ES2320001T3

ES2320001T3 - Epsilon polilisina contra la halitosis.

Info

Publication number: ES2320001T3
Application number: ES04803351T
Authority: ES
Inventors: Lucas Huybrechts
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-01-19
Filing date: 2004-11-29
Publication date: 2009-05-18
Anticipated expiration: 2024-11-29
Also published as: WO2005068645A3; JP2007523891A; CA2553613A1; DK1709069T3; WO2005068645B1; ATE419828T1; WO2005068645A2; RU2006129942A; EP1709069A2; BRPI0418420A; EP1709069B1; BE1015863A6; DE602004018985D1; CN1922203A; US20080226565A1

Abstract

Uso de epsilon polilisina como compuesto antimicrobiano contra la halitosis.

Description

Epsilon polilisina contra la halitosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los productos para su uso en el tratamiento de la halitosis.

Antecedentes de la invención

Se sabe que la caries está causada por el ácido producido por bacteriales orales. Los azúcares, tales como la glucosa, son una fuente de alimentación importante para las bacterias y se requiere de su disponibilidad para la producción de ácido. El Streptococcus mutans (S. mutans) se considera como el culpable más importante en la aparición de la caries, sobrevive bien en la cavidad oral y produce cantidades relativamente grandes de ácido. S. mutans también produce enzimas glucosiltransferasas que catalizan la producción de glucanos y fructanos adhesivos, los cuales son utilizados por las bacterias para mejorar la unión a los dientes y la placa. La saliva puede proteger parcialmente de manera eficaz los dientes, contiene agentes antibacterianos, sustancias tampón y bloques de construcción de calcio y fosfato que se pueden utilizar para el trabajo de reparación. No obstante, la aptitud en la protección de la saliva no es suficiente y la superficie dental se destruirá y desmineralizará gradualmente como resultado de la producción regular de ácido. Con el tiempo aparecerán agujeros que pueden dar lugar finalmente a la pérdida de los dientes.

El uso de flúor para la reducción de la caries ha crecido enormemente durante los últimos cuarenta años. Hoy en día, las pastas de dientes que contienen flúor están disponibles a escala mundial. Muchos estudios científicos han demostrado que el flúor tiene la capacidad de (por lo menos parcialmente) inhibir la caries; una aptitud basada en la reducción del proceso de desmineralización y reforzamiento del proceso de remineralización (US 5089255; Dental Caries, O. Fejerskow et al; Blackwell Munksgaard,2003, ISBN 1-4051-0718-9). El efecto del flúor se puede potenciar con el uso de co-sustancias, tales como componentes de zinc (US4396599). No obstante, el efecto protector e inhibidor del flúor está limitado a aproximadamente el 25% de la caries que aparecería si no se utilizara flúor. Incluso hoy en día, el número de personas en el mundo que están afectadas de caries es enorme. Además, el perfil toxicológico del flúor se encuentra en debate (especialmente por su potencial carcinogénico, inflamación, dañino para el pulmón, immunológico, fluorosis y deformación ósea). Algunos países europeos han prohibido los suplementos de flúor del Mercado y la U.S. Food and Drug Administration (FDA) ha limitado su uso en pastas de dientes para el uso doméstico a un máximo de 1150 ppm. Más recientemente, se han explorado diversas estrategias en la búsqueda de nuevos agentes protectores: 1. Destrucción de bacterias, 2. Reducción de la producción de ácido, 3. Prevención de la unión de bacterias a la superficie y la placa dental, 4. Reparación de la superficie dental con bloques de construcción de calcio y fosfato y 5. Absorción del ácido en la superficie dental.

1. Destrucción de bacterias. Se han descubierto muchos agentes con actividad bacteriana contra bacterias de la cavidad oral; se incluyen péptidos lantibióticos de bacterias (US4209508; US 20030118590 pendiente), enzimas líticos de bacteriófagos que son capaces de destruir la pared celular de streptococcus mutans (US 6355012, US 6399098), extractos de células de levadura (US 4980151) o componentes de aceites naturales, tales como aceite de Cubeba o aceite de citronella java (US4590215: alfa cadinol). También los extractos de plantas, tales como Angelica Gigas, Akebia quinata, Camellia sinensis y Flor de Ginseng Coreana (J. Dent. Res. 2003; vol 82, tema específico B, 1591 y 1670) parecen demostrar actividad antibiótica. Además, se han desarrollado agentes antibacterianos sintéticos que actúan contra streptococcus mutans: cloruro de N-alquil-piridinio, bisbiguanidas (Clorohexidina, US 6143281), galactomananos de amonio cuaternario (US 4282204), polifenoles (triclosán; US 6136298) y péptidos de histidina modificados (US 5672351). Otras estrategias consisten en la estimulación de una reacción inmunológica contra S. Mutans con péptidos que tienen una estructura idéntica en comparación con partes del antígeno I/II de S. Mutans (proteína de la pared celular; US 6024958 y US 6500433), o el uso de anticuerpos contra el antígeno I/II de S. Mutans que han sido producidos con otras bacterias (US 5612031). Algunos sugieren el uso de bacteriófagos en la lucha contra S. Mutans (US 4957686 y US 4891210).

2. La producción de ácido se puede limitar con el uso de azúcares, tales como eritritol (US 6238648, US6177064, US 4346116), xilitol, trealosa, palatinosa (US 5985622). A pesar de su utilización a gran escala en alimentación, es necesario sustituir grandes cantidades de glucosa y el uso de una dosis elevada puede dar lugar a un efecto secundario laxante no deseado.

3. La unión de S. Mutans a la superficie dental se podría limitar posiblemente de varias maneras: los pirofosfatos y ZnO limitan la formación de la placa y reducen las posibilidades de unión (US 5455024); las glucanasas y dextranasas degradan los glucanos que son utilizados por las bacterias para unirse a la placa (US 5468479); podría ser posible utilizar una vacuna de péptido que estimule una reacción inmunológica contra la glucosiltransferasa; esta enzima cataliza la producción de glucanos (US 5686075); péptidos con una estructura similar a partes del antígeno I/II de S. Mutans podrían competir con el antígeno por la unión a la placa (US 6500433).

4. Trabajo de reparación. La saliva contiene iones calcio y fosfato que contribuyen a la reparación de la superficie del diente. También contiene proteínas naturales (por ejemplo, estaterina) que ayuda a evitar la precipitación de dichos iones, manteniéndolos disponibles para el trabajo de reparación. La caseína (US 5130123) y especialmente también la caseína no desnaturalizada (US 5427769) tienen una capacidad anticariogénica. Los caseinfosfopéptidos (CPP) se producen mediante la hidrólisis de caseína, y también tienen capacidad anticariogénica. Los CPP forman un complejo con iones calcio y fosfato y estimulan el trabajo de reparación.

5. Adhesión a la superficie del diente y absorción de ácido

La adhesión permite que el producto se acumule en la localización en la que es necesario, la superficie del diente. El caseinfosfopéptido, así como la fosvitina, una proteína hallada en el huevo, tienen la capacidad de unirse; se acumulan en la superficie y generan una capacidad de tampón local que contribuye a evitar que el ácido se disuelva el diente (US 5.279.814 en B.Jiang et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (5), 1187-1190,2001 en B.Jiang et al, J. Agric. Food Chem.,48, 990-994,2000 en A. Goulas et al, J. of Protein Chemistry, vol 15, no.1, 1-9,1996). Los productos con componentes básicos tienen capacidad tamponadora. Se han utilizado la arginina y los péptidos pequeños (2-4) que contienen por lo menos un aminoácido arginina para aumentar el pH de la placa (US 621851, US 4225579, US 5762911 en Kanapka, Archs. oral. Biol. 28,1007-1015,1983). También se recomiendo el quitosano (sales) (US 4512968); pero su potencial está limitado por la falta de solubilidad a pH neutro o básico. Otra poliamina, la polietilenimino fluorofosfato parece unirse al diente y protegerlo frente al ácido (US 4020019). Sin embargo, su resistencia contra la degradación enzimática y su capacidad para unirse a una pared celular, lo hace irritante y tóxico. La aparición de caries aún está muy extendida, a pesar de los muchos esfuerzos de investigación creativa que se han llevado a cabo; 99% de alemanes y el 94% de italianos entre 35-44 años de edad y el 40% de niños belgas entre 5-7 años de edad padecen de caries según un estudio epidemiológico que se ha llevado a cabo en Europa hace algunos años. Por tanto, es necesario que se desarrollen nuevos productos con una fuerte capacidad de protección contra el ataque ácido sobre el diente.

JP2004107309 describe el uso combinado de los componentes epsilon polilisina (o polilisina), abrasivo y zinc en formulaciones de un dentífrico para su uso en el control de la placa dental, la prevención del cálculo dental, la prevención de la caries, la prevención de la gingivitis y la prevención de la ozostomia. Se considera que el componente de Zinc es un componente antimicrobiano activo (particularmente contra Streptococcus mutans). La epsilon polilisina se utiliza como protector para el zinc contra el efecto estabilizante de los abrasivos.

De Boever et al. (1995, JADA 126:1384-1393) se refiere al tratamiento satisfactorio de la halitosis con gluconato de clorhexidina. Se indica que está acompañado por una disminución en la prevalencia y el número de bacterias específicas putativas del mal olor, pero no de otras bacterias. Más particularmente, D2 específica que las bacterias anaeróbicas que residen en la lengua juegan un papel principal en la etiología del mal olor, independientemente del estado periodontal.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere al uso de épsilon-polilisina como compuesto antimicrobiano contra la halitosis.

Se ha demostrado que la epsilon polilisina tiene actividad antibacteriana contra una gran variedad de bacterias de la cavidad oral incluyendo bacterias productoras de ácido. Se indica su relevancia para el control de la flora bacteriana en la cavidad oral en general.

Los productos se pueden utilizar en formulaciones para tratar la cavidad oral: dentífricos, geles, colutorio, saliva artificial... para pacientes y consumidores sanos. Tienen un perfil toxicológico atractivo en comparación con el fluoruro y se pueden utilizar en sistemas alimentarios.

Por consiguiente, la presente invención prevé el uso de epsilon polilisina formulada como una solución refrescante de la boca, un colutorio, un pulverizador para la boca, un gel, un chicle, caramelos, pastillas de menta, cápsulas, comprimidos o saliva artificial como compuesto antimicrobiano contra la halitosis.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1: proporciona una representación esquemática de la reacción entre epsilon polilisina y un epóxido bisfosfonilado en e-polilisina bisfosfonilada. El epóxido se produce a partir de difosfonato de vinilideno.

Figura 2: La reacción entre epsilon-polilisina y anhídrido 3-hidroxi-ftálico en epsilon polilisina 3-hidroxi-ftalada.

Figura 3: La susceptibilidad de organismos anaeróbicos que se han aislado de la cavidad oral en presencia de los productos (22; epsilon polilisina bisfosfonilada),(6; epsilon polilisina),(10; copolímero de caseinfosfopéptido y epsilon polilisina) o (27; epsilon polilisina 3-hidroxi-ftalada). La concentración inhibidora mínima (MIC) se indica en mg/ml en un intervalo explorado de 0,2 a => 3,5 mg/ml.

Figura 4: La susceptibilidad de organismos microaerofílicos que se han aislado en la cavidad oral en presencia de los productos (22), (6), (10) ó (27) y expresada en MIC.

Figura 5: La susceptibilidad de hongos (parecidos a levaduras) que se han aislado en la cavidad oral en presencia de los productos (22), (6), (10) ó (27) y expresada en MIC.

Figura 6: La susceptibilidad de organismos aeróbicos que se han aislado en la cavidad oral y de cepas estándar en presencia de los productos (22), (6), (10) ó (27) y expresada en MIC.

Figura 7: La susceptibilidad de cepas de Streptococcus spp. que se han aislado en la cavidad oral y de una cepa estándar en presencia de los productos (22), (6), (10) ó (27) y expresada en MIC.

Descripción de la invención

En un aspecto de la invención se ha demostrado que el péptido policatiónico, epsilon-polilisina, proporciona por sí mismo una actividad antibacteriana sustancial contra una amplia variedad de bacterias que residen en la cavidad oral, incluyendo streptococcus mutans y bacterias anaeróbicas (figura 4). Se puede utilizar como tal en formulaciones para proteger el diente y para tratar la cavidad oral.

Actividad antibacteriana de epsilon polilisina y e-polilisina modificada Figuras 3 a 7

En un aspecto de la presente invención se ha demostrado que la epsilon polilisina, la epsilon polilisina bisfosfonilada, la epsilon polilisina 3-hidroxi-ftalada y el copolímero de caseinfosfopéptido y epsilon polilisina (CPP x elys)n muestran una actividad antimicrobiana contra bacterias que residen en la cavidad oral. Se han evaluado más de cien bacterias anaeróbicas, aeróbicas, microaerofílicas y hongos diferentes, recogidos todos de la cavidad oral. La epsilon-polilisina muestra la mayor actividad contra anaerobios. De 28 cepas anaeróbicas, el crecimiento de 24 se inhibió por concentraciones en el intervalo de 3,5-0,2 mg/ml. Las bacterias gram-negativas son a menudo susceptibles de un valor de mic (concentración inhibidora mínima) baja de =< 0,2 mg/ml, incluyendo cepas de las especies Prevotella nigrescens, Porphyromonas asaccharolytica, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum. Estas bacterias intervienen frecuentemente en la periodontitis, infecciones de la pulpa dental y otras infecciones en la cavidad oral. Además, los anaerobios gram positivos son susceptibles frecuentemente de valores mic bajos (=< 0,2 a 0,4 mg/ml) de epsilon-polilisina. La e-polilisina bisfosfonilada mostró también una buena actividad contra anaerobios, pero el copolímero caseinfosfopéptido e-polilisina y e-polilisina 3-hidroxi-ftalada fueron menos eficaces. La e-polilisina bisfosfonilada y la e-polilisina 3-hidroxi-ftalada y (CPP x elys)_{n} no son activos contra aerobios, pero la e-polilisina inhibe el crecimiento de 7 cepas de 21 en el intervalo de 1,7 a 0,2 mg/ml. La e-polilisina bisfosfonilada inhibe 6 de 9 cepas de Streptococcus a 1,7 mg/ml. La e-polilisina muestra la mayor actividad contra bacterias microaerofílicas con una concentración inhibidora de 0,2 mg/ml en el caso de 17 de31 cepas. La e-polilisina bisfosfonilada también muestra actividad (valor mic de 0,2 mg/ml para 12 cepas de 31). Una vez más, la e-polilisina fue la más activa contra los hongos evaluados con una concentración inhibidora de entre 0,2 y 0,8 mg/ml para las 21 cepas evaluadas.

La actividad antibacteriana de e-polilisina muestra a la vez múltiples actividades en la cavidad oral y satisface múltiples necesidades. No sólo contribuye a la protección del diente, sino que también mantiene la flora bacteriana bajo control (de forma similar a lo que hace la histatina un péptido natural en la saliva) y también ayuda a evitar el mal olor en la boca (halitosis). De hecho, muchos de los anaerobios que causan infecciones tales como parodontitis también contribuyen al mal olor en la boca, mediante la producción de compuestos que contienen azufre. En particular, es relevante indicar que a las concentraciones más bajas (0,2 a 0,4 mg/ml), muestra actividad inhibidora contra un 71% de anaerobios que han sido recogidos de la cavidad oral (17 de 24 especies) y contra el 12% de aerobios recogidos de la cavidad oral (2 de 17). La actividad antimicrobiana selectiva de e-polilisina hace que sea una herramienta válida para su uso contra la halitosis (mal olor en la boca). La e-polilisina es capaz de atacar los organismos responsables de la halitosis de una manera parcialmente selectiva. La fuerte actividad antibacteriana (especialmente también contra hongos) hace que sea un buen candidato para el uso en saliva artificial para pacientes con Xerostomía (boca seca). Esto incluye pacientes con cáncer oral, enfermedad de Hodgkin, síndrome de Sjögren, VIH, ... A menudo, se enfrentan a infección fúngica en la cavidad oral. La epsilon polilisina es beneficiosa por su contribución a la protección del diente, pero también para la protección dela cavidad oral de manera global.

Otros componentes en las formulaciones finales

Los polímeros se pueden utilizar con otros componentes conocidos en las formulaciones finales para su uso en la cavidad oral: dentífricos, soluciones refrescantes de la boca, colutorios, pulverizadores bucales, geles, chicles, caramelos, caramelos y otros sistemas de alimentación, saliva artificial. La formulación final puede contener detergentes no iónicos, aniónicos, anfotéricos, catiónicos o zwitteriónicos descritos en las Patentes de Estados Unidos US 3988433, US 4051234, US 3959458. Los detergentes no iónicos son condensados de grupos de óxido de alquileno hidrofílicos con componentes orgánicos hidrofóbicos. Por ejemplo: poloxámeros (comercializados con el nombre de Pluronic), ésteres de polioxietilensorbitan (Tween), condensados con óxido de polietileno de alquil fenoles, condensados de óxido de etileno con productos de reacción del óxido de propileno y etilendiamina, condensados con óxido de etileno de alcoholes alifáticos, óxidos de amina terciaria con una cadena larga, óxido de fosfina terciaria con una cadena larga, dialquilsulfóxidos con una cadena larga y mezclas. Los detergentes anfotéricos son aminas alifáticas secundarias y terciarias, con una cadena alifática y con la presencia de un grupo aniónico (por ejemplo, carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfato, fosfonato). Los detergentes aniónicos son sales de alquilsulfatos con 8 a 20 átomos de carbono (por ejemplo, alquil sulfato sódico) y sales de monoglicéridos sulfonados de ácidos grasos con 8 a 20 átomos de carbono. Ejemplos: lauril sulfato sódico y monoglicérido sulfonato sódico de coco, sarcosinatos, tales como lauroil sarcosinato sódico, lauril sulfoacetato sódico, lauroil isetionato sódico, lauril éter carboxilato sódico, dodecil bencenosulfonato sódico o mezclas.

Frecuentemente la dosis de un detergente aniónico se encuentra entre el 0,025% y el 9% y preferiblemente entre el 0,1% y el 5% p/p. Se pueden utilizar espesantes en la formulación final para proporcionar el perfil reológico deseado: goma guar, polímeros de carboxivinilo, carragenanos, Konjac, escleroglucano, carboximetilcelulosa, hidroxietil celulosa, copolímeros de polioxietilenglicol y polioxipropilenglicol, goma karaya, goma arábiga, goma tragacanto y xantano en una concentración de 0,1% a 15%. Los polímeros reticulados de ácido acrílico, tales como Carbopol de BF Goodrich, son conocidos en el sector. La formulación final puede contener un humidificador. Los polialcoholes proporcionan una sensación de humedad y evitan que el producto se endurezca tras el contacto con el aire. Incluyen glicerina, sorbitol, butilenglicol, polietilenglicol, sorbitol. La formulación final puede contener agentes abrasivos: sílice, tal como sílice hidratada amorfa, metafosfato sódico, metafosfato potásico, trifosfato cálcico, fosfato cálcico dihidratado, fosfato cálcico, pirofosfato cálcico, bicarbonato sódico, bicarbonato cálcico, alúmina hidratada. Algunas veces se utilizan polímeros como abrasivos (US 3070510); melaminas, polifenoles, ureas, urea-formaldehído...; se describen abrasivos de base sílice en US3538230 y US3862307 (incluido por referencia). "Syloid" (de W.R. Grace y compañía) y "Zeodent" (de la corporación de J.M. Huber) son conocidos en la técnica. Frecuentemente los dentífricos contienen entre un 10% y un 70% de abrasivo o mezcla de abrasivos.

La formulación final puede contener productos contra el sarro, tales como sales de pirofosfato, tales como Na_{4}P_{2}O_{7}, K_{4}P_{2}O_{7}, Na_{2}K_{2}P_{2}O_{7}, Na_{2}HP_{2}O_{7} y K_{2}H_{2}P_{2}O_{7}, hexametafosfato de sodio, tripolifosfato de sodio y fosfatos cíclicos, tales como trimetafosfato de sodio. La dosis es de aproximadamente 0,5% a 10% p/p. Finalmente se podrían utilizar policarboxilatos aniónicos o quitosano carboxilado con el fin de aumentar el efecto anti-sarro. Los copolímeros de anhídrido maleico con otros monómeros etilénicos, tales como metil vinil éter con un peso molecular entre 30.000 y 1.000.000 y preferiblemente entre 30.000 y 500.000 son conocidos bajo el nombre de Gantrez (US 4627977). La concentración en la formulación final se encuentra entre 0,5% y 5%. Otras posibilidades incluyen citrato de zinc trihidratado, polifosfatos, difosfonatos (EDHP).

La formulación final puede contener aromatizantes, a menudo a una concentración entre 0,001% y 5% y preferiblemente entre 0,5% y 1,5% p/p. Algunos ejemplos son: menta verde, menta, mentol, anetol, salicilato de metilo, cassia, acetato de 1-mentilo, eugenol, aceite de perejil, oxanona, alfa-irisona, mejorana, propenil guaetol, vanilina, timol, linalool, cinamaldehído glicerol acetal, té de Canadá, sassfras, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limón, lima, pomelo, naranja. La formulación final también puede contener edulcorantes; además de los edulcorantes anticariogénicos conocidos, son válidos los siguientes productos: sacarosa, glucosa, sacarina, dextrosa, levulosa, lactosa, manitol, sorbitol, fructosa, maltosa, xilitol, sales de sacarina, taumatina, aspartato, D-triptófano, dihidrocalcona, acesulfamo y sales de ciclamato.

La formulación final puede contener componentes contra la sobre-sensibilidad (por ejemplo, nitrato de potasio o citrato de potasio), agentes blanqueantes (peróxido de hidrógeno, peróxido de calcio, peróxido de urea), conservantes, agentes refrescantes (carboxamidas, mentol, cetales), componentes antiinflamatorios (aspirina, ibuprofeno,
naproxeno, ...).

La formulación se puede disponer en un sistema de una o dos etapas. Los componentes de una formulación de "dos etapas" se guardan por separado en dos compartimentos y se mezclan justo antes de su uso.

Se conocen composiciones de formulaciones finales y se añaden para referencia: por ejemplo para dentífricos US 3988433, para colutorios US3988433, para caramelos US 4083955, para chicles US 4083955 y para tratamiento subgingival US 5198220.

Los dentífricos y geles contienen a menudo un abrasivo (10% a 50%), un detergente (0,5% a 10%), un espesante (0,1% a 5%), un humidificador (10% a 55%), un aromatizante (0,04% a 2%), un edulcorante (0,1% a 3%), un agente colorante (0,01% a 0,5%), agua (2% a 45%) y finalmente un producto anticariogénico (0,05% a 10%) o un producto contra el sarro (0,1% a 13%).

Los colutorios y pulverizadores contienen a menudo agua (45% a 95%), etanol (0% a 25%), un humidificador (0% a 50%), un agente tensioactivo (0,01% a 7%), un aromatizante (0,04% a 2%), un edulcorante (0,1% a 3%), un agente colorante (0,001% a 0,5%) y finalmente un producto anticariogénico (fluoruro; 0,05% a 0,3%) o un producto contra el sarro (0,1% a 3%).

Otra formulación se refiere a geles no abrasivos (geles subgingivales). Contienen un espesante (0,1% a 20%), un humidificador (0,1% a 910%), un aromatizante (0,04% a 2%), un edulcorante (0,1% a 3%), un agente colorante (0,01% a 0,5%), agua (2% a 45%) y un producto anticariogénico o anti-sarro.

Las formulaciones de chicles contienen a menudo goma (50% a 99%), un aroma (0,4% a 2%), un edulcorante (0,01% a 20%) y opcionalmente un producto anticariogénico. En las patentes US 4642903, US 4946684, US 4305502, US 4371516, US 5188825, US 5215756, US 5298261, US 3882228, US 4687662, US 4642903 se han descrito caramelos, pastillas de menta, cápsulas, comprimidos y otros sistemas de alimentación.

Algunas de las siguientes realizaciones y ejemplos se han incluido únicamente como referencias y no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplos A. Métodos y Materiales

Productos. Caseinfosfopéptido (CPP, PM 1-2 kD, 1000-2000 dalton), bisfosfonato de vinilideno, anhídrido 3-hidroxi-ftálico, epsilon-polilisina (PM 4100 dalton) están disponibles en el mercado.

Determinación de la susceptibilidad de microorganismos que han sido aislados de la cavidad oral a Epsilon-polilisina, e-polilisina bifosfonilado, copolímero de caseinfosfopéptido y e-polilisina y e-polilisina 3-hidroxiftalado.

Las investigaciones incluyeron más de cien cepas aisladas de la cavidad oral: anaerobios, bacterias microaerofílicas, aerobios, Streptococcus spp. y hongos de tipo levadura. Los microorganismos se aislaron de la saliva, la membrana mucosa, bolsillos gingivales y caries. La susceptibilidad (MIC) de las bacterias y hongos de tipo levadura se determinó mediante la técnica de dilución en placa en agar. Las muestras investigadas se disolvieron en agua destilada estéril (inmediatamente antes del experimento) para obtener las siguientes concentraciones: 3,5, 1,7, 0,8, 0,4 y 0,2 mg/ml y se añadieron en agar apropiado. Las placas se inocularon utilizando un inoculador multipunto Steers. El inóculo contenía 10^{6} CFU/spot. En cada serie experimental, se comprobó el crecimiento de las cepas en el medio de cultivo sin los compuestos investigados. La concentración a la que no se observó crecimiento macroscópico de los microbios en el medio se consideró como la concentración más baja, que inhibe el crecimiento de los microbios (MIC). Los exámenes de las susceptibilidad de los microbios a los péptidos se llevó a cabo dos veces.

Anaerobios. La susceptibilidad de las bacterias se determinó mediante métodos de dilución en agar con agar de Brucella complementado con sangre de oveja desfibrinada al 5%, menadiona y hemina. Las soluciones de las muestras con concentraciones de 3,5-0,2 mg/ml se añadieron en agar. La placa de agar sin muestras investigadas se incluyó como control del crecimiento bacteriano. El inóculo de 10^{6} CFU/ml se aplicó a las placas de agar con replicador Steers. La incubación se realizó durante 48 horas a 37ºC (310ºK) en tarros anaeróbicos que contenían una mezcla de 10% CO_{2}, 10% H_{2} y 80% N_{2} en presencia de catalizador de paladio e indicador de anaerobiosis. Bacterias microaerofílicas. La susceptibilidad de las bacterias se determinó mediante los métodos de dilución en agar con agar de Brucella complementado con sangre de oveja al 5%. Las soluciones de las muestras con concentraciones de 3,5-0,2 mg/ml se añadieron en agar. La placa de agar sin muestras investigadas se incluyó como control del crecimiento bacteriano. El inóculo de 10^{6} CFU/ml se aplicó a las placas de agar con replicador Steers. La incubación se realizó a 37ºC en tarros anaeróbicas con Campy Pak (bio Merieux) durante 48 horas.

Streptococcus spp. La susceptibilidad de las bacterias se determine mediante métodos de dilución en agar con agar Mueller-Hinton complementado con sangre de oveja al 5%. Las soluciones de las muestras con concentraciones de 3,5-0,2 mg/ml se añadieron en agar La placa de agar sin muestras investigadas se incluyó como control del crecimiento bacteriano. El inóculo de 10^{6} CFU/ml se aplicó a las placas de agar con replicador Steers. La incubación se realizó durante 24 horas a 37ºC (310ºK) en tarros anaeróbicos que contenían una mezcla de 10% CO_{2} y 90% N_{2,}. Aerobios. La susceptibilidad a muestras investigadas se determinó mediante la técnica de dilución en placa en agar Mueller-Hinton. Las soluciones de las muestras con concentraciones de 3,5-0,2 mg/ml se añadieron en agar. La placa de agar sin muestras investigadas se incluyó como control del crecimiento bacteriano. El inóculo de 10^{6} CFU/ml se aplicó a las placas de agar con replicador Steers. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37ºC en condiciones aeróbicas.

Hongos tipo levadura. La susceptibilidad de los hongos a muestras investigadas se determinó mediante la técnica de dilución en placa en agar de Sabouraud. Las soluciones de las muestras con concentraciones de 3,5-0,2 mg/ml se añadieron en agar. La placa de agar sin muestras investigadas se incluyó como control del crecimiento fúngico. El inóculo de 10^{6} CFU/ml se aplicó a las placas de agar con replicador Steers. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37ºC en condiciones aeróbicas.

Análisis químico y métodos de purificación

Los espectros ^{1}H, ^{13}C, ^{31}P se registran en un Bruker AC 250 NMR. El contenido en fósforo se determina con un Thermofinnigan Element II (HR ICPMS). La Cromatografía de Permeación en Gel se lleva a cabo con gel fino Sephadex G-25. Los procedimientos de purificación por ultrafiltración se llevan a cabo con cartuchos de celulosa Millipore prep/scale (poro: 1kD) y una bomba peristáltica Millipore "Easy load masterflex".

B. Procedimientos de producción

Copolímero de caseinfosfopéptido y epsilon-polilisina (CPP x elys)_{n}; (10) Se disuelven 10 gramos de caseinfosfopéptido en 86 ml de agua desionizada y s se enfrían a 6ºC con hielo. Se añaden 1,6 gramos de EDAC. Se añaden 4,1 gramos de epsilon-polilisina después de 15 minutos. Se ajusta el pH a 7,8 y se deja evolucionar la reacción durante toda la noche (20 horas) a 20ºC (se añade un poco de agua adicional, 40 ml, en el caso de que la viscosidad aumente demasiado).

Posteriormente, se añaden 300 ml de agua desionizada y se ajusta el pH a 9. Se ultrafiltra con cartuchos de celulosa Millipore prep/scale con un poro de 1000 dalton y se producen 2 litros de filtrado; se liofiliza (o se seca por pulverización) el residuo retenido.

Epsilon-polilisina bisfosfonilada (Bispho x elys) (producto 18);procedimiento de 1 etapa

Se disuelven 165 mg de bisfosfonato de vinilideno (2-sal sódica; pH 6) en 1 ml de peróxido de hidrógeno (30%); se añaden 6 mg de tungstato sódico y 68 mg de ácido trifluoroacético; se deja reaccionar durante una hora a temperatura ambiente. Se añaden 120 mg de epsilon-polilisina y se deja reaccionar durante 5 horas de 50 a 55ºC. Se precipita un producto durante la reacción. Se extrae el disolvente mediante decantación y se disuelve el precipitado en agua con adición de NaOH 8N. Se purifica en una columna Sephadex 25G con NaOH 0,01N; se liofiliza el producto.

Epsilon-polilisina bisfosfonilada (Bispho x elys) (producto 22) (Fig.1); procedimiento de 2 etapas (unión del componente bifosfonato a e-polilisina no desnaturalizada en isopropanol/agua a pH ácido).

Etapa 1

Se disuelven 23 gramos de bisfosfonato de vinilideno (2-sal sódica, pH de la solución es 6) en 85 ml de peróxido de hidrógeno (30%) y se añaden 77 mg de tungstato sódico. Se deja reaccionar durante tres horas a 60ºC. Se añaden 160 ml de acetona y se separará una 2ª capa en el fondo; se enfría y se extrae el disolvente por decantación. Se lava la 2ª capa con acetona, se extrae la acetona por decantación y se seca.

(Nota: la reacción también se puede llevar a cabo con bisfosfonato de vinilideno (4-sal sódica, pH de la solución es básico); la extracción de acetona/agua se puede llevar a cabo con otro procedimiento conocido, diferente de la decantación).

Etapa 2

Se añaden 60 ml de agua al producto seco de la etapa 1. Se añaden 10 gramos de epsilon polilisina y 1,4 ml de BF_{3} (opcionalmente); se ajusta el pH a 4 con HCl y se añaden 67 ml de isopropanol. Se deja reaccionar durante toda la noche entre 50 y 65ºC y posteriormente se ajusta el pH a 6,9 con NaOH 8N. Aparece una segunda capa con la adición de 150 ml de acetona; se enfría y se separa el disolvente por decantación. Se lava la segunda capa con acetona. Se extrae el disolvente por decantación y se seca. Se añaden 300 ml de agua y se ajusta el pH a 9 con NaOH 8N. Se ultrafiltra con un cartucho para escala preparativa Millipore (paso de 1000 dalton) con una solución de NaOH de 200 mg/litro. Se producen 2 litros de filtrado y se seca (liofiliza) el residuo retenido.

^{1}H-RMN (D_{2}O): desplazamiento químico (integración): 1,35(2), 1,55(2), 1,75(2) en 3,2(2) grupos CH_{2} de epsilon polilisina; 3,65 (1) CH-componente de epsilon polilisina (parcialmente recolocado); 3,0 (0,25): nueva señal, no está presente en el espectro de epsilon polilisina; grupo CH_{2} del componente de vinilideno acoplado (el desplazamiento químico sugiere el acoplamiento N-CH_{2} y no el acoplamiento O-CH_{2}; la integración sugiere cuatro grupos bisfosfonilo por molécula de epsilon polilisina de (+- 4000 a 4100 dalton).

El número de grupos bisfosfonilo por molécula de epsilon polilisina según la determinación de P con HRICPMS: 4.3.

Epsilon-polilisina bisfosfonilada (Bispho x elys) (producto 23); procedimiento de 2 etapas (unión del componente bisfosfonato a e-polilisina no desnaturalizada en agua a pH ácido).

Etapa 1

Se añaden 279 mg de bisfosfonato de vinilideno (2-sal sódica, solución de pH 6) a 1 ml de peróxido de hidrógeno (30%); se añaden 6 mg de tungstato sódico y se deja reaccionar durante 4 horas a 70ºC. Se añaden 2 ml de acetona y se extrae el disolvente de la segunda capa por decantación y se seca al vacío.

Etapa 2

Se añaden 120 mg epsilon-polilisina, 0,7 ml de agua desionizada y (opcionalmente) BF_{3} al producto de la etapa 1 y se ajusta el pH a 4. Se deja evolucionar la reacción durante toda la noche a 50ºC y después se ajusta el pH a 8,2. Se purifica la mezcla en una columna Sephadex 25-G con NaOH acuoso (200 mg/L). El número de grupos bisfosfonilo por molécula de epsilon-polilisina según HRICPMS: 3,9.

Epsilon-polilisina bisfosfonilada (Bispho x elys); procedimiento de 2 etapas (unión del componente bisfosfonato a e-polilisina desnaturalizada en isopropanol/H_{2}O a pH ácido).

Etapa 1

Se añaden 279 mg de bisfosfonato de vinilideno (2-sal sódica, solución de pH 6) a 1 ml de peróxido de hidrógeno (30%); se añaden 6 mg de tungstato sódico y se deja reaccionar durante 4 horas a 70ºC. Se añaden 2 ml de acetona y aparece una segunda capa; se extrae el disolvente por decantación y se lava la segunda capa con acetona, se extrae la acetona por decantación y se seca el producto, el epóxido, al vacío.

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Etapa 2

Se desnaturalizan 120 mg de epsilon-polilisina en 0,7 ml de agua en presencia de 336 mg de urea durante un periodo de 6 horas a 40ºC. Se añade la epsilon-polilisina desnaturalizada al producto de la etapa 1, el epóxido; se añade opcionalmente 1 gotas de BF_{3} y se ajusta el pH a 4. Se añaden 0,8 ml de isopropanol y se deje evolucionar la reacción durante toda la noche a 50ºC y después se aumenta el pH a 6.5. Se añade acetona, se enfría y aparece una segunda capa y se extrae el disolvente por decantación; se lava la segunda capa con acetona y se extrae el disolvente por decantación; se seca el producto al vacío. Se disuelve 1 ml de producto en agua y se purifica en una columna Sephadex 25-G a pH 11 (con 200 mg/L NaOH en agua) y se ajusta después el pH a 6,5 y se liofiliza el producto. Se purifica de nuevo en una columna Sephadex G-25 a pH 6,5. El número de grupos bisfosfonato presentes por molécula de epsilon-polilisina (HRICPMS): 11

Epsilon-polilisina bisfosfonilada (Bispho x elys) (producto 24); procedimiento de 2 etapas (unión del componente bisfosfonato a epsilon-polilisina desnaturalizada en isopropanol/H_{2}O a pH ácido).

Etapa 1

Se añaden 550 mg bisfosfonato de vinilideno (2-sal sódica, solución de pH 6) a 2 ml de peróxido de hidrógeno y se añaden 16 mg de tungstato sódico. Se deja reaccionar durante 3 horas y 20 minutos a 65ºC y a un pH de 4,6. Se ajusta el pH posteriormente a 6,6 y se añade acetona. Aparece una segunda capa. Se enfría y se extrae el disolvente por decantación; se lava la segunda capa con acetona, se extrae la acetona por decantación y se seca el producto.

Etapa 2

Se desnaturalizan 240 mg de epsilon-polilisina en 1,2 ml de agua en presencia de 675 mg de urea durante un periodo de 7 horas a 40ºC. Se añade la epsilon-polilisina desnaturalizada al producto de la etapa 1, el epóxido, se añaden opcionalmente 2 gotas de BF_{3} y se ajusta el pH a 4,0. Se añaden 1,35 ml de isopropanol y se deja evolucionar la reacción durante toda la noche a 56ºC. Se ajusta después el pH a 6,7 y se añade acetona. Se enfría y se extrae el disolvente mediante decantación. Se lava la segunda capa restante con acetona, se extrae el disolvente por decantación y se seca al vacío. Se disuelve el producto en agua, se ajusta el pH a 8,1 y se purifica mediante ultrafiltración (poro de 1 kD; disolvente: 20 mg NaOH/litro); se liofiliza el producto. El número de grupos bisfosfonato presentes por molécula de epsilon-polilisina: 6,3.

Epsilon-polilisina bisfosfonilada (Bispho x elys) (producto 25). Procedimiento de 2 etapas (unión del componente bisfosfonato a epsilon-polilisina desnaturalizada en agua a pH ácido).

Etapa 1

Se añaden 20,8 mg difosfonato de vinilideno (2-sal sódica, solución de pH 6) a 42 ml de peróxido de hidrógeno (30%) y 250 mg de tungstato sódico, se ajusta el pH a 4,6 y se deja reaccionar durante 3 horas a 69ºC; se ajusta el pH posteriormente a 6,4. Se añaden 80 ml de acetona (aparece una segunda capa); se enfría y se extrae la capa acetona/agua por decantación; se lava de nuevo la segunda capa con acetona y se extrae la acetona por decantación; opcionalmente se seca la segunda capa

Etapa 2

Se desnaturalizan 5 g de epsilon polilisina en 9 ml de agua en presencia de 10,1 g de urea (4 h, 20ºC). Se añade la e-polilisina desnaturalizada al producto de la etapa 1 (epóxido), se añaden opcionalmente 0,68 ml de BF_{3}, se ajusta el pH a 4 y se deja reaccionar durante toda la noche a 50ºC. A continuación, se ajusta el pH a 7,0 y se ultrafiltra con una solución acuosa de NaOH 40 mg/L. Se producen 2 litros de filtrado y se liofiliza el residuo retenido.

Epsilon-polilisina 3-hidroxi-ftalada. (producto 27) (Figura 2)

Se añaden 5,4 gramos de epsilon polilisina y 3,2 gramos de anhídrido 3-hidroxi-ftálico a 40 ml de DMSO sin agua a 6ºC. Después de una noche a 20ºC aparece un aceite amarillo. Se lava con acetona, se extrae el disolvente por decantación y se seca al vacío. Se disuelve el producto en 300 ml de agua con la adición de

NaOH hasta que el pH es 11. Se ultrafiltra a 35ºC en un cartucho de celulosa para escala preparativa Millipore (paso de 1000 dalton) y a una presión de 1,5 bar con 0,05N NaOH. Se producen 2 litros de filtrado y se liofiliza el residuo retenido.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5089255 A [0003]

\bullet US 4396599 A [0003]

\bullet US 4209508 A [0003]

\bullet US 20030118590 A [0003]

\bullet US 6355012 B [0003]

\bullet US 6399098 B [0003]

\bullet US 4980151 A [0003]

\bullet US 4590215 A [0003]

\bullet US 6143281 A [0003]

\bullet US 4282204 A [0003]

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\bullet US 5672351 A [0003]

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\bullet US 6500433 B [0003] [0003]

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\bullet US 4225579 A [0003]

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\bullet US 4512968 A [0003]

\bullet US 4020019 A [0003]

\bullet JP 2004107309 B [0004]

\bullet US 3988433 A [0014] [0019] [0019]

\bullet US 4051234 A [0014]

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\bullet US 3070510 A [0014]

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\bullet US 3862307 A [0014]

\bullet US 4627977 A [0015]

\bullet US 4083955 A [0019] [0019]

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\bullet US 4642903 A [0023] [0023]

\bullet US 4946684 A [0023]

\bullet US 4305502 A [0023]

\bullet US 4371516 A [0023]

\bullet US 5188825 A [0023]

\bullet US 5215756 A [0023]

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\bullet US 3882228 A [0023]

\bullet US 4687662 A [0023]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bullet O. FEJERSKOW et al. Dental Caries. Blackwell Munksgaard, 2003 [0003]

\bulletJ. Dent. Res., 2003, vol. 82 (B), 1591, 1670 [0003]

\bullet B.JIANG et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001, vol. 65 (5), 1187-1190 [0003]

\bullet B.JIANG et al. J. Agric. Food Chem., 2000, vol. 48, 990-994 [0003]

\bullet A. GOULAS et al. J. of Protein Chemistry, 1996, vol. 15 (1), 1-9 [0003]

\bulletKANAPKA. Archs. oral. Biol., 1983, vol. 28, 1007-1015 [0003]

\bullet DE BOEVER et al. JADA, 1995, vol. 126, 1384-1393 [0005]

Claims

1. Uso de epsilon polilisina como compuesto antimicrobiano contra la halitosis.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha epsilon polilisina se formula como una solución refrescante de la boca, un colutorio, un pulverizador para la boca, un gel, un chicle, caramelos, pastillas de menta, cápsulas, comprimidos o saliva artificial.