrações baixas de plasminogénio durante 24 horas. Na ausência de Αβ, o plasminogénio não tem efeito sobre a adesão celular (Figura 4C). Todavia, o plasminogénio tem um efeito dramático potenciante sobre o destaque celular induzido por Αβ. Os níveis mínimos de plasminogénio que são necessários para potenciar o destaque celular induzido por Αβ (10-20 pg/mL) estão bem abaixo daqueles que se encontram no plasma humano (250 pg/mL). A degradação mediada por plasmina da molécula de matriz extracelular laminina precede o destaque neuronal e a morte celular no cérebro isquemico. Testámos se a criação de plasmina estimulada por Αβ conduz à degradação de laminina. O destaque foi acompanhado pela degradação da laminina da proteína da matriz extracelular (Figura 4D) .

Considerámos a possibilidade de a criação de lisinas livres durante a formação de plasmina estimulada por Αβ ter sido responsável pela cinética observada de segunda ordem. Para testar isto, foi utilizada carboxi-peptidase B (CpB), uma enzima que cliva os resíduos de lisina e arginina C-terminais) e o inibidor de CpB CPI. A Figura 5A demonstra que na presença de CpB a criação de plasmina é fortemente diminuída. Para além disso, este efeito depende da actividade de CpB na medida em que isto é abolido pela co-incubação com CPI. A Figura 5A também 57 ΡΕ1536778 demonstra que CpB não abole completamente a criação de plasmina estimulada por Αβ, mas que a reacção prossegue com cinética lenta de primeira ordem. Estes resultados sugerem que a criação de lisinas livres (mediada por plasmina) durante a reacção é essencial para a criação eficiente de plasmina estimulada por Αβ, presumivelmente apoiando a ligação de plasminogénio e tPA através da interacção com os seus respectivos domínios Kringle. Uma dependência semelhante na criação de lisinas C-terminais foi demonstrada para a criação eficiente de plasmina mediada por fibrina58. Estes resultados demonstram que a formação de plasmina estimulada por Αβ é regulada pela carboxipeptidase B in vitro. Assim, se o destaque das células é o resultado da criação de plasmina, CpB pode afectar o destaque de células induzida por Αβ e/ou viabilidade. Demonstrámos que o destaque celular induzido por plasminogénio e Αβ é completamente prevenido pela co-incubação com CpB (Figura 5B,C) . Isto é acompanhado por uma inibição completa da formação de plasmina estimulada por Αβ, tanto no meio como nas células (Figura 5D). 3. Endostatina pode formar fibrilhas amilóides compreendendo a estrutura β cruzada.

Utilizando a coloração com vermelho do Congo (não apresentado), a análise de difracção de raios X e TEM, demonstrou-se a presença de estrutura β cruzada em endostatina agregada a partir de Escherichia coli, assim como a partir de Pichia pastoris, e a capacidade da 58 ΡΕ1536778 endostatina formar fibrilhas amilóides (Figura 6A-B). Verificou-se que a endostatina bacteriana produziu linhas de reflexão a 4,7 Â(distância da ligação de hidrogénio), assim como a 10-11 Â (distância inter-folha). As linhas de reflexão apresentam intensidades máximas a ângulos de difracção opostos. 0 eixo da fibra com a sua distância de 4,7 Â das repetições da ligação de hidrogénio é orientado ao longo do eixo capilar vertical. Isto implica que a distância inter-folha de 10-11 Â é perpendicular a estas ligações de hidrogénio. Isto é consistente com a proteína como tendo uma conformação de folha β cruzada com uma estrutura β cruzada. As folhas β intramoleculares numa proteína globular não podem causar um padrão de difracção que é ordenado desta forma. A partir da quantidade de dispersão de ruído segue-se que apenas uma parte da proteína toma parte na formação da estrutura β cruzada. Verificou-se que a presença das estruturas β cruzadas na endostatina correlacionam com a sua capacidade de estimular a activação de plasminogénio mediada por tPA (Figura 6C) e correlaciona com a morte celular neuronal (Figura 6D).

Aqui demonstrou-se que a endostatina é um exemplo de uma proteína desnaturada que é capaz de estimular a sugerida via cruzada β. 4. IAPP liga-se a tPA e estimula a activação de plasminogénio mediada por tPA.

Os depósitos amilóides de IAPP são formados no pâncreas de doentes diabéticos do tipo 1159. O IAPP pode 59 ΡΕ1536778 causar a morte celular in vitro e é pensa-se, deste modo, que contribui para a destruição de células β que é observada in vivo, que leva a insuficiente produção de insulina. 0 LAPP forma fibrilhas compreendendo a estrutura β cruzada60.

Testou-se se IAPP podia estimular a activação de plasminogénio mediada por tPA (Figura 7). De facto, de modo semelhante a Αβ, o IAPP pode estimular a formação de plasmina por tPA. 5. A albumina glicada liga-se a Tioflavina T e tPA, e agrega as fibrilhas amilóides compreendendo a estrutura β cruzada.

Foi demonstrado que a glicação de várias proteínas pode induzir ou aumentar a capacidade destas proteínas se ligarem a tPA e estimularem a formação de plasmina mediada por tPA22;61. Mostrou-se aqui que a glicação de albumina com g6p confere notoriamente elevada afinidade da ligação de tPA a albumina (Fig. 8A), mas também leva à sua capacidade de ligar Tioflavina T (Fig. 8C) . A ligação de tPA pode ter competição com vermelho do Congo (Fig. 8B) . Adicionalmente, a ligação de Tioflavina T a albumina glicada pode ter competição em tPA (Fig. 8D, E). 0 facto de que o vermelho do Congo e/ou Tioflavina T e tPA competem ilustra que estes têm, ou os mesmos sítios de ligação, ou sobreponíveis. 60 ΡΕ1536778

As análises com TEM das preparações de albumina modificada com g6p revelaram que após uma incubação de quatro semanas são formados os agregados amorfos de albumina (Fig. 8G), que exibem um espectro de CD indicativo da presença de 7% dos resíduos de aminoácidos de albumina em folha β (Tabela I) . A incubação prolongada até 23 semanas resultou numa mudança para estruturas fibrosas altamente ordenadas tipo folha, com um comprimento de aproximadamente 500 nm e um diâmetro variando desde cerca de 50 a 100 nm (Fig . 8H) Estas fibras apresentaram um aumento de 19% de folha β, quando analisado com espectropolarimet ria ' de CD (Tabela I) . A albumina de um lote diferente, que foi glicada da mesma maneira, já mostrou feixes de agregados fibrosos após um período de duas semanas de incubação (Fig. 81), enquanto um aumento no conteúdo de folhas β não é detectado com espectropolari-metria de CD (Tabela I) . Em cada feixe podem ser identificadas cerca de dez fibras separadas lineares com uma largura de 3-5-nm- com um comprimento de 200-300 nm. No topo de cada feixe são observadas manchas regularmente distribuídas, com um diâmetro de aproximadamente 5 nm. Estas manchas podem ser tomadas por moléculas de albumina globular que estão ligadas às fibras, ou alternativamente, que são parcialmente incorporadas nas fibras. Os agregados estavam ausentes na albumina controlo (não apresentado) e não foram medidas folhas β utilizando espectropolarimetria de CD (Tabela I) . As estruturas fibrosas obtidas após períodos de duas-semanas e 23-semanas de glicação estimulam a fluorescência de Tioflavina T (ThT) numa forma seme- 61 ΡΕ1536778 lhante, enquanto os precipitados amorfos obtidos após quatro semanas aumentaram fortemente o sinal fluorescente.

As análises de difracção de raios X de fibra revelaram que a albumina-g6p (23 semanas) compreende uma quantidade significativamente eficaz de fibras cristalinas (Fig. 8J, L) , enquanto os padrões de difracção da albumina-g6p (2 semanas) e da albumina-g6p (4 semanas) mostram caracteristicas com origem em proteína globular precipitada amorfa, muito semelhante aos padrões obtidos para os controlos da albumina (Fig. 8K) . Para a albumina-g6p (23 semanas), a repetição de 4,7 Â corresponde às caracterís-ticas de distância da ligação de hidrogénio entre as cadeias β nas folhas β. As repetições de 2,3 e 3,3 Â têm uma orientação preferida perpendicular à repetição de 4,7 À (Fig. 8M). Combinando as repetições de 2,3 e 3,3 Â sugere-se que o eixo da fibra é orientado perpendicularmente à direcção das ligações de hidrogénio, com uma repetição de 6,8 Â. Esta dimensão corresponde ao comprimento de duas ligações peptídicas e indica que as cadeias β correm paralelamente ao eixo da fibra. Isto implica que a estrutura da albumina-g6p (23 semanas) é composta de estrutura β cruzada consistindo de folhas β de empilhadas de cadeias com ligações de hidrogénio (Fig. 8N). Uma orientação semelhante é encontrada em fibrilhas amilóides da primeira região com previsão de α-hélice de PrPc62. quando o eixo a é de 9,4 Â, ou alternativamente 4,7 Â, e o eixo c é 6,8 Â, as repetições de 2,5 e 6,0 Â podem ser apenas indexadas como (h k 1) . Isto implica uma repetição 62 ΡΕ1536778 altamente ordenada do eixo b, correspondente à distância inter folha β. Com o eixo a e eixo c de 4,7, ou 9,4 Â e 6,8 Â, respectivamente, a forte repetição de 3,8 À deve ser indexada como (2 0 1) ou (1 0 1) . Considerando todas as observações é nítido que as fibras de albumina-g6p (23 semanas) são constituídas por estruturas β cruzadas, uma característica particular das fibrilhas amilóides.

Estes resultados mostram que devido a incubação e/ou modificação com unidades de açúcar são formadas estruturas β cruzadas em albumina que são capazes de suportar a ligação de tPA. 6. Glicação de hemoglobina induz ligação de tPA e formação de fibrilha. A incubação de hemoglobina humana com g6p resultou numa ligação de tPA de elevada afinidade (Fig. 9A). Os adutos amorfos agregados de Hb-g6p incluindo fibrilhas foram observados com TEM (Fig. 9B) , enquanto o controlo de Hb não agregava (não apresentado). A Hb humana de doentes de diabetes mellitus tem a tendência de formar agregados fibrilhares, uma vez mais do que 12,4% da Hb estava glicada (Tabela II). 7. A albumina amilóide é formada independentemente do carbo-hidrato (derivado) A partir das observações listadas acima é nítido 63 ΡΕ1536778 que a modificação de grupos -NH2 de albumina com g6p induzem a formação de amilóide de estrutura β cruzada. A questão que se pôs a seguir foi se o desencadeamento da redobragem da albumina globular numa dobra de amilóide foi uma propriedade restrita de g6p, ou se a formação de amilóide ocorre independentemente do carbo-hidrato original ou derivado de carbo-hidrato utilizado para a formação de AGE. As soluções de albumina foram incubadas durante 86 semanas a 37 °C com 1 M de g6p, 250 mM de DL-gliceraldeí-do/100 mM de NaCNBH3, 1 M de β-D-(-)-frutose, 1 M de D(+)-glucose, 500 molécula de ácido glioxílico/100 mM de NaCNBH3, e correspondentes tampões de controlo PBS e PBS/NaCNBH3. O gliceraldeido e ácido glioxilico são derivados de carbo-hidratos que são precursores de AGE em reacções de Maillard63;64. Após 86 semanas albumina-gliceraldeído e albumina-frutose eram suspensões amarelo claro/castanho. Os controlos eram incolores e soluções claras. A albumina-glucose e albumina-ácido glioxilico eram soluções límpidas amarelo claras a castanho claro. A albumina-g6p:86 era uma solução límpida e castanho escura. A formação de AGE foi confirmada por medições de autofluorescência utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão específicos para AGE (não apresentado), ligação de poab anti-AGE 4B5 (não apresentado) e ligação de poab anti-AGE (não apresentado). Como esperado, a albumina-ácido glioxilico não apresentou um sinal autofluorescente devido ao facto de que (principalmente) são formados adutos de carboximetil-lisina (CML) não fluorescentes63. 64 ΡΕ1536778

Os dados de autofluorescência e a ligação de anticorpos específicos para AGE listados acima mostram que vários carbo-hidratos e derivados de carbo-hidratos podem levar a estruturas AGE semelhantes. Utilizando g6p como ponto de partida para a formação de AGE, mostrou-se que as propriedades de amilóide adoptadas pela albumina, semelhantes às observadas em fibrilhas bem estudadas de Αβ e IAPP. Deste modo, testou-se a presença de estruturas de amilóide nos adutos de albumina-AGE obtidos com carbo-hidratos alternativos e derivados. Mediu-se a fluorescência das soluções de albumina-AGE-ThT (Fig. 10J) e de preparações de albumina-AGE secas ao ar que foram incubadas com vermelho do Congo (Fig. 10A-I). A incubação da albumina com gliceraldeído, glucose ou frutose resultou num sinal fluorescente aumentado de ThT (Fig. 10J) . Após subtracção do sinal do ruído de ThT e tampão, não foi medida fluorescência amilóide - ThT específica para albumina-ácido glioxílico e tampões de controlo. A albumina-g6p, albumina-gliceraldeído e albumina-frutose produziu um sinal fluorescente de vermelho do Congo semelhante aos sinais de Αβ e IAPP (Fig. 10C-E, G-H). Com albumina-glucose, é observado um padrão uniformemente distribuído de precipitados fluorescentes (Fig. 10F) . Com albumina-ácido glioxílico e tampões de controlo dificilmente é observada qualquer coloração (Fig. 10A-B, I) . Estes dados de ThT e fluorescência de vermelho do Congo mostram que, adicionalmente a albumina-g6p, a albumina-gliceraldeído, albumina-glucose e albumina-frutose possuem propriedades do tipo amilóide. Para substanciar ainda mais estas observações testou-se a 65 ΡΕ1536778 ligação da protease de serina tPA específica para amilóides numa ELISA. A enzima ligou-se especificamente a albumina-g6p, albumina-gliceraldeído, albumina-glucose e albumina-frutose (Fig. 10K-L) e aos controlos positivos Αβ e IAPP, como foi apresentado anteriormente49. Não é observada ligação de tPA para a albumina-ácido glioxílico e tampões de controlo. A partir dos dados de ThT, vermelho do Congo e tPA, é nítido que as propriedades de indução de amilóide em albumina não são uma propriedade exclusiva de g6p. Aparentemente, um espectro de carbo-hidratos e derivados de carbo-hidratos, compreendendo g6p, glucose, frutose, glice-raldeído, e provavelmente mais, tem a capacidade para desencadear a mudança de uma dobra globular nativa para a dobra de estrutura β cruzada de amilóide, após a sua ligação covalente a albumina. 8. Análise da ligação de vermelho do Congo e ligação de tPA a Αβ.

Foi demonstrado que Αβ pode ligar tPA e vermelho do Congo. Mostrou-se que a ligação de tPA a Αβ pode ser competitiva com o vermelho do Congo (Fig. 11). Estes resultados apoiam a observação de que as estruturas em Αβ, fibrina e albumina glicada são semelhantes e são capazes de mediar a ligação a tPA. 66 ΡΕ1536778 9. Ligação de FXII humana a péptidos e proteínas amilóides, que contêm a dobra de estrutura β cruzada

Os gráficos na figura 12 mostram que FXII se liga especificamente a todos os compostos amilóides testados. As kD's para ΙιΑβ (1-40), FP13, albumina-AGE e Hb-AGE são aproximadamente 2, 11, 8 e 0,5 nM, respectivamente. Os dados obtidos com a ELISA competitiva FXII - tPA mostram que tPA inibe eficientemente a ligação de FXII a (poli)péptido amilóides (Fig. 12). A partir destes dados concluiu-se que FXII e f.l. tPA competem para sítios de ligação sobreponíveis em ΙιΑβ (1-40). K2P-tPA não inibe a ligação de FXII. A ligação de FXII a albumina-AGE é também efectivamente abolida por tPA mas não por K2P-tPA, de modo semelhante ao que foi observado para ΙιΑβ (1-40) . Isto indica que FXII pode ligar-se de uma maneira semelhante a ΙιΑβ (Ι-ΙΟ) e albumina-AGE. Adicionalmente, estes dados mostram que os primeiros três domínios de tPA (dedo, tipo EGF, kringle 1) parecem estar envolvidos no efeito inibidor de f.l. tPA em interacções entre FXII e ΙιΑβ (1-40) de amilóide ou albumina-AGE. Utilizando u ensaio de transferência de gota testou-se a ligação de FXII a hAIAPP de amilóide e ϊιΑβ (Ι-ΙΟ) depositados. Não foi observada ligação de FXII para os controlos negativos PBS e mAIAPP (Fig. 12) . Contudo, FXII liga-se especif icamente a ΙιΑβ (1-40), de acordo com um relatório prévio65,assim como a hAIAPP (Fig. 12). Estes dados, em conjunto com os dados de ELISA apresentados na Fig. 12A-F, sugerem que FXII pode ligar-se a polipéptidos que não partilham homologia de sequência de aminoácidos, apesar de partilharem a dobra de estrutura β cruzada. Isto 67 ΡΕ1536778 está de acordo com os nossos dados recentes de interacções entre tPA e polipéptidos, que contêm a dobra específica de amilóides. 10. Ligação de tPA a moléculas contendo a estrutura β cruzada, Άβ e albumina glicada requer a presença de uma região N-terminal em tPA, que contém o domínio de dedo.

Foram mostrados vários domínios em tPA para mediar a ligação a fibrina ou fragmentos de fibrinal2;53; 66;67. Contudo é conhecido que o domínio tPA é necessário para ligação a Αβ ou outras moléculas contendo a estrutura β cruzada. Mostrou-se que um tPA mutado, denominado reteplase, que não possui o dedo N-terminal, EGF e domínio kringle 1 (K2-tPA)não é capaz de se ligar a moléculas compreendendo a estrutura β cruzada (Figura 13A, B). Estes resultados sugerem que a região N-terminal é necessária para a ligação de tPA a fibrilhas compreendendo uma estrutura β cruzada.

Expressão e purificação de tPA-F-GST e RPTP-GST A purificação das construções coma a marca GST de tPA-F-GST e RPTPP - GST (controlo) a partir do meio de 293T utilizando glutationa acoplada a esferas de Sepharose 4B resultou em bandas únicas de aproximadamente 35 kDa e 150 kDa, respectivamente (não apresentado). Estavam também presentes vestígios de BSA, originados pelo FCS utilizado no meio. 68 ΡΕ1536778 ELISA: Ligação de tPA-F-GST e RPTP-GST a Αβ(1-40) humana e albumina glicada

Na ELISA, a tPA controlo ligada a Αβ(1-40) humana e albumina-g6p na presença de excesso de sACA (Fig. 13C) . isto mostra que no ensaio utilizado a tPA é capaz de se ligar a amilóides fibrosos de uma forma independente de kringle2. 0 domínio F de tPA liga-se a Αβ(1-40) humana e a albumina-g6p, enquanto não é observada ligação com RPTPP-GST. Deste modo, a ligação observada com tPA-F-GST é específica e não tem origem na marca GST. Este resultado aponta para o domínio de dedo de tPA como um domínio específico concebido pela natureza para ligação a fibrilhas amilóides de estrutura β cruzada.

Prepararam-se construções de cDNA em pcDNA3 de fragmentos F, F-EGF, EGF, F-EGF-K1 e Kl de tPA humana. As proteínas recombinantes com uma marca GST C-terminal foram expressas em células BHK e segregadas no meio. 0 meio das células BHK que expressam a marca GST isolada foi utilizado como um controlo. 0 meio condicionado foi utilizado para ensaio de precipitações utilizando Αβ e fibrilhas IAPP, seguido por análise de transferência de Western. A ligação eficiente a Αβ é evidente para todos os três mutantes de tPA que contêm o domínio de dedo, í.e. F-GST, F-EGF-GST e F-EGF-K1-GST (Fig. 13D) . As construções Kl-GST e EGF-GST, assim como a marca GST isolada permanecem no sobrenadante após incubação com Αβ. Foi obtido um padrão semelhante após precipitação de IAPP (não apresentado). 69 ΡΕ1536778

Comparou-se a ligação de F-EGF-GST de tPA purificado, f.1.recombinante, Actilyse tPA e um controlo GST a Αβ amilóide imobilizada, o fragmento de fibrina al48-160FP13 amilóide, IAPP amilóide e um controlo mAIAPP não amilóide (Fig. 13EG). 0 tPA de comprimento total e F-EGF-GST de tPA ligam-se a três péptidos amilóides; para Αβ os kDs para tPA e F-EGF são 2 e 2 nM, respectivamente, para FP13 5 e 2 nM, para IAPP 2 e 13 nM. Não é observada ligação a mAIAPP não amilóide (Fig.l3E). A GST não se liga a FP13 e IDPP, enquanto é detectada alguma ligação a Αβ. Isto pode reflector a pequena fracção de fGST que se liga a Αβ no ensaio de precipitação (Fig. 13D).

Com a análise imuno-histoquímica testou-se a ligação da construção F-EGF-GST de tPA purificado recombinante a secções de parafina de cérebro humano infligido por AD. A presença de deposições de amilóide foi confirmada pelo Dept. de Patologia (UMC Utrecht) utilizando técnicas convencionais. Nestas experiências, estas deposições de amilóide foram localizadas utilizando fluorescência de vermelho do Congo (Fig. 131, , K, M). Na Fig. 13H e I, e na Fig. 13J e K é nitidamente observado que as áreas que são positivas para ligação do vermelho do Congo coincide com áreas que são positivas para a ligação a F-EGF-GST de tPA. 0 controlo de coloração com GST não apresenta ligação específica à marca isolada (Fig. 13L-M). Presentemente, com base em homologia sequencial e estrutural, próximas de tPA, são conhecidas três proteínas que contêm um ou mais 70 ΡΕ1536778 domínios de dedo, i.e. HGFa (um domínio F) , FXII (um domínio F, Fn (uma cadeia de seis domínios F, duas cadeias de domínios F) . a partir dos resultados acima listados concluiu-se que o domínio F de tPA desempenha um papel crucial na ligação de tPA a (poli)péptidos amilóides. Colocou-se a hipótese que o domínio de dedo pode ser um módulo geral de ligação a estrutura β cruzada. Presentemente são conhecidas 4 proteínas, tPA, FXII, HGFa e fibronectina, que contêm um motivo de dedo. A Figura 14A apresenta esquematicamente a localização do módulo de dedo nas respectivas proteínas. A Fig 14B mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos humanas do domínio de dedos nestas quatro proteínas. A Figura 14C mostra uma representação esquemática da estrutura 3-dimensional do domínio de dedo de tPA, e dos quarto e quinto domínios de dedo da fibronectina. Para testar a hipótese de que o domínio de dedos se liga, em geral, a amilóide clonaram-se os domínios F de HGFa e FXII, assim como o quarto e quinto domínios F de Fn, que são conhecidos pela sua capacidade de se ligarem a fibrina68. Utilizando um ensaio de precipitação, mostrou-se que F4-GST de Fn e F4-5-GST de Fn, assim como F-GST de FXII e F-GST de HGFa se ligam especif icamente a Αβ (Fig. 13 M-N) e IAPP (não apresentado) . F5-GST de Fn liga-se a Αβ em alguma extensão, contudo, é extraído menos eficientemente do meios e parece ser libertado parcialmente durante o procedimento de lavagem do precipitado amilóide (Fig. 13M) . Não ficou nenhuma construção no meio após a extracção do controlo positivo F-EGF-GST de tPA, enquanto que não foi detectado controlo negativo GST na fracção do precipitado (não 71 ΡΕ1536778 apresentado). Estes dados mostram que a ligação a (poli)péptidos de amilóide não é uma capacidade única do domínio F de tPA, é ainda uma propriedade mais geral dos domínios F testados. Além disso, estes dados indicam que a ligação observada de FXII a (poli)péptidos amilóides, como apresentado na Fig. 13A, H e por Shibayama et al. 65, é regulada via o domínio F. 11. Dominio de tPA de ligação a amilóide

Foi verificado que o domínio de dedo de tPA era importante para a ligação com elevada afinidade a fibrinal2;66. Os presentes resultados utilizando reteplase (K2-P tPA) e F-tPA, F-EGF-tPA e F-EGF-Kl-tPA indicam um importante papel para o domínio de dedo N-terminal de tPA na ligação a factores estimuladores para além da fibrina. De longe, estes factores ligam o vermelho do Congo e contêm estrutura β cruzada. Além disso, o sítio de ligação de fibronectina para a fibrina foi mapeada no domínio de dedo em tandem F4-F568. Foi demonstrado que a activação de plasminogénio por um tPA de comprimento total, na presença de fragmento de fibrina FCB2, pode ser inibida por fibronectina69. Em conjunto, estas observações sugerem que tPA e fibronectina competem, via o seu domínio de dedo, para os mesmos sítios de ligação ou sobreponíveis na fibrina. Estes dados, agora, mostram que os domínios F4-5 de Fn se ligam a Αβ de amilóide. 72 ΡΕ1536778

12. Ligação de anticorpos anti-AGE a (poli)péptidos amilóides e ligação de anti-Αβ a adutos proteina-AGE

Recentemente, 0'Nuallain e Wetzel70 mostraram que os anticorpos estimulados contra um péptido com carac-terísticas de amilóide, pode ligar-se a qualquer outro péptido com propriedades de amilóide semelhantes, independentemente da sequência de aminoácidos. Com base nestes dados e nas nestas observações de que o activador de plasminogénio do tipo tecido e o factor XII pode ligar-se a uma família de polipéptidos de sequência não relacionada, que partilham uma dobra específica para a estrutura β cruzada amilóide, colocou-se a hipótese de uma vasta classe de proteínas poder apresentar afinidade contra esta unidade estrutural, em vez de contra um epitopo linear ou confor-macional, construído por resíduos de aminoácidos específicos. Esta hipótese levou-nos à questão de se os anticorpos estimulados contra a albumina-AGE, que contêm a dobra de estrutura β cruzada amilóide, também apresentam uma vasta gama de especificidade contra qualquer (poli)péptido que alberga esta dobra de estrutura β cruzada.

Numa preparação de ELISA, aa-AGEl, que foi estimulada contra albumina glicada g6p-AGE, liga-se a albumina-AGE: 23 de amilóide (Kd = 66 nM) e Hb-AGE:32 (Kd = 20 nM), assim como a Αβ(1-40) (Kd = 481 nM) e IAPP (Kd = 18 nM) (Fig.l5A-C). Os controlos negativos foram albumina não glicada e Hb, péptido não amilóide de ratinho ΔΙΑΡΡ para 73 ΡΕ1536778

IAPP e anticorpo policlonal anti-vitronectia humana a-hVn K9234 para Αβ. Para testar se a mesma fracção de α-AGEl se liga a IAPP e Αβ, o anticorpo foi pré-incubado com fibrilhas IAPP, seguido por precipitação das fibrilhas, em conjunto com a possível fracção de ligação a amilóide de a-AGE1. A ligação de α-AGEl, que fica no sobrenadante, a Αβ(1-40) foi reduzida (Fig. 15D) . Isto indica que a mesma fracção de α-AGEl se liga a IAPP e Αβ(1-40). Com um ensaio de precipitação avaliou-se a ligação de anti-AGEl a péptidos amilóides numa via alternativa. Após incubação de soluções de anti-AGE com fibrilhas amilóides Αβ(16-22)(Fig. 15E; faixa 1-2), Αβ(1-40) (Fig. 15E; faixa 4-5) e IAPP (Fig. 15E; faixa 6-7), e subsequente precipitação das fibrilhas amilóides, o sobrenadante foi completamente desprovido de α-AGEl por Αβ(16-22). Com IAPP, aproximada-mente 50% do anticorpo é encontrado na fracção amilóide, enquanto menos anticorpo é precipitado com Αβ(1-40). Estes dados obtidos de uma forma complementar mostram de novo que anti-AGEl pode ligar-se a péptidos amilóides, que não partilham homologia de sequência de aminoácidos com a albumina-AGE:23, ainda que partilhe a dobra de estrutura β cruzada. Adicionalmente, a observação de que a ligação de tPA a péptidos amilóides inibe a ligação de anti-AGEl, também indica que anti-AGEl, como tPA, se liga à dobra de estrutura β cruzada (Fig.l5F-G). A observação de que tPA reduz a ligação de anti-AGEl a Αβ a uma menor extensão do que a redução observada com IAPP, está putativamente relacionada com o maior número de sítios de ligação de anti-AGEl ao revestimento de Αβ, quando comparado com IAPP 74 ΡΕ1536778 (ver Fig.l5B-C), e com a maior afinidade de tPA para IAPP (kD = 6 nM) do que para Αβ (kD = 4 6 nM) , quando se utiliza placas de ELISA Exiqon (não apresentado). Os dados de ligação em conjunto sugerem que anti-AGEl se ligam a esta dobra amilóide, independentemente do (poli)péptido que alberga a dobra de estrutura β cruzada, que identifica anti-AGEl como um membro da classe de proteínas que se ligam a estrutura β cruzada multi-ligando.

Com base nos resultados acima listados obtidos com anti-AGEl, testou-se se ο Αβ(1-42)anti-humano de coelho H-43 comercialmente disponível também apresenta uma especificidade de largo espectro contra qualquer (poli)-péptido com sequência de aminoácidos não relacionada, apesar de ter as características de amilóide. De facto, com uma ELISA pode mostrar-se que H-43 não só se liga a Αβ(1-40), mas também a IAPP e albumina-AGE (Fig. 15H) . Adicionalmente, a ligação de H-43 a IAPP imobilizada foi efectivamente diminuída por tPA (Fig. 151). estas observações em conjunto mostram que anti-Αβ(1-42) H-43 pode ligar-se a outros (poli)péptidos de amilóide de uma maneira semelhante a uma proteína tPA multi-ligando de ligação a uma estrutura β cruzada.

As ELISAs com policlonais de ratinho anti-albumina-AGE/Αβ mostram que o anticorpo não se liga apenas a estes antigénios, mas que se liga especificamente a outros péptidos amilóides para além dos utilizados para a imunização (Fig. 15J-L). Semelhante ao anticorpo de coelho 75 ΡΕ1536778 anti-AGEl e anti-Αβ(1-42) H-43, anti-albumina-AGE/Αβ apresenta afinidade para os péptidos amilóides testados, independentemente da sequência de aminoácidos. Isto sugere que também o anti-albumina-AGE/Αβ de ratinho é um anticorpo de ligação a amilóide multi-ligando.

Com base nas caracteristicas de ligação ao amilóide de anti-AGEl, anti-Αβ(1-42) H-43 e anti-albumina-AGE/Αβ, purificou-se a fracção de ligação a amilóide de anti-AGE2, que é estimulada contra albumina-AGE:23, com fibrilhas de Αβ irreversivelmente acopladas a uma coluna. Esta fracção foi utilizada para análise imuno-histoquímica de uma secção de cérebro humano que é infligido por doença de Alzheimer. Na Fig. 15M é nitidamente observado que o anticorpo se liga especificamente à deposição amilóide esférica, indicada pela fluorescência do vermelho do Congo, mostrada na Fig. 15N. A observação de que os anticorpos anti-amilóide e anti-AGE apresentam afinidade para uma vasta gama de (poli)péptidos sequencialmente não relacionados, desde que a dobra da estrutura β cruzada esteja presente, está de acordo com os dados recentemente publicados por 0'Nuallain e Wetzel70 e Kayed et al.71. A partir de vários relatórios anteriores na literatura pode ser destilado que podem ser obtidos os anticorpos anti-β cruzada. For exemplo, os anticorpos que reagem de forma cruzada contra fibrina e Αβ e contra Αβ e hemoglobina são descritos72;73. Indicou-se aqui que o fibrinogénio e hemoglobina-AGE adoptam a dobra 76 ΡΕ1536778 de estrutura β cruzada, que sugere que a reactividade cruzada observada para os anticorpos anti-Αβ foi de facto a ligação de anticorpos anti-estrutura β cruzada a epitopos de estrutura semelhante em Αβ, fibrinogénio e hemoglobina.

Com base nestes resultados com os anticorpos policlonais anti-AGE e amilóide pôs-se a hipótese de que podiam ser obtidos os anticorpos anti-estrutura β cruzada. Deste modo, fundiram-se baços de ratinhos imunizados com BSA glicada e Αβ com células de mieloma. Subsequentemente seleccionara-se anticorpos potenciais anti-estrutura β cruzada através do exame da ligação de anticorpos produzidos por hibridoma a hemoglobina glicada e IAPP. Utilizando este procedimento isolou-se o anticorpo monoclonal 3H7, que reconhece a hemoglobina glicada assim como vários péptidos que contêm a estrutura β cruzada (Fig. 16) . Não foi observada ligação a hemoglobina não glicada ou um péptido sintético que não forma fibrilhas de amilóide (mAIAPP) 13. ELISA Sanduíche: pesquisa de estruturas amilóides em solução

Utilizando uma abordagem de ELISA sanduíche com revestimento de tPA que foi coberto com albumina-AGE:23 amilóide em solução, seguida por detecção com de largo espectro com anti-Ab(1-42) H-43 (Fig. 17), foi possível detectar em solução proteínas contendo a estrutura β cruzada. 77 ΡΕ1536778 É aqui revelado que as estruturas tridimensionais do domínio de dedo7 4;75 de tPA e os domínios de dedo 4-575; 76 de fibronectina revelam uma impressionante homologia estrutural no que respeita a uma distribuição de densidade de carga local. Ambas as estruturas contêm uma cadeia semelhante de cinco resíduos de aminoácidos expostos a solvente com carga alternante; para Arg7, Glu9,Arg23, Glu32, Arg30 de tPA, e para Arg83, Glu85, Lys87, Glu89, Arg90 de fibronectina, localizada no quinto domínio de dedo, respectivamente. Os alinhamentos dos resíduos carregados são localizados no mesmo lado do módulo de dedo. Estes alinhamentos podem ser essenciais para a ligação de fibrina.

Com base nestas observações, resultados e as semelhanças aqui reveladas, mostrou-se que os mesmos sítios de ligação de tPA estão presentes em todas as proteínas que se ligam e activam tPA e que este sítio de ligação compreende a estrutura β cruzada.

Em conjunto, os nossos dados mostram que a estrutura β cruzada é um elemento de estrutura quaternária fisiológica relevante cujo aparecimento é fortemente regulado e cuja ocorrência induz uma normal resposta fisiológica, í.e. a remoção de biomoléculas indesejadas. Para o nosso conhecimento, a existência de um sistema geral, que denominamos "via da estrutura β cruzada" para remover biomoléculas indesejadas é, aqui, revelada pela 78 ΡΕ1536778 primeira vez. Estes resultados mostram que este mecanismo é fundamental para a natureza e controla muitos processos fisiológicos para proteger organismos de lesões induzidas ou de acumulação de biomoléculas desnecessárias ou desnaturadas. Se for, de alguma forma desregulado, este sistema pode causar problemas graves. Por outro lado, se apropriadamente utilizado, este sistema pode ser aplicável para induzir morte celular em células alvo específicas, como por exemplo células tumorais.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1.

Representação esquemática da "via da estrutura β cruzada" A estrutura β cruzada é encontrada em várias proteínas (1) . A formação de uma estrutura β cruzada pode ser desencadeada por vários estados fisiológicos ou patológicos e inicia subsequentemente uma cascata de eventos, a "via de estrutura β cruzada". De entre os factores que desencadeiam ou regulam a formação de uma estrutura β cruzada numa dada proteína estão: 1) as propriedades físico-químicas da proteína, 2) proteólise, 3) modificação pós-tradução regulada, incluindo ligação cruzada, oxidação, fosforilação, glicosilação e glicação, 4) glucose, e 5) zinco. Certas mutações na sequência de uma proteína são conhecidas por aumentar a capacidade da 79 ΡΕ1536778 proteína adoptar uma estrutura β cruzada e formar fibrilhas de amilóide. Estas mutações são frequentemente encontradas em formas hereditárias de amiloidose, por exemplo em AD. A presente invenção revela múltiplos novos exemplos de proteínas capazes de adoptar uma estrutura β cruzada. Várias proteínas são conhecidas por se ligarem a proteínas contendo β cruzada (2). Estas proteínas são parte da, aqui revelada, cascata de sinalização ("via da estrutura β cruzada") que é desencadeada após a formação de uma estrutura β cruzada. A "via da estrutura β cruzada" é modulada de várias maneiras (3,4,5). Os factores que regulam a via incluem moduladores de síntese e secreção, incluindo reguladores NO, assim como moduladores de actividade, incluindo inibidores de protease. A via está envolvida em muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo, mas não se limitando a aterosclerose, diabetes, amiloidose, hemorragia, inflamação, esclerose múltipla, doença de Parkinson, sepsia, síndroma de uremia hemolítica (7) . Dado o papel estabelecido para tPA na potenciação a longo termo, a "via da estrutura β cruzada" pode também estar envolvida na aprendizagem.

Figura 2.

Estrutura β cruzada em fibrina. (A) Fluorescência de Tioflavina T de um coágulo de fibrina. Foi formado um coágulo de fibrina na presença 80 ΡΕ1536778 de Tioflavina T e a fluorescência foi registada nos pontos de tempo indicados. A fluorescência de ruído de base do tampão, Tioflavina T e de um coágulo formado na ausência de Tioflavina T, foi subtraída. (B) A análise de dicroismo circular do péptido 85, 86 e 87 derivados da fibrina. Elipsicidade (Dg.cm2/dmol) é apresentada em gráfico contra o comprimento de onda (nm) . O espectro de CD demonstra que os péptidos 85 e 86, mas não o péptido 87, contêm folhas β. (C) Análise de difracção de raios X das fibras do péptido 85 revela que o péptido forma folhas β cruzadas. (D) Ensaio de activação de plasminogénio com os péptidos 85, 86 e 87 de fibrina. É observado que o péptido 85 e 86, ambos contendo a estrutura β cruzada estimulam a formação de plasmina por tPA, enquanto o péptido 87, que não possui uma estrutura β cruzada não o faz.

Figura 3.

Ligação de tPA, plasminogénio e plasmina a Αβ. A Αβ foi revestimento de placas de plástico de 96 poços. Concentrações crescentes de (A) tPA ou (B) plasmin(ogénio) foram deixadas a ligar ao péptido imobilizado. Após extensiva lavagem a ligação de tPA e plasmin(ogénio) foi avaliada por ensaios imunoabsorventes ligados a enzima utilizando anticorpos anti-tPA e anti-plasminogénio. A ligação de (C) tPA e (D) plasmina a Αβ na presença de 50 mM ácido ε-aminocapróico (ε-ACA) foi avaliado como em A e B. 81 ΡΕ1536778

Figura 4.

Estimulação da formação de plasmina mediada por tPA por Άβ e estimulação sinergistica da separação de células por plasminogénio e Αβ. (A) Plasminogénio (200 pg/mL) e tPA (200 μΜ) foram incubados com Αβ (5 μΜ) ou tampão controlo. As amostras foram retiradas da mistura de reacção nos períodos de tempo indicados e actividade de plasmina foi medida por conversão do substrato cromogénico da plasmina S-2251 a 405 nm. (B) As células N1E-115 foram diferenciadas e receberam as concentrações indicadas de plasmina na presença ou ausência de 25 μΜ de Αβ. Após 48 horas as células mortas foram retiradas por lavagem e as restantes células aderentes foram coradas com azul de metileno. A plasmina não pode evitar a separação de células induzida por Αβ. (C) As células N1E-115 foram diferenciadas e receberam as concentrações indicadas de plasminogénio na presença ou ausência de 10 μΜ de Αβ. Após 24 horas a separação de células foi então avaliada. A Αβ ou plasminogénio isolado não afectam a adesão celular, mas causam a separação de células massiva quando adicionados em conjunto. (D) Análise de imunotransferência da formação de plasmina e degradação de laminina. As células N1E-115 diferenciadas foram tratadas com ou sem Αβ (10 μΜ) na ausência ou presença de plasminogénio adicionado. A adição de Αβ resulta na 82 ΡΕ1536778 formação de plasmina (painel inferior) e na degradação de laminina (painel superior).

Figura 5.

Carboxipeptidase B inibe a formação de plasmina mediada por tPA e separação celular estimulados por Αβ. (A) Plasminogénio (200 pg/mL) e tPA (200 μΜ) foram incubados com Αβ (5 μΜ) ou tampão controlo. As amostras foram retiradas da mistura de reacção nos períodos indicados de tempo e a actividade de plasmina foi medida pela conversão do substrato cromogénico da plasmina S-2251 a 405 nm. A reacção foi efectuada na ausência ou na presença de 50 pg mL-1 de carboxipeptidase B (CpB) e na ausência ou presença de 3,5 μΜ de inibidor de carboxipeptidase (CPI). A CpB atenua fortemente a formação de plasmina estimulada por A. (B) As células N1E-115 foram diferenciadas e tratadas com Αβ (10 μΜ) , plasminogénio (Plg, 20 pg ml-1) e/ou CpB (1 μΜ) como indicado. Após 24 horas as células foram fotografadas. (C) Subsequentemente, as células foram lavadas uma vez com PBS e as restantes células foram quantificadas como uma percentagem de células aderentes por coloração com azul de metileno. (D) as células foram tratadas como em (B) e (C) e as fracções de meio e as células foram recolhidas e analisadas por transferência de western utilizando um anticorpo anti-plasmin(ogénio) . Αβ estimula a formação de plasmina que é inibida por CpB. 83 ΡΕ1536778

Figura 6.

Endostatina pode formar fibrilhas compreendendo a estrutura β cruzada e estimula a activação de plasminogénio (A) TEM mostra a formação de fibrilhas de endostatina. (B) Análise de raios X revela a presença de estrutura β cruzada em endostatina precipitada (prec.). (C) 0 ensaio de activação de plasminogénio que demonstra a actividade de estimulação da estrutura β cruzada contendo endostatina na formação de plasmina mediada por tPA. Αβ é apresentada para comparação. (D) Análise de endostatina induziu morte celular por coloração com azul de metileno. É observado que apenas a forma precipitada é capaz de induzir eficientemente a morte celular. A morte celular directa, mas não a separação de células, é protegida na presença de glucose suficiente. Tampão prec. indica o tampão controlo.

Figura 7.

IAPP estimula a activação de plasminogénio mediada por tPA

Ambos os núcleos de amilóide de comprimento total (fl-hIAPP) e truncado amilóide (Δ-hIAPP), mas não IAPP (Δ -mIAPP) de ratinho estimularam a activação de plasminogénio mediada por tPA. 84 ΡΕ1536778

Figura 8.

Albumina glicada: Ligação de tioflavina T e tPA, imagens TEM, difracção de raios X de fibras. (A) ELISA apresentando ligação de tPA a albumina-g6p. (B) Competição de ligação de tPA a albumina-g6p pelo vermelho do Congo como determinado utilizando ELISA. (C) Medições de fluorescência da ligação de Tioflavina T a albumina-g6p, que é incubada duas-, quatro-, ou 23 semanas. (D) Inibição do sinal fluorescente obtido após incubação de 430 nM de albumina-g6p com 19 μΜ de Tioflavina T por tPA. (E) Análise espectrofotométrica a 420 nm mostra que quantidades crescentes de tPA resultam num decréscimo da absorvência especifica obtido após incubação de 500 nM de albumina-g6p com 10 μΜ de Tioflavina T. (G) Micrografias electrónicas apresentando precipitados amorfos de albumina-g6p glicada de quatro-semanas, (H) feixes de agregados fibrilhares de albumina-g6p incubada 23-semanas. (I) Duas-semanas de albumina-g6p glicada. (J) Dispersão de raios X de albumina-g6p (23 semanas). As intensidades de dispersão têm um código de cores numa escala linear e diminuem na ordem de branco-cinza. A dispersão do controlo amorfo albumina é subtraída, assim como a dispersão da parede do vidro do capilar e do ar. Os espaçamentos d e a direcção do eixo da fibra são dados e as orientações preferidas são indicadas com setas. (K) Varrimentos radiais do controlo de albumina e de albumina-g6p (23 semanas). (L) Varrimento 85 ΡΕ1536778 radial de albumina-g6p (23 semanas), apresentando repetições com origem na estrutura fibrosa, após subtracção da dispersão do ruido de fundo da albumina amorfa precipitada. Os espaçamentos d (em Â) são apresentados acima dos picos. (M) Varrimentos tangenciais ao longo dos ângulos de varrimento 2q, correspondendo aos espaçamentos d indicados. Os varrimentos mostram que a repetição de 4,7 À, que corresponde à distância da ligação de hidrogénio nas folhas β individuais, e a repetição de 6 Â, estão orientadas perpendicularmente à repetição de 2,3 Â, que se apresenta paralelamente ao eixo da fibra. (N) Desenho esquemático da orientação das estruturas β cruzadas em fibrilhas de albumina-g6p amilóide (23 semanas).

Figura 9.

Formação de fibrilhas de hemoglobina humana. (A) Ligação de tPA a Hb-g6p glicada in vitro. (B) Micografias electrónicas apresentando Hb glicada in vitro, que agrega de uma maneira amorfa e fibrosa.

Figura 10. São introduzidas propriedades de amilóide da albumina-AGE independentemente dos carbo-hidratos ou derivados de carbo-hidratos utilizados para glicação. 86 ΡΕ1536778 (A-I) Fluorescência de vermelho do Congo de preparações de albumina secas ao ar. A fluorescência foi medida com albumina incubada com tampão (A) ou com tampão e NaCNBH3 (B), com péptido do núcleo amilóide humano de IAPP (C) , Αβ (D) , com albumina incubada com g6p (E) , glucose (F) , frutose (G) , gliceraldeido (H) , e ácido glioxilico (I) . (J) A fluorescência amilóide da tioflavina T foi medida em solução com as preparações de albumina indicadas. (K-L) A ligação da protease de serina de tPA que se liga a amilóide a preparações de albumina foi ensaiada utilizando uma preparação de ELISA. Em (K) é apresentada a ligação de tPA a albumina-glucose, -frutose, -gliceraldeido, -ácido glioxilico, e controlos albumina-tampão. Em (L) é apresentada a ligação de tPA aos controlos positivos albumina-g6p, Αβ e IAPP, assim como a albumina incubada com tampão de controlo.

Figura 11.

Análise de vermelho do Congo e ligação de tPA ao

Anticorpo (A) Ligação de tPA a Αβ imobilizada, como medido utilizando uma ELISA. (B) Influência de concentrações crescentes de vermelho do Congo na ligação de tPA a Αβ. Na ELISA 10 pg mL-1 de Αβ(1-40) foi revestido e incubado com 40 nM de tPA e 0-100 pm de vermelho do Congo. 87 ΡΕ1536778

Figura 12.

Ligação de FXII humano a péptidos e proteínas amilóides, que contêm dobras de estrutura β cruzada (A-B) A ligação de FXII aos péptidos protótipo amilóides 1ιΑβ(1-40) e fragmento de fibrina humano al47-159 FP13, e albumina-AGE e Hb-AGE, que contêm todos estrutura β cruzada, foi testada numa ELISA. FXII não se liga aos controlos negativos de polipéptidos de ilhéu amilóide D de ratinho (AmIAPP), albumina-controlo e Hb-controlo, que todos sem estrutura específica de amilóide. Os kD's para 1ιΑβ(1-40), FP13, albumina-AGE e Hb-AGE são aproximadamente 2, 11, 8 e 0,5 nM, respectivamente.(C-D) O revestimento 1ιΑβ(1-40) foi incubado com 2,5 nM FXII em tampão de ligação, na presença de uma série de concentrações de activador de plasminogénio do tipo tecido humano recombinante (Actilyse®, tPA de comprimento total), ou Reteplase® (K2P-tPA). A concentração de f.l. tPA- e K2P-tPA foi no máximo 135 vez o kD para a ligação de tPA a 1ιΑβ(1-40) (50 nM). (EF) o revestimento de albumina-AGE de amilóide foi incubado com 15 nM de FXII em tampão de ligação, na presença de uma série de concentrações de f.l. tPA ou K2P-tPA. A concentração de tPA foi no máximo 150 vezes o kD para a ligação de tPA a albumina-AGE (1 nM) . (G) A ligação de FXII a 1ιΑβ(1-40) e o protótipo do fragmento de amilina de amilóide humano hDIAPP foi testada utilizando análise de transferência de gota. Foram colocados 10 pg dos 88 ΡΕ1536778 péptidos que contêm estrutura β cruzada, assim como o controlo negativo péptido mAIAPP e salino tamponado com fosfato (PBS) em duplicado. FXII ligou-se especificamente a 1ιΑβ(1-40), assim como a hAIAPP.

Figura 13.

Dominio de dedos liga-se aos (poli)péptidos do amilóide (A) Ligação de tPA e K2-P tPA a albumina-g6p. (B) Ligação de tPA e K2-P tPA a Αβ(1-40) . 0 anticorpo de tPA utilizado para a detecção reconhece tPA e K2-P-tPA com igual afinidade (não apresentado). (C) Ligação de tPA-F-GST e tPA a Αβ(1-40) imobilizada e albumina-g6p. 0 controlo RPTPP-GST não se liga a Αβ ou albumina-g6p. (D) 0 ensaio de precipitação com fibrilhas Αβ insolúveis e domínios tPA. Foi utilizado o meio BHK condicionado de linhas de células estavelmente transfectadas que expressam tPAF, F-EGF, EGF, F-EGF-K1 e Kl com uma marca C-terminal GST, assim como somente a marca. 'Controlo', meio antes da precipitação, Άβ' , precipitado Αβ de amilóide, após a precipitação, 'Sup', meio após extracção com Αβ. As amostras foram analisadas em transferência de Western utilizando anticorpo anti-GST de coelho Z-5. (E-G) ELISA apresentando a ligação de tPA F-EGF-GST e tPA f.l. recombinante a amilóide Αβ (E), FP13 (F) e IAPP (G) . 0 mAIAPP foi revestido como controlo negativo não amilóide (E) . Os péptidos foram imobilizados em placas de ELISA e cobertos com séries de concentrações 89 ΡΕ1536778 de tPA e F-EGFGST. 0 GST foi utilizado como um controlo negativo. A ligação foi detectada utilizando anticorpo anti-GST de coelho Z-5. (H-M) A análise imuno-histoquimica da ligação de tPA F-EGF-GST a depósitos de amilóide no cérebro de humano infligido por AD. As secções de cérebro foram cobertas com tPA F-EGF-GST (H, J) ou o controlo negativo GST (L) . As mesmas secções foram incubadas com vermelho do Congo (I, K, M) para localizar os depósitos de amilóide. (N-0) Ensaio de precipitação com fibrilhas insolúveis Αβ e domínio de dedos. Os domínios F recombinantes com uma marca C-terminal GST foram expressos por células BHK estavelmente transfectadas. Controlo', meio antes da precipitação, Άβ' , precipitado de Αβ amilóide lavado, após a precipitação, 'Sup', meio após extracção com Αβ. As amostras foram analisadas em transferência de Western utilizando anticorpo anti-GST de coelho Z-5.

Figura 14. O modulo do dedo. (A) Representação esquemática da localização do domínio de dedo em tPA, factor XII, HGFa e fibronectina. (B) Alinhamento da sequência de aminoácidos do domínio de dedo das respectivas proteínas. (C) Representação da estrutura de péptido do domínio de dedo de tPA e o quarto e o quinto domínio de dedo de FN. As ligações persulfureto conservadas são apresentadas em bola e bastão. 90 ΡΕ1536778

Figura 15.

Anticorpos estimulados contra péptidos amilóides reagem de forma cruzada com proteínas glicadas, e vice-versa A ELISA (A-C) com albumina glicada g6p-AGE:23 imobilizada e Hb-AGE, seus controlos não glicados (A) , Αβ (1-40) (B) , e IAPP e mAIAPP (C) . Para a ELISA Αβ, o anticorpo policlonal anti-vitronectina humana α-hVn K9234 foi utilizado como um controlo negativo. (D) a ligação de α-AGEl a imobilizada Αβ(1-40) numa placa de ELISA, após pré-incubação de α-AGEl com fibrilhas IAPP. (E) 0 ensaio de precipitação com anticorpo anti-AGEl e fibrilhas de amilóide de Αβ(16-22) (faixa 1-2), Αβ(1-40) (faixa 4-5) e IAPP (faixa 6-7) . Após precipitação e lavagem das fibrilhas, amostras foram fervidas em tampão de amostra não redutor e analisadas por SDS-PAGE. s = sobrenadante após extracção de amilóide, p = precipitado de amilóide após extracção, m = marcador molecular. (F-G) Numa preparação de ELISA, Αβ(1-40) (F) imobilizada e IAPP (G) são co-incubadas com tPA e 250 ou 18 nM α-AGEl, respectivamente. (H) numa preparação de ELISA a ligação de α-Αβ(1-42) H-43 ao controlo positivo Αβ(1-40) imobilizado, e a IAPP e albumina-AGE:23 é testada. A albumina-controlo: 23 e mAIAPP são utilizados como controlos negativos. (I) A ligação de 100 nM de α-Αβ(1-42) H-43 a IAPP, imobilizado numa placa de ELISA, na presença de uma série de concentrações de tPA. 91 ΡΕ1536778 (J-K) ELISA apresentando a ligação de um anticorpo policlonal em soro de ratinho estimulado contra albumina-AGE:23 e Αβ(1-40) (proporção 9:1) ('poab anti-amilóide1) e de um anticorpo policlonal estimulado contra uma proteína de controlo ('soro de controlo1) a IAPP imobilizada (J) e albumina-AGE:23 (K). 0 soro foi diluído em PBS com 0,1% v/v de Tween20. (L) ELISA apresentando a ligação de soro poab anti-amilóide de ratinho a amilóide Αβ(1-40), hAIAPP e fragmento de fibrina al48-160 FP13. O soro controlo com anticorpos produzidos contra uma proteína não relacionada, tampão e mAIAPP não amilóide imobilizada e fragmento de fibrina al48-157 FP10 foram utilizados como controlos negativos. (Μ) A análise imuno-histoquímica da ligação de anti-AGE2 de Coelho a uma placa esférica amilóide (seta) numa secção de um cérebro humano infligido por AD. Amplificação de 400x. (N) Fluorescência de vermelho do Congo da mesma secção. Amplificação de 630x.

Figura 16.

Anticorpo monoclonal anti-estrutura-p-cruzada 3H7 detecta hemoglobina glicada, Αβ, IAPP e FP13 ELISA apresentando a ligação do anticorpo monoclonal de ratinho anti-estrutura-p-cruzada 3H7 a (A) hemoglobina glicada vs hemoglobina não glicada controlo ou (B)Αβ, hIAPP, AmIAPP e fragmento de fibrina al48-160FP13. 92 ΡΕ1536778

Figura 17. ELISA Sanduíche para detecçâo de albumina-AGE de amilóide ou hemoglobina amilóide em solução A tPA recombinante imobilizada em Imobilizadores de proteína foi coberta com solução de albumina-AGE:23 ou solução de oralbumina-controlo:23 nas concentrações indicadas. A seguir, as estruturas de amilóide ligadas foram detectadas com anti-Αβ(1-42) H-43 (A).

Tabelas

Tabela I

Percentagem de folha β, ccmo calculado a partir do espectro de CD Amostrai Tempo de incubação (semanas) Folha β (%)t Αβ (16-22) 100 Albumina-gliceraldeído 2 0 Albumina controlo 2 0 Albumina-g6p 2 0 Albumina-g6p 4 7 Albumina controlo 23 0 Albumin-g6p 23 19 Φ Albumina incubada duas semanas foi de um lote diferente do da albumina incubada quarto e 23 semanas. t É dada a percentagem de resíduos de aminoácidos em folhas β._ ΡΕ1536778 93

Tabela II

Correlação entre as concentrações de HbAlc e formação de fibrilhas de Hb in vitro.

Controlos saudáveis Doentes com diabetes mellitus amostra [HbAlc] (%) φ Fibrast amostra (%)* [HbAlc] Fibrast 1 5,6 1 5,5 - 2 5,9 2 5,8 - 3 6,2 3 5,8 - 4 10,7 - 5 11,3 - 6 11,6 - 7 12,4 + 8 12,5 - 9 12,5 - 10 12,6 + 11 12,7 - 12 12,8 - 13 13,3 + 14 13,7 + 15 14,8 + 16 15,3 + φ A concentração de HbAlc é dada como uma percentagem da quantidade total de Hb presente em eritrócitos de doentes com diabetes mellitus e de controlos saudáveis. 0 d.p. é 2,3% dos valores dados. t Presença de fibras como determinado com TEM. 94 ΡΕ1536778

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Lisboa, 16 de Março de 2009

Claims (1)

1. ΡΕ1536778 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto capaz de se ligar a uma estrutura beta cruzada para a preparação de um medicamento para diminuir as proteínas desorganizadas que adoptaram uma conformação parcialmente estruturada, envolvida numa doença conformacional, em que o referido composto é um anticorpo ou compreende um domínio de dedo, em que o referido domínio de dedo é derivado de Fibronectina, FXII ou HGFa, e em que a referido doença é uma doença caracterizada por amilóide, aterosclerose, diabetes, hemorragia, trombose, cancro, sepsia, Esclerose Múltipla, doenças autoimunitárias, artrite reumatóide, doença associada com perda de memória ou doença de Parkinson e/ou epilepsia. Lisboa, 16 de Março de 2009